ES2301247T3 - Nuevo receptor acoplado a proteina g. - Google Patents

Abstract

Una proteína recombinante o purificada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

Description

Nuevo receptor acoplado a proteína G.

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo general de los receptores biológicos y los diversos usos que se pueden hacer de tales receptores. Más específicamente, la invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican un nuevo receptor afín a neurotensina (NLR), y al receptor propiamente dicho.

Antecedentes de la invención

Los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) constituyen una familia de proteínas que comparten una organización estructural común caracterizada por un extremo N-terminal extracelular, siete hélices alfa hidrófobas que constituyen supuestamente dominios transmembranales, y un dominio C-terminal intracelular. Los GPCRs se unen a una amplia variedad de ligandos que disparan señales intracelulares a través de la activación de proteínas G transductoras (Caron, et al., Rec. Prog. Horm. Res. 48:277-290 (1993); Freedman et al., Rec. Prog. Horm. Res. 51:319-353 (1996)).

Se han clonado hasta ahora más de 300 GPCRs, y se supone generalmente que existen mucho más de 1000 receptores de esta clase. En términos mecanísticos, aproximadamente el 50-60% de todos los fármacos clínicamente importantes actúan modulando las funciones de diversos GPCR (Cudermann, et al., J. Mol. Med. 73:51-63 (1995)). Son particularmente interesantes los receptores localizados en el sistema nervioso central. Se sabe que los receptores acoplados a proteína G localizados en esta región están implicados en la transmisión, modulación y sensación del dolor. Por ello, nuevos receptores acoplados a proteína G encontrados en el cerebro y la médula espinal pueden utilizarse en ensayos para la identificación de nuevos agentes para producir anestesia y analgesia.

Se ha descrito la evidencia de subtipos de receptores de receptores de neurotensina adicionales (Tyler et al., Brain Research 792:246-252 (1998)).

Sumario de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de un nuevo receptor acoplado a proteína G que se expresa en el sistema nervioso central y tiene una estructura distinta de todos los receptores consignados anteriormente. Dado que el mismo parece compartir una homología sustancial con el receptor de neurotensina humana, se hace referencia al mismo en esta memoria como el "receptor afín a neurotensina".

En su primer aspecto, la invención está dirigida a una proteína, excepto la existente en la naturaleza, que comprende una secuencia de aminoácidos constituida funcionalmente por SEQ ID NO: 1. El término "constituida funcionalmente por" hace referencia a las proteínas en las cuales la secuencia de SEQ ID NO: 1 ha sufrido adiciones, deleciones o sustituciones que no alteran sustancialmente las características funcionales del receptor. El término tiene por objeto abarcar proteínas que tienen exactamente la misma secuencia de aminoácidos que la de SEQ ID NO: 1, así como proteínas con diferencias de secuencia que no son sustanciales como se evidencia por el hecho de que las mismas retienen las propiedades básicas, de fijación cualitativa de ligandos y fisiológicas del receptor afín a neurotensina. El término "excepto la existente en la naturaleza" hace referencia a un compuesto que o bien se expresa por medios recombinantes o que se encuentra en un estado purificado (con preferencia purificado sustancialmente).

La invención abarca también una proteína recombinante o purificada, que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

La invención está dirigida también a un polinucleótidos recombinante o purificado, que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Este aspecto de la invención abarca polinucleótidos que codifican proteínas constituidas por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, vectores de expresión que comprenden tales polinucleótidos, y células hospedadoras transformadas con tales vectores. Se incluye también el receptor recombinante afín a neurotensina producido por células hospedadoras obtenidas de esta manera.

Preferiblemente, el polinucleótido que codifica el receptor afín a neurotensina tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 2, y los vectores y células hospedadoras utilizados para la expresión del receptor utilizan también este polinucleótido particular.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para ensayar un compuesto de prueba en cuanto a su capacidad para unirse a un receptor afín a neurotensina humana. El método se lleva a cabo incubando una fuente de NLR con un ligando que se sabe se une al receptor y con el compuesto de prueba. La fuente del receptor debería expresar, preferiblemente, una gran cantidad de NLR con relación a otros receptores acoplados a proteína G. Una vez completada la incubación, la idoneidad del compuesto de prueba para unirse a NLR se determina por la magnitud en la que se ha desplazado la unión de ligando. El receptor comprende la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1. Aunque no es esencial, el ensayo puede acompañarse de un ensayo para determinar si se ha activado una ruta de segundo mensajero, v.g. la ruta de adenil-ciclasa. Esto debería ayudar a determinar si un compuesto particular que se une a NLR actúa como agonista o como antagonista.

Un método alternativo para determinar si un compuesto de prueba es un agonista de NLR, método que no requiere ligando alguno, consiste en utilizar un ensayo de señalización celular, por ejemplo, un ensayo que mide la actividad intracelular de adenil-ciclasa o la concentración intracelular de calcio. El compuesto de prueba debería incubarse generalmente con células que expresan grandes cantidades de NLR con relación a otros vectores acoplados a proteína G, típicamente una célula transfectada con un vector de expresión que codifica el NLR de SEQ ID NO: 1. Los compuestos de prueba que son agonistas se identifican por el hecho de que los mismos causan un cambio estadísticamente significativo en los resultados obtenidos del ensayo de señalización de células cuando se comparan con células de control no expuestas al compuesto de prueba. Las células de control pueden ser o bien células que no han sido transfectadas o células que se han transfectado falsamente con un vector que no produce receptor activo. Las células que expresan NLR expuestas a compuestos de prueba que son agonistas podría esperarse típicamente que exhibieran un aumento significativo en la actividad de adenil-ciclasa o en la concentración intracelular de calcio con relación a células de control.

