ITMI981044A1 - Immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza perfezionato - Google Patents
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Description
La presente invenzione riguarda un metodo per ridurre l'intensità di fluorescenza di fondo o fluorescenza endogena e, pertanto, l'interferenza, e fare migliorare il recupero di analita, in immunosaggi di polarizzazione a fluorescenza. Una causa dell'intensità della fluorescenza di fondo è la presenza di bilirubina, legata con legame primario, in un campione di prova, per esempio un campione clinico, che viene analizzato per quantificare la concentrazione di un particolare analita bersaglio nel campione, per esempio, una sostanza fisiologicamente attiva oppure un composto fisiologicamente attivo (per esempio un farmaco terapeutico). Si è ora scoperto che, quando si aggiungono uno o più composti del gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina e acido naftalen-l-solfonico e loro sali (qui di seguito denominati 'ad-ditivi'), al campione ad una miscela di reagenti o ad una miscela di reagenti contenente 1'analita-bersaglio in un immunosaggio di polarizzazione a fluorescenza, l'intensità di base o fluorescenza viene efficace-mente ridotta. Inoltre, il recupero deii'analita è migliorato. La diminuzione delia fluorescenza di fondo ed il miglioramento nel recupero fanno aumentare il grado di precisione dei risultati ottenuti in saggi di polarizzazione a fluorescenza. Inoltre, il metodo della presente invenzione non influisce negativamente in nessun altro modo sulle caratteristiche di realizzazione del saggio di polarizzazione a fluorescenza.
In un immunosaggio di polarizzazione a fluorescenza (FPIA) si impiega un colorante fluorescente speciale, per esempio, un analita marcato con fluoresceina (denominato tracciante o coniugato della fluoresceina) per competere in un sistema di saggio omogeneo con un analita non marcato in un campione, per il legame ad un anticorpo specifico. Il principio dell 'immunosaggio di polarizzazione a fluorescenza è stato descritto da W.B. Dandliker e YS/23.04.98 G.A. Feigen, in 'Quantification of thè Antigen-Antibody Reaction by thè Polarization of Fluorescence', Biochem. Biophys. Res. Comm. 5:299 (1981). Il saggio si basa sul principio che, quando una piccola molecola di un analita marcato con fluoresceina non è legata, essa ruota liberamente ma, quando 1'analita marcato con fluoresceina è legato ad una molecola di anticorpo grande, la rotazione libera viene notevolmente limitata. Il grado di rotazione del tracciante è indicato inversamente dal valore della polarizzazione a fluorescenza che è un valore calcolato dall'intensità di fluorescenza orizzontale e verti-cale misurata dell'analita marcato con fluoresceina legato e libero, in soluzione. Il valore delia polarizzazione a fluorescenza (mP) viene determinato usando le intensità di fluorescenza polarizzata misurata nella seguente equazione:
Dapprima viene realizzata una curva standard usando il valore di polarizzazione di fluorescenza degli apparecchi di taratura, come descritto qui di seguito. Quando il valore di polarizzazione di fluorescenza del campione viene letto contro la curva standard si può determinare la concentrazione dell'analita.
Marcatori di fluoresceina sono ben noti nel
settore e tra essi sono compresi per esempio 5—[(4,6— diclorotriazin-2-ii-ammino ]fiuoresceina e fluoresceina isotiocianato.
È desiderabile rendere minima la fluorescenza di fondo nel saggio, il più. possibile, per ottenere un maggiore grado di precisione analitica. Si deve notare che, nel.tentativo di fare aumentare il grado di precisione, l'intensità della prova viene anche essa corretta con l'intensità di fondo nel calcolo del valore della polarizzazione di fluorescenza. Tuttavia, l'intensità di fondo può non rimanere sempre costante durante il periodo della misurazione. Quando l'intensità di fondo è relativamente bassa in confronto all'intensità del tracciante, il valore della polarizzazione di fluorescenza può non venire influenzato da un valore di intensità di fondo insignificante. Tuttavia, quando l'intensità di fondo iniziale, ossia, i valori di intensità Bh e Bv nella formula di cui sopra è elevata e/o instabile oppure variabile, ciò porta ad incoerenze nel calcolo finale. Più specificamente, le incoerenze possono influire in modo significativo sul calcolo finale della polarizzazione (mP) a causa del fatto che il valore di intensità di fondo iniziale, ossia Bh e Bv che viene usato per il calcolo finale, può differire dall'intensità di fondo finale o effettiva in corri-spondenza del tempo durante il quale si misura l'intensità della prova totale, ossia, Th e Tv. L'intensità della prova è costituita dal componente orizzontale e dal componente verticale dell'effettiva intensità di fondo e dell'intensità del tracciante in corrispondenza del momento nel quale si effettua la misurazione di un campione.
