ES2292460T3 - Receptor acoplado a proteina g. - Google Patents
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Abstract
Una proteína, excepto la existente en la naturaleza, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Description
Receptor acoplado a proteína G.
La presente invención se refiere a ácidos
nucleicos que codifican un nuevo receptor acoplado a proteína G y
al receptor propiamente dicho.
Los receptores acoplados a proteínas G (GPCRs)
constituyen una familia de proteínas que comparten una organización
estructural común caracterizada por un extremo extracelular
N-terminal, 7 hélices alfa hidrófobas que
constituyen supuestamente dominios transmembranales y un dominio
intracelular C-terminal. Los GPCRs se fijan a una
gran diversidad de ligandos que desencadenan señales intracelulares
por la activación de proteínas G transductoras (Caron et
al., Rec. Prog. Horm. Res. 48:277-290 (1993);
Freedman et al., Rec. Prog. Horm. Res.
51:319-353 (1996)).
Aproximadamente el 50-60% de
todos los fármacos clínicamente relevantes actúan por modulación de
las funciones de diversos GPCRs (Cudermann et al., J. Mol.
Med. 73:51-63 (1995)). Presentan interés particular
los receptores localizados en el sistema nervioso central. Se sabe
que los receptores acoplados a proteínas G en esta región están
involucrados en la transmisión, modulación y sensación del dolor.
Por tanto, los receptores acoplados a proteínas G derivados del
cerebro y la médula espinal pueden utilizarse en ensayos para la
identificación de nuevos agentes anestésicos y analgésicos.
La presente invención está basada en el
descubrimiento de un nuevo receptor acoplado a proteína G que es
estructuralmente distinto de los receptores consignados
previamente. En esta memoria se hace referencia al mismo como el
"receptor B1C3".
En su primer aspecto, la invención está dirigida
a una proteína, excepto la existente en la naturaleza, que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. El término
"constituido funcionalmente por" hace referencia a las
proteínas en las cuales la secuencia de SEQ ID NO: 1 ha sufrido
adiciones, deleciones, o sustituciones que no alteran
sustancialmente las características funcionales del receptor. El
término tiene por objeto abarcar proteínas que tienen exactamente
la misma secuencia de aminoácidos que la de SEQ ID NO: 1, así como
proteínas con diferencias de secuencia que no son sustanciales como
se evidencia porque retienen las propiedades básicas, la fijación
cualitativa de ligandos y las propiedades fisiológicas del receptor
B1C3. El término "excepto la existente en la naturaleza" hace
referencia a un compuesto que o bien es expresado por medios
recombinantes o que se encuentra en un estado purificado (con
preferencia sustancialmente purificado).
En una realización preferida, la proteína tiene
una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de SEQ ID
NO: 1. La invención incluye anticuerpos que se fijan preferentemente
a dicha proteína (es decir, anticuerpos que tienen al menos una
afinidad 100 veces mayor para B1C3 que cualquier otra proteína); y
anticuerpos producidos por un proceso que implica la inyección de
una preparación farmacéuticamente aceptable de B1C3 en un animal
capaz de producción de anticuerpos. Preferiblemente, un anticuerpo
monoclonal para B1C3 se produce por administración de B1C3 a un
ratón seguida por fusión de las células del bazo del ratón con
células de mieloma.
La invención está dirigida también a un
polinucleótido, excepto el existente en la naturaleza, que codifica
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
1. Este aspecto de la invención abarca polinucleótidos que
codifican proteínas constituidas por la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 1, vectores de expresión que comprenden tales
polinucleótidos, y células hospedadoras aisladas transformadas con
tales vectores. Se incluye también el receptor B1C3 recombinante
producido por células hospedadoras aisladas obtenidas de esta
manera. Preferiblemente, el polinucleótido que codifica el receptor
B1C3 tiene una secuencia constituida por la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 2, y los vectores y células hospedadoras
aisladas utilizados para la expresión del receptor utilizan también
este polinucleótido particular.
En otro aspecto, la presente invención está
dirigida a un método para ensayar un compuesto de test respecto a
su capacidad para fijarse al receptor B1C3. El método se realiza por
incubación de una fuente de B1C3 con un ligando que se sabe se fija
al receptor, y con el compuesto de test. La fuente del receptor
debería expresar preferiblemente una gran cantidad de B1C3 con
relación a otros receptores acoplados a proteínas G. Una vez
completada la incubación, la amplitud del compuesto de test para
fijarse a B1C3 se determina por la extensión con la que se ha
desplazado la fijación del ligando. Preferiblemente, el receptor
presente debería tener la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.
Aunque no es esencial, el ensayo de fijación puede ir acompañado
por un ensayo para determinar si se ha activado un camino de segundo
mensajero, v.g., el camino de la adenil-ciclasa.
Esto debería contribuir a determinar si un compuesto particular que
se fija a B1C3 actúa como agonista o como antagonista.
Un segundo método para determinar si un
compuesto de test es un agonista de B1C3, un método que no requiere
ligando alguno, consiste en utilizar un ensayo de señalización de
células, v.g., un ensayo que mide la actividad intracelular de
adenil-ciclasa o la concentración intracelular de
calcio. El compuesto de test debería incubarse generalmente con
células que expresen cantidades elevadas de B1C3 con relación a
otros receptores acoplados a proteínas G, típicamente una célula
transfectada con un vector de expresión que codifica el B1C3 de SEQ
ID NO: 1. Los compuestos de test que son agonistas se identifican
porque los mismos causan un cambio estadísticamente significativo
en los resultados obtenidos por el ensayo de señalización de células
cuando se comparan con células de control no expuestas al compuesto
de test. Las células de control pueden ser células que no han sido
transfectadas o células que han sido transfectadas falsamente con un
vector que no produce receptor activo. Sería de esperar que las
células que expresan B1C3 expuestas a compuestos de test que son
agonistas exhibieran típicamente un aumento significativo en la
actividad de adenil-ciclasa o en la concentración
intracelular de calcio con relación a las células de control.
Es un hecho bien conocido que, después de
estimulación con un agonista, los GPCRs se internalizan. Así pues,
otro método que puede utilizarse para identificar un ligando
endógeno de B1C3, o para seleccionar los compuestos que actúan como
agonistas del receptor, consiste en determinar si una célula que
expresa el receptor internaliza el mismo en respuesta al contacto
con uno o más compuestos de test. Un método para realizar esto
consiste en marcar el receptor B1C3 con una sonda fluorescente
(v.g., por expresión del mismo como una proteína de fusión enlazada
a la proteína fluorescente verde) y utilizar microscopía para
determinar si se produce internalización (véase el Ejemplo 3). Para
hacer esto, puede comenzarse con un extracto bruto de compuestos y,
si se produce internalización, purificar los factores responsables
utilizando métodos estándar de bioquímica.
