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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, die einen neuen G-Protein-gekoppelten
Rezeptor codieren, und den Rezeptor selbst.
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Hintergrund der Erfindung
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G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren (GPCRs) bilden eine Familie von Proteinen, die eine gemeinsame strukturelle
Organisation teilen, die durch ein extrazelluläres N-terminales Ende, sieben
hydrophobe alpha-Helizes, welche vermutlich Transmembrandomänen darstellen,
und eine intrazelluläre
C-terminale Domäne
gekennzeichnet ist. GPCRs binden eine große Vielfalt von Liganden, welche
intrazelluläre
Signale durch die Aktivierung von transduzierenden G-Proteinen auslösen (Caron
et al., Rec. Prog. Horm. Res. 48: 277–290 (1993); Freedman et al.,
Rec. Prog. Horm. Res. 51: 319–353
(1996)).
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Ungefähr 50–60% aller
klinisch relevanten Arzneimittel wirken durch Modulieren der Funktionen
von verschiedenen GPCRs (Cudermann et al., J. Mol. Med. 73: 51–63 (1995)).
Von besonderem Interesse sind Rezeptoren, die im Zentralnervensystem
lokalisiert sind. G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren in dieser Region sind bekanntermaßen an der Weiterleitung, Modulation
und Empfindung von Schmerz beteiligt. Somit können aus dem Gehirn und dem
Rückenmark
abgeleitete G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren in Assays für
die Identifizierung neuer anästhetischer
und analgetischer Mittel verwendet werden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Ermittlung eines neuen G-Protein-gekoppelten
Rezeptors, der von früher
berichteten Rezeptoren strukturell verschieden ist. Er wird hierin
als "B1C3-Rezeptor" bezeichnet.
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In
ihrem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Protein, das nicht
in der Natur vorkommt und die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1
umfaßt.
Der Begriff "funktionell
bestehend aus" bezeichnet
Proteine, in denen die Sequenz von SEQ ID NO: 1 Additionen, Deletionen
oder Substitutionen unterzogen worden ist, welche die funktionellen
Merkmale des Rezeptors nicht wesentlich verändern. Mit dem Begriff wird
beabsichtigt, Proteine einzuschließen, welche exakt die gleiche
Aminosäuresequenz
wie jene von SEQ ID NO: 1 aufweisen, wie auch Proteine mit Sequenzunterschieden,
die nicht wesentlich sind, wie es dadurch verdeutlicht wird, daß sie die
grundlegenden qualitativen Ligandenbindungs- und physiologischen Eigenschaften des
B1C3-Rezeptors beibehalten. Der Begriff "nicht wie in der Natur vorkommend" bezieht sich auf
eine Verbindung, welche entweder durch rekombinante Mittel exprimiert
wird oder welche in einem gereinigten (vorzugsweise im wesentlichen
gereinigten) Zustand vorliegt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
besitzt das Protein eine Aminosäuresequenz,
die aus der Sequenz der SEQ ID NO: 1 besteht. Die Erfindung schließt Antikörper ein,
welche präferentiell
an ein solches Protein binden (d. h. Antikörper mit einer mindestens 100fach
größeren Affinität für B1C3 als
für ein
beliebiges anderes Protein); und Antikörper, die durch ein Verfahren
hergestellt werden, das die Injektion einer pharmazeutisch annehmbaren
Präparation
von B1C3 in ein Tier, das zur Antikörperherstellung in der Lage
ist, beinhaltet. Vorzugsweise wird monoklonaler Antikörper gegen
B1C3 durch Verabreichen von B1C3 an eine Maus und danach Fusionieren
der Milzzellen der Maus mit Myelomzellen hergestellt.
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Die
Erfindung richtet sich auch auf ein Polynukleotid, außer wie
in der Natur vorkommend, das ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 1 umfaßt.
Dieser Aspekt der Erfindung beinhaltet Polynukleotide, die Proteine
codieren, welche aus der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 1 bestehen, Expressionsvektoren, die solche Polynukleotide
umfassen, und isolierte Wirtszellen, die mit solchen Vektoren transformiert
sind. Ebenfalls eingeschlossen ist rekombinanter B1C3-Rezeptor,
der von isolierten Wirtszellen produziert wird, die auf diese Weise
hergestellt wurden. Vorzugsweise weist das den B1C3-Rezeptor codierende
Polynukleotid eine Sequenz auf, die aus der Nukleotidsequenz von
SEQ ID NO: 2 besteht, und die Vektoren und isolierten Wirtszellen,
die zur Expression des Rezeptors verwendet werden, verwenden ebenfalls dieses
besondere Polynukleotid.
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In
einem anderen Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf
ein Verfahren zum Assay einer Testverbindung hinsichtlich ihrer
Fähigkeit,
an den B1C3-Rezeptor zu binden. Das Verfahren wird durchgeführt mittels
Inkubieren einer Quelle von B1C3 mit einem Ligand, der bekannterweise
an den Rezeptor bindet, und mit der Testverbindung. Die Quelle von
Rezeptor sollte vorzugsweise eine große Menge an B1C3 relativ zu anderen
G-Protein-gekoppelten Rezeptoren exprimieren. Nach Abschluß der Inkubation
wird die Fähigkeit
der Testverbindung, an B1C3 zu binden, durch das Ausmaß, zu welchem
die Ligandenbindung verdrängt
worden ist, bestimmt. Vorzugsweise sollte der vorhandene Rezeptor
die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Sequenz aufweisen. Obwohl nicht essentiell,
kann der Bindungsassay von einem Assay begleitet werden, um zu bestimmen,
ob ein Second-Messenger-Weg, z. B. der Adenylcyclase-Weg, aktiviert
worden ist. Dies sollte dabei helfen, zu bestimmen, ob eine bestimmte
Verbindung, die an B1C3 bindet, als ein Agonist oder Antagonist
wirkt.
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Ein
zweites Verfahren zur Bestimmung, ob eine Testverbindung ein B1C3-Agonist
ist, ein Verfahren, das keinen Ligand erfordert, besteht darin,
einen Zell-Signalleitungs-Assay
zu verwenden, z. B. einen Assay, der entweder die intrazelluläre Adenylcyclaseaktivität oder die
intrazelluläre
Calciumkonzentration mißt.
Die Testverbindung sollte im allgemeinen mit Zellen inkubiert werden,
die hohe Mengen an B1C3 relativ zu anderen G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren exprimieren, typischerweise einer Zelle, die mit einem
Expressionsvektor transfiziert ist, der das B1C3 von SEQ ID NO:
1 codiert. Testverbindungen, die Agonisten sind, werden dadruch
identifiziert, daß sie
eine statistisch signifikante Änderung
in den aus dem Zell-Signalleitungs-Assay erhaltenen Ergebnissen
verursachen, wenn mit nicht der Testverbindung ausgesetzten Kontrollzellen
verglichen wird. Die Kontrollzellen können entweder Zellen sein,
die nicht transfiziert worden sind, oder Zellen, die mit einem Vektor
scheintransfiziert worden sind, der keinen aktiven Rezeptor produziert.
Von B1C3 exprimierenden Zellen, die Testverbindungen ausgesetzt
werden, welche Agonisten sind, wird typischerweise erwartet, eine signifikante
Erhöhung
der Adenylcyclaseaktivität
oder der intrazellulären
Calciumkonzentration relativ zu Kontrollzellen aufzuzeigen.
