JP6461901B2 - ネコ科苦味受容体及び方法 - Google Patents

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Description

本願は、ネコ科苦味受容体及び方法に関する。
味覚系は、外界の化学組成物に関する感覚情報を提供する。哺乳類は少なくとも５つの基礎的な味覚の様相すなわち：甘味、苦味、酸味、塩味、及びうま味を有すると考えられている。各々の味覚の様相は、舌の表面に見出される味覚受容体細胞において発現される１つ又は複数の別個のタンパク質受容体によって仲介されると考えられている。苦味、甘味、及びうま味の刺激を認識する味覚受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属する。受容体の微妙な違いにより、どのリガンドが結合し、また受容体が刺激を受けるとどのようなシグナルが生成されるかが変化しうる。
ＧＰＣＲスーパーファミリーの様々なメンバーは他の多くの生理機能、例えば内分泌機能、外分泌機能、心拍度数、脂肪分解、及び炭水化物代謝を仲介する。いくつかのそのような受容体の生化学的分析及び分子クローニングから、これらの受容体のドメインの構造及び機能に関する多数の基本原理が明らかとなっている。
哺乳類が５つの主要な様相を味わう能力はおおむね類似していると思われるが、食餌及び環境の違いにより、味覚受容体は哺乳類生物種全体では多少異なるように進化してきた。例えば、甘味化合物の受容体の構成要素である味覚受容体タイプ１タンパク質メンバー２（Ｔａｓｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｔｙｐｅ １ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｍｅｍｂｅｒ ２）（ＴＡＳ１Ｒ２）をコードする遺伝子は、ネコ科動物及びいくつかの他の偏性肉食動物では機能を持たない偽遺伝子に突然変異している。一方、イルカのような水生哺乳類は最も機能的な味覚受容体を喪失している。
苦味の様相は通常、不快なものとされている。数多くの天然毒素及び合成毒素は苦味物質として特徴付けられてきた。その結果、苦味知覚は、植物に見出されることの多い有毒化合物の摂取をやめさせる手段として進化してきたという仮説が立てられる。苦味を有する化合物の数は概算で数万である。苦味知覚を阻止する化合物、例えば、味覚細胞の表面に埋め込まれた一群のモノマーＧタンパク質共役型受容体である味覚受容体タイプ２（「ＴＡＳ２Ｒ」）タンパク質のサブセットに作用するｐ‐ジプロピルスルファモイル安息香酸（プロベネシド）も同定されている。
研究により、ヒト及び他の霊長類のＴＡＳ２Ｒの分子多様性が個体の苦味知覚の機能的な差をもたらすことが示されている（非特許文献１及び２）。地理的領域の特定の植物相への接触は、ＴＡＳ２Ｒに対する淘汰の主たる原動力であると思われる。
ヒトは約２６個の機能性ＴＡＳ２Ｒをコードし、莫大な数の化合物の検出を可能としている。これまで約５５０個の化合物がヒトにとって苦味物質であるとして同定されている。ヒトＴＡＳ２Ｒ（ｈＴＡＳ２Ｒ）のあるサブセットは現時点では無差別的である、すなわち、いくつかの化学的分類に属する多数のリガンドによって活性化されると考えられているが、他のｈＴＡＳ２Ｒは特定の化学的分類のリガンドのみと結合する。加えて、いくつかのｈＴＡＳ２Ｒはオーファン受容体であって該受容体を刺激する化合物は未だ同定されていない。
苦味刺激のシグナル伝達はガストデューシンのα‐サブユニットを介して行われる。このＧタンパク質サブユニットは味覚ホスホジエステラーゼ（ｔａｓｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）を活性化し、サイクリックヌクレオチドのレベルを減少させる。伝達経路のさらなるステップは未だ知られていない。ガストデューシンのβγ‐サブユニットも、ＩＰ３（イノシトール３リン酸）及びＤＡＧ（ジグリセリド）の活性化により味覚を仲介する。これらの第二メッセンジャーはゲート型イオンチャネルを開口させる場合もあれば、内部カルシウムの放出を引き起こす場合もある。ＴＡＳ２Ｒはすべてガストデューシン含有細胞に位置しているが、ガストデューシンのノックアウトでは苦味化合物に対する感度は完全には無くならず、苦味に関する重複したメカニズムを示唆している。
ｈＴＡＳ２Ｒ３８は最も広く研究された苦味受容体である。２０世紀初め、苦味化合物であるフェニルチオカルバミド（ＰＴＣ）の知覚において対立する２つが、人々を被検者として観察された。ほとんどの人々はＰＴＣの味を感じることが可能であったが、約２５％の人々は感じられなかった。研究者らは、有味者／無味者の表現型がある程度の遺伝性を有することに気づいた。その後、２群間の表現型の差は、遺伝子型の差、より具体的にはｈＴＡＳ２Ｒ３８のＤＮＡ内の３つの位置における一塩基多型（ＳＮＰ）に帰する可能性があると判定された。
他の生物種はヒトのものと全く異なるＴＡＳ２Ｒレパートリーを示す。例えば、マウスはそのゲノム中にコードされた３４個の完全長ＴＡＳ２Ｒを有する一方、ニワトリは３個しか持っていない（非特許文献３）。化合物によっては多数のＴＡＳ２Ｒによって検出可能であるが、生物種間のＴＡＳ２Ｒレパートリーの差が苦味知覚の差に帰着することはほぼ確実である。
苦味知覚は、味覚受容体２ファミリー（ＴＡＳ２Ｒ）のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）によって仲介される。ＴＡＳ２Ｒ遺伝子は、Ｇタンパク質と相互作用して味覚のシグナル伝達を仲介する、味覚の伝達に関与している関連する７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型受容体のファミリーをコードしている。特に、ＴＡＳ２ＲはＧタンパク質であるガストデューシンとリガンド特異的な方式で相互作用する。
現在までに、ヒトＴＡＳ２Ｒ（ｈＴＡＳ２Ｒ）を特性解析するために多くの研究が行われてきた。ヒトゲノムは、糖タンパク質である約２６個の機能性ＴＡＳ２Ｒをコードしている。全てのＴＡＳ２Ｒは、第２の細胞外ループの中心内部におけるＡｓｎ結合型グリコシル化のための保存された部位を共有している。ｈＴＡＳ２Ｒはさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発現された時にホモオリゴマー及び他のＧＰＣＲとのヘテロオリゴマーを形成する能力を有するが、現在のところＴＡＳ２Ｒ受容体のオリゴマー化が機能的な意味合いを持つという証拠は存在しない。
苦味受容体細胞は、ＴＡＳ２Ｒ遺伝子の発現を特徴とし、かつ他の味覚刺激の検出に当てられた受容体細胞からは完全に分離された、化学感覚細胞の独特な亜集団に相当する。各々の苦味受容体細胞は多数の苦味受容体を発現しているが、共発現の程度には未だ議論の余地がある。
味覚系における発現に加え、ＴＡＳ２Ｒは非味覚組織においても見出される。これらの口外の部位の中には、気道上皮、胃腸組織、生殖器、及び脳がある。苦味受容体はマウスにおける精子の分化又は成熟に関係している。ＴＡＳ２Ｒの非味覚性の発現は消化及び呼吸を調節するために使用されることが知られている。
腸内分泌細胞株（ＳＴＣ‐１細胞）におけるＴＡＳ２Ｒ受容体の活性化は、腸の運動性を低減することができるペプチドホルモンのコレシストキニン（ＣＣＫ）の放出をもたらす。従って、ＴＡＳ２Ｒ経路を活性化する潜在的毒素の摂取は、食物が胃を通り抜ける速度を低下させ、継続して摂食する意欲を減じる可能性がある。ＣＣＫの放出はさらに、迷走神経の感覚神経プロセスを興奮させて脳にシグナルを運び、食物摂取の調節が末梢及び中枢のいずれの制御も伴うことを示唆している。ＴＡＳ２Ｒシグナル伝達ネットワークの活性化はさらに、又は別例として、毒素が血液循環に入ることができる前に腸上皮からの吸収された毒素の排除を間接的に増大させる可能性がある。というのも、あるデータは、ＣＣＫを分泌する腸内分泌細胞が腸から血液循環中への毒性物質の移動を低減するパラクリンシグナル伝達システムに関与することを示唆しているからである。腸管の下部では、ＴＡＳ２Ｒ受容体の活性化は異なる効果を有する。一部の苦味リガンドが結腸上皮に適用されると、該リガンドは陰イオンの分泌を誘導し、該陰イオンは、あらゆる有害な刺激物を結腸から洗い流すことのできる上皮による体液分泌をもたらす。
孤立化学感覚細胞（ＳＣＣ）も上部呼吸器系全体にわたって存在し、ＴＡＳ２Ｒ受容体、ＰＬＣβ２、ガストデューシン、及び伝達チャネル（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ）ＴｒｐＭ５を含む一連の味覚関連シグナル伝達分子全体を発現する。ＳＣＣは三叉神経のポリモーダルな疼痛線維（ｐａｉｎ ｆｉｂｅｒ）上にシナプスを形成する。ＳＣＣのＴＡＳ２Ｒ受容体を活性化する毒素の吸入は刺激性となり、呼吸における三叉神経を介した反射変化を喚起することになる。加えて、活性化された三叉神経線維は気道上皮の局所的神経原性炎症をもたらすペプチドモジュレーターを放出し、毒素の存在に応答して免疫系を活性化する。
ヒトの苦味受容体であるｈＴＡＳ２Ｒ２、ｈＴＡＳ２Ｒ４１、ｈＴＡＳ２Ｒ４２、ｈＴＡＳ２Ｒ４５、ｈＴＡＳ２Ｒ４８、及びｈＴＡＳ２Ｒ６０は、これらの受容体についてリガンドが未だ同定されていないので、今もなおオーファンＧＰＣＲとみなされている。
最近まで、ｈＴＡＳ２Ｒ２は、１０種のヒト集団（南米のカリチアーナ族（Ｋａｒｉｔｉａｎａ）、スルイ族（Ｓｕｒｕｉ）、ワオラニインディアン、東欧のロシア人、中東のドルーズ族（Ｄｒｕｚｅ）、東アジアのタイヤル族（Ａｔａｙａｌ）、中国人、日本人、並びに東南アジアのクメール人（Ｋｈｍｅｒｓ）及びメラネシア人）から、並びにＧｅｎＢａｎｋ供給源から収集された配列において見出されるコドン１６０の２塩基欠失ゆえに、偽遺伝子として注釈付けされていた。ｈＴＡＳ２Ｒ２はその欠失に関して多型であることが分かっており、完全な遺伝子はアディゲ人（Ａｄｙｇｅｉ）（東欧）、ムブティ族（Ｍｂｕｔｉ）（アフリカのピグミー）及びビアカ族（Ｂｉａｋａ）（アフリカのピグミー）に見出される（非特許文献３）。
ネコ科ゲノムは最小限の包括度で配列決定済みである（非特許文献４及び５）。その結果、大きな欠落部がネコ科ゲノム配列中に存在しており、２０００個をわずかに超えるネコ科遺伝子しか現在まで注釈付けがなされていない。比較として、ヒトゲノムは約２５，０００個の注釈付けされた遺伝子を有する。ゲノムアセンブリにおけるギャップより前の配列は低品質であり、したがって、欠けている情報に加えて、存在するデータの大部分が低品質である。従って、ネコ科ゲノミクス内において、かつネコ科動物の味知覚の分子基盤を決定する際に、発見されるべきことが多くある。ネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）はネコ科ゲノムにおいて未だ注釈付けされていないし、現在まで生化学的に調査もなされていない。加えて、数多くのネコ科動物の種族が特定の地理的領域に起源を有し、したがって独自の植物相にさらされており、種族特異的なＴＡＳ２Ｒの差が存在する可能性がある。
ネコ科ＴＡＳ２Ｒ苦味受容体の同定及び特性解析は、ネコ科動物の味覚プロファイルとその変調について理解するのに有用である。
イマイ（Ｉｍａｉ）ら、バイオロジー・レターズ（Ｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．）、２０１２年、第８巻、第４号、ｐ．６５２−６５６ リー（Ｌｉ）ら、ヒューマン・バイオロジー（Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１１年、第８３巻、ｐ．３６３−３７７ ゴウ（Ｇｏ）ら、ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、２００５年５月、第１７０巻、第１号、ｐ．３１３−３２６ マリケン（Ｍｕｌｌｉｋｉｎ）ら、ビーエムシー・ゲノミクス（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、２０１０年、第１１巻、ｐ．４０６ ポンティウス（Ｐｏｎｔｉｕｓ）ら、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００７年、第１７巻、ｐ．１６７５−１６８９
新規なネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体が本明細書中に開示される。
一実施形態において、単離されたネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）受容体ポリペプチドは、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の細胞外ドメイン；ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の膜貫通領域、又はネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の細胞内ドメインを含み、該ｆＴＡＳ２Ｒ受容体は、配列番号１８、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６から選択された配列を含み、単離されたｆＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドは、配列番号２、４、６、又は１０のアミノ酸配列からなるものではない。
一実施形態において、単離されたｆＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドは、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドの細胞外ドメインであって、配列番号２のアミノ酸１、６８〜８４；１４６〜１７９；若しくは２４９〜２５７；配列番号４のアミノ酸１〜１０、７３〜８８；１５１〜１８６；若しくは２５６〜２６４；配列番号６のアミノ酸１〜８；７２〜８８；１５０〜１８６；若しくは２５６〜２６５；配列番号８のアミノ酸１〜２；６９〜８７；１５１〜１８３；若しくは２５３〜２６１；配列番号１０のアミノ酸１〜８；７２〜８８；１５０〜１８７；若しくは２５７〜２６５；配列番号１２のアミノ酸１〜６；７２〜８８；１５０〜１８３；若しくは２５３〜２６２；配列番号１４のアミノ酸１；６９〜８７；１５０〜１８１；若しくは２５１〜２６０；配列番号１６のアミノ酸１〜８；６９〜８８；１５０〜１８５；若しくは２５２〜２６１；配列番号１８のアミノ酸１〜１７：８３〜９８；１６１〜１９８；若しくは２６８〜２７７；配列番号２０のアミノ酸１；６９〜８８；１５０〜１８５；若しくは２５５〜２６４；配列番号２２のアミノ酸１〜２；６９〜８７；１４９〜１８１；若しくは２５１〜２６０；配列番号２４のアミノ酸１〜２；６９〜８７；１４９〜１８１；若しくは２５１〜２５９；若しくは、配列番号２６のアミノ酸１〜８；７２〜８８；１５０〜１８５；若しくは２５４〜２６３；を含む細胞外ドメイン；ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドの膜貫通領域であって、配列番号２のアミノ酸２〜２２、４７〜６７、８５〜１０５、１２５〜１４５、１８０〜２００、２２８〜２４８、若しくは２５８〜２７８；配列番号４のアミノ酸１１〜３１、５２〜７２、８９〜１０９、１３０〜１５０、１８７〜２０７、２３５〜２５５、若しくは２６５〜２８５；配列番号６のアミノ酸９〜２９、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８７〜２０７、２３５〜２５５、若しくは２６６〜２８６；配列番号８のアミノ酸３〜２３、４８〜６８、８８〜１０８、１３０〜１５０、１８４〜２０４、２３２〜２５２、若しくは２６２〜２８２；配列番号１０のアミノ酸９〜２９、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８８〜２０８、２３６〜２５６、若しくは２６６〜２８６；配列番号１２のアミノ酸７〜２７、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８４〜２０４、２３２〜２５２、若しくは２６３〜２８３；配列番号１４のアミノ酸２〜２２、２．４８〜６８、８８〜１０８、１２９〜１４９、１８２〜２０２、２３０〜２５０、若しくは２６１〜２８１；配列番号１６のアミノ酸９〜２９、４８〜６８、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８６〜２０６、２３１〜２５１、若しくは２６２〜２８２；配列番号１８のアミノ酸１８〜３８、６２〜８２、９９〜１１９、１４０〜１６０、１９９〜２１９、２４７〜２６７、若しくは２７８〜２９８；配列番号２０のアミノ酸２〜２２、４８〜６８、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８６〜２０６、２３４〜２５４、若しくは２６５〜２８５；配列番号２２のアミノ酸３〜２３、４８〜６８、８８〜１０８、１２８〜１４８、１８２〜２０２、２３０〜２５０、若しくは２６１〜２８１；配列番号２４のアミノ酸３〜２３、４８〜６８、８８〜１０８、１２８〜１４８、１８２〜２０２、２３０〜２５０、若しくは２６０〜２８０；若しくは、配列番号２６のアミノ酸９〜２９、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８６〜２０６、２３３〜２５３、若しくは２６４〜２８４を含む膜貫通領域、又は、細胞内ドメインであって、配列番号２のアミノ酸２３〜４６；１０６〜１２４；２０１〜２２７；若しくは２７９〜２９８；配列番号４のアミノ酸３２〜５１；１１０〜１２９；２０８〜２３４；若しくは２８６〜３０４；配列番号６のアミノ酸３０〜５０；１１０〜１２８；２０８〜２３４；若しくは２８７〜３１６；配列番号８のアミノ酸２４〜４７；１０９〜１２９；２０５〜２３１；若しくは２８３〜３０６；配列番号１０のアミノ酸３０〜５０；１１０〜１２８；２０９〜２３５；若しくは２８７〜３１１；配列番号１２のアミノ酸２８〜５０；１１０〜１２８；２０５〜２３１；若しくは２８４〜３３７；配列番号１４のアミノ酸２３〜４８；１０９〜１２８；２０３〜２２９；若しくは２８２〜３００；配列番号１６のアミノ酸３０〜４７；１１０〜１２８；２０７〜２３０；若しくは２８３〜３０９；配列番号１８のアミノ酸３９〜６１；１２０〜１３９；２２０〜２４６；若しくは２９９〜３３４；配列番号２０のアミノ酸２３〜４７；１１０〜１２８；２０７〜２３３；若しくは２８６〜３２２；配列番号２２のアミノ酸２４〜４７；１０９〜１２７；２０３〜２２９；若しくは２８２〜２９９；配列番号２４のアミノ酸２４〜４７；１０９〜１２７；２０３〜２２９；若しくは２８１〜３０８；若しくは、配列番号２６のアミノ酸３０〜５０；１１０〜１２８；２０７〜２３２；若しくは２８５〜３１２を含む細胞内ドメインを含む。
新規なネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドのフラグメント、も開示される。
一実施形態において、該ポリヌクレオチドは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５のヌクレオチド配列；配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５を有するポリヌクレオチドの相補体に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び先述のヌクレオチド配列の相補体、から選択されたヌクレオチド配列を含む。
該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び宿主細胞、並びにオリゴヌクレオチドを含む発現ベクター及び宿主細胞も開示される。
ｆＴＡＳ２Ｒ受容体を検出するための抗体及びキットも開示される。
さらに、ｆＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドと相互作用するか又は該ポリペプチドの活性を変調する化合物を同定する方法も本明細書中に開示される。
一実施形態において、該方法は、本明細書中のＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドを試験化合物と接触させること、及び該受容体ポリペプチドと試験化合物との間の相互作用を検出することを含む。
一実施形態において、該方法は、本明細書中に開示されたＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドを、試験化合物の存在下又は非存在下で受容体リガンドと接触させること、及び試験化合物が受容体へのリガンドの結合又はリガンドによる受容体の活性化を変調するかどうかを判定することを含む。
さらなる方法も開示される。
一実施形態において、可食組成物を調製する方法は、可食組成物又はその構成要素を、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドと、該可食組成物又はその構成要素に由来する苦味化合物の量を低減するのに十分な時間、接触させることを含む。
一実施形態において、動物に対する食味を制御するために可食組成物を調製する方法は、動物に対する可食組成物の食味を低下させるために化合物を該可食組成物に加えることを含み、該化合物はネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト又は正のモジュレーターである。
一実施形態において、食味が増強された可食組成物を調合する方法は、可食組成物中の、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターである化合物の存在を判定すること；及び、該化合物がアゴニスト若しくは正のモジュレーターである場合には、可食組成物中の該受容体のアンタゴニストの量を増加させること若しくは可食組成物中の該化合物の量を低減することにより、又は、該化合物がアンタゴニスト若しくは負のモジュレーターである場合には、可食組成物中の該化合物の量を増加させることにより、該可食組成物の食味を増強することを含む。
一実施形態において、苦味化合物を、該化合物を必要とする動物に与える方法は、動物に可食組成物を与えることを含み、ここで、該可食組成物は、苦味化合物と、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアンタゴニスト又はモジュレーターである化合物であって、動物による可食組成物の受容を、該化合物を含まない可食組成物の受容と比較して変更する化合物とを含む。苦味化合物は、医薬品、口腔ケア材料、栄養補助食品、又は忌避剤を含んでもよい。
さらに、動物に与える可食組成物をコーティングするか又は該可食組成物中に組み込むための香味組成物及び該香味組成物の製造方法も開示される。
一実施形態において、香味組成物は、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであって、該アゴニストはデナトニウム、アロイン、又はＰＴＣであり、該アンタゴニストはプロベネシドである、アゴニスト又はアンタゴニストと；任意選択で食味増強剤と；任意選択で、可食組成物に香味組成物を付着させるのを支援する化合物と；任意選択で、色又は芳香を提供するための化合物とを含み、香味組成物は液体、固体、粉体、ペースト、ゲル、スプレッド調合物、顆粒、又は噴霧用調合物である。
一実施形態において、香味組成物を製造する方法は、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであって、該アゴニストはデナトニウム、アロイン、若しくはＰＴＣであり、該アンタゴニストはプロベネシドである、アゴニスト又はアンタゴニストと；任意選択で食味増強剤と；任意選択で、可食組成物に香味組成物を付着させるのを支援する化合物と；任意選択で、色又は芳香を提供するための化合物とを、食肉加工品、食肉副産物、魚加工品、魚副産物、乳製品、乳製品副産物、微生物タンパク質の供給源、植物性タンパク質、炭水化物及びアミノ酸からなる群から選択された材料と混合して香味組成物を得ることを含み、該香味組成物は液体、固体、粉体、ペースト、ゲル、スプレッド調合物、顆粒、又は噴霧用調合物である。
上記及びその他の利点、並びにさらなる発明的特徴は、以降の図面、詳細な説明、実施例、及び特許請求の範囲から明白となろう。
いくつかのヒト及びネコ科苦味受容体、すなわち：ヒトのＴＡＳ２Ｒ１６（配列番号３０）、ＴＡＳ２Ｒ４（配列番号２７）、ＴＡＳ２Ｒ９（配列番号２８）、ＴＡＳ２Ｒ１０（配列番号２９）及びＴＡＳ２Ｒ３８（配列番号３１）；並びにネコ科苦味受容体ＴＡＳ２Ｒ４（配列番号８）、９（配列番号１２）、１０（配列番号１４）、１２（配列番号１６）、及び３８（配列番号１８）の、３番目から７番目までの膜貫通（ＴＭ）領域（膜貫通領域を灰色で表す）を示している配列アラインメントを示す図。 ヒトＴＡＳ２Ｒ３８ポリペプチド（配列番号３１）及び５匹のネコ個体のゲノムＤＮＡのシーケンシングから決定されたネコ科ＴＡＳ２Ｒ３８ポリペプチド（配列番号１８）の配列アラインメントを示す図。
詳細な説明
一群の新規なネコ科苦味受容体である、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）が本明細書中に開示される。これらのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、ネコ科味覚伝達経路、具体的には苦味伝達経路の一部の構成要素であり、６‐ｎ‐プロピルチオウラシル、オクタアセチルスクロース、ウンデカ酢酸ラフィノース、シクロヘキシミド、デナトニウム、グリシン銅、及びキニーネのような苦味物質のネコ科動物による味検出に関与する。新規なネコ科苦味受容体をコードするポリヌクレオチドも、新規なネコ科苦味受容体の発現のための発現ベクター及び宿主細胞も開示される。核酸及びコードされたポリペプチドを発現及び単離する方法も開示される。
核酸は、該核酸を発現する細胞、例えば味覚細胞の同定のためのプローブを提供する。例えば、ＴＡＳ２Ｒポリペプチドの発現のためのプローブは、葉状乳頭、有郭乳頭、及び茸状乳頭に存在する味覚細胞を同定するために使用可能である。特に、ＴＡＳ２Ｒプローブは苦味を感知する細胞を同定するのに有用であり、苦味を感知する細胞と該細胞の中枢神経系への投射との関係を解明する解剖地図作成のためのツールとしての役割を果たすことができる。新規なネコ科苦味受容体に結合して該受容体の活性を変調する化合物を同定する方法が開示される。該方法において、ｆＴＡＳ２Ｒファミリーのメンバーは、細胞の活性を発現する味覚受容体のモジュレーターを同定するための、直接的又は間接的リポーター分子として作用する。そのような化合物はネコ科苦味受容体の活性の変調に有用である。ネコ科苦味受容体の活性の変調は、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤、及び／又は増強剤によって達成することができる。これらの変調化合物は、食物又は薬物の味をカスタマイズするため、例えば食物又は薬物の苦味を減少させるために、食品産業及び製薬産業において使用可能である。よって、本明細書中に開示された方法は、特にネコ科動物のための、嫌悪化合物が回避又は阻止されている食物、食物食味付与剤（ｆｏｏｄ ｐａｌａｔａｎｔｓ）、おやつ、及び薬剤を設計又は調合するのに有用である。
「アゴニスト」又は「受容体アゴニスト」は、本明細書中で使用される場合、細胞受容体に対する親和性を有し、かつ細胞受容体の機能的活性を刺激する分子を指す。受容体における機能的活性の刺激のレベルは、例えばベースラインを少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、少なくとも１，０００％、少なくとも１０，０００％上回るものであってよい。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸に類似の方式で機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸ミメティックを指す。天然に存在するアミノ酸とは、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸、並びにその後修飾を受けるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ‐カルボキシグルタマート、及びＯ‐ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合している炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのようなアナログは修飾されたＲ基を有するか（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持している。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが天然に存在するアミノ酸に類似の方式で機能する化学化合物を意味する。アミノ酸は、その一般に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ生化学命名法委員会推奨の１文字記号のいずれかにより本明細書中で参照される場合がある。