In un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza, tipicamente, si impiega una sorgente di luce avente la lunghezza d'onda compresa tra 475 nm e 495 nm per eccitare la miscela di reazione. Un analita marcato con fluoresceina all'atto dell'assorbimento deila luce emette luce in meno di 10 nanosecondi con una lunghezza d'onda compresa tra 505 e 530 nm.
Siero, plasma oppure urina possono emettere, di per sè, luce ad una lunghezza d'onda compresa tra 510 e 520 nm e, pertanto, possono interferire con la misurazione della polarizzazione di fluorescenza. L'interferenza può non essere limitata soltanto alla presenza di- bilirubina nei campioni. Campioni che hanno un basso contenuto di bilirubina possono contenere altri composti endogeni oppure esogeni che generano un'intensità di fondo di fluorescenza molto elevata/oppure emettono luce nell'intervallo di lunghezza d'onda compreso tra 510 e 520 nm. Tali campioni possono generare un'intensità di fondo ele-vata oppure un'intensità di fondo instabile e rendere non affidabili risultati ottenuti da saggi di pola-rizzazione di fluoresenza per applicazioni nel settore diagnostico o nei settore analitico.
Così, una diminuzione e/o una stabilizzazione dell'intensità di fondo in un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza è necessaria per ottenere risultati affidabili in applicazioni nel settore diagnostico o nel settore analitico.
L'influsso di diversi additivi sull'intensità di fondo e sul recupero dell'analita è stato preso in considerazione in immunosaggi, ivi compresi quelli aventi un fondo di fluorescenza elevato oppure instabile, allo scopo di realizzare un immunosaggio che possa dare un risultato accettabile per tutti i campioni clinici, per esempio, campioni di siero, di plasma oppure di urina. Vedi i brevetti U.S. N.
4.252.783 e 4.492.762.
Secondo la presente invenzione, si è ora scoperto che, quando almeno uno dei composti scelti dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina, acido naftalen 1-solfonico oppure loro sali, oppure una combinazione di questi composti, viene introdotto nella miscela di reazione contenente un analita in un saggio di polarizzazione di fluorescenza, il grado di precisione del saggio viene sostanzialmente fatto aumentare a causa di una diminuzione della fluorescenza di fondo e/o di un aumento di recupero dell'analita.
La presente.invenzione, così, riguarda un metodo per quantificare la quantità di un analita presente in un campione di prova mediante un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza, in cui l'analita nel campione clinico oppure una miscela di reagenti contenenti detto analita viene posto a contatto con almeno un composto scelto dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina, acido naftalen 1-solfonico e loro sali ed una loro qualsiasi combinazione.
La presente invenzione inoltre riguarda un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza per un analita-bersaglio in un campione di prova con una diminuita interferenza di fondo e/o un migliorato recupero di analita, in cui il campione clinico contenente un analita oppure una miscela di reagenti contenente 1'analita viene posto a contatto con una quantità efficace di almeno un composto scelto dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7iodo-5-chinolina, acido naftalen 1-solfonico, loro sali, ed una loro qualsiasi combinazione.
Il termine 'recupero' di un analita significa una accurata misurazione del vero valore di analita in un campione al quale 'è stata aggiunta' una quan-tità nota dell'analita ossia, il campione è 'inchiodato' con 1'analita. 'Recupero' di analita è un parametro significativo per valutare il grado di precisione globale di un saggio di polarizzazione di fluorescenza. Così, 'recupero' 100% significa che il saggio ha dato l'esatto valore della vera quantità di analita presente nel campione. Un valore inferiore a 100% significa che il saggio fornisce una indicazione in difetto della quantità di analita effettivamente presente nel campione. In modo analogo, un valore superiore a 100% indica che il saggio fornisce una indicazione in eccesso della quantità di analita presente nel campione.