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Es
ist allgemein bekannt, daß GPCRs
bei Stimulation mit einem Agonisten interalisieren bzw. ins Zellinnere
gelangen. Somit besteht ein anderes Verfahren, das zum Identifizieren
eines endogenen Liganden von B1C3 oder zum Screenen nach Verbindungen,
welche als Agonisten des Rezeptors wirken, darin, zu bestimmen,
ob eine Zelle, welche den Rezeptor exprimiert, diesen in Antwort
auf den Kontakt mit einer oder mehreren Testverbindung(en) internalisiert.
Ein Verfahren, um dies zu bewirken, besteht darin, den B1C3-Rezeptor
mit einer fluoreszenten Sonde zu markieren (z. B. durch Exprimieren
desselben als Fusionsprotein in Verknüpfung mit dem Grün-Fluoreszierenden-Protein)
und Mikroskopie anzuwenden, um zu bestimmen, ob eine Internalisierung
stattfindet (siehe Beispiel 3). Hierbei kann man mit einem Rohextrakt
von Verbindungen beginnen und, falls Internalisierung stattfindet,
die verantwortlichen Faktoren unter Anwendung von Standardverfahren
der Biochemie reinigen.
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Die
Erfindung umfaßt
ebenfalls ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine Testverbindung ein
Antagonist oder inverser Agonist von B1C3 ist, welches auf der bekannten
konstitutiven Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren beruht,
die stattfindet, wenn derartige Rezeptoren in großen Mengen
exprimiert werden. Dieses Verfahren erfordert, daß für den Rezeptor
codierende DNA so in einen Expressionsvektor eingebaut wird, daß sie funktionell
an einen Promotor verknüpft
ist und daß der
Vektor dann verwendet wird, um einen geeigneten Wirt zu transfizieren.
Zur ausreichenden Herstellung von Rezeptor, um zu einer konstitutiven
Rezeptoraktivierung zu führen
(d. h. Aktivierung in Abwesenheit von natürlichem Ligand), werden Expressionssysteme,
die zu einer reichlichen Proteinherstellung fähig sind, bevorzugt, z. B.
kann die B1C3-DNA funktionell an einen CMV-Promotor verknüpft und
in COS- oder HEK293-Zellen
exprimiert werden. Nach der Transfektion werden Zellen mit aktivierten
Rezeptoren basierend darauf selektiert, daß sie eine erhöhte Aktivität in einem Zell-Signalleitungs-Assay
relativ zu vergleichbaren Zellen aufzeigen, welche entweder nicht
transfiziert wurden oder welche mit einem Vektor transfiziert wurden,
der nicht in der Lage ist, funktionelles B1C3 zu exprimieren. Typischerweise werden
die Zellen selektiert, entweder weil sie eine statistisch signifikante Änderung
in der intrazellulären
Adenylcyclaseaktivität,
in der intrazellulären
Calciumkonzentration oder in einer Reportergenaktivität, wie SEAP
(sezernierte alkalische Phosphatase) zeigen. Die selektierten Zellen
werden mit der Testverbindung kontaktiert, und der Zell-Signalleitungs-Assay wird wiederholt,
um zu bestimmen, ob dies zu einer Verringerung der Aktivität relativ
zu selektierten Zellen führt,
welche nicht mit der Testverbindung kontaktiert worden sind. Zum
Beispiel würde
eine statisch signifikante Verringerung entweder in der Adenylcyclaseaktivität, der Calciumkonzentration
oder der SEAP-Aktivität,
relativ zu Kontrollzellen, anzeigen, daß die Testverbindung ein Antagonist
von B1C3 ist. Vorzugsweise besitzt das in den Assays verwendete
B1C3 die Sequenz von SEQ ID NO: 1.
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Assays
für mit
B1C3 wechselwirkende Verbindungen können durch Inkubieren einer
Quelle, welche den Rezeptor enthält
(z. B. eine stabil transformierte Zelle) mit einem für B1C3 spezifischen
Liganden, sowohl in Gegenwart als auch Abwesenheit von Testverbindung,
und Messen der Modulation der intrazellulären Calciumkonzentration durchgeführt werden.
Eine signifikante Erhöhung
oder Verringerung in der ligandenstimulierten Calcium-Signalleitung
in Antwort auf die Testverbindung weist darauf hin, daß eine Wechselwirkung
am B1C3-Rezeptor
stattfindet. Der bevorzugte Rezeptor ist derjenige, welche die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 1 aufweist.
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In
einem anderen Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf
ein Verfahren zum Assayen einer Testverbindung hinsichtlich ihres
Vermögens,
die Expression von B1C3 zu verändern.
Dieses Verfahren wird durch Kultivieren von Zellen, welche B1C3
exprimieren, in Gegenwart der Testverbindungen durchgeführt. Die Zellen
werden dann abgesammelt, und die Expression von B1C3 wird mit der
Expression in Kontrollzellen, welche unter im wesentlichen identischen
Bedingungen jedoch in Abwesenheit von Testverbindung wachsen gelassen
wurden, verglichen. Der bevorzugte Rezeptor ist ein solcher, welcher
die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 1 aufweist. Eine bevorzugte Testverbindung ist ein
Oligonukleotid von mindestens 15 Nukleotiden Länge, umfassend eine Sequenz,
welche zu der Sequenz der in dem Assay verwendeten B1C3-mRNA komplementär ist.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die 1 enthält die vollständige Nukleotidsequenz
eines Klons, der durch die im Beispielabschnitt beschriebenen Verfahren
konstruiert wurde. Der Klon wurde bei der Internationalen Hinterlegungsbehörde "Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" mit der Adresse Mascheroder Weg IB, D-3300
Braunschweig, Deutschland, hinterlegt. Die Hinterlegung wurde am
14. Mai 1999 vorgenommen und erhielt die Zugangsnummer DSM 12808.
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Die 2 zeigt
die abgeleitete Aminosäuresequenz
von Ratten-B1C3. Das Polynukleotid von 1 codiert
für ein
Protein mit einer Länge
von 400 Aminosäuren.
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Die 3 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen
B1C3 und Sequenzen für
Maus- und Ratten-EDG-1-Rezeptoren.
B1C3 ist etwa zu 34% homolog zum Maus-EDG-1-Rezeptor und zu etwa 33% homolog zum
Ratten-EDG-1-Rezeptor.
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Definitionen
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Die
folgende Beschreibung verwendet eine Reihe von Begriffen, welche
sich auf die rekombinante DNA- Technologie
beziehen. Um ein klares und konsistentes Verständnis der Beschreibung und
der Patentansprüche
zu ermöglichen,
einschließlich
des Umfangs, der solchen Begriffen gegeben werden soll, sind die
folgenden Definitionen vorgesehen.
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Klonierungsvektor:
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Ein
Plasmid oder eine Phagen-DNA
oder eine andere DNA-Sequenz, welche in der Lage ist, in einer Wirtszelle
autonom zu replizieren, und welche durch eine oder eine kleine Zahl
von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen gekennzeichnet ist.
Ein Fremd-DNA-Fragment kann an diesen Stellen in den Vektor gespleißt werden,
um die Replikation und Klonierung des Fragments herbeizuführen. Der
Vektor kann einen Marker enthalten, der zur Verwendung bei der Identifizierung
von transformierten Zellen geeignet ist. Zum Beispiel kann ein Marker
Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz bereitstellen.