受容体「アンタゴニスト」は、本明細書中で使用される場合、アゴニストと同じ部位において受容体に結合するが、活性型の受容体によって始動される機能的応答を活性化しない、一種の受容体リガンドを指す。アンタゴニストは、結合すると、アゴニストの結合を阻止することによりアゴニストの結合で生じる機能的応答を阻害する。アゴニスト及びアンタゴニストは受容体上の同じ結合部位について「競争する」ので、受容体の活性レベルは、該部位についての各分子の相対的親和性及びそれらの相対濃度によって決まることになる。アゴニストの適用の前に、それと同時に、又はその後に適用されたアンタゴニストによる、アゴニストにより誘発される機能的応答の阻害は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％；少なくとも２０％；少なくとも３０％；少なくとも４０％；少なくとも５０％；少なくとも６０％；少なくとも７０％；少なくとも８０％；少なくとも９０％；少なくとも９５％；少なくとも９８％；少なくとも９９％；少なくとも９９．５％；又は少なくとも１００％となりうる。ある実施形態では、アンタゴニスト及びアゴニストは同じモル濃度で適用される。
「抗体」とは、抗原に特異的に結合し、かつ抗原を認識するポリペプチドを指す。用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、本明細書中では互換的に使用され、抗体全体及びその任意の抗原結合性フラグメント（抗原結合部分）又は同起源の一本鎖抗体を含む。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。用語「モノクローナル抗体」は、ほぼ均質の抗体の集団から得られた抗体を意味する。すなわち、該集団を構成している個々の抗体は、微量存在しうる自然発生の突然変異の可能性を除いて同一である。いくつかの実施形態では、用語「モノクローナル抗体」は、単細胞クローンに由来する抗体を指す。
「抗体」は、少なくとも１本の重（Ｈ）鎖及び１本の軽（Ｌ）鎖を含む。天然に存在するＩｇＧでは、例えば、これらの重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合によって相互に連結されており、２対の重鎖及び軽鎖が存在する。これら２つもジスルフィド結合によって相互に連結されている。重鎖はそれぞれ、重鎖可変領域（本明細書中ではＶＨと略記）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。軽鎖はそれぞれ、軽鎖可変領域（本明細書中ではＶＬと略記）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬから成る。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられた超可変性の領域、及びそれらの間に組み込まれた、より保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）又は連結（Ｊ）領域（重鎖及び軽鎖においてそれぞれＪＨ若しくはＪＬ）と名付けられた領域に、さらに細分化できる。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、３個のＣＤＲ ３個のＦＲ及び１個のＪドメインが、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、Ｊの順に配置構成されたものからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と結合する。抗体の定常領域は、宿主の組織又は因子、例えば免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）又は古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）のような液性因子への免疫グロブリンの結合を仲介する場合もある。
抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合性フラグメント」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持している、抗体の１つ以上のフラグメントを指す。完全長の抗体のある種のフラグメントは抗体の抗原結合機能を発揮することができることが示されている。抗体の抗原結合部分又は抗原結合性フラグメントとして記載される結合性フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、一価のフラグメントであってＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるもの；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むｄＡｂ；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント（ウォード（Ｗａｒｄ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８９年、第３４１巻、ｐ．５４４−５４６）であって、ＶＨドメインからなるもの；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなるｄＡｂ；並びに、（ｖｉｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又は（ｉｘ）２つ以上の単離ＣＤＲの組み合わせであって任意選択で合成リンカーによって連結されたもの、が挙げられる。更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬ及びＶＨ）は別個の遺伝子によってコードされるが、該ドメインは、組換え法を使用して、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対をなして一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖（そのような免疫グロブリンフラグメントの同起源の一本鎖抗体は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）として作製されることを可能にする合成リンカーによって、連結することが可能である。そのような一本鎖抗体も用語「抗体フラグメント」に包含される。抗体フラグメントは当業者に既知の従来の技法を使用して得られ、かつ該フラグメントは完全な抗体と同じ一般的な方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合性フラグメントは、組換えＤＮＡ技術により、又は完全な免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断により、生産可能である。
「抗ＴＡＳ２Ｒ」又は「ＴＡＳ２Ｒ」抗体とは、ＴＡＳ２Ｒの遺伝子、ｃＤＮＡ、又はこれらの部分配列によってコードされたポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである。
用語「キメラポリペプチド」は、自然界には存在しない分子であって、ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチド配列のうち全部又は一部分が線状の該キメラポリペプチド配列の一部である分子を指す。ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチド配列の一部分は、完全なｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドの１つ以上のドメインのアミノ酸配列であってよい。例えば、該部分はｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドの細胞外ドメインであってもよい。キメラポリペプチドは当分野で既知の任意の方法によって作製可能である。例えば、キメラポリペプチドは組換え発現系によって作製されることも可能であるし、合成されることも可能である。
「コドン最適化」とは、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に適用される方法であって、対象とする非ネコ科の生物体、例えばキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）又は出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）の細胞におけるポリペプチドの発現増強のために、発現されるポリペプチドのアミノ酸を変化させることなく、本来のネコ科の配列の少なくとも１つ、２つ以上、又は全てのコドンを、発現生物体の遺伝子においてより高頻度又は最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、該ヌクレオチド配列を改変する方法を表す。好ましい実施形態では、ポリペプチド配列をコードしている核酸、又はそのフラグメント、の全てのコドンについてコドン最適化がなされる。多くの生物体は、成長中のペプチド鎖に特定のアミノ酸を挿入するためにコードする特定のコドンの使用について偏りを示す。コドンバイアス又はコドン選好と呼ばれることもある、生物種間でのコドン利用の相違は、遺伝子コードの縮重によって生じ、多くの生物種の間で十分立証されている。コドンバイアスはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、この効率はさらに、とりわけ、翻訳されるコドンの性質及び特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の有用性に依存すると考えられている。細胞内で選択されるｔＲＮＡの優位性は一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンを反映している。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づき、所与の生物体における最適な遺伝子発現に合わせて作られることが可能である。コドン最適化の方法は当分野において知られており、例えば無料のインターネットアクセス可能なプログラムであるＪＣａｔ（グロート（Ｇｒｏｔｅ）Ａら、「ＪＣａｔ：標的遺伝子のコドン利用をその潜在的発現宿主に適応させるための新規ツール（ＪＣａｔ： ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｔｏ ａｄａｐｔ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｔｏ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈｏｓｔ）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）、２００５年７月１日、第３３巻（ウェブサーバ紹介号）：Ｗ５２６−３１）又は米国特許出願公開第２０１３００１７２１７号明細書若しくは国際公開第２００４０５８１６６号に開示された方法論があり、上記参照文献は参照により本明細書中に組み込まれる。
「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関しては、保存的に改変されたバリアントとは、同一若しくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸を指し、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重により、いくつかの機能的に同一な核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。よって、コドンによってアラニンが指定されているあらゆる位置において、該コドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく記載の対応コドンのうちいずれかに変更されることが可能である。そのような核酸の変異は、保存的に改変された変異の１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列は、該核酸のあらゆるサイレント変異についても述べている。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常はメチオニン用の唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常はトリプトファン用の唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が機能的に同一な分子を生じるように改変可能であることを認識するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異はそれぞれ、記載された各配列に暗に含まれている。当業者はさらに、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加であって、コードされた配列中の単一のアミノ酸又は数パーセントのアミノ酸を変更、付加、欠失するものは、その変更が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合は「保存的に改変されたバリアント」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は当分野において良く知られている。そのような保存的に改変されたバリアントは、本発明の多型バリアント、異種間ホモログ、及びアレルに追加されるものであり、上記多型バリアント、異種間ホモログ、及びアレルを除外するものではない。
「Ｃ末端ドメイン」は、タンパク質の最後の膜貫通ドメインの端部及びＣ末端に位置する領域であって、通常は細胞質内に位置する領域を指す。
「細胞質ドメイン」又は「細胞内ドメイン」は、細胞の内部に面するＴＡＳ２Ｒタンパク質のドメイン、例えば「Ｃ末端ドメイン」、並びに膜貫通ドメインの細胞内ループ、例えば膜貫通領域１及び２の間の細胞内ループ、膜貫通領域３及び４の間の細胞内ループ、並びに膜貫通領域５及び６の間の細胞内ループを指す。
用語「細胞外ドメイン」は、細胞膜から突出し、細胞の細胞外の面に露出しているＴＡＳ２Ｒポリペプチドのドメインを指す。そのようなドメインには、細胞の細胞外の面に露出している「Ｎ末端ドメイン」、並びに細胞の細胞外の面に露出している膜貫通ドメインの細胞外ループ、すなわち膜貫通領域２及び３の間のループ、並びに膜貫通領域４及び５の間のループが挙げられる。「Ｎ末端ドメイン」領域はＮ末端を始点として膜貫通ドメインの始点に近い領域まで及ぶ。これらの細胞外ドメインは、可溶性相及び固相のいずれのｉｎ ｖｉｔｒｏリガンド結合アッセイにも有用である。
用語「ネコ科」は、本明細書中では、イエネコ及び野生のネコ類を含むネコ科の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、ネコ科には、野生のネコ類又は捕獲されたネコ類の両方、例えばアメリカライオン、チータ、ヤマネコ、オセロット、ライオン、トラ、ジャガー、ピューマ、及びヒョウ等の野生及び外来のネコ類を挙げることができる。
本明細書中で使用される場合、「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、配列若しくは細胞が外来の生物種を起源とするか、若しくは、同じ生物種由来である場合は計画的な人的介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座におけるその本来の形態から実質的に改変されていること、又は、配列が任意の天然の配列とは関係なく新たに設計されていることを意味する。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターは、そのポリヌクレオチドの由来元の生物種とは異なる生物種に由来するか、又は、同一若しくは類似の生物種に由来する場合には、一方若しくは両方がそれらの元の形態及び／又はゲノム遺伝子座から実質的に改変されているか、若しくはプロモーターが作動可能に連結されるポリヌクレオチドのための本来のプロモーターではない。「異種配列」とは、作動可能に連結されていないか、又は自然界において互いに隣接していない配列である。「異種ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、天然においてはｆＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのポリペプチド配列には含まれないポリペプチドを指す。ポリペプチド又は核酸の発現のための「異種細胞」とは、そのポリペプチド又は核酸を通常は発現しない細胞を指す。
「相同性」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチド分子の間の同一性（％）を指す。２つのＤＮＡ、又は２つのポリペプチド配列は、該配列が該分子の所定の長さにわたって少なくとも約５０％、具体的には少なくとも約７５％、より具体的には少なくとも約８０％〜８５％、少なくとも約９０％、及び最も具体的には少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合、互いに「ほぼ相同である」。本明細書中で使用される場合、ほぼ相同であるとは、指定されたＤＮＡ又はポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列も指す
一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列の、それぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドの一致又はアミノ酸対アミノ酸の一致を指す。
用語「イムノアッセイ」は、抗原に特異的に結合するための抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、抗原の単離、標的化、及び／又は定量を行うために特定の抗体の特異的に結合する性質を使用することを特徴とする。
本明細書中で使用される場合、ＴＡＳ２Ｒ受容体、又はそのリガンド結合性フラグメントの活性の「阻害」又は「阻止」とは、ＴＡＳ２Ｒ受容体又はフラグメントのアゴニストに対する機能的応答が、その阻害剤が存在する状態において低減又は抑制されること、例えば、ＴＡＳ２Ｒ受容体が細胞内シグナル伝達経路と相互作用して生じる機能的応答がより小さいこと、例えば、ＴＡＳ２Ｒ受容体がＧタンパク質と相互作用して、阻害が存在しない状態でアゴニストによって誘発されるよりも細胞内Ｃａ２＋の増大がより小さいシグナル伝達を促進することを意味する。
ＴＡＳ２Ｒ受容体との化合物の「相互作用」とは、該化合物の受容体への結合又は該化合物による受容体の機能的応答の変調を意味することができる。
本明細書中で互換的に使用される、用語「単離された」又は「精製された」は、核酸、ポリペプチド、又はその他の生体構成部分であって、天然において関連している構成要素から取り出されているものを指す。用語「単離された」は、ポリペプチドであって、該分子が自然界においてともに見出される生物体全体から分離しておりかつ別個であるか、又は同じ種類の他の生体高分子がほぼ存在しない状態で存在しているものを指すことができる。ポリヌクレオチドに関しての用語「単離された」は、核酸分子であって、自然界において該核酸分子に通常関連している配列を全部若しくは部分的に欠いているもの；又は自然界に存在するとおりの配列であるが、該配列に関連する異種配列を有するもの；又は染色体との関係から切り離された分子を指す場合がある。純度及び均質性は、典型的には、分析化学技法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。調製物中に存在する優勢な分子種であるタンパク質が実質的に精製される。特に、単離されたＴＡＳ２Ｒ核酸は、ＴＡＳ２Ｒ遺伝子に隣接してＴＡＳ２Ｒ以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。いくつかの実施形態では、用語「精製された」は、核酸又はタンパク質が少なくとも８５％の純度、具体的には少なくとも９０％の純度、より具体的には少なくとも９５％の純度、又はさらにより具体的には少なくとも９９％の純度であることを意味する。
「リガンド」は、本明細書中で使用される場合、ＴＡＳ２Ｒ受容体のような巨大分子に結合する分子を指す。リガンドは、小分子であってもよいし、タンパク質、糖、核酸又は脂質のような生体構成部分であってもよい。リガンドはＴＡＳ２Ｒ受容体活性を変調する分子となりうる。受容体の活性を変調する分子は、本明細書中に定義されるようなアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターとなりうる。
様々なＴＡＳ２Ｒ受容体のリガンドが当分野において知られている。例えば、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ１のリガンドには、アドフムロン、アドルプロン、アマロゲンチン、アルボレシン、カスカリリン、クロラムフェニコール、シス‐イソコフムロン、シス‐イソロアドフムロン（ｃｉｓ−ｉｓｏｌｏａｄｈｕｍｕｌｏｎｅ）、コフムロン、コルプロン、デキストロメトルファン、ジフェニドール（ジフェニルチオ尿素、スルホカルバニリド、ｓｙｍ‐ジフェニルチオ尿素、又はチオカルバニリド）、フムロン（ｈｕｍｕｌｏｎ，ｈｕｍｕｌｏｎｅ）、イソキサントフモール、ルプロン（ｌｕｐｕｌｏｎ，ｌｕｐｌｏｎｅ）、パルテノリド、ピクロトキシニン、サイクラミン酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、チアミン、トランス‐イソアドフムロン、トランス‐イソコフムロン、トランス‐イソフムロン、キサントフモール、及びヨヒンビンが挙げられる。哺乳類ＴＡＳ２Ｒ１は、ヒト、げっ歯類、イヌ科、又はネコ科に由来するものであってよい。一実施形態において、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ１はネコ科ＴＡＳ２Ｒ１である。
哺乳類ＴＡＳ２Ｒ３のリガンドにはクロロキンを挙げることができる。哺乳類ＴＡＳ２Ｒ３は、ヒト、げっ歯類、イヌ科、又はネコ科に由来するものであってよい。一実施形態において、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ３はネコ科ＴＡＳ２Ｒ３である。
哺乳類ＴＡＳ２Ｒ４のリガンドには、アマロゲンチン、アルボレシン、アルテモリン、アザチオプリン、ブルシン、樟脳、クロルフェニラミン、コルヒチン、ダプソン、安息香酸デナトリウム、ジフェニドール、パルテノリド、カッシン、キニーネ、及びヨヒンビンを挙げることができる。哺乳類ＴＡＳ２Ｒ４は、ヒト、げっ歯類、イヌ科、又はネコ科に由来するものであってよい。一実施形態において、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ４はネコ科ＴＡＳ２Ｒ４である。
哺乳類ＴＡＳ２Ｒ７のリガンドには、カフェイン、クロルフェニラミン、クロモリン、ジフェニドール、パパベリン、及びキニーネを挙げることができる。哺乳類ＴＡＳ２Ｒ７は、ヒト、げっ歯類、イヌ科、又はネコ科に由来するものであってよい。一実施形態において、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ７はネコ科ＴＡＳ２Ｒ７である。
哺乳類ＴＡＳ２Ｒ９のリガンドには、オフロキサシン、ピレンザピン（ｐｉｒｅｎｚａｐｉｎ）、及びプロカインアミドを挙げることができる。哺乳類ＴＡＳ２Ｒ９は、ヒト、げっ歯類、イヌ科、又はネコ科に由来するものであってよい。一実施形態において、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ９はネコ科ＴＡＳ２Ｒ９である。
哺乳類ＴＡＳ２Ｒ１０のリガンドには、（−）‐αツジョン、アブシンチン、アルボレシン、アルグラビン、アルテモリン、アザチオプリン、ベンゾイン、カフェイン、樟脳、カスカリリン、クロラムフェニコール、クロロキン、クロルフェニラミン、クマリン、ククルビタシンｂ、ククルビタシンｅ、ククルビタシン類、シクロヘキシミド、シクロヘキシミド、ダプソン、安息香酸デナトリウム、デキストロメトルファン、ジフェニドール、エリスロマイシン、ファモチジン、ハロペリドール、パパベリン、パルテノリド、ピクロトキシニン、カッシン、キニーネ、ストリキニーネ、及びヨヒンビンを挙げることができる。哺乳類ＴＡＳ２Ｒ１０は、ヒト、げっ歯類、イヌ科、又はネコ科に由来するものであってよい。一実施形態において、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ１０はネコ科ＴＡＳ２Ｒ１０である。
哺乳類ＴＡＳ２Ｒ３８のリガンドには、６‐メチル‐２‐チオウラシル、アセチルチオ尿素、イソチオシアン酸アリル、カプロラクタム、クロルフェニラミン、ジメチルチオホルムアミド、ジフェニドール、（ジフェニルチオ尿素、スルホカルバニリド、ｓｙｍ‐ジフェニルチオ尿素、チオカルバニリド）、エチレンチオ尿素、ｎ，ｎ‐エチレンチオ尿素、エチルピラジン、リモニン、メチマゾール、ｎ‐エチルチオ尿素、ｎ‐メチルチオ尿素、フェネチルイソチオシアナート、フェニルチオカルバミド（ｐｔｃ）、プロベネシド、プロピルチオウラシル、シニグリン、サイクラミン酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、及びヨヒンビンを挙げることができる。哺乳類ＴＡＳ２Ｒ３８は、ヒト、げっ歯類、イヌ科、又はネコ科に由来するものであってよい。一実施形態において、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ３８はネコ科ＴＡＳ２Ｒ３８である。
哺乳類ＴＡＳ２Ｒ４３のリガンドには、アセスルファムＫ、アロイン、アマロゲンチン、アルボレシン、アルグラビン、アリストロキン酸、カフェイン、クロラムフェニコール、クロモリン、安息香酸デナトリウム、ジフェニドール、ファルカリンジオール、グロシェイミン（グロスヘイミン）、ヘリシン、プロベネシド、キニーネ、及びサッカリンを挙げることができる。哺乳類ＴＡＳ２Ｒ４３は、ヒト、げっ歯類、イヌ科、又はネコ科に由来するものであってよい。一実施形態において、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ４３はネコ科のＴＡＳ２Ｒ４３である。
哺乳類ＴＡＳ２Ｒ４４のリガンドには、アセスルファムＫ、アロイン、アリストロキン酸、ジフェニドール、ファモチジン、パルテノリド、キニーネ、及びサッカリンを挙げることができる。哺乳類ＴＡＳ２Ｒ４４は、ヒト、げっ歯類、イヌ科、又はネコ科に由来するものであってよい。一実施形態において、哺乳類ＴＡＳ２Ｒ４４はネコ科ＴＡＳ２Ｒ４４である。
ＴＡＳ２Ｒ受容体の「リガンド結合フラグメント」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＴＡＳ２Ｒ受容体のリガンドに特異的に結合する能力を保持しているＴＡＳ２Ｒ受容体の１つ以上のフラグメントを指す。
「モジュレーター」は、アゴニスト結合部位とは異なる結合部位に結合することにより、受容体の機能的応答を変調する分子である。正のモジュレーター又は「増強剤」は受容体の機能的応答を増強する一方、負のモジュレーター又は「阻害剤」は受容体の機能的応答を阻害する。「アロステリックモジュレーター」は受容体の立体配座変化を引き起こし、特にアゴニスト結合部位におけるリガンドに対する受容体の親和性を変化させる。正のアロステリックモジュレーターは、アゴニスト結合部位におけるリガンドに対する親和性を増大させ、かつ／又は受容体の機能的活性を増強する一方、負のアロステリックモジュレーターは、アゴニスト結合部位におけるリガンドに対する親和性を低下させ、かつ／又は受容体の機能的活性を阻害する。モジュレーターには、非ペプチド分子、例えば非ペプチドミメティック、非ペプチドのアロステリックエフェクター、及びペプチドを挙げることができる。
本明細書中のＴＡＳ２Ｒ受容体の活性を「変調すること」又は「変更すること」とは、ＴＡＳ２Ｒ受容体又はそのリガンド結合フラグメントへのアゴニスト、アンタゴニスト又はモジュレーターの結合に応答して生じるＴＡＳ２Ｒ受容体活性の任意の変化を指すことができる。すなわち、該変更は、受容体の機能的応答を刺激すること、それに拮抗すること、又はそれを変調することとなりうる。
ポリヌクレオチドに関して「天然に存在しない」とは、該ポリヌクレオチド配列が自然界では生物体のゲノムＤＮＡ中に存在しないことを意味する。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、又は「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含む。ポリヌクレオチドは一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、合成、天然型、及び非天然型の、既知のヌクレオチドアナログ又は改変された主鎖の残基若しくは結合であって、基準の核酸と同様の結合特性を有するものを含有することが可能である。そのようなアナログの例には、限定するものではないが、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、メチルホスホン酸、キラル‐メチルホスホン酸、２‐Ｏ‐メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、当分野で既知の適切な方法、例えば天然供給源からの単離、化学合成、又は酵素的合成によって得ることが可能である。ヌクレオチドはその一般に容認された１文字コードによって参照されうる。