Preferibilmente, i composti scelti in combinazione sono acido naftalen-l-solfonico e 1,10-fenantrolina oppure acido naftalen-l-solfonico e 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina .
I composti 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina e acido naftalen-l-solfonico formano loro corrispondenti sali tradizionali, per esempio, l’acido naftalen-l-solfonico forma, per esempio un saie di litio oppure un saie di sodio.
La presente invenzione inoltre riguarda una serie di reagenti per la realizzazione di un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza per la quantificazione di un analita in un campione di prova, in cui è compreso almeno un composto scelto dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-chinolina e loro sali e, eventualmente, acido naftalen-l-solfonico.
Detta serie di reagenti, opportunamente, comprende :
1) dodecil solfato di litio in quantità compresa tra circa 0,5% e circa 2%;
2) idrossipropil beta ciclodestrina in quantità compresa tra circa 10% e circa 30%;
3) 1,10-fenantrolina in quantità compresa tra circa 0,06% e circa 0,25%; e
4) azide di un metallo alcalino in quantità compresa tra circa 0,09% e circa 3,0%.
L'azide di un metallo alcalino, usualmente, è sodio azide.
La serie di reagenti, preferibilmente, comprende inoltre acido naftalen-l-solfonico in quantità compresa tra 0,75% e circa 5%.
Un reagente particolarmente interessante in tale serie di reagenti è un reagente singolo che contiene circa 0,85% di acido naftalen-l-solfonico, 20% di sale sodico delia idrossipropil beta ciclodestrina, 0,20% di 1,10-fenantrolina monoidrato, 1,25% di dodecil solfato di litio, e 0,09% di sodio azide.
Un tipico, saggio viene effettuato nel modo seguente:
Miscela di reagenti
Una miscela di reagenti secondo la presente invenzione, impiegata in un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza, tipicamente comprende i componenti A, B, C e D descritti qui di seguito.
ComponenteA:campione
Siero, plasma oppure urina da esaminare per la presenza di composti (analitì), per esempio, barbiturati oppure benzodiazepine.
Componente B: diluente
Dodecil solfato di litio in quantità compresa tra circa 0,5% e circa 2%; acido naftalen-l-solfonico in quantità compresa tra circa 0,75% e circa 5% o più (agente di miglioramento del recupero); 1,10-fenantrolina in quantità compresa tra 0,06% e circa 0,25% (sostanza che fa diminuire la fluorescenza di fondo); idrossipropil beta ciclodestrina in quantità compresa tra circa 10% e circa 30%; 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina (sostanza che fa diminuire la fluorescenza di fondo) in quantità compresa tra circa 0,06% e circa 0,25%; e una azide di un metallo alcalino, per esempio sodio azide in quantità compresa tra circa 0, 09% e circa 3,0%.
Componente C: reagente anticorpo
Antisieri di pecora anti-barbiturato di siero oppure antisieri di pecora anti-benzodiazepina di siero. Gli antisieri vengono stimolati nella pecora mediante metodi tradizionali ben noti a coloro che sono esperti nel settore.
Componente D; reagente tracciante
Barbiturato marcato con fluoresceina oppure benzodiazepina marcata con fluoresceina in un adatto tampone.
Apparecchiatura
COBAS® INTEGRA (Roche Diagnostic Systems, Ine., Branchburg, N.J.) oppure qualsiasi adatto apparecchio di analisi per effettuare un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza:
Protocollo per effettuare il saggio
In una vaschetta si introducono uno dopo l'altro un reagente anticorpo, un diluente ed un campione di siero di sangue, plasma oppure urina. Dopo miscelazione ed incubazione per un breve periodo di tempo (132 secondi sull'apparecchio COBAS® INTEGRA), si misura l'intensità di fondo. Quindi, si aggiunge il tracciante, si effettua l'incubazione della miscela ottenuta per un certo periodo di tempo (che, nel caso dell'apparecchio COBAS® INTEGRA, è tipicamente 90 secondi) e si effettua la misurazione dell'intensità di prova finale.
