DE69028694T2

DE69028694T2 - Verfahren und zubereitungen zur krebsbehandlung mit oligonukleotiden

Info

Publication number: DE69028694T2
Application number: DE69028694T
Authority: DE
Inventors: Larry Smith
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1989-02-15
Filing date: 1990-01-24
Publication date: 1997-05-15
Anticipated expiration: 2010-01-25
Also published as: CA2046916A1; DE69028694D1; US5087617A; ES2094148T3; EP0458829A1; EP0458829B1; AU5085690A; JPH04505752A; DK0458829T3; AU635002B2; CA2046916C; WO1990009180A1; ATE143265T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die sich für die Krebstherapie eignen. Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden, um Tumorzellen aus Knochenmark vor der autologen Knochenmarktransplantation zu entfernen. Die Knochenmarkzellen werden von einem Individuum erhalten und einer die Proliferation hemmenden Menge eines Oligonucleotids mit einer Sequenz, die komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die von einem Gen transkribiert ist, das in den Krebszellen vorhanden ist, ausgesetzt. Die Zellen werden dann dem Individuum reinfundiert. Diese Behandlung hemmt insbesondere die Proliferation oder tötet maligne Zellen ab, nicht jedoch normale Zellen. Vorzugsweise kodiert das Gen für das Protein P53, wobei jedoch auch andere Antisense-Oligonucleotide verwendet werden können. Die Erfindung umfaßt auch Zusammensetzungen für die Verabreichung in vivo.
Diese Erörterung erläutert die Probleme, denen sich klinische Forscher gegenübersehen, die versuchen, die Behandlung von Krebs zu verbessern. Eine Anzahl von Druckschriften sind zur Erleichterung für den Leser aufgenommen worden. Die Aufnahme dieser Druckschriften bedeutet nicht, daß eingeräumt wird, daß diese Druckschriften Stand der Technik im Hinblick auf die vorliegenden Erfindung darstellen.
Krebs ist eine der gefürchtetsten Erkrankungen unseres Zeitalters und fordert jedes Jahr Tausende Tote. Ungeachtet erheblicher Fortschritte bei der Krebstherapie bleibt allerdings noch in erheblichem Maß Raum für Verbesserungen. Viele antineoplastische Mittel, die gegenwärtig bei der Krebsbehandlung eingesetzt werden, haben einen nicht-akzeptabel niedrigen therapeutischen Index; mit anderen Worten sind diese Mittel nicht imstande, bei Dosierungen, die keine nicht-akzeptable Toxizität bei normalen Geweben hervorrufen, die Proliferation von malignen Zellen zu blockieren oder diese Zellen abzutöten. Dementsprechend ruft die Behandlung mit diesen Mitteln unerwünschte Nebenwirkungen hervor, und in vielen Fällen kann eine wirksame Dosis dieser Mittel für den Wirt sogar tödlich sein. Daher haben Krebsforscher viele Jahre lang versucht, ein Verfahren zur Behandlung von Krebs zu entwickeln, das es ermöglichen würde, selektiv Krebszellen abzutöten, ohne normales Wirtsgewebe zu zerstören.
Die autologe Knochenmarktransplantation (ABMT) stellt einen erheblichen Fortschritt auf diesem Gebiet dar. Bei dieser Technik werden zuerst Knochenmarkzellen aus einem an Krebs leidenden Individuum entnommen, und anschließend wird der Patient umfangreich mit Strahlung, antineoplastischen Mitteln oder einer Kombination beider in einer ausreichenden Dosis, um die meisten, wenn nicht alle der malignen Zellen auszuschalten, behandelt. Diese Behandlung tötet allerdings oftmals normale hämatopoetische Zellen ebenfalls ab. Als Folge ist es erforderlich, das hämatopoetische System des Patienten durch Transplantation von Knochenmark, das vor der Behandlung entnommen wurde, zu rekonstituieren. Dieses Verfahren wird von Chang et al. in Lancet, 8. Februar 1986, S. 294-295 und in einer Monographie mit dem Titel "Autologous Bone Marrow Transplantation: Proceedings of the Third International Symposium", Dicke et al. (Hrsg.), The University of Texas M. D. Anderson Hospital and Tumor Institute, Houston (1987), beschrieben.
Ein Hauptnachteil, der mit der ABMT verbunden ist, ist die Tatsache, daß Zellen des Knochenmarktransplantats oftmals mit malignen Zellen kontaminiert sind. Dies gilt insbesondere, wenn der Patient an einer malignen Erkrankung leidet, von der bekannt ist, daß sie in das Knochenmark eindringt oder dort ihren Ursprung hat, z. B. Leukämien, Lymphome, Myelom, Brustkrebs und Kleinzellkarzinom der Lunge.
Bestehende Ansätze zur Verringerung oder Ausschaltung von malignen Zellen aus dem Knochenmark beinhalten die Anwendung von monoklonalen Antikörpern, von Arzneistoffen oder einfach der in vitro-Kultur. Diese bestehenden Reinigungsverfahren weisen jedoch gut dokumentierte inhärente Mängel auf. Zum Beispiel hängen Techniken, bei denen Antikörper eingesetzt werden, von der Antigendichte auf den Tumorzellen ab, die in einigen Fällen recht niedrig ist (Boyle und Gee, Cancer Investigation, Bd. 5 (1987), S. 113-118). Darüber hinaus macht die Heterogenizität von Tumorantigenen die Selektion eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch für einen gegebenen Tumor ist, kompliziert. In einer Studie ist daniber berichtet worden, daß Mafosamid wirksamer als monoklonale Antikörper für die Reinigung von Knochenmark vor der Transplantation ist. Ungeachtet dieses Berichts, nach dem dieses Verfahren das klinische Ergebnis bei Patienten mit akuter Leukämie verbesserte, war dieses Verfahren nicht kurativ (Gorin, Exp. Hemat., Bd. 16 (1988), S. 415 (Abstract 9)). Andere Forscher berichten, daß es eine signifikante fortschreitende Verschiebung von maligner zu normaler Myelopoese gibt, wenn Knochenmark von Spendern mit akuter oder chronischer myelozytischer Leukämie in Kultur für bis zu etwa 4 Wochen gehalten wird. Dieser Befund hat zu Versuchen geführt, Knochenmark durch in vitro-Kultur vor der autologen Knochenmarktransplantation zu reinigen (Coulumbel et al., J. Clin. Invest., Bd. 75 (1985), S. 961; Eaves et al., Haem. Blood Transfusion, Bd. 29 (1985), S. 163). Obwohl eine Gruppe berichtet, daß dieses Verfahren einen Patienten mit akuter myelogener Leukämie geheilt zu haben scheint (Chang et al., Lancet, Bd. 1 (1986), S. 2914), beschränkt das kontinuierliche Vorhandensein von maligner Hämatopoese während der gesamten Zeit der Kultur den therapeutischen Wert dieser Technik.
In jüngster Zeit wurde bemerkt, daß die Expression bestimmter Gene, die an der zellulären Proliferation beteiligt sind, durch Behandlung von Zellen, die diese Gene exprimieren, mit "Antisense"-Molekülen gehemmt werden kann. Diese Antisense-Moleküle weisen eine Sequenz auf, die komplementär zu einem Abschnitt von RNA ist, der von dem ausgewählten Gen transkribiert ist. Der genaue molekulare Mechanismus der Hemmung ist zwar nicht bekannt, es ist jedoch vorgeschlagen worden, daß er das Ergebnis der Bildung von Duplexen zwischen dem Antisense-Molekül und der RNA ist, die von dem Tragetgen transkribiert ist. Die Duplexe können möglicherweise Translation, Prozessierung oder Transport der mRNA-Sequenz hemmen oder zu einem Verdau durch das Enzym RNaseH führen.
Kürzlich durchgeführte Studien, die die Verwendung von Antisense- Oligonucleotiden beinhalten, sind von Stein und Cohen, Cancer Res., Bd. 48 (1988), S. 2659 zusammengefaßt worden. Mehrere Arten von Antisense-Molekülen sind hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Synthese spezieller Proteine sowohl in intakten Zellen als auch in in vitro-Systemen für die Proteinsynthese zu hemmen, abgesucht worden; vgl. Paoletti, Anti-Cancer Drug Design, Bd. 2 (1988), S. 325. Zum Beispiel ist darüber berichtet worden, daß Mittel mit einer Spezifität für RNA, die vom myc-Gen transkribiert ist, die Proliferation der humanen AML-Linie HL60 (Wickstrom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S. 1028; EP-0 288 163) und normaler T-Lymphozyten (Heikkila et al., Nature, Bd. 328 (1987), S. 445) hemmen, und es ist berichtet worden, daß Oligodesoxyribonucleotide, die komplementär zu Cyclin-mRNA sind, die Teilung von 3T3-Zellen unterdrücken (Jaskulski et al., Science, Bd. 240 (1988), S. 1544-1546). Darüber hinaus ist berichtet worden, daß in einem murinen System die Transfektion eines Plasmids, das für Antisense-p53-RNA kodiert, in transformierte Metha- oder nicht-transformierte NIH3T3-Fibroblasten die Wachstumsgeschwindigkeit der Transfektanten verringert (Shohat et al., Oncogene, Bd. 1 (1987), S. 277-283). Selbstverständlich haben Studien bei Mäusen möglicherweise nur eine sehr begrenzte Übertragbarkeit auf humane Systeme, insbesondere wenn, wie bei p53, erhebliche Unterschiede zwischen der Struktur des murinen Gens und des humanen Gens mit der gleichen Bezeichnung bestehen (Lamb und Crawford, Mol. Cell Biol., Bd. 6 (1986), S. 1379).
Die molekulare Klonierung und die in vitro-Expression eines cDNA- Klons für das humane zelluläre Tumorantigen p53 ist von Harlow et al., Mol. Cell Biol., Bd. 5/7 (1985), S. 1601-1610 beschrieben worden.