La invención engloba también un método para determinar si un compuesto de prueba es un antagonista de NLR, que está basado en la activación conocida de los receptores acoplados a la proteína G que se produce cuando tales receptores se expresan en grandes cantidades. Este método requiere que el DNA que codifica el receptor se incorpore en un vector de expresión de forma que esté enlazado operativamente a un promotor, y que el vector se utilice luego para transfectar una célula hospedadora apropiada. A fin de producir suficiente receptor para dar como resultado la activación constitutiva del receptor (es decir, la activación en ausencia de ligando natural), se prefieren sistemas de expresión capaces de producir abundante proteína, por ejemplo, el DNA de NLR puede estar enlazado operativamente a un promotor de CMV, y se puede expresar en células COS o HEK293. Después de la transfección, las células con receptores activados se seleccionan basándose en el incremento de actividad mostrado en un ensayo de señalización celular con relación a células comparables que, o bien no se han transfectado o se han transfectado con un vector que es incapaz de expresar NLR funcional. Típicamente, las células se seleccionarán porque exhiben un incremento estadísticamente significativo en la actividad intracelular de adenil-ciclasa o en la concentración intracelular de calcio. Las células seleccionadas se ponen en contacto con el compuesto de prueba, y se repite el ensayo de señalización celular para determinar si éste da como resultado una disminución de actividad con relación a células seleccionadas que no han estado en contacto con el compuesto de prueba. Por ejemplo, una disminución estadísticamente significativa en la actividad de adenil-ciclasa o en la concentración de calcio, con relación a las células de control, indicaría que el compuesto de prueba es un antagonista de NLR. El NLR utilizado en los ensayos tiene la secuencia de
SEQ ID NO:1.

Los ensayos para determinar compuestos que interaccionan con NLR se pueden realizar incubando una fuente que contiene el receptor (por ejemplo, una célula transformada establemente) con un ligando específico para NLR tanto en presencia como en ausencia del compuesto de prueba, y midiendo la modulación de la concentración intracelular de calcio. Un incremento o una disminución significativo(a) en la señalización de calcio estimulada por el ligando en respuesta al compuesto de prueba es indicativo de una interacción que se produce en el receptor afín a neurotensina. El receptor comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para ensayar un compuesto de prueba en cuanto a su capacidad para alterar la expresión de NLR. Este método se lleva a cabo dejando crecer células que expresan NLR en presencia del compuesto de prueba. Las células se recogen luego y se compara la expresión de NLR con la expresión en células de control que se han dejado crecer en condiciones esencialmente idénticas pero en ausencia del compuesto de prueba. El receptor es uno que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Un compuesto de prueba preferido es un oligonucleótido con una longitud de al menos 15 nucleótidos, que comprende una secuencia complementaria a la secuencia del mRNA de NLR utilizado en el ensayo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. La Figura 1 contiene la secuencia de nucleótidos completa de un clon construido por los métodos descritos en la sección de Ejemplos. El clon se depositó en la International Depository Authority Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) en la dirección Mascheroder Weg 1B, D-38124, Braunschweig, Alemania. El depósito (pcDNA plasmídico 3-10-29-FL) se hizo el 9 de abril de 1998 y le fue asignado el número de acceso DSM 12101. La secuencia de aminoácidos de NLR humano comienza en el nucleótido 65 y termina con el codón de terminación que comienza en el nucleótido 1310.

Figura 2. La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos deducida de NLR humano. El polinucleótido de la Figura 1 codifica una proteína de 415 aminoácidos de longitud.

Definiciones

La descripción que sigue utiliza varios términos que se refieren a tecnología de DNA recombinante. A fin de proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance que se ha de dar a tales términos, se proporcionan las definiciones siguientes.

Vector de clonación: Un DNA plasmídico o de fago, u otra secuencia de DNA, que es capaz de replicarse autónomamente en una célula hospedadora, y que se caracteriza por uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento por endonucleasas de restricción. En estos sitios, puede empalmarse en el vector un fragmento de DNA extraño a fin de provocar la replicación y clonación del fragmento. El vector puede contener un marcador adecuado para utilización en la identificación de células transformadas. Por ejemplo, los marcadores pueden proporcionar resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.

Vector de expresión: Un vector similar a un vector de clonación, pero que es capaz de inducir la expresión del DNA que se ha clonado en él, después de transformación en un hospedador. El DNA clonado se pone habitualmente bajo el control de (es decir, se enlaza operativamente a) ciertas secuencias reguladoras, tales como promotores o intensificadores. Las secuencias promotoras pueden ser constitutivas, inducibles o reprimibles.

Sustancialmente puro: Como se utiliza en esta memoria, "sustancialmente puro" significa que el producto deseado está esencialmente exento de componentes celulares contaminantes. Una proteína o ácido nucleico "sustancialmente puro(a)" comprenderá típicamente al menos 85% de una muestra, prefiriéndose porcentajes más elevados. Los contaminantes pueden incluir proteínas, hidratos de carbono o lípidos. Un método para determinar la pureza de una proteína o ácido nucleico consiste en someter a electroforesis una preparación en una matriz, tal como poliacrilamida o agarosa. La pureza se evidencia por la aparición de una sola banda después de la tinción. Otros métodos para evaluar la pureza incluyen cromatografía y centrifugación analítica.

Proteína recombinante: Una proteína recombinante o receptor recombinante es una proteína no endógena producida por la introducción de un vector de expresión en células hospedadoras.

Hospedante: Cualquier célula procariota o eucariota que es el receptor de un vector de expresión o vector de clonación replicable es el "hospedador" para dicho vector. El término engloba células procariotas o eucariotas que se han modificado por ingeniería genética para incorporar un gen deseado en su cromosoma o en su genoma. Los ejemplos de células que pueden servir como hospedadores son bien conocidos en la técnica, al igual que lo son las técnicas de transformación celular (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor (1989)).

Promotor: Una secuencia de DNA encontrada típicamente en la región 5' de un gen, localizada próxima al codón de partida. La transcripción se inicia en el promotor. Si el promotor es del tipo inducible, entonces la velocidad de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor.

Secuencia Nucleotídica Complementaria: Una secuencia nucleotídica complementaria, como se utiliza en esta memoria, se refiere a la secuencia que se originaría por el apareamiento normal de bases. Por ejemplo, la secuencia nucleotídica 5'-AGAC-3' tendría como secuencia complementaria 5'-GTGT-3'.