Determinazione di una curva standard
Si prepara una curva standard utilizzando concentrazioni standard di analita (come descritto qui di seguito negli esempi 5 e 6) allo scopo di determnare il contenuto di analita con riferimento alla curva standard.
Gli esempi che seguono servono ad illustrare ulteriormente differenti forme di realizzazione della presente invenzione.
L'invenzione verrà illustrata ulteriormente dalla figura 1, che è un grafico a barre che illustra la possibilità degli additivi descritti nell'esempio 1 di ridurre la fluorescenza di fondo del siero.
ESEMPIO 1
Diminuzione della fluorescenza del siero in campioni di siero itterico usando additivi dell'invenzione
Campione
Campioni di siero itterico clinici.
Diluenti
Diluente 1 - Controllo
Diluente 2:
Diluente 3:
Diluente 4:
Diluente 5 :
Reagente anticorpo
Si è stimolato un anticorpo policlonale contro Nordiazepam secondo procedimenti noti. Negli esempi 1-3, 1'anticorpo è quello usualmente incluso in Roche Diagnostic Systems' OLINE® Benzodiazepine assay.
Reagentetracciante
Nordiazepam marcato con fluoresceina.
Appare cc hia tu ra
COBAS® INTEGRA
Protocollo
90 μΐ di reagente anticorpo, 45 μΐ di diluente del campione e 14 μΐ di campione sono stati introdot
ti uno dopo l'altro in una vaschetta. Dopo miscelazione e incubazione per un breve periodo di tempo (tipicamente, circa 132 secondi), si è misurata l'intensità di fondo della miscela ottenuta. Quindi, si sono aggiunti 20 μΐ di tracciante, si è effettuata l'incubazione della miscela per un breve periodo di tempo (anche in questo caso tipicamente circa 90 secondi) e si è effettuata la misurazione dell'intensità di prova finale. Le misurazioni ottenute sono riportate qui di seguito nella tabella 1.
TABELLA 1
Riassunto dei risultati
Come indicato nella tabella 1 di cui sopra, il diluente 2 è molto efficace nel ridurre la fluorescenza di fondo. Ciò viene messo in evidenza dalla diminuzione dell'intensità di fondo/intensità di prova in confronto con il diluente i (il controllo).
In modo simile, il diluente 3 che è costituito dal controllo con l'aggiunta di 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina, è anch'esso molto efficace nel fare diminuire la fluorescenza del siero in confronto al diluente 1, .ed è perfino più efficace quando è combinato con acido naftalen-l-solfonico (diluente campione 5).
Il diluente 4, che è costituito dal controllo con l'aggiunta di 1,10-fenantrolina, è anch'esso molto efficace nel ridurre la fluorescenza di fondo, come messo in evidenza dalla diminuzione dell'intensità di fondo/intensità di prova anche in questo caso in confronto con il diluente 1.
I risultati riportati nella tabella 1 sono inoltre riassunti sotto forma di grafico nella figura i, con la condizione che nei risultati della figura 1, si impiega un ulteriore diluente, ossia controllo più 0,85% di acido naftalen-l-solfonico, che non viene riportato nella tabella 1.
ESEMPIO 2
Recupero di Nordiazepam da campioni itterici clinici dopo raggiunta di 1.10-fenantrolina
Campione
Campioni di siero itterico clinici sono stati 'in-chiodati' a 70 ng/mi di Nordiazepam usando uno stock di 7 pg/ml
Diluente
1% di dodecil solfato di litio, 15% di idrossipropil-p-ciclodestrina con oppure senza 0,15% di 1,10-fenantrolina (PAE).
Reagente anticorpo
Anticorpo policlonale stimolato contro Nordiazepam.
Reagente tracciante
Nordiazepam marcato con f luoresceina .
Apparecchiatura
COBAS® INTEGRA
Protocollo
95 μΐ di reagente anticorpo, 57 μΐ di diluente del campione e 18 μΐ di campione sono stati introdotti uno dopo l'altro in una vaschetta. Dopo miscelazione e incubazione per un breve periodo di tempo, si è misurata l'intensità di fondo della miscela. Quindi, si è effettuata l'aggiunta di 20 μΐ di tracciante, si è effettuata l'incubazione della miscela per un breve periodo di tempo e si è effettuata la misurazione dell'intensità di prova finale. Le misurazioni ottenute sono riportate nella tabella 2.