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Expressionsvektor:
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Ein
Vektor, ähnlich
zu einem Klonierungsvektor, der jedoch zum Induzieren der Expression
der DNA, welche in ihn kloniert worden ist, nach einer Transformation
in einen Wirt in der Lage ist. Die klonierte DNA wird üblicherweise
unter die Steuerung von bestimmten regulatorischen Sequenzen, wie
Promotoren oder Enhancern, gebracht (d. h. damit funktionsfähig verbunden).
Promotoren können
konstitutiv, induzierbar oder reprimierbar sein.
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Im wesentlichen rein:
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Wie
hierin verwendet, bedeutet "im
wesentlichen rein",
daß das
gewünschte
Produkt im wesentlichen frei von kontaminierenden zellulären Komponenten
ist. Ein(e) "im
wesentlichen reine(s)" Protein
oder Nukleinsäure
wird typischerweise mindestens 85% einer Probe umfassen, wobei größere Prozentsätze bevorzugt sind.
Kontaminanten können
Proteine, Kohlenhydrate oder Lipide einschließen. Ein Verfahren zur Bestimmung der
Reinheit eines Proteins oder einer Nukleinsäure besteht durch elektrophore tische
Behandlung eines Präparats
in einer Matrix, wie Polyacrylamid oder Agarose. Reinheit wird durch
das Auftreten einer Einzelbande nach Färbung bewiesen. Andere Verfahren
zum Überprüfen der
Reinheit schließen
Chromatografie und analytische Zentrifugation ein.
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Rekombinantes Protein:
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Ein
rekombinantes Protein oder ein rekombinanter Rezeptor ist ein nicht-endogenes
Protein, welches durch die Einführung
eines Expressionsvektors in Wirtszellen hergestellt wird.
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Wirt:
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Jedwede
prokaryotische oder eukaryotische Zelle, welche der Empfänger eines
replizierbaren Expressionsvektors oder Klonierungsvektors ist, ist
der "Wirt" für diesen
Vektor. Der Begriff beinhaltet prokaryotische oder eukaryotische
Zellen, welche manipuliert worden sind, um ein gewünschtes
Gen auf ihrem Chromosom oder in ihrem Genom einzubinden. Beispiele
von Zellen, welche als Wirte dienen können, sind im Fachgebiet gut
bekannt, wie auch Techniken für
zelluläre
Transformation (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor (1989)).
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Promotor:
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Eine
DNA-Sequenz, welche typischerweise in der 5'-Region eines Gens gefunden wird, die
proximal zum Startcodon lokalisiert ist. Die Transkription wird
am Promotor initiiert. Wenn der Promotor vom induzierbaren Typ ist,
dann steigt die Transkriptionsrate in Antwort auf ein induzierendes
Agens.
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Komplementäre Nukleotidsequenz:
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Eine
komplementäre
Nukleotidsequenz, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Sequenz,
welche durch normale Basenpaarung entstehen würde. Zum Beispiel wird die
Nukleotidsequenz 5'-AGAC-3' die komplementäre Sequenz
5'-GTCT-3' aufweisen.
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Expression:
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Expression
ist der Vorgang, durch welchen ein Polypeptid aus DNA produziert
wird. Der Vorgang beinhaltet die Transkription des Gens zu mRNA
und die Translation dieser mRNA zu einem Polypeptid.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung richtet sich auf ein R1C3-Rezeptor-Protein,
genetische Sequenzen, welche das Protein codieren, Verfahren zum
Assay von Verbindungen, um zu bestimmen, ob sie mit B1C3 interagieren,
und ein Verfahren zum Assayen von Verbindungen hinsichtlich ihrer
Fähigkeit,
die Rezeptorexpression zu verändern.
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Die
Nukleinsäure,
welche den Rezeptor codiert, und der Rezeptor selbst werden durch
die Strukturen, welche in der 1 (SEQ ID
NO: 2) bzw. der 2 (SEQ ID NO: 1) gezeigt werden,
definiert. Allerdings beinhaltet die Erfindung nicht nur Sequenzen,
die identisch zu denjenigen sind, welche in den Figuren und der Sequenzauflistung
gezeigt sind, sondern auch Sequenzen, welche im wesentlichen gleich
sind, und Sequenzen, welche ansonsten im wesentlichen gleich sind
und welche zu einem Rezeptor führen,
der die grundlegenden Bindungsmerkmale von B1C3 beibehält. Es ist
zum Beispiel allgemein bekannt, daß Techniken, wie ortsgerichtete
Mutagenese angewandt werden können,
um Variationen in die Struktur eines Proteins einzuführen. Variationen
im B1C3-Rezeptor, welche durch dieses oder irgendein ähnliches
Verfahren eingebracht wurden, sind von der Erfindung abgedeckt,
vorausgesetzt, daß der
resultierende Rezeptor die grundlegenden qualitativen Bindungs-
und physiologischen Merkmale von nicht-verändertem
B1C3 beibehält.
Somit betrifft die Erfindung Proteine, welche Aminosäuresequenzen
umfassen, die funktionell aus SEQ ID NO: 1 bestehen.
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I. Nukleinsäuresequenzen, welche für B1C3 codieren
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DNA-Sequenzen,
welche für
Ratten-B1C3 codieren, werden überall
im adulten Ratten-Zentralnervensystem exprimiert. Gewebe aus diesen
Bereichen kann als eine Quelle für
die Isolierung von Nukleinsäuren, die
den Rezeptor codieren, verwendet werden. Darüber hinaus können Zellen
und Zellinien, welche B1C3 exprimieren, verwendet werden. Diese
können
entweder kultivierte Zellen sein, welche keiner Transformation unterzogen
wurden, oder Zellinien, welche spezifisch manipuliert wurden, um
rekombinantes B1C3 zu exprimieren. Am stärksten bevorzugt sind die Zellen,
welche als DSMZ Nr. 12808 hinterlegt worden sind. DNA, welche B1C3
codiert, kann als Ergebnis von standardmäßigen Restriktionsverdaus erhalten
werden. Alternativ dazu kann PolyA+mRNA
aus Gewebe oder Zellen isoliert, revers transkribiert und kloniert
werden. Die so gebildete cDNA-Bibliothek kann dann unter Verwendung
von Sonden gescreent werden, welche aus der SEQ ID NO: 2 abgeleitet
sind. Sonden sollten typischerweise eine Länge von mindestens 14 Basen
aufweisen und sollten vorzugsweise nicht aus Regionen der DNA erhalten
werden, welche den hoch konservierten Transmembrandomänen von
B1C3 entsprechen.
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B1C3
kann auch aus rekombinanten Zellen, welche die Volllängen-B1C3-Sequenz
enthalten, oder aus cDNA-Bibliotheken
durch Ausführen
von PCR-Amplifikationen unter Verwendung von Primern, welche an
beiden Enden des B1C3-Gens lokalisiert sind, erhalten werden. Diese
Primer können
aus den in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenzen ausgewählt werden.