「作動可能に連結された」という用語は、核酸配列が別の核酸配列との機能的な関係をなすように配置されていることを指す。例えば、プレ配列若しくは分泌先導配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体タンパク質として発現される場合、該ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されている。プロモーター若しくはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、該コード配列に作動可能に連結されている。あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が一続きであること、及び、分泌先導配列の場合には、一続きでありかつリーディングフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味している。しかしながら、エンハンサーは一続きである必要はない。連結は好都合な制限酵素切断部位における連結反応によって遂行される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプター又はリンカーが通常の実務に従って使用される。核酸は、別の核酸配列との機能的な関係をなすように配置されているとき、「作動可能に連結されて」いる。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、該コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列に関しては、作動可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が一続きであること、及び、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、一続きでありかつリーディングフレーム内にあることを意味している。
動物可食組成物（例えば食物）のための「食味増強剤」又は「食味付与剤（ｐａｌａｔａｎｔ）」とは、対象動物に訴える芳香、味、後味、食感、口当たり、及び器官感覚受容性の感覚のうち少なくともいずれかを提供する添加剤である。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、少なくとも２個のアミノ酸を定義された順に連結することで形成された分子を指すために、本明細書中で互換的に使用される。１つのアミノ酸残基とその次との間の連結はアミド結合であり、ペプチド結合と呼ばれることもある。ポリペプチドは、当分野で既知の適切な方法、例えば天然供給源からの単離、組換え発現系における発現、化学合成、又は酵素的合成によって得ることが可能である。該用語はさらに、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸の人工の化学的ミメティックであるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
ポリペプチドの巨大分子構造は様々な構築レベルに関して説明されることが可能である。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は、ポリペプチド内の局所的に秩序立った三次元構造を指す。これらの構造は一般にドメインとして知られている。ドメインは、ポリペプチドの一部分であって、該ポリペプチドの小型ユニットを形成し、かつ典型的には長さ５０〜３５０アミノ酸の部分である。典型的なドメインは、β‐シート及びα‐ヘリックスのストレッチのような、より低次の構築の区間で作られている。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立の三次ユニットの非共有結合による会合によって形成された三次元構造を指す。
用語「プライマー」は、長さ約１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは約１５〜５０、より好ましくは長さ１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは長さ約１８〜２８ヌクレオチドの単離された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、対象とする一本鎖核酸配列との二本鎖を形成し、かつ、適切な条件下での（すなわちヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼのような誘発剤が存在する状態並びに適切な温度及びｐＨにおける）ポリメラーゼを使用した相補鎖の重合を可能にするための核酸合成の開始地点としての役割を果たすことが可能な一本鎖オリゴヌクレオチドである。プライマーは、誘発剤が存在する状態で伸長生成物の合成を刺激（プライミング）するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源及び方法の使用を含む数多くの要因に依存することになろう。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。増幅された配列のその後のクローニングを容易にするために、プライマーはその５’末端に添付された制限酵素切断部位の配列を有することがある。そのような酵素及び部位は当分野においてよく知られている。プライマーそれ自体は当分野でよく知られた技術を使用して合成可能である。一般に、プライマーは市販のオリゴヌクレオチド合成機を使用して作製可能である。「プライマー対」は、ＰＣＲによって特定のＤＮＡ標的配列を増幅するために選ばれた一対のプライマー配列である。対の一方のプライマーはＤＮＡ標的（例えばｃＤＮＡ）の「センス」鎖の３’末端に相補的であり、他方はＤＮＡ標的の「アンチセンス」鎖の３’末端に相補的である。
本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は対象とする別の核酸とハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プローブは一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。本明細書中のプローブは、長さ約１０〜１００ヌクレオチド、好ましくは約１５〜８０、より好ましくは長さ２０〜５０ヌクレオチドの、オリゴヌクレオチドである。プローブは、例えばサザンハイブリダイゼーション又はその他の当分野で既知の方法による特定の核酸配列の検出、同定及び単離において有用である。本発明で使用される任意のプローブは、任意の「リポーター分子」を用いて標識されて、任意の検出系、例えば、限定するものではないが酵素系（例えばＥＬＩＳＡ、及び酵素に基づいた組織化学的アッセイ）、蛍光系、放射性の系、及び発光系において検出可能であるようになることも企図される。本発明がいかなる特定の検出系又は標識に限定されることも、意図されていない。
用語「組換え」は、核酸分子について説明するために使用可能であり、ゲノム、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、又は合成を起源とするポリヌクレオチドであって、その起源又は操作が原因で、該ポリヌクレオチドが自然界において関連しているポリヌクレオチドの全部又は一部と関連していない、ポリヌクレオチドを指す。タンパク質又はポリペプチドに関して使用されるような用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって生じたポリペプチドを指すことができる。一般に、対象とする遺伝子は、当分野で既知の方法により、クローニングされ、次いで形質転換された生物体中で発現させる。宿主生物は、発現条件下において外来遺伝子を発現してタンパク質を産生する。
用語「固体担体」は、剛性又は半剛性の１つ以上の表面を有する材料又は材料群を指す。材料の例には、プラスチック（例えばポリカーボネート）、複合糖質（例えばアガロース及びセファロース）、アクリル樹脂（例えばポリアクリルアミド及びラテックスのビーズ）、ニトロセルロース、ガラス、シリコンウェーハ、並びに正に荷電したナイロンが挙げられる。いくつかの態様では、固体担体の少なくとも１つの表面はほぼ平面であってよいが、いくつかの態様では、例えばウェル、隆起領域、ピン、食刻溝などを用いて、異なる分子について領域を物理的に分離することが望ましい場合がある。ある態様では、固体担体は、ビーズ、樹脂、ゲル、ミクロスフェア、又はその他の幾何学的形状をとることになろう。
抗体に「特異的に（若しくは選択的に）結合する」、又は「〜と特異的に（若しくは選択的に）免疫反応性である」という言葉は、タンパク質又はペプチドに関する場合、タンパク質及び他の生体物質の異種混合集団中におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。よって、規定のイムノアッセイ条件下において、指定された抗体は、特定のタンパク質に対して少なくともバックグラウンドの２倍結合し、かつ試料中に存在する他のタンパク質に対しては、意味のある量ではほとんど結合しない。そのような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性について選択された抗体を必要とする可能性がある。例えば、ｆＴＡＳ２Ｒに対して生成されたポリクローナル抗体は、ｆＴＡＳ２Ｒタンパク質又はその免疫原性の部分と特異的に免疫反応性であり、かつＴＡＳ２Ｒタンパク質のオーソログ又は多型バリアント及びアレルを除く他のタンパク質とは免疫反応性でないポリクローナル抗体だけを得るために選択されることが可能である。この選択は、ＴＡＳ２Ｒ分子と交差反応する抗体を他の分子種又は他のＴＡＳ２Ｒ分子から取り出すことにより達成されうる。ｆＴＡＳ２Ｒ ＧＰＣＲファミリーメンバーのみを認識して他のＧＰＣＲは認識しない抗体も選択可能である。特定のタンパク質との特異的免疫反応性を有する抗体を選択するために様々なイムノアッセイ形式が使用されうる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質との特異的免疫反応性を有する抗体を選択するために日常的に使用されている（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用可能なイムノアッセイの形式及び条件に関する記載については、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ）、「抗体、実験の手引き（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、１９８８年を参照されたい）。典型的には、特異的又は選択的な反応とは、バックグラウンドシグナル又はノイズの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０倍超〜１００倍となろう。
受容体に関し、用語「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」、及び「選択的に結合する」は、ＴＡＳ２Ｒ受容体のような受容体が特定のリガンドに対して相当の親和性を示すことを意味する。「相当の」結合親和性には、少なくとも１０４Ｍ−１、少なくとも１０５Ｍ−１、具体的には少なくとも１０６Ｍ−１、より具体的には少なくとも１０７Ｍ−１、さらに具体的には少なくとも１０８Ｍ−１、又はさらにより具体的には少なくとも１０９Ｍ−１の親和性を伴う結合が含まれる。結合親和性は、親和性の範囲、例えば１０４Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、具体的には１０５Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、より具体的には１０６Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１として示すことも可能である。特異的結合は、そのような結合を決定するための任意の当分野で認識された手段によって決定可能である。いくつかの実施形態では、特異的結合はスキャチャード解析及び／又は競合結合アッセイによって決定される。
本明細書中で使用される場合、ＴＡＳ２Ｒ受容体又はそのリガンド結合フラグメントの「刺激」又は「活性化」とは、ＴＡＳ２Ｒ受容体又はフラグメントが、機能的応答を生じる状態、例えばＴＡＳ２Ｒ受容体が細胞内シグナル伝達経路と相互作用して機能的応答を生じる、例えばＴＡＳ２Ｒ受容体がＧタンパク質と相互作用して細胞内Ｃａ２＋を増大させるシグナル伝達を促進する状態に置かれることを意味する。
「ほぼ同じ」生物活性とは、ポリペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログ、アナログ、又はバリアントであって、元のポリペプチドの生物活性の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、及び最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上を保持しているものを指す。ポリペプチドのフラグメント、誘導体、ホモログ、アナログ、又はバリアントが元のポリペプチドの生物活性を保持している程度は、当分野で利用可能な任意の手段、例えば、限定するものではないが本明細書中に列挙又は記載されたアッセイによって評価されうる。
「ＴＡＳ２Ｒ結合パートナー」とは、本明細書中に開示されたＴＡＳ２Ｒポリペプチドに直接又は間接に結合する化合物である。
リガンドの結合又は受容体活性を測定するための本明細書中に記載されたアッセイにおいて使用される「ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチド」（又はＴＡＳ２Ｒ受容体若しくはＴＡＳ２Ｒ）は、ＴＡＳ２Ｒ受容体；ＴＡＳ２Ｒ受容体のドメイン、例えば細胞外ドメイン、膜貫通領域、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合フラグメント、サブユニット会合ドメイン、活性部位など；又は、ＴＡＳ２Ｒ受容体若しくはそのドメインのいずれかが異種タンパク質に共有結合で連結されているキメラタンパク質を含むことができる。
本明細書において「味物質（ｔａｓｔａｎｔ）」は、特異的ＴＡＳ２Ｒ受容体又は一連のＴＡＳ２Ｒ受容体に結合することができるリガンドを意味する。
本明細書中で使用されるような用語「味知覚（ｔａｓｔｅ ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ）」は、味覚刺激に対するＴＡＳ２Ｒ受容体の応答（例えば、生化学的応答、行動反応）又は感受性を指す。味知覚の改変には、味物質に応答した哺乳類の生化学的応答、食物摂取行動、味の優先傾向、代謝応答、又は一般行動の変更（増強、低減、若しくは変化）が挙げられる。「味知覚」は、哺乳類によるｉｎ ｖｉｖｏの味の感覚をもたらす神経シグナルの伝送を必要とはしないが、含むことはできる。
７個の膜貫通領域を含む「膜貫通ドメイン」は、ＴＡＳ２Ｒポリペプチドのドメインであって原形質膜内に位置するものを指し、かつ膜貫通ドメインの「領域」とも呼ばれる相応の細胞質（細胞内）ループ及び細胞外ループをさらに含みうる。膜貫通領域はさらに、細胞外ドメインとの組み合わせ又は単独でリガンドに結合することも可能であり、従ってｉｎ ｖｉｔｒｏのリガンド結合アッセイにも有用である。
本明細書中で使用される用語「膜貫通領域」は、膜内において熱力学的に安定な三次元タンパク質構造、例えば単一の膜貫通型αヘリックス又は膜貫通型βバレル）を意味する。
用語「ベクター」は、宿主細胞において標的遺伝子を発現するための核酸配列を意味する。例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、及びウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターの例には、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。例えば、ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーのような発現調節エレメントに加えて、細胞膜を標的とするか若しくは分泌シグナルを伝達する配列又は先導配列を備えている発現ベクターであってよい。ベクターは目的に応じて当分野で既知の様々な方法で製造されうる。発現ベクターは、該ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを備えてもよい。さらに、複製可能な発現ベクターは複製開始点を備えうる。用語「組換えベクター」又は「発現ベクター」は、異種ヌクレオチド配列の発現、生産、及び単離の目的で該異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたベクターを意味する。異種ヌクレオチド配列は、本明細書中に開示されたｆＴＡＳ２Ｒ受容体又キメラポリペプチドの全部又は一部をコードしているヌクレオチド配列であってよい。
ヒトＴＡＳ２Ｒ（ｈＴＡＳ２Ｒ）遺伝子及び偽遺伝子のヌクレオチド配列が基準として使用されて、バイオインフォマティクス手法により、かつては未知であったネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）遺伝子が同定された。続いて、単離されたネコ科ゲノムＤＮＡがｆＴＡＳ２Ｒ遺伝子をクローニングするために使用された。次いで、いくつかのネコ科動物のクローニングされたｆＴＡＳ２Ｒ遺伝子のヌクレオチド配列は、シーケンシング、例えばサンガーの塩基配列決定法により決定されて、該遺伝子のコンセンサスヌクレオチド配列を確立し、配列中のあらゆるバリアント部位を同定するために使用された。
ｆＴＡＳ２Ｒ受容体をコードするポリヌクレオチドが開示される。一実施形態において、該ポリヌクレオチドは単離されている。該ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５のヌクレオチド配列；配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有するｆＴＡＳ２Ｒをコードするヌクレオチド配列；ｆＴＡＳ２Ｒをコードし、かつ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列；配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５を有するポリヌクレオチドの相補体に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；先述のヌクレオチド配列のうちいずれか１つのヌクレオチド配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含むヌクレオチド配列；及び、先述のヌクレオチド配列のうちいずれか１つの相補体、から選択されたヌクレオチド配列を含むことができる。一実施形態において、相同性（％）は少なくとも９０％である。一実施形態において、相同性（％）は少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％である。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５のヌクレオチド配列；配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５を有するポリヌクレオチドの相補体に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び先述のヌクレオチド配列の相補体から選択されたヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１７のヌクレオチド配列；配列番号１８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号１７を有するポリヌクレオチドの相補体に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び先述のヌクレオチド配列の相補体から選択されたヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ヌクレオチド配列は非ネコ科細胞における発現のためにコドン最適化がなされる。一実施形態において、非ネコ科細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）細胞、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の細胞、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）の細胞、又は哺乳類細胞である。一実施形態において、哺乳類細胞はヒト又はネズミ科細胞である。大腸菌、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）細胞、キイロショウジョウバエ細胞、線虫細胞、ヒト細胞、又はネズミ科細胞における新規なｆＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドの発現のためにコドン最適化がなされた配列の例は、配列番号５８〜１３５に開示されている。
さらに開示されるのは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、又は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、若しくは２５の相補体に対する少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有する配列を含むポリヌクレオチドである。
同じく開示されるのは、本明細書中に開示された少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む組成物である。一実施形態において、各ポリヌクレオチドは異なるｆＴＡＳ２Ｒ受容体の一部分をコードしている。一実施形態において、組成物は、本明細書中に開示されたポリヌクレオチドのうち少なくとも３、４、又は５個を含む。
一実施形態において、組成物は、本明細書中に開示されたポリヌクレオチドのうち少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個を含む。一実施形態において、組成物の各ポリヌクレオチドは異なるｆＴＡＳ２Ｒ受容体、又はそのフラグメントをコードしている。一実施形態において、組成物は、配列番号１７及び配列番号２１のうち少なくともいずれかを含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、組成物は、ネコ科ＴＡＳ２Ｒポリペプチドをコードする核酸の一部分を増幅するためのプライマー対を含む。一実施形態において、プライマー対は表５のプライマー対から選択される。本明細書中に開示されたプライマー対は、特定のＴＡＳ２Ｒポリヌクレオチド又はそのフラグメントの、ＰＣＲを使用するヌクレオチド配列の決定に有用である。一本鎖ＤＮＡプライマーの対は、ｆＴＡＳ２Ｒ遺伝子自体の増幅的ＤＮＡ合成をプライミングするために、ｆＴＡＳ２Ｒ遺伝子内又は該遺伝子の周囲の配列にアニーリングされることが可能である。アレル特異的プライマーも使用可能である。そのようなプライマーは特定のｆＴＡＳ２Ｒ突然変異アレルにのみアニーリングし、よって鋳型として突然変異アレルが存在する状態においてのみ生成物を増幅することになる。
ｆＴＡＳ２Ｒ３８をコードする核酸配列中の一塩基多型は、多数の対象個体に由来する増幅されたネコ科ゲノムＤＮＡのシーケンシングからｃＤＮＡ配列（配列番号１７）のヌクレオチド２２０において同定された。ヌクレオチド２２０で観察された２つのアレルはＧ及びＡであった。Ｇ２２０Ａ核酸変異は、ｆＴＡＳ２Ｒ３８タンパク質配列（配列番号１８）のアミノ酸変異Ｄ７４Ｎに相当する。一実施形態において、開示されたポリヌクレオチドは、ヌクレオチド２２０を含有する配列番号１７のうち少なくとも１５個連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド２２０にＡが存在するヌクレオチド配列；又は該ヌクレオチド配列の相補体を含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド２２０を含有する配列番号１７のうち少なくとも２０個連続したヌクレオチドであって、ヌクレオチド２２０にＡが存在するヌクレオチド；又は該ヌクレオチド配列の相補体を含む。一実施形態において、開示されたｆＴＡＳ２Ｒ３８ポリペプチドは、配列の残基７４にＮが存在する配列番号１８、又はそのフラグメントであってＮ７４残基を含むものを含む。
別の態様において、単離されたｆＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドが開示される。
一実施形態において、単離されたｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドは、本明細書中に開示されたポリヌクレオチドによってコードされている。
一実施形態において、単離されたｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、若しくは配列番号２６のアミノ酸配列；又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、若しくは配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことが可能である。一実施形態において、単離されたｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドは、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、若しくは配列番号２６のアミノ酸配列；又は、先述のアミノ酸配列のうち１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態において、単離されたｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドは、配列番号１８又は配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
ＴＡＳ２Ｒ苦味受容体のような感覚ＧＰＣＲは、Ｎ末端ドメイン；細胞外ドメイン；７個の膜貫通領域、細胞質ループ、及び細胞外ループを含む膜貫通ドメイン；細胞質ドメイン；並びにＣ末端ドメインを備えたドメイン構造を有する。これらのドメインは、疎水性ドメイン及び親水性ドメインを同定する配列分析プログラムのような当分野で既知の方法を使用して、構造的に同定可能である。そのようなドメインは、キメラタンパク質の作製に、また本明細書中に開示されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、例えばリガンド結合アッセイに、有用である。
７個の膜貫通領域並びに細胞外及び細胞質ループは当分野で既知の標準的な方法を使用して同定可能である。例えば、ｆＴＡＳ２Ｒタンパク質の膜貫通領域は、ストックホルム大学のストックホルムバイオインフォマティクスセンター（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）からインターネット上で利用可能なソフトウェアであるＴＯＰＣＯＮＳ（アンドレアス・バーンセル（Ａｎｄｒｅａｓ Ｂｅｒｎｓｅｌ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００９年、第３７巻（ウェブサーバ紹介号）、Ｗ４６５−８）を使用して同定可能である。ＴＯＰＣＯＮＳによって同定されたｆＴＡＳ２Ｒの７個の膜貫通領域並びに細胞外及び細胞質ループは次の表に示されている。
ｆＴＡＳ２Ｒタンパク質の膜貫通領域並びに細胞外及び細胞質ループの別の予測は、同じくストックホルムバイオインフォマティクスセンターからインターネット上で利用可能な別のソフトウェア、例えばＳＣＡＭＰＩ（アンドレアス・バーンセル（Ａｎｄｒｅａｓ Ｂｅｒｎｓｅｌ）ら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００８年、第１０５巻、ｐ．７１７７−７１８１）；ＰＲＯＤＩＶ（ホーカン・ヴィクルンド（Ｈａｋａｎ Ｖｉｋｌｕｎｄ）及びアーン・エロフソン（Ａｒｎｅ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ）、プロテイン・サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００４年、第１３巻、ｐ．１９０８−１９１７）、並びにＯＣＴＡＰＵＳ（ホーカン・ヴィクルンド（Ｈａｋａｎ Ｖｉｋｌｕｎｄ）及びアーン・エロフソン（Ａｒｎｅ Ｅｌｏｆｓｓｏｎ）、バイオインフォマティクス（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、２００８年、第２４巻、ｐ．１６６２−１６６８）を使用して生成可能である。構造上の領域を予測するための当分野で既知のさらなる方法には、ゴールドマン‐エングルマン‐スタイツ（Ｇｏｌｄｍａｎ−Ｅｎｇｌｅｍａｎ−Ｓｔｅｉｔｚ）、又はカイト‐ドゥーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）、１９８２年、第１５７巻、ｐ．１０５−１３２）、又はホップ‐ウッズ（Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ）の疎水性予測方法が挙げられる。二次構造予測方法には、ガルニエ‐ロブソン（Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ）、又はデレアージュ・アンド・ルウ（Ｄｅｌｅａｇｅ ａｎｄ Ｒｏｕｘ）若しくはシュウ‐ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）が挙げられる。当分野で知られているように、利用可能な様々なアルゴリズムが、アミノ酸配列に基づいて膜貫通領域に関するわずかに異なる境界線を予測しうる。