Viele der zitierten Druckschriften sind zwar von allgemeinem wissenschaftlichen Interesse; sie leiden allerdings an einer Reihe von Mängeln, was dazu führt, daß sie nicht ausreichen, um die Wirksamkeit von Oligonucleotiden als chemotherapeutischen Mitteln für Krebs zu belegen. Zum Beispiel zeigt keine der Studien, "ber die bisher berichtet worden ist, daß die Behandlung mit ausgewählten Antisense-Oligonucleotiden wahrscheinlich einen akzeptablen therapeutischen Index hat. Es ist nicht gezeigt worden, daß Antisense-Oligonucleotide für maligne Zellen letal sind oder sogar die Proliferation von malignen Zellen, jedoch nicht der entsprechenden normalen Zellen unter den gleichen Behandlungsbedingungen hemmen. Darüber hinaus beschreiben diese Studien nicht die Wirkungen von Antisense-Oligonucleotiden auf frische Tumorzellen oder frische normale Zellen; statt dessen verwenden diese Studien kontinuierliche Zellinien, die sich in vielfacher Hinsicht von frischen Zellen unterscheiden und deren Relevanz als Modell für das Absuchen von chemotherapeutischen Mitteln wiederholt von Mitgliedern der wissenschaftlichen Gemeinschaft in Frage gestellt worden ist (Vinditti Seminars in Oncology, Bd. 8 (1981), S. 349). Mit der vorliegenden Erfindung werden diese Mängel glücklicherweise überwunden, und das therapeutische Potential einer Chemotherapie mit ausgewählten Antisense-Oligonucleotiden wird zum ersten Mal überzeugend dargelegt.
Antisense-Oligonucleotide gegen c-myb-Proto-Oncogen und deren Verwendung werden in WO 90/05445 beschrieben, die gemäß Artikel 54 (3) EPÜ zu berücksichtigen ist.
Darüber hinaus haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung nun festgestellt, daß bestimmte Antisense-Oligonucleotide und insbesondere ein Oligonucleotid, das komplementär zu der mRNA ist, die für das humane p53-Genprodukt kodiert, möglicherweise erfolgreich zur selektiven Ausschaltung maligner Zellen aus Knochenmark vor der autologen Knochenmarktransplantation verwendet werden können. Diese und weitere Vorteile der Erfindung werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Es ist ein neues und nicht naheliegendes Verfahren zur Behandlung von Knochenmarkzellen aus einem an Krebs leidenden Individuum vor der Reinfusion der Knochenmarkzellen in das Individuum aufgefunden worden. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Stufen: Erhalt von Knochenmarkzellen aus dem Individuum und Aussetzen der Knochenmarkzellen einer die Proliferation hemmenden Menge eines Oligonucleotids mit einer Sequenz, die komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die von einem Targetgen transkribiert ist, das in den Zellen des Krebses vorhanden ist. Targetgene, die sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, werden hier ausführlicher zum Beispiel im Abschnitt mit dem Titel "Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen" beschrieben. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Targetgen jedoch ein "Verrätergen" der Art, wie es nachstehend vollständiger beschrieben wird. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Targetgen um ein Gen, das für p53 kodiert. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die die Proliferation hemmende Menge ungefähr 10 bis 200 mikromolar.
Es wird ein Verfahren zur Behandlung eines an Krebs leidenden Individuums bereitgestellt, das den Erhalt von Knochenmarkzellen aus dem Individuum, das Aussetzen der Knochenmarkzellen einer die Proliferation hemmenden Menge eines Oligonucleotids mit einer Sequenz, die komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die von einem Targetgen transkribiert ist, das in den Zellen des Krebses vorhanden ist, und die Transplantation der ausgesetzten Zellen in das Individuum umfaßt. Alternativ erhält das auf diese Weise behandelte Individuum eine zusätzliche Zubereitung, die ebenfalls Oligonucleotide enthält. Das beschriebene Verfahren mag sich für die Behandlung einer beliebigen Anzahl von Arten von Krebs eignen, insbesondere denen, bei denen bekannt ist, daß sie p53 exprimieren, und zwar unter Einschluß von Krebs der Zellen des hämatopoetischen Systems, von Leukämie, myelogener Leukämie, Lymphom, Brustkrebs, Myelom oder gastrointestinalem Krebs.
Bei dem ausgewählten Oligonucleotid kann es sich um ein beliebiges einer Anzahl von Typen handeln, unter Einschluß derjenigen mit einem geladenen oder ungeladenen Gerüst. Besonders bevorzugt sind die Methylphosphonat-Oligonucleotide und die Thiophosphat-Oligonucleotide. Ebenfalls bevorzugt sind Oligonucleotide, die mindestens acht Basen umfassen und die komplementär zu einer RNA-Sequenz sind, die sich 5' vom Initiationskodon des Targetgens befindet. Darüber hinaus kann das Oligonucleotid mindestens acht Basen umfassen und sich innerhalb von vierzig Basen vom Initiationskodon aus befinden. Schließlich kann das Oligonucleotid die Sequenz GGTCTGACGGAAGGCCCAGTGACGGTAC umfassen.
Die Knochenmarkzellen können den Oligonucleotiden zwar unter einer Reihe von Bedingungen ausgesetzt werden; in einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Expositionsstufe jedoch die Stufen des Fraktionierens der Knochenmarkzellen zum Erhalt einer mononuclearen Zellfraktion und das Züchten der mononuclearen Fraktion zusammen mit einer die Proliferation hemmenden Menge des Oligonucleotids für mindestens 1 bis 10 Tage.
Ein allgemeines Verfahren zum Abtöten von Krebszellen umfaßt es, die Krebszellen einer letalen Menge eines Oligonucleotids mit einer Sequenz, die komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die von einem Targetgen transkribiert ist, das in den Krebszellen vorhanden ist, auszusetzen. Die Krebszellen umfassen vorzugsweise Krebszellen, die im Knochenmark vorhanden sind. Geeignete Targets können z. B. durch Testen von Oligonucleotiden, die komplementär zu RNA sind, die von derartigen Targets abgeleitet ist, gemäß Verfahren bestimmt werden, bei denen das Potential für die selektive Abtötung durch Vergleich der Wirkungen bestimmter Antisense-Oligonucleotide auf frische Tumorzellen und entsprechendes normales Gewebe bestimmt wird (vgl. etwa Beispiel 1). Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß es wichtig ist, daß das gewählte Oligonucleotid nicht nur die Prohferation der Zellen des Tumors hemmt, sondern diese Zellen auch selektiv abtötet. Eine Menge des Oligonucleotids, die ausreicht, um dieses Ziel zu erreichen, wird als eine letale Menge angesehen. Eine letale Menge ist als eine ausreichende Menge definiert, die es erlaubt, eine Serumkonzentration an Oligonucleotiden von etwa 30 bis 200 mikromolar zu erzielen, wenn es sich bei dem Gen um p53 handelt.
Gemäß einer Ausführungsform wird eine Zusammensetzung zur Behandlung eines an Krebs leidenden Individuums bereitgestellt. Eine ausreichende Menge der Zusammensetzung, die Oligonucleotide enthält, die komplementär zu RNA sind, die von einem Targetgen transkribiert ist, um die Krebszellen in dem Individuum abzutöten, wird dem Individuum verabreicht. Die beschriebenen Verfahren können zur Behandlung von Krebserkrankungen einer Anzahl von Arten unter Einschluß von Krebserkrankungen der Zellen des hämatopoetischen Systems, Leukämie, myeloider Leukämie, Lymphom, Brustkrebs, Karzinom der Lunge, gastrointestinaler Krebs und multiplem Myelom, angewandt werden.
Eine Anzahl von Arten von Oligonucleotiden unter Einschluß derjenigen mit geladenem oder ungeladenem Gerüst, wie Methylphosphonat- oder Thiophosphat-Oligonucleotide, können verwendet werden. Die ungeladenen Oligonucleotide sind jedoch bevorzugt. Die Oligonucleotide können mindestens 8 Basen umfassen und komplementär zu einer RNA-Sequenz sein, die sich 5' vom Initiationskodon des RNA-Transkripts befindet. Alternativ dazu kann das Oligonucleotid mindestens 8 Basen umfassen und sich innerhalb von 40 Basen vom Initiationskodon des Transkripts aus befinden. Gemäß einer speziellen Ausführungsform umfaßt das Oligonucleotid die Sequenz GGTCTGACGGAAGGCCCAGTGACGGTAC. Schließlich umfaßt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen zur Hemmung der Proliferation von malignen Zellen unter Einschluß von Zusammensetzungen, die Oligonucleotide umfassen, die komplementär zu mRNA sind, die vom p53-Gen transkribiert ist.
