ES2283024T3 - Un nuevo receptor galanina. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO RECEPTOR DE GALANINA QUE SE HA DENOMINADO RECEPTOR 2 DE GALANINA. LA INVENCION SE REFIERE TANTO A UNA PROTEINA DEL RECEPTOR COMO A LOS ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LA PROTEINA. ADEMAS LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS Y A COMPOSICIONES BASADOS BIEN EN PROTEINAS DE GAL - R2 O EN ACIDOS NUCLEICOS.
Description
Un nuevo receptor galanina.
La presente invención pertenece al campo general
de los receptores biológicos y los diversos usos que pueden hacerse
de tales receptores. De modo más específico, la invención se refiere
a ácidos nucleicos que codifican un nuevo receptor galanina y la
proteína receptora propiamente dicha.
La galanina es un péptido neuroendocrino pequeño
(29-30 aminoácidos) que no pertenece a ninguna
familia de péptidos conocida (Bedecs et al., Int. J
Biochem. Cell. Biol. 27: 337-349 (1995)). La
misma está ampliamente distribuida en el sistema nervioso central y
otros tejidos, y se ha consignado que tiene un gran número de
actividades biológicas y farmacológicas diversas. Se ha consignado
que la galanina: (a) promueve la liberación de la hormona del
crecimiento (Bauer et al., The Lancet 2:
192-195 (1986)); (b) inhibe la liberación de
insulina inducida por glucosa (Ahren et al., FEBS
Lett, 299: 233-237 (1988)); (c) regula la
motilidad en el tracto gastrointestinal
(Fox-Thelkeld et al., Gastroenterology
101: 1471-1476 (1991)); (d) estimula el
comportamiento de alimentación (Crawley et al., J.
Neurosci 10: 3695-3700 (1990)); y (e) deteriora
la función cognitiva (Mastropaolo et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85: 9841-9845 (1988)).
De interés farmacológico particular son los
efectos analgésicos de la galanina (Post et al., Acta
Physiol. Scand. 132: 583-584 (1988)). En la
médula espinal, la galanina inhibe los reflejos nociceptivos y
potencia el efecto analgésico de la morfina
(Wiesenfeld-Hallin et al., Neurosci. Lett.
105: 149-154 (1989)). La administración
direccionada de galanina hiperpolariza las neuronas de las astas
dorsales y se ha consignado que la administración crónica de un
antagonista del receptor galanina después de axotomía aumenta
notablemente la autonomía en las ratas (Verge et al.,
Neurosci. Lett. 149: 193-197 (1993)). Estas
observaciones indican que la galanina, como la morfina, ejerce
acciones anti-nociceptivas potentes in vivo.
Así pues, los efectos farmacológicos conocidos de la galanina
sugieren potenciales aplicaciones terapéuticas como anestésico o
analgésico en animales y humanos.
La galanina ejerce sus efectos por fijación a
receptores fijados a la membrana. El cDNA para uno de tales
receptores ("GAL-R1") ha sido clonado a partir
tanto de humanos como de ratas (Habert-Ortoliet
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
9780-9783 (1994); Burgevin et al., J. Mol.
Neurosci. 6: 33-41 (1995)). Se han encontrado
niveles altos de mRNA de GAL-R1 de rata en el
hipocampo ventral, el tálamo, la amígdala y la médula oblonga del
cerebro y en las astas dorsales de la médula espinal (Burgevin et
al., supra). Datos farmacológicos obtenidos utilizando
fragmentos de galanina, agonistas y antagonistas han sugerido que
más de un tipo de receptor puede ser responsable de las acciones de
la galanina (para una revisión, véase Valkna et al.,
Neurosci. Lett. 187: 75-78 (1995)). El
aislamiento y la caracterización de nuevos receptores para galanina
serían sumamente deseables para ayudar al descubrimiento y
desarrollo de agentes terapéuticos para alterar la actividad de la
galanina in vivo.
La presente invención está basada en el
descubrimiento de un nuevo receptor galanina
("GAL-R2") que es distinto de los receptores
consignados previamente en términos de estructura, distribución
tisular y características de fijación. Receptores tanto de rata
como humanos han sido aislados y secuenciados. Tal como se utiliza
en esta memoria, el término "GAL-R2" hace
referencia al receptor de una cualquiera de estas especies a no ser
que el texto, expresamente o por contexto, indique otra cosa.
En su primer aspecto, la invención está dirigida
a proteínas, exenta esencialmente s de componentes contaminantes
celulares, que comprenden la secuencia de aminoácidos de
GAL-R2 humano (como se muestra en la figura 2). La
invención comprende adicionalmente anticuerpos que se fijan
específicamente a GAL-R2 (es decir, que tienen al
menos una afinidad 100 veces mayor para GAL-R2 que
cualquier otra proteína) y anticuerpos producidos por un proceso
que implica la inyección de preparaciones farmacéuticamente
aceptables de tales proteínas en un animal capaz de producción de
anticuerpos. En una realización preferida, se produce un anticuerpo
monoclonal para GAL-R2 por inyección de la
preparación farmacéuticamente aceptable de GAL-R2 en
un ratón y fusión subsiguiente de células del bazo del ratón con
células de mieloma.
La invención está dirigida también a un
polinucleótido, sustancialmente exento de componentes contaminantes
celulares, que codifica una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos de la secuencia de GAL-R2 humano (como
se muestra en la figura 2). Este aspecto de la invención abarca
polinucleótidos que codifican proteínas constituidas por las
secuencias de aminoácidos que se muestran en las figuras, vectores
de expresión que comprenden tales polinucleótidos, y células
hospedadoras transformadas con dichos vectores. Se incluyen también
las proteínas recombinantes humanas GAL-R2
producidas por las células hospedadoras producidas de esta manera.
Preferiblemente, el polinucleótido que codifica
GAL-R2 humano tiene la secuencia de nucleótidos que
se muestra en la figura 2. Se prefiere también que los vectores y
células hospedadoras utilizados para la expresión de
GAL-R2 utilicen estos polinucleótidos
particulares.
En otro aspecto, la presente invención está
dirigida a un método para ensayar un compuesto de test respecto a
su capacidad para fijarse a GAL-R2. El método se
lleva a cabo por incubación de una fuente de GAL-R2
con un ligando conocido por fijarse al receptor y con el compuesto
de test. La fuente de GAL-R2 debería estar
sustancialmente exenta de otros tipos de receptores galanina, es
decir, más del 90% de los receptores galanina presentes deberían
corresponder a GAL-R2. Una vez completada la
incubación, la capacidad del compuesto de test para fijarse a
GAL-R2 se determina por el grado en el que se ha
desplazado la fijación de ligando. Una fuente preferida de
GAL-R2 para uso en el ensayo es una célula
transformada con un vector para expresar el receptor y que
comprende un polinucleótido que codifica una proteína constituida
por la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2
(GAL-R2 humano). En lugar de utilizar células en el
ensayo, puede prepararse una preparación de membrana a partir de
las células y puede utilizarse ésta como la fuente de
GAL-R2. Aunque no es esencial, el ensayo puede ir
acompañado por la determinación de la activación de un camino de
segundo mensajero tal como el camino de la
adenil-ciclasa. Esto debería ayudar a determinar si
un compuesto que se fija a GAL-R2 está actuando
como agonista o antagonista para la galanina.
En otro aspecto, la presente invención está
dirigida a un método para ensayar un compuesto de test respecto a
su capacidad para alterar la expresión de GAL-R2.
Este método se lleva a cabo cultivando células que expresan
GAL-R2, pero sustancialmente exentas de otros
receptores galanina, en presencia del compuesto de test. Las
células se recogen luego y se compara la expresión de
GAL-R2 con la expresión en células de control que se
han desarrollado en condiciones esencialmente idénticas pero en
ausencia del compuesto de test. En realizaciones preferidas, las
células que expresan GAL-R2 son células
transformadas con un vector de expresión que comprende una
secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína constituida
por la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 2
(GAL-R2 humano). Un compuesto de test preferido es
un oligonucleótido de al menos 15 nucleótidos de longitud y que
comprende una secuencia complementaria a una secuencia representada
en SEQ ID NO:3. El método preferido para determinar la expresión
del receptor es por medio de un ensayo de fijación de
receptores.