Expresión: La expresión es el proceso por el cual se produce un polipéptido a partir de DNA. El proceso implica la transcripción del gen en mRNA, y la traducción de este mRNA en un polipéptido.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a una proteína del receptor afín a neurotensina, a secuencias genéticas que codifican la proteína, a un método para ensayar compuestos respecto a su unión a los receptores afines a neurotensina, y a un método para ensayar compuestos respecto a su capacidad para alterar la expresión de los receptores.

El receptor y su ácido nucleico se definen por las estructuras que se muestran en las figuras 1 y 2 y en SEQ ID Núms. 1 y 2. Sin embargo, la presente invención abarca no sólo secuencias idénticas a las que se muestran en las figuras y en el listado de secuencias, sino también secuencias que son esencialmente iguales y secuencias que son de otro modo sustancialmente iguales y que dan como resultado un receptor que retiene las características de unión básicas de NLR. Por ejemplo, es bien sabido que pueden utilizarse técnicas tales como mutagénesis orientada para introducir variaciones en la estructura de una proteína. Variaciones en el receptor afín a neurotensina introducidas por este método o un método similar están abarcadas por la invención, con la condición de que el receptor resultante retenga las características cualitativas básicas y fisiológicas de unión del NLR inalterado. Así pues, la invención se refiere a proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

I. Secuencias de Ácido Nucleico que Codifican NLR

Las secuencias de DNA que codifican el receptor afín a neurotensina humana se expresan en el sistema nervioso central, la placenta y los músculos esqueléticos, y cualquiera de éstos puede servir como una fuente para el aislamiento de ácidos nucleicos que codifican el receptor. Además, pueden utilizarse células y líneas de células que expresan NLR humano. Éstas pueden ser células cultivadas que no han sufrido transformación, o líneas de células modificadas específicamente por ingeniería genética para expresar NLR recombinante. En todos los casos, el mRNA poli A+ se aísla del tejido o de las células, se transcribe de forma inversa, y se clona. La genoteca de cDNA así formada puede cribarse luego utilizando sondas derivadas de SEQ ID NO: 2. Las sondas deberían tener típicamente una longitud de al menos 14 bases y, preferiblemente, no deberían obtenerse a partir de las regiones del DNA correspondientes a los dominios transmembranales de NLR altamente conservados.

Alternativamente, el receptor análogo a neurotensina humana puede obtenerse a partir de células recombinantes que contienen la secuencia de NLR de longitud total o de genotecas de cDNA por realización de amplificaciones por PCR con iniciadores localizados en ambos extremos del gen NLR. Estos iniciadores pueden seleccionarse a partir de las secuencias que se muestran en SEQ ID NO: 2. La sección de ejemplos describe un procedimiento por el cual se utilizaron las amplificaciones PCR para obtener el receptor afín a neurotensina a partir de cDNA de médula espinal fetal.

II. Anticuerpos para NLR

Se describen anticuerpos que se unen específicamente al receptor afín a neurotensina humana, y un proceso para producir tales anticuerpos. Los anticuerpos que se "unen específicamente" se definen como aquéllos que tienen al menos una afinidad cien veces mayor para NLR que para cualquier otra proteína. El proceso para producir tales anticuerpos puede implicar inyectar la proteína NLR propiamente dicha en un animal apropiado o, alternativamente, inyectar péptidos cortos obtenidos que correspondan a diferentes regiones del receptor. Los péptidos deberían tener al menos una longitud de cinco aminoácidos, y deberían seleccionarse de regiones que se cree que son exclusivas para NLR.

Así, deberían evitarse en general en la selección de péptidos para la generación de anticuerpos las regiones transmembranales muy conservadas. Métodos para producir y detectar anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica, como se evidencia por artículos de referencia estándar tales como: (Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1988); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (1982); Kennett, et al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses (1980); y Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, (1984)).

"Anticuerpo", como se utiliza en esta memoria, debe considerarse que incluye tanto moléculas intactas como fragmentos que retienen su capacidad para unirse al antígeno (por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')_{2}). Estos fragmentos se producen por lo general escindiendo proteolíticamente anticuerpos intactos con utilización de enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}). El término "anticuerpo" se refiere también tanto a anticuerpos monoclonales como a anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se derivan de los sueros de animales inmunizados con el antígeno. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando la tecnología del hibridoma (Kohler, et al., Nature 256:495 (1975); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas. Elsevier. N.Y. p. 563-681 (1981)). En general, esta tecnología implica inmunizar un animal, habitualmente un ratón, con NLR intacto o con un fragmento derivado de NLR. Los esplenocitos de los animales inmunizados se extraen y se fusionan con células de mieloma adecuadas, por ejemplo células SP_{2}O. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y se clonan después por dilución limitante (Wands, et al., Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las células obtenidas a través de esta selección se ensayan luego para identificar clones que secretan anticuerpos capaces de unirse a NLR.

Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de la presente invención, pueden utilizarse para detectar la presencia de NLR utilizando cualquiera de una diversidad de inmunoensayos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse en radioinmunoensayos o en ensayos inmunométricos, conocidos también como ensayos de "dos sitios" o "sándwich" (véase Chard, T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques", in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)). En un ensayo inmunométrico típico, se une una cantidad de anticuerpo sin marcar a un soporte sólido que es insoluble en el fluido que se estudia, por ejemplo sangre, linfa, extractos celulares, etc. Después de la unión inicial del antígeno al anticuerpo inmovilizado, se añade una cantidad de un segundo anticuerpo detectablemente marcado (que puede ser o no el mismo que el primero), para permitir la detección y/o cuantificación del antígeno unido (véase, por ejemplo, Radioimmune Assay Method, Kirkham et al., ed. p. 199-206. E & S. Livingstone. Edinburgh (1970)). Se conocen en la técnica muchas variaciones de estos tipos de ensayos, y se pueden emplear para la detección del NLR.

Los anticuerpos para NLR humano pueden utilizarse también en la purificación del receptor intacto o de fragmentos del receptor (véase generalmente Dean et al., Affinity Chromatography. A Practical Approach, IRL Press (1986)). Típicamente, el anticuerpo se inmoviliza en una matriz cromatográfica tal como Sepharose 4B. La matriz se empaqueta luego en una columna, y la preparación que contiene el NLR se hace pasar a su través en condiciones que promueven la unión, por ejemplo en condiciones de salinidad baja. La columna se lava luego, y el NLR unido se eluye, utilizando un tampón que promueve la disociación del anticuerpo, por ejemplo un tampón que tiene un pH o concentración salina alterado(a). El NLR eluido se puede transferir a un tampón de elección, por ejemplo mediante diálisis, y se puede almacenar o se puede utilizar directamente.