La invención abarca también un método para
determinar si un compuesto de test es un antagonista o agonista
inverso de B1C3, que está basado en la conocida activación
constitutiva de los receptores acoplados a proteínas G que ocurre
cuando dichos receptores se expresan en grandes cantidades. Este
método requiere que el DNA que codifica el receptor se incorpore en
un vector de expresión de tal manera que el mismo se enlace
operativamente a un promotor y que el vector se utilice luego para
transfectar un hospedador apropiado. Para producir receptor
suficiente para dar como resultado una activación constitutiva del
receptor (es decir, activación en ausencia de ligando natural), se
prefieren sistemas de expresión capaces de producción abundante de
proteínas, v.g., el DNA de B1C3 puede enlazarse operativamente a un
promotor de CMV y expresarse en células COS o HEK293. Después de la
transfección, las células con receptores activados se seleccionan
basándose en que las mismas exhiben una actividad incrementada en
un ensayo de señalización de células con relación a células
comparables que no han sido transfectadas o que han sido
transfectadas con un vector que es incapaz de expresar B1C3
funcional. Típicamente, las células se seleccionarán sea porque las
mismas exhiben un cambio estadísticamente significativo en la
actividad intracelular de adenil-ciclasa, en la
concentración intracelular de calcio, o en la actividad de genes
informadores tales como SEAP (fosfatasa alcalina secretada). Las
células seleccionadas se ponen en contacto con el compuesto de test
y se repite el ensayo de señalización de células para determinar si
esto da como resultado una disminución de la actividad con relación
a células seleccionadas que no se han puesto en contacto con el
compuesto de test. Por ejemplo, una disminución estadísticamente
significativa en la actividad de adenil-ciclasa, la
concentración de calcio o la actividad de SEAP con relación a
células de control indicaría que el compuesto de test es un
antagonista de B1C3. Preferiblemente, el B1C3 utilizado en los
ensayos tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.
Los ensayos para compuestos que interaccionan
con B1C3 pueden realizarse por incubación de una fuente que
contiene el receptor (v.g., una célula transformada establemente)
con un ligando específico para B1C3 tanto en presencia como en
ausencia de compuesto de test y medida de la modulación de la
concentración intracelular de calcio. Un aumento o una disminución
importante en la señalización de calcio estimulada por el ligando
en respuesta al compuesto de test es indicativo de la existencia de
una interacción en el receptor B1C3. El receptor preferido es el
que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto, la presente invención está
dirigida a un método para ensayar un compuesto de test respecto a
su capacidad para alterar la expresión de B1C3. Este método se
realiza cultivando células que expresan B1C3 en presencia del
compuesto de test. Las células se recogen luego y se compara la
expresión de B1C3 con la expresión en células de control cultivadas
en condiciones esencialmente idénticas pero en ausencia del
compuesto de test. El receptor preferido es uno que tiene la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Un compuesto de test
preferido es un oligonucleótido de al menos 15 nucleótidos de
longitud que comprende una secuencia complementaria a la secuencia
del mRNA de B1C3 utilizado en el ensayo.
Figura 1. La Figura 1 contiene la secuencia de
nucleótidos completa de un clon construido por los métodos
descritos en la sección de ejemplos. El clon se depositó en la
International Depository Authority Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH en la dirección Mascheroder
Weg IB, D-3300 Braunschweig, Alemania. El depósito
se efectuó el 14 de mayo de 1999 y le fue asignado el número de
acceso DSM 12808.
Figura 2. La Figura 2 muestra la secuencia de
amino-ácidos deducida de B1C3 de rata. El polinucleótido de la
Figura 1 codifica una proteína de 400 aminoácidos de longitud.
Figura 3. La Figura 3 muestra una comparación de
secuencias entre B1C3 y las secuencias de los receptores
EDG-1 de ratón y rata. B1C3 tiene una homología de
aproximadamente 34% con el receptor EDG-1 de ratón y
aproximadamente una homología de 33% con el receptor
EDG-1 de rata.
La descripción que sigue utiliza varios términos
que hace referencia a la tecnología del DNA recombinante. Con
objeto de proporcionar una comprensión clara y consistente de la
memoria descriptiva y las reivindicaciones, con inclusión del
alcance que debe asignarse a dichos términos, se proporcionan las
definiciones siguientes.
Vector de clonación: Un plásmido o DNA de
fago u otra secuencia de DNA que es capaz de replicarse
autónomamente en una célula hospedadora y que se caracteriza por
uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento por
endonucleasas de restricción. Un fragmento de DNA extraño puede
cortarse y empalmarse al vector en estos sitios a fin de producir
la replicación y clonación del fragmento. El vector puede contener
un marcador adecuado para uso en la identificación de células
transformadas. Por ejemplo, un marcador puede proporcionar
resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.
Vector de expresión: Un vector similar a
un vector de clonación pero que es capaz de inducir la expresión
del DNA que ha sido clonado en él, después de transformación en un
hospedador. El DNA clonado se pone usualmente bajo el control de
(es decir se enlaza operativamente a) ciertas secuencias reguladoras
tales como promotores o intensificadores. Los promotores pueden ser
constitutivos, inducibles o reprimibles.
Sustancialmente puro: Tal como se utiliza
en esta memoria, "sustancialmente puro" significa que el
producto deseado está esencialmente exento de componentes celulares
contaminantes. Una proteína o ácido nucleico "sustancialmente
pura(o)" comprenderá típicamente al menos 85% de una
muestra, prefiriéndose porcentajes mayores. Los contaminantes
pueden incluir proteínas, carbohidratos o lípidos. Un método para
determinar la pureza de una proteína o ácido nucleico consiste en
someter a electroforesis una preparación en una matriz tal como
poliacrilamida o agarosa. La pureza se evidencia por la aparición
de una sola banda después de la tinción. Otros métodos para evaluar
la pureza incluyen cromatografía y centrifugación analítica.
Proteína recombinante: Una proteína
recombinante o receptor recombinante es una proteína no endógena
producida por la introducción de un vector de expresión en células
hospedadoras.