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II. Antikörper gegen B1C3
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, welche spezifisch an
B1C3 binden, und ein Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper. Antikör per, welche "spezifisch binden" sind als diejenigen
definiert, welche eine mindestens hundertfach größere Affinität für B1C3 als
für andere
Proteine besitzen. Das Verfahren zur Herstellung derartiger Antikörper kann
entweder das Injizieren des B1C3-Proteins selbst in ein geeignetes Tier
oder alternativ dazu das Injizieren von kurzen Peptiden, die hergestellt
wurden, um unterschiedlichen Regionen des Rezeptors zu entsprechen,
beinhalten. Die Peptide sollten mindestens fünf Aminosäuren lang sein und sollten
aus Regionen gewählt
werden, welche angenommenermaßen
einzigartig für
B1C3 sind. Somit sollten die hoch konservierten Transmembranregionen
beim Auswählen
von Peptiden für
die Erzeugung von Antikörpern
im allgemeinen vermieden werden. Verfahren zur Herstellung und zum
Nachweis von Antikörpern sind
dem Fachmann auf dem Gebiet allgemein bekannt, wie es durch Standard-Referenzwerke
verdeutlicht wird, wie etwa: Harlow et al., Antibodies, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1988)); Klein, Immunology:
The Science of Self-Nonself Discrimination (1982); Kennett et al.,
Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological
Analyses (1980); und Campbell, "Monoclonal
Antibody Technology",
in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,
(1984)).
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"Antikörper", wie hierin verwendet,
schließt
beabsichtigtermaßen
intakte Moleküle
wie auch Fragmente ein, welche ihre Fähigkeit, an Antigen zu binden,
beibehalten (z. B. Fab- und F(ab')2-Fragmente). Diese Fragmente werden typischerweise
durch proteolytisches Spalten von intakten Antikörpern unter Verwendung von
Enzymen hergestellt, wie Papain (zur Herstellung von Fab-Fragmenten)
oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')2-Fragmenten).
Der Begriff "Antikörper" betrifft des weiteren
sowohl monoklonale Antikörper
als auch polyklonale Antikörper.
Polyklonale Antikörper
werden aus den Seren von Tieren abgeleitet, welche mit dem Antigen
immunisiert wurden. Monoklonale Antikörper können unter Anwendung der Hybridomtechnologie
hergestellt werden (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Hammerling
et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier,
M. Y., S. 563–681
(1981)). Im allgemeinen beinhaltet diese Technologie das Immunisieren
eines Tiers, üblicherweise
einer Maus, entweder mit intaktem B1C3 oder einem Fragment, das
aus B1C3 abgeleitet ist. Die Splenozyten der immunisierten Tiere
werden extrahiert und mit geeigneten Myelomzellen, z. B. SP2O-Zellen, fusioniert. Nach der Fusion werden
die resultierenden Hybridomzellen selektiv in HAT-Medium gehalten
und dann durch limitierendes Verdünnen geklont (Wands et al.,
Gastroenterology 80: 225–232 (1981)).
Die durch eine solche Selektion erhaltenen Zellen werden dann geassayt,
um Klone zu identifizieren, welche Antikörper sezernieren, die zur Bindung
an B1C3 fähig
sind.
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Die
Antikörper,
oder Fragmente von Antikörpern,
der vorliegenden Erfindung können
verwendet werden, um das Vorhandensein von B1C3 unter Anwendung
eines Beliebigen von einer Vielzahl von Immunoassays nachzuweisen.
Zum Beispiel können
die Antikörper
in Radio-Immuno-Assays
oder in immunometrischen Assays verwendet werden, ebenfalls bekannt
als "Two-site"- oder "Sandwich"-Assays (siehe Chard,
T., "An Introduction
to Radioimmune Assay and Related Techniques", in Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N. Y (1978)).
In einem typischen immunometrischen Assay wird eine Menge an unmarkiertem
Antikörper
an einen festen Träger
gebunden, welcher in dem zu testenden Fluid, z. B. Blut, Lymphe,
Zellextrakte etc., unlöslich
ist. Nach der anfänglichen
Bindung von Antigen an immobilisierten Antikörper wird eine Menge von nachweisbar
markiertem Zweitantikörper
(welche der gleiche sein kann wie der erste, oder nicht) zugegeben,
um eine Detektion und/oder Quantifizierung von gebundenem Antigen zu
gestatten (siehe z. B. Radioimmune Assay Method, Kirkham et al.,
Hrsg., S. 199–206,
E. & S. Livingstone, Edinburgh
(1970)). Viele Variationen dieser Typen von Assays sind im Fachgebiet
bekannt und können
für den Nachweis
von B1C3 eingesetzt werden.
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Antikörper gegen
B1C3 können
auch in der Reinigung von entweder intaktem Rezeptor oder Fragmenten
des Rezeptors verwendet werden (siehe im allgemeinen, Dean et al.,
Affinity Chromatography. A Practical Approach, IRL Press (1986)).
Typischerweise wird Antikörper
auf einer chromatografischen Matrix, wie Sepharose 4B, immobilisiert.
Die Matrix wird dann in eine Säule
geladen, und die B1C3 enthaltende Präparation wird unter Bedingungen
hindurchlaufen gelassen, welche eine Bindung fördern, z. B. unter Bedingungen
von niedrigem Salzgehalt. Die Säule
wird dann gewaschen, und gebundenes B1C3 wird unter Verwendung eines
Puffers eluiert, welcher die Dissoziation von Antikörper fördert, z.
B. Puffer mit einem veränderten pH-Wert
oder einer veränderten
Salzkonzentration. Das eluierte B1C3 kann, z. B. durch Dialyse,
in einen Puffer nach Wahl überführt und
entweder aufbewahrt oder direkt verwendet werden.
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III. Radioliganden-Assay hinsichtlich
Rezeptorbindung
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Eine
der Hauptanwendungen für
B1C3-Nukleinsäuren
und rekombinante Proteine erfolgt in Assays, welche entworfen sind,
um Agentien zu identifizieren, welche zur Bindung an den Rezeptor
in der Lage sind. Derartige Agentien können entweder Agonisten, welche
die normalen Effekte der Rezeptorbindung nachahmen, oder Antagonisten,
welche die normalen Effekte der Rezeptorbindung inhibieren, sein.
Von besonderem Interesse ist die Identifizierung von Agentien, welche
an den B1C3-Rezeptor
binden und die intrazelluläre
Signalleitung, wie etwa die Adenylcyclaseaktivität oder das intrazelluläre Calcium,
modulieren. Diese Agentien finden eine potenzielle therapeutische
Anwendung entweder als Analgetika oder Anästhetika.
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In
Radioliganden-Bindungsassays wird eine Quelle von B1C3 zusammen
mit einem Liganden, der bekanntermaßen an den Rezeptor bindet,
und mit der hinsichtlich Bindungsaktivität zu testenden Verbindung inkubiert.
Die bevorzugte Quelle von B1C3 sind Zellen, vorzugsweise Säugerzellen,
die transformiert wurden, um den Rezeptor rekombinant zu exprimieren.
Die gewählten
Zellen sollten keine wesentliche Menge von irgendeinem anderen G-Protein-gekoppelten
Rezeptor exprimieren, welcher an Ligand binden und die Ergebnisse
verzerren könnte.
Dies kann einfach festgestellt werden durch Ausführen von Bindungsassays an
Zellen, welche aus dem gleichen Gewebe oder der gleichen Zelllinie
abgeleitet sind, wie diejenigen, die rekombinant B1C3 exprimieren,
aber welche keiner Transformation unterzogen worden sind.