Mit diesen Zusammensetzungen können eindrucksvolle Steigerungen der Wirksamkeit der Knochenmarkreinigung für die autologe Knochenmarktransplantation und in der Krebschemotherapie im allgemeinen erzielt werden. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und den hier vorgelegten Beispielen noch deutlicher. Diese Beispiele und die Erörterung sollen erläuternd, nicht jedoch erschöpfend sein.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden, um Knochenmark von malignen Zellen vor der autologen Knochenmarktransplantation abzureichern oder weitgehend abzureichern. Die gewählten Antisense-Oligonucleotide weisen eine Sequenz auf, die komplementär oder im wesentlichen komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die von einem Gen transkribiert ist, das, wenn es blockiert wird, insbesondere das Wachstum maligner Zellen im Vergleich mit normalen Zellen hemmt oder die malignen Zellen abtötet. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonucleotid komplementär zu mRNA, die vom Humangen transkribiert ist, das für ein Protein kodiert, das als p53 bekannt ist.
Wie jedoch die folgende Erörterung zeigt, können Oligonucleotide, die komplementär zu mRNA sind, die von anderen Genen transkribiert ist, die für die Lebensfähigkeit der Zelle entscheidend sind, ebenfalls das Ziel für die Hemmung mit Antisense-Oligonucleotiden sein. Höhere Organismen weisen ein komplexes System von miteinander in Wechselwirkung stehenden Mechanismen auf, die für die Bestimmung der Größe, der Position und des Aufbaus ihrer Komponentengewebe verantwortlich sind. Eine derartige Regulation erfordert es, daß koordinierende Informationen zwischen Zellen über variierende Abstände übertragen werden. Dies wird zumindest zum Teil durch eine Reihe von informationstragenden Molekülen erreicht, die Elemente des endokrinen und parakrinen Systems sowie Zelloberflächenkomponenten, die durch Zell-Zell-Kontakt in Aktion treten, umfaßt. Von besonderem Interesse sind die Informationsmoleküle, die Anweisungen weitergeben, die die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zelle betreffen und die zelluläre Proliferation und Differentiation regulieren.
Einzelne Zellen erfassen, interpretieren und reagieren auf diese exogenen Informationen mittels komplexer afferenter sensorischer und efferenter antwortender Systeme, deren Komponenten Rezeptoren für die Informationsmoleküle exogenen Ursprungs, sekundäre Botenstoffe und transkriptionale und translationale Regulatoren umfassen. Wenn also eine Zelle mit einem speziellen Satz von Informationsmolekülen konfrontiert wird und eine Interpretation erfolgt, dann manifestiert sich letztere zumindest zum Teil als ein entsprechendes Muster der Genexpression, das erforderlich ist, um eine geeignete Reaktion zu erzielen. Derartige Muster kann man sich als "kooperative Muster" vorstellen.
Das Verhalten von neoplastischen Zellen deutet darauf hin, daß sie in gewisser Weise anomal im Hinblick auf diese Mechanismen sind (Weinstein, J. Cell. Biochem., Bd. 33 (1987), S. 213), und es ist eine Reihe von spezifischen tumorassoziierten Veränderungen für bestimmte Komponenten dieser Mechanismen bei Tumorzellen beschrieben worden. Es wird daher angenommen, daß die sensorische Komponente von malignen Zellen auf aus der Umgebung stammende Reize reagiert, indem sie für ein "nicht-kooperatives Muster" der Genexpression sorgt, das wiederum für den malignen Phänotyp sorgt.
Sowohl normale als auch maligne primäre (frische) Zellen sterben ab, wenn sie in eine signifikant anomale Umgebung in vivo oder in vitro gebracht werden, selbst wenn sie mit allen erforderlichen Nährstoffen und physikalischen Bedingungen, die erforderlich sind, um die zellulären Funktionen aufrechtzuerhalten, versorgt werden. Primäre maligne Zellen können typischerweise einen etwas breiteren Bereich an Umgebungen tolerieren als normale Zellen, der Bereich ist jedoch noch sehr beschränkt. Es scheint also so, daß primäre normale oder maligne Zellen so programmiert sind, daß sie absterben, wenn ihnen aus der Umgebung stammende Informationsmoleküle entzogen werden, die sie anweisen, zu überleben.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben festgestellt, daß Antisense-p53-Oligonucleotide die Proliferation hemmen und schließlich primäre humane leukämische Blasten abtöten können, während sie keine ähnlichen Wirkungen auf frische normale Knochenmarkzellen ausüben. Dieses eindeutige Ergebnis weist darauf hin, daß die interaktiven Mechanismen für Erfassung, Interpretation und Reaktion auf Informationsmoleküle aus der Umgebung, die an der Regulation der Zellproliferation und der Lebensfähigkeit beteiligt sind, bei malignen Zellen gegenüber normalen Zellen im Hinblick auf ihre dynamischen Wechselwirkungen (die die Signaltransduktion und -interpretation beinhalten) so verändert sind, daß die Hemmung eines einzelnen Gens oder eines Satzes von Genen, die für Proteine kodieren, die an diesem Prozeß beteiligt sind, durch Antisense-Oligonucleotide ausreicht, um die Bedeutung der Informationsmoleküle zu verändern, so daß ein zelluläres Todes- oder Wachstumshemmungsprogramm selektiv in den malignen Zellen aufgerufen werden kann. Der Ausdruck "Verrätergene" wird hier verwendet, um diejenigen Gene in malignen Zellen zu beschreiben, die sich als Ziele für die Hemmung mit Antisense-Molekülen entsprechend der vorliegenden Erfindung eignen, was zu Wachstumshemmung oder Abtötung der malignen Zellen, nicht jedoch ihrer normalen Gegenstücke, über einen gewählten Dosisbereich führt. Geeignete Target- oder Verrätergene können selbst funktionell anomal sein, oder sie können normal sein, jedoch eine Funktion für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und der Proliferation von malignen Zellen als Teil eines anomalen Musters der Genexpression haben. Da jedoch die einfache Wachstumshemmung der malignen Zellen, die nur andauert, während sie Antisense-Oligonucleotiden ausgesetzt sind, für eine systemische Behandlung nicht geeignet wäre, ist es im Hinblick auf diesen Aspekt der Erfindung von besonderer Bedeutung, daß der Erfinder der vorliegenden Anmeldung imstande war, die selektive Abtötung von malignen Zellen zu dokumentieren.
Da die als Ziele vorgesehenen Verrätergene Gene umfassen, die entscheidend für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und für die Proliferation von malignen Zellen sind, fallen ihre Produkte möglicherweise in bestimmte Kategorien. Diese umfassen Informationsmolekille, die Anweisungen tragen, die die Zellproliferation, die Lebensfähigkeit und die Differentiation betreffen, sowie deren Rezeptoren; sekundäre Botenmoleküle, die an der Signaltransduktion und mit größter Wahrscheinlichkeit an deren Interpretation beteiligt sind; sowie transkriptionale und translationale Regulatoren, die auf derartige Informationen reagieren, indem sie für ein bestimmtes Muster der Genexpression auf der RNA- oder Proteinebene sorgen. Nachstehend wird eine Teilliste von potentiellen Target- oder "Verräter"-Genen vorgelegt, die sich möglicherweise für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung eignen. Informationsmoleküle, die normalerweise eine exogene Quelle haben, sind eingeschlossen, da neoplastische Zellen manchmal derartige Moleküle bilden, die eine autostimuherende Wirkung haben können. Regulationen der zellulären Differentiation werden erwähnt, da Differentiations- und Proliferationspotential oftmals gekoppelt sind und in einer inversen Beziehung stehen. Wenn das angegebene Molekül kein Protein ist, dann kodieren die entsprechenden Targetgene für Enzyme, die an der Synthese, dem Abbau oder der Modifikation des angegebenen Moleküls beteiligt sind. Tabelle I Möglicherweise geeignete Targetgene für die Knochenmarkreinigung
Dementsprechend umfassen spezielle Ausführungsformen der Erfindung Verfahren zur (1) Knochenmarkreinigung. Speziell für diese Ausführungsform bevorzugt sind Oligonucleotide, die gegen das Gen gerichtet sind, das für p53 kodiert.
Nachstehend wird ein Modell zur Entfernung von malignen Zellen aus Knochenmark durch Behandlung der Knochenmarkzellen mit ausgewählten Antisense-Oligonucleotiden beschrieben. Der bisher noch nicht gewürdigte Befund des Erfinders, daß ausgewählte Antisense-Oligonucleotide toxisch für Zellen des Tumors, nicht jedoch für normale Knochenmarkzellen sind, stellt eine starke experimentelle Basis für die Anwendung des Verfahrens bei der autologen Knochenmarktransplantation dar.
Patienten, für die sich die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als am wirksamsten erweisen können, umfassen die mit Krebs des hämatopoetischen Systems, Brustkrebs und gastrointestinalem Krebs. Die erstgenannte Kategorie von Erkrankungen umfaßt, jedoch ohne Beschränkung hierauf, verschiedene Formen von Lymphomen und Leukämle sowie multiplen Myelomen.
Zuerst erhält man eine Probe des Knochenmarks aus dem Patienten nach einer Anzahl von Standardtechniken, und Einschluß des Absaugens aus dem Darmbeinkamm, wie es z. B. in den US-Patenten 4 481 946 und 4 486 188 beschrieben ist. Der Patient wird dann mit einer optimalen Dosis Bestrahlung oder Chemotherapie behandelt, wie es bereits in "Autologous Bone Marrow Transplantation: Proceedings of the Third International Symposium", Dicke et al. (Hrsg.), The University of Texas J. D. Anderson Hospital and Tumor Institute, Houston (1987), beschrieben ist.