Hospedador: Una célula procariota o
eucariota que es el destinatario de un vector de expresión o vector
de clonación replicable es el "hospedador" de dicho vector. El
término abarca células procariotas o eucariotas que han sido
modificadas por ingeniería genética para incorporar un gen deseado
en su cromosoma o en su genoma. Ejemplos de células que pueden
servir como hospedadores son bien conocidos en la técnica, como lo
son los métodos para la transformación celular (véase, v.g.,
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición, Cold Spring Harbour (1989)).
Promotor: Una secuencia de DNA encontrada
típicamente en la región 5' de un gen, localizada proximal al codón
de partida. La transcripción se inicia en el promotor. Si el
promotor es del tipo inducible, entonces la tasa de transcripción
aumenta en respuesta a un agente inductor.
Secuencia de nucleótidos complementaria:
Una secuencia de nucleótidos complementaria, tal como se utiliza en
esta memoria, se refiere a la secuencia que se produciría por
apareamiento de bases normal. Por ejemplo, la secuencia de
nucleótidos 5'-AGAC-3' tendría la
secuencia complementaria
5'-GTCT-3'.
Expresión: La expresión es el proceso por
el cual se produce un polipéptido a partir de DNA. El proceso
implica la transcripción del gen en mRNA y la traducción de este
mRNA en un polipéptido.
La presente invención está dirigida a una
proteína receptora B1C3, secuencias genéticas que codifican la
proteína, métodos para ensayar compuestos a fin de determinar si
los mismos interaccionan con B1C3 y un método para ensayar
compuestos respecto a su capacidad para alterar la expresión del
receptor.
El ácido nucleico codificante del receptor y el
receptor propiamente dicho se definen por las estructuras que se
muestran en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) y la Figura 2 (SEQ ID NO: 1),
respectivamente. Sin embargo, la invención abarca no sólo
secuencias idénticas a las que se muestran en las figuras y el
listado de secuencias, sino también secuencias que son
esencialmente iguales y secuencias que son por lo demás
sustancialmente iguales y que dan como resultado un receptor que
retiene las características básicas de fijación de B1C3. Por
ejemplo, es bien sabido que pueden utilizarse técnicas tales como
mutagénesis orientada para introducir variaciones en la estructura
de una proteína. Las variaciones en el receptor B1C3 introducidas
por este u otro método similar están abarcadas por la invención con
tal que el receptor resultante retenga las características
cualitativas básicas de fijación y fisiológicas del B1C3
inalterado. Así pues, la invención se refiere a proteínas que
comprenden secuencias de aminoácidos constituidas funcionalmente por
SEQ ID NO: 1.
\newpage
Las secuencias de DNA codificantes de B1C3 de
rata se expresan en todo el sistema nervioso central de la rata
adulta. El tejido de estas áreas puede utilizarse como fuente para
el aislamiento de ácidos nucleicos que codifican el receptor.
Adicionalmente, pueden utilizarse células y líneas de células que
expresan B1C3. Éstas pueden ser o bien células cultivadas que no
han sido sometidas a transformación o líneas de células modificadas
específicamente por ingeniería genética a fin de expresar B1C3
recombinante. Son muy preferidas las células depositadas como DSMZ
No. 12808. El DNA que codifica B1C3 puede obtenerse como resultado
de digestiones estándar de restricción. Alternativamente, puede
aislarse poli A^{+} mRNA a partir de tejido o células, someterse
a transcripción inversa y clonarse. La genoteca de cDNA así formada
puede explorarse luego utilizando sondas derivadas de SEQ ID NO: 2.
Las sondas deberían tener típicamente al menos 14 bases de longitud
y preferiblemente no deberían obtenerse de regiones del DNA
correspondientes a dominios transmembranales de B1C3 altamente
conservados.
Puede obtenerse también B1C3 de células
recombinantes que contengan la secuencia B1C3 de longitud total o
de genotecas de cDNA por realización de amplificaciones PCR con
utilización de iniciadores localizados en cualquier extremo del gen
de B1C3. Estos iniciadores pueden seleccionarse a partir de las
secuencias que se muestran en SEQ ID NO: 2.
La presente invención está dirigida también a
anticuerpos que se fijan específicamente a B1C3 y a un proceso para
producir tales anticuerpos. Anticuerpos que "se fijan
específicamente" se definen como aquéllos que tienen al menos
una afinidad 100 veces mayor para B1C3 que para otras proteínas. El
proceso para producir dichos anticuerpos puede implicar o bien
inyectar la proteína B1C3 propiamente dicha en un animal apropiado
o, alternativamente, inyectar péptidos cortos producidos para
corresponder a regiones diferentes del receptor. Los péptidos
deberían tener una longitud de al menos 5 aminoácidos y deberían
seleccionarse de regiones consideradas como exclusivas de B1C3.
Así, deberían evitarse por regla general regiones transmembranales
altamente conservadas en la selección de péptidos para la
generación de anticuerpos. Métodos para fabricar y detectar
anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica tal
como se evidencia por trabajos estándar de referencia tales como:
Harlow et al., Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, N.Y. (1988)); Klein, Immunology: The Science of
Self-Nonself Discrimination (1982); Kennett et
al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in
Biological Analyses (1980); y Campbell, "Monoclonal Antibody
Technology", en Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology, (1984)).
"Anticuerpo", tal como se utiliza en esta
memoria, tiene por objeto incluir moléculas intactas así como
fragmentos que retienen su capacidad de fijación a un antígeno
(v.g., los fragmentos Fab y F(ab')_{2}). Estos
fragmentos se producen típicamente por escisión proteolítica de
anticuerpos intactos utilizando enzimas tales como papaína (para
producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos
F(ab')_{2}). El término "anticuerpo" se refiere
también tanto a anticuerpos monoclonales como a anticuerpos
policlonales. Los anticuerpos policlonales se derivan de los sueros
de animales inmunizados con el antígeno. Los anticuerpos
monoclonales pueden prepararse utilizando la tecnología del
hibridoma (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Hammerling
et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell
Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981)). En
general, esta tecnología implica inmunizar un animal, usualmente un
ratón, con B1C3 intacto o con un fragmento derivado de B1C3. Los
esplenocitos de los animales inmunizados se extraen y se fusionan
con células de mieloma adecuadas, v.g., células SP_{2}O.
Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se
mantienen selectivamente en medio HAT y se clonan luego por
dilución limitante (Wands et al., Gastroenterology
80:225-232 (1981)). Las células obtenidas por dicha
selección se ensayan luego para identificar clones que secreten
anticuerpos capaces de fijarse a B1C3.
