FR2763691A1

FR2763691A1 - Procede ameliore d'analyse immunologique par polarisation de fluorescence

Info

Publication number: FR2763691A1
Application number: FR9806380A
Authority: FR
Inventors: Charles Cheng; Kathryn Sarah Schwenzer; Raymond Thomas Wong
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-05-22
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 1998-11-27
Anticipated expiration: 2018-05-20
Also published as: US6066505A; JP4115588B2; DE19823073A1; IT1302564B1; JPH1183855A; ITMI981044A1; FR2763691B1

Abstract

L'invention concerne un procédé pour quantifier la quantité d'un analyte présent dans un échantillon d'essai par une analyse immunologique par polarisation de fluorescence, dans lequel l'analyte, dans l'échantillon clinique ou dans un mélange de réactifs contenant ledit analyte, est mis en contact avec au moins un composé choisi dans le groupe comprenant la 1, 10-phénanthroline, la 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine, l'acide naphtalène-1-sulfonique et leurs sels, et une combinaison quelconque de ceux-ci, le procédé ayant une précision accrue en raison d'une réduction de la fluorescence de fond et/ ou assurant une meilleure récupération de l'analyte, ainsi qu'un ensemble de réactifs pour mettre en oeuvre ce procédé, qui comprend au moins un composé choisi dans le groupe comprenant la 1, 10-phénanthroline, la 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine et leurs sels, et éventuellement de l'acide naphtalène-1-sulfonique.

Description

PROCEDE AMELIORE D'ANALYSE IMMUNOLOGIQUE PAR

POLARISATION DE FLUORESCENCE

L'invention concerne un procédé pour réduire l'intensité de la fluorescence de fond ou la fluorescence endogène, et donc les interférences, et d'améliorer le taux de récupération des analytes dans les analyses immunologiques par polarisation de fluorescence. L'une des raisons de l'intensité de fluorescence de fond réside dans la présence de bilirubine, qui a subi une fixation primaire dans un échantillon d'essai, par exemple un échantillon clinique soumis à une analyse pour quantifier la concentration d'un analyte cible particulier se trouvant dans l'échantillon, par exemple un principe ou composé physiologiquement actif (par exemple un médicament à usage thérapeutique). Il s'est maintenant avéré que si l'on ajoute un ou plusieurs composés

choisis dans le groupe comprenant la 1,10-phénanthroline, la 8-hydroxy-7iodo-5-

quinoléine et l'acide naphtalène-1-sulfonique et leurs sels (ci-après appelés aussi "additifs") à l'échantillon, à un mélange de réactifs ou à un mélange de réactifs contenant l'analyte cible dans le cadre d'une analyse immunologique par polarisation de fluorescence, on a effectivement une réduction de l'intensité de fond de la fluorescence. En outre, le taux de récupération de l'analyte est amélioré. La réduction de la fluorescence de fond et l'amélioration du taux de récupération augmentent la précision des résultats obtenus dans les analyses immunologiques par polarisation de fluorescence. De plus, le procédé de l'invention n'affecte pas autrement d'une manière

indésirable les performances de l'analyse par polarisation de fluorescence.

Une analyse immunologique par polarisation de fluorescence (FPIA) utilise un colorant fluorescent spécialement adapté, par exemple un analyte marqué par la fluorescéine (appelé "traceur" ou "conjugué de fluorescéine") pour entrer en

compétition, dans le cadre d'un système d'analyse homogène, avec l'analyte non-

marqué se trouvant dans un échantillon, pour fixation à un anticorps spécifique. Le principe de l'analyse immunologique par polarisation de fluorescence a été décrit pour la première fois par W.B. Dandliker et G. A. Feigen dans "Quantification of the

Antigen-Antibody Reaction by the Polarization of Fluorescence", Biochem. Biophys.

Res. Comm. 5:299 (1981). L'analyse se fonde sur le principe selon lequel, quand une petite molécule d'un analyte marqué par la fluorescéine n'est pas fixée, elle tourne librement, mais que la rotation libre est soumise à une forte restriction quand l'analyte marqué par la fluorescéine est fixé à une grosse molécule d'anticorps. Le degré de rotation du traceur est inversement indiqué par la valeur de la polarisation de fluorescence, qui est une valeur calculée à partir de l'intensité mesurée de la fluorescéine horizontale et verticale de l'analyte marqué par la fluorescéine, fixé et libre, en solution. La valeur de la polarisation de fluorescence (mP) est déterminée par utilisation des intensités mesurées de la fluorescence polarisée, grâce à l'équation suivante: ((Th - Bh) - (Tv - Bv)) mP = ((Th - Bh) + (Tv - Bv)) Th: Intensité d'essai horizontale Tv: Intensité d'essai verticale Bh: Intensité de fond horizontale Bv: Intensité de fond verticale On trace d'abord une courbe étalon en utilisant la valeur de la polarisation de fluorescence des étalons, comme décrit ci-après. En comparant à la courbe étalon la valeur de la polarisation de fluorescence de l'échantillon, on peut déterminer la

concentration de l'analyte.