Die Knochenmarkprobe kann dann eingefroren und gelagert werden, bis sie benötigt wird, wie es z. B. in den US-Patenten 4 107 937 und 4 117 881 beschrieben ist, oder sie wird unmittelbar mit dem Oligonucleotid behandelt, wie es nachstehend ausführlicher beschrieben wird.
Einer der wichtigsten Parameter, die die Ausführung der vorliegenden Erfindung betreffen, ist die RNA-Sequenz, gegen die das Antisense-Oligonucleotid gerichtet ist (Target-RNA). Das Oligonucleotid kann gegen RNA als Ziel gerichtet sein, die von einer Anzahl von ausgewählten Targetgenen transkribiert wird, die vorstehend erörtert wurden, solange das Oligonucleotid die malignen Zellen abtötet oder das Wachstum hemmt, jedoch nicht so toxisch für normales Gewebe ist, als das es verhindern würde, einen akzeptablen therapeutischen Index zu erzielen. Geeignete Oligonucleotide können mit Hilfe der vorliegenden Offenbarung durch Testen auf die differentielle Toxizität, wie es z. B. im nachstehenden Beispiel I beschrieben ist, identifiziert werden. Ferner kann es sich, wie es vorstehend angegeben wurde, bei geeigneten Targets um die, die für Zelloberflächenrezeptoren, Modulatoren von intrazellulären Botenstoffen und transkriptionale Regulatoren kodieren, sowie um Effektorgene handeln, die die Zellproliferation und -lebensfähigkeit regulieren. Eine im Handel erhältliche Datenbank (Genebank) umfaßt eine große Anzahl an genetischen Sequenzen, die herangezogen werden können, um geeignete Oligonucleotide für die Ausführung der Erfindung zu entwickeln.
Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat jedoch festgestellt, daß ein Oligodesoxynucleotid, das komplementär zu der mRNA ist, die vom p53- Gen transkribiert ist, überraschend wirksam bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung ist. Dieses Gen ist mit der Regulation der Zellproliferation und der Genexpression in Zusammenhang gebracht worden; Mercer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 79 (1982), S. 6309-6312; Mercer et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 4 (1984), S. 276-281. Seine Expression ist nicht auf Tumorzellinien beschränkt; frische humane Tumorzellen aus Patienten mit kolorektalen oder Mammatumoren zeigen ebenfalls eine erhöhte Expression des p53-Genprodukts. Bisher war der Erfinder der vorliegenden Anmeldung imstande, die p53-Proteinsynthese in akuten myeloblastischen Leukämiezellen nachzuweisen, er war jedoch nicht imstande, sie in normalen Zellen aus Knochenmark unter Anwendung eines metabolischen Markierungsassays nachzuweisen (Smith et al., J. Exp. Med., Bd. 164 (1986), S. 751). Erfindungsgemäß hat der Erfinder nun gezeigt, daß Antisense-Oligonucleotide, die komplementär zu p53-mRNA sind, eine selektive Toxizität für maligne Zellen zeigen, nicht jedoch das Wachstum von normalen Knochenmarkzellen hemmen. Diese Studien werden kurz im nachstehenden Beispiel 1 beschrieben.
Als eine allgemeine Tatsache weisen die Oligonucleotide, die eingesetzt werden, eine Sequenz auf, die komplementär zu der Sequenz der Target-RNA ist. Absolute Komplementarität ist jedoch nicht erforderlich; im allgemeinen wird jedes beliebige Oligonucleotid mit einer ausreichenden Komplementarität, um einen stabilen Duplex mit der Target-RNA zu bilden, als geeignet angesehen. Da die stabile Duplexbildung von der Sequenz und der Länge des hybridisierenden Oligonucleotids und dem Grad der Komplementarität zwischen dem Antisense-Oligonucleotid und der Target-Sequenz abhängt, kann das System eine geringere Genauigkeit (Komplementarität) tolerieren, wenn längere Oligonucleotide verwendet werden. Gegenwärtig wird jedoch angenommen, daß Oligonucleotide mit einer Länge von etwa 8 bis 49 Basen und einer ausreichenden Komplementaritt, um einen Duplex mit einer Schmelztemperatur von mehr als etwa 40ºC unter physiologischen Bedingungen zu bilden, besonders geeignet für die Ausführung der Erfindung sind; Thoung et al., PNAs USA, Bd. 84 (1987), S. 5129; Wilson et al., Nucleic Acids Res., Bd. 16 (1988), S. 5137. Dementsprechend sind derartige Oligonucleotide bevorzugt.
Eine weitere Variable, die die Ausführung der Erfindung beeinflußt, ist der Bereich der Target-RNA, mit dem das gewählte Oligonucleotid hybridisieren soll. Oligonucleotide, die zu einer stabilen Hybridisierung mit einem beliebigen Bereich der RNA imstande sind, sind zwar für die Ausführung der Erfindung geeignet; der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat jedoch festgestellt, daß Oligonucleotide, die komplementär zu einem Bereich sind, der das Initiationskodon einschließt, besonders wirksam sind. Die am stärksten bevorzugten Oligonucleotide sind die mit einer Sequenzkomplementarität gegenüber dem Initiationskodon und einem Bereich, der sich etwa 5 bis 37 Basen stromaufwärts (in der 5'-Richtung) davon erstreckt. Am stärksten bevorzugt ist ein Oligonucleotid, das sich etwa 25 Basen stromaufwärts vom Initiationskodon erstreckt.
Das eingesetzte Oligonucleotid kann ein nicht-modifiziertes Oligonucleotid oder ein Oligonucleotid-Analogon darstellen. Geeignete Analoga umfassen, ohne Beschränkung hierauf, die Ethyl- und Methylphosphonat-Analoga, die im US-Patent 4 469 863 beschrieben sind, und die Thiophosphatmodifizierten Oligonucleotide, die von LaPlanche et al., Nucleic Acids Research, Bd. 14 (1986), S. 9081 und von Stec et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 106 (1984), S. 6077 beschrieben werden. Ferner bedeuten neuere Fortschritte in der Herstellung von Oligonucleotid-Analoga, daß weitere Mittel ebenfalls für die hier beschriebenen Zwecke verwendet werden können, z. B. 2'-O-Methylribonucleotide (Inoue et al., Nucleic Acids Res., Bd. 15 (1987), S. 6131) und chimäre Oligonucleotide, bei denen es sich um Verbund-RNA-DNA-Analoga handelt (Inoue et al., FEBS Lett., Bd. 215 (1987), S. 327). Die am stärksten bevorzugten Oligonucleotide werden nach dem Verfahren von Matsukura et al., Gene, Bd. 72 (1988), S. 343 synthetisiert.
Selbstverständlich müssen, damit die Tumorzell-Targets durch die ausgewählten Antisense-Oligonucleotide wirksam gehemmt oder vergiftet werden, die Zellen den Oligonucleotiden unter Bedingungen ausgesetzt werden, die ihre Aufnahme durch die malignen Zellen erleichtern. Dies kann durch eine Anzahl von Verfahren erreicht werden, z. B. unter Einschluß der einfachen Inkubation der Zellen mit den Oligonucleotiden in einem geeigneten Nährmedium für eine ausreichende Zeitspanne, um eine selektive Hemmung der malignen Zellen zu erzielen. Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat festgestellt, daß die Kultur des Knochenmarks mit ausgewählten Oligonucleotiden (im Beispiel Antisense-p53-Oligonucleotiden) die Proliferation der Zellen nach 8 Stunden Exposition (und möglicherweise eher) hemmt. Die Inkubation für mindestens etwa 7 bis 10 Tage tötet frische maligne Zellen (im Beispiel leukämische Blasten) ab, hat jedoch keine signifikante Wirkung auf frische Zellen aus normalem Knochenmark. Dementsprechend beinhaltet es ein bevorzugtes Verfahren für die Ausführung der Erfindung, die Knochenmarkzellen in eine Kultur zu bringen, wie es z. B. von Gartner und Kaplan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77 (1980), S. 4756; Coulombel et al., Blood, Bd. 67 (1986), S. 842; Meagher et al., Blood, Bd. 72 (1988), S. 273 oder im US-Patent 4 721 096 beschrieben wird, und zwar bei einer optimalen Konzentration des ausgewählten Antisense-Oligonucleotids.
Die Konzentration des Oligonucleotids kann, abhängig von einer Anzahl von Faktoren unter Einschluß der Art der Krebszellen, die Im Mark vorhanden sind, dem Typ und der Spezifität des speziellen gewählten Antisense-Oligonucleotids/der speziellen gewählten Antisense-Oligonucleotide und der relativen Toxizität des Oligonucleotids für maligne und normale Knochenmarkzellen variieren. Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat zwar eine signifikante Hemmung der Tumorzell-DNA-Synthese bei Oligonucleotidkonzentrationen mit einem recht geringen Wert von 30 mikromolar beobachtet; eine optimale Hemmung wurde jedoch bei Konzentrationen von mindestens 60 mikromolar im nachstehend beschriebenen Modellsystem beobachtet. Mit Hilfe der in der vorliegenden Anmeldung dargelegten Techniken sollte der Fachmann in der Lage sein, die optimale Konzentration zu bestimmen, die in einem gegebenen Fall angewandt werden sollte.
Nachdem die Knochenmarkzellen dem Oligonucleotid ausgesetzt und in einigen Fällen gezüchtet worden sind, wie es vorstehend beschrieben wurde, werden sie dem Transplantatempfänger infundiert, um die Hämatopoese wiederherzustellen.