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Der
Assay kann entweder mit intakten Zellen oder mit aus den Zellen
hergestellten Membranen durchgeführt
werden (siehe z. B. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:
10230–10234
(1993)). Die Membranen, oder Zellen, werden mit einem für den B1C3-Rezeptor
spezifischen Ligand und mit einer Präparation der zu testenden Verbindung
inkubiert. Nachdem die Bindung abgeschlossen ist, wird Rezeptor
aus der Lösung, welche
Ligand und Testverbindung enthält,
z. B. durch Filtration getrennt, und der Betrag der Bindung, welche stattgefunden
hat, wird bestimmt. Vorzugsweise ist der verwendete Ligand nachweisbar
mit einem Radioisotop, wie etwa 125I, markiert.
Allerdings können
anstatt dessen, nach Wunsch, fluoreszente oder chemolumineszente
Markierungen verwendet werden. Unter den am häufigsten verwendeten fluoreszenten
Markierungsverbindungen finden sich Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin,
Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Verwendbare chemolumineszente Verbindungen schließen Luminol,
Isoluminol, theromatischen (theromatic) Acridiniumester, Imidazol,
Acridiniumsalz und Oxalatester ein. Jegliches dieser Mittel kann
verwendet werden, um einen zur Verwendung in dem Assay geeigneten
Liganden herzustellen.
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Nichtspezifische
Bindung kann durch Ausführen
der Bindungsreaktion in Gegenwart eines großen Überschusses an nichtmarkiertem
Ligand bestimmt werden. Zum Beispiel kann markierter Ligand mit
Rezeptor und Testverbindung in Gegenwart eines tausendfachen Überschusses
an nichtmarkiertem Ligand inkubiert werden. Die nichtspezifische
Bindung sollte von der Gesamtbindung, d. h. der Bindung in Abwesenheit
von nichtmarkiertem Ligand, subtrahiert werden, um die spezifische
Bindung für
jede getestete Probe zu erhalten. Andere Schritte, wie Waschen,
Rühren,
Schütteln,
Filtrieren und dergleichen, können
nach Bedarf in den Assays eingeschlossen werden. Typischerweise
werden Waschschritte nach der Trennung von membrangebundenem Ligand
von in Lösung
verbleibendem Ligand und vor der Quantifizierung der Menge an gebundenem Ligand,
z. B. durch Zählen
des radioaktiven Isotops, eingeschlossen. Die in Gegenwart von Testverbindung erhaltene
spezifische Bindung wird mit derjenigen verglichen, welche in Gegenwart
von markiertem Ligand allein erhalten wird, um das Ausmaß zu bestimmen,
zu welchem die Testverbindung die Rezeptorbindung verdrängt hat.
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Bei
der Durchführung
von Bindungsassays muß man
darauf achten, Artefakte zu vermeiden, welche es so erscheinen lassen
können,
daß eine
Testverbindung mit dem B1C3-Rezeptor wechselwirkt, wenn die Bindung
tatsächlich
durch irgendeinen anderen Mechanismus inhibiert wird. Zum Beispiel
sollte die zu testende Verbindung in einem Puffer vorliegen, welcher
selbst die Bindung von Ligand an B1C3 nicht wesentlich inhibiert,
und sollte vorzugsweise bei mehreren unterschiedlichen Konzentrationen
getestet werden. Präparationen
der Testverbindung sollten auch hinsichtlich proteolytischer Aktivität untersucht
werden, und es ist wünschenswert,
daß Antiproteasen
in den Assays eingeschlossen werden. Schließlich ist es in hohem Maße wünschenswert,
daß Verbindungen,
welche festgestelltermaßen
die Bindung von Ligand an B1C3-Rezeptor
verdrängen,
nochmals in einem Konzentrationsbereich untersucht werden, der ausreicht,
um eine Scatchard-Analyse der Ergebnisse durchzuführen. Dieser
Typ von Analyse ist im Fachgebiet allgemein bekannt und kann zur Bestimmung
der Affinität
einer Testverbindung für
einen Rezeptor eingesetzt werden (siehe z. B. Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, 11.2.1–11.2.19 (1993); Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Work et al., Hrsg.,
N. Y. (1978) etc.). Computerprogramme können eingesetzt werden, um die
Analyse der Ergebnisse zu unterstützen (siehe z. B. Munson, P.,
Methods Enzymol. 92: 543–577
(1989); McPherson, G. A., Kinetic, EBDA Ligand, Lowry-A Collection
of Radioligand Binding Analysis Programs, Elsevier-Biosoft U.K.
(1985)).
-
Die
Aktivierung von Rezeptor durch die Bindung von Ligand kann unter
Anwendung einer Anzahl unterschiedlicher Assays überwacht werden. Zum Beispiel
können
Adenylcyclase-Assays durch Kultivieren von Zellen in Vertiefungen
einer Mikrotiterplatte und danach Inkubieren der Vertiefungen in
Gegenwart oder Abwesenheit von Testverbindung durchgeführt werden.
Dann kann cAMP in Ethanol extrahiert, lyophilisiert und in Assay-Puffer
resuspendiert werden. Ein Assay von so gewonnenem cAMP kann unter
Anwendung jedes Verfahrens zur Bestimmung der cAMP-Konzentration
durchgeführt
werden, z. B. dem "Biotrack
cAMP Enzyme-immunoassay SystemJ" (Amersham)
oder dem "Cyclic
AMP [3H] Assay System" (Amersham). Typischerweise werden Adenylcyclase-Assays
getrennt von Bindungsassays durchgeführt, aber es kann auch möglich sein, Bindungs-
und Adenylcyclase-Assays an einer einzigen Präparation von Zellen durchzuführen. Andere "Zell-Signalleitungs- Assays", welche zum Überwachen
der Rezeptoraktivität
verwendet werden können,
sind untenstehend beschrieben.
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IV. Identifizierung von B1C3-Agonisten
und -Antagonisten unter Anwendung von Zell-Signalleitungs-Assays
-
B1C3-Rezeptoren
können
ebenfalls verwendet werden, um nach Arzneistoffkandidaten unter
Anwendung von Zell-Signalleitungs-Assays zu screenen. Um B1C3-Agonisten zu identifizieren,
wird die DNA, welche einen Rezeptor codiert, in einen Expressionsvektor
eingebaut und dann in einen geeigneten Wirt transfiziert. Die transformierten
Zellen werden dann mit einer Reihe von Testverbindungen in Kontakt
gebracht, und der Effekt von jeder Testverbindung wird verfolgt.
Unter den Assays, welche verwendet werden können, finden sich Assays, welche
die cAMP-Herstellung messen (siehe obenstehende Erörterung),
Assays, welche die Aktivierung von Reportergen-Aktivität messen,
Assays, welche die Modulation der Bindung von Ligand messen, z.
B. GTP-gamma-S, oder Assays, welche Änderungen in der intrazellulären Calciumkonzentration
messen.
-
Zell-Signalleitungs-Assays
können
auch verwendet werden, um B1C3-Antagonisten zu identifizieren. G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren können
sogar in Abwesenheit ihres passenden Liganden in ihren aktiven Zustand
versetzt werden, indem sie bei sehr hoher Konzentration in einem
heterologen System exprimiert werden. Zum Beispiel kann Rezeptor
unter Anwendung der Baculovirus-Infektion
von Sf9-Insektenzellen überexprimiert
werden, oder das B1C3-Gen kann funktionsfähig an einen CMV-Promotor verknüpft und
in COS- oder HEK293-Zellen exprimiert werden. In diesem aktivierten
konstitutiven Zustand können
Antagonisten des Rezeptors in Abwesenheit von Ligand durch Messen
der Fähigkeit
einer Testverbindung, die konstitutive Zell-Signalleitungs-Aktivität zu inhibieren,
identifiziert werden. Passende Assays hierfür sind wiederum cAMP-Assays,
Reportergen- Aktivierungs-Assays
oder Assays, welche die Bindung von GTP-gamma-S messen.