Figura 1: Se muestra la secuencia de nucleótidos
compuesta y la secuencia de aminoácidos traducida correspondiente
(en código de una sola letra) de GAL-R2 de rata. La
secuencia de ácido nucleico ha recibido la designación SEQ ID
NO:1, y la secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO:2.
Figura 2: Se muestra la secuencia de nucleótidos
compuesta y la secuencia de aminoácidos traducida correspondiente
(en código de una sola letra) de GAL-R2 humano. La
secuencia de ácido nucleico ha recibido la designación SEQ ID
NO:3, y la secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO:4.
Figura 3: Se han alineado las secuencias de
aminoácidos de GAL-R2 de rata (RGALR2.PRO),
GAL-R1 de rata (rGALR1-PRO),
GAL-R2 humano (HGALR2.PRO) y GAL-R1
humano (hGALR1.PRO) para mostrar las regiones de homología. Se han
encuadrado los residuos en la secuencia de HGAL-R2
que están compartidos con otras secuencias. Con objeto de optimizar
la alineación, se han creado lagunas en varios lugares en las
secuencias de GAL-R2, indicándose estas lagunas por
recuadros negros. La secuencia de rGALR1.PRO ha sido designada como
SEQ ID NO:5, y la secuencia hGALR1.PRO como SEQ ID NO:6.
Figura 4: Se muestra la isoterma de saturación
de la fijación de ^{125}I-galanina a las membranas
de células HEK-293 que expresan
GAL-R2. Se incubaron concentraciones crecientes de
radiotrazador con las membranas, se dejó que la fijación alcanzara
el equilibrio, y posteriormente la se filtró mezcla de reacción como
se describe en el Ejemplo 3. Se midió la fijación inespecífica en
presencia de 1 \muM de galanina sin marcar y se sustrajo de la
fijación total para obtener la fijación específica.
Figura 5: La figura 4 muestra los resultados de
ensayos de fijación en los cuales se dejaron competir galanina sin
marcar y péptidos afines a galanina con galanina marcada por sitios
de GAL-R2. Los datos se han convertido en
porcentajes, sirviendo la fijación en ausencia de competidor como
100%. No se observó inhibición alguna cuando los ensayos de
fijación se realizaron en presencia de péptidos no afines a
galanina.
Figura 6: La galanina atenuaba la estimulación
de adenil-ciclasa por la forskolina de una manera
dependiente de la dosis en células HEK-293 que
expresaban GAL-R2. El panel A muestra el nivel basal
de cAMP en células no tratadas con forskolina ni galanina (C); el
efecto de galanina 1 \muM (G); el efecto de forskolina 0,1 mM
(F); y el efecto de galanina 1 \muM + forskolina 0,1 mM (F+G). En
el panel B, las células se incubaron en presencia de forskolina 0,1
mM sola o en presencia de forskolina con diversas concentraciones de
galanina. El cAMP intracelular se extrajo luego y se midió por
inmunoensayo enzimático como se describe en el Ejemplo 4. Los
resultados se expresan como porcentajes, donde 100% es el valor
obtenido en presencia de forskolina sola.
La descripción que sigue utiliza varios términos
que hacen referencia a la tecnología del DNA recombinante. Con
objeto de proporcionar una comprensión clara y consistente de la
memoria descriptiva y las reivindicaciones, con inclusión del
alcance que debe adscribirse a dichos términos, se proporcionan las
definiciones siguientes:
Vector de clonación: Un DNA de plásmido o
fago u otra secuencia de DNA que es capaz de replicarse
autónomamente en una célula hospedadora, y que se caracteriza por
uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de
endonucleasas de restricción. Un fragmento de DNA extraño puede
someterse a corte y empalme en el vector en estos sitios a fin de
causar la replicación y clonación del fragmento. El vector puede
contener un marcador adecuado para uso en la identificación de
células transformadas. Por ejemplo, los marcadores pueden
proporcionar resistencia a la tetraciclina o resistencia a la
ampicilina.
Vector de expresión: Un vector similar a
un vector de clonación pero que es capaz de inducir la expresión
del DNA que se ha clonado en él, después de transformación en un
hospedador. El DNA clonado está puesto usualmente bajo el control
de (es decir, está enlazado operativamente a) ciertas secuencias
reguladoras tales como promotores o intensificadores. Las
secuencias promotoras pueden ser constitutivas, inducibles o
reprimibles.
Sustancialmente puro: Tal como se utiliza
en esta memoria, "sustancialmente puro" significa que el
producto deseado está exento esencialmente de componentes
contaminantes celulares. Los contaminantes pueden incluir, pero sin
carácter limitante, proteínas, carbohidratos o lípidos. Un método
para determinar la pureza de una proteína o ácido nucleico consiste
en someter a electroforesis una preparación en una matriz tal como
poliacrilamida o agarosa. La pureza se evidencia por la aparición
de una sola banda después de la tinción.
Hospedador: Cualquier célula procariota
o eucariota que es el destinatario de un vector de expresión o
vector de clonación replicable es el "hospedador" para dicho
vector. El término abarca células procariotas o eucariotas que se
han modificado por ingeniería genética para incorporar un gen
deseado en su cromosoma o en su genoma. Ejemplos de células que
pueden servir como hospedadores son bien conocidos en la técnica,
dado que son métodos para transformación celular (véase v.g.
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
segunda edición. Cold Spring Harbor (1989)).
Promotor: Una secuencia de DNA que se
encuentra típicamente en la región 5' de un gen, localizada en
situación proximal al codón de comienzo. La transcripción se inicia
en el promotor. Si el promotor es del tipo inducible, entonces la
velocidad de transcripción aumenta en respuesta a un agente
inductor.
Secuencia de Nucleótidos Complementaria:
Una secuencia de nucleótidos complementaria, como se utiliza en esta
memoria, hace referencia a la secuencia que se produciría por
apareamiento normal de bases. Por ejemplo, la secuencia de
nucleótidos 5'-AGAC-3' tendría la
secuencia complementaria
5'-GTCT-3'.
Expresión: La expresión es el proceso por
el cual se produce un polipéptido a partir de DNA. El proceso
implica la transcripción del gen en mRNA, y la traducción de este
mRNA en un polipéptido.
La presente invención está dirigida a las
proteínas receptoras de GAL-R2, secuencias genéticas
que codifican los receptores, un método para ensayar compuestos
respecto a fijación a GAL-R2 y un método para
ensayar compuestos por su capacidad para alterar la expresión de
GAL-R2. Los receptores y sus ácidos nucleicos se
definen por sus estructuras (como se muestran en las figuras 1 y 2)
así como por su distribución tisular y características de
fijación.
fijación.
Con respecto a la estructura, se comprenderá que
la presente invención abarca no sólo secuencias idénticas a las que
se muestran en las figuras, sino también secuencias que son
esencialmente iguales y secuencias que son de otro modo
sustancialmente iguales y que dan como resultado un receptor que
retiene las características de fijación básicas de
GAL-R2. Por ejemplo, es bien sabido que pueden
utilizarse técnicas tales como la mutagénesis orientada para
introducir variaciones en la estructura de una proteína. Las
variaciones en GAL-R2 introducidas por este método
o un método similar están abarcadas por la invención con la
condición de que el receptor resultante retenga la capacidad para
fijarse específicamente a galanina o péptidos semejantes a galanina.
Así, la invención se refiere a proteínas que comprenden secuencias
de aminoácidos constituidas por la secuencia de SEQ ID NO:4
(humana).