Beispiel I

Das folgende Beispiel erläutert die Fähigkeit von p53-Antisense-Oligonucleotiden, die Proliferation von frischen humanen Myeloid-Leukämie- Zellen in einem Modellsystem, bei dem die Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin als ein Maß für die zelluläre Proliferation herangezogen wird, zu hemmen.
Das spezielle Oligonucleotid, das für die nachstehenden Versuche verwendet wurde, war ein 28 Basen umfassendes, Thiophosphat-modifiziertes Oligodesoxynucleotid, das komplementär zum AUG-Initiationskodon und den 25 Basen, die benachbart und 5' dazu angeordnet sind, war. Dieses Oligonucleotid weist die Sequenz GGTCTGACGGAAGGCCCAGTGACGGTAC auf und wird hier als Antisense-p53-ODN(1) bezeichnet.
Das entsprechende Sense-Oligodesoxynucleotid mit der Sequenz CCAGACTGCCTTCCGGGTCACTGCCATG wurde als eine Kontrolle verwendet. Dieses Oligodesoxynucleotid wird hier als Sense-p53-ODN(a) bezeichnet. Die Ohgodesoxynucleotide (ODN) wurden gemäß veröffentlichter Verfahren (Matsukura et al., Gene, Bd. 72 (1988), S. 343) bei Applied Biosystems, Inc., 777 Lincoln Center Drive, Foster City, Kalifornien, synthetisiert und gereinigt. Vor der Verwendung wurde die Oligonucleotidzubereitung (ODN-Zubereitung) in einer kleinen Menge von autoklaviertem destilliertem Wasser gelöst. Alpha-minimal-essentielles Medium (minus Nucleotide und Nudeoside) wurde dann zugegeben, um eine 100 mikromolare Stammlösung jedes der gewählten Oligonucleotide herzustellen. Die Stammlösungen wurden bei -70ºC gelagert.
Leukämische Blastenzellen wurden aus dem peripheren Blut von zwei Patienten mit akuter myelogener Leukämie mit hoher Blastenzahl erhalten. Normale Knochenmarkspezies wurden dann von zwei Spendern aus dem Darmbeinkamm nach Standardverfahren erhalten. Jeder Satz von Proben wurde 1:3 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung verdünnt, und die mononuclearen Zellen wurden durch eine Ficoll-Hypaque (d=1,077)-Zentrifugationsstufe isoliert. T-Lymphozyten wurden durch eine zweite Zentrifugation mit dem Dichtefraktioniermedium nach Rosettenbildung mit roten Blutzellen von Schafen entfernt, wie es bereits beschrieben wurde (Minden et al., Blood, Bd. 54 (1979), S. 186). Mehr als 95% der Patientenzellen, die nach der Entfernung der T-Lymphozyten erhalten wurden, wiesen eine Blastenmorphologie auf.
Vor dem Test in dem Assay zur Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin (³HTdR) wurden die normalen mononuclearen Knochenmarkzellen mit Wachstumsfaktoren für 3 Tage stimuliert, um sicherzustellen, daß eine maximale Anzahl an Zellen im Zyklus sein würde, wenn sie den ODNs ausgesetzt werden. Kurz gesagt wurden die Zellen in Gegenwart von Alpha-MEM, 20% fötalem Kälberserum und 10% 5637-Blasenzellkarzinomlinie-konditioniertem Medium (5637-CM) bei einer Anfangszelldichte von 5x10&sup5; Zellen pro ml gezuchtet. Das 5637-CM ist eine Quelle fur hämatopoetische Wachstumsfaktoren (unter Einschluß von IL-1, GM-CSF und G-CSF) und wurde hergestellt, wie es Hoang und McCulloch, Blood, Bd. 67 (1985), S. 748 beschrieben wurde. Die Kulturen wurden bei 37ºC in 5% CO&sub2; an der Luft inkubiert.
Bei einigen Versuchen wurden normale mononucleare Knochenmarkzellen oder leukämische Blastenzellen unter den gleichen Bedingungen für variable Zeitspannen in Gegenwart von ODNs gezüchtet. Anteile wurden zu verschiedenen Zeiten für den ³HTdR-Assay entnommen, um die Kinetik der Hemmung zu bestimmen.
Die zelluläre Proliferation wurde durch die ³HTdR-Aufnahme im wesentlichen so überwacht, wie es von McCulloch und Till, Blood, Bd. 49 (1977), S. 269 beschrieben wurde. Jede Variable wurde dreifach bestimmt. Leukämische Blasten oder normale mononucleare Knochenmarkzellen wurden zunächst in Alpha-MEM mit 10&sup7; Zellen pro ml suspendiert. Ein Anteil dieser Zellen erhielt 1000 rad über 0,56 Minuten aus einer Cäsiumquelle zur Verwendung als Kontrolle zur Bestimmung der Hintergrundzählraten. Sowohl bestrahlte als auch nicht-bestrahlte Zellen wurden in 96 Vertiefungen umfassenden Platten mit flachem Boden bei einer Dichte von 2 oder 1x10&sup5; Zellen in einem Volumen von 0,2 ml, das aus Alpha-MEM, 10% FCS und 10% 5637-CM (dialysiert, um Thymidin zu entfernen), bestand, gezüchtet. Weitere Kulturen von nicht-bestrahlten Zellen, die variierende Mengen an Antisense-p53-ODN(1) oder dem entsprechenden Sense-p53-ODN(1) enthielten, wurden unter den gleichen Bedingungen hergestellt. Die Kulturen wurden bei 37ºC in 5% CO&sub2; an der Luft für die angegebenen Zeitspannen inkubiert. Sie wurden dann einem Puls mit 1 Microcurie pro Vertiefung an ³HTdR für 4 Stunden ausgesetzt, und die Zellen wurden auf 2,4 cm-Whatman GF/C-Filtern unter Verwendung einer Saugnutsche geerntet. Die Filter wurden anschließend mit 50 ml Kochsalzlösung, 5% Trichloressigsäure in destilliertem Wasser und 95% Ethanol (Fisher) gespült. Die trockenen Filter wurden dann in Szintillationsfläschchen mit 5 ml Formula-963 (Du Pont)-Szintillationsflüssigkeit gegeben. Schließlich wurden die Zählraten bestimmt, und die Mittelwerte für jede Bedingung wurden unter Anwendung einer Einweganalyse der Varianz verglichen.
Bei einem anfänglichen Test des Systems wurden Blasten aus Patient Nr. 1 in Mikrovertiefungen für 18 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von 30 mikromolar Antisense-p53-ODN(1) inkubiert und dann hinsichtlich der Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin untersucht. Die in der nachstehenden Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß das Antisense-Oligonucleotid eine signifikante Hemmung der Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin hervorrief. Der mittlere CPM-Wert für die bestrahlten Zellen betrug 1234. Tabelle 1