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Ein
bevorzugter Zell-Signalleitungs-Assay basiert auf stabil mit B1C3
transfizierten Zellen, welche eine Änderung der intrazellulären Calciumspiegel
in Antwort auf Inkubation in Gegenwart von Ligand zeigen. Somit kann
eine Vorgehensweise zum Identifizieren von B1C3-Agonisten oder -Antagonisten
angewandt werden, welche ähnlich
zu den oben erörterten
Radiorezeptor-Assays ist, außer
daß die
Calciumkonzentration anstatt der gebundenen Radioaktivität gemessen
wird. Die Konzentration von Calcium in Gegenwart von Testverbindung
und Ligand wird mit derjenigen in Gegenwart von Ligand allein verglichen,
um zu bestimmen, ob die Testverbindung am B1C3-Rezeptor wechselwirkt.
Eine statistisch signifikante Erhöhung des intrazellulären Calciums
in Antwort auf die Testverbindung weist darauf hin, daß die Testverbindung
als ein Agonist wirkt, wohingegen eine statistisch signifikante
Verringerung des intrazellulären
Calciums darauf hinweist, daß sie
als ein Antagonist wirkt.
-
Es
können
auch Assays durchgeführt
werden, welche die Aktivierung eines Reportergens messen. Zum Beispiel
können,
rekombinantes B1C3 exprimierende, Zellen mit einem Reportergen (z.
B. einem Chloramphenicolacetyltransferase- oder Luciferase-Gen)
transfiziert werden, welches funktionstüchtig an ein Adenylcyclase-
oder ein Diacylglycerol-Antwortelement gebunden ist. Die Zellen
werden dann mit Testverbindungen inkubiert, und die Expression des
Reportergens wird mit der Expression in Kontrollzellen verglichen,
welche kein rekombinantes B1C3 exprimieren aber welche ansonsten
im wesentlichen identisch sind. Eine statistisch signifikante Veränderung
der Reportergenexpression in den B1C3 exprimierenden Zellen deutet
auf eine Testverbindung hin, welche mit dem B1C3-Rezeptor wechselwirkt.
-
V. Assay hinsichtlich der Fähigkeit,
B1C3-Expression zu modulieren
-
Ein
Weg, die biologischen Effekte von B1C3 entweder zu erhöhen oder
zu verringern, besteht darin, das Ausmaß zu verändern, zu welchem der Rezeptor
in Zellen exprimiert wird. Deshalb sind Assays für die Identifizierung von Verbindungen,
welche die Expression entweder inhibieren oder verstärken, von
beträchtlichem
Interesse. Diese Assays werden durchgeführt mittels Kultivieren der
Zellen, welche B1C3 exprimieren, in Gegenwart einer Testverbindung
und danach Vergleichen der Rezeptor-Expression in diesen Zellen
mit der Expression in Zellen, welche unter im wesentlichen identischen
Bedingungen aber in Abwesenheit von Testverbindung wachsen gelassen
wurden. Wie in den oben erörterten
Bindungsassays, ist es wünschenswert, daß die verwendeten
Zellen im wesentlichen frei von konkurrierenden G-Protein-gekoppelten
Rezeptoren sind. Ein Weg zum Messen der Rezeptor-Expression besteht
darin, die B1C3-Sequenz an eine Sequenz zu fusionieren, welche ein
Peptid oder Protein codiert, das leicht quantifiziert werden kann.
Zum Beispiel kann die B1C3-Sequenz
an eine Sequenz ligiert werden, welche Hämagglutinin codiert, und verwendet
werden, um Zellen stabil zu transfizieren. Nach Inkubation mit Testverbindung
kann der Hämagglutinin/Rezeptor-Komplex
immunpräzipitiert
werden, und Western-Blots können
unter Anwendung von Anti-Hämagglutinin-Antikörper durchgeführt werden.
Alternativ dazu kann eine Scatchard-Analyse von Bindungsassays mit
markiertem Ligand durchgeführt
werden, um die Rezeptoranzahl zu ermitteln. Die Bindungsassays können wie
oben erörtert ausgeführt werden
und werden vorzugsweise Zellen verwenden, welche manipuliert worden
sind, um B1C3 rekombinant zu exprimieren.
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Eine
bevorzugte Gruppe von Testverbindungen zum Einbringen in den B1C3-Expressions-Assay
besteht aus Oligonukleotiden, die zu verschiedenen Segmenten der
B1C3-Nukleinsäuresequenz
komplementär sind,
welche in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist. Diese Oligonukleotide sollten
mindestens 15 Basen lang sein und sollten aus nicht-konservierten Regionen
der Rezeptor-Nukleinsäuresequenz
abgeleitet sein.
-
Oligonukleotide,
welche festgestelltermaßen
die Rezeptor-Expression verringern, können abgewandelt oder konjugiert
werden, um ihre Effektivität
zu erhöhen.
Zum Beispiel können
Nukleosidphosphorothioate für
ihre natürlichen
Gegenstücke
substituiert werden (siehe Cohen, J., Oligodeoxynucleotides, Antisense
Inhibitors of Gene Expression, CRC Press (1989)). Die Oligonukleotide
können
auch in vivo an einen Patienten zum Zwecke des Inhibierens der B1C3-Expression
zugeführt
werden. Wenn dies getan wird, wird es bevorzugt, daß das Oligonukleotid
in einer Form verabreicht wird, welche seine Aufnahme durch die
Zellen verbessert. Zum Beispiel kann das Oligonukleotid mittels
eines Liposoms zugeführt
oder an ein Peptid konjugiert werden, welches von den Zellen aufgenommen
wird (siehe z. B.
U.S.-Patente Nr. 4 897
355 und
4 394 448 ;
siehe auch Nicht-U.S.-Patentdokumente
WO 8903849 und
EP 0263740 ). Andere Verfahren zur
Erhöhung
der Effizienz der Oligonukleotidzuführung sind im Fachgebiet allgemein
bekannt und sind ebenfalls mit der vorliegenden Erfindung kompatibel.
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Nachdem
die Erfindung nun beschrieben worden ist, wird sie durch die Bezugnahme
auf die folgenden Beispiele leichter zu verstehen sein, welche zur
Veranschaulichung angegeben sind, und mit welchen nicht beabsichtigt
wird, den Umfang der Erfindung einzuschränken.
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Beispiele
-
Beispiel 1: Klonierung von Ratten-BC13
-
Sonden-Erzeugung für cDNA-Bibliotheks-Screening:
-
Ein
Verfahren zum Erhalten einer neuen Sequenz, welche einen Rezeptor
codiert, besteht darin, ein Screening von cDNA-Bibliotheken mit
einer relevanten Sonde bei mäßiger bis
niedriger Stringenz durchzuführen.