Les marqueurs à la fluorescéine sont bien connus dans la technique et comprennent par exemple la 5-[(4,6-dichlorotriazine-2-yl-amino]fluorescéine et

l'isothio-cyanate de fluorescéine.

Il est souhaitable de minimiser dans toute la mesure du possible la

fluorescence de fond de l'analyse, pour arriver à une plus grande précision analytique.

On observe que, dans une tentative pour augmenter la précision, l'intensité d'essai est elle aussi corrigée en fonction de l'intensité de fond lors du calcul de la valeur de la polarisation de fluorescence. Cependant, l'intensité de fond peut ne pas être toujours constante pendant la durée des mesures. Quand l'intensité de fond est relativement faible par comparaison avec l'intensité du traceur, la valeur de la polarisation de fluorescence ne peut être affectée par une valeur non- compatible de l'intensité de fond. Cependant, quand l'intensité initiale de fond, c'est-à-dire les intensités Bh et By dans la formule ci-dessus, sont élevées et/ou instables ou changeantes, il en résulte des incohérences dans le calcul final. Plus précisément, les incohérences peuvent influer d'une manière significative sur le calcul final de la polarisation (mP) du fait que la valeur initiale de l'intensité de fond, c'est-à-dire Bh et By, qui est utilisée pour le calcul final, peut différer de l'intensité de fond finale ou effective au moment o l'on mesure l'intensité d'essai totale, c'est-à-dire Th et Tv. L'intensité d'essai comprend la composante horizontale et la composante verticale de l'intensité de fond effective, et

l'intensité du traceur au moment de la mesure d'un échantillon.

Dans une analyse immunologique par polarisation de fluorescence, on utilise habituellement pour exciter le mélange réactionnel une source lumineuse ayant une longueur d'onde comprise entre 475 et 495 nm. Un analyte marqué à la fluorescéine, après avoir absorbé la lumière, émet une lumière en moins de 10

nanosecondes à une longueur d'onde comprise entre 505 et 530 nm.

Le sérum, le plasma ou l'urine peuvent, par eux-mêmes, émettre de la lumière à une longueur d'onde comprise entre 510 et 520 nm, et donc interfèrent avec la mesure de la polarisation de fluorescence. L'interférence peut ne pas être juste limitée à la présence de bilirubine dans les échantillons. Les échantillons ayant une teneur peu élevée en bilirubine peuvent contenir d'autres composés endogènes ou exogènes, qui produisent une très forte intensité de fond de fluorescence, ou émettent une lumière comprise entre 510 et 520 nm. Ces échantillons peuvent produire une grande intensité de fond ou une intensité de fond qui est instable, et rendre les résultats obtenus dans les analyses par polarisation de fluorescence peu fiables pour des utilisations diagnostiques ou analytiques. Ainsi, la réduction et/ou la stabilisation de l'intensité de fond, lors d'une analyse immunologique par polarisation de fluorescence, sont nécessaires pour arriver à des utilisations diagnostiques ou

analytiques fiables en application clinique.

L'influence de différents additifs sur l'intensité de fond et le taux de récupération de l'analyte est prise en compte dans les analyses immunologiques, notamment celles dans lesquelles le fond de fluorescence est élevé ou instable, l'objectif étant d'obtenir une analyse immunologique qui puisse donner un résultat acceptable pour tous les échantillons cliniques, tels par exemple que des échantillons de sérum, de plasma ou d'urine. Il est fait référence aux brevets US N 4 252 783 et 4

492 762.

Selon l'invention, on a maintenant découvert que, quand au moins l'un des

composés choisis dans le groupe comprenant la 1,10-phénanthroline, la 8hydroxy-7-

iodo-5-quinoléine, l'acide naphtalène-l-sulfonique ou leurs sels, ou une combinaison de ces composés, sont incorporés dans le mélange réactionnel contenant un analyte dans le cadre d'une analyse par polarisation de fluorescence, on a une forte augmentation de la précision de l'analyse grâce à une réduction de la fluorescence de

fond et/ou une amélioration du taux de récupération de l'analyte.