Es wurde ein zweiter Versuch im wesentlichen so durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß die Konzentration an Antisense-p53-ODN(1) variiert wurde. In diesem Versuch (Tabelle 2) trat die Hemmung der Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin bei der höchsten untersuchten Konzentration an ODN auf. Der mittlere CPM-Wert für bestrahlte Zellen betrug 3802. Tabelle 2
N.S. = nicht signifikant verschieden von unbehandelter Kontrolle
In einem weiteren Versuch wurden Blasten aus Patient Nr. 1 für eine verlängerte Zeitspanne in Gegenwart oder Abwesenheit von 30 mikromolar Antisense-p53-ODN(1) gezüchtet, und es wurden periodisch Proben zur Untersuchung im ³HTdR-Assay entnommen (Tabelle 3). Am Ende von 7 Tagen wurden die Kulturen mit einem Umkehrphasenmikroskop untersucht. Alle Zellen in den Antisense-ODN-behandelten Kulturen waren tot und lösten sich auf. Obwohl die Kulturen für mehrere Tage fortgesetzt wurden, gab es weiterhin kein Anzeichen von lebensfähigen Zellen, und das Gewebekulturmedium behielt seine normale Farbe. Die Kontrollkultur blieb jedoch gesund und mußte am Tag 7 mit frischem Medium versorgt werden. Zu diesem Zeitpunkt hatte dieses Medium eine gelblich-orange Farbe angenommen, was ein Zeichen für einen aktiven Metabolismus der gezüchteten Zellen ist.
Es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin, die sich bei Kontrollkulturen zeigte, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Beginn der Kultur untersucht wurden. Bei der behandelten Gruppe war jedoch die Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin, die nach 24 Stunden Kultur beobachtet wurde, signifikant geringer als der Wert nach 8 Stunden (p< 0,001) oder der Wert nach 48 Stunden (p< 0,003). Der Wert nach 96 Stunden war signifikant geringer als der Wert nach 48 Stunden (p< 0,0003). Der mittlere CPM-Wert für bestrahlte Zellen betrug 1234. Die Ergebnisse der Zellzahlen sind in Tabelle 4 gezeigt. Die Masse der Zellen in einer frischen Leukämieprobe sind jedoch proliferativ inert; die Zellzahlen sind also kein sehr empfindliches Maß für die Zellproliferation. Tabelle 3 Patient Nr. 1 Mittlerer CPM-Wert/%Inhibition/P-Wert zu verschiedenen Zeiten in Stunden Tabelle 4
Ein dritter Versuch wurde unter Anwendung der gleichen Bedingungen, wie sie in dem vorstehend beschriebenen Versuch angegeben wurden, durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die untersuchten Leukämiezellen von einem anderen Spender (Patient Nr. 2) erhalten wurden und daß das Sense-ODN als eine zusätzliche Kontrolle verwendet wurde. Die Ergebnisse dieses Versuchs (Tabelle 5) zeigten, daß die Proliferation von Tumorzellen signifikant durch 30 bis 60 mikromolar Antisense-Oligonucleotid, nicht jedoch durch 60 mikromolar Sense-Oligonucleotid-Kontrolle, gehemmt wurde. Der mittlere CPM-Wert für bestrahlte Zellen betrug 3585. Tabelle 5
* a.s. = Antisense
s. = Sense
N.S. = nicht signifikant verschieden von der unbehandelten Kontrolle
Ein abschließender Versuch wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie es unmittelbar vorstehend beschrieben wurde. Bei diesem Versuch wurden die Leukämiezellen jedoch von einem zweiten Spender erhalten, und zwei normale Knochenmarkproben, die mit 5637-CM für 3 Tage (wie es in Abschnitt B beschrieben wird) stimuliert worden waren, wurden verwendet. Es wurde bereits gezeigt, daß leukämische Blastenzellen allgemein Dichteanforderungen > 2x10&sup5;/ml für ein fortgesetztes Wachstum zeigen (Hoang und Mcculloch, Leukemia Res., Bd. 10 (1986), S. 273. Ein Sense-p53-Oligodesoxynucleotid wurde als eine Kontrolle bei allen drei Sätzen von Kulturen eingeschlossen. Die normalen Knochenmarkkulturen wurden am Tag 7 durch Entfernung einer Hälfte des Kulturmediums und Zugabe eines halben Volumens an frischem Medium versorgt. Am Tag 10 wurde festgestellt, daß der größte Teil der leukämischen Blastenzellen in der Kultur, die das Antisense-Oligodesoxynucleotid, nicht jedoch das Sense-Oligodesoxynucleotid erhielt, abgestorben war, und zwar durch Beobachtung mit einem Phasenmikroskop und durch das Fehlen von Proliferation und Verbrauch des Kulturmediums. Keine der Behandlungen zeigte irgendeine signifikante Toxizität für normale Knochenmarkzellen, die für 10 Tage mit einer Versorgung beobachtet wurden, wie es vorstehend beschrieben wurde. Dieser Versuch bestätigte also die selektive Toxizität des Antisense-Oligodesoxynucleotids für maligne Zellen.
Über die Aufnahme von tritiummarkiertem Thymidin, die nach 24, 48 und 96 Stunden Kultur mit dem Sense- oder Antisense-Oligonucleotid für beide Sätze von Kulturen beobachtet wurde, wird in den nachstehenden Tabellen 6 und 7 berichtet; sie zeigt ebenfalls eine selektive Hemmung maligner Zellen durch die Antisense-Oligonucleotide. Tabelle 6 Mittlerer CPM-Wert/%Inhibition/P-Wert zu verschiedenen Zeiten in Stunden
* a.s. = Antisense
s. = Sense
N.S. = nicht signifikant verschieden von 0 mikromolar Tabelle 1 Normales Knochenmark Mittlere CPM-Werte für Spender 1 und 2 zu verschiedenen Zeiten in Stunden
a.s. = Antisense
s. = Sense
Nur mittlere Zählraten pro Minute sind angegeben, da zu jedem gegebenen Zeitpunkt keines der Ergebnisse signifikant verschieden von der unbehandelten Kontrolle war, mit der Ausnahme, daß bei 96 Stunden 30 mikromolar Sense-ODN signifikant höher war als die unbehandelte Kontrolle (p=0,012).