一実施形態において、単離されたＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドは、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の少なくとも１つの細胞外ドメイン；ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の少なくとも１つの膜貫通ドメイン；又はネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の少なくとも１つの細胞内のドメインを含むことが可能であり、該ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、若しくは配列番号２６のアミノ酸配列；又は配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、若しくは配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の相同性、具体的には少なくとも９７％の相同性、より具体的には少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、単離されたｆＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドは、配列番号２、４、６、又は１０のアミノ酸配列からなるものではない。
一実施形態において、ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸１、６８〜８４；１４６〜１７９；若しくは２４９〜２５７；配列番号４のアミノ酸１〜１０、７３〜８８；１５１〜１８６；若しくは２５６〜２６４；配列番号６のアミノ酸１〜８；７２〜８８；１５０〜１８６；若しくは２５６〜２６５；配列番号８のアミノ酸１〜２；６９〜８７；１５１〜１８３；若しくは２５３〜２６１；配列番号１０のアミノ酸１〜８；７２〜８８；１５０〜１８７；若しくは２５７〜２６５；配列番号１２のアミノ酸１〜６；７２〜８８；１５０〜１８３；若しくは２５３〜２６２；配列番号１４のアミノ酸１；６９〜８７；１５０〜１８１；若しくは２５１〜２６０；配列番号１６のアミノ酸１〜８；６９〜８８；１５０〜１８５；若しくは２５２〜２６１；配列番号１８のアミノ酸１〜１７：８３〜９８；１６１〜１９８；若しくは２６８〜２７７；配列番号２０のアミノ酸１；６９〜８８；１５０〜１８５；若しくは２５５〜２６４；配列番号２２のアミノ酸１〜２；６９〜８７；１４９〜１８１；若しくは２５１〜２６０；配列番号２４のアミノ酸１〜２；６９〜８７；１４９〜１８１；若しくは２５１〜２５９；又は配列番号２６のアミノ酸１〜８；７２〜８８；１５０〜１８５；若しくは２５４〜２６３を含むことが可能である。
一実施形態において、ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドの膜貫通ドメインは、配列番号２のアミノ酸２〜２２、４７〜６７、８５〜１０５、１２５〜１４５、１８０〜２００、２２８〜２４８、若しくは２５８〜２７８；配列番号４のアミノ酸１１〜３１、５２〜７２、８９〜１０９、１３０〜１５０、１８７〜２０７、２３５〜２５５、若しくは２６５〜２８５；配列番号６のアミノ酸９〜２９、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８７〜２０７、２３５〜２５５、若しくは２６６〜２８６；配列番号８のアミノ酸３〜２３、４８〜６８、８８〜１０８、１３０〜１５０、１８４〜２０４、２３２〜２５２、若しくは２６２〜２８２；配列番号１０のアミノ酸９〜２９、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８８〜２０８、２３６〜２５６、若しくは２６６〜２８６；配列番号１２のアミノ酸７〜２７、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８４〜２０４、２３２〜２５２、若しくは２６３〜２８３；配列番号１４のアミノ酸２〜２２、２． ４８〜６８、８８〜１０８、１２９〜１４９、１８２〜２０２、２３０〜２５０、若しくは２６１〜２８１；配列番号１６のアミノ酸９〜２９、４８〜６８、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８６〜２０６、２３１〜２５１、若しくは２６２〜２８２；配列番号１８のアミノ酸１８〜３８、６２〜８２、９９〜１１９、１４０〜１６０、１９９〜２１９、２４７〜２６７、若しくは２７８〜２９８；配列番号２０のアミノ酸２〜２２、４８〜６８、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８６〜２０６、２３４〜２５４、若しくは２６５〜２８５；配列番号２２のアミノ酸３〜２３、４８〜６８、８８〜１０８、１２８〜１４８、１８２〜２０２、２３０〜２５０、若しくは２６１〜２８１；配列番号２４のアミノ酸３〜２３、４８〜６８、８８〜１０８、１２８〜１４８、１８２〜２０２、２３０〜２５０、若しくは２６０〜２８０；又は配列番号２６のアミノ酸９〜２９、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８６〜２０６、２３３〜２５３、若しくは２６４〜２８４を含むことが可能である。
一実施形態において、ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドの細胞内ドメインは、配列番号２のアミノ酸２３〜４６；１０６〜１２４；２０１〜２２７；若しくは２７９〜２９８；配列番号４のアミノ酸３２〜５１；１１０〜１２９；２０８〜２３４；若しくは２８６〜３０４；配列番号６のアミノ酸３０〜５０；１１０〜１２８；２０８〜２３４；若しくは２８７〜３１６；配列番号８のアミノ酸２４〜４７；１０９〜１２９；２０５〜２３１；若しくは２８３〜３０６；配列番号１０のアミノ酸３０〜５０；１１０〜１２８；２０９〜２３５；若しくは２８７〜３１１；配列番号１２のアミノ酸２８〜５０；１１０〜１２８；２０５〜２３１；若しくは２８４〜３３７；配列番号１４のアミノ酸２３〜４８；１０９〜１２８；２０３〜２２９；若しくは２８２〜３００；配列番号１６のアミノ酸３０〜４７；１１０〜１２８；２０７〜２３０；若しくは２８３〜３０９；配列番号１８のアミノ酸３９〜６１；１２０〜１３９；２２０〜２４６；若しくは２９９〜３３４；配列番号２０のアミノ酸２３〜４７；１１０〜１２８；２０７〜２３３；若しくは２８６〜３２２；配列番号２２のアミノ酸２４〜４７；１０９〜１２７；２０３〜２２９；若しくは２８２〜２９９；配列番号２４のアミノ酸２４〜４７；１０９〜１２７；２０３〜２２９；若しくは２８１〜３０８；又は配列番号２６のアミノ酸３０〜５０；１１０〜１２８；２０７〜２３２；若しくは２８５〜３１２を含むことが可能である。
一実施形態において、ｆＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドは、膜貫通領域２、膜貫通領域３、膜貫通領域４、膜貫通領域５、膜貫通領域６、及び膜貫通領域７であって、各膜貫通領域は配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６から独立に選択された対応する膜貫通領域配列のうち少なくとも連続２０アミノ酸を含む、膜貫通領域；又は、膜貫通領域３、膜貫通領域６、及び膜貫通領域７であって、各膜貫通領域は配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６から独立に選択された対応する膜貫通領域配列のうち少なくとも連続２０アミノ酸を含む、膜貫通領域；細胞外ドメイン３であって、配列番号２のアミノ酸１４６〜１７９；配列番号４のアミノ酸１５１〜１８６；配列番号６のアミノ酸１５０〜１８６；配列番号８のアミノ酸１５１〜１８３；配列番号１０のアミノ酸１５０〜１８７；配列番号１２のアミノ酸１５０〜１８３；配列番号１４のアミノ酸１５０〜１８１；配列番号１６のアミノ酸１５０〜１８５；配列番号１８のアミノ酸１６１〜１９８；配列番号２０のアミノ酸１５０〜１８５；配列番号２２のアミノ酸１４９〜１８１；配列番号２４のアミノ酸１４９〜１８１；及び配列番号２６のアミノ酸１５０〜１８５；から選択された少なくとも連続１５アミノ酸を含む、細胞外ドメイン３；並びに細胞外ドメイン４であって、配列番号２のアミノ酸２４９〜２５７；配列番号４のアミノ酸２５６〜２６４；配列番号６のアミノ酸２５６〜２６５；配列番号８のアミノ酸２５３〜２６１；配列番号１０のアミノ酸２５７〜２６５；配列番号１２のアミノ酸２５３〜２６２；配列番号１４のアミノ酸２５１〜２６０；配列番号１６のアミノ酸２５２〜２６１；配列番号１８のアミノ酸２６８〜２７７；配列番号２０のアミノ酸２５５〜２６４；配列番号２２のアミノ酸２５１〜２６０；配列番号２４のアミノ酸２５１〜２５９；及び配列番号２６のアミノ酸２５４〜２６３、から選択された少なくとも連続８アミノ酸を含む、細胞外ドメイン４を含む。
さらに開示されるのは、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の少なくとも１つの細胞外ドメイン；ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の少なくとも１つの膜貫通ドメイン；又はネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の少なくとも１つの細胞内ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
別の態様では、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドの細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、又は膜貫通領域を含み、かつさらに異種ポリペプチドを含むキメラポリペプチドが開示される。ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドの細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、又は膜貫通領域は、本明細書中に開示されたもののうち任意のものであってよい。
異種ポリペプチドは、当分野で既知の任意の適切なポリペプチド、又は本願において有用であるようなポリペプチドの一部分であってよい。異種ポリペプチドは、例えば、発現系における該キメラポリペプチドの正確なフォールディングを可能にすること、及び／又はキメラポリペプチドの単離を容易にすることのための、細胞内局在化及び発現を決定する配列であってもよい。異種ポリペプチドは、キメラポリペプチドの任意の部分、例えばｆＴＡＳ２Ｒ配列のアミノ末端又はカルボキシ末端に連結されることが可能である。例えば、異種ポリペプチドは、ラットのソマトスタチンの最初の４５アミノ酸、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、６×ヒスチジン（ｈｉｓ）タグ、ＭＹＣ、蛍光タンパク質タグ、Ｖ５、及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のうち少なくともいずれかであってよい。異種ポリペプチドがラットのソマトスタチンの最初の４５アミノ酸である場合、該異種ポリペプチドは細胞膜を標的とすることを可能にするために典型的にはキメラポリペプチドのアミノ末端に配置される。異種ポリペプチドがキメラポリペプチドのより容易な単離を可能にするためのタグ、例えば６×ヒスチジンタグである場合、該異種ポリペプチドはキメラポリペプチドのアミノ末端に配置可能である。キメラポリペプチドにおける異種ポリペプチドの特定の機能的態様を得るための、キメラポリペプチド中でのｆＴＡＳ２Ｒ配列のアミノ末端又はカルボキシ末端に対する異種ポリペプチドの適切な位置の決定は、当業者によって下されることが可能である。
さらに開示されるのは、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
さらに開示されるのは、本明細書中に開示された少なくとも２個のｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドを含む組成物である。一実施形態において、組成物は本明細書中に開示された少なくとも３、４、又は５個のポリペプチドを含む。一実施形態において、組成物は本明細書中に開示された少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３個のポリペプチドを含む。一実施形態において、組成物中のポリペプチドはそれぞれ異なるｆＴＡＳ２Ｒ受容体である。一実施形態において、組成物は、配列番号１８を含むポリペプチドと配列番号２２を含むポリペプチドとを含む。
別途指定のない限り、特定のポリペプチド配列は該配列の保存的に改変されたバリアントをも暗黙的に包含する。ポリペプチド配列における保存的アミノ酸置換には、ある分類のアミノ酸の、同じ分類のアミノ酸による置換が含まれ、ここで分類とは、共通の物理化学的なアミノ酸側鎖の性質及び自然界で見出される相同なタンパク質における高い置換頻度、例えば標準的なデイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）の交換頻度マトリックス又はＢＬＯＳＵＭマトリックスによって決定されるようなものによって定義される。アミノ酸側鎖の６個の一般的分類が類別されており、以下すなわち：分類Ｉ（Ｃｙｓ）；分類ＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；分類ＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；分類ＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；分類Ｖ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；及び分類ＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が挙げられる。例えば、Ａｓｐを、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＧｌｕのような分類ＩＩＩの別の残基の代用とすることは、保存的置換である。当業者であれば、ホップ／ウッズ及びカイト‐ドゥーリトルプロットの参照により、変化を許容することが可能な対象とする分子の領域を容易に決定することができる。
別途指定のない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列と同様にその保存的に改変されたバリアント（例えば縮重コドン置換）及び相補的配列をも暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシンの残基で置換されている配列を生成することにより達成されうる（バッツァー（Ｂａｔｚｅｒ）ら、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、１９９１年、第１９巻、ｐ．５０８１；オオツカ（Ｏｈｔｓｕｋａ）、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９８５年、第２６０巻、ｐ．２６０５−２６０８；ロッソリーニ（Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・プローブス（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ）、１９９４年、第８巻、ｐ．９１−９８）。
同一性（％）（相同性）は、２つの分子の間の配列情報について、配列をアラインメントし、２つのアラインメントされた配列の間の一致の正確な数を計数し、短いほうの配列の長さで除算し、その結果に１００を乗算することにより、直接比較することで決定可能である。容易に利用可能なコンピュータ・プログラム、例えばＡＬＩＧＮ（デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）、Ｍ．Ｏ．、デイホフ、Ｍ．Ｏ．編「タンパク質の配列及び構造アトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、増補５版、米国ワシントンＤＣのナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファンデーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、第３巻、ｐ．３５３−３５８）が分析を支援するために使用されてもよく、ＡＬＩＧＮは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）及びウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、アドバンシズ・イン・アプライド・マスマティックス（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ）、１９８１年、第２巻、ｐ．４８２−４８９の局所的相同性アルゴリズムを、ペプチド分析用に適応させている。ヌクレオチド配列の同一性を決定するためのプログラムは、ウィスコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）、バージョン８（米国ウィスコンシン州マディソンのジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）から入手可能）において利用可能であって、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＧＡＰプログラムであり、同じくスミス及びウォーターマンのアルゴリズムに依る。これらのプログラムは、製造業者が推奨し、かつ上記に引用されたウィスコンシン配列分析パッケージに記載の初期設定パラメータを用いて容易に利用される。例えば、ある特定のヌクレオチド配列の基準配列に対する同一性（％）は、初期設定のスコアリングテーブル及びヌクレオチド位置６個のギャップペナルティを用いて、スミス及びウォーターマンの相同性アルゴリズムを使用して決定することが可能である。
別例として、ヌクレオチドの相同性は、相同な領域の間で安定な二本鎖を形成する条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、その後の一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いた消化、及び消化されたフラグメントのサイズ判定によって決定可能である。ほぼ相同なＤＮＡ配列は、例えばその特定の系について定義されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定可能である。適当なハイブリダイゼーション条件の定義は当分野の技術の範囲内にある。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験の手引き（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、米国ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、又は、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、米国ニューヨーク州のジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、１９９１年、６．３．１−６．３．６を参照されたい。一実施形態において、高ストリンジェンシー条件は、４５℃の６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）と、その後の６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄、又はその等価条件である。中程度のハイブリダイゼーション条件は、３０℃の２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションと、その後の５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄に等価なものとして定義される。高ストリンジェントな条件は当分野において周知であり、かつ本明細書中の目的には、４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションと、その後の６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄に等価な条件が挙げられる。
本明細書中に開示されるのは、本明細書中に開示されたネコ科ＴＡＳ２Ｒポリペプチド又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。一実施形態において、組換えベクターは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、若しくは２５からなるポリヌクレオチド；配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、若しくは２５の相補体からなるポリヌクレオチド；又は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、若しくは配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、若しくは２５の相補体と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有する配列からなるポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、組換えベクターは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５のヌクレオチド配列；配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５を有するポリヌクレオチドの相補体に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び先述のヌクレオチド配列の相補体、から選択されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、ベクターは、配列番号１７又は配列番号２１のポリヌクレオチド配列を含む。さらに開示されるのは、本明細書中に開示されたキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
組換えベクターは原核生物又は真核生物の宿主細胞において使用するために構築されうる。例えば、原核細胞が宿主細胞として使用される場合、使用される発現ベクターは一般に、転写を開始することができる強力なプロモーター（例えばｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター）、翻訳を開始するためのリボソーム結合部位、及び転写／翻訳終結配列を備えている。真核細胞が宿主細胞として使用される場合、使用されるベクターは一般に、真核細胞において作用する複製開始点、例えば、ｆ１複製開始点、ＳＶ４０複製開始点、ｐＭＢ１複製開始点、アデノ複製開始点、ＡＡＶ複製開始点、又はＢＢＶ複製開始点を備えているが、これらに限定はされない。真核生物の宿主細胞用の発現ベクター中のプロモーターは、哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター若しくはＥＦ‐１αプロモーター）又は哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、シンドビスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、及びＨＳＶのｔｋプロモーター）であってよい。真核生物の宿主細胞用の発現ベクター中の転写終結配列は、一般に、ポリアデニル化配列であってよい。
さらに開示されるのは、本明細書中に開示された発現ベクター又はポリヌクレオチドを含む宿主細胞である。適切な宿主細胞は、本明細書中に開示された、組換えベクターのうち少なくとも１つ又は少なくとも１つのポリヌクレオチド、例えば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、若しくは２５からなるポリヌクレオチドを用いて、形質転換することが可能である。
ベクターの宿主細胞は、発現ベクターによって実際に利用されることが可能な任意の細胞であってよい。例えば、宿主細胞は、哺乳類細胞のような高等な真核細胞であってもよいし、酵母細胞のような下等な真核細胞であってもよい。さらに、宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞であってもよい。原核生物の宿主細胞は、バチルス属細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｅｎｕｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９、大腸菌ＢＬ２１、大腸菌ＲＲ１、大腸菌ＬＥ３９２、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６、大腸菌Ｗ３１１０、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）など；又は腸内細菌、例えばネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及び様々なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種などであってよい。真核生物の宿主細胞は、酵母（例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、昆虫細胞、植物細胞、又は動物細胞、例えばマウスＳｐ２／０、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ‐７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ‐２９３、若しくはＭＤＣＫ細胞株であってよい。いくつかの実施形態では、魚類の細胞は本願において有用である。
ポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターは、当分野で既知の方法を使用して宿主細胞内へ導入されうる。例えば、原核細胞が宿主細胞として使用される場合、導入はＣａＣｌ２法又はエレクトロポレーション法を使用して実施されうる一方、真核細胞が宿主細胞として使用される場合、導入はマイクロインジェクション、リン酸カルシウム共沈澱法、エレクトロポレーション、リポソームを介したトランスフェクション、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ライフ・テクノロジーズ・コーポレイション（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））トランスフェクション、又は遺伝子銃法（ｇｅｎｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によって実施されうるが、これらに限定はされない。
発現ベクターが細胞内へ導入された後、遺伝子導入細胞はｆＴＡＳ２Ｒの発現を促進する条件下で培養されることが可能である。ｆＴＡＳ２Ｒは、当分野で既知の標準的な技法を使用して培養物から回収可能である。
本明細書中に開示された発現ベクターは、味物質を同定及び特性解析するためのアッセイに特に有用である。核酸及びベクターを個々に又はライブラリとして導入／発現するための手段は当分野において良く知られている。様々な個々の細胞、器官、又は動物全体のパラメータは様々な手段によって測定可能である。開示されたｆＴＡＳ２Ｒ配列は、例えば、動物の味覚組織において、伝達可能な作用因子、例えばアデノウイルス発現ベクターを用いた送達により、発現可能である。
試料中のＴＡＳ２Ｒファミリーのメンバーに関するＤＮＡ及びＲＮＡの存在についての核酸アッセイには、当業者に周知の多数の技法、例えばサザン分析、ノーザン分析、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクション、Ｓ１分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような増幅技法、並びにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが挙げられる。加えて、ＴＡＳ２Ｒタンパク質は当分野で既知の様々なイムノアッセイ技法を用いて検出可能である。被験試料は、典型的には陽性対照（例えば組換えＴＡＳ２Ｒタンパク質を発現する試料）及び陰性対照の両方と比較される。