TABELLA 2
Effetto della 1,10-fenantrolina sul fondo di fluorescenza e su recupero deH’a (Nordiazepam) nel siero
* Diminuzione % nel fondo (colonna 9) = (Colonna 7 - Colonna 8) 100 ;Colonna 7 ;in cui la colonna 7 indica l'intensità di prova di fondo (%) senza 1,10-fenantrolina e la colonna 8 indica l'i 1,10-fenantrolina. ;Riassunto dei risultati ;Come indicato nella tabella 2 l'impiego di 18 μΐ di un campione di siero itterico ha generato un'intensità di fondo elevata fino a 60% del segnale del tracciante finale (vedi colonna 7). Le intensità di fondo di questi campioni con intensità di fondo elevata sono state soppresse (ridotte) in modo significativo fino ad una diminuzione 78% aggiungendo 1,10-fenantrolina (vedi colonna 9). Tuttavia, campioni con intensità di fondo superiore a 32% anche con l'aggiunta di 1,10-fenantrolina (vedi colonna 8, per esempio le ultime tre voci), hanno dato risultati per il recupero di Nordiazepam nel siero che erano inaccettabilmente bassi per un saggio diagnostico. Ciò significa, riferendosi alla colonna 6, ultime due voci, che la quantità misurata di analita era significativamente inferiore a 100%. In modo analogo, alcuni campioni (vedi anche colonna 6), hanno dato un iper-recupero di analita 'inchiodato' (recupero superiore a 100%). Inoltre, si deve notare che, mentre si è avuta una diminuzione nella fluorescenza di fondo, non si è potuto ottenere un soddisfacente recupero analitico dell'analita in questi campioni semplicemente usando 1,10-fenantrolina. ;ESEMPIO 3 ;Accurato recupero di Nordiazepam da campioni di siero itterico dopo l’aggiunta di acido naftalen- 1 -solfonico ;Campione ;Si sono 'inchiodati' campioni itterici clinici a 150 ng/ml di Nordiazepam usando uno stock di 15 μς/ιηί. Diluente ;1,25% di dodecil solfato di litio, 20% di idrossipropil-p-ciclodestrina, 0,2% di 1,10-fenantrolina con e senza 0,85% di acido naftalen-l-solfonico. ;Reagente anticorpo ;Anticorpo policlonale stimolato contro Nordiazepam. ;Reagente tracciante ;Nordiazepam marcato con fluoresceina. ;Apparecchiatura ;COBAS® INTEGRA ;Protocollo senza acido naftalen-l-solfonico ;95 μΐ di reagente anticorpo, 45 μΐ di diluente del campione senza acido naftalen-l-solfonico e 14 μΐ di campione sono stati introdotti uno dopo l'altro in una vaschetta. Dopo miscelazione e incubazione per un breve periodo di tempo, si è misurata l'intensità di fondo. Quindi, si sono aggiunti 20 μΐ di tracciante, si è effettuata l'incubazione della miscela per un breve periodo di tempo e si è effettuata la misurazione dell'intensità di prova finale. ;Protocollo con O.S5% di acido naftalcn- 1 -solfonico ;90 μΐ di reagente anticorpo, 45 μΐ di diluente del campione contenente 0,85% di acido naftalen-1-solfonico e 14 μί di campione sono stati introdotti uno dopo l'altro in una vaschetta. Dopo miscelazione ed incubazione per un breve periodo di tempo, si è misurata l'intensità di fondo. Si sono introdotti quindi 20 μΐ di tracciante, si è effettuata l'incubazione della miscela per un breve periodo di tempo e si è effettuata la misurazione dell’intensità finale della prova. ;I risultati di queste misurazioni vengono riportati qui di seguito nella tabella 3. ;;TABELLA 3 ;; ;;
* Risultato non valido a causa di un elevato fondo.