III. Ensayo de Radioligandos para Unión al Receptor

Uno de los usos principales para los ácidos nucleicos de NLR y las proteínas recombinantes tiene lugar en ensayos diseñados para identificar agentes capaces de unirse al receptor NLR. Tales agentes pueden ser agonistas que imitan los efectos normales de la unión al receptor, o antagonistas que inhiben los efectos normales de la unión al receptor. De particular interés es la identificación de agentes que se unen al receptor afín a neurotensina y modulan la señalización intracelular, tal como la actividad de adenil-ciclasa o el calcio intracelular. Estos agentes tienen una aplicación terapéutica potencial como analgésicos o anestésicos.

En los ensayos de unión de radioligandos, se incuba una fuente de NLR junto con un ligando que se sabe se une al receptor y con el compuesto a probar en cuanto a actividad de unión. La fuente preferida de NLR son células, preferiblemente células de mamífero, transformadas para expresar recombinantemente el receptor. Las células seleccionadas no deben expresar una cantidad sustancial de ningún otro receptor acoplado a proteína G que pudiera unirse al ligando y distorsionar los resultados. Esto se puede determinar fácilmente realizando ensayos de unión sobre células derivadas del mismo tejido o línea celular que aquéllas que expresan recombinantemente NLR pero que no han sufrido transformación alguna.

El ensayo se puede realizar con células intactas o con membranas preparadas a partir de las células (véase, por ejemplo, Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:10230-10234 (1993)). Las membranas, o las células, se incuban con un ligando específico para el receptor NLR, y con una preparación del compuesto a ensayar. Después que se ha completado la unión, el receptor se separa de la solución que contiene el ligando y el compuesto de prueba, por ejemplo mediante filtración, y se determina la cantidad de unión que se ha producido. Preferiblemente, el ligando utiliza do se marca de forma detectable con un radioisótopo tal como ^{125}I. No obstante, si se desea, pueden utilizarse en su lugar marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes. Entre los compuestos marcadores fluorescentes utiliza dos más habitualmente se encuentran el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la ficocianina, la aloficocianina, o-ftaldehído y la fluorescamina. Compuestos quimioluminiscentes útiles incluyen luminol, isoluminol, éster teromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio, y éster oxalato. Cualquiera de estos agentes se puede utilizar para producir un ligando adecuado para utilización en el ensayo.

La unión inespecífica se puede determinar llevando a cabo la reacción de unión en presencia de un gran exceso de ligando sin marcar. Por ejemplo, el ligando marcado se puede incubar con receptor y con compuesto de prueba en presencia de un exceso de mil veces de ligando sin marcar.

La unión inespecífica se debería restar de la unión total, es decir, la unión en ausencia de ligando sin marcar, para llegar a la unión específica para cada muestra ensayada. En caso necesario, pueden incluirse en los ensayos otras etapas tales como lavado, agitación mecánica, agitación manual, filtración y similares. Típicamente, las etapas de lavado se incluyen después de la separación del ligando unido a la membrana del ligando que queda en disolución, y antes de la cuantificación de la cantidad de ligando unido, por ejemplo por conteo del isótopo radioactivo. La unión específica obtenida en presencia del compuesto de prueba se compara con la obtenida en presencia del ligando marcado solo, para determinar el grado en el que el compuesto de prueba ha desplazado la unión al receptor.

En la realización de los ensayos de unión, debe tenerse cuidado de evitar artefactos que pueden hacer que parezca que un compuesto de prueba está interaccionando con el receptor afín a neurotensina cuando, de hecho, la unión está siendo inhibida por cualquier otro mecanismo. Por ejemplo, el compuesto que se ensaya debe estar en un tampón que no inhiba sustancialmente por sí mismo la unión del ligando a NLR, y preferiblemente debería ensayarse a varias concentraciones diferentes. También se deberían examinar las preparaciones del compuesto de prueba respecto a actividad proteolítica, y es deseable que se incluyan antiproteasas en los ensayos. Finalmente, es muy deseable que los compuestos identificados por desplazar la unión del ligando al receptor NLR se reexaminen en un intervalo de concentraciones suficiente para llevar a cabo un análisis de Scatchard de los resultados. Este tipo de análisis es bien conocido en la técnica y se puede utilizar para determinar la afinidad de un compuesto de prueba por un receptor (véase, por ejemplo, Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 11.2.1-11.2.19 (1993); Laboratory Techniques and Biochemistry and Molecular Biology. Work et al., ed., N.Y. (1978) etc.). Se pueden utilizar programas de ordenador como ayuda en el análisis de los resultados (véase, por ejemplo, Munson, P., Methods Enzymol. 92:543-577 (1983); McPherson, G.A., Kinetic, EBDA Ligand. Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis Programs. Elsevier-Biosoft. U.K. (1985)).

La activación del receptor por la unión del ligando se puede monitorizar utilizando un número de ensayos diferentes. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de adenil-ciclasa dejando crecer células en los pocillos de una placa de microtitulación, e incubando después los pocillos en presencia o en ausencia de compuesto de prueba. El cAMP puede extraerse luego en etanol, liofilizarse y resuspenderse en tampón de ensayo. El ensayo de cAMP así recuperado se puede llevar a cabo utilizando cualquier método para determinar la concentración de cAMP, por ejemplo el Sistema de Inmunoensayo Enzimático de cAMP Biotrack (Amersham), o el Sistema de Ensayo de AMP [^{3}H] Cíclico (Amersham). Típicamente, los ensayos de adenil-ciclasa se realizarán por separado de los ensayos de unión, pero también puede ser posible realizar la unión y los ensayos de adenil-ciclasa en una única preparación de celdas. Más adelante se describen otros "ensayos de señalización celular" que pueden utilizarse para monitorizar la actividad del receptor.