Los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, de
la presente invención pueden utilizarse para detectar la presencia
de B1C3 utilizando cualquiera de una diversidad de inmunoensayos.
Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse en
radioinmunoensayos o en ensayos inmunométricos, conocidos también
como ensayos "de dos sitios" o "sándwich" (véase
Chard, T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related
Techniques", en Laboratory Techniques in Biochemistry and
Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)). En un
ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo sin marcar
se fija a un soporte sólido que es insoluble en el líquido de test,
v.g., sangre, linfa, extractos celulares, etc. Después de la
fijación inicial del antígeno al anticuerpo inmovilizado, se añade
una cantidad de un segundo anticuerpo marcado detectablemente (que
puede ser o no el mismo que el primero) para permitir la detección
y/o cuantificación del antígeno fijado (véase, v.g.,
Radioimmune Assay Method, Kirkham et al., compiladores, pp.
199-206, E & S. Livingstone, Edimburgo (1970)).
Muchas variaciones de estos tipos de ensayos se conocen en la
técnica y pueden emplearse para la detección de B1C3.
Los anticuerpos para B1C3 pueden utilizarse
también en la purificación del receptor intacto o fragmentos del
receptor (véase en general: Dean et al., Affinity
Chromatography. A Practical Approach, IRL Press (1986)).
Típicamente, el anticuerpo se inmoviliza sobre una matriz
cromatográfica tal como Sepharose 4B. La matriz se empaqueta luego
en una columna y la preparación que contiene B1C3 se hace pasar a su
través en condiciones que promueven la fijación, v.g. en
condiciones de baja concentración de sal. La columna se lava luego y
el B1C3 fijado se eluye utilizando un tampón que promueve la
disociación del anticuerpo, v.g., un tampón que tiene un pH o
concentración de sal alterados. El B1C3 eluido puede transferirse a
un tampón de elección, v.g., por diálisis, y guardarse luego o
utilizarse directamente.
\global\parskip0.850000\baselineskip
Uno de los usos principales de los ácidos
nucleicos y proteínas recombinantes de B1C3 es en ensayos diseñados
para identificar agentes capaces de fijarse al receptor. Tales
agentes pueden ser agonistas, que mimetizan los efectos normales de
la fijación del receptor, o antagonistas, que inhiben los efectos
normales de la fijación del receptor. Es particularmente
interesante la identificación de agentes que se fijan al receptor
B1C3 y modulan la señalización intracelular, tal como la actividad
de adenil-ciclasa o calcio intracelular. Estos
agentes tienen aplicación terapéutica potencial como analgésicos o
anestésicos.
En los ensayos de fijación de radioligandos, una
fuente de B1C3 se incuba junto con un ligando conocido por fijarse
al receptor y con el compuesto que se testa para actividad de
fijación. La fuente preferida de B1C3 son células, preferiblemente
células de mamífero, transformadas para expresar el receptor
recombinantemente. Las células seleccionadas no deben expresar una
cantidad sustancial de ningún otro receptor acoplado a proteína G
que pudiera fijarse al ligando y distorsionar los resultados. Esto
puede determinarse fácilmente por realización de ensayos de
fijación sobre células derivadas del mismo tejido o línea de células
que las que expresan B1C3 recombinantemente pero que no han sufrido
transformación alguna.
El ensayo puede realizarse con células intactas
o con membranas preparadas a partir de las células (véase,
v.g., Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:10230-10234 (1993)). Las membranas, o las
células, se incuban con un ligando específico para el receptor B1C3
y con una preparación del compuesto que se testa. Después que se ha
completado la fijación, el receptor se separa de la solución que
contiene el ligando y el compuesto de test, v.g., por filtración, y
se determina la cantidad de fijación que ha ocurrido.
Preferiblemente, el ligando utilizado está marcado detectablemente
con un radioisótopo tal como ^{125}I. No obstante, en caso
deseado, pueden utilizarse en su lugar marcadores fluorescentes o
quimioluminiscentes. Entre los compuestos marcadores fluorescentes
utilizados más corrientemente se encuentran isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina,
aldehído o-ftálico y fluorescamina. Compuestos
quimioluminiscentes útiles incluyen luminol, isoluminol, éster
teromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio, y éster
oxalato. Cualquiera de estos agentes puede utilizarse para producir
un ligando adecuado para uso en el ensayo.
La fijación inespecífica puede determinarse
realizando la reacción de fijación en presencia de un gran exceso
de ligando sin marcar. Por ejemplo, el ligando marcado puede
incubarse con el receptor y el compuesto de test en presencia de un
exceso de mil veces de ligando sin marcar. La fijación inespecífica
debe sustraerse de la fijación total, es decir la fijación en
ausencia del ligando sin marcar, para llegar a la fijación
específica para cada muestra testada. Otros pasos tales como
lavado, agitación, sacudidas, filtración y análogos pueden
incluirse en los ensayos en caso necesario. Típicamente, se incluyen
pasos de lavado después de la separación del ligando fijado a la
membrana del ligando que permanece en solución y antes de la
cuantificación de la cantidad de ligando fijada, v.g., por recuento
de un isótopo radiactivo. La fijación específica obtenida en
presencia de compuesto de test se compara con la obtenida en
presencia exclusivamente de ligando marcado para determinar la
extensión en la que el compuesto de test ha desplazado la fijación
del receptor.
En la realización de ensayos de fijación, debe
tenerse cuidado para evitar artefactos que pueden hacer que parezca
que un compuesto de test está interaccionando con el receptor B1C3
cuando, en realidad, la fijación está siendo inhibida por cualquier
otro mecanismo. Por ejemplo, el compuesto a testar debería
encontrarse en un tampón que no inhiba en sí mismo sustancialmente
la fijación del ligando a B1C3 y, preferiblemente, debería testarse
a varias concentraciones diferentes. Las preparaciones del compuesto
de test deberían examinarse también en cuanto a actividad
proteolítica, y es deseable que se incluyan antiproteasas en los
ensayos. Finalmente, es muy deseable que los compuestos
identificados como desplazadores de la fijación del ligando al
receptor B1C3 se examinen de nuevo en una gama de concentraciones
suficiente para realizar un análisis Scatchard de los resultados.