La tabella 3 illustra il problema di un 'iperrecupero' di analita in un siero umano normale che è
stato 'inchiodato' con bilirubina. La bilirubina interferisce con la misurazione e dà un risultato di prova che è superiore al vero contenuto dell'analita presente nel campione. Così, nella colonna 4, il valore di analita ottenuta senza l'aggiunta di acido naftalen-l-solfonico è sostanzialmente più elevato rispetto al valore vero noto di 100%. Invece, aggiungendo acido naftalen-l-solfonico, la misurazione che si ottiene è nettamente più vicina al valore vero noto di 100% (vedi colonna 5).
ESEMPIO 4
Accurato recupero di Secobarbital da campioni di siero itterico dopo raggiunta di acido naftalen- 1 -solforico
Campione
Campioni itterici clinici sono stati 'inchiodati' a 1000 ng/ml di Secobarbital usando uno stock di 100 pg/ml.
Diluente campione
1,25% di dodecil solfato di litio, 20% di idrossipropil-p-ciclodestrina, 0,2% di 1,10-fenantrolina con e senza 0,85% di acido naftalen-l-solfonico.
Reagenteanticorpo
Anticorpo policlonale che è stato stimolato contro Secobarbital secondo procedimenti noti. Negli esempi 4 e 5, 1'anticorpo è quello usualmente impiegato in Roche Diagnostic Systems' OLINE© Benzodiazepine assay.
Reagente tracciante
Secobarbital marcato con f luoresceina .
Apparecchiatura
COBAS® INTEGRA
Protocollo senza acido naftalen- 1 -solfonico
55 μΐ di reagente anticorpo, 45 μΐ di diluente del campione senza acido naftalen-l-solfonico e 4 μΐ di campione sono stati introdotti uno dopo l'altro in una vaschetta. Dopo miscelazione e incubazione per un breve periodo di tempo, si è misurata l'intensità di fondo. Quindi, si sono aggiunti 20 μΐ di tracciante, si è effettuata l'incubazione della miscela per un breve periodo di tempo e si è effettuata la misurazione dell'intensità della prova finale.
Protocollo con 0,85% di acido naftalen- 1 -solfonico
90 μΐ di reagente anticorpo, 45 μΐ di diluente campione contenente 0,85% di acido naftalen-l-solfonico e 4 μΐ di campione sono stati introdotti uno dopo l'altro in una vaschetta. Dopo miscelazione ed incubazione per un breve periodo di tempo, si è misurata l'intensità di fondo. Quindi, si sono aggiunti 20 μΐ di tracciante, si è effettuata l'incubazione della miscela per un breve periodo di tempo e si è effettuata la misurazione dell'intensità di prova finale.
I risultati di queste misurazioni sono riportati qui di seguito nella tabella 4.
TABELLA 4
La tabella 4 inoltre indica la correzione di ' iper-recupero ' di analita in campioni ' inchiodati ' mediante l'impiego di acido naftalen-l-solfonico.
ESEMPIO 5
Serie (oppure insieme) di reagenti per un'analisi di siero barbiturati Concentrazioni dei componenti reagenti anticorpo anti siero barbiturati pH 7.5. 0.1 M
Ingredienti
Tampone Tris 0,1 M, pH 7,5 contenente 1% di glicole etilenico, 0,056% di proteina che lega la riboflavina, 0,09% di sodio azide e siero di pecora stimolato contro Secobarbital ad un'adatta diluizione o ad un adatto titolo.
Concentrazioni del componente reagente tracciante di siero barbiturati pH 8.0. 0.1 M
Ingredienti
Tampone fosfato 0,1M, ph 8, contenente 0,01% di gamma globulina di bue, 0,09% di sodio azide ed un tracciante che è Secobarbital marcato con fluoresceina.
Concentrazione del componente diluente: ingredienti
0,85% di acido naftalen-l-solfonico, 20% di sale sodico della idrossipropil beta ciclodestrina, 0,20% di 1,10-fenantrolina monoidrato, 1,25% di dodecil solfato di litio, 0,09% di sodio azide.
Dispositivi di taratura di siero barbiturati (denominati anche Standard)
Si sono preparati dispositivi di taratura 'inchiodando' Secobarbital rispettivamente a 0, 0,5, 1, 2 e 4 pg/ml, in siero umano normale che non contiene farmaci .