IV. Identificación de Agonistas y de Antagonistas de NLR utilizando Ensayos de Señalización Celular

Los receptores afines a neurotensina pueden utilizarse también para seleccionar fármacos candidato utilizando ensayos de señalización celular. Para identificar los agonistas de NLR, se incorpora en un vector de expresión el DNA que codifica un receptor, y se transfecta después en un hospedador apropiado. Las células transformadas se ponen en contacto luego con una serie de compuestos de prueba, y se monitoriza el efecto de cada uno. Entre los ensayos que pueden utilizarse se encuentran ensayos que miden la producción de cAMP (véase la exposición anterior), ensayos que miden la activación de la actividad del gen informador, ensayos que miden la modulación de la unión de ligandos, v.g. GTP-gamma-S, o ensayos que miden cambios en la concentración intracelular de calcio.

Los ensayos de señalización celular pueden utilizarse también para identificar antagonistas de NLR. Los receptores acoplados a la proteína G se pueden poner en su estado activo incluso en ausencia de su ligando cognato expresándolos a una concentración muy elevada en un sistema heterólogo. Por ejemplo, el receptor se puede sobreexpresar utilizando la infección con baculovirus de células de insecto Sf9, o el gen de NLR puede enlazarse operativamente a un promotor de CMV y expresarse en células COS o HEK293. En este estado constitutivo activado, los antagonistas del receptor se pueden identificar en ausencia de ligando midiendo la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la actividad de señalización celular constitutiva. Ensayos apropiados para esto son, nuevamente, ensayos de cAMP, ensayos de activación de genes informadores, o ensayos que miden la unión de GTP-gamma-S.

Un ensayo preferido de señalización celular se basa en la observación de que las células transfectadas establemente con NLRs muestran un cambio en los niveles intracelular de calcio en respuesta a la incubación en presencia de ligando. De este modo, se puede utilizar un proceso para identificar los agonistas o antagonistas de NLR que es similar a los ensayos de radiorreceptores expuestos anteriormente, excepto que se mide la concentración de calcio en lugar de la radioactividad unida. La concentración de calcio en presencia de compuesto de prueba y ligando se compara con la existente en presencia de ligando solo, para determinar si el compuesto de prueba está interaccionando en el receptor afín a neurotensina. Un incremento estadísticamente significativo en el calcio intracelular en respuesta al compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba está actuando como agonista, mientras que una disminución estadísticamente significativa en el calcio intracelular indica que aquél está actuando como antagonista.

Pueden realizarse también ensayos que miden la activación de un gen informador. Por ejemplo, células que expresan el receptor NLR recombinante pueden transfectarse con un gen informador (v.g. un gen de cloranfenicol-acetiltransferasa o luciferasa) enlazado operativamente a un elemento de respuesta a adenil-ciclasa o diacilglicerol. Las células se incuban luego con compuestos de prueba y la expresión del gen informador se compara con la expresión en células de control que no expresan NLR recombinante pero que son esencialmente idénticas en otros aspectos. Un cambio estadísticamente significativo en la expresión del gen informador en las células que expresan NLR es indicativo de un compuesto de prueba que interacciona con el receptor NLR.

V. Ensayo para Determinación de la Idoneidad para Modular la Expresión de NLR

Una forma de incrementar o disminuir los efectos biológicos de NLR consiste en alterar el grado en el que el receptor se expresa en las células. Por lo tanto, los ensayos para la identificación de compuestos que inhiben o potencian la expresión son de considerable interés. Estos ensayos se llevan a cabo dejando crecer células que expresan NLR en presencia de un compuesto de prueba y comparando después la expresión del receptor en estas células con la expresión en células que se dejan crecer en condiciones esencialmente idénticas pero en ausencia del compuesto de prueba. Al igual que en los ensayos de unión expuestos anteriormente, es deseable que las células utiliza das estén sustancialmente libres de receptores competidores acoplados a la proteína G. Una forma de cuantificar la expresión del receptor es fusionar la secuencia de NLR con una secuencia que codifica un péptido o proteína que se puede cuantificar fácilmente. Por ejemplo, la secuencia de NLR puede ligarse a una secuencia que codifica hemaglutinina, y utilizarse para transfectar células establemente. Después de la incubación con el compuesto de prueba, el complejo hemaglutinina/vector puede inmunoprecipitarse y someterse a una transferencia Western con anticuerpo antihemaglutinina. Como alternativa, se puede realizar un análisis de Scatchard de los ensayos de unión con ligando marcado para determinar el número de receptores. Los ensayos de unión se pueden llevar a cabo como se ha expuesto anteriormente, y utilizarán preferiblemente células que se han manipulado mediante ingeniería genética para expresar NLR de forma recombinante.

Un grupo preferido de compuestos de prueba para la inclusión en el ensayo de expresión de NLR está constituido por oligonucleótidos complementarios a diversos segmentos de la secuencia SEQ ID NO:2 de ácido nucleico de NLR. Estos oligonucleótidos deben tener una longitud de al menos 15 bases, y deberían derivarse de regiones no conservadas de la secuencia de ácido nucleico del receptor.

Los oligonucleótidos que se sabe reducen la expresión del receptor pueden derivatizarse o conjugarse a fin de aumentar su eficacia. Por ejemplo, pueden emplearse nucleósido-fosforotioatos en sustitución de sus homólogos naturales (véase Cohen J., Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)). Los oligonucleótidos se pueden suministrar a un paciente in vivo con el fin de inhibir la expresión de DRR. Cuando se hace esto, se prefiere que el oligonucleótido se administre en una forma que potencie su absorción por las células. Por ejemplo, el oligonucleótido puede suministrarse por medio de un liposoma, o puede conjugarse a un péptido que es ingerido por las células (véanse, por ejemplo, las patentes U.S. Núms. 4.897.355 y 4.394.448; véanse también los documentos que no son patente U.S. WO 8903849 y EP 0263740). Otros métodos para potenciar la eficacia del suministro de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica y son compatibles también con la presente invención.