L'invention concerne ainsi un procédé pour quantifier la quantité d'un analyte présent dans un échantillon d'essai, par une analyse immunologique par polarisation de fluorescence, o l'analyte, se trouvant dans l'échantillon clinique ou dans un mélange de réactifs contenant ledit analyte, est mis en contact avec au moins un composé choisi dans le groupe comprenant la 1,10-phénanthroline, la 8- hydroxy-7- iodo-5-quinoléine, l'acide naphtalène-l-sulfonique et leurs sels, et toute combinaison

de ces derniers.

L'invention concerne aussi une analyse par polarisation de fluorescence, portant sur un analyte cible dans un échantillon d'essai, avec des interférences de fond réduites et/ou une amélioration du taux de récupération de l'analyte, l'analyte contenant l'échantillon clinique ou un mélange de réactifs contenant l'analyte étant mis en contact avec une quantité efficace d'au moins un composé choisi dans le groupe comprenant la 1,10-phénanthroline, la 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine, l'acide

naphtalène-1-sulfonique, leurs sels, et toute combinaison de ceux-ci.

L'expression "taux de récupération" d'un analyte représente une mesure précise de la valeur vraie de l'analyte, dans un échantillon auquel on a "ajouté" une quantité connue de l'analyte, c'est-à-dire que l'échantillon est "dopé" par l'analyte. Le "taux de récupération" de l'analyte est un paramètre significatif lors de l'évaluation de la précision globale d'une analyse par polarisation de fluorescence. Ainsi, un "taux de récupération" de 100 % signifie que l'analyse donne la valeur exacte de la quantité vraie d'analyte dans l'échantillon. Une valeur du taux de récupération inférieure à 100 % signifie que l'analyse donne un résultat inférieur à la quantité d'analyte effectivement présente dans l'échantillon. D'une manière analogue, un taux de récupération supérieur à 100 % est le signe que l'analyse donne une valeur supérieure

à la quantité d'analyte se trouvant dans l'échantillon.

De préférence, les composés sélectionnés en combinaison sont l'acide

naphtalène-l-sulfonique et la 1,10-phénanthroline ou encore l'acide naphtalène-1-

sulfonique et la 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine.

Les composés 1,10-phénanthroline, 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine et acide naphtalène-l-sulfonique forment leurs sels classiques correspondants, et par exemple l'acide naphtalène-l-sulfonique forme par exemple un sel de lithium ou de sodium. L'invention concerne aussi un ensemble de réactifs pour mettre en oeuvre une analyse immunologique par polarisation de fluorescence pour quantifier un analyte dans un échantillon d'essai, le groupe comprenant au moins un composé choisi dans le groupe comprenant la 1,10-phénanthroline, la 8-hydroxy-7-iodo-5- quinoléine

et leurs sels, et éventuellement l'acide naphtalène-l-sulfonique.

Cet ensemble de réactifs comprend avantageusement: 1) du dodécylsulfate de lithium en une quantité comprise entre environ 0,5 % etenviron 2 %; 2) de l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine, en une quantité comprise entre environ 10 % et environ 30 %; 3) de la 1,10-phénanthroline, en une quantité comprise entre environ 0,06 % et environ 0,25 %; et 4) un azoture d'un métal alcalin en une quantité comprise entre environ

0,09 % et environ 3,0 %.

L'azoture d'un métal alcalin est habituellement l'azoture de sodium.

L'ensemble de réactifs comprend de préférence en outre de l'acide naphtalène-1-sulfonique en une quantité comprise entre environ 0,75 % et environ 5

%.

Un ensemble de réactifs particulièrement intéressants de ce type est

constitué d'un réactif unique qui contient environ 0,85 % d'acide naphtalène-1-

sulfonique, 20 % du sel de sodium de l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine, 0, 20 % de 1,10-phénanthroline monohydratée, 1,25 % de dodécylsulfate de lithium et 0,09 %

d'azoture de sodium.

On procède comme suit pour mettre en oeuvre une analyse représentative: Mélange de réactifs Un mélange de réactifs selon l'invention, utilisé dans des analyses immunologiques par polarisation de fluorescence, comprend habituellement les

composants A, B, C et D ci-dessous.

Composant A: échantillon Il s'agit du sérum, du plasma ou de l'urine, dans lequel on veut contrôler la

présence de composés (analytes) tels que des barbiturates ou des benzodiazépines.