Um neue Gene zu finden, welche mit Rezeptoren für Lipiden (Sphingosinphosphat,
Lysophosphatidinsäure,
Cannabinoide etc.) zusammenhängen,
wurde die Sequenz eines EST (Expressed Sequence Tag), aa451451,
verwendet, um eine cDNA-Sonde für
das Screening von cDNA-Bibliotheken zu erzeugen. Es wurden die folgenden
Oligonukleotide für
PCR verwendet:
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Zwei
von diesen Oligonukleotiden wurden in einer Polymerasekettenreaktions-Mischung
(Gesamtvolumen 100 μl)
verwendet, welche 1,511 einer Rattenhirn(ohne Kleinhirn)-cDNA-Bibliothek
in pcDNA1 (Invitrogen), 1 × PCR-Puffer
(14 mM (NH4)2SO4, 1,5 mM MgCl2,
50 mm Tris-HCl (pH 9,2), Roche Diagnostics), 200 μM dNTPs (Amersham-Pharmacia), 2,6U "Expand High FidelityJ" (Roche Diagnostics)
und jeweils 100 pmol der Primer SP6 und 451-1R enthielt. Die Amplifikation
wurde auf einem Gene Amp PCR Sys 9700J (Perkin Elmer: Applied Biosystems)
durchgeführt.
Die Matrize wurde bei 94°C
während
3 Minuten denaturiert, gefolgt von 35 Zyklen, bestehend aus Denaturierungs-,
Annealing- und Verlängerungsschritten,
jeweils während
1 Minute bei 94°C,
53°C bzw.
72°C, und
dann während
zusätzlichen
5 Minuten bei 72°C
verlängert.
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Das
resultierende Produkt wurde 1:100 verdünnt und mit den Primern SP6-1R
und 451-3R amplifiziert. Die Polymerasekettenreaktions-Mischung
(50 il) enthielt 1 il verdünnte
Lösung
aus der ersten PCR-Reaktion, 1 × PCR-Puffer (der gleiche
wie oben, Roche Diagnostics), 200 iM dNTPs (Amersham-Pharmacia),
2,6U "Expand High
FidelityJ" (Roche
Diagnostics) und 50 pmol jeweils der Primer SP6-1R und 451-3R. Die
Amplifikation wurde auf einem Gene Amp PCR Sys 9700J (Perkin Elmer:
Applied Biosystems) durchgeführt.
Die Matrize wurde bei 94°C
3 Minuten lang denaturiert, gefolgt von 25 Zyklen, bestehend aus
Denaturierungs-, Annealing- und Verlängerungsschritten bei 94°C (1 Minute),
53°C (1
Minute) bzw. 72°C
(1 Minute 20 Sekunden), und dann weitere 5 Minuten lang bei 72°C verlängert.
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Ein
PCR-Produkt von 450 bp wurde herausgeschnitten und mit dem QIAquickJ-Gelextraktions-Kit
(Qiagen) gereinigt, mit Klenow (Amersham-Pharmacia) glattendig gemacht
und in mittels ER V verdauten und dephosphorylierten KS-subkloniert.
Die Plasmide wurden mit dem Alkalische-Lyse-Protokoll unter Verwendung eines
Qiaprep 8J-Kits (Qiagen) präpariert
und durch Sequenzierung unter Verwendung eines "ABI Prism dRhodamineJ cycle sequencing
ready reaction"-Kit
(PE Applied Biosystems) gescreent. Die Sequenz des 450 bp großen Ratten-Fragments
war identisch zu derjenigen von EST aa451451. Ein NotI/HindIII-Fragment
von 400 bp wurde dann verdaut, herausgeschnitten und mit dem QIAquickJ-Gelextraktions-Kit
(Qiagen) gereinigt, um als Werkzeug zum Isolieren eines EDG-verwandten
Ratten-Klons verwendet
zu werden.
-
cDNA-Bibliothek-Screening:
-
Eine
Ratten-Hirnstamm/Rückenmark-cDNA-Bibliothek
von Stratagene (Kat.-Nr.
936521) wurde unter Anwendung des NotI/HindIII-Fragments als Sonde gescreent. 8 × 105 Plaques wurden plattiert, auf Hybond N+J-Filter
(Amersham-Pharmacia) überführt, 5 Minuten
lang denaturiert (1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH) und 5 Minuten lang
neutralisiert (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8). Die Filter wurden
in 2 × SSC
gespült
und eine Stunde lang bei Raumtemperatur an Luft trocknen gelassen.
Die Membranen wurden über
Nacht bei 42°C
in 50% Formamid, 10% Dextransulfat (aus einer 50%igen Lösung), 1%
SDS, 5 × SSC,
1 × Denhardt's, 10 mM Tris, pH8,
und 100 _g/ml schallbehandeltem Lachssperma hybridisiert. Das NotI/HindIII-Fragment
wurde unter Anwendung von T7-Quick PrimeJ (Amersham-Pharmacia) statistisch
markiert und bei 3 × 106 cpm/ml zu der Hybridisierungslösung gegeben.
Die Filter wurden mit 2 × SSC/0,1%
SDS bei Raumtemperatur gewaschen, woran sich eine Hochstringenz-Waschung
mit 0,2 × SSC/0,1%
SDS bei 65°C
anschloß.
-
Unter
Anwendung dieses Screening-Vorgehens wurden 6 unabhängige Klone
identifiziert und durch wiederholtes Plattieren und Screenen mit
dem markierten NotI/HindIII-Fragment isoliert. Zwei unabhängige Klone
wurden einer Sequenzierung unterzogen (Klone BIA7 und C3A3). Die
DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß der
Klon BIA7 die 5'-Sequenz
eines vermeintlichen neuen GPCRs enthielt, wobei jedoch das 3'-Ende fehlte. Obwohl
C3A3 die gesamte codierende Sequenz enthielt, fehlte ihm ein Nukleotid,
was zu einem verfrühten Stopcodon
führt.
Um die vollständige
codierende Sequenz zu erhalten, wurden die 2 Klone mit XbaI verdaut und
miteinander ligiert. Der resultierende Klon "B1C3" enthielt
die vollständige
codierende Region eines vermeintlichen neuen GPCR.
-
Ergebnisse:
-
Die
vollständige
Nukleotidsequenz des B1C3-cDNA-Klons wird in der 1 gezeigt.
Das offene Leseraster besteht aus 1203 Nukleotiden, welche ein Protein
von 401 Aminosäuren
(2) mit einer vorhergesagten Molekülmasse von
etwa 42,3 kDA codieren. Die Proteinsequenz enthält Schlüsselmerkmale von GPCRs: das
Vorhandensein von sieben hydrophoben Helices, welche wahrscheinlich
Transmembrandomänen repräsentieren;
einen Aminoterminus; und einen Carboxyterminus.
-
Darüber hinaus
sind auch mehrere Modifikationsstellen, von welchen vorgeschlagen
wurde, an der Regulierung der Rezeptorfunktion beteiligt zu sein,
in der vorhergesagten Aminosäuresequenz
vorhanden. So weist die Rezeptor-Sequenz auf: eine potenzielle cAMP-Phosphorylierungsstelle
an der Position 236; N-verknüpfte
Glycosylierungsstellen; Myristylierungsstellen; und Proteinkinase-C-Phosphorylierungsstellen.
Die Nukleotidsequenz und primär
vorhergesagte Aminosäuresequenz
des B1C3-Rezeptors sind in ihrer Gesamtheit nicht in der Genebank-Datenbank
vorhanden. Die Sequenzen ähneln
am nähesten
denjenigen des Maus- und Ratten-EDG-1-Rezeptors (Epithelial-Differenzierungs-Gen-Rezeptor). Ein
Sequenz-Alignment von B1C3 mit bekannten Rezeptoren enthüllt, daß er zu
etwa 34% identisch mit Maus-EDG-1- und zu 33% identisch mit Ratten-EDG-1-Rezeptoren
ist (3).