Este tipo de análisis es bien conocido en la técnica y puede
utilizarse para determinar la afinidad de un compuesto de test para
un receptor (véase, v.g., Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, 11.2.1-11.2.19
(1993); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,
Work et al., ed., N.Y. (1978) etc.). Pueden utilizarse
programas de ordenador para facilitar el análisis de los resultados
(véase, v.g., Munson, P., Methods Enzymol.
92:543-577 (1983); McPherson, G.A., Kinetic,
EBDA Ligand, Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis Programs,Elsevier-Biosoft, Reino Unido (1985)).
EBDA Ligand, Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysis Programs,Elsevier-Biosoft, Reino Unido (1985)).
La activación del receptor por la fijación del
ligando puede monitorizarse utilizando cierto número de ensayos
diferentes. Por ejemplo, pueden realizarse ensayos de
adenil-ciclasa por cultivo de células en los
pocillos de una placa de microtitulación e incubación posterior de
los pocillos en presencia o ausencia del compuesto de test. Puede
extraerse luego el cAMP en etanol, liofilizarse y suspenderse de
nuevo en tampón de ensayo. El ensayo del cAMP así recuperado puede
realizarse utilizando cualquier método para determinación de la
concentración de cAMP, v.g., el Sistema J Biotrack cAMP
Enzyme-Immunoassay (Amersham) o el Sistema Cyclic
AMP[^{3}H] Assay (Amersham). Típicamente, los ensayos de
adenil-ciclasa se realizaran por separado de los
ensayos de fijación, aunque puede ser también posible realizar los
ensayos de fijación y de adenil-ciclasa sobre una
misma preparación de células. Otros "ensayos de
señalización de células" que pueden utilizarse para monitorizar
la actividad del receptor se describen a continuación.
Los receptores B1C3 pueden utilizarse también
para seleccionar fármacos candidato utilizando ensayos de
señalización de células. Para identificar agonistas de B1C3, el DNA
que codifica un receptor se incorpora en un vector de expresión y
se transfecta luego a un hospedador apropiado. Las células
transformadas se ponen luego en contacto con una serie de
compuestos de test y se monitoriza el efecto de cada uno. Entre los
ensayos que pueden utilizarse se encuentran ensayos que miden la
producción de cAMP (véase la discusión anterior), ensayos que miden
la activación de la actividad de un gen informador, ensayos que
miden la modulación de la fijación de ligando, v.g.,
GTP-gamma-S, o ensayos que miden
cambios en la concentración intracelular de calcio.
Los ensayos de señalización de células pueden
utilizarse también para identificar antagonistas de B1C3. Receptores
acoplados a proteínas G pueden ponerse en su estado activo incluso
en ausencia de su ligando cognato por expresión de los mismos a
concentración muy alta en un sistema heterólogo. Por ejemplo, el
receptor puede sobreexpresarse utilizando la infección por
baculovirus de células de insecto Sf9, o bien puede enlazarse
operativamente el gen de B1C3 a un promotor CMV y expresarse en
células COS o HEK293. En este estado constitutivo activado, los
antagonistas del receptor pueden identificarse en ausencia de
ligando por medida de la aptitud de un compuesto de test para
inhibir la actividad constitutiva de señalización de células.
Ensayos apropiados para esto son, una vez más, ensayos de cAMP,
ensayos de activación de genes informadores o ensayos que miden la
fijación de GTP-gamma-S.
Un ensayo preferido de señalización de células
está basado en células transfectadas establemente con B1C3 que
exhiben un cambio en los niveles intracelulares de calcio en
respuesta a la incubación en presencia de ligando. Así, puede
utilizarse un procedimiento para identificar agonistas o
antagonistas de B1C3 que es similar a los ensayos con
radiorreceptores expuestos anteriormente, excepto que se mide la
concentración de calcio en lugar de la radiactividad fijada. La
concentración de calcio en presencia del compuestos de test y el
ligando se compara con la existente en presencia de ligando solo
para determinar si el compuesto de test está interaccionando con el
receptor B1C3. Un aumento estadísticamente significativo en el
calcio intracelular en respuesta al compuesto de test indica que el
compuesto de test está actuando como agonista, mientras que una
disminución estadísticamente significativa en el calcio
intracelular indica que aquél está actuando como antagonista.
Pueden realizarse también ensayos que miden la
activación de un gen informador. Por ejemplo, las células que
expresan B1C3 recombinante pueden transfectarse con un gen
informador (v.g., un gen de
cloranfenicol-acetiltransferasa o luciferasa)
enlazado operativamente a un elemento de respuesta a
adenil-ciclasa o diacilglicerol. Las células se
incuban luego con los compuestos de test, y la expresión del gen
informador se compara con la expresión en células de control que no
expresan B1C3 recombinante pero que son esencialmente idénticas en
otros aspectos. Un cambio estadísticamente significativo en la
expresión del gen informador en las células que expresan B1C3 es
indicativo de un compuesto de test que interacciona con el receptor
B1C3.
Una vía para aumentar o disminuir los efectos
biológicos de B1C3 consiste en alterar la extensión en la que el
receptor se expresa en las células. Por esta razón, los ensayos para
la identificación de compuestos que inhiben o intensifican la
expresión presentan un interés considerable. Estos ensayos se
efectúan cultivando células que expresan B1C3 en presencia de un
compuesto de test y comparando luego la expresión del receptor en
estas células con la expresión en células cultivadas en condiciones
esencialmente idénticas pero en ausencia del compuesto de test.
Como en los ensayos de fijación expuestos anteriormente, es deseable
que las células utilizadas estén sustancialmente exentas de
receptores competidores acoplados a proteínas G. Una vía para medir
la expresión del receptor consiste en fusionar la secuencia de B1C3
a una secuencia que codifique un péptido o proteína que pueda
cuantificarse fácilmente. Por ejemplo, la secuencia de B1C3 puede
ligarse a una secuencia que codifique hemaglutinina y utilizarse
para transfectar células de manera estable. Después de la
incubación con el compuesto de test, el complejo
hemaglutinina/receptor puede someterse a inmunoprecipitación y
realizarse transferencias Western utilizando un anticuerpo
anti-hemaglutinina. Alternativamente, puede
realizarse un análisis Scatchard de los ensayos de fijación con
ligando marcado a fin de determinar el número de receptores. Los
ensayos de fijación pueden realizarse como se ha expuesto
anteriormente y uti-
lizarán preferiblemente células que se han modificado por ingeniería genética para expresar B1C3 recombinantemente.
lizarán preferiblemente células que se han modificado por ingeniería genética para expresar B1C3 recombinantemente.