Secuencias de DNA codificantes de
GAL-R2 están presentes en una diversidad de tejidos,
cualquiera de los cuales puede servir como fuente para el
aislamiento de ácido nucleico codificante del receptor. En las
ratas, los tejidos de la médula espinal y del cerebro se encuentran
entre las fuentes preferidas, siendo especialmente preferidos los
ganglios dorsales de la médula espinal y el hipocampo, los cuerpos
mamilares y el cerebelo del cerebro. Adicionalmente, células y
líneas de células que expresan GAL-R2 pueden servir
como fuente para ácido nucleico. Éstas pueden ser células
cultivadas que no han sido sometidas a transformación o líneas de
células modificadas específicamente por ingeniería genética para
expresar GAL-R2 recombinante.
Están disponibles muchos métodos para aislar
secuencias de DNA, los cuales pueden adaptarse para el aislamiento
de ácido nucleico de GAL-R2 (véase por ejemplo
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
segunda edición, Cold Spring Harbor Press (1989)). Un método
preferido para GAL-R2 de rata, ilustrado en el
Ejemplo 1, consiste en escrutar una genoteca de cDNA que se ha
preparado por transcripción inversa de mRNA aislado de tejidos o
células que se sabe expresan GAL-R2. La genoteca
puede prepararse a partir, por ejemplo, de ganglios de raíz dorsal
o de tejido cerebral de la rata. Se ha encontrado que una genoteca
de cDNA de médula espinal del tallo cerebral de rata en ZAP II
produce resultados adecuados. Un método similar puede utilizarse
para GAL-R2 humano o, alternativamente, puede
escrutarse una genoteca de DNA humano como se describe en el Ejemplo
7.
Se espera que una gran diversidad de sondas
específicas para GAL-R2 puedan utilizarse de modo
igualmente satisfactorio para el escrutinio de genotecas de cDNA.
Una vía para producir fácilmente una gran cantidad de muestra
consiste en utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
para amplificar la secuencia deseada a partir de una genoteca de
cDNA. Por ejemplo, puede realizarse una PCR sobre una genoteca de
cDNA de ganglios de la raíz dorsal de la rata utilizando los
iniciadores:
La letra "I" en las secuencias anteriores
es la abreviatura de inosina.
Los fragmentos amplificados pueden fraccionarse
por tamaños en un gel de agarosa e insertarse los fragmentos
seleccionados (v.g., fragmentos de 400-1000 pares de
bases de longitud) en un vector apropiado (v.g.,
pGEM-T). El vector puede introducirse en células
competentes (v.g., células DH5) por cualquiera de los métodos
establecidos para transformación de células, v.g., por
precipitación con fosfato de calcio. Las células transformadas que
contienen el DNA de interés pueden identificarse realizando
nuevamente una PCR con los iniciadores TM2 y TM7. Las inserciones
de DNA presentes en estas células se cortan, se purifican y se lavan
con ^{32}P. Los fragmentos de DNA marcados así producidos se
utilizan como sondas para escrutar una genoteca de cDNA respecto a
GAL-R2. La presencia de la secuencia correcta en
las células seleccionadas puede confirmarse por secuenciación del
DNA y, en caso necesario, los clones parciales pueden someterse
juntos a corte y empalme para formar una secuencia de longitud
total.
Aunque se sabe que el procedimiento anterior es
adecuado para obtener ácido nucleido de GAL-R2, se
espera que puedan desarrollarse técnicas alternativas con
relativamente poco esfuerzo. Así pues, pueden escrutarse genotecas
de cDNA utilizando sondas sintetizadas sobre la base de la secuencia
de GAL-R2 representada en la figura 1 para ratas y
la representada en la figura 2 para humanos. En general, las sondas
deberían tener una longitud de al menos 14 nucleótidos y no
deberían seleccionarse de regiones que se sepa están altamente
conservadas entre las proteínas, v.g., los dominios
transmembranales de los receptores enlazados a proteínas G.
Alternativamente, utilizando las secuencias representadas en las
figuras, debería ser posible seleccionar iniciadores PCR que
amplifiquen la secuencia de longitud total de
GAL-R2. Las mismas técnicas que han resultado
satisfactorias en la rata y en humanos pueden utilizarse asimismo
para obtener secuencias de GAL-R2 para otras
especies.
Con objeto de expresar GAL-R2
recombinante, la secuencia estructural para la proteína arriba
descrita deben ponerse en un vector que contenga señales de
transcripción y traducción reconocibles por un hospedador apropiado.
Las secuencias GAL-R2 clonadas, preferiblemente en
forma bicatenaria, se insertan en el vector de expresión en un
enlace operativo, es decir, las mismas se posicionan de tal modo que
se encuentren bajo el control de las secuencias reguladoras del
vector y de tal manera que se produce mRNA que se traduce en la
secuencia de aminoácidos de
GAL-R2.
GAL-R2.
La expresión de la proteína del receptor
GAL-R2 en hospedadores diferentes puede dar como
resultado modificaciones diferentes posteriores a la traducción que
pueden, potencialmente, alterar las propiedades del receptor.
Preferiblemente, el ácido nucleico codificante de
GAL-R2 se expresa en células eucariotas,
especialmente células de mamífero. Estas células proporcionan
modificaciones posteriores a la traducción que, inter alia,
ayudan al plegamiento correcto de la proteína receptora. Ejemplos
de un vector apropiado,
pCDNA3-GAL-R2, y hospedador, células
HEK293, se dan en el Ejemplo 2.
Otras células de mamífero que pueden utilizarse
incluyen, sin limitación, células NIH-3T3, células
CHO, células HeLa, células LM(tk-), etc. Vectores adecuados
para uso en cada uno de estos diversos tipos de células son bien
conocidos en la técnica (véase, v.g., Sambrook et al.,
supra). Promotores eucariotas preferidos incluyen el del gen
metalotioneína I de ratón; el promotor TK del virus del Herpes; el
promotor precoz de SV40; y el promotor del gen de levadura GAL4.
Algunos ejemplos de promotores de procariotas adecuados incluyen los
capaces de reconocer las polimerasas T4, los promotores P_{R} y
P_{L} del bacteriófago lambda, y los promotores trp, recA, de
choque térmico y lacZ de E. coli.
Pueden introducirse vectores de expresión en
células hospedadoras por métodos tales como precipitación con
fosfato de calcio, microinyección o electroporación. Las células que
expresan el receptor GAL-R2 pueden seleccionarse
utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Un método simple
para confirmar la presencia del ácido nucleico del receptor en
células consiste en realizar la amplificación por PCR utilizando los
procedimientos e iniciadores arriba indicados. La presencia del
receptor funcional puede confirmarse por realización de ensayos de
fijación utilizando galanina marcada.
Una vez que las células productoras del receptor
GAL-R2 recombinante han sido identificadas, pueden
utilizarse las mismas en ensayos de fijación o en ensayos diseñados
para identificar agentes capaces de alterar la expresión de
GAL-R2. Alternativamente, pueden aislarse las
membranas de las células y utilizarse en ensayos de fijación del
receptor.
La presente invención está dirigida también a
anticuerpos que se fijan específicamente a GAL-R2 y
a un proceso para producir tales anticuerpos. Los anticuerpos que
"se fijan específicamente a GAL-R2" se definen
como aquéllos que tienen una afinidad al menos 100 veces mayor para
GAL-R2 que para GAL-R1 y cualquier
proteína no desnaturalizada que no se fije a galanina. El proceso
para producir tales anticuerpos puede implicar inyección de la
proteína GAL-R2 propiamente dicha en un animal
apropiado o, preferiblemente, inyección de péptidos cortos
producidos que corresponden a regiones diferentes de
GAL-R2. Los péptidos debían tener una longitud de al
menos 5 aminoácidos y deberían seleccionarse de regiones que se
cree son exclusivas de la proteína GAL-R2. Así,
deberían evitarse por lo general regiones transmembranales
altamente conservadas en la selección de los péptidos para la
generación de anticuerpos. Métodos para producir y detectar
anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica como
se pone de manifiesto por trabajos estándar de referencia tales
como: Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988)); Klein, Immunology: The
Science of Self-Nonself Discrimination (1982);
Kennett, et al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New
Dimension in Biological Analyses (1980); y Campbell, "Monoclonal
Antibody Technology", en Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology, (1984)).