Composant B: diluant Dodécylsulfate de lithium, en une quantité comprise entre environ 0,5 % à environ 2 %; acide naphtalène-l-sulfonique en une quantité comprise entre environ 0,75 et environ 5 % ou plus (renforçateur du taux de réduction); 1,10-phénanthroline, en une quantité comprise entre environ 0,06 % et environ 0,25 % (réducteur de fluorescence de fond); hydroxypropyl-3-cyclodextrine en une quantité comprise entre environ 10 % et environ 30 %; 8-hydroxy-7-iodo-5- quinoléine (réducteur de fluorescence de fond) en une quantité comprise entre environ 0,06 % et environ 0,25 %; et azoture d'un métal alcalin, tel par exemple que l'azoture de sodium, en une

quantité comprise entre environ 0,09 % et environ 3,0 %.

Composant C: réactif anticorps Antisérums de mouton contre le barbiturate sérique ou antisérums de mouton contre la benzodiazépine sérique. Les antisérums sont préparés chez des

moutons par des procédés classiques bien connus de l'homme de métier.

Composant D: réactif traceur Barbiturate marqué par la fluorescéine, ou benzodiazépine marquée par la

fluorescéine, dans un tampon approprié.

Instrument COBAS INTEGRA (Roche Diagnostic Systems, Inc., Branchburg, N. J.) ou un analyseur approprié quelconque pouvant mettre en oeuvre une analyse

immunologique par polarisation de fluorescence.

Protocole de mise en oeuvre de l'analyse On place successivement dans une cuve le réactif anticorps, le diluant et un échantillon de sérum sanguin, de plasma ou d'urine. Après avoir mélangé et incubé pendant un bref laps de temps (132 secondes sur le COBAS INTEGRA), on mesure l'intensité de fond. Puis on ajoute le traceur, on incube le mélange obtenu pendant un certain temps (qui dans le COBAS INTEGRA est habituellement de 90 secondes),

puis on mesure l'intensité d'essai finale.

Elaboration d'une courbe étalon On prépare une courbe étalon en utilisant des concentrations étalons de l'analyte (comme décrit ci- après dans les Exemples 5 et 6), pour permettre de

déterminer la teneur en analyte par référence à la courbe étalon.

L'invention sera mieux comprise en regard des formes de réalisation différentes, ainsi que de la Figure 1, qui est un graphique à barres présentant l'aptitude

des additifs décrits dans l'Exemple 1 à réduire la fluorescence de fond du sérum.

EXEMPLE 1

Réduction de la fluorescence du sérum dans des échantillons de sérum ictérique par utilisation des additifs de l'invention Echantillon:

Echantillons de sérum ictérique d'origine clinique.

Diluants: Diluant I - Témoin 20 % d'hydroxypropyl-3-cyclodextrine (HPC), 1,25 % de dodécylsulfate de lithium (LDS) Diluant 2 Témoin plus 0, 2 % de 1,10-phénanthroline, 0,85 % d'acide naphtalène- 1 -sulfonique (alpha) Diluant 3 Témoin plus 0,2 % de 8-hydroxy-7-iodo- 5-quinoléine Diluant 4 Témoin plus 0,2 % de 1,10-phénanthroline Diluant 5 Témoin plus 0,2 % de 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine, 0,85 % d'acide naphtalène-1-sulfonique (alpha) Réactif anticorps: Anticorps polyclonal, préparé contre du nordiazépam par des techniques connues. Dans les Exemples 1 à 3, l'anticorps est celui qui se trouve dans le dosage de

la benzodiazépine ONLINE de Roche Diagnostic Systems.

Réactif traceur:

Nordiazépam marqué à la fluorescéine.

Instrument: COBAS INTEGRA Protocole: On place successivement dans une cuve 90 lil du réactif anticorps, 45 pl du diluant échantillon et 14 gl de l'échantillon. Après avoir mélangé et incubé pendant un bref laps de temps (habituellement environ 132 secondes), on mesure l'intensité de fond du mélange obtenu. Puis on ajoute 20 pl du traceur, on incube le mélange pendant un bref laps de temps (une fois de plus habituellement pendant environ 90 secondes) et on mesure l'intensité d'essai finale. Les résultats des mesures sont

consignés ci-dessous dans le Tableau 1.

Tableau 1

Numéro de Concentration de Intensité de fond/intensité d'essai (%) l'échantillon la bilirubine ictérique (mg/dl) Diluant Diluant Diluant Diluant Diluant

1 2 3 4 5

1 9,7 37 33 35 30 27

2 * 38 15 13 12 11

3 3,3 42 17 15 14 12

4 3,5 79 23 19 20 16

5,2 33 14 12 11 11

6 4,2 31 21 19 15 15

7 6,0 60 25 20 18 17

8 6,5 32 17 15 12 13

9 7,9 63 32 32 31 28

5,4 90 31 24 30 22

11 7,3 54 29 27 23 23

12 8,0 73 29 29 30 25

13 4,7 48 28 27 23 22

* Essai non-effectué Résumé des résultats: Comme il ressort du Tableau 1 ci-dessus, le diluant 2 est très efficace pour ce qui est de réduire la fluorescence de fond. C'est ce que montre la réduction du rapport intensité de fond/intensité d'essai par comparaison avec le

diluant 1 (le témoin).