Un grupo preferido de compuestos de test para
inclusión en el ensayo de expresión de B1C3 está constituido por
oligonucleótidos complementarios a diversos segmentos de la
secuencia de ácido nucleico de B1C3 que se muestra en SEQ ID NO: 2.
Estos oligonucleótidos deberían tener una longitud de al menos 15
bases y deberían derivarse de regiones no conservadas de la
secuencia de ácido nucleico del receptor.
Los oligonucleótidos que se haya encontrado que
reducen la expresión del receptor pueden derivatizarse o conjugarse
a fin de aumentar su eficacia. Por ejemplo, se pueden emplear
nucleosido-fosforotioatos en sustitución de sus
contrapartidas naturales (véase Cohen, J.,
Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC
Press (1989)). Los oligonucleótidos pueden suministrarse también a
un paciente in vivo para el propósito de inhibir la
expresión de B1C3. Cuando se hace esto, se prefiere que el
oligonucleótido se administre en una forma que aumente su adsorción
por las células. Por ejemplo, el oligonucleótido puede suministrarse
por medio de un liposoma o conjugado a un péptido que es ingerido
por las células (véanse, v.g., las Patentes U.S. núms.
4.897.355 y 4.394.448; véanse también los documentos no
patentados en los Estados Unidos WO 8903849 y EP 0263740). Otros
métodos para aumentar la eficiencia del suministro de
oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica y son también
compatibles con la presente invención.
Una vez descrita la invención, la misma se
comprenderá más fácilmente por referencia a los ejemplos que siguen,
que se proporcionan a modo de ilustración y no deben interpretarse
como limitantes del alcance de la invención.
Generación de la Sonda para la Exploración de
una Genoteca de cDNA: Un método de obtención de una nueva
secuencia codificante de un receptor consiste en realizar una
exploración a severidad moderada o baja de genotecas de cDNA con
una sonda relevante. Para encontrar nuevos genes afines a receptores
de lípidos (fosfato de esfingosina, ácido lisofosfatídico,
cannabinoides, etc) se utilizó la secuencia de un EST (Etiqueta de
Secuencia Expresada), aa451451, a fin de generar una sonda de cDNA
para la exploración de genotecas de cDNA. Se utilizaron los
oligonucleótidos siguientes para la PCR:
Se utilizaron dos de estos oligonucleótidos en
una mezcla para reacción en cadena de polimerasa (volumen total 100
\mul), que contenía 1.5il [sic] de una genoteca de cDNA de cerebro
de rata (sin el cerebelo) en pcDNA1 (Invitrogen), tampón 1X PCR
((NH_{4})_{2}SO_{4} 14 mM, MgCl_{2} 1,5 mM,
Tris-HCl 50 mM (pH 9,2), Roche Diagnostics), dNTPs
200 \muM (Amersham-Pharmacia), 2,6 U de Expand
High FidelityJ (Roche Diagnostics) y 100 pmoles de cada uno de los
iniciadores SP6 y 451-1R. La amplificación se llevó
a cabo en un Gene Amp PCR Sys 9700J (Perkin Elmer: Applied
Biosystems). El molde se desnaturalizó a 94ºC durante 3 minutos,
seguido por 35 ciclos constituidos por pasos de desnaturalización,
reasociación y extensión, cada uno durante 1 minuto a 94ºC, 53ºC y
72ºC, respectivamente, y se extendió luego durante 5 minutos más a
72ºC.
El producto resultante se diluyó en relación
1:100 y se amplificó con iniciadores SP6-1R y
451-3R. La mezcla de la reacción en cadena de
polimerasa (50 il) contenía 1 il de solución diluida de la primera
reacción PCR, 1X tampón PCR (el mismo que anteriormente, Roche
Diagnostics), 200 iM de dNTPs (Amersham-Pharmacia),
2,6 U Expand High FidelityJ (Roche Diagnostics) y 50 pmoles de cada
uno de los iniciadores SP6-1R y
451-3R. La amplificación se llevó a cabo en un Gene
Amp PCR Sys 9700J (Perkin Elmer: Applied Biosystems). El molde se
desnaturalizó a 94ºC durante 3 minutos, seguido por 25 ciclos
constituidos por pasos de desnaturalización, reasociación y
extensión a 94ºC (1 minuto),
53ºC (1 minuto) y 72ºC (1 minuto y 20 segundos) respectivamente, y se extendió luego durante 5 minutos más a 72ºC.
53ºC (1 minuto) y 72ºC (1 minuto y 20 segundos) respectivamente, y se extendió luego durante 5 minutos más a 72ºC.
Un producto PCR de 450 pb se escindió y se
purificó con el kit de extracción en gel QIAquickJ (Qiagen), se
hizo romo en los extremos con Klenow
(Amersham-Pharmacia) y se subclonó en KS- digerido
con ER V, y desfosforilado. Los plásmidos se prepararon con el
protocolo de lisis alcalina utilizando un kit Qiaprep 8J (Qiagen) y
se exploraron por secuenciación utilizando el kit de reacción
rápida de secuenciación por ciclos ABI Prism dRhodamineJ (PE
Applied Biosystems). La secuencia del fragmento de 450 pb de rata
era idéntica a la de EST aa451451. Se digirió luego un fragmento
NotI/HindIII de 400 pb, se escindió y se purificó con el kit de
extracción de gel QIAquickJ (Qiagen) para utilizarlo como
herramienta para aislar un clon de rata afín a EDG.
Exploración de Genotecas de cDNA: Una
genoteca de cDNA de tallo cerebral/médula espinal de rata de
Stratagene (cat #936521) se exploró utilizando el fragmento
NotI/HindIII como sonda. Se extendieron en placas 8 x 10^{5}
calvas, se transfirieron a filtros Hybond N+J
(Amersham-Pharmacia), se desnaturalizaron durante 5
minutos (NaCl 1,5 M y NaOH 0,5 M) y se neutralizaron durante 5
minutos (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 8). Los
filtros se enjuagaron en 2X SSC y se secaron al aire durante una
hora a la temperatura ambiente. Las membranas se hibridaron durante
una noche a 42ºC en formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10%
(procedente de una solución al 50%), SDS al 1%, 5 x SSC, 1 x
Denhardt's, Tris 10 mM de pH 8 y 100 g/ml de esperma de salmón
tratado por ultrasonidos. El fragmento NotI/HindIII se marcó
aleatoriamente utilizando T7 Quick PrimeJ
(Amersham-Pharmacia) y se añadió a la solución de
hibridación a 3 x 10^{6} cpm/ml. Los filtros se lavaron con 2X
SSC/0,1% SDS a la temperatura ambiente seguido por un lavado de
alta severidad con 0,2 x SSC/0,1% SDS a 65ºC.