Habiéndose descrito ahora la invención, la misma se comprenderá más fácilmente por la referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan a título ilustrativo y que no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de NLR Humano

Se diseñaron un par de oligonucleótidos degenerados basados en las secuencias peptídicas conservadas entre los diversos miembros de la familia de receptores de opioides y somatostatina. Las secuencias de los iniciadores son como sigue:

5'-AARMTSAARACIGCYACIAA-3'	(SEQ ID NO:3)	iniciador directo 1I-U; y
5'-AYRGCGAYRTAICKRTCIAC-3'	(SEQ ID NO:4)	iniciador inverso 2I-L.

La mezcla de la reacción en cadena de polimerasa (volumen total 100 \mul) contenía -250 ng del DNA genómico humano (NOVAGEN), 1 X tampón PCR (KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,9), Pharmacia), dNTPs 200 \muM (Pharmacia), 200 pmol de cada uno de los iniciadores anteriores, y 5 U de polimerasa Taq (Pharmacia). Las amplificaciones se realizaron en un RoboCycler Gradient 40 (Stratagene). El molde se desnaturalizó a 95ºC durante un minuto, seguido por 35 ciclos constituidos por los pasos de desnaturalización, reasociación y extensión, cada uno durante un minuto a 95ºC, 42ºC y 72ºC, respectivamente. Los productos resultantes se resolvieron en un gel de agarosa al 1%. Una banda principal esperada de alrededor de 220 pb se escindió y se purificó con el Kit Sephaglas BandPrep (Pharmacia) y se clonó en pGEM-T (Promega). Los plásmidos se prepararon con el protocolo de lisis alcalina y se cribaron con el método de secuenciación de terminación didesoxi de Sanger et al. Se encontró que la mayoría de los productos PCR clonados eran el receptor de opioides delta humano, que se separó por hibridación de colonias bacterianas. Entre los otros receptores de opioides humanos conocidos (kappa y mu) y hORL1 (Orphanin FQ o receptor de nociceptina), se encontraba un nuevo receptor supuesto acoplado a proteína G, que se designó 10-29.

Se utilizó PCR para determinar en primer lugar la genoteca de cDNA de tejido humano a cribar con un par de iniciadores diseñados sobre la base del fragmento PCR original (véase arriba): Las secuencias de los oligonucleótidos eran:

5'-TGGTCCTGCTCCTTGGAATG	(SEQ ID NO:5)	29-1, iniciador directo; y
5' GCGAAGCACACGGTCTCAAA	(SEQ ID NO:6)	29-2, iniciador inverso.

La mezcla PCR (volumen total 30 \mul) contenía 1 \mul de cDNA Humano QUICK-Screen Library Panel (CLONTECH, Cat #k 1003-1), 1 X tampón PCR (Pharmacia), dNTPs 200 \muM (Pharmacia), 25 pmol de cada iniciador y 1 U de polimerasa Taq (Pharmacia). La desnaturalización inicial de los moldes durante 1 min a 95ºC fue seguida por 45 ciclos de desnaturalización, reasociación y extensión, cada uno durante 1 minuto a 95ºC, 55ºC y 72ºC, respectivamente. Se encontró que las genotecas de cerebro, placenta, músculo esquelético y, a mucho menor nivel, riñón contenían clones positivos (datos no presentados). Se eligió una genoteca de cDNA de cerebro humano \lambdagt11 (CLONTECH, Cat #HL3002b) para seleccionar el gen con el fragmento PCR original de 220 pb como sonda, marcado por el método de cebado aleatorio (Glóbulos de Marcación de DNA Ready-To-Go (-dCTP), Pharmacia). La prehibridación y la hibridación se llevaron a cabo a 62ºC en 2 X SSC, 5 X solución de Denhardt, 0,5% de SDS y 100 \mug/ml de DNA de esperma de arenque. La concentración de la sonda era aproximadamente 0,5 x 106 cpm/ml. Se identificó un clon positivo. El inserto de este clon se escindió, se subclonó en pBlueScript, y se designó pBS 10-29.

El clon pBS 10-29 contiene el término N completo para el receptor supuesto: sin embargo, la región codificante está interrumpida por codones de parada en el extremo de la región transmembranal 5 (TM5) y la homología con HNTR1 se ha perdido también más allá de esta región. Aparentemente, en este cDNA los intrones no se han empalmado completamente. Se obtuvo un clon de DNA genómico humano P1 utilizando los iniciadores 29-1 (iniciador directo, véase arriba), y 29-B:

5'- GGGGAAGTAGTGGAACTTGATGC-3',

(SEQ ID NO:7)

iniciador inverso

Este clon P1 se digirió con endonucleasa de restricción Stu-I y el material digerido se sometió a electroforesis, seguida por transferencia Southern y cribado con la sonda 10-29 descrita anteriormente. Se identificó un fragmento StuI de 8,5 kb del clon P1 que proporcionaba una señal fuerte después de hibridación. Este fragmento se subclonó en pBlueScript, se designó pBS10-29-8k y se secuenció completamente. Se encontró que incluía 12 pb aguas arriba del codón inicial y la región codificante hasta la región TM-5, pero no contenía información de secuencia para el término C del receptor.

Otro fragmento Kpn1 de 11 kb, que se solapaba con el fragmento de 8 kb a aproximadamente 1,3 kb del extremo 3' del último, se subclonó también en pBlueScript (pBS 10-29-11k). Después de amplificación en bacterias, el fragmento Kpn1 se aisló en gran cantidad y se digirió completamente con Sau3AI. Los fragmentos resultantes se clonaron aleatoriamente en pBlueScript y se secuenciaron. Se encontró que dos clones, 8 y 74 eran idénticos y contenían un tramo que codificaba la región TM7. Se diseñaron iniciadores alrededor de esta región que permitían la determinación de secuencias situadas más aguas arriba, el terminal C completo y la región 3' no traducida. Los resultados sugirieron que existe otro intrón aguas arriba de TM7 dado que no se encontró un TM6 reconocible en la posición esperada con relación a la región TM7.