本明細書中に開示された核酸及びアミノ酸の配列情報はさらに、ＴＡＳ２Ｒのポリペプチド又はポリヌクレオチドが相互作用するであろう相手の結合パートナー化合物の同定を可能にする。結合パートナー化合物を同定する方法には、溶液分析、ＴＡＳ２Ｒポリペプチドが固定化されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、及び細胞系アッセイが挙げられる。
天然のリガンド及び合成化合物などの特異的結合分子は、単離された、又は組換えの、ＴＡＳ２Ｒ生成物、ＴＡＳ２Ｒバリアント又はそのような生成物を発現する細胞を使用して、同定又は開発可能である。結合パートナーは、ＴＡＳ２Ｒ生成物の精製並びに既知の免疫学的方法を使用した流体試料及び組織試料中のＴＡＳ２Ｒ生成物の検出又は定量に有用である。結合分子はさらに、ＴＡＳ２Ｒの生物活性（特にシグナル伝達に関与する活性）を変調（すなわち阻止、阻害、若しくは刺激）するのにも有用である。結合分子はさらに、ネコ科動物の生体試料中のＴＡＳ２Ｒポリペプチドを検出することにより哺乳類のような生物体の味知覚を予測する方法においても有用である。
ｆＴＡＳ２Ｒ受容体に結合し、かつ／又は同受容体を変調する化合物を同定する方法が開示される。
一実施形態において、該方法は、ＴＡＳ２Ｒ受容体を、ＴＡＳ２Ｒ受容体に結合する疑いのある試験化合物と接触させること；及び、該化合物とＴＡＳ２Ｒ受容体との間の結合を検出することを含む。結合は、当業者に知られた任意の結合アッセイ、例えばゲルシフトアッセイ、ウエスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、ファージを用いる発現クローニング、クロマトグラフィーによる共分画（ｃｏ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、共沈、架橋結合、相互作用トラップ／ツーハイブリッド分析、サウスウエスタン分析、及びＥＬＩＳＡなどによって判定可能である。方法はさらに、標識、例えば放射性標識（例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ）、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、及び免疫原性標識などに取り付けられたリガンドを使用する場合もある。１つの変法では、表面にＴＡＳ２Ｒ受容体を発現している細胞を含む組成物が、該方法において使用される。別の変法では、単離されたＴＡＳ２Ｒ受容体又はＴＡＳ２Ｒ受容体を含む細胞膜が使用される。結合は、例えば標識化合物の使用によって直接測定されてもよいし、間接的に測定されてもよい。ＴＡＳ２Ｒ受容体に結合するとして同定された化合物は、その活性を確認又は定量するために、ＴＡＳ２Ｒ活性アッセイ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏのモデルを含む他のアッセイにおいてさらに試験されてもよい。
ＴＡＳ２Ｒタンパク質、ドメイン、又はキメラタンパク質へのリガンドの結合は、溶液中で、固相に付着されて、二重膜中で、脂質単層中で、又は小胞内で、試験可能である。ＴＡＳ２Ｒ受容体へのリガンドの結合は、例えば分光特性（例えば蛍光、吸収度、屈折率）における、又は流体力学的（例えば形状）特性、クロマトグラフィー特性、若しくは溶解特性における変化を使用して試験可能である。
そのような試験において使用されるＴＡＳ２Ｒのポリペプチド又はポリヌクレオチドは、溶液中に遊離していてもよいし、固体担体に付着されてもよいし、細胞表面にあってもよいし、細胞内に位置していてもよいし、又は細胞の一部分に関連付けられていてもよい。当業者であれば、例えば、ＴＡＳ２Ｒ受容体又はポリヌクレオチドと試験されている化合物との間の複合体の形成を測定することが可能である。別例として、当業者は、試験されている化合物によって引き起こされる、ＴＡＳ２Ｒ受容体又はポリヌクレオチドとその基質との間の複合体形成の減少を検査することが可能である。いくつかの実施形態において、ＴＡＳ２Ｒ受容体又はポリヌクレオチドの認識部位を、電気的又は光学的いずれかのモニタリングシステムと連動させる。適当な化学刺激は、受容体のリガンド結合ドメインに結合して、その連動させた電気的又は光学的変化が読み出し値において観察可能である程度に受容体の立体配座を変化させることが可能である。一実施形態において、固体担体は、ネコ科特異的な電子舌又はバイオセンサとして構築される。
溶液アッセイの実施形態では、方法は、ＴＡＳ２Ｒ受容体を１つ以上の試験化合物と接触させるステップと、ＴＡＳ２Ｒ受容体に結合する化合物を同定するステップとを含むことができる。ＴＡＳ２Ｒ受容体に結合する化合物の同定は、ＴＡＳ２Ｒポリペプチド／結合パートナー複合体を単離すること、及びＴＡＳ２Ｒポリペプチドから結合パートナー化合物を分離することにより達成可能である。１つの態様では、ＴＡＳ２Ｒポリペプチド／結合パートナー複合体は、ＴＡＳ２Ｒ受容体又は試験化合物のいずれかに対して免疫特異的な抗体を使用して単離される。さらに別の実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ受容体又は試験化合物のいずれかがその単離を容易にする標識又はタグを含み、かつ結合パートナー化合物を同定する方法は、標識又はタグとの相互作用によってＴＡＳ２Ｒポリペプチド／結合パートナー複合体を単離するステップを含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの１つの変法において、方法は、固定化されたＴＡＳ２Ｒ受容体を試験化合物と接触させるステップと、ＴＡＳ２Ｒ受容体への試験化合物の結合を検出するステップとを含む。代替実施形態では、試験化合物が固定化され、ＴＡＳ２Ｒ受容体の結合が検出される。固定化は、当分野で良く知られた方法のうち任意のもの、例えば担体、ビーズ、若しくはクロマトグラフ樹脂への共有結合形成、及び、非共有結合の、抗体結合のような高親和性相互作用を使用して、又は固定化された化合物がビオチン部分を備えているストレプトアビジン／ビオチン結合の使用により行われる。担体は、例えば、ネコ科特異的な電子舌又はバイオセンサとして構築されてもよい。
別の実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ受容体の結合パートナー化合物を同定するために細胞系アッセイが使用される。１つの実施形態では、該方法は、細胞の表面に発現されたＴＡＳ２Ｒ受容体を試験化合物と接触させるステップと、ＴＡＳ２Ｒ受容体への試験化合物の結合を検出するステップとを含む。いくつかの実施形態では、検出は、分子の結合によって引き起こされた細胞内の生理学的事象を検出することを含む。
別の実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ受容体に対する適切な結合親和性を有する化合物についてのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が使用される。簡潔に述べると、多数の異なる試験化合物が固体基材上で合成される。該試験化合物をＴＡＳ２Ｒ受容体と接触させ、そして洗浄する。その後、結合したＴＡＳ２Ｒ受容体は当分野で良く知られた方法によって検出される。本発明の精製ポリペプチドが、前述の薬物スクリーニング技法で使用するためにプレート上に直接コーティングされることも可能である。加えて、該タンパク質を捕捉して固体担体上に固定化するために非中和抗体が使用されてもよい。
一般に、発現されたＴＡＳ２Ｒ受容体は、アミノ酸又は炭水化物のようなリガンドと併せてＨＴＳ結合アッセイに使用することが可能である。同定されたリガンドは、適切な放射性同位元素、例えば１２１Ｉ、３Ｈ、３５Ｓ又は３２Ｐを用いて、当業者に良く知られた方法によって標識される。別例として、リガンドは、適切な蛍光性誘導体を用いてよく知られた方法によって標識されてもよい（バインドゥル（Ｂａｉｎｄｕｒ）ら、ドラッグ・ディベロプメント・リサーチ（Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｒｅｓ．）、１９９４年、第３３巻、ｐ．３７３−３９８；ロジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）、ドラッグ・ディスカバリー・トゥデイ（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ）、１９９７年、第２巻、ｐ．１５６−１６０）。組換えタンパク質を発現する細胞株から作製された細胞膜調製物中の受容体に特異的に結合した放射性リガンドは、いくつかの標準的な方法のうちの１つ、例えば結合したリガンドを結合していないリガンドから分離するための受容体‐リガンド複合体の濾過によって、ＨＴＳアッセイにおいて検出可能である。代替方法には、そのような分離の必要がないシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）又はＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）の形式が挙げられる。蛍光性リガンドの結合は、様々な方法、例えば蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、結合したリガンドの直接的な分光蛍光定量分析、又は蛍光偏光法で検出可能である。
さらに別の実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ受容体又は試験化合物のいずれかがその単離を容易にする標識又はタグを含み、かつ試験化合物を同定する方法は、標識又はタグとの相互作用によってＴＡＳ２Ｒポリペプチド／試験化合物複合体を単離するステップを含む。例示的なこの種のタグは、一般にはおよそ６個のヒスチジン残基のポリヒスチジン配列であって、そのように標識された化合物のニッケルキレーションを使用した単離を可能にするものである。他の標識及びタグ、例えばＦＬＡＧタグ（米国ニューヨーク州ロチェスターのイーストマン・コダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ））は良く知られており、当分野において日常的に使用されている。
結合の検出は、固定化されていない化合物上の放射性標識を使用して、固定化されていない化合物上の蛍光標識を使用して、固定化されていない化合物に免疫特異的な抗体を使用して、固定化されていない化合物上の標識であって固定化される化合物が取り付けられる蛍光性担体を励起する標識、及び当分野で周知かつ日常的に実行されているその他の技法を使用して、遂行可能である。
ＴＡＳ２Ｒ受容体の特異的リガンドを同定するために、その他のアッセイ、例えば標的への試験リガンドの直接的結合を測定することによって標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイ、及びイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣ法又はその他の物理的かつ分析的方法を用いた親和性限外濾過によって標的タンパク質のリガンドを同定するアッセイが使用されてもよい。別例として、そのような結合相互作用は、２つのタンパク質又はポリペプチドの間の相互作用を検出するための遺伝学的アッセイである酵母ツーハイブリッドシステムを使用して間接的に判断される。
本明細書中に開示された方法のいずれにおいても、ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのリガンドとみなされるためには、試験化合物は、該試験化合物の存在下での応答と非存在下での応答との間で統計的有意差を達成するのに十分な量だけ、測定される相互作用を変化させなければならない。一実施形態において、リガンドとみなされるためには、試験化合物は、該試験化合物の存在下での応答と非存在下での応答との間で統計的有意差を達成するのに十分な量だけ、測定される相互作用を変化させなければならない。統計的有意差は、ｔ検定のような当分野で既知の任意の適当な統計的検定によって判定可能である。例えば、統計的有意差があるためには、ｐ値は最低でも０．０５、最低でも０．０１、又は最低でも０．００１である。
さらに開示されるのは、ＴＡＳ２Ｒ受容体の活性を変調（すなわち増大又は低減）する化合物を同定する方法であって、ＴＡＳ２Ｒ受容体を化合物と接触させることと、該化合物がＴＡＳ２Ｒ受容体の活性を改変するかどうか判定することとを含む方法である。別の実施形態では、方法は、試験化合物の存在下又は非存在下でＴＡＳ２Ｒ受容体を既知のＴＡＳ２Ｒ受容体リガンドと接触させることを含む。試験化合物の存在下における活性は試験化合物の非存在下での活性と比較される。試験化合物を含有する試料の活性が試験化合物を欠く試料中の活性よりも高い場合、該化合物はアゴニストである。同様に、試験化合物を含有する試料の活性が試験化合物を欠く試料中の活性よりも低い場合、該化合物はアンタゴニストである。
一実施形態において、ＴＡＳ２Ｒタンパク質活性は、該受容体をホスホリパーゼＣシグナル伝達経路に結び付ける無差別的（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）なＧタンパク質を備えた異種細胞においてＴＡＳ２Ｒ遺伝子を発現させることにより測定される（オファーマン（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ）及びサイモン（Ｓｉｍｏｎ）、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９５年、第２７０巻、ｐ．１５１７５−１５１８０を参照されたい）。任意選択で、該細胞株はＴＡＳ２Ｒ遺伝子を本来は発現しない真核細胞株であり（例えばライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のカタログ番号Ｒ７００−０７）、無差別的なＧタンパク質はＧα１５である（上述のオファーマン及びサイモン）。
一実施形態において、ＴＡＳ２Ｒポリペプチドは、受容体の成熟を促進する異種シャペロン配列を備えたキメラ受容体として真核細胞中で発現されて、分泌経路又は細胞膜局在化によって目的を達成する。好ましい実施形態では、異種配列は、ロドプシンのＮ末端フラグメントのようなロドプシン配列である。そのようなキメラＴＡＳ２Ｒ受容体は、ライフ・テクノロジーズのカタログ番号Ｒ７００−０７の細胞のような任意の真核細胞において発現可能である。好ましくは、細胞は、受容体を細胞内シグナル伝達経路又はホスホリパーゼＣβのようなシグナル伝達タンパク質に結びつけることができる機能的なＧタンパク質、例えばＧα１５を含む。そのような細胞におけるそのような発現受容体の活性化は、任意の標準的な方法を使用して、例えば細胞内のＦＵＲＡ‐２依存的な蛍光の検出により細胞内カルシウムの変化を検出することなどにより、検出可能である。
別の実施形態では、シグナル伝達に対する試験化合物の効果を評価するために、転写レベルが測定されることも可能である。対象とするＴＡＳ２Ｒタンパク質を含有する宿主細胞は、何らかの相互作用を達成するのに十分な時間、試験化合物と接触させられ、次いで遺伝子発現のレベルが測定される。そのような相互作用を達成するための時間は、例えば時間経過をとって転写のレベルを時間の関数として測定することによって、経験的に決定されうる。転写の量は、当業者に適切であることが知られた任意の方法を使用することにより測定されうる。例えば、対象とするタンパク質のｍＲＮＡ発現がノーザンブロットを使用して検出されてもよいし、そのポリペプチド生成物がイムノアッセイを使用して同定されてもよい。別例として、レポーター遺伝子を使用する転写に基づくアッセイが、参照により本明細書中に組込まれる米国特許第５，４３６，１２８号明細書に記載されているようにして使用されてもよい。レポーター遺伝子は、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼであってよい。更に、対象とするタンパク質が、緑色蛍光タンパク質のような第２のレポーターへの付加によって間接的なレポーターとして使用されることも可能である（例えば、ミスティリ（Ｍｉｓｔｉｌｉ）及びスペクター（Ｓｐｅｃｔｏｒ）、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９７年、第１５巻、ｐ．９６１−９６４を参照）。その後、転写の量は、試験化合物が存在しない状態におけるいずれかの同じ細胞の転写の量と比較されるか、又は、転写の量は対象とするタンパク質を欠くほぼ同一の細胞における転写の量と比較されてもよい。ほぼ同一の細胞とは、組換え細胞が調製された元の同じ細胞であるが異種ＤＮＡの導入による改変はなされていない細胞に由来しうる。転写の量の何らかの差は、対象とするタンパク質の活性を試験化合物が何らかの方法で変更したことを示す。
一実施形態において、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体のアゴニストを同定する方法は、本明細書中に開示されたネコ科Ｔａｓ２Ｒ受容体ポリペプチドを試験化合物と接触させることと；化合物の存在下における受容体の生物活性の、化合物の非存在下における該ポリペプチドの生物活性に対する増大を検出することとを含む。
一実施形態において、ネコ科Ｔａｓ２Ｒ受容体のアンタゴニストを同定する方法は、本明細書中に開示されたネコ科Ｔａｓ２Ｒ受容体ポリペプチドを試験化合物と接触させることと；化合物の存在下における受容体の生物活性の、化合物の非存在下における該ポリペプチドの生物活性に対する減少を検出することとを含む。
受容体‐Ｇタンパク質相互作用が検査されることも可能である。例えば、受容体へのＧタンパク質の結合又は受容体からのＧタンパク質の放出が検査されることが可能である。例えば、ＧＴＰの非存在下において、アゴニストは、Ｇタンパク質（３個のサブユニット全て）の受容体との緊密な複合体の形成をもたらすことになろう。この複合体は、上記のように様々な方法で検出可能である。そのようなアッセイは、アンタゴニストを探索するために改変されることが可能であり、例えば、ＧＴＰの非存在下で受容体及びＧタンパク質にアゴニストを添加し、これらが緊密な複合体を形成すること、次いで、受容体‐Ｇタンパク質複合体の解離を調べることによりアンタゴニストについてスクリーニングすることによる。ＧＴＰの存在下において、他の２個のＧタンパク質サブユニットからのＧタンパク質αサブユニットの放出は、活性化の基準としての役割を果たす。
いくつかの実施形態では、ＴＡＳ２Ｒ‐ガストデューシン相互作用がＴＡＳ２Ｒ受容体活性化の働きとしてモニタリングされる。リガンド依存的なＴＡＳ２Ｒ受容体のガストデューシンとの結合は、ＴＡＳ２Ｒファミリーの任意のメンバーの修飾因子を同定するためのマーカーとして使用可能である。
活性化又は阻害されたＧタンパク質は、ひいては標的の酵素、チャネル、及びその他のエフェクタータンパク質の性質を変更することになる。古典的実例は、視覚系におけるトランスデューシンによるｃＧＭＰホスホジエステラーゼの活性化、促進性（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）Ｇタンパク質によるアデニル酸シクラーゼの活性化、Ｇｑ及びその他同族のＧタンパク質によるホスホリパーゼＣの活性化、並びにＧｉ及び他のＧタンパク質による種々のチャネルの変調である。下流の結果、例えばホスホリパーゼＣによるジアシルグリセロール及びＩＰ３の生成、ひいてはＩＰ３によるカルシウム動員なども検査可能である。
受容体の活性化は典型的にはその後の細胞内事象、例えばＩＰ３のような第２メッセンジャーの増大を開始させ、このことにより細胞内貯蔵物のカルシウムイオンが放出される。いくつかのＧタンパク質共役型受容体の活性化は、ホスホリパーゼＣを介したホスファチジルイノシトールの加水分解によるイノシトール３リン酸（ＩＰ３）の形成を刺激する（ベリッジ（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ）及びアーヴィン（Ｉｒｖｉｎｅ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８４年、第３１２巻、ｐ．３１５−２１）。ＩＰ３は次に、細胞内カルシウムイオン貯蔵物の放出を刺激する。よって、細胞質のカルシウムイオンレベルの変化、又はＩＰ３のような第２メッセンジャーレベルの変化は、Ｇタンパク質結合型受容体の機能を評価するために使用可能である。そのようなＧタンパク質共役型受容体を発現している細胞は、イオンチャネル活性化及び細胞内貯蔵物の両方の寄与の結果として細胞質カルシウムレベルの増大を示す可能性があり、その場合には、必須ではないがそのようなアッセイを、カルシウムを含まないバッファーであって任意選択でＥＧＴＡのようなキレート剤が補足されたバッファー中で実施して、内部貯蔵物からのカルシウム放出に起因する蛍光応答を識別することが望ましいかもしれない。ＩＰ３の生成は様々な市販のキットを使用して測定可能である。ＩＰ３の生成を検出するためのいくつかの実例のキットは、ウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡにおいて細胞溶解産物中のＩＰ３を検出可能なＩＰ３特異的な抗体を使用する。別例として、該抗体は蛍光標識されてプレートリーダを使用して検出される。
受容体の活性（味覚の伝達）の変調は、ＴＡＳ２Ｒタンパク質と関連する分子の投与によるＴＡＳ２Ｒシグナル伝達経路の変調に応答して変化する細胞内Ｃａ２＋レベルの変化を測定することによりアッセイ可能である。Ｃａ２＋レベルの変化は、任意選択で蛍光性のＣａ２＋指標色素及び蛍光画像解析を使用して測定される。
一実施形態において、Ｇタンパク質共役受容体のアッセイには、受容体の活性を伝えるためのイオン又は電圧に感受性の色素を取り込ませた細胞が含まれる。そのような受容体の活性を判定するためのアッセイは、試験化合物の活性を評価するための陽性対照又は陰性対照として他のＧタンパク質共役受容体の既知のアゴニスト及びアンタゴニストも使用することが可能である。変調化合物（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、モジュレーター）を同定するためのアッセイにおいて、細胞質中のイオンのレベル又は細胞膜電圧の変化は、イオン感受性又は細胞膜電圧の蛍光指示薬をそれぞれ使用してモニタリングされることになろう。使用されうるイオン感受性指示薬及び電圧プローブは様々な供給元から市販されている。Ｇタンパク質共役型受容体については、Ｇα１５及びＧα１６のような無差別的なＧタンパク質を、選ばれたアッセイにおいて使用することができる。そのような無差別的なＧタンパク質は、多種多様な受容体の共役を可能にする。
活性化されたＧＰＣＲタンパク質は、該受容体のＣ末端尾部（及び恐らくは同様に他の部位）をリン酸化するキナーゼの基質となる。よって、アゴニストはγ線標識されたＧＴＰから受容体への３２Ｐの転移を促進することになり、該受容体はシンチレーション計数器でアッセイ可能である。Ｃ末端尾部のリン酸化はアレスチン様タンパク質の結合を促進し、かつＧタンパク質の結合を妨害することになる。キナーゼ／アレスチン経路は多数のＧＰＣＲタンパク質の脱感作において重要な役割を果たす。例えば、味覚受容体が活性を持続する期間を変調する化合物は、所望の味覚の延長又は不愉快な味覚の遮断の手段として有用であろう。
イオン流の変化は、ＴＡＳ２Ｒタンパク質を発現している細胞又は細胞膜の分極（すなわち電位）の変化を決定することにより評価されてもよい。細胞の分極の変化を判定する１つの手段は、電圧クランプ及びパッチクランプの技法、例えば「セルアタッチ」モード、「インサイドアウト」モード、及び「ホールセル」モードを用いた電流の変化の測定（それによる分極の変化の測定）によるものである。細胞全体の電流は当分野で既知の標準的な方法論を用いて適宜決定される。その他の既知のアッセイには、放射性標識イオン流アッセイ及び電位感受性の色素を使用する蛍光アッセイが挙げられる。一般に、試験される化合物は１ｐＭ〜１００ｍＭの範囲で存在する。
その他のアッセイは、活性化されたときにアデニル酸シクラーゼのような酵素を活性化又は阻害することによって細胞内の環状ヌクレオチド（例えばｃＡＭＰ又はｃＧＭＰ）のレベルの変化をもたらす受容体の活性の決定を伴うことが可能である。環状ヌクレオチド作動性イオンチャネル、例えばｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの結合により活性化されると陽イオン透過性となる竿体光受容細胞チャネル及び嗅覚ニューロンチャネルが存在する（例えばアルテンホーフェン（Ａｌｔｅｎｈｏｆｅｎ）ら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、１９９１年、第８８巻、ｐ．９８６８−９８７２、ダラン（Ｄｈａｌｌａｎ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９０年、第３４７巻、ｐ．１８４−１８７を参照されたい）。受容体の活性化が環状ヌクレオチドレベルの減少をもたらす場合、アッセイにおいて受容体を活性化する化合物を細胞に加える前に、細胞内の環状ヌクレオチドレベルを増大させる作用薬、例えばホルスコリンに細胞を曝露することが好ましい場合がある。この種のアッセイのための細胞は、ＧＰＣＲホスファターゼ、環状ヌクレオチド−ｃｒａｔｅｄイオンチャネルをコードするＤＮＡ、及び活性化された時に細胞質中の環状ヌクレオチドレベルの変化を引き起こす受容体（例えばある種のグルタミン酸受容体、ムスカリン性アセチルコリン受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体など）をコードするＤＮＡを用いた宿主細胞の同時トランスフェクションにより作製可能である。
１つの実施形態では、細胞内のｃＡＭＰ又はｃＧＭＰの変化はイムノアッセイを使用して測定可能である。オファーマン（Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ）及びサイモン（Ｓｉｍｏｎ）、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９５年、第２７０巻、ｐ．１５１７５−１５１８０に記載された方法は、ｃＡＭＰのレベルを決定するために使用されうる。同様に、フェレイ‐ボスコ（Ｆｅｌｌｅｙ−Ｂｏｓｃｏ）ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピラトリー・セル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９９４年、第１１巻、ｐ．１５９−１６４に記載された方法はｃＧＭＰのレベルを決定するために使用されうる。さらに、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰのうち少なくともいずれかを測定するためのアッセイキットは、参照により本願に組込まれる米国特許第４，１１５，５３８号明細書に記載されている。
別の実施形態では、ホファチジルイノシトール（ＰＩ）の加水分解が、参照により本願に組込まれる米国特許第５，４３６，１２８号明細書に従って分析されることが可能である。簡潔に述べると、該アッセイは、３Ｈ‐ミオイノシトールを用いて細胞を４８時間以上にわたって標識することを伴う。標識された細胞は試験化合物で１時間処理される。処理された細胞は溶解されてクロロホルム‐メタノール‐水の中で抽出され、その後イノシトールリン酸がイオン交換クロマトグラフィーによって分離されてシンチレーション計数によって定量される。刺激比（ｆｏｌｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）は、アゴニストの存在下でのカウント数毎分（ｃｐｍ）の、バッファー対照の存在下でのｃｐｍに対する比率を計算することにより決定される。同様に、阻害比（ｆｏｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、アンタゴニストの存在下でのｃｐｍの、バッファー対照（アゴニストを含有してもよいし含有しなくてもよい）の存在下でのｃｐｍに対する比率を計算することにより決定される。
ポリペプチドの機能に対する試験化合物の効果は、上述のパラメータのうちのいずれかを調べることにより測定可能である。ＧＰＣＲ活性に影響を及ぼす任意の適切な生理学的変化が、本明細書中に開示されたポリペプチドに対する試験化合物の影響を評価するために使用可能である。機能上の結果が無傷細胞、動物又は動物行動を使用して判定される場合、様々な効果、例えば神経伝達物質放出、ホルモン放出、既知及び特性未知の両方の遺伝マーカーの転写の変化（例えばノーザンブロット法）、細胞増殖又はｐＨ変化のような細胞代謝の変化、並びにＣａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、又はｃＡＭＰのような細胞内の第２メッセンジャーの変化などを測定することも可能である。
潜在的なＴＡＳ２Ｒアゴニストである試験化合物で処理される試料又はアッセイは、変調の程度を調べるために、試験化合物を含まない対照試料と比較される。ＴＡＳ２Ｒタンパク質の活性化は、対照に対するＴＡＳ２Ｒ活性の値が１１０％、任意選択で１５０％、２００〜５００％、又は１０００〜２０００％である場合に達成される。
既知のアゴニスト及び潜在的なＴＡＳ２Ｒアンタゴニストである試験化合物で処理される試料又はアッセイは、変調の程度を調べるために、試験化合物を含まない既知のアゴニストで処理された対照試料と比較される。対照試料には１００％の相対値が割り当てられる。ＴＡＳ２Ｒタンパク質の阻害は、対照に対するＴＡＳ２Ｒ活性の値が約９０％、任意選択で５０％、任意選択で２５〜０％である場合に達成される。