De même, le diluant 3, qui comprend le témoin additionné de 8-hydroxy-

7-iodo-5-quinoléine, est lui aussi très efficace pour ce qui est de réduire la fluorescence du sérum par comparaison au diluant 1, et il est même encore plus efficace quand il est combiné à l'acide naphtalène-1sulfonique (diluant

échantillon 5).

Le diluant 4, qui comprend le témoin additionné de 1,10-phénanthroline, est de même très efficace pour ce qui est de réduire la fluorescence de fond, comme le montre la réduction du rapport intensité de fond/intensité d'essai, ici

aussi par comparaison avec le diluant 1.

Les résultats consignés dans le Tableau I sont aussi récapitulés sous forme graphique sur la Figure 1 illustrant l'aptitude des additifs à réduire la fluorescence sérique, avec en ordonnées: Fond, % et en abcisses:numéro de l'échantillon de bilirubine. Cependant, dans les résultats de la Figure 1, on utilise un diluant additionnel, plus précisément le témoin additionné de 0,85 %

d'acide naphtalène-1-sulfonique, ce qui ne ressort pas du Tableau 1.

En effet, les diluants utilisés sont les suivants: % HPC, 1,25 % LDS, 0, 2 % 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine, 0,85 % acide naphtalène-1- sulfonique alpha % HPC, 1,25 % LDS, 0,2 % 1,10-phénanthroline % HPC, 1, 25 % LDS, 0,2 % 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine % HIPC, 1,25 % LDS, 0,2 % 1,10-phénanthroline, 0,85 % acide naphtalène-1-sulfonique alpha 20 % HPC, 1,25 % LDS, 0,85 % acide naphtalène-1-sulfonique alpha

% HPC, 1,25 % LDS

EXEMPLE 2

Récupération du nordiazépam à partir d'échantillons ictériques cliniques après addition de 1, 1 0-phénanthroline Echantillon: Echantillons cliniques de sérum ictérique, dopés à 70 ng/ml de

nordiazépam à l'aide d'une solution mère à 7 gg/ml.

Diluant: 1 % de dodécylsulfate de lithium, 15 % d'hydroxypropyl-03cyclodextrine

avec ou sans 0,15 % de 1,10-phénanthroline (PAE).

Réactif anticorps:

Anticorps polyclonal produit contre le nordiazépam.

Réactif traceur:

Nordiazépam marqué à la fluorescéine.

Instrument:

COBAS INTEGRA.

Protocole: On place successivement dans une cuve 95 agl du réactif anticorps, 57 pl du diluant échantillon et 18 gl de l'échantillon. Après avoir mélangé et incubé pendant un bref laps de temps, on mesure l'intensité de fond. Puis on ajoute 20 gl du traceur, on incube le mélange pendant un bref laps de temps et on mesure l'intensité d'essai final. Les résultats des mesures sont consignés dans le

Tableau 2.

Tableau 2

Effet de la 1,10-phénanthroline sur le fond de fluorescence et le fond de récupération de l'analyte (nordiazépam) dans le sérum

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Taux de Taux de Taux de Taux de Intensité de Intensité de Echantillon Bilirubine récupération récupération récupération récupération fond/intensité fond/intensité Réduction ictérique totale, mg/l de l'analyte, de l'analyte, de l'analyte de l'analyte d'essai (%), d'essai (%), du fond (%)* ng/ml, sans ng/ml, avec (%), sans (%), avec sans avec Témoin 0 73,37 68,85

1 2,1 74,43 57,41 101 83 37 8 78

2 5,3 91,48 71,4 125 104 57 22 61

3 5,3 92,74 69,55 126 101 42 19 55

4 5,6 97,36 69,05 133 99 52 19 63

5,8 81,77 65,4 111 95 28 17 39

6 7,2 103,09 64,88 141 87 57 30 47

7 7,3 32,98 99,09 45 144 60 36 40

8 10,5 85,58 74,66 117 108 35 27 23

9 14,1 71,08 67,39 97 98 38 32 16

26,1 45,08 42,91 61 62 53 48 9

11 44,4 36,03 26,66 49 39 55 53 4.4

* Réduction de l'intensité de fond (colonne 9) = (Colonne 7 - Colonne 8)x 100/Colonne 7 w Le chiffre de la Colonne 7 correspond à l'intensité d'essai de fond (%) sans 1,10-phénanthroline, et celui de la Colonne 8 donne l'intensité

d'essai de fond (%) avec la 1,10-phénanthroline.