"Anticuerpo", tal como se utiliza en esta
memoria, tiene por objeto incluir moléculas intactas así como
fragmentos que retienen su capacidad para fijarse a un antígeno
(v.g., los fragmentos Fab y F(ab)_{2}. Estos
fragmentos se producen típicamente por escisión proteolítica de
anticuerpos intactos utilizando enzimas tales como papaína (para
producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos
F(ab)_{2}). El término "anticuerpo" se refiere
también tanto a anticuerpos monoclonales como a anticuerpos
policlonales. Los anticuerpos policlonales se derivan de los sueros
de animales inmunizados con el antígeno. Los anticuerpos
monoclonales se pueden preparar utilizando tecnología de hibridoma
(Kohler, et al., Nature 256: 495 (1975); Hammerling,
et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell
Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)). En
general, esta tecnología implica inmunizar un animal, usualmente un
ratón, con GAL-R2 intacto o un fragmento derivado de
GAL-R2. Los esplenocitos de los animales
inmunizados se extraen y se fusionan con células de mieloma
adecuadas, v.g., células SP_{2}O. Después de la fusión, las
células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en
medio HAT y se clonan luego por dilución limitante (Wands, et
al., Gastroenterology 80: 225-232
(1981)). Las células obtenidas por dicha selección se ensayan luego
para identificar los clones que secretan anticuerpos capaces de
fijarse a GAL-R2.
Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, de
la presente invención pueden utilizarse para detectar la presencia
de la proteína GAL-R2 utilizando cualquiera de una
diversidad de inmunoensayos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden
utilizarse en radioinmunoensayos o ensayos inmunométricos, conocidos
también como ensayos de "dos sitios" o "sándwich" (véase
Chard, T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related
Techniques", en Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)). En
un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo sin
marcar se fija a un soporte sólido que es insoluble en el fluido
que se ensaya, v.g., sangre, linfa, extractos celulares, etc.
Después de la fijación inicial del antígeno al anticuerpo
inmovilizado, se añade una cantidad de segundo anticuerpo marcado
detectablemente (que puede ser o no el mismo que el primero) para
permitir la detección y/o cuantificación del antígeno fijado (véase
v.g. Radioimmune Assay Method, Kirkham et al., e.d., pp.
199-206, E & S. Livingstone, Edimburgo (1970)).
Muchas variaciones de estos tipos de ensayos se conocen en la
técnica y pueden emplearse para la detección de
GAL-R2.
Los anticuerpos para GAL-R2
pueden utilizarse también en la purificación del receptor intacto o
fragmentos del receptor (véase en líneas generales, Dean et
al., Affinity Chromatography, A Practical Approach, IRL Press
(1986)). Típicamente, el anticuerpo se inmoviliza en una matriz
cromatográfica tal como Sepharose 4B. La matriz se empaqueta luego
en una columna y la preparación que contiene GAL-R2
se pasa a su través en condiciones que promueven la fijación, v.g.,
en condiciones de baja concentración de sal. La columna se lava
luego, y el GAL-R2 fijado se eluye utilizando un
tampón que promueve disociación del anticuerpo, v.g., un tampón que
tiene un pH o concentración de sal alterados. El
GAL-R2 eluido puede transferirse a un tampón de
elección, v.g., por diálisis, y guardarse o utilizarse
directamente.
Uno de los usos principales para los ácidos
nucleicos y proteínas recombinantes GAL-R2 es en
ensayos diseñados para identificar agentes, distintos de galanina,
capaces de fijarse a los receptores GAL-R2. Tales
agentes pueden ser agonistas, que mimetizan los efectos de
galanina, o antagonistas, que inhiben los efectos de galanina. De
particular interés es la identificación de agentes que se fijan a
los receptores GAL-R2 y modulan la actividad de
adenil-ciclasa en las células. Estos agentes tienen
aplicación terapéutica potencial como analgésicos o
anestésicos.
Un ejemplo de un ensayo que puede utilizarse
para detectar compuestos que se fijan a GAL-R2 se
presenta en el Ejemplo 4. La característica esencial de este ensayo
es que una fuente de GAL-R2 se incuba junto con un
ligando conocido que se fija al receptor y con el compuesto que se
ensaya en cuanto a actividad de fijación. La fuente preferida para
GAL-R2 son células, preferiblemente células de
mamífero, transformadas para expresar recombinantemente el
receptor. Las células seleccionadas no deberían expresar una
cantidad sustancial de ningún otro receptor que fije galanina,
v.g., GAL-R1. Esto puede determinarse fácilmente por
realización de ensayos de fijación de galanina en células derivadas
del mismo tejido o línea de células que las que expresan
recombinantemente GAL-R2 pero que no han sufrido
transformación.
El ensayo puede realizarse con células intactas
o, preferiblemente, con membranas preparadas a partir de las
células (véase v.g. Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90: 10230-10234 (1993)). Las membranas se
incuban con un ligando específico para los receptores galanina y
con una preparación del compuesto que se ensaya. Una vez completada
la fijación, se separa el receptor de la solución que contiene
ligando y compuesto de test, v.g. por filtración, y se determina la
cantidad de fijación que se ha producido. Preferiblemente, el
ligando utilizado es galanina marcada detectablemente con un
radioisótopo tal como ^{125}I. No obstante, si se desea, pueden
utilizarse en su lugar marcadores fluorescentes o
quimioluminiscentes. Entre los compuestos marcadores fluorescentes
utilizados más comúnmente se encuentran isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina,
o-ftaldehído y fluorescamina. Compuestos
quimioluminiscentes útiles incluyen luminol, isoluminol, éster de
acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio, y éster oxalato.
Cualquiera de estos agentes que pueden utilizarse para marcar
detectablemente galanina producirá un ligando adecuado para uso en
el ensayo.
La fijación inespecífica puede determinarse por
realización de la reacción de fijación en presencia de un gran
exceso de ligando sin marcar. Por ejemplo, puede incubarse
^{125}I-galanina con receptor y compuesto de test
en presencia de un exceso de 1000 veces de galanina sin marcar. La
fijación inespecífica debe restarse de la fijación total, es decir
la fijación en ausencia de galanina sin marcar, para llegar a la
fijación específica para cada muestra ensayada. Otros pasos tales
como lavado, agitación, sacudidas, filtración y análogos pueden
incluirse en los ensayos en caso necesario. Típicamente, se incluyen
pasos de lavado después de separar el ligando fijado a la membrana
del ligando que permanece en solución y antes de la cuantificación
de la cantidad de ligando fijado, v.g., por recuento del isótopo
radioactivo. La fijación específica obtenida en presencia del
compuesto de test se compara con la obtenida en presencia del
ligando marcado solo para determinar el grado en que el compuesto
de test ha desplazado la galanina.
En la realización de los ensayos de fijación,
debe tenerse cuidado a fin de evitar artefactos que pueden aparentar
que un compuesto de test está interaccionando con el receptor
GAL-R2 cuando, de hecho, la fijación está siendo
inhibida por algún otro mecanismo. Por ejemplo, el compuesto que se
ensaya debería encontrarse en un tampón que no inhiba por sí mismo
sustancialmente la fijación de galanina a GAL-R2 y,
preferiblemente, debería ensayarse a varias concentraciones
diferentes. Las preparaciones del compuesto de test deberían
examinarse también respecto a actividad proteolítica, y es deseable
que se incluyan antiproteasas en los ensayos. Finalmente, es muy
deseable que los compuestos identificados como desplazantes de la
fijación del ligando al receptor GAL-R2 se
re-examinen en un intervalo de concentraciones
suficiente para realizar un análisis Scatchard de los resultados.