Beispiel 2

Das folgende vorhergesagte Beispiel beschreibt die Anwendung der Erfindung zur Reinigung von malignen Zellen aus Knochenmark bei einem ausgewählten Krebspatienten.
Knochenmark wird aus dem Darmbein eines Krebspatienten abgesaugt, und die mononucleare Zellfraktion wird durch Zentrifugation über einen Gradienten aus Ficoll-Hypaque (d=1,077) erhalten. Mononucleare Knochenmarkzellen werden mit einer Dichte von etwa 1x10&sup7; Zellen pro ml in einem Kulturmedium resuspendiert, das MEM (Gibco), angereichert mit einer Quelle für Wachstumsfaktoren (wie 5637-CM), 5x10&supmin;&sup6; Mol/l Hydrocortison-Hemisuccinat, 0,25 mg/ml Katalase, 2 mmol/l Mannit (alle drei von Sigma), 1% Natriumpyruvat-Lösung (100X), 1% Vitaminlösung (100x10,8% Aminosäurelösung), (50X), 0,4% nicht-essentielle Aminosäurelösung (200X), 1% L-Glutamin (200 mmol/l) (alle bezogen von Gibco), 12,5% Pferdeserum (Hydone), 12,5% FCS (Gibco) und 60 mikromolar Antisense-p53-ODN(1), umfaßt. Suspensionen werden in geeignete Kulturgefäße gegeben und bei 37ºC in 5% CO&sub2; an der Luft inkubiert. Die Kultur wird in geeigneten Abständen durch vollständigen Mediumaustausch und durch Entfernung eines Anteils der nichtanhaftenden Zellen, der der Menge des Wachstums entspricht, versorgt. Im allgemeinen wird die Kultur vor dem Ablauf von etwa 10 Tagen geerntet.
Als eine wahlweise Stufe können die Zellen am Ende der Kulturzeitspanne untersucht werden, um die Anzahl oder den Prozentsatz, sofern vorhanden, an malignen Zellen, die nach der Behandlung mit den Oligonucleotiden verbleiben, zu bestimmen. Geeignete Assayverfahren umfassen die Karyotyp-Analyse, bei der die malignen Zellen einen charakteristischen Karyotyp haben, wie das Philadelphia-Chromosom, oder die, die von Watson und Duff, Enzymology, Bd. 58 (1979), S. 322 und von Sloan et al., Br. J. Cancer, Bd. 44 (1981), S. 85 beschrieben werden.
Nach einer geeigneten Kulturdauer, um mindestens einen Hauptanteil der malignen Zellen aus der Marksuspension abzureichern (im allgemeinen etwa 10 Tage), werden die Zellen aus der Kultur geerntet und dem Empfänger infundiert, wie es bereits beschrieben wurde (Autologous Bone Marrow Transplantation, Dicke, Spitzer und Jagannath (Hrsg.), The University of Texas, M. D. Anderson Hospital and Tumor Institute, Houston, 1987). Als eine wahlweise Stufe kann der Patient eine ergänzende Therapie mit einer pharmazeutischen Zubereitung erhalten, die das gewählte Antisense-Oligonucleotid, das fur die Knochenmarkreinigung verwendet wird, enthält, oder alternativ mit einer zweiten Antisense-Oligonucleotid-Zubereitung.
Zusätzlich zu ihrer Eignung zur Entfernung von malignen Zellen aus Knochenmark vor der Transplantation können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die Antisense-Oligonucleotide umfassen, auch eine bedeutende klinische Anwendung als chemotherapeutische Mittel für die Behandlung einer Anzahl von Tumoren, z. B. unter Einschluß von gastrointestinalem Krebs, Brustkrebs und Blutkrebs, finden. Die Antisense-p53-Oligonucleotide können sich als besonders nützlich erweisen, wenn sie Empfängern von Antisense-p53-Oligonucleotid-gereinigten Knochenmarktransplantaten verabreicht werden.
Mehrere der nachstehend angegebenen Parameter stehen in Beziehung zur Auswahl der speziellen Oligonucleotidsequenz, die für die Reinigung von Knochenmark verwendet werden soll, und sie treffen auch für die Auswahl des speziellen Antisense-Oligonucleotids, das als chemotherapeutisches Mittel in vivo verwendet werden soll, zu. Wie bei den Antisense- Oligonucleotiden, die für die Knochenmarkreinigung verwendet werden, ist z. B. eine absolute Komplementarität in bezug auf die Targetgensequenz nicht erforderlich. Statt dessen wird ein Grad der Komplementarität, der ausreicht, um eine stabile Hybridisierung mit dem gewählten RNA-Target zu erlauben, als geeignet angesehen. Ferner können Oligonucleotide mit variierenden Längen eingesetzt werden; Oligonucleotide mit etwa 8 bis etwa 40 Basen sind jedoch bevorzugt. Das Antisense-Oligonucleotid kann zu praktisch jedem Abschnitt der Sequenz innerhalb des Targetgens komplementär sein, wobei jedoch Antisense-Oligonucleotide, die komplementär zum mitiationskodon und Basen, die sich in 5'-Richtung davon erstrecken, sind, bevorzugt sein mögen. Oligonucleotide, die komplementär zu RNA sind, die für p53 kodiert, sind besonders bevorzugt. Die vollständige Sequenz des p53-Gens, die von Lamb und Crawford, Molecular and Cellular Biology, Bd. 6 (1986), S. 1379-1385 angegeben und durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird, kann beim Entwurf von Antisense-Sequenzen, die sich für die Ausführung der Erfindung eignen, hilfreich sein. Die Sequenz GGTCTGACGGAAGGCCCAGTGACGGTAC ist jedoch bevorzugt.
Bei dem Antisense-Oligonucleotid, das für die Ausführung der Erfindung gewählt wird, kann es sich um ein beliebiges der Arten von Oligonucleotiden handeln, die von Stein und Cohen, Cancer Research, Bd. 48 (1988), S. 2569-2668 beschrieben werden und, ohne Beschränkung, nicht-modifizierte Oligodesoxynucleotide, Ethyl- oder Methylphosphonat-modifizierte Oligodesoxynucleotide, Thiophosphat-modifizierte Oligonucleotide, Dithioate sowie andere Oligonucleotid-Analoga unter Einschluß derjenigen, die Ribozymstrukturen enthalten, sowie Oligoribonucleotide, wie die, die von Inoue et al., Nucleic Acids Res., Bd. 15 (1987), S. 6131 beschrieben werden; und chimäre Oligonucleotide, die Verbund-RNA-DNA-Analoga sind (Inoue et al., FEBS Lett., Bd. 215 (1987), S. 327), umfassen. Oligonucleotide mit einem lipophilen Gerüst, z. B. Methylphosphonat-Analoga mit Ribozymstrukturen, mögen sich als vorteilhaft unter bestimmten Umständen erweisen; diese Moleküle haben eine längere Halbwertszeit in vivo, da die lipophile Struktur die Geschwindigkeit der renalen Clearance verringert, während die Ribozymstruktur die Spaltung der Target-RNA fördert (Gerlach, Nature, Bd. 334 (1988), S. 585).
Die Oligonucleotide können in pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert und unter Anwendung therapeutischer Pläne, die mit der speziellen Formulierung übereinstimmen, verabreicht werden. Wie weiter nachstehend beschrieben wird, sollten Fachleute auf dem Gebiet der Chemotherapie mit Hilfe der vorliegenden Offenbarung in der Lage sein, geeignete Dosierungen und Pläne für die Verabreichung für jede einer Anzahl geeigneter Zusammensetzungen, die die Verbindungen enthalten, abzuleiten. Pharmazeutische Zusammensetzungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung umfassen also Zusammensetzungen, bei denen der aktive Bestandteil in einer wirksamen Menge enthalten ist, um die Zellen des Krebses abzutöten, ohne eine nicht-akzeptable Toxizität für den Patienten hervorzurufen. Eine bevorzugte Dosierung umfaßt jedoch die, die ausreicht, um eine wirksame Blutkonzentration von etwa 10 bis 200 mikromolar zu erzielen. Vorstehend wurde zwar ein bevorzugter Bereich beschrieben; die Bestimmung der wirksamen Mengen für die Behandlung der einzelnen Arten von Tumoren können jedoch von den Fachleuten auf dem Gebiet der chemotherapeutischen Verabreichung bestimmt werden.
Zusätzlich zu den Antisense-Oligonucleotidverbindungen können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen eine Anzahl von geeigneten Excipienten und Hilfsstoffen enthalten, die die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Zubereitungen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Vorzugsweise werden die Zubereitungen für die parenterale Verabreichung entwickelt. Es wird jedoch angenommen, daß Zubereitungen, die für die orale oder rektale Verabreichung entwickelt werden, ebenfalls in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. Bevorzugte Zusammensetzungen umfassen etwa 0,1 bis etwa 1 Gew.-% des aktiven Bestandteils.
Geeignete Formulierungen für die parenterale Verabreichung umfassen wäßrige Lösungen der aktiven Verbindung in wasserlöslicher oder wasserdispergierbarer Form. Alternativ können Suspensionen der aktiven Verbindungen in geeigneten lipophilen Trägern verabreicht werden. Die Formulierungen können Substanzen enthalten, die die Viskosität erhöhen, z. B. Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit und/oder Dextran. Wahlweise kann die Formulierung auch Stabilisatoren enthalten.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Verbindungen eingekapselt in Liposomen verabreicht werden. Das Oligonucleotid kann, abhängig von seiner Löslichkeit, sowohl in der wäßrigen Schicht als auch in der Lipidschicht oder in dem, was allgemein als Liposomensuspension bezeichnet wird, vorhanden sein. Die hydrophobe Schicht umfaßt im allgemeinen, jedoch nicht ausschließlich, Phospholipide, wie Lecithin und Sphingomyelin, Steroide, wie Cholesterin, und mehr oder weniger ionische oberflächenaktive Stoffe, wie Diacetylphosphat, Stearylamin oder Phosphatidsäure und/oder weitere Materialien mit einer hydrophoben Beschaffenheit.