ＴＡＳ２Ｒ受容体の活性又は発現を変調する作用薬が、例えば、推定上のモジュレーターをＴＡＳ２Ｒポリペプチド又はポリヌクレオチドを含有する細胞とともにインキュベートし、ＴＡＳ２Ｒ受容体の活性又は発現に対する推定上のモジュレーターの効果を決定することにより、同定される場合もある。一実施形態において、モジュレーターとみなされるためには、推定上のモジュレーターは、推定上のモジュレーターの存在下及び非存在下における応答の間で統計的有意差を達成するのに十分な量、測定される相互作用を変更しなければならない。統計的有意差は、ｔ検定のような当分野で既知の任意の適当な統計的検定によって決定可能である。例えば、統計的有意差があるためには、ｐ値は最低でも０．０５、最低でも０．０１、又は最低でも０．００１である。ＴＡＳ２Ｒ受容体の活性を変調する化合物の選択性は、ＴＡＳ２Ｒ受容体に対する該化合物の効果を他のＴＡＳ２Ｒ受容体に対する該化合物の作用と比較することにより判断することが可能である。選択的なモジュレーターには、例えば、ＴＡＳ２Ｒポリペプチド又はＴＡＳ２Ｒ受容体をコードする核酸に特異的に結合する、抗体及び他のタンパク質、ペプチド、又は有機分子を挙げることができる。ＴＡＳ２Ｒ受容体活性を変調するとして同定された化合物は、該化合物の活性を確認又は定量するために、ｉｎ ｖｉｖｏモデルを含む他のアッセイでさらに試験されてもよい。
ＴＡＳ２Ｒポリヌクレオチド及びポリペプチド、並びにこれらのホモログは、味覚受容体を発現する細胞を同定するため、味知覚のため、及び味覚伝達の検査のための有用なツールである。ＴＡＳ２Ｒ核酸に特異的にハイブリダイズするＴＡＳ２Ｒファミリーメンバー特異的な試薬、例えばＴＡＳ２Ｒのプローブ及びプライマー、並びにＴＡＳ２Ｒタンパク質に特異的に結合するＴＡＳ２Ｒ特異的な試薬、例えばＴＡＳ２Ｒ抗体は、味覚細胞の発現及び味覚伝達の調節について調査するために使用される。例えば、ＴＡＳ２Ｒ抗体は、特定のＴＡＳ２Ｒを発現するネコ科味覚細胞について、入り混じったネコ科細胞集団から同定及び単離のうち少なくともいずれかを行うために使用可能である。例えば、本明細書中に開示されたポリヌクレオチドプローブは、生体内分布研究及び診断アッセイにおいて使用されうる。
さらに提供されるのは、ＴＡＳ２Ｒファミリーメンバーのモジュレーターをスクリーニングするためのキットである。そのようなキットは容易に入手可能な材料及び試薬から調製可能である。例えば、そのようなキットは、次の材料：ＴＡＳ２Ｒの核酸又はタンパク質、反応チューブ、及びＴＡＳ２Ｒ活性を試験するための説明書、のうちのいずれか１つ以上を含むことが可能である。任意選択で、キットは生物学的活性を有するＴＡＳ２Ｒ受容体を含有する。種々様々なキット及び構成要素が、意図されるキットのユーザ及びユーザの特定の必要性に応じて調製されることが可能である。
ｆＴＡＳ２Ｒ受容体及びキメラポリペプチドに対する抗体も開示される。
モノクローナル又はポリクローナルの抗ｆＴＡＳ２Ｒ抗体の調製については、当分野で既知の任意の技法が使用可能である。一本鎖抗体を生産するための技法（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）を、本明細書中に開示されたポリペプチドに対する抗体を生産するように適合させることも可能である。さらに、遺伝子組換えマウス、又は他の哺乳類のような他の生物体が、ヒト化抗体を発現するために使用されてもよい。別例として、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体及びヘテロ多量体Ｆａｂフラグメントを同定することが可能である。１つの実施形態では、モノクローナル抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離されたＤＮＡ配列は、ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８９年、第２４６巻、ｐ．１２７５−１２８１によって概説された一般的なプロトコールに従って、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
モノクローナル抗体及びポリクローナル血清が回収されて、イムノアッセイ、例えば固体担体上に固定化された免疫原を用いる固相イムノアッセイにおいてタンパク質免疫原に対して力価測定されることが可能である。典型的には、１０４以上の力価を備えたポリクローナル抗血清が選択されて、競合結合イムノアッセイを使用して、非ＴＡＳ２Ｒタンパク質、又は他のＴＡＳ２Ｒファミリーメンバー若しくは他の生物体由来の他の関連タンパク質に対する該血清の交差反応性について試験される。特異的なポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体は通常、最低でも約０．１ｍＭ、より一般的には最低でも１μＭ、具体的には最低でも約０．１μＭ又はそれより優れている、より具体的には０．０１μＭ又はそれより優れているＫｄで結合することになろう。
イムノアッセイは、ｆＴＡＳ２Ｒを定性的又は定量的に検出するために、例えば、味覚受容体細胞、特に苦味受容体細胞、及びＴＡＳ２Ｒファミリーメンバーのバリアントを同定するために、使用することが可能である。
抗ｆＴＡＳ２Ｒ抗体は、ネコ科動物から得られた混合細胞集団からネコ科味覚細胞を単離するために使用することも可能である。一実施形態において、抗ｆＴＡＳ２Ｒ抗体に結合したネコ科味覚細胞の単離は、フローサイトメトリーによって達成可能である。当分野で既知の他の方法も使用可能である。
当分野で知られるように、味覚行動は、マルチチャネル味覚計（例えばＤａｖｉｓ ＭＳ１６０型マウス味覚計、米国フロリダ州タラハシーのダイログ・インスツルメンツ（ＤｉＬｏｇ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））を使用して、動物（例えばマウス）の舐め反応（ｌｉｃｋｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を数えることにより味の優先傾向を直接測定する短期アッセイにおいて判定可能である。適切な対照のサンプリングと比較した、マウスが味物質を舐める平均頻度（対照に対する舐め頻度として定義される比率）は、その刺激が食欲を刺激するか、中立的であるか、又は忌避性であるかを示す。加えて、口当たりの良い刺激の増強又は抑制について評価するために、口当たりの良い刺激の摂取における変化が試験刺激の存在下で判断されることも可能である。
さらなる実施形態において、動物は、当分野で既知のオペラント試験方法を使用して、別個の刺激を定性的に識別するように訓練することが可能である。これらの動物はその後、２つの刺激の間の質的類似性を食味又は優先傾向に関係なく判定するために使用可能である。
ｆＴＡＳ２Ｒ受容体が、食欲刺激性の味覚応答又は忌避性の味覚応答に関与することが報告された脳領域を活性化するかどうか判定するために、電極がこれらの脳領域に取り付けられて動物が覚醒状態又は麻酔状態で試験されてもよい。
別例として、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）又は脳波記録法のような神経活動をモニタリングするためのその他の非侵襲的方法が、食欲刺激性の味覚応答又は忌避性の味覚応答に関連する神経活動をモニタリングするために使用されてもよい。そのような方法は、細胞系の実験において受容体機能を改変することが確認された刺激によって誘発された神経活動に対する、年齢、経験又は栄養状態のような様々な要因の影響について判断するために使用されてもよい。
さらに提供されるのは、任意選択で単一包装に包含された、本明細書中に開示された少なくとも１つの組成物、ポリペプチド、又は核酸を含むキットである。該キットは、任意選択で、例えばｆＴＡＳ２Ｒ受容体若しくはｆＴＡＳ２Ｒ受容体をコードするポリヌクレオチド又はＴＡＳ２Ｒ受容体の活性を変更する化合物を検出する際のキット構成要素の使用に関する説明書を備えている。
一実施形態において、キットは、本明細書中に開示された少なくとも１つの抗ＴＡＳ２Ｒ抗体及び該抗体とＴＡＳ２Ｒ抗原との間の複合体を検出するための試薬を含む。例えば、キットは、抗体と生体試料中のＴＡＳ２Ｒ抗原との間の結合反応を可能にするバッファー、又は該バッファーを生成するための構成要素を含むことができる。
ＴＡＳ２Ｒポリペプチドの活性は、機能的、化学的、及び物理的な効果を決定するための様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのアッセイを使用して、例えばリガンドの結合（例えば放射性リガンド結合）、第２メッセンジャー（例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧ、又はＣａ２＋）、イオン流、リン酸化レベル、転写レベル、神経伝達物質レベルなどを測定して、評価することが可能である。更に、そのようなアッセイはＴＡＳ２Ｒファミリーメンバーの阻害剤及び活性化剤について試験するために使用可能である。味覚伝達活性のそのようなモジュレーターは、例えば苦味の検出を改変するために、味知覚をカスタマイズするのに有用である。
該アッセイのＴＡＳ２Ｒタンパク質は、典型的には配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、若しくは配列番号２６の配列を有するポリペプチド；配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、若しくは配列番号２６の保存的に改変されたバリアント；又は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、若しくは配列番号２６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である配列、から選択されることになろう。一実施形態において、ポリペプチドは配列番号１８又は配列番号２２の配列を有する。
いくつかの実施形態では、アッセイのポリペプチドは、ＴＡＳ２Ｒタンパク質のドメイン、例えば細胞外ドメイン、膜貫通領域、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、リガンド結合ドメイン、サブユニット会合ドメイン、活性部位などを含むことになろう。ＴＡＳ２Ｒタンパク質又はそのドメインのいずれかは、本明細書中に記載されたアッセイで使用されるキメラタンパク質を作出するために異種タンパク質に共有結合で連結されることが可能である。一実施形態において、ポリペプチドは配列番号１８又は配列番号２２に由来するドメインを有する。
ＴＡＳ２Ｒ受容体活性のモジュレーターは、組換え型又は天然型のいずれかの、上述のようなＴＡＳ２Ｒポリペプチドを使用して試験される。組換え型又は天然型のいずれかの該タンパク質は、単離されてもよく、細胞内での発現、細胞由来の細胞膜における発現、組織中での発現又は動物での発現が可能である。例えば、ＴＡＳ２Ｒを発現する組織、形質転換細胞、又は細胞膜由来の切片又は解離細胞が使用可能である。アッセイは、人工／合成の膜系においてＴＡＳ２Ｒポリペプチドを使用して準備されうる。変調は、本明細書中に記載されたｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのアッセイのうち任意のものを使用して試験される。味覚伝達はさらに、完全長のＴＡＳ２Ｒ‐ＧＰＣＲ又はキメラ分子、例えば異種シグナル伝達ドメインに共有結合で連結されたＴＡＳ２Ｒ受容体の細胞外ドメイン若しくは膜貫通領域、若しくはこれらの組み合わせ、若しくはＴＡＳ２Ｒ受容体の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインのうち少なくともいずれかに共有結合で連結された異種細胞外ドメイン及び膜貫通領域のうち少なくともいずれかを使用して、溶解状態又は固体状態の反応を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで検査されることも可能である。更に、対象とするタンパク質のリガンド結合ドメインは、リガンドの結合についてアッセイするために溶解状態又は固体状態の反応においてｉｎ ｖｉｔｒｏで使用可能である。数多くの実施形態において、ＴＡＳ２Ｒポリペプチドのうち全て又は一部のほかに、ＴＡＳ２Ｒの細胞膜への局在化を容易にするロドプシンのような追加の配列、例えば、ロドプシンタンパク質のＮ末端フラグメントを含むキメラ受容体が作製されうる。
ＴＡＳ２Ｒファミリーメンバーのモジュレーター又はリガンドとして試験される化合物は、任意の化合物、例えば小分子、又は生体分子のようなより複雑な分子、例えばタンパク質、糖、核酸若しくは脂質であってよい。別例として、モジュレーターはＴＡＳ２Ｒ遺伝子に遺伝子組換えがなされたものであってよい。本質的にあらゆる化学化合物が、本明細書中に開示されたアッセイ及び方法において潜在的なモジュレーター又はリガンドとして使用可能である。ある有用な実施形態では、化合物は水性溶液又は有機溶液（例えばＤＭＳＯ溶液）に溶解可能である。アッセイは、アッセイのステップを自動化し、かつ任意の好都合な供給源からアッセイに化合物を供給することにより、大規模ライブラリを含む化学物質のライブラリをスクリーニングするように設計され、該アッセイは典型的には並行して（例えばロボットによるアッセイでのマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式で）実行される。
単一の受容体の２つ以上のアゴニストの構造についての知識は、該受容体との相互作用についてスクリーニングするためのさらなる化合物ライブラリを当業者が合理的に設計することを可能にする。そのような化合物のコンピュータ・モデリングも容易になる。化合物ライブラリをスクリーニングすることにより、食物、特に動物用食物、栄養素及び栄養補助食品並びにそのようなフィトケミカルを含有する医薬調製物又はホメオパシー調製物の、苦味のある構成成分を抑制又は排除する組成物の開発が可能となる。別例として、スクリーニングは、食欲抑制薬、動物忌避剤などの生産において苦味反応を増強するための構造的に関連するアゴニストの同定を可能にする。
香味組成物、可食組成物、並びに可食組成物及び香味組成物を製造する方法が本明細書中に開示される。
香味組成物は、動物により摂取されるように可食組成物の受容を改善するため、該動物用の可食組成物に加えることが可能な組成物である。可食組成物の例には、食物、おやつ、栄養補助食品、医薬品、デンタルケア製品のような口腔ケア材料、咀嚼用製品、飲用製品などが挙げられる。可食組成物は、タブレット、カプセル、カプレット、可食フィルム、ウェットフード、液状食物、おやつ又はキブルの形をとることが可能である。
１つの態様では、香味組成物は、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体のアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターである化合物を含む。一実施形態において；香味組成物は、食味増強剤；任意選択で、香味組成物を可食組成物に付着させる助けとなる粘着性化合物；及び、任意選択で、ヒト用に色又は芳香を提供する化合物をさらに含み、該香味組成物は固体、液体、粉体、ペースト、ゲル、噴霧用調合物又はスプレッド調合物である。一実施形態において、香味組成物はコーティング組成物であり、粘着性化合物をさらに含む。可食組成物の知覚される苦味の変質又はマスキングは、本明細書中に開示された食味に関する行動アッセイのうち任意のもの、例えば標準的な２ボウル比較法（ｔｗｏ ｂｏｗｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を使用して試験することが可能である。
「基本の食物組成物」は、本明細書中で使用される場合、香味組成物と組み合わせることが可能な動物用食物を指す。１つの実施形態では、動物用食物はネコ科用に調合され、ドライフード、缶入りフード、セミドライフード、食用のご褒美など、及び先述の食物のうち１つ以上を含む組み合わせが含まれる。食物が受容者（動物、特にネコ科動物など）によって、既知の必須栄養素を提供する正常な１日当たりの飼料を該動物が受け取るような量で容認可能なように摂取されうる限り、様々な大きさ及び形状の基本の食物組成物が使用されうる。例えば、基本の食物組成物はコーティングされていなくてもよいし、脂質を含むコーティング剤でコーティングされてもよい。望ましい場合には、給餌は動物に１日当たり１回以上給餌することにより実行されうる。
一実施形態において、香味組成物は、可食組成物のより高い食味を動物に与えるのに有効な量で、可食組成物、例えば基本の食物組成物（例えばネコ科用）と組み合わされる。そのような香味組成物の有効な量は、特に以下に提供される一般的な手引きを考慮すれば、過度の実験作業を伴うことなく当業者によって容易に決定される。
一実施形態において、香味組成物は、香味組成物が基本の食物組成物に組み込まれるようなかたちで基本の食物組成物と組み合わされてもよい。組み込まれる、ということにより、香味組成物が密接に可食組成物と関連付けられて、例えば正常な貯蔵条件ではほとんど解離しないことが意味される。１つの実施形態では、香味組成物を可食組成物全体にわたってほぼ均一に分散させる。他の実施形態では、香味組成物の分布は意図的に不均一であってもよい。そのような実施形態では、香味組成物は、基本の食物と混合される細片又は小片を提供してもよい。様々な実施形態において、香味組成物は、可食組成物の乾燥重量の約０．５重量％〜約３重量％、具体的には約０．８重量％〜約２．５重量％、及びより具体的には約１重量％〜約２重量％を提供するのに有効な量で可食組成物中に付与されうる。
別の実施形態では、香味組成物は、可食組成物の表面に、例えばコーティングの形で付与される。可食組成物のコーティングには、例えば噴霧、粉付などによる可食組成物の表面上への香味組成物の局所的付与が挙げられる。香味組成物を含むコーティングは、香味組成物を表面に付着させるのを助けるために１つ以上の脂肪を含む場合もある。コーティングはさらに、又は別例として、可食組成物の表面への香味組成物の付着を容易にするのに有用な他の構成要素を含む場合もある。必要ではないが、香味組成物を可食組成物上に均一にコーティングすること、又は例えばコーティングされた食物を繰り返し転動させることにより、香味組成物の均一な分布を達成することも可能である。１つ以上のコーティングが施されうる。香味組成物は、基本の動物用食物組成物の乾燥重量の約０．５重量％〜約３重量％、具体的には約０．８重量％〜約２．５重量％、及びより具体的には約１重量％〜約２重量％を提供するのに有効な量で可食組成物の表面上に付与されうる。
香味組成物は、乾燥状態の動物用食物組成物のような可食組成物の中で分散され、かつ該可食組成物上にコーティングされてもよい。１つの実施形態では、完成した動物用食物生成物は販売用に包装されて最終的には動物に供給される。他の実施形態では、香味組成物は供給される前に食物と組み合わせるために包装される場合もある。いくつかの実施形態では、動物はネコ科の動物である。
一実施形態において、香味組成物は、香味料のような追加の食味増強剤をさらに含む場合もある。適切な香味料には、例えば、野菜香味料、肉香味料（例えば肝臓香味料）、チーズ香味料、酵母、ピロリン酸ナトリウム、脂肪、過リン酸塩、リン酸塩、及び／又は、食味を改善するために香辛料業界で利用されるその他の食物成分又は調味成分が挙げられる。適切な肉香味料には、例えば、食肉由来の香味料（例えば牛肉、豚肉、ベーコン、ラム、ハム、魚肉、鶏肉、七面鳥、及び／又はその他の家禽香味料）が挙げられる。
食物の食味又は受容とは、ネコ科等の動物の、ある食物を摂食する全体的な意欲を指す。ペットのような動物のための好ましい香味付与剤（ｆｌａｖｏｒａｎｔ）及び食味増強剤の開発は主観的である。ヒトに作用する香味付与剤が必ずしもネコ科動物にも作用するとは限らない。同様に、１つの動物種で有効な香味付与剤が、異なる動物種では同様に作用しない場合もある。当業者であれば、食物及び香味付与剤に関する動物にとっての好みを判定するために、食味試験が慣例的に使用されることを認識するであろう。本願における目的のために、そのような食味試験は、ネコ科を含む任意の動物に関して香味付与剤に対する好みの試験を実施するために、有効かつ直接的である。食味を増大させるための香味組成物を開発する伝統的方法は、様々な香味付与剤候補であってこれらの成分がヒトによってどのように知覚されるかについての知識に基づいて経験的に選択されたものを使用し、かつ「試行錯誤」の手法が、既知の標的製品に対して各候補を経験的に試験するために、又はより好ましい食味付与剤を同定するために、使用される。開示されたネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドは、標的生物種のための味覚受容体に基づいた食味増強剤の計画的な設計を可能にし、実質的に食味付与剤開発のプロセスを改善及び短縮することになる。
１つの実施形態では、香味組成物はネコ科用食物のための食味付与剤であり、該香味組成物は、香味組成物を含まないネコ科用食物と比較して、ネコ科動物のために改善された食味を示し、これは、食味付与剤を含むネコ科用食物の、食味付与剤が存在しない動物用食物と比較して改善された摂取によって測定される。
香味組成物は、非濃縮形態又は濃縮形態のいずれかの液体香味料として使用されうる。香味組成物が乾燥状態の香味組成物であるようにする場合、香味組成物は、例えば噴霧乾燥器のような適切な乾燥器、又はオーブンで乾燥させてもよい。香味組成物は様々な他の有用な構成要素、例えばマルトデキストラン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒａｎ）、ゴム、又は、食物に結合する能力若しくは所望の食感、粘性、流動性、色、芳香などを保持する能力のような１つ以上の好ましい機能性を組成物に提供するのに有用となりうる組み合わせを含むことができる。そのような構成要素及びその用途は、熟練した食品科学者には容易に理解されるであろう。
食味試験は標準的な２ボウル比較法によって実施可能である。この試験では、各動物に、測定された量の対照飼料又は試験飼料のどちらかが入っている２つのボウルの食物が与えられる。対照飼料及び試験飼料は同一の基本組成物を含有する。動物は、自身が好む食物を選択することを許される。各ボウルから摂食された食物の量が測定される。２つの飼料から摂食された量を直接比較することで、相対的な食味について、信頼性をもって示される。
例えば、ネコ科動物に、等量の食物の入った２個のボウルであって一方は試験される香味組成物を含有し、他方は香味組成物を含有しないものが与えられる。２個のボウルの中の食物の量はネコ科動物に与えられる前に計量される。試験中、ネコ科動物が一方のボウルを食べ切ってしまい、かつまだ空腹であるので他方を食べ続けることを確実に防ぐステップが取られるべきである。これは、例えば、ネコ科動物の元に２個のボウルがある時間を制限することにより、又はネコ科動物を完全に満足させるのに十分な食物を各ボウルに提供することにより、遂行可能である。
試験の終了時、２個のボウルは各ボウルから摂食された食物の量を決定するために再び計量される。より多くの食物が試験香味組成物の入ったボウル（ボウルＡ）から摂食された場合、その香味組成物が動物の優先傾向に対して正の効果を有していたことを示すために、食物摂取比率が正の値として記録される。より多くの食物が対照食物の入ったボウル（ボウルＢ）から摂食された場合、香味組成物が対照食物よりも機能しなかったことを示すために、比率は負の値として記録される。
例えば、香味組成物は乾燥状態の基本のネコ科用食物組成物に適用されて、多数のネコ科動物（例えば１０匹）に一定期間（例えば２日間）与えられる。ボウルの配置は、右側又は左側に置かれたボウルに対して優先傾向を示す動物を原因とするバイアスを除くために毎日変更される。各ボウルに対する各動物の優先傾向は、その特定の動物についての摂取比率（ＩＲ）として計算可能であり、例えば、動物１についてのＩＲ＝（ボウルＡから消費されたグラム数）／（ボウルＡ＋ボウルＢから消費された合計グラム数）、である。平均の優先傾向は、試験期間中の各日の平均値として計算される。よって、０．５に近いＩＲ値は同等の優先傾向を示す。０．５を超えるＩＲ値、典型的には０．５５を超えるＩＲ値は優先傾向を示す。ＩＲスコアに基づいた優先傾向の概算の度合いは、使用される動物の数及びデータの統計分析によって決められる。
動物に与える可食組成物をコーティングするため、又は該可食組成物中に組み込むための香味組成物を作製する方法が開示される。
一実施形態において、該方法は、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターと；任意選択で食味増強剤と；任意選択で、可食組成物への香味組成物の付着を助ける化合物と；任意選択で、色又は芳香を提供するための化合物とを、食肉加工品、食肉副産物、魚加工品、魚副産物、乳製品、乳製品副産物、微生物タンパク質の供給源、植物性タンパク質、炭水化物及びアミノ酸の担体からなる群から選択された材料と混合して香味組成物を得ることを含み、該香味組成物は、液体、固体、粉体、ペースト、ゲル、スプレッド調合物、顆粒、又は噴霧用調合物である。一実施形態において、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを組成物に混入させる。一実施形態において、アゴニストはデナトニウム、アロイン、又はＰＴＣであり、アンタゴニストはプロベネシドである。
液体の香味組成物を作製するために、例えば、市販の液体成分がミキサー内でネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターと組み合わされる。湿性の成分は粉砕又は乳化されてスラリーにされ、液体成分は該スラリーと組み合わされる。市販のプロテアーゼがタンパク質を加水分解するためにスラリーに添加されて、その後、熱、酸又は別の方法で不活性化されてもよい。ソルビン酸のような保存剤も添加可能である。水は、スラリーの粘性及び固形分を調整して噴霧の適用を容易にするために添加される。
香味組成物の乾燥調合物は、市販の乾燥成分、例えばアミノ酸、無機塩類及び有機材料を、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターとバッチミキサー中にて所望の割合で組み合わせ、均質にブレンドしてから乾燥することにより調製可能である。
別の乾燥調合物の実施形態によれば、湿性成分及び乾燥成分は、湿性成分をミキサー内で全部又は一部の乾燥成分とともに均質な混合物が形成されるまで混合することにより組み合わされる。該混合物を、蒸発又は凍結乾燥によって、例えば乾燥した粉体状の生成物を形成するために乾燥させ、該生成物は次に均質な混合物が形成されるまでタンブラー中で任意の残りの乾燥成分と混成される。
動物用の可食組成物を調製する方法が開示される。
一実施形態において、該方法は、可食組成物又はその構成要素を、本明細書中に開示されたｆＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドと、該可食組成物又はその構成要素から苦味化合物の量を低減するのに十分な時間、接触させることを含む。苦味化合物の量を低減する時間は、当業者によって決定可能である。接触は、連続的、半連続的、又はバッチ式のプロセスで行うことが可能である。一実施形態において、可食組成物はネコ科用である。
一実施形態において、該方法は、動物に対する可食組成物の食味を低下させるために該可食組成物に化合物を添加することを含み、該化合物はネコ科苦味受容体のアゴニスト又は正のモジュレーターである。一実施形態において、食味は、添加化合物を含まない可食組成物よりも、添加化合物を含んだ可食組成物をネコ科動物が１０〜３０％少なく摂取する程度まで低下する。一実施形態において、食味の低下は、摂取された可食組成物のカロリー、摂取された可食組成物の重量、又は摂取された可食組成物の体積の減少として測定される。
動物にとっての食味が増強された可食組成物を調合する方法が開示される。
一実施形態において、該方法は、可食組成物中の、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターである化合物の存在を決定すること；及び、可食組成物の食味を、化合物がアゴニスト若しくは正のモジュレーターである場合は可食組成物中の受容体アンタゴニストの量を増加させるか若しくは可食組成物中の化合物の量を低減することにより、又は化合物がアンタゴニスト若しくは負のモジュレーターである場合は可食組成物中の該化合物の量を増加させることにより、増強することを含む。該化合物を含む香味組成物を、香味組成物が可食組成物に組み込まれるか又は少なくとも部分的に可食組成物をコーティングするように可食組成物に適用することにより、該化合物の量を増加させることができる。
さらに開示されるのは、苦味化合物を、それを必要とする動物（例えばネコ科の動物）に与える方法である。当業者であれば、場合によってはヒト又は他の動物が苦味化合物（例えば医薬品、栄養素など）を必要とする場合があること、及び動物に該化合物を与えることは困難な場合があることを認識するであろう。
一実施形態において、該方法は、ネコ科用の可食組成物をネコ科動物に与えることを含み、該可食組成物は、ネコ科苦味化合物と、知覚される可食組成物の苦味を変更するか、可食組成物中の苦味化合物をマスキングするか、又はネコ科動物におけるネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体のアゴニスト、アンタゴニスト、若しくはモジュレーターとして作用してネコ科動物による苦味知覚を変更する化合物とを含む。一実施形態において、苦味化合物は、治療薬、栄養補助食品又は口腔ケア製品を構成する。栄養補助食品とは、それを供給しなければ十分な量が摂取されない場合のある栄養素を提供するように意図された補給剤を指し、そのような栄養素として例えばビタミン、ミネラル、繊維質、プロバイオティクス、脂肪酸、及びアミノ酸が挙げられる。治療薬又は医薬品とは、化合物、要素、又は混合物であって、単独で、又は別の化合物、要素若しくは混合物と組み合わせて対象者に投与された時、対象者に対して生理学的な効果を直接的又は間接的に与えるものを指す。口腔ケア製品とは、健全な歯、歯肉を促進するか、息を爽やかにするか、又は口腔疾患を予防若しくは治療するために使用される製品を指す。