Utilizando este procedimiento de exploración, se
identificaron 6 clones independientes y se aislaron por extensión
en placa y exploración repetidas con el fragmento NotI/HindIII
marcado. Se sometieron dos clones independientes a secuenciación
(clones BIA7 y C3A3). El análisis de la secuencia de DNA reveló que
el clon B1A7 contenía la secuencia 5' de un nuevo GPCR supuesto,
pero faltaba el extremo 3'. Aunque C3A3 contenía la secuencia
codificante entera, faltaba un nucleótido, lo que conducía a un
codón de parada prematuro. Con objeto de obtener la secuencia
codificante completa, los dos clones se digirieron con XbaI y se
ligaron uno a otro. El clon resultante "B1C3" contiene la
región codificante completa de un GCPR nuevo supuesto.
Resultados: La secuencia de nucleótidos
completa del clon de cDNA de B1C3 se muestra en la Figura 1. El
marco de lectura abierto comprende 1203 nucleótidos, que codifican
una proteína de 401 aminoácidos (Figura 2) con un peso molecular
predicho de aproximadamente 42,3 kDa. La secuencia de proteína
contiene las características identificadoras de los GCPRs: la
presencia de 7 hélices hidrófobas que parecen representar dominios
transmembranales; un término amino; y un término carboxi.
Adicionalmente, varios sitios de modificación propuestos como
implicados en la regulación de la función del receptor están
presentes también en la secuencia de aminoácidos predicha. Así, la
secuencia del receptor tiene: un sitio potencial de fosforilación de
cAMP en la posición 236; sitios de glicoxilación enlazados a N;
sitios de miristilación; y sitios de fosforilación de Proteína
Quinasa-C. La secuencia de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos primaria predicha del receptor B1C3 no
están presentes en su totalidad en la base de datos Genebank. Las
secuencias se asemejan muy estrechamente a las del receptor
EDG-1 de ratón y de rata (receptor del gen de
diferenciación epitelial). Una alineación de secuencias de B1C3 con
receptores conocidos revela que el mismo es idéntico
aproximadamente en un 34% al receptor EDG-1 de ratón e idéntico en un 33% al receptor EDG-1 de rata (Figura 3).
aproximadamente en un 34% al receptor EDG-1 de ratón e idéntico en un 33% al receptor EDG-1 de rata (Figura 3).
Preparación del Tejido: Se sacrificaron
ratas macho Sprague-Dawley adultas (aproximadamente
250 g, Charles River, St.-Constant, Quebec) por decapitación. Se
extirparon rápidamente el cerebro, la médula espinal con DRGs
todavía unidos y varios tejidos periféricos (corazón, riñón, bazo,
hígado, pulmón y músculo esquelético), se congelaron
instantáneamente en isopentano a -40ºC durante 20 s y se guardaron a
-80ºC. El tejido congelado se seccionó a 16 m en un criostato
Microm HM 500MJ (Alemania) y se montó descongelado en portaobjetos
ProbeOn PlusJ (Fisher Scientific, Montreal, Quebec). Las secciones
se guardaron a -80ºC antes de la hibridación in situ.
Síntesis de Ribosonda: El plásmido
pBluescript KS^{-}-B1A7, que contenía un fragmento
de 1 kb del extremo 5' del gen B1A7, se linealizó por corte en el
sitio del polienlazador a ambos lados del cDNA insertado utilizando
las enzimas de restricción NotI o SacI (Pharmacia Biotech, U.S.A.) y
los tampones apropiados. Las ribosondas B1A7 antisentido y sentido
se transcribieron in vitro utilizando RNA polimerasa T7 o T3
(Promega), respectivamente, en presencia de
-[^{35}S]-UTP (aproximadamente 800 Ci/mmol;
Amersham, Oakville, Ontario).
Hibridación in situ : Se
post-fijaron secciones en paraformaldehído al 4%
(BDH, Poole, Inglaterra) en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,4)
durante 10 min a la temperatura ambiente (TA) y se enjuagaron en 3
cambios de tampón de citrato de sodio estándar 2X (SSC; NaCl 0,15
M; citrato de sodio 0,015 M, pH 7,0). Las secciones se equilibraron
luego en trietanolamina 0,1 M, se trataron con anhídrido acético al
0,25% en trietanolamina, se enjuagaron en 2X SSC y se deshidrataron
en una serie de etanol (50-100%). La hibridación se
realizó en un tampón que contenía formamida al 75% (Sigma, St.
Louis, Mo.), NaCl 600 mM, Tris 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, 1X
solución de Denhardt (Sigma), 50 g/ml de DNA de esperma de salmón
desnaturalizado (Sigma), sulfato de dextrano al 10% (Sigma),
ditiotreitol 20 mM y sondas de cRNA marcadas con
-[^{35}S]-UTP (10 x 10^{6} cpm/ml) a 55ºC
durante 18 h en cámaras humidificadas. Después de la hibridación,
los portaobjetos se enjuagaron en 2X SSC a la temperatura ambiente,
se trataron con 20 g/ml de RNasa IA (Pharmacia) en tapón de RNasa
(Tris 100 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) durante 45 min a 37ºC
y se lavaron hasta una severidad final de 0,1X SSC a 70ºC. Las
secciones se deshidrataron luego con etanol y se expusieron a
película Kodak Biomax MRJ durante 14-21 días,
después de lo cual se sumergieron en emulsión Kodak NTB2 diluida en
relación 1:1 con agua destilada y se expusieron durante
7-8 semanas a 4ºC antes del revelado y la
contratinción con acetato de cresil-violeta
(Sigma).
Resultados: Los autorradiogramas de la
película de hibridación in situ revelan que el mRNA de B1A7
se expresa ubicuamente en el sistema nervioso central (CNS) de la
rata adulta. En la médula espinal de la rata, el mRNA de B1A7 se
expresa abundantemente de manera uniforme en toda la sustancia
blanca y la sustancia gris. En cambio, en el cerebro de la rata el
mRNA de B1A7 se expresa variablemente. El mRNA del receptor se
expresa fundamentalmente en tractos de fibras por todo el cerebro, a
saber, el cuerpo calloso, la comisura anterior (anterior y
posterior), el fórnix, las fimbrias (del hipocampo), la cápsula
interna y el pedúnculo cerebelar. Otras estructuras, con inclusión
del córtex piriforme del lóbulo olfatorio, el hipocampo y el núcleo
habenular están marcadas moderadamente; mientras que diversas otras
regiones del cerebro, tales como el córtex y la sustancia gris
periacueductal, por ejemplo, expresan mensajes moderada-
mente. El examen al microscopio de las secciones procesadas en emulsión sugiere que estas células no son neuronales.
mente. El examen al microscopio de las secciones procesadas en emulsión sugiere que estas células no son neuronales.