Este tipo de análisis es bien conocido en la técnica y puede
utilizarse para determinar la afinidad de un compuesto de test para
el receptor (véase, v.g., Ausubel, et al., Current Protocols
in Molecular Biology, 11.2.1-11.2.19 (1993);
Laboratory Techniques and Biochemistry and Molecular Biology, Work,
et al., ed. N.Y. (1978), etc.). Pueden utilizarse programas
de ordenador para ayudar al análisis de los resultados (véase v.g.,
Munson, P., Methods Enzymol. 92: 543-577
(1983); McPherson, G.A., Kinetic, EBDA Ligand,
Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis
Programs, Elsevier-Biosoft, Reino Unido (1985)). Un
ejemplo de los tipos de curvas que pueden obtenerse utilizando este
método se muestra en la figura 5, y ejemplos de constantes
inhibidoras para péptidos afines a galanina determinados utilizando
ensayos de fijación se muestran en la Tabla 1.
La activación de un camino de segundo mensajero
puede examinarse realizando ensayos de
adenil-ciclasa para compuestos que han sido
identificados por fijarse al receptor GAL-R2. Estos
ensayos pueden llevarse a cabo como se expone en el Ejemplo 5 o
utilizando cualquier otro método para determinar la concentración de
cAMP. Típicamente, los ensayos de adenil-ciclasa se
realizarán por separado de los ensayos de fijación, pero también
puede ser posible realizar los ensayos de fijación y de
adenil-ciclasa sobre una misma preparación de
células.
Una vía para aumentar o disminuir los efectos
biológicos de la galanina consiste en alterar el grado en que se
expresa GAL-R2 en las células. Por esta razón, los
ensayos para la identificación de compuestos que inhiban o aumenten
la expresión presentan un interés considerable. Estos ensayos se
llevan a cabo cultivando células que expresan
GAL-R2 en presencia de un compuesto de test y
comparando luego la expresión del receptor en estas células con
células cultivadas en condiciones esencialmente idénticas pero en
ausencia del compuesto de test. Como en los ensayos de fijación
expuestos anteriormente, es deseable que las células utilizadas
estén sustancialmente exentas de receptores para galanina distintos
de GAL-R2. El análisis Scatchard de los ensayos de
fijación realizados con galanina marcada puede utilizarse para
determinar el número de receptores. Los ensayos de fijación pueden
llevarse a cabo como se ha expuesto anteriormente en la sección IV y
utilizarán preferiblemente células que han sido modificadas por
ingeniería genética para expresar recombinantemente
GAL-R2 como se describe en las secciones I y II.
Un grupo preferido de compuestos de test para
inclusión en el ensayo de expresión de GAL-R2 está
constituido por oligonucleótidos complementarios para diversos
segmentos de la secuencia de ácido nucleico de
GAL-R2. Estos oligonucleótidos deberían tener al
menos una longitud de 15 bases y deberían derivarse de regiones no
conservadas de la secuencia de ácido nucleico del receptor.
Oligonucleótidos que se ha encontrado reducen la
expresión del receptor pueden derivatizarse o conjugarse a fin de
aumentar su eficacia. Por ejemplo, pueden emplearse
nucleósido-fosforotioatos en sustitución de sus
homólogos naturales (véase Cohen, J.,
Oligodeoxy-nucleotides, Antisense Inhibitors of Gene
Expression, CRC Press (1989)). Los oligonucleótidos pueden
suministrarse a un paciente in vivo con el propósito de
inhibir la expresión de GAL-R2. Cuando se hace
esto, es preferible que el oligonucleótido se administre en una
forma que aumente su absorción por las células. Por ejemplo, el
oligonucleótido puede suministrarse por medio de un liposoma o
conjugado a un péptido que es ingerido por las células (véanse v.g.,
las Patentes U.S. Núms. 4.897.355 y 4.394.448; véanse también los
documentos no patentados en los Estados Unidos WO 8903849 y EP
0263740). Otros métodos para mejorar la eficiencia del suministro
de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica y son también
compatibles con la presente
invención.
invención.
Una vez descrita la invención, la misma se
comprenderá más fácilmente por referencia a los ejemplos siguientes
que se proporcionan con carácter de ilustración y que no deben
interpretarse como limitantes del alcance de la invención.
Se utilizó una estrategia de escrutinio de
homología basada en PCR para aislar nuevas secuencias de cDNA
codificantes de los receptores acoplados a proteínas G. Secuencias
que codificaban probablemente receptores acoplados a proteínas G se
amplificaron a partir de mRNA de ganglios de raíz dorsal de rata por
PCR de transcripción inversa utilizando los iniciadores
siguientes:
Los moldes para la amplificación por PCR se
sintetizaron utilizando un "Kit de Síntesis de cDNA de la Primera
Cadena" (Pharmacia Biotech.) y 400 ng de poli A + RNA de ganglios
de raíz dorsal. El cDNA de la primera cadena así preparado se
diluyó dos veces con agua destilada, se calentó a 95ºC durante 3
minutos y se enfrió rápidamente en hielo. Se amplificaron luego 5
\mul del cDNA así producido con 50 pmoles de cada uno de los
iniciadores TM2 y TM7 y 2,5 unidades de
DNA-polimerasa Taq en KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM,
Tris (HCl) 10 mM, y dNTPs 200 \muM, de pH 9,0. Los tubos de
reacción se calentaron a 95ºC durante 1 minuto y se sometieron luego
a 40 ciclos de desnaturalización (a 95ºC/1 min), reasociación
(45ºC/1 min) y extensión (72ºC/1 min). La extensión final se
realizó durante 10 minutos. Los fragmentos amplificados se
analizaron y se fraccionaron por tamaños en una columna de agarosa
al 1,5%. Los fragmentos entre 400 pb y 1000 pb de longitud se
escindieron del gel, se purificaron utilizando un kit Sephaglas
BandPrep de Pharmacia, y se insertaron en un vector
pGEM-T de Promega. Los plásmidos recombinantes así
producidos se utilizaron para transformar células competentes
DH5.
Las células transformadas se extendieron sobre
placas de agar 2YT que contenían ampicilina y los clones
pGEM-T recombinantes se seleccionaron por PCR
directa de colonias utilizando iniciadores diseñados para los
promotores T7 y SP6. Las condiciones de la PCR fueron exactamente
las mismas que anteriormente excepto que se utilizaron 50 pmoles de
cada uno de los iniciadores T7 y SP6 en lugar de los iniciadores TM2
y TM7. La temperatura de reasociación era 50ºC y se realizaron 30
ciclos. Se preparó DNA plasmídico a partir de los clones que
contenían plásmidos recombinantes utilizando un "Sistema de
Purificación de DNA Wizard Miniprep" (Promega Corporation)
partiendo de 4 ml de cultivo bacteriano. La secuencia de DNA de
estos clones se determinó utilizando el método de terminación de
cadenas de didesoxinucleótidos de Sanger sobre moldes plasmídicos
bicatenarios desnaturalizados utilizando un kit de frecuencia T7,
de Pharmacia.
El fragmento de inserción de DNA del clon
3B-21 se escindió del vector utilizando Sac II y Nde
I, se aisló en un gel de agarosa y se marcó con ^{32}P por
síntesis aleatoria cebada utilizando un kit de marcación de DNA
Ready-To-Go de Pharmacia. Este
fragmento marcado se utilizó para escrutar una genoteca de cDNA de
médula espinal de tallo cerebral de rata en ZAP II (Stratagene).
Los filtros se prehibridaron durante 2 horas a 42ºC en formamida al
50%, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt, 1% de glicina y 100
\mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y cizallado.