Claims

1. Zusammensetzung zur Behandlung eines an Krebs leidenden Menschen, wobei die Zusammensetzung ein Oligonucleotid mit einer Sequenz enthält, die komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die von einem Targetgen, das unter den für p53, abl und bcr/abl kodierenden Genen ausgewählt ist, transkribiert ist, wobei bei der Behandlung Knochenmarkzellen von einem an Krebs leidenden Menschen einer die Proliferation hemmenden Menge dieser Zusammensetzung ausgesetzt werden, um bevorzugt die Krebszellen unter den Knochenmarkzellen durch die Zusammensetzung abzutöten, bevor die Knochenmarkzellen der Person reinfundiert werden.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Krebs zusätzlich definiert ist als ein Krebs von Zellen des hämatopoetischen Systems.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Krebs um Leukämie handelt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Krebs um myeloide Leukämie handelt.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Krebs um ein Lymphom handelt.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Krebs um Brustkrebs handelt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Krebs um ein multiples Myelom handelt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Krebs um einen gastrointestinalen Krebs handelt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid ein geladenes Gerüst aufweist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid ein ungeladenes Gerüst aufweist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Oligonucleotid um ein Methylphosphonat-Oligonucleotid handelt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Oligonucleotid um ein Thiophosphat-Oligonucleotid handelt.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid mindestens 8 Basen umfaßt und komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die sich in 5'-Stellung zum Initiationskodon des Targets befindet.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid die folgende Sequenz umfaßt:

GGTCTGACGGAAGGCCCAGTGACGGTAC.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligonucleotid mindestens 8 Basen umfaßt und sich innerhalb von 40 Basen des Initiationskodons befindet.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die die Proliferation hemmende Menge 10-200 mikromolar beträgt.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Expositionsstufe folgendes umfaßt:

Fraktionieren der Knochenmarkzellen zum Erhalt einer mononuklearen Zellfraktion und

Züchten der mononuklearen Fraktion zusammen mit einer die Proliferation hemmenden Menge des Oligonucleotids für eine Zeitspanne von mindestens 1-10 Tagen.

18. Zusammensetzung, die bevorzugt humane Krebszellen in einem Gewebe, das sowohl Krebszellen als auch normale Zellen enthält, abtötet, wobei die Zusammensetzung eine Menge eines Oligonucleotids enthält, das eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die von einem Target, das unter für p53, abl oder bcr/abl kodierenden Genen ausgewählt ist, transkribiert ist, zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung von Krebs beim Menschen.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Krebszellen Zellen umfassen, die im Knochenmark vorliegen.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei der Krebs zusätzlich als Krebs von Zellen des hämatopoetischen Systems definiert ist.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Krebs um Leukämie handelt.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Krebs um myeloide Leukämie handelt.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Krebs um ein Lymphom handelt.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Krebs um Brustkrebs handelt.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Krebs um Lungenkrebs handelt.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Krebs um einen gastromtestinalen Krebs handelt.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Krebs um ein multiples Myelom handelt.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Oligonucleotid um ein Methylphosphonat-Oligonucleotid handelt.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Oligonucleotid um ein Thiophospat-Oligonucleotid handelt.

30. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das Oligonucleotid mindestens 8 Basen umfaßt und komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die sich in 5'-Stellung zum Initiationskodon des RNA-Transkripts befindet.

31. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das Oligonucleotid mindestens 8 Basen umfaßt und sich innerhalb von 40 Basen des Initiationskodons des RNA-Transkripts befindet.

32. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das Oligonucleotid die folgende Sequenz umfaßt:

GGTCTGACGGAAGGCCCAGTGACGGTAC.

33. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die letale hemmende Menge 30-200 mikromolar ist.

34. Pharmazeutische Zusammensetzung, die bevorzugt humane Krebszellen in einem Gewebe, das sowohl Krebszellen als auch normale Zellen enthält, abtötet, umfassend ein Oligonucleotid, das komplementär zu einer mRNA ist, die von dem für p53 kodierenden Gen transkribiert ist.

35. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das Oligonucleotid mindestens 8 Basen umfaßt und komplementär zu einer RNA-Sequenz ist, die sich in 5'-Stellung zum Initiationskodon des Gens befindet.

36. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das Oligonucleotid 8-49 Basen umfaßt.

37. Zusammensetzung nach Anspruch 34, umfassend 10-200 mikromolar Oligonucleotide.

38. Zusammensetzung nach Anspruch 34 oder 36, wobei es sich bei dem Oligonucleotid um ein Methylphosphonat-Oligonucleotid handelt.

39. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das Oligonucleotid ein geladenes Gerüst aufweist.

40. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das Oligonucleotid ein ungeladenes Gerüst aufweist.

41. Zusammensetzung nach Anspruch 34 oder 36, wobei es sich bei dem Oligonucleotid um ein Thiophosphat-Oligonucleotid handelt.

42. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das Oligonucleotid mindestens 8 Basen umfaßt und sich innerhalb von 40 Basen des Initiationskodons befindet.

43. Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das Oligonucleotid die folgende Sequenz umfaßt:

GGTCTGACGGAAGGCCCAGTGACGGTAC.

44. Pharmazeutische Zusammensetzung, die bevorzugt humane Krebszellen in einem Gewebe, das sowohl Krebszellen als auch normale Zellen enthält, abtötet, umfassend ein Oligonucleotid, das komplementär zu einer mRNA ist, die von den für abl oder bcr/abl kodierenden Genen transkribiert ist.