ネコ科用の可食組成物を製造する方法も開示される。
一実施形態において、該方法は、ネコ科用の食物組成物又はその構成要素を、本明細書中のＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドと、該食物製品又は構成要素から苦味化合物を取り除くのに十分な時間、接触させることを含む。一実施形態において、ＴＡＳ２Ｒ受容体は、食物組成物から分離することが可能な固体担体に結合される。一実施形態において、接触は連続的な操作である。一実施形態において、食物組成物は複数のＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドと接触させられる。
一実施形態において、該方法は、可食組成物中の１つ以上の苦味化合物の存在を判定すること；存在すると判定された１つ以上の苦味化合物に基づいて可食組成物の苦味プロファイルを決定すること；及び、可食組成物の食味を増強するために可食組成物に化合物を添加するか又は可食組成物から化合物を除去することを含み、化合物は、可食組成物の苦味プロファイルを変更するか、可食組成物中に存在する苦味化合物のうち１つ以上をマスキングするか、又はネコ科苦味受容体のアゴニスト、アンタゴニスト若しくはモジュレーターとして作用する。一実施形態において、可食組成物への化合物の添加は、化合物を含むコーティング溶液を可食組成物に、コーティングが少なくとも部分的にネコ科用の可食組成物を包囲するように適用することを含む。一実施形態において、可食組成物は基本の食物、香味組成物、おやつ、治療薬、又は栄養補助食品である。可食組成物中の苦味化合物の存在は、本明細書中に開示された方法により、又は当分野で既知の任意の他の方法により、判定可能である。可食組成物の苦味プロファイルとは、可食組成物中に存在すると判定された苦味化合物を列挙することを指し、かつ任意選択で可食組成物中の所与の苦味化合物の量をさらに含む。一実施形態において、可食組成物はネコ科用である。
さらに開示されるのは忌避剤組成物である。一実施形態において、忌避剤組成物（ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｏｎ）は、拒否反応を誘発するのに十分な量、例えば重量比で少なくとも０．０５％〜約３０％の、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体のアゴニスト又は正のモジュレーター、並びに任意選択で、芳香薬又は香料、例えばローズマリー油、ミント油、珪皮油、リモネン、若しくはオイゲノール、並びに１つ以上の不活性成分、例えば液体希釈剤、担体、増粘剤、界面活性剤、保存剤、芳香薬、脱臭剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗微生物剤、殺生物剤、並びに数種類のアジュバントのうち１つ以上、例えば、限定するものではないが、湿潤剤、展着剤、固着剤、泡抑制剤、バッファー及び酸性化剤を含むことが可能である。適切な液体希釈剤には、界面活性剤の有無に関わりなく水、石油蒸留物、又は他の液状担体が挙げられる。担体の例には、ベントナイト、フラー土、その他の粘土、タルク、チョーク、石英、アタパルジャイト、モンモリロナイト又は珪藻土、バーミキュライト、高度に分散したケイ酸、アルミナ及びケイ酸塩、方解石、大理石、軽石、海泡石及びドロマイト、無機及び有機粉体、おがくず、ココナツの殻、トウモロコシの穂軸並びにタバコの茎が挙げられる。一実施形態において、忌避剤組成物は、スプレーとして施薬するためのＦｉｇｅｎ １１／１２又はプロパン／ブタンのような推進剤ガスを、例えば１５：８５の比率でさらに含むことが可能である。一実施形態において、ｆＴＡＳ２Ｒアゴニストはデナトニウム、アロイン、又はＰＴＣである。
本発明の他の実施形態は以降の非限定的な実施例に記載されている。
実施例
実施例１．ネコ科苦味受容体（ＴＡＳ２Ｒ）の遺伝子配列及びポリペプチド配列の決定
本実施例では、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ遺伝子が、ヒトの苦味受容体遺伝子配列を用いてＮＣＢＩのイエネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ）ホールゲノムショットガン法コンティグデータベースに検索要求することにより同定された。使用されたヒト遺伝子配列は、表２にＮＣＢＩ遺伝子ＩＤによって特定されている。
ヒットした中の個々のコンティグを、手作業による開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の同定のためダウンロードし、該遺伝子が完全長でありそうかどうか判断した。双方のネコ科ゲノムアセンブリからの配列を得て、該配列を比較した。
予測される機能遺伝子は、長さがおよそ３００アミノ酸であってｂｌａｓｔ検索された配列がアラインメントされたときに開始部位及び終結部位がヒトのタンパク質と同様の位置にあるタンパク質を含めるように選択された一組の規則に基づいて同定され、次いで配列をオーソロガスなイヌ科苦味遺伝子の配列と比較して類似性が合理的であることを確認した。表３は、使用されたイヌ科苦味遺伝子配列を特定している。
以下の表４は、同定された完全長のネコ科遺伝子についてまとめている。ネコ科遺伝子と最も近いヒトホモログとの間のタンパク質の類似性（％）が同表に提示されている。
ＤＮＡ塩基配列を確認するためのネコ科苦味遺伝子それぞれのクローニングは、一匹のネコのゲノムＤＮＡを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって所望の遺伝子を増幅した後に実施された。個々のネコ科遺伝子を増幅するためのプライマー候補は市販のソフトウェアを使用して設計された。プライマーのセットは、単離されたネコ科ゲノムＤＮＡからネコ科遺伝子配列を増幅してＤＮＡ塩基配列を決定するために、予測されたアニーリング温度、正確性、二量体化及びミスプライミングの可能性、並びに所望の配列の位置に基づいて設計されたものの中から選択された。各遺伝子を増幅するために使用されたプライマー対は表５に示されている。
代表的な遺伝子ＴＡＳ２Ｒ３８の増幅及びクローニングのプロセスについて簡単に記載する。ｆＴＡＳ２Ｒ３８配列を、ＥａｓｙＡハイフィデリティＰＣＲクローニング酵素（Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）（米国カリフォルニア州サンタクララのアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ））、カスタムプライマー、及び鋳型としてネコ科ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲによって増幅した。
得られたＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ‐Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（米国ウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にライゲーションした。該ベクターを用いてＤＨ５‐α細菌細胞（米国カリフォルニア州カールスバードのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を形質転換した。プラスミドを、形質転換したＤＨ５‐α細胞の培養物からプラスミド・ミニプレップ・キット（Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（米国ジョージア州ノークロスのオメガ・バイオテク（Ｏｍｅｇａ ＢｉｏＴｅｃ））を使用して精製した。精製されたプラスミドＤＮＡを使用した遺伝子の塩基配列決定は、イリノイ大学（シャンペーン−アーバナ）の中核ＤＮＡ塩基配列決定施設（Ｃｏｒｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）によって実施された。塩基配列決定データは、該データの品質を判定し、かつデータを編集するために、ＳｅｑＭａｎ Ｐｒｏ（米国ウィスコンシン州マディソンのディーエヌエースター（ＤＮＡＳｔａｒ））で分析された。
単離されたネコ科ゲノムＤＮＡの塩基配列決定で決定された遺伝子配列を、ホールゲノムショットガン法のコンティグから得られた配列と比較し、具体的なヌクレオチド差、予測されるタンパク質配列、及びタンパク質構造を同定するために分析した。ネコ科苦味受容体遺伝子のｃＤＮＡ及びポリペプチドそれぞれについて配列表に開示された配列は、表６に示される配列番号によって同定される。
概して、ネコ科遺伝子は、表７に示されるように該遺伝子の相同なヒト相当物にちなんで命名されている。しかしながら、ｆＴＡＳ２Ｒ４３のような多数のヒト遺伝子に類似しているネコ科遺伝子については、そのネコ科遺伝子は該遺伝子の相同なイヌ科相当物として命名されている。
いくつかのヒト及びネコ科苦味受容体の３番目〜７番目の膜貫通（ＴＭ）領域の配列アラインメントが図１に示されている。該配列アラインメントは、この２つの生物種の苦味受容体における本領域の相同性がかなりの程度であることを示している。
ヒトＴＡＳ２Ｒ３８ポリペプチド（配列番号３１）と、５匹のネコ個体のゲノムＤＮＡの塩基配列決定から決定されたネコ科ＴＡＳ２Ｒ３８ポリペプチド（配列番号１８）との配列アラインメントが図２に示されている。ｈＴＡＳ２Ｒ３８のアミノ酸のうちｆＴＡＳ２Ｒ３８のアミノ酸と異なるものは図２において枠付きとなっている。６‐ｎ‐プロピルチオウラシル（ＰＲＯＰ）の味知覚に影響することが知られているヒトでの多型の位置、Ａ４９Ｐ、Ｖ２６２Ａ、Ｉ２９３Ｖ（ここでＡＶＩは無味者でありＰＡＶは有味者である）は、図２において灰色の網掛けとなっている。フェニルチオカルバミド（ＰＴＣ）がヒトＴＡＳ２Ｒ３８受容体に結合するために重要であることが知られている残基は、図２において黒色の太枠によって表示されている（残基９９‐１００、１０３、２５５、及び２５９）。これらのアミノ酸は、ＰＴＣに直接結合するか、結合ポケットに寄与するか、又は他のアミノ酸と会合することにより受容体活性化に関与するかのうちいずれかである。
ＴＯＰＣＯＮＳは各ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドの７回膜貫通領域並びに細胞外ループ及び細胞質ループを同定するために使用された。この分析の結果は表１に示されている。
実施例２．ネコ科ＴＡＳ２Ｒのための発現系
Ａ．ネコ科ＴＡＳ２Ｒのための発現ベクターの生成
本実施例は、代表的なネコ科苦味受容体であるＴＡＳ２Ｒ３８のための発現ベクターの生成について説明する。ＴＡＳ２Ｒ受容体それぞれについて類似のプロセスが行われる。
ネコ科ＴＡＳ２Ｒ３８の完全長の遺伝子を、全コード領域にわたる遺伝子特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
ＴＡＳ２Ｒ３８のｃＤＮＡを、プラスミド／発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｄ‐Ｖ５Ｈｉｓ（米国カリフォルニア州カールスバードのライフ・テクノロジーズ）を基にした発現カセットであって、そのマルチプルクローニングサイト内に受容体の表面検出を可能にするためのＦＬＡＧエピトープ、次に導入遺伝子の細胞表面標的化を容易にするためのラットのソマトスタチン受容体サブタイプ３の最初の４５アミノ酸（ＲＳＳタグ）をコードするヌクレオチド配列、及びカルボキシ末端における免疫細胞化学的な検出を容易にするための単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープ（ＨＳＶエピトープ）をコードするヌクレオチド配列（ＨＳＶタグ）を含有する発現カセットにサブクローニングした。
ＦＬＡＧタグ、ＲＳＳタグ、ＴＡＳ２Ｒ３８、及びＨＳＶタグをコードする核酸配列を、この順序で、受容体タンパク質への翻訳を可能にする構築物を作出するためにインフレームで融合させた。結果として得られる発現ベクター中の受容体ｃＤＮＡは、ＴＡＳ２Ｒ３８にＲＳＳタグが先行し、かつＨＳＶタグが後続する接合されたアミノ酸配列をコードする。
該構築物を含む発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１１Ｄ‐ＦＬＡＧＶ５Ｈｉｓ‐ＴＡＳ２Ｒ３８と呼ばれ、ＴＡＳ２Ｒ３８タンパク質（配列番号１８）の発現を可能にする。
本明細書中に開示された他のｆＴＡＳ２Ｒそれぞれのための発現ベクターの生成は、類似のステップによって実施された。
Ｂ．ｆＴＡＳ２Ｒを一過性に発現する細胞株の作製
本明細書中に開示された所望のＴＡＳ２Ｒを一過性に発現する細胞株は、適当な発現ベクター、例えば実施例２Ａで上述されたように構築されたｐｃＤＮＡ３．１Ｄ‐ＦＬＡＧＶ５Ｈｉｓ‐ＴＡＳ２Ｒ３８を、真核細胞株（ライフ・テクノロジーズ、カタログ番号Ｒ７００‐０７）の細胞にトランスフェクションすることにより作製された。
０日目、１ウェルあたり６０，０００個の細胞を、ポリリジンでコーティングされた黒色の透明底９６ウェルプレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））に播種した。翌日、１５０ｎｇのＴＡＳ２Ｒ３８発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３．１Ｄ‐ＦＬＡＧＶ５Ｈｉｓ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）））を、４５ｎｇの、ラットのガストデューシンの最後の４４アミノ酸を含有するＧａ１６キメラ（Ｇα１６ｇｕｓｔ４４）と共に用いて、細胞を１ウェル当たり０．５ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（インビトロジェン）でトランスフェクションした。細胞を次いで３７℃、５％ＣＯ２にて２２〜４４時間インキュベートした。
ｆＴＡＳ２Ｒ３８の発現は、Ｆｌｕｏ‐４ＡＭ（ライフ・テクノロジーズ・コーポレイション（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））カルシウムアッセイを使用する自動カルシウムイメージングによって決定される、既知のｈＴＡＳ２Ｒ３８リガンド（例えばＰＴＣ）に対する機能的応答の存在について試験することにより判断された。Ｆｌｕｏ‐４ＡＭは細胞内のカルシウム動特性（濃度の変化）の蛍光指示薬であり、カルシウム濃度の変化、特にアゴニストへの曝露後に生じる受容体活性化に応答した増大のモニタリングを可能にする。
本明細書中に開示された他のｆＴＡＳ２Ｒを一過性に発現する細胞株の作製も同様であった。
作製された様々な細胞株におけるｆＴＡＳ２Ｒの発現はフローサイトメトリーによって判断された。細胞外のＦＬＡＧタグは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートしたＦＬＡＧ‐特異抗体で検出された。所与のｆＴＡＳ２Ｒを発現する細胞の割合（％）は、ＦＩＴＣシグナルについて陽性の細胞の割合（％）によって決定された。ｆＴＡＳ２Ｒ発現のレベルは測定された蛍光強度の幾何平均によって決定された。発現されたｆＴＡＳ２Ｒの各々についての結果は表８に示されている。
Ｃ．一過性にトランスフェクションされた細胞株のスクリーニング
既知のｈＴＡＳ２Ｒ３８リガンドであるＰＴＣ及びＰＲＯＰに対するｆＴＡＳ２Ｒ３８の機能的応答、並びに既知のｈＴＡＳ２Ｒ４３リガンドであるアロイン、デナトニウム及びサッカリン）に対するｆＴＡＳ２Ｒ４３の機能的応答についての試験は、Ｆｌｕｏ‐４ＡＭ（ライフ・テクノロジーズ・コーポレイション）カルシウムアッセイを使用する自動カルシウムイメージングによって決定された。
ｆＴＡＳ２Ｒ３８は、１００μＭのＰＴＣによってベースラインよりも８１％活性化されたが、３０μＭのＰＲＯＰによっては刺激されなかった。ｆＴＡＳ２Ｒ４３は、３００μＭのアロインによってベースラインよりも４５％、及び１ｍＭのデナトニウムによってベースラインよりも１７％活性化されたが、６．７ｍＭのサッカリンによっては刺激されなかった。更に、ＰＴＣ、デナトニウム及びアロインに対する応答は１ｍＭのプロベネシドによって阻害された。
本明細書中に開示されたその他のｆＴＡＳ２Ｒ各々の機能的応答についての試験は、各ｆＴＡＳ２Ｒの対応するホモログに対する既知のリガンドを使用して、類似の方法によって実施可能である。
Ｄ．ｆＴＡＳ２Ｒを安定して発現する細胞株の作製
ｆＴＡＳ２Ｒを安定して発現する細胞株も得られる。
これらの実験については、ｆＴＡＳ２Ｒ３８のｃＤＮＡは、プラスミド／発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（米国カリフォルニア州カールスバードのライフ・テクノロジーズ）を基にした発現カセットであって、そのマルチプルクローニングサイト内に導入遺伝子の細胞表面標的化を容易にするためのラットのソマトスタチン受容体サブタイプ３の最初の４５アミノ酸（ＲＳＳタグ）をコードするヌクレオチド配列、及び免疫細胞化学的な検出を容易にするための単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄエピトープ（ＨＳＶエピトープ）をコードするヌクレオチド配列（ＨＳＶタグ）を含有する発現カセットにサブクローニングされる。
ＲＳＳタグ、ＨＳＶタグ、及びｆＴＡＳ２Ｒ３８をコードする核酸配列を、この順序で、受容体タンパク質への翻訳を可能にする構築物を作出するためにインフレームで融合させる。結果として得られる発現ベクター中の受容体ｃＤＮＡは、ｆＴＡＳ２Ｒ３８にＲＳＳタグ及びＨＳＶタグが先行する接合されたアミノ酸配列をコードする。
該構築物を含む発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ‐ＴＡＳ２Ｒ３８と呼ばれ、ｆＴＡＳ２Ｒ３８タンパク質（配列番号１８）の発現を可能にする。
本明細書中に開示された他のｆＴＡＳ２Ｒのための発現ベクターの生成も同様である。使用される制限酵素は適宜変更される。
本明細書中に開示された所望のｆＴＡＳ２Ｒを安定して発現する細胞株は、適当な発現ベクター、例えば実施例２Ａで上述されたように構築されたｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ‐ＴＡＳ２Ｒ３８を、真核生物の宿主細胞株（ライフ・テクノロジーズ、カタログ番号Ｒ７００‐０７）であって国際公開第２００４／０５５０４８号（米国特許第７９１９２３６号明細書）に記載されるようなラットのガストデューシンの最後の４４アミノ酸を含有するＧα１６キメラで形質転換されたもの（Ｇα１６‐ガストデューシン４４細胞）にトランスフェクションすることにより生成される。
０日目、Ｇα１６‐ガストデューシン４４細胞を１ウェルあたり９００，０００個の細胞密度で６ウェルプレートに播種し、選択的な増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）の加熱不活性化済みウシ胎児血清、２ｍＭのＬ‐グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ）において一晩成長させる。
１日目、培地を２ｍｌの抗生物質を含まず血清を含まない増殖培地に交換する。１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（ライフ・テクノロジーズ・コーポレイション）を２５０μｌのＤＭＥＭに溶解して室温で５分間インキュベートする。並行して、４μｇのｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ‐ＴＡＳ２Ｒ３８ ＤＮＡを２５０μｌのＤＭＥＭに溶解する。結果として得られる２つの溶液を混合し、室温で２０分間インキュベートしてから細胞培養培地中の細胞に添加する。４時間後、培地を抗生物質を含まず血清を含有する増殖培地に置き換える。細胞を加湿雰囲気（３７Ｃ．、５％ＣＯ２）においてインキュベートする。
２４時間後、細胞を、選択的な増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）の加熱不活性化済ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ‐グルタミン、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８及び２００μｇ／ｍｌのゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）を含んだＤＭＥＭ）に再度播種し、加湿雰囲気（３７Ｃ、５％ＣＯ２）においてさらにインキュベートする。
２〜４週間の培養（必要に応じて培地を交換）の後、ゼオシン耐性のコロニーを選択して増殖させる。
ｆＴＡＳ２Ｒ３８の発現は、Ｆｌｕｏ‐４ＡＭ（ライフ・テクノロジーズ・コーポレイション）カルシウムアッセイを使用する自動カルシウムイメージングによって決定される、既知のｈＴＡＳ２Ｒ３８リガンド（例えばＰＴＣ及びＰＲＯＰ）に対する機能的応答の存在について試験することにより判断される。Ｆｌｕｏ‐４ＡＭは細胞内のカルシウム動特性（濃度の変化）の蛍光指示薬であり、カルシウム濃度の変化、特にアゴニストへの曝露後に生じる受容体活性化に応答した増大のモニタリングを可能にする。１つのクローンが選択され、その結果Ｇα１６‐ガストデューシン４４／ＴＡＳ２Ｒ３８細胞株が得られる。Ｇα１６‐ガストデューシン４４／ＴＡＳ２Ｒ３８細胞株は、１００μＭのＰＴＣの存在下でベースラインよりも９０％刺激されたが、３０μｍのＰＲＯＰでは刺激されなかった。
本明細書中に開示されたその他のｆＴＡＳ２Ｒを安定して発現する細胞株の生成も同様である。
実施例３．ネコ科ＴＡＳ２Ｒのリガンド及びエフェクターのための細胞系スクリーニング
ネコ科ＴＡＳ２Ｒ３８受容体のアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレーターの同定は、ネコ科ＴＡＳ２Ｒ３８及びＧα１６ｇｕｓｔ４４でトランスフェクションされた細胞に対する試験化合物の効果がトランスフェクションされていない細胞に対する試験化合物の効果と比較される、細胞系スクリーニングアッセイによって実施される。
スクリーニングアッセイに先立ち、細胞にカルシウム感受性の色素であるＦｌｕｏ‐ＡＭ（ライフ・テクノロジーズ）を実施例２Ｂに記載されるようにして３７℃で１時間取り込ませる。色素を洗い流し、細胞をＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ（登録商標）ＩＩ（モレキュラー・デバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））において２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ；ライフ・テクノロジーズ）中でアッセイする。細胞を刺激するために、試験化合物の１０倍希釈系列０．０１ｍＭ〜１ｍＭを使用する。既知のヒトＴＡＳ２Ｒ３８アゴニストであるＰＴＣは試験化合物の１つである。
刺激は１００〜１８０秒間導入及びモニタリングされる。データは分析され、刺激前の読取値であるベースラインのシグナルを上回る割合（％）としてグラフ表示される。特定の試験化合物によるｆＴＡＳ２Ｒ３８発現細胞株の刺激は、シグナルが、受容体発現細胞株におけるバッファー単独からのシグナル及び試験化合物を導入されたトランスフェクションされていない細胞株試料からのシグナルのいずれよりも大きい場合に生じると考えられる。
本明細書中に開示された他のｆＴＡＳ２Ｒのアゴニスト、アンタゴニスト、及びモジュレーターについての細胞系スクリーニングも同様である。
実施例４．香味組成物及び忌避剤組成物
本明細書中に開示されたネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体のアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターを含む、例示的な動物用乾燥香味組成物は、一般に以下の組成で作製される。
乾燥香味組成物中の同定されたアゴニストはデナトニウム、アロイン、若しくはＰＴＣであり、又は同定されたアンタゴニストはプロベネシドである。
ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体のアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターを含む、例示的な動物用液体香味組成物は、一般に以下の組成で作製される。
液体香味組成物中の同定されたアゴニストはデナトニウム、アロイン、若しくはＰＴＣであり、又は同定されたアンタゴニストはプロベネシドである。
ペットのネコが対象物を噛んだり食べたりするのを防止するために該対象物に噴霧するためのエアロゾルの形態の例示的な忌避剤組成物は、５０％の有効成分溶液であって有効成分はネコ科ＴＡＳ２Ｒアゴニスト又は正のモジュレーターである溶液を、５０％の推進剤ガスであって例えばＦｒｉｇｅｎ １１／１２（ハロゲン化炭化水素）又はプロパン／ブタン（例えば１５：８５比）とともに、エアゾール缶の中で調合することにより作製される。有効成分溶液は、液体希釈剤（例えば水）に溶解された重量比で約０．５％〜約３０％のネコ科ＴＡＳ２Ｒアゴニスト又は正のモジュレーターと、任意選択で０．５〜１．５％の芳香薬又は香料と、最大２９．５％のイソプロパノールとからなる。ネコ科ＴＡＳ２Ｒアゴニストはデナトニウム、アロイン、又はＰＴＣである。
実施形態１． ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の細胞外ドメイン；ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の膜貫通領域、又はネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体の細胞内ドメインを含む、単離されたネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）受容体ポリペプチドであって、該ｆＴＡＳ２Ｒ受容体は、配列番号１８、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６のうちから選択された配列を含み、前記単離されたネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）受容体ポリペプチドは配列番号２、４、６、又は１０のアミノ酸配列からなるものではないポリペプチド。
実施形態２． 実施形態１のポリペプチドであって：ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドの前記細胞外ドメインは、配列番号２のアミノ酸１、６８〜８４；１４６〜１７９；若しくは２４９〜２５７；配列番号４のアミノ酸１〜１０、７３〜８８；１５１〜１８６；若しくは２５６〜２６４；配列番号６のアミノ酸１〜８；７２〜８８；１５０〜１８６；若しくは２５６〜２６５；配列番号８のアミノ酸１〜２；６９〜８７；１５１〜１８３；若しくは２５３〜２６１；配列番号１０のアミノ酸１〜８；７２〜８８；１５０〜１８７；若しくは２５７〜２６５；配列番号１２のアミノ酸１〜６；７２〜８８；１５０〜１８３；若しくは２５３〜２６２；配列番号１４のアミノ酸１；６９〜８７；１５０〜１８１；若しくは２５１〜２６０；配列番号１６のアミノ酸１〜８；６９〜８８；１５０〜１８５；若しくは２５２〜２６１；配列番号１８のアミノ酸１〜１７：８３〜９８；１６１〜１９８；若しくは２６８〜２７７；配列番号２０のアミノ酸１；６９〜８８；１５０〜１８５；若しくは２５５〜２６４；配列番号２２のアミノ酸１〜２；６９〜８７；１４９〜１８１；若しくは２５１〜２６０；配列番号２４のアミノ酸１〜２；６９〜８７；１４９〜１８１；若しくは２５１〜２５９；又は、配列番号２６のアミノ酸１〜８；７２〜８８；１５０〜１８５；若しくは２５４〜２６３を含み；ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドの前記膜貫通領域は、配列番号２のアミノ酸２〜２２、４７〜６７、８５〜１０５、１２５〜１４５、１８０〜２００、２２８〜２４８、若しくは２５８〜２７８；配列番号４のアミノ酸１１〜３１、５２〜７２、８９〜１０９、１３０〜１５０、１８７〜２０７、２３５〜２５５、若しくは２６５〜２８５；配列番号６のアミノ酸９〜２９、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８７〜２０７、２３５〜２５５、若しくは２６６〜２８６；配列番号８のアミノ酸３〜２３、４８〜６８、８８〜１０８、１３０〜１５０、１８４〜２０４、２３２〜２５２、若しくは２６２〜２８２；配列番号１０のアミノ酸９〜２９、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８８〜２０８、２３６〜２５６、若しくは２６６〜２８６；配列番号１２のアミノ酸７〜２７、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８４〜２０４、２３２〜２５２、若しくは２６３〜２８３；配列番号１４のアミノ酸２〜２２、４８〜６８、８８〜１０８、１２９〜１４９、１８２〜２０２、２３０〜２５０、若しくは２６１〜２８１；配列番号１６のアミノ酸９〜２９、４８〜６８、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８６〜２０６、２３１〜２５１、若しくは２６２〜２８２；配列番号１８のアミノ酸１８〜３８、６２〜８２、９９〜１１９、１４０〜１６０、１９９〜２１９、２４７〜２６７、若しくは２７８〜２９８；配列番号２０のアミノ酸２〜２２、４８〜６８、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８６〜２０６、２３４〜２５４、若しくは２６５〜２８５；配列番号２２のアミノ酸３〜２３、４８〜６８、８８〜１０８、１２８〜１４８、１８２〜２０２、２３０〜２５０、若しくは２６１〜２８１；配列番号２４のアミノ酸３〜２３、４８〜６８、８８〜１０８、１２８〜１４８、１８２〜２０２、２３０〜２５０、若しくは２６０〜２８０；又は配列番号２６のアミノ酸９〜２９、５１〜７１、８９〜１０９、１２９〜１４９、１８６〜２０６、２３３〜２５３、若しくは２６４〜２８４を含み、かつ前記細胞内ドメインは、配列番号２のアミノ酸２３〜４６；１０６〜１２４；２０１〜２２７；若しくは２７９〜２９８；配列番号４のアミノ酸３２〜５１；１１０〜１２９；２０８〜２３４；若しくは２８６〜３０４；配列番号６のアミノ酸３０〜５０；１１０〜１２８；２０８〜２３４；若しくは２８７〜３１６；配列番号８のアミノ酸２４〜４７；１０９〜１２９；２０５〜２３１；若しくは２８３〜３０６；配列番号１０のアミノ酸３０〜５０；１１０〜１２８；２０９〜２３５；若しくは２８７〜３１１；配列番号１２のアミノ酸２８〜５０；１１０〜１２８；２０５〜２３１；若しくは２８４〜３３７；配列番号１４のアミノ酸２３〜４８；１０９〜１２８；２０３〜２２９；若しくは２８２〜３００；配列番号１６のアミノ酸３０〜４７；１１０〜１２８；２０７〜２３０；若しくは２８３〜３０９；配列番号１８のアミノ酸３９〜６１；１２０〜１３９；２２０〜２４６；若しくは２９９〜３３４；配列番号２０のアミノ酸２３〜４７；１１０〜１２８；２０７〜２３３；若しくは２８６〜３２２；配列番号２２のアミノ酸２４〜４７；１０９〜１２７；２０３〜２２９；若しくは２８２〜２９９；配列番号２４のアミノ酸２４〜４７；１０９〜１２７；２０３〜２２９；若しくは２８１〜３０８；又は、配列番号２６のアミノ酸３０〜５０；１１０〜１２８；２０７〜２３２；若しくは２８５〜３１２を含む、ポリペプチド。