-
Beispiel 2: In-Situ-Hybridisierungsexperimente
-
Präparation
von Gewebe:
-
Adulte
männliches
Sprague-Dawley-Ratten (etwa 250 g; Charles River, St.-Constant, Quebec)
wurden durch Enthauptung getötet.
Gehirn, Rückenmark
mit noch verbundenen DRGs und mehrere periphere Gewebe (Herz, Niere,
Milz, Leber, Lunge und Skelettmuskulatur) wurden unverzüglich entnommen,
in Isopentan bei –40°C während 20
Sekunden schockgefroren und bei –80°C aufbewahrt. Gefrorenes Gewerbe
wurde bei 16 _m in einem Microm HM 500 MJ-Cryostat (Deutschland) geschnitten und
auf ProbeOn-PlusJ-Objektträgern (Fisher
Scientific, Montreal, Quebec) tau-montiert. Die Schnitte wurden
bei –80°C vor der
In-situ-Hybridisierung aufbewahrt.
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Ribosonden-Synthese:
-
Das
pBluescript-KS–-B1A7-Plasmid, welches
ein 1 Kb großes
Fragment des 5'-Endes
des B1A7-Gens enthielt, wurde durch Schneiden in der Polylinkerstelle
auf einer von beiden Seiten der inserierten cDNA unter Verwendung
entweder des Restriktionsenzyms NotI oder SacI (Pharmacia Biotech,
U.S.A.) und der geeigneten Puffer linearisiert. Antisinn- bzw. Sinn-B1A7-Ribosonden
wurden in vitro unter Verwendung von entweder T7- oder T3-RNA-Polymerase
(Promega) transkribiert, und zwar in Gegenwart von -[35S]-UTP
(etwa 800 Ci/mmol; Amersham, Oakville, Ontario).
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In-situ-Hybridisierung:
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Die
Schnitte wurden in 4% Paraformaldehyd (BDH, Poole, England) in 0,1
M Phosphatpuffer (pH 7,4) während
10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) nachfixiert und in 3 Wechseln
von 2 × Standard-Natriumcitratpuffer
(SSC; 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0) gespült. Die
Schnitte wurden dann in 0,1 M Triethanolamin äquilibriert, mit 0,25% Essigsäureanhydrid
in Triethanolamin behandelt, in 2 × SSC gespült und in einer Ethanol-Reihe
(50–100%)
dehydratisiert. Die Hybridisierung wurde in einem Puffer, welcher
75% Formamid (Sigma, St. Louis, Mo.), 600 mM NaCl, 10 mM Tris (pH
7,5), 1 mM EDTA, 1 × Denhardt-Lösung (Sigma), 50
_g/ml denaturierte Lachssperma-DNA (Sigma), 10% Dextransulfat (Sigma),
20 mM Dithiothreitol und -[35S]-UTP-markierte
cRNA-Sonden (10 × 106 cpm/ml) enthielt, bei 55°C während 18
Stunden in befeuchteten Kammern durchgeführt. Im Anschluß an die
Hybridisierung wurden Objektträger
in 2 × SSC
bei Raumtemperatur gespült,
mit 20 g/ml RNase IA (Pharmacia) in RNase-Puffer (10 mM Tris, 500
mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) während
45 Minuten bei 37°C
behandelt und zu einer letztendlichen Stringenz von 0,1 × SSC bei
70°C gewaschen.
Die Schnitte wurden dann mit Ethanol dehydratisiert und an Kodak
Biomax MRJ-Film während 14–21 Tagen
exponiert, und in Kodak NTB2-Emulsion, welche 1:1 mit destilliertem
Wasser verdünnt
war, eingetaucht und 7–8
Wochen lang bei 4°C
exponiert, vor der Entwicklung und Gegenfärbung mit Cresylviolettacetat
(Sigma).
-
Ergebnisse:
-
In-situ-Hybridisierungs-Film-Autoradiogramme
zeigen, daß B1A7-mRNA
ubiquitär
im adulten Ratten-Zentralnervensystem (ZNS) exprimiert wird. Im
Ratten-Rückenmark
wird die B1A7-mRNA überall
in der weißen
und grauen Substanz gleichmäßig hoch
exprimiert. Im Rattengehirn wird die B1A7-mRNA jedoch variabel exprimiert.
Die mRNA des Rezeptors wird vorwiegend in Fasertrakten im gesamten
Gehirn exprimiert, nämlich
dem Corpus callosum, der anterioren Kommissur (anterior und posterior),
Fornix, Fimbria (des Hippocampus), der Capsula interna und dem Kleinhirnpedunkel.
Andere Strukturen, einschließlich
des piriformen Cortex des olfaktorischen Lobus, des Hippocampus
und des Habenularkerns, sind mäßig gefärbt; während verschiedene
andere Regionen des Gehirns, wie zum Beispiel der Cortex und das
periaquäduktale
Grau, die Botschaft schwach exprimieren. Eine mikroskopische Untersuchung
von Emulsions-verarbeiteten Schnitten legt nahe, daß diese
Zellen nicht-neuronal sind.
-
Zusätzlich zu
dieser zentralen Verteilung wird ein mäßiges Hybridisierungssignal
für B1A7-Botschaft in
adulter Rattenmilz, aber nicht in Herz, Niere, Leber, Lunge oder
Skelettmuskel nachgewiesen. Vorbereitende Ergebnisse unter Verwendung
der Ratten-B1A7-Ribosonde weisen darauf hin, daß die B1A7-Rezeptor-mRNA im
Maus-ZNS ähnlich verteilt
ist, während
keine Markierung im humanen adulten Rückenmark oder DRGs nachgewiesen
wird.
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Beispiel 3: Entwicklung eines Assays für den endogenen
Ligand
-
Ein
Verfahren, das verwendet werden kann, um den endogenen Ligand zu
identifizieren oder natürliche
oder synthetische Verbindungen zu screenen, besteht darin, den Rezeptor
strukturell, vorzugsweise über seinen
Carboxyterminus, an eine fluoreszente Sonde zu verknüpfen, zum
Beispiel das grünfluoreszierende Protein
(GFP). Es ist eine allgemein bekannte Tatsache, daß nach Stimulierung
mit einem Agonisten die GPCRs internalisieren (Ashworth et al.,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 512–516 (1995)). Wenn er an eine
fluoreszente Sonde (z. B. GFP) gekoppelt ist, kann man die Internalisierung
des Rezeptors leicht durch herkömmliche Techniken
verfolgen (z. B. fluoreszente oder konfokale Mikroskopie etc.).
Deshalb kann man einen Gewebeextrakt aus Gehirn, Rückenmark
etc. anfertigen, einen fraktionierten Extrakt mit den Zellen inkubieren,
die das Hybrid-GPCR-GFP-Konstrukt exprimieren, und die Internalisierung
verfolgen. Nur die Fraktionen, welche endogenen Ligand für diesen
besonderen GPCR enthalten, werden verursachen, daß das Hybrid
internalisiert. Eine solche aktive Fraktion kann dann weiter fraktioniert
werden, bis die Gewinnung eines reinen Liganden erzielt worden ist.
In ähnlicher
Weise kann man Assays hinsichtlich Rezeptor-aktivierenden Verbindungen
in einer komplexen Mischung einer synthetischen Bibliothek von Verbindungen
vornehmen. SEQUENZAUFLISTUNG