La hibridación con la sonda marcada se realizó a 42ºC durante 18
horas en una solución que contenía 50% de formamida, 5 x SSC, 1 x
solución de Denhardt, 0,3% de SDS y 100 \mug/ml de DNA de esperma
de salmón desnaturalizado y cizallado. Los filtros se lavaron dos
veces en 2 x SSC, 0,1% SDS a la temperatura ambiente. Los mismos se
lavaron luego dos veces durante 15 min en 2 x SSC, 0,1% SDS a 42ºC,
dos veces durante 15 min a 42ºC en 0,2 x SSC,
0,1% SDS, dos veces con 0,05 x SSC, 0,1% SDS a 55ºC y finalmente en la misma solución de lavado a 65ºC.
0,1% SDS, dos veces con 0,05 x SSC, 0,1% SDS a 55ºC y finalmente en la misma solución de lavado a 65ºC.
Los fagos que se hibridaron positivamente se
purificaron, y sus inserciones se rescataron por escisión mediada
con fago adyuvante para producir DNAs plasmídicos. Un clon, 21RSC4,
contenía la secuencia codificante completa para el receptor excepto
51 pb de la región 5'. Esta región se obtuvo por PCR y se unió luego
en el sitio Bsu36I en el nucleótido número 16 de 21RSC4. De este
modo, se generaron 67 pb en el extremo 5' de la región codificante
del clon pBS/GAL-R2 a partir de un fragmento
generado por PCR.
Se encontró que el plásmido
pBS/GAL-R2 recombinante contenía un marco de lectura
abierto de 372 aminoácidos, flanqueado por regiones sin traducir 3'
y 5' de, respectivamente, 289 y 308 pb. La secuencia del marco de
lectura abierto se muestra en la figura 1 junto con la secuencia de
aminoácidos de la proteína codificada. La proteína tiene un peso
molecular de 40.700 daltons. El análisis de hidropatía de la
proteína es consistente con una topografía de siete dominios
transmembranales, indicativa de la familia de receptores acoplados a
proteínas G (Sprengel et al., "Hormone Receptors", en
Handbook of Receptors and Channels: G
Protein-Coupled Receptors, Peroutka, S.J., ed., pp.
153-207, CRC Press (1994)). Adicionalmente, el
análisis de la secuencia reveló que el marco de lectura abierto de
pBS/GAL-R2 contiene varias características/residuos
estructurales conservados que se encuentran entre los miembros de
la familia de receptores neuropeptídicos, que incluyen: una
asparagina en TM1 (Asn43); una leucina (Leu67) y un ácido aspártico
(Asp71) en TM2; y un residuo arginina (Arg123) y tirosina (Tyr124)
en TM3. Otras características de este gen receptor
GAL-R2 son: sitios potenciales para glicosilación
en N en el término amino (Asn2, Asn11); la presencia de varias
serinas y treoninas en el término carboxilo; y la presencia de un
segundo y tercer bucles intracelulares, que pueden servir como
sitios potenciales para fosforilación por
proteína-quinasas.
Una comparación del marco de lectura abierto de
GAL-R2 de rata con las secuencias de los receptores
GAL-R2 y GAL-R1 humanos se muestra
en la figura 3. En conjunto, GAL-R2 de rata tiene
una identidad de aproximadamente 53% al nivel de nucleótidos y
35,5% al nivel de aminoácidos con GAL-R1 de rata
(Burgevin et al., J. Mol. Neurosci. 6:
33-41 (1995)) y 34,8% con GAL-R1
humano (Habert-Ortoli et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91 9780-9783 (1994)). Sin
embargo, la homología de secuencia es mayor en los dominios
transmembranales supuestos. Respectivamente, las homologías entre
GAL-R1 y GAL-R2 de rata conocidos en
TM1 a TM7 son 37,5%, 67%, 41,6%, 25%, 50%, 33% y 50%.
Globalmente, es evidente que
GAL-R2 tiene una secuencia exclusiva que lo separa
de los otros receptores acoplados a proteínas G u otros miembros de
la subfamilia de receptores neuropeptídicos. Los residuos de
aminoácidos esenciales para la fijación de galanina al receptor
GAL-R1 han sido identificados como His264, His267,
Phe282 y, en menor proporción, Glu271. Solamente uno de estos
residuos, correspondiente a His264, se conserva en
GAL-R2.
Para generar un vector de expresión de mamífero,
un fragmento de restricción Hind III - Bst-XI de 1,4
kb de pBS/GAL-R2 se aisló y se subclonó entre los
sitios Hind III y BstX-I de pcDNA3 de InVitrogen,
San Diego, CA. Este vector de expresión, designado pCDNA3/
GAL-R2 contiene, además de la secuencia codificante
del receptor entera, 50 pb de secuencia 5' no traducida y 288 pb de
secuencia 3' no traducida. El DNA plasmídico para análisis ulterior
se preparó utilizando el sistema Qiaprep de Qiagen.
Se obtuvieron células HEK293s del laboratorio de
Cold Spring Harbor. Las mismas se mantuvieron en medio de cultivo a
37ºC, 5% CO_{2} y se diluyeron 10 veces cada tres días. Las
células se inocularon en matraces de 80 cm^{2} (2 x 10^{6}
células por matraz) en Medio Esencial Modificado de Dulbecco (DMEM,
Gibco BRL), se complementaron con 10% de suero bovino fetal (FBS),
100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 0,25
\mug/ml de fungizona. Un día después de la inoculación, las
células se transfectaron transitoriamente utilizando un método de
CaCl_{2} modificado (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) y 30 \mug de
DNA plasmídico por matraz. Las células se cosecharon 48 horas
después de la transfección para experimentos de fijación de ligando
o de transducción de señales.
Se transfectaron células HEK293s en matraces de
80 cm^{2} con 30 \mug de pCDNA3/GAL-R2. Después
de 21 días de selección en medio de cultivo que contenía 600
\mug/ml de G418, las colonias resistentes se agruparon y se
expandieron para los estudios de fijación de radioligandos y
transducción de señales.
Se realizó un ensayo de fijación de galanina
sobre las membranas brutas preparadas a partir de células
transfectadas con pcDNA3/GAL-R2. Las células se
cultivaron en cápsulas Petri de 150 mm hasta aproximadamente 80% de
la confluencia. Antes de la cosecha, las células contenidas en las
placas Petri se lavaron una sola vez con PBS fría (Gibco BRL). Las
células se rascaron luego en PBS enfriada con hielo utilizando un
rascador de células de Teflón. Las células así cosechadas se
centrifugaron suavemente a 1500 x g a 4ºC, se resuspendieron en
tapón de membrana, "MB" (HEPES 20 mM de pH 7,5 que contenía 10
\mug/ml de benzamidina, 5 \mug/ml de leupeptina, 5 \mug/ml de
inhibidor de tripsina de soja, y 0,1 mM de fluoruro de
fenil-metil-sulfonilo) y se
disgregaron con un Polytron a un ajuste de \sim20.000 rpm durante
30 s. La suspensión de células disgregada se centrifugó a
\sim100.000 x g durante 60 minutos a 4ºC utilizando un rotor de
ángulo fijo en una Ultracentrífuga Beckman L8-70M.
El sedimento así obtenido se resuspendió en el tampón de membrana a
una concentración de 1,0-1,5 mg/ml, se dividió en
partes alícuotas y se congeló a -80ºC hasta su utilización.
La reacción de fijación se realizó en un volumen
total de 100 \mul de tampón de fijación (MB + 0,4% de seroalbúmina
bovina) que contenía 5-10 \mug de proteína de
membrana y 0,1 nM de ^{125}I-galanina (2200
cI/mmol, DuPont/NEN con o sin competidores sin marcar. Se estimó la
fijación inespecífica en presencia de 1 \muM de galanina sin
marcar. Las reacciones de fijación transcurrieron durante 20 min a
la temperatura ambiente y se detuvieron por filtración a través de
Unifilters-96, filtros GF-B
(Canberra Packard), utilizando el sistema de filtración Filtermate
196, de 96 pocillos, de Canberra Packard. Los filtros se lavaron 5
veces con 0,5 ml de HEPES 20 mM enfriado en hielo, de pH 7,5. Los
filtros se secaron a 55ºC durante 1 hora y se añadieron luego 100
\mul de \muScint-20 (Canberra Packard) por
pocillo. Los filtros se sometieron a recuento con el contador de
microplacas Topcount, de Canberra Packard.