Récapitulatif des résultats Comme on le voit sur le Tableau 2, l'utilisation de 18 jil d'un échantillon de sérum ictérique conduit à une forte intensité de fond allant jusqu'à 60 % du signal traceur final (voir colonne 7). L'intensité de fond de ces échantillons à grande intensité de fond subit une suppression presque complète (une forte réduction), jusqu'à une

réduction de 78 %, si l'on ajoute de la 1,10-phénanthroline (voir colonne 9).

Cependant, les échantillons ayant une intensité de fond supérieure à 32 %, et même avec addition de 1,10-phénanthroline (voir colonne 8, par exemple les trois derniers chiffres), donnent des taux de récupération du nordiazépam dans le sérum qui sont beaucoup trop faibles pour une analyse diagnostique. Si l'on se réfère à la Figure 6, les deux derniers chiffres, cela signifie que la quantité mesurée d'analyte est très inférieure à 100 %. D'une manière analogue, certains échantillons (voir de nouveau la colonne 6) donnent un taux de récupération de l'analyte dopé supérieur à 100 %. On observe aussi, bien que l'on ait une réduction de la fluorescence de fond, que l'on ne i 5 peut dans ces échantillons arriver à un taux de récupération analytique satisfaisant de

l'analyte en utilisant simplement de la 1,10-phénanthroline.

EXEMPLE 3

Récupération précise du nordiazépam à partir d'échantillons de sérum ictérique après addition d'acide naphtalène-1-sulfonique Echantillon: Des échantillons cliniques d'ictère sont dopés à 150 ng/ml de nordiazépam

avec une solution mère à 15 gg/ml.

Diluant:

1,25 % de dodécylsulfate de lithium, 20 % d'hydroxypropyl-13-

cyclodextrine, 0,2 % de 1,10-phénanthroline, avec et sans 0,85 % d'acide naphtalène-

1-sulfonique. Réactif anticorps

Anticorps polyclonal préparé contre le nordiazépam.

Réactif traceur:

Nordiazépam marqué à la fluorescéine.

Instrument: COBAS INTEGRA (Roche Diagnostic Systems, Inc., Branchburg,

N.J.).

Protocole sans acide naphtalène-l-sulfonique On place successivement dans une cuve 95 pl du réactif anticorps, 45 pl

du diluant échantillon sans acide naphtalène-l-sulfonique, et 14 pl de l'échantillon.

Après avoir mélangé et incubé pendant un bref laps de temps, on mesure l'intensité de fond. Puis on ajoute 20 pl du traceur, on incube le mélange pendant un bref laps de temps, et on mesure l'intensité d'essai final. Protocole avec 0.85 % d'acide naphtalène-1-sulfonique On place successivement dans une cuve 90 pl du réactif anticorps, 45 gl du diluant échantillon contenant 0,85 % d'acide naphtalène-l-sulfonique et 14 pl de l'échantillon. Après avoir mélangé et incubé pendant un bref laps de temps, on mesure l'intensité de fond. Puis on ajoute 20 pl du traceur, on incube le mélange pendant un

bref laps de temps, et on mesure l'intensité d'essai final.

Les résultats des mesures sont consignés ci-dessous dans le Tableau 3.

Tableau 3

1 2 1 3 4 5

Nordiazépam récupéré Nordiazépam récupéré Concentration de la bilirubine ( i f (mg/dl)(ns '(ngml) (c%') (mg/dl) Sans Avec Sans Avec

0 132 129..

166 138 126 106

181 141 137 109

* 139 * 107

* Résultat non-valable, en raison d'un fond élevé.

Le Tableau 3 présente le problème de la "surrécupération" de l'analyte dans un sérum humain normal qui a été dopé à la bilirubine. La bilirubine interfère avec la mesure et donne un résultat d'essai qui est supérieur à la teneur vraie de l'analyte dans l'échantillon. Ainsi, dans la colonne 4, la valeur obtenue pour l'analyte sans addition d'acide naphtalène-1-sulfonique est très supérieure à la valeur vraie connue, de 100 %. Par contraste, après addition d'acide naphtalène-l- sulfonique, le résultat de la mesure est manifestement plus près de la valeur vraie connue, qui est de

% (voir colonne 5).

EXEMPLE 4

Récupération précise du sécobarbital à partir d'échantillons de sérum ictérique après addition d'acide naphtalène-1-sulfonique Echantillon: Des échantillons cliniques d'ictère sont dopés à 1000 ng/ml de sécobarbital

avec une solution mère de 100 pg/ml.