Utilizando el iniciador 3'-270r (5'-TCCTCTGTGAAGTTTTGAGGC-3' (SEQ ID NO: 8)) correspondiente a una secuencia en la región 3' no traducida, fue posible clonar el término C completo del gen 10-29 por PCR anidada, utilizando dos iniciadores 10-29 específicos, anidados, directos, 29-1, véase arriba, y 29-f3': 5'-ATCGTCTGGGGCTTCT
CCG-3' (SEQ ID NO: 9). Un \mul de cDNA preparado a partir de médula espinal fetal humana con DRGs fijados Se seleccionó como molde para la primera tanda de PCR; las amplificaciones PCR anidadas se realizaron utilizando los productos PCR previos (1 \mul) como moldes. Las condiciones de la PCR eran las mismas que se han descrito arriba, excepto en lo que se refiere a la temperatura de reasociación (50ºC) y el número de ciclos (35). Se amplificó un fragmento de 857 pb, se clonó en pGEM-7 (fácil) (Promega) y se secuenció. Este clon se designó 29-CT (para el término C) y se encontró que compartía 222 pb con pBS 10-29 hasta la posición en la que comienza el primer intrón. El resto de la secuencia codifica la parte restante del gen 10-29. La combinación de ambas secuencias forma la región codificante entera del receptor, que totaliza 1245 pb y tiene una proteína receptora deducida de 415 aminoácidos.

La secuencia de nucleótidos completa del clon cDNA compuesto se ilustra en la Figura 1. El marco de lectura abierto constituido por 1245 nucleótidos codifica una proteína de 415 aminoácidos (Figura 2) con una masa molecular predicha de -43,6 kDaltons. La secuencia de la proteína contiene todos los rasgos característicos de GPCRs siete hélices hidrófobas que representan probablemente dominios transmembranales, un dominio de término amino y un dominio de término carboxi. Existe un sitio de glicosilación potencial en el dominio extracelular N-terminal (posición 9) y una secuencia conservada NPXXY en la posición 323-327.

La secuencia de nucleótidos y la secuencia predicha de aminoácidos del receptor 10-29 se asemejan muy estrechamente a las secuencias de los receptores de neurotensina NTR-1 y NTR-2. Una alineación de secuencias del receptor 10-29 con los receptores de neurotensina conocidos revela que la misma es aproximadamente 32% idéntica a los NTR-1 y NTR-2 humano y de rata. Entre los dominios transmembranales, el grado máximo de homología se observa en la región TM-2 (61%) y el mínimo en la región TM-4 (20%). La semejanza en los aminoácidos entre NTR-1, NTR-2 y el receptor 10-29 es particularmente alta (> 55%), lo que sugiere que la neurotensina puede servir como el ligando endógeno para el receptor 10-29. Así pues, el receptor 10-29 puede ser un nuevo subtipo del receptor de neurotensina.

Ejemplo 2 Experimentos de Hibridación In Situ

Preparación del tejido: Se obtuvieron ganglios congelados de médula espinal y de la raíz dorsal humana adulta y fetal, del Brain and Tissue Bank for Developmental Disorders, Universidad de Maryland en Baltimore, de acuerdo con las directrices éticas más estrictas. Se sacrificaron por decapitación ratas macho adultas Sprague-Dawley (\sim 250 g: Charles River, St-Constant, Quebec). Se extirparon inmediatamente el cerebro y la médula espinal con DRGs todavía fijados, se congelaron bruscamente en isopentano a -40ºC durante 20 s, y se guardaron a -80ºC. El tejido congelado se seccionó a 16 \mum en un criostato Microm HM 500 M (Alemania), y se montó descongelado sobre portaobjetos ProbeOn Plus (Fisher Scientific, Montreal, Quebec). Las secciones se guardaron a -80ºC antes de la hibridación in situ.

Síntesis de Ribosondas: Se linealizó el plásmido pCDNA3-10-29 que contenía un fragmento de 506 pb utilizando las enzimas de restricción XbaI o HindIII que cortan en el polienlazador en ambos sitios del cDNA insertado. Las ribosondas de 10-29 de sentido y antisentido se transcribieron in vitro utilizando RNA polimerasas T7 o SP6 (Pharmacia Biotech), respectivamente, en presencia de [^{35}S]UTP (\sim 800 Ci/mmol; Amersham, Oakville, Ontario). A continuación de la transcripción, el molde de DNA se digirió con DNAsa I (Pharmacia). Las ribosondas se purificaron a continuación en microcolumnas G-50 ProbeQuant (Pharmacia Biotech, EE.UU.), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La calidad de las ribosondas marcadas se verificó mediante electroforesis en gel de poliacri-
lamida-urea.

Hibridación In Situ : Las secciones se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 4% (BDH, Poole, Inglaterra), en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4) durante 10 minutos a la temperatura ambiente (TA), y se lavaron en tres cambios de 2 X tampón de citrato de sodio estándar (SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M citrato de sodio, pH 7,0). Las secciones se equilibraron luego en trietanolamina 0,1 M, se trataron con anhídrido acético al 0,25% en trietanol-amina, se lavaron en 2 X SSC, y se deshidrataron en una serie etanólica (50-100%). La hibridación se realizó en un tampón que contenía 75% de formamida (Sigma. St-Louis. Mo), 600 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 X solución de Denhardt (Sigma), 50 mg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado (Sigma), 50 mg/ml de tRNA de levadura (Sigma), 10% de sulfato de dextrano (Sigma), 20 mM de ditiotreitol y sondas de cRNA marcadas con [^{35}S]UTP (10 X 106 cpm/ml), a 55ºC durante 18 h en cámaras humidificadas. Tras la hibridación, los portaobjetos se lavaron en 2 X SSC a TA, se trataron con 20 mg/ml de RNAsa IA (Pharmacia) en tampón de RNAsa (10 mM Tris, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) durante 45 minutos a TA, y se lavaron a una severidad final de 0,1 X SSC a 65ºC. Las secciones se deshidrataron luego y se expusieron a una película Kodak Biomax MR durante 17-21 días, y/o se bañaron en una emulsión Kodak NTB2 diluida 1:1 con agua destilada, y se expusieron durante 6 semanas a 4ºC antes del revelado y la contratinción con acetato de cresil-violeta (Sigma).