Cuando se transfectó a células HEK293,
pCDNA3/GAL-R2 dio como resultado la expresión de
sitios específicos de fijación de
^{125}I-galanina. Se generaron sitios de fijación
inespecíficos de ^{125}I-galanina por la
transfección del vector propiamente dicho o un constructo de
expresión de pCDNA3 de control que codificaba un receptor de
delta-opioides. Se generó una agrupación de células
HEK293 estables que expresaban el receptor GAL-R2
por selección de células transfectadas con
pCDNA3/GAL-R2 utilizando G418 y se llevaron a cabo
experimentos de fijación sobre las membranas de estas células. Un
ejemplo de los resultados de un experimento de fijación se muestra
en la figura 4.
Se detectó una sola clase de sitios de fijación
de galanina ^{125}I saturables con un valor Kd estimado para
^{125}I-galanina de 1,68 ± 0,43 nM y un Bmax de
1-2 pmol/mg de proteína bruta. Se utilizaron
diversos péptidos afines a galanina en experimentos de competición
utilizando como trazador ^{125}I-galanina. Las
curvas de competición para estos péptidos se presentan en la figura
5, y los valores Ki de los péptidos ensayados se resumen en la
Tabla 1.
La fijación de galanina marcada fue desplazada
por galanina y péptidos afines a galanina, pero no por ligandos no
afines a galanina (v.g. sustancia P, polipéptido intestinal
vasoactivo, angiotensina II y dinorfina). La diferencia principal
entre GAL-R1 y GAL-R2 de rata, sin
embargo, reside en el reconocimiento del péptido quimérico C7, que
es equipolente a la galanina en el receptor GAL-R1,
pero es mucho menos activo en GAL-R2.
Agrupaciones estables de células transfectadas
se inocularon en placas de 24 pocillos y se dejaron crecer durante
una noche. Antes de los experimentos, las células se lavaron con PBS
a 37ºC y se cubrieron luego con PBS que contenía
3-isobutil-1-metilxantina
(IBMX) 1 mM. Las células contenidas en pocillos duplicados se
estimularon durante 10 minutos a 37ºC con forskolina (0,1 mM) sola,
o en presencia de diversas concentraciones de galanina o péptidos
afines a galanina. Se extrajo cAMP en etanol, se liofilizó y se
resuspendió en tampón de ensayo 0,5 mM. El ensayo de cAMP se
realizó utilizando el Sistema de Inmunoensayo Enzimático de cAMP
Biotrack (Amersham) o el Sistema de Ensayo de AMP Cíclico [^{3}H]
(Amersham).
Se encontró que la activación de
GAL-R2 de rata en las células HEK293 transfectadas
establemente conduce a una inhibición significativa de la
acumulación de cAMP estimulada por forskolina, y que esta inhibición
ocurre de una manera dependiente de la concentración (Figura 6).
Las células no transfectadas no exhibían este efecto.
Se sacrificaron ratas
Sprague-Dawley macho adultas (\sim300 g; Charles
River, St-Constant, Quebec), por decapitación. Se
extirparon inmediatamente el cerebro, la hipófisis y la médula
espinal, se congelaron bruscamente en isopentano a -40ºC durante 20
s y se guardaron a -80ºC. El tejido congelado se seccionó a 14
\mum en un criostato Microm HM 500M (Alemania) y se montó después
de descongelación en portaobjetos ProbeOn Plus (Fisher Scientific,
Montreal, Quebec). Las secciones se guardaron a -80ºC antes de la
hibridación in situ.
El plásmido
pCDNA3-GAL-R2 se linealizó
utilizando las enzimas de restricción XbaI o Hind III que cortan en
el polienlazador a ambos lados del cDNA insertado. Se transcribieron
in vitro ribosondas GAL-R2 de sentido y
antisentido utilizando RNA-polimerasas T7 o SP6
(Pharmacia Biotech.), en presencia de [^{35}S]UTP
(\sim800 Ci/mmol); Amersham, Oakville, Ontario). Después de la
transcripción, el DNA molde se digirió con DNAsa I (Pharmacia). Las
ribosondas se purificaron ulteriormente por extracción con
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico y se precipitaron en etanol al
70% que contenía acetato de amonio y tRNA. La calidad de las
ribosondas marcadas se comprobó por electroforesis en gel de
poliacrilamida-urea.
Las secciones se post-fijaron en
paraformaldehído al 4% (BDH, Poole, Inglaterra) en tampón de fosfato
0,1 M (pH 7,4) durante 10 min a la temperatura ambiente (TA) y se
lavaron en tres cambios de tampón de citrato de sodio estándar 2X
(SSC: NaCl 0,15M, citrato de sodio 0,015M, pH 7,0). Las secciones se
equilibraron luego en trietanol-amina 0,1M, se
trataron con anhídrido acético al 0,25% en trietanolamina, se
lavaron en 2X SSC y se deshidrataron en una serie de etanol
(50-100%). La hibridación se realizó en un tampón
que contenía formamida al 75%, NaCl 600 mM, Tris 10 mM (pH 7,5),
EDTA 1 mM, 1X solución de Denhardt, 50 mg/ml de DNA de esperma de
salmón desnaturalizado, 50 mg/ml de tRNA de levadura, sulfato de
dextrano al 10%, ditriotreitol 20 mM y sondas de cRNA marcadas con
[^{35}S]UTP (10 x 10^{6} cpm/ml) a 55ºC durante 18 h en
cámaras humidificadas. Después de la hibridación, los portaobjetos
se lavaron en 2 X SSC a TA, se trataron con 20 mg/ml de RNasa IA en
tampón de RNasa (Tris 10 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5)
durante 45 min a TA y se lavaron a una severidad final de 0,1 X SSC
a 65ºC. Las secciones se deshidrataron luego y se expusieron a
película Kodak Biomax MR durante 10 días y/o se sumergieron en
emulsión Kodak NTB2 diluida en relación 1:1 con agua destilada y se
expusieron durante 3-4 semanas a 4ºC antes de
revelado y contratinción con acetato de violeta de cresilo. Las
estructuras neuroanatómicas se identificaron de acuerdo con el
atlas de cerebro
de rata de Paxinos y Watson (Paxinos et al., The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, N.Y. (1986)).
de rata de Paxinos y Watson (Paxinos et al., The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, N.Y. (1986)).
Se observaron los niveles máximos de expresión
de mRNA de GAL-R2 de rata en los ganglios de raíz
dorsal con células de diámetro grande, intermedio y pequeño
marcadas específicamente. Se observó sólo una marcación difusa a lo
largo de las astas dorsales y ventrales de la médula espinal. En el
cerebro de la rata, las densidades máximas de marcación de mRNA de
GAL-R2 se detectaban en el hipocampo dorsal, los
cuerpos mamilares y el cerebelo (en particular, la capa de células
de Purkinje). Se detectó una marcación más moderada en el núcleo
pontino así como en un núcleo motor craneal específico. Se detectó
una hibridación moderada a débil a lo largo de las cortezas
cerebrales. Otras áreas cefálicas tales como el tálamo, el
hipotálamo restante, y los ganglios basales estaban desprovistas
por lo general de marcación. Esta distribución difiere
considerablemente de la consignada para mRNA de
GAL-R1 que se expresa particularmente bien en el
hipocampo ventral, la amígdala, el núcleo supraóptico, varios
núcleos hipotalámicos y talámicos, el núcleo parabraquial lateral y
el locus ceruleus del cerebro de la rata.