Diluant échantillon:

1,25 % de dodécylsulfate de lithium, 20 % d'hydroxypropyl-3-

cyclodextrine, 0,2 % de 1,10-phénanthroline, avec et sans 0,85 % d'acide naphtalène- 1-sulfonique. Réactif anticorps: Anticorps polyclonal qui a été préparé contre du sécobarbital par des techniques connues. Dans les Exemples 4 et 5, l'anticorps est celui qui est actuellement utilisé dans le système de dosage du sécobarbital ONLINE de Roche

Diagnostic Systems.

Réactif traceur:

Sécobarbital marqué à la fluorescéine.

Instrument: COBAS INTEGRA Protocole sans l'acide naphtalène-l-sulfonique: On place successivement dans une cuve 95 "l du réactif anticorps, 45 Pul du diluant échantillon sans acide naphtalène-l- sulfonique, et 4 il d'échantillon. Après

mélange et incubation pendant un bref laps de temps, on mesure l'intensité de fond.

Puis on ajoute 20 jil du traceur, on incube le mélange pendant un bref laps de temps et

on mesure l'intensité d'essai final.

Protocole avec 0.85 % d'acide naphtalène-1-sulfonique On place successivement dans une cuve 90 gl du réactif anticorps, 45 gl du diluant échantillon contenant 0,85 % d'acide naphtalène-l-sulfonique, et 4 ml de l'échantillon. Après mélange et incubation pendant un bref laps de temps, on mesure l'intensité de fond. Puis on ajoute 20 gl du traceur, on incube le mélange pendant un

bref laps de temps et on mesure l'intensité d'essai final.

Les résultats de ces mesures sont consignés ci-dessous dans le Tableau 4.

Tableau 4

1 2 [ 3 4 2 5

S6cobarbital récupéré Concentration de récupéré Sécobarbital récupéré (%) bilirubine (mg/di) ( bilirubine (mg/dl) Sans Avec Sans Avec

0 960 991

955 1038 99 104

1130 1057 118 106

1192 1054 124 106

Le Tableau 4 présente aussi à titre d'exemple la correction, réalisée par utilisation d'acide naphtalène-1-sulfonique, de la "surrécupération" de l'analyte dans

les échantillons dopés.

EXEMPLE 5

Ensemble de réactifs pour le dosage des barbiturates sériques Barbiturates sériques. réactif anticorps. concentration des composants. pH 7.5. 0.1 M. Ingrédients: Tampon Tris 0,1 M pH 7,5 contenant 1 % d'éthylèneglycol, 0,056 % de protéine de fixation à la riboflavine, 0,09 % d'azoture de sodium et un sérum de

mouton préparé contre le sécobarbital, pour une dilution ou un titre approprié.

Barbiturates sériques. réactif traceur, concentration des composants. pH 8.0. 0.1 M. Ingrédients: Tampon phosphate 0,1 M pH 8, contenant 0,01 % de gamma-globuline bovine, 0,09 % d'azoture de sodium et un traceur, qui est du sécobarbital marqué à la fluorescéine. Concentration des composants du diluant. Ingrédients: 0,85 % d'acide naphtalène-1- sulfonique, 20 % du sel de sodium de l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine, 0, 20 % de 1,10-phénanthroline monohydratée, 1,25 % de dodécylsulfate de sodium, 0,09 % d'azoture de sodium.

Barbiturates sériques. étalons On prépare des étalons en dopant un sérum humain normal sans

médicament avec 0, 0,5, 1, 2 et 4 gig/ml de sécobarbital.

On lit la polarisation de fluorescence après incubation. Les valeurs lues de la polarisation changent et permettent de tracer une courbe étalon. Les échantillons inconnus sont soumis à l'essai d'une manière analogue, et on calcule en utilisant la courbe d'étalonnage la teneur en analyte, par exemple le barbiturate, la

benzodiazépine et analogues.

EXEMPLE 6

Ensemble de réactifs pour le dosage des benzodiazépines sériques Benzodiazépines sériques, réactif anticorps. concentration des composants. pH 7.5. 0.1 M. Ingrédients: Tampon Tris 0,1 M pH 7,5 contenant 1 % d'éthylèneglycol, 0,056 % de protéine de fixation à la riboflavine, 0,09 % d'azoture de sodium et un sérum de

mouton préparé contre la benzodiazépine à une dilution ou un titre approprié.