Además de esta distribución central, se detecta
una señal de hibridación moderada para el mensaje de B1A7 en el
bazo de la rata adulta, pero no en corazón, riñón, hígado, pulmón o
músculo esquelético. Los resultados preliminares, utilizando la
ribosonda de B1A7 de rata, indican que el mRNA del receptor B1A7
está distribuido análogamente en el CNS del ratón, mientras que no
se detecta marcación alguna en las médulas espinales o DRGs humanas
adultas.
Un método que puede utilizarse para identificar
el ligando endógeno o para explorar compuestos naturales o
sintéticos consiste en enlazar estructuralmente el receptor,
preferiblemente por su término carboxi a una sonda fluorescente,
por ejemplo la proteína fluorescente verde (GFP). Es un hecho bien
conocido que después de estimulación con un agonista, los GPCRs se
internalizan (Ashworth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
92:512-516 (1995)). Cuando se acoplan a una sonda
fluorescente (v.g., GFP) puede monitorizarse fácilmente la
internalización del receptor por técnicas convencionales (v.g.,
microscopía fluorescente o confocal, etc.). Por consiguiente, puede
prepararse el extracto tisular de cerebro, médula espinal, etc.,
incubar un extracto fraccionado con las células que expresan el
constructo híbrido GPCR-GFP y monitorizar la
internalización. Únicamente las fracciones que contienen ligando
endógeno para este GPCR particular harán que el híbrido se
internalice. Una fracción activa de este tipo puede fraccionarse
luego adicionalmente hasta que se consigue la recuperación de un
ligando puro. Análogamente, pueden ensayarse los compuestos
activadores del receptor en una mezcla compleja de una genoteca de
compuestos sintética.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Astra Pharma Inc.
\hskip1cm Ahmad, Sultan
\hskip1cm Hoffert, Cyrla
\hskip1cm O'Donnell, Dajan
\hskip1cm Pelletier, Manon
\hskip1cm Wlaker, Philippe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Receptor Acoplado a Proteína G
B1C3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> transeúnte 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 400
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Iniciador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttaggtga cactatagaa ta
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Iniciador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgcggaag gagtagatg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Iniciador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctctagatg catgctcgag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Iniciador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggagcagg ccaaacagg
\hfill19
Claims (15)
1. Una proteína, excepto la existente en la
naturaleza, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
1.
2. La proteína de la reivindicación 1, en donde
dicha proteína está constituida por la secuencia de amino-ácidos de
SEQ ID NO: 1.
3. Un anticuerpo que tiene al menos una afinidad
100 veces mayor para la proteína de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que cualquier otra proteína.
4. Un polinucleótido, excepto como existe en la
naturaleza, que codifica una proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
5. El polinucleótido de la reivindicación 4, en
donde dicho polinucleótido codifica una proteína constituida por la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
6. El polinucleótido de la reivindicación 4, en
donde dicho polinucleótido está constituido por la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 2.
7. Un vector de expresión que comprende el
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones
4-6.
8. Una célula hospedadora aislada transformada
con el vector de la reivindicación 7.
9. Un método para determinar si un compuesto de
test es un agonista de la proteína de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende:
- a)
- incubar una célula que expresa la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 con dicho compuesto de test; y
- b)
- determinar si dicho compuesto de test causa un aumento estadísticamente significativo en la actividad intracelular de adenil-ciclasa o la concentración intracelular de calcio.
10. Un método para determinar si un compuesto de
test es un ligando o agonista de la proteína de la reivindicación 1
o la reivindicación 2 que comprende determinar si una célula que
expresa una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos
constituida funcionalmente por SEQ ID NO: 1 internaliza dicha
proteína en respuesta al contacto con dicho compuesto de test.
11. El método de la reivindicación 10, en
donde:
- a)
- dicha proteína se expresa recombinantemente en dicha célula como una proteína de fusión enlazada a una proteína fluorescente;
- b)
- la célula del paso (a) se pone en contacto con dicho compuesto de test; y
- c)
- la internalización de dicha proteína se determina por microscopía.
12. Un método para determinar si un compuesto de
test es un antagonista de la proteína de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que comprende:
- a)
- incorporar una molécula de DNA que codifica la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en un vector de expresión de tal modo que aquélla se enlaza operativamente a un promotor;
- b)
- transfectar dicho vector de expresión a un hospedador;
- c)
- seleccionar las células transfectadas en el paso b) que tienen la proteína activada constitutivamente como se evidencia por:
- i)
- un aumento estadísticamente significativo en la actividad intracelular de adenil-ciclasa; o
- ii)
- un aumento estadísticamente significativo en la concentración intracelular de calcio;
- d)
- poner en contacto las células seleccionadas en el paso c) con dicho compuesto de test; y
- e)
- determinar si dicho compuesto de test causa una disminución estadísticamente significativa en dicha actividad de adenil-ciclasa o dicha concentración de calcio con relación a células de control que no se han puesto en contacto con dicho compuesto de test.
13. Un método para ensayar un compuesto de test
respecto a su capacidad para alterar la expresión de la proteína de
la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende:
- a)
- cultivar células que expresan la proteína de la reivindicación 1 o la reivindicación 2;
- b)
- recoger dichas células; y
- c)
- comparar la expresión de la proteína en las células expuestas a dicho compuesto de test con células de control cultivadas en condiciones esencialmente idénticas pero no expuestas a dicho compuesto de test.
14. El método de la reivindicación 13, en el
cual dichas células que expresan dicha proteína son células
transformadas con un vector de expresión que comprende una secuencia
de polinucleótidos que codifica la proteína de la reivindicación 1 o
la reivindicación 2.
15. El método de la reivindicación 13 o la
reivindicación 14, en el cual dicho compuesto de test es un
oligonucleótido de al menos 15 nucleótidos de longitud y que
comprende una secuencia complementaria a la secuencia de
polinucleótidos que codifica dicha proteína.
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