El alto nivel de expresión de
GAL-R2 observado en las neuronas sensoriales de los
ganglios de raíz dorsal y los niveles más moderados observados en
el asta dorsal de la médula espinal es consistente con el papel de
la galanina en la transmisión del dolor. La presencia de niveles
elevados de GAL-R2 en el hipocampo dorsal y los
cuerpos mamilares es consistente con un papel en la función
cognitiva.
Una genoteca de DNA genómico humano preparada a
partir de placenta humana (Clonetech) en el vector
EMBL-3 se escrutó con un fragmento aleatorio
marcado (marcado con el kit de marcación
T7-Quick-Prime, nº. de catálogo
#27-9252-01, Pharmacia Biotech.) que
contenía la región codificante completa de cDNA de
GAL-R2 de rata. Las condiciones de
pre-hibridación e hibridación fueron como sigue:
Pre-hibridación: 50% formamida,
5X solución de Denhardt, 5X SSC, 1% glicina, 100 g/ml de DNA de
esperma de salmón cizallado y desnaturalizado a 42ºC durante 5
horas.
Hibridación: 50% formamida, 1X solución de
Denhardt, 5X SSC, 0,3% SDS, 100 g/ml de DNA de esperma de salmón
cizallado y desnaturalizado, una noche a 42ºC.
Lavado: Se realizó un paso de lavado a partir de
la severidad baja de 2X SSC, 0,1% SDS a 42ºC a la severidad máxima
de 0,2X SSC, 0,1% SDS a 60ºC (65ºC para transferencias
Southern).
Se identificaron 8 clones positivos, que se
procesaron para escrutinio secundario en condiciones de hibridación
y lavado idénticas a las primeras. El escrutinio secundario dio como
resultado la identificación de 4 clones; los otros 4 clones se
consideraron positivos falsos. Los 4 clones positivos se procesaron
respecto a escrutinio terciario y cuaternario a fin de obtener
clones puros.
Se purificó el DNA a partir de los 4 clones
puros indicados anteriormente y se procesó para análisis de
restricción e hibridación por transferencia Southern con objeto de
identificar fragmentos más pequeños que produjeran una señal
positiva. Se identificaron 3 bandas con hibridación positiva (de
tamaños estimados \sim5kb, \sim3,2 kb y \sim0,7 kb) por la
escisión con las endonucleasas de restricción Sac I y Rsa I
(Pharmacia Biotech.) por hibridación mediante transferencia
Southern. Estas bandas se escindieron del gel y se subclonaron en el
plásmido pBlueScript KS (-) digerido con Sac I o Eco RV. Los
constructos plasmídicos se sometieron a secuenciación por el método
de secuenciación didesoxi de Sanger (kit de Secuenciación T7,
Pharmacia Biotech. Cat. #27-1682-01)
y el Kit de Secuenciación ABI Prizm Cycle (Cat. #402079,
Perkin-Elmer) y se construyó la secuencia
compuesta.
La secuencia de nucleótidos para el gen de
GAL-R2 humano se representa en la figura 2. Está
presente un marco de lectura abierto de 1155 nucleótidos que
codifica supuestamente una proteína de 385 aminoácidos con un peso
molecular calculado de 41.478 kD. Existe un intrón supuesto de más
de 1000 nucleótidos de longitud después de la base número 420. La
secuencia intrónica se ha eliminado de la secuencia finalizada
reproducida en la figura 2. Los límites exón/intrón se determinaron
basándose en las secuencias de consenso alrededor de los sitios de
corte y empalme 5' y 3' en pre-mRNAs de vertebrados
(Lodish et al., Molecular Cell Biology, 3ª Ed., Scientific
American Books, pp. 500; figura 4). A nivel de proteínas, el 84,4%
de los aminoácidos son idénticos entre el GAL-R2 de
rata y humano; la identidad entre GAL-R2 humano y el
GAL-R1 de rata o humano es aproximadamente 34%.
Una vez descrita con detalle esta invención, se
comprenderá por una persona con experiencia en la técnica que la
invención puede realizarse dentro de una gama extensa y equivalente
de condiciones, parámetros y análogos.
El plásmido HUMAN GAL-R2 ha sido
depositado de acuerdo con el tratado de Budapest en "Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSMZ),
Braunschweig, Alemania. El número de depósito es DSM 11632, y la
fecha de depósito es 26 de junio de 1997.
(1) INFORMACION GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Astra Pharma Inc., Canadá
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Un Nuevo Receptor galanina
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Astra AB
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: S-151 85 Södertalje
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Södertalje
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: ninguno
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO:46-8 553 26000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 46-8 553 28820
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1714 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 372 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1219 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 385 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 345 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 349 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "iniciador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGTCGAC TTCATCGTCW MYCTIKCIYT IGCNGAC
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "iniciador PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipRHWRCARTAI ATIATIGGRT T
\hfill21
Claims (17)
1. Una proteína, exenta esencialmente de
componentes contaminantes celulares, que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO:4.
2. Un polinucleótido, exento esencialmente de
componentes contaminantes celulares, que codifica una proteína que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4.
3. El polinucleótido de la reivindicación 2,
en donde dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos de
SEQ ID NO:3.
4. Un vector que comprende el polinucleótido
de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.
5. Una célula hospedadora transformada con el
vector de la reivindicación 4.
6. Una proteína recombinante que comprende SEQ
ID NO:4 o SEQ ID NO:4 que tiene adiciones, deleciones o
sustituciones que retienen las propiedades cualitativas de fijación
de SEQ ID NO:4.
7. Un anticuerpo específico para una proteína
que comprende SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:4 que tiene adiciones,
deleciones o sustituciones que retienen las propiedades cualitativas
de fijación de SEQ ID NO:4, siendo producido dicho anticuerpo por
un proceso que comprende el paso de inyectar una preparación
farmacéuticamente aceptable que comprende la proteína de la
reivindicación 1 en un animal capaz de producir dicho
anticuerpo.
8. Un anticuerpo que se fija específicamente a
una proteína de la reivindicación 1.
9. Un método para identificar un agente capaz
de fijarse a la proteína de la reivindicación 1 que comprende:
(a) incubar una fuente que contiene la proteína
de la reivindicación 1, pero sustancialmente exenta de otros
receptores galanina, con:
- i)
- un ligando conocido que se fija a la proteína de la reivindicación 1; y
- ii)
- un agente de test; y
(b) determinar el grado en que dicha fijación de
ligando es desplazada por dicho agente de test.
10. El método de la reivindicación 9, en donde
dicha fuente es una célula transformada con un vector de la
reivindicación 4.
11. El método de la reivindicación 9, en donde
dicha fuente es una preparación de membrana derivada de una célula
transformada con un vector de la reivindicación 4.
12. Un método para ensayar la capacidad de un
agente para activar la proteína de la reivindicación 1, que
comprende:
a) incubar una fuente que contiene la proteína
de la reivindicación 1, pero sustancialmente exenta de otros
receptores galanina, con un agente de test; y
b) determinar la activación de un camino de
segundo mensajero.
13. Un método para identificar un compuesto
capaz de modular la expresión de la proteína de la reivindicación
1, que comprende:
(a) cultivar células que expresan la proteína de
la reivindicación 1, pero sustancialmente exentas de otros
receptores galanina, en presencia de un compuesto de test; y
(b) comparar la expresión de la proteína de la
reivindicación 1 en las células expuestas a dicho compuesto de test
con células de control no expuestas a dicho compuesto de test.
14. El método de la reivindicación 13, en
donde dichas células que expresan la proteína de la reivindicación
1 son células transformadas con un vector de acuerdo con la
reivindicación 4.
15. El método de la reivindicación 13, en
donde dicho compuesto de test es un oligonucleótido que tiene una
longitud de al menos 15 nucleótidos y que comprende una secuencia
complementaria a una secuencia representada en SEQ ID NO:3.
\newpage
16. El método de la reivindicación 13, en
donde la expresión de dicha proteína se determina por detección de
la fijación de un ligando de la proteína de la reivindicación 1.
17. El método de la reivindicación 16, en
donde el ligando es galanina.
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