Resultados: El patrón de expresión del clon 10-29 en la médula espinal del adulto humano es absolutamente singular como se observa tanto al nivel de los autorradiogramas de película como por autorradiografía en emulsión de alta resolución. A todos los niveles segmentales examinados (cervical, torácico y lumbar), solo un pequeño número de neuronas expresaban específicamente mRNA de 10-29, y estas células se restringían a 3 regiones funcionalmente distintas de la materia gris medular, a saber la sustancia gelatinosa, el núcleo de Clarke y el asta ventral. Dentro de la sustancia gelatinosa, una proporción modesta (< 10%) de pequeñas neuronas altamente marcadas estaban dispersas por todo el campo. La señal de hibridación en el núcleo de Clarke era espectacular, expresando unas cuantas células individuales niveles muy altos de mRNA de 10-29. El análisis al microscopio reveló que la señal estaba asociada exclusivamente con la mayoría, pero no con todas las neuronas grandes del núcleo de Clarke. Estas neuronas envían sus axones al funículo lateral para formar el tracto espinocerebelar posterior y están involucradas en el procesamiento de la información propioceptiva de las extremidades inferiores. Dentro del asta ventral, una minoría de neuronas motoras grandes (aproximadamente 10 células/sección) estaban marcadas, pero en una proporción mucho
menor.

Se observaba también la expresión del mRNA del receptor del clon 10-29 en las neuronas de la sustancia gelatinosa de la médula espinal humana fetal y en los ganglios de la raíz dorsal (DRG). La expresión del clon 10-29 en los DRG adultos está pendiente de confirmación. Los controles de hibridación estándar con sondas de sentido marcadas con ^{35}S eran negativos.

Los estudios preliminares utilizando la sonda humana 10-29 en secciones de cerebro de rata han proporcionado resultados positivos. Se detectó una señal de hibridación débil, pero específica, en las células piramidales CA del hipocampo.

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(Formulario pasa a página siguiente)

1

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Astra Pharma Inc. Canada

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVO RECEPTOR

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Astra AB, Patent Department

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: S-151 85 Sodertälje

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Södertälje

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO:

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Suecia

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: ninguno

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 46-8 553 26000

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: 46-8 553 28820

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 415 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: no pertinente

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no pertinente

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1360 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AARMTSAARA CIGCYACIAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AYRGCGAYRT AICKRTCIAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTCCTGCT CCTTGGAATG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGAAGCACA CGGTCTCAAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGAAGTAG TGGAACTTGA TGC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCTCTGTGA AGTTTTGAGG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGTCTGGG GCTTCTCCG

\hfill

19

Claims (16)

1. Una proteína recombinante o purificada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la cual dicha secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

3. Un polinucleótido recombinante o purificado que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

4. El polinucleótido de la reivindicación 3, en donde dicho polinucleótido codifica una proteína constituida por la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1.

5. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 3 o la reivindicación 4.

6. Una célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 5.

7. La proteína de la reivindicación 1 producida por la célula hospedadora de la reivindicación 6.

8. El polinucleótido de la reivindicación 4, en donde dicho polinucleótido tiene una secuencia constituida por los nucleótidos 65-1309 de SEQ ID NO:2.

9. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.

10. Una célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 9.

11. Un método de ensayo de un compuesto de prueba respecto a su idoneidad para unirse a la proteína de la reivindicación 1, que comprende:

a)

incubar una fuente que contiene la proteína de la reivindicación 1 con:

i)

un ligando conocido que se une a dicha proteína;

ii)

dicho compuesto de prueba; y

b)

determinar la extensión en la que la unión de dicho ligando es desplazada por dicho compuesto de prueba.

12. Un método para determinar si un compuesto de prueba es un agonista de la proteína de la reivindicación 1, que comprende:

a)

incubar una célula que expresa la proteína de la reivindicación 1 con dicho compuesto de prueba; y

b)

determinar si dicho compuesto de prueba causa un aumento estadísticamente significativo en su actividad intracelular de adenil-ciclasa o en la concentración intracelular de calcio.

13. Un método para determinar si un compuesto de prueba es un agonista de la proteína de la reivindicación 1, que comprende:

a)

incorporar una molécula de DNA que codifica la proteína de la reivindicación 1 en un vector de expresión de tal modo que la misma se enlaza operativamente a un promotor;

b)

transfectar dicho vector de expresión en un hospedador;

c)

seleccionar células transfectadas en el paso b) que tienen receptores afines a neurotensina activados constitutivamente como se evidencia por:

i)

un aumento estadísticamente significativo en la actividad intracelular de adenil-ciclasa; o bien por

ii)

un aumento estadísticamente significativo en la concentración intracelular de calcio;

d)

poner en contacto las células seleccionadas en el paso c) con dicho compuesto de prueba; y

e)

determinar si dicho compuesto de prueba causa una disminución estadísticamente significativa en dicha actividad de adenil-ciclasa o dicha concentración de calcio en comparación con células de control que no se han puesto en contacto con dicho compuesto de prueba.

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14. Un método para ensayar un compuesto de prueba en cuanto a su idoneidad para alterar la actividad de la proteína de la reivindicación 1, que comprende:

a)

incubar una fuente que contiene la proteína de la reivindicación 1 con:

i)

un ligando que se une con especificidad a dicha proteína;

ii)

dicho compuesto de prueba; y

b)

determinar si dicho compuesto de prueba aumenta o disminuye la concentración intracelular de calcio en respuesta a dicho ligando.

15. Un método de ensayo de un compuesto de prueba respecto a su idoneidad para alterar la expresión de la proteína de la reivindicación 1, que comprende:

a)

cultivar células que expresan la proteína de la reivindicación 1;

b)

recoger dichas células; y

c)

comparar la expresión de dicha proteína en las células expuestas a dicho compuesto de prueba con células de control que se han cultivado en condiciones esencialmente idénticas pero sin exposición a dicho compuesto de prueba.

16. El método de la reivindicación 15, en el cual dicho compuesto de prueba es un oligonucleótido de al menos 15 nucleótidos de longitud y que comprende una secuencia complementaria a la secuencia de un polinucleótido que codifica la proteína de la reivindicación 1.