実施形態３． 膜貫通領域２、膜貫通領域３、膜貫通領域４、膜貫通領域５、膜貫通領域６、及び膜貫通領域７であって、膜貫通領域はそれぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６のうちから独立に選択された対応する膜貫通領域配列における少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む、膜貫通領域；又は、膜貫通領域３、膜貫通領域６、及び膜貫通領域７であって、膜貫通領域はそれぞれ、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６のうちから独立に選択された対応する膜貫通領域配列における少なくとも２０個の連続するアミノ酸を含む、膜貫通領域；細胞外ドメイン３であって、配列番号２のアミノ酸１４６〜１７９；配列番号４のアミノ酸１５１〜１８６；配列番号６のアミノ酸１５０〜１８６；配列番号８のアミノ酸１５１〜１８３；配列番号１０のアミノ酸１５０〜１８７；配列番号１２のアミノ酸１５０〜１８３；配列番号１４のアミノ酸１５０〜１８１；配列番号１６のアミノ酸１５０〜１８５；配列番号１８のアミノ酸１６１〜１９８；配列番号２０のアミノ酸１５０〜１８５；配列番号２２のアミノ酸１４９〜１８１；配列番号２４のアミノ酸１４９〜１８１；及び配列番号２６のアミノ酸１５０〜１８５のうちから選択された少なくとも１５個の連続するアミノ酸を含む細胞外ドメイン３；並びに、細胞外ドメイン４であって、配列番号２のアミノ酸２４９〜２５７；配列番号４のアミノ酸２５６〜２６４；配列番号６のアミノ酸２５６〜２６５；配列番号８のアミノ酸２５３〜２６１；配列番号１０のアミノ酸２５７〜２６５；配列番号１２のアミノ酸２５３〜２６２；配列番号１４のアミノ酸２５１〜２６０；配列番号１６のアミノ酸２５２〜２６１；配列番号１８のアミノ酸２６８〜２７７；配列番号２０のアミノ酸２５５〜２６４；配列番号２２のアミノ酸２５１〜２６０；配列番号２４のアミノ酸２５１〜２５９；及び配列番号２６のアミノ酸２５４〜２６３から選択された少なくとも８個の連続するアミノ酸を含む細胞外ドメイン４を含む実施形態１又は２のポリペプチド。
実施形態４． 異種ポリペプチドをさらに含む実施形態１〜３のうちいずれか１つのポリペプチド。
実施形態５． 前記異種ポリペプチドはネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に連結されている、実施形態４のポリペプチド。
実施形態６． 配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜５のうちいずれか１つのポリペプチド。
実施形態７． 配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列からなる、実施形態１〜６のうちいずれか１つのポリペプチド。
実施形態８． 非天然物である、実施形態１〜７のうちいずれか１つのポリペプチド。
実施形態９． ｆＴＡＳ２Ｒ受容体活性を有するか、又はｆＴＡＳ２Ｒ受容体のリガンドに結合する、実施形態１〜８のうちいずれか１つのポリペプチド。
実施形態１０． 前記配列は配列番号１８である、実施形態１〜９のうちいずれか１つのポリペプチド。
実施形態１１． ｆＴＡＳ２ＲはｆＴＡＳ２Ｒ３８であり、かつ配列番号１８のアミノ酸７４はＮである、実施形態１〜１０のうちいずれか１つのポリペプチド。
実施形態１２． 前記細胞外ドメインは、ｆＴＡＳ２Ｒ受容体配列の細胞外ドメイン２若しくは３における少なくとも１５個の連続するアミノ酸、又は細胞外ドメイン４における少なくとも８個の連続するアミノ酸の配列を含み；前記膜貫通領域は、ｆＴＡＳ２Ｒ受容体配列の膜貫通領域における少なくとも２０個の連続するアミノ酸の配列を含み、かつ前記細胞内ドメインは、ｆＴＡＳ２Ｒ受容体配列の細胞内ドメインにおける少なくとも１７個の連続するアミノ酸の配列を含む、実施形態１〜１１のうちいずれか１つのポリペプチド。
実施形態１３． 実施形態１〜１２のうちいずれか１つのポリペプチドを少なくとも２個含む組成物。
実施形態１４． 実施形態１〜１２のうちいずれか１つのポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
実施形態１５． ネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）受容体ポリペプチド、又はそのフラグメントをコードする、単離されたポリヌクレオチドであって、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５のヌクレオチド配列；配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５を有するポリヌクレオチドの相補体に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び上述した各ヌクレオチド配列の相補体のうちから選択されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
実施形態１６． 配列番号１７のうち少なくとも１５個の連続するヌクレオチドであって、該連続するヌクレオチドはヌクレオチド２２０を含有し、かつヌクレオチド２２０にはＡが存在する、ヌクレオチド；又は該ヌクレオチド配列の相補体を含むポリヌクレオチド。
実施形態１７． 少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態１６のポリヌクレオチド。
実施形態１８． 少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態１６又は１７のポリヌクレオチド。
実施形態１９． 前記ヌクレオチド配列は非ネコ科細胞における発現用にコドン最適化がなされている、実施形態１４〜１８のうちいずれか１つのポリヌクレオチド。
実施形態２０． 前記非ネコ科細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＥ．）、出芽酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ ｃｅｌｌｙｅａｓｔ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の細胞、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）の細胞、又は哺乳類の細胞である、実施形態１９のポリヌクレオチド。
実施形態２１ 前記哺乳類の細胞はネズミ科又はヒトの細胞である、実施形態２０のポリヌクレオチド。
実施形態２２． 非天然物である、実施形態１４〜２１のうちいずれか１つのポリヌクレオチド。
実施形態２３． 実施形態１４〜２２のうちいずれか１つのポリヌクレオチドを少なくとも２個含む組成物。
実施形態２４． ネコ科ＴＡＳ２Ｒポリペプチドをコードする核酸の少なくとも一部分を増幅するためのプライマー対。
実施形態２５． 表５のプライマー対から選択されたプライマー対を含む実施形態２４の組成物。
実施形態２６． 実施形態１４〜２２のうちいずれか１つのポリヌクレオチドによってコードされているネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチド。
実施形態２７． 実施形態１４〜２２のうちいずれか１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
実施形態２８． 実施形態２７の発現ベクターを含む宿主細胞。
実施形態２９． 前記細胞は哺乳類細胞、魚類細胞、酵母細胞、細菌細胞、又は昆虫細胞である、実施形態２８の宿主細胞。
実施形態３０． 前記細胞は、ヒト、ネズミ科、又はネコ科の細胞である、実施形態２８又は２９の宿主細胞。
実施形態３１． 前記細胞は、細菌、昆虫、又は酵母の細胞である、実施形態２８又は２９の宿主細胞。
実施形態３２． 実施形態２８〜３１のうちいずれか１つの細胞を少なくとも１個含む細胞培養物。
実施形態３３． 配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５における少なくとも１５個、最大で１００個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列；又は該ヌクレオチド配列の相補体を含む、オリゴヌクレオチド。
実施形態３４． 少なくとも１８個、最大で５０個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態３３のオリゴヌクレオチド。
実施形態３５． 少なくとも１８個、最大で３０個の連続するヌクレオチドを含む、実施形態３３又は３４のオリゴヌクレオチド。
実施形態３６． 実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチドのｆＴＡＳ２Ｒ受容体エピトープに特異的に結合する、単離された抗体又はそのフラグメント。
実施形態３７． ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドと相互作用する化合物を同定する方法であって、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチドを試験化合物と接触させること、及び、前記ポリペプチドと試験化合物との間の相互作用を検出することを含む方法。
実施形態３８． 前記ポリペプチドと試験化合物との間の相互作用を検出することが、電気的性質の測定、イオン濃度の変化の測定、タンパク質立体配座の変化の測定、前記ポリペプチドへの試験化合物の結合の測定、リン酸化レベルの変化の測定、転写レベルの変化の測定、第２メッセンジャーレベルの変化の測定、神経伝達物質レベルの変化の測定、分光学的特性の変化の測定、流体力学的（例えば形状の）性質の変化の測定、クロマトグラフ特性の変化の測定、又は溶解度の変化の測定を含む、実施形態３７の方法。
実施形態３９． 試験化合物を、前記受容体と相互作用する化合物であると同定することをさらに含む、実施形態３７又は３８の方法。
実施形態４０． ネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドを変調する化合物を同定する方法であって、実施形態１〜１２及び２４のうちいずれか１つのポリペプチドを、別々のアッセイで試験化合物の存在下及び非存在下の両方においてＴＡＳ２Ｒ受容体リガンドと接触させること、及び、試験化合物が受容体ポリペプチドへのリガンドの結合又はリガンドによる受容体ポリペプチドの活性化を変調するかどうか判定することを含む方法。
実施形態４１． 試験化合物が受容体へのリガンドの結合又はリガンドによる受容体の活性化を変調するかどうかを判定することが、電気的性質の測定、イオン濃度の測定、タンパク質立体配座の変化の測定、前記ポリペプチドへの試験化合物の結合の測定、リン酸化レベルの変化の測定、転写レベルの変化の測定、第２メッセンジャーレベルの変化の測定、又は神経伝達物質レベルの変化の測定を含む、実施形態４０の方法。
実施形態４２． 試験化合物をモジュレーターとして同定することをさらに含む、実施形態４０又は４１の方法。
実施形態４３． 前記ポリペプチドは、固体担体に結合されるか、宿主細胞内、二重膜内、脂質単層内、又は小胞内で発現される、実施形態３７〜４２のうちいずれか１つの方法。
実施形態４４． 可食組成物を調製する方法であって、可食組成物又はその構成要素を、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチドと、該可食組成物又はその構成要素に由来する苦味化合物の量を低減するのに十分な時間、接触させることを含む方法。
実施形態４５． 前記ポリペプチドは前記可食組成物から分離することが可能な固体担体に結合される、実施形態４４の方法。
実施形態４６． 前記接触は、連続操作、半連続操作、又はバッチ操作である、実施形態４４又は４５の方法。
実施形態４７． 前記可食組成物はネコ科用の食物組成物であり、前記組成物又はその構成要素は複数の異なるポリペプチドと接触させられる、実施形態４４〜４６のうちいずれか１つの方法。
実施形態４８． 食味が増強された可食組成物を調合する方法であって、可食組成物中の実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターである化合物の存在を判定すること；及び、前記可食組成物の食味を、前記化合物がアゴニスト若しくは正のモジュレーターである場合は可食組成物中の受容体のアンタゴニストの量を増加させるか若しくは可食組成物中の前記化合物の量を低減することにより、又は前記化合物がアンタゴニスト若しくは負のモジュレーターである場合は可食組成物中の前記化合物の量を増加させることにより、増強することを含む方法。
実施形態４９． 前記化合物の量を増加させることは、前記化合物を含む香味組成物を可食組成物に適用して香味組成物が可食組成物に組み込まれるか又は少なくとも部分的に可食組成物をコーティングするようにすることを含む、実施形態４８の方法。
実施形態５０． 前記可食組成物は、食物、香味組成物、おやつ、医薬品、口腔ケア材料、栄養補助食品、咀嚼用製品、又は飲用製品を含む、実施形態４８又は４９の方法。
実施形態５１． 苦味化合物を、それを必要とする動物に与える方法であって、動物に可食組成物を与えることを含み、該可食組成物は、苦味化合物と、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、又はモジュレーターである化合物であって、動物による可食組成物の受容を、該化合物を含まない可食組成物の受容と比較して変更する化合物とを含む、方法。
実施形態５２． 苦味化合物は、医薬品、口腔ケア材料、忌避剤、又は栄養補助食品を含む、実施形態５１の方法。
実施形態５３． 動物に対する可食組成物の食味を制御するために可食組成物を調製する方法であって、動物に対する可食組成物の食味を低下させるために該可食組成物に化合物を添加することを含み、該化合物は実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト又は正のモジュレーターである、方法。
実施形態５４． 前記食味は、可食組成物を与えられる動物が、添加される化合物を含まない可食組成物よりも前記化合物を含む可食組成物を１０〜３０％少なく摂取する程度まで低下する、実施形態５３の方法。
実施形態５５． 前記低下は、摂取された可食組成物のカロリー、摂取された可食組成物の重量、又は摂取された可食組成物の体積で測定される、実施形態５３又は５４の方法。
実施形態５６． 動物に与える可食組成物をコーティングするため、又は動物に与える可食組成物中に組み込むための香味組成物を作製する方法であって、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであって前記アゴニストはデナトニウム、アロイン、又はＰＴＣであり、前記アンタゴニストはプロベネシドである、アゴニスト又はアンタゴニストと、担体とを混合して香味組成物を得ること；及び、任意選択で、該香味組成物中に食味増強剤、可食組成物への香味組成物の付着を助ける化合物、又は色若しくは芳香を提供するための化合物を混合すること；を含み、香味組成物は、液体、固体、粉体、ペースト、ゲル、スプレッド調合物、顆粒、又は噴霧用調合物である、方法。
実施形態５７． 動物に与える可食組成物をコーティングするため、又は動物に与える可食組成物中に組み込むための香味組成物であって、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのネコ科ＴＡＳ２Ｒ受容体ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであって、前記アゴニストはデナトニウム、アロイン、又はＰＴＣであり、前記アンタゴニストはプロベネシドである、アゴニスト又はアンタゴニストと；任意選択で食味増強剤と；任意選択で、可食組成物への香味組成物の付着を助ける化合物と；任意選択で、色若しくは芳香を提供するための化合物と；を含み、香味組成物は液体、固体、粉体、ペースト、ゲル、スプレッド調合物、顆粒、又は噴霧用調合物である、香味組成物。
実施形態５８． 前記可食組成物は、食物、おやつ、栄養補助食品、医薬品、口腔ケア材料、咀嚼用製品、忌避剤、又は飲用製品である、実施形態５７の香味組成物又は実施形態５３〜５６のうちいずれか１つの方法。
実施形態５９． 前記可食組成物は、ドライフード、ソフトフード、セミソフトフード、液体、タブレット、カプセル、カプレット、顆粒、ペースト、コロイド状混合物、分散物、又はゲルである、実施形態５７若しくは５８の香味組成物又は実施形態５３〜５６のうちいずれか１つの方法。
実施形態６０． 前記可食組成物はネコ科動物に与えるためのものである、実施形態４８〜５６のうちいずれか１つの方法又は実施形態５７〜５８のうちいずれか１つの香味組成物。
実施形態６１：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ３８のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態６２：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ４２のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態６３：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ４３のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態６４．ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ４４のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態６５：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ６７のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態６６：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ１２のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態６７：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ１０のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態６８：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ９のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態６９：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ７のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態７０：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ４のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態７１：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ３のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態７２：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ２のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。実施形態７３：ｆＴＡＳ２Ｒ受容体はｆＴＡＳ２Ｒ１のドメインを含む、実施形態１〜１２及び２６のうちいずれか１つのポリペプチド。
本明細書中で使用される場合、用語「１つ」は量の限定を示すものではなく、言及された品目が少なくとも１つ存在することを示している。用語「又は」、「若しくは」は「及び／又は」を意味する。用語「含む」、「有する」、「備える」、「含有する」は、オープンエンドの用語（すなわち「を含んでいるがこれらに限定されない」）として解釈されるべきである。量に関して使用される修飾語「約」は、明示された値を含み、かつ文脈により規定される意味を有する（例えば、特定の量の測定に関連した誤差の程度が含まれる）。
値の範囲についての記述は、別途記載のない限り、単にその範囲内にある各々別個の値を個々に参照する簡便な方法としての役割を果たすように意図されており、各々別個の値はあたかもその値が本明細書中で個々に記述されるかのように本明細書中に組み込まれる。すべての範囲の端点はその範囲内に含まれ、かつ独立に組み合わせることが可能である。
別途記載のない限り、本明細書中で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
参照文献はすべて、参照により本願に組み込まれる。
本発明の実施形態は、本発明を実行するための本発明者らに知られた最良の形態を含めて本明細書中に記載されている。これらの実施形態の変形形態は、先述の説明を読めば当業者には明白となりうる。本発明者らは当業者がそのような変形形態を適切に使用することを予期しており、かつ本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されたのとは異なるように実行されることも意図している。従って、本発明は、本願に添付された特許請求の範囲に記述された主題の全ての改変形態及び等価物を、準拠法に認められるように含むものである。さらに、上記要素のあらゆる可能な変形形態における任意の組み合わせは、別途記載のない限り、又は他に文脈から明白に否定されない限り、本発明によって包含される。

Claims (17)

  1. 配列番号１８、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６のうちから選択された配列を含む単離されたネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）ポリペプチド。
  2. 異種ポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記異種ポリペプチドは前記ネコ科ＴＡＳ２Ｒポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に連結されている、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドは配列番号１８又は配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. （ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｂ）ネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）ポリペプチド、又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドであって、
    配列番号１７、配列番号７、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、又は配列番号２５のヌクレオチド配列；
    配列番号１８、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、又は配列番号２６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び
    上述した各ヌクレオチド配列の相補体
    のうちから選択されたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
    のうちから選択される、単離されたポリヌクレオチド。
  6. 請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  8. 前記細胞は哺乳類細胞、魚類細胞、ヒト細胞、ネズミ科細胞、ネコ科細胞、酵母細胞、細菌細胞、又は昆虫細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
  9. ネコ科ＴＡＳ２Ｒポリペプチドと相互作用する化合物を同定する方法であって、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させること、及び
    前記ポリペプチドと試験化合物との間の相互作用を検出すること
    を含む方法。
  10. ネコ科ＴＡＳ２Ｒポリペプチドの機能的応答を変調する化合物を同定する方法であって、
    請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドを、別々のアッセイで試験化合物の存在下及び非存在下の両方においてＴＡＳ２Ｒリガンドと接触させること、及び
    試験化合物が前記ポリペプチドへのリガンドの結合又はリガンドによる前記ポリペプチドの活性化を変調するかどうか判定すること
    を含む方法。
  11. 可食組成物を調製する方法であって、
    可食組成物又はその構成要素を、配列番号１８、配列番号８、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６のうちから選択された配列を含む単離されたネコ科ＴＡＳ２Ｒ（ｆＴＡＳ２Ｒ）ポリペプチドと、前記可食組成物又はその構成要素に由来する苦味化合物の量を低減するのに十分な時間、接触させることを含む方法。
  12. ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドが異種ポリペプチドをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記異種ポリペプチドはｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に連結されている、請求項１２に記載の方法。
  14. ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドは前記可食組成物から分離することが可能な固体担体に結合されている、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記接触は、連続操作、半連続操作、又はバッチ操作である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記可食組成物はネコ科用の食物組成物であり、前記組成物又はその構成要素は複数の異なるポリペプチドと接触させられる、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ｆＴＡＳ２Ｒポリペプチドは配列番号１８又は配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
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