Benzodiazépines sériques. réactif traceur. concentration des composants pH 7.0. 0.1 M. Ingrédients: Tampon ACES 0,1 M à pH 7,0 contenant 1 % d'éthylèneglycol, 0,01 % de gamma-globuline bovine, 0,09 % d'azoture de sodium et un traceur, qui est constitué

de nordiazépam marqué à la fluorescéine.

Ingrédients du diluant: % d'acide naphtalène-l-sulfonique alpha, 20 % du sel de sodium de l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine, 0,20 % de 1,10phénanthroline monohydratée, 1,25

% de dodécylsulfate de lithium, 0,09 % d'azoture de sodium.

Benzodiazépines sériques étalons: On prépare des étalons dans un sérum humain normal en utilisant comme

décrit ci-dessus pour le sécobarbital 0, 25, 50, 100 et 200 ng/ml de nordiazépam.

Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-

dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et

d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour quantifier la quantité d'un analyte présent dans un échantillon d'essai, par une analyse immunologique par polarisation de fluorescence, caractérisé en ce que l'analyte, dans l'échantillon clinique ou dans un mélange de réactifs contenant ledit analyte, est mis en contact avec au moins un composé choisi dans le groupe comprenant la 1, 10-phénanthroline, la 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine,

l'acide naphtalène-l-sulfonique et leurs sels, et une combinaison quelconque de ceux-

ci.

2. Analyse immunologique par polarisation de fluorescence portant sur un analyte cible dans un échantillon d'essai avec une interférence de fond réduite, caractérisée en ce que l'échantillon clinique contenant l'analyte ou un mélange de réactifs contenant l'analyte, est mis en contact avec une quantité efficace d'au moins

un composé choisi dans le groupe comprenant la 1,1 0-phénanthroline, la 8-hydroxy-7-

iodo-5-quinoléine, l'acide naphtalène-l-sulfonique, leurs sels et une combinaison

quelconque de ceux-ci.

3. Analyse immunologique par polarisation de fluorescence portant sur un analyte cible dans un échantillon d'essai avec une récupération améliorée de l'analyte, caractérisée en ce que l'échantillon clinique contenant l'analyte ou un mélange de réactifs contenant l'analyte, est mis en contact avec une quantité efficace d'au moins

quelconque de ceux-ci.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en

ce que l'échantillon d'essai est un échantillon clinique choisi parmi le sérum, le plasma

et l'urine.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en

ce que le composé choisi est la 1,10-phénanthroline ou la 8-hydroxy-7iodo-5-

quinoléine.

6. Procédé selon les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les

composés choisis en combinaison sont l'acide naphtalène-l-sulfonique et la 1,10-

phénanthroline, ou l'acide naphtalène-l-sulfonique et la 8-hydroxy-7iodo-5-

quinoléine.

7. Utilisation d'au moins un composé choisi dans le groupe comprenant la

1,1 0-phénanthroline, la 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine, l'acide naphtalène- 1 -

sulfonique et leurs sels, pour réduire des interférences dans une analyse par

polarisation de fluorescence.

8. Utilisation d'au moins un composé choisi dans le groupe comprenant la

1,10-phénanthroline, la 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine, l'acide naphtalène-1-

sulfonique et leurs sels, pour améliorer la récupération de l'analyte dans une analyse

par polarisation de fluorescence.

9. Ensemble de réactifs pour mettre en oeuvre une analyse immunologique par polarisation de fluorescence pour quantifier un analyte dans un échantillon d'essai, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé choisi dans le groupe comprenant la 1,10-phénanthroline, la 8-hydroxy-7-iodo-5-quinoléine et

leurs sels, et éventuellement l'acide naphtalène-l-sulfonique.

10. Ensemble de réactifs selon la revendication 9, comprenant: 1) du dodécylsulfate de lithium en une quantité comprise entre environ 0,5 % et environ 2 %; 2) de l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine en une quantité comprise entre environ 10 % et environ 30 %; 3) de la 1, 10-phénanthroline en une quantité comprise entre environ 0,06 % et environ 0,25 %; et 4) l'azoture d'un métal alcalin, en une quantité comprise entre environ

0,09 % et environ 3,0 %.

11. Ensemble de réactifs selon la revendication 10, comprenant en outre de l'acide naphtalène-l-sulfonique en une quantité comprise entre environ 0,75 % et

environ 5 %.

12. Ensemble de réactifs selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce

que l'azoture d'un métal alcalin est l'azoture de sodium.

13. Ensemble de réactifs selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un réactif unique contenant environ 0,85 % d'acide naphtalène-l-sulfonique,

% du sel sodium de l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine, 0,20 % de 1,10-

phénanthroline monohydratée, 1,25 % de dodécylsulfate de lithium et 0,09 %

d'azoture de sodium.