Si è letta la polarizzazione di fluorescenza dopo incubazione. Le letture di polarizzazione variavano e hanno consentito la costruzione di una curva standard. Si sono esaminati campioni non noti in modo simile e si è calcolato il contenuto di analita, per esempio barbiturato, benzodiazepina e simili, utilizzando la curva standard.
ESEMPIO e
Serie (oppure insieme) di reagenti per il saggio di siero Benzodiazeipine Concentrazioni del componente reagente anticorpo anti siero benzodia2epine PH 7.5. 0, 1 M:
Ingredienti
Tampone Tris 0,1 M, pH 7,5 contenente 13⁄4 di etiien glicole, 0,056% di proteina che lega la riboflavina, 0,09% di sodio azide e siero di pecora stimolato contro Benzodiazepina ad un'adatta diluizione o ad un adatto titolo.
Concentrazioni del componente reagente tracciante di siero benzodiazepina. pH 7,0. 0.1 M
Ingredienti
Tampone ACES 0,IH a pH 7,0, contenente 1% di etilene glicole, 0,01% di gamma-globulina di bue, 0,09% di sodio azide ed un tracciante che è Nordiazepan marcato con fluoresceina.
Ingredienti del diluente
85% di acido naftalen-l-solfonico (alfa), 20% di sale sodico della idrossipropil beta ciclodestrina, 0,20% di 1,10-fenantrolina monoidrato, 1,25% di dodecil solfato di litio, 0,09% di sodio azide.
Elementi di taratura di siero Benzodiazepina
Si sono preparati elementi di taratura in siero umano normale a 0, 25, 50, 100 e 200 ng/ml come precedentemente descritto per Secobarbital.
Ing. Barzanò & Zanardo Milano S.p.A.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per determinare quantitativamente la quantità di un analita presente in un campione di prova mediante un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza, in cui l'analita, nel campione clinico oppure in una miscela di reagenti contenente detto analita, viene, posto a contatto con almeno un composto scelto dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina, acido naftalen-l-solfonico e loro sali e qualsiasi loro combinazione .
- 2. Immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza per un analita-bersaglio, in un campione di prova con una ridotta interferenza di fondo, in cui il campione clinico contenente 1’analita oppure una miscela di reagenti contenente 1'analita viene posto a contatto con una quantità efficace di almeno un composto scelto dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina, acido naftalen-l-solfonico, loro sali e qualsiasi loro combinazione.
- 3. Immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza per un analita-bersaglio in un campione di prova, con un migliorato recupero di analita, in cui il campione clinico contenente l’analita oppure una miscela di reagenti contenente l'analita viene posto a contatto con una quantità efficace di almeno un composto scelto dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina, acido naftalen-l-solfonico, loro sali ed una qualsiasi loro combinazione .
- 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui il campione di prova è un campioni clinico scelto da siero, plasma oppure urina .
- 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui il composto scelto è 1,10-fenantrolina oppure è 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina.
- 6. Metodo secondo le rivendicazioni da 1 a 4, in cui i composti scelti in combinazione sono acido naftalen-l-solfonico e 1,10-fenantrolina, oppure acido naftalen-l-solfonico e 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina .
- 7. Impiego di almeno un composto scelto dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina, acido naftalen-l-solfonico e loro salì, per ridurre l'interferenza di un saggio di polarizzazione di fluorescenza.
- 8. Impiego di almeno un composto scelto dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7iodo-5-chinolina, acido naftalen-l-solfonico e suoi sali per fare migliorare il recupero di analita in un saggio di polarizzazione di fluorescenza.
- 9. Serie di reagenti per effettuare un immunosaggio di polarizzazione di fluorescenza per la determinazione quantitativa di un analita in un campione di prova, che comprende almeno un composto scelto dal gruppo costituito da 1,10-fenantrolina, 8-idrossi-7-iodo-5-chinolina e loro sali e, eventualmente, acido naftaìen-l-solfonico.
- 10. Serie di reagenti secondo la rivendicazione 9 che comprende: 1) dodecil solfato di litio in quantità compresa tra circa 0,5% e circa 2%; 2) idrossipropil beta ciclodestrina in quantità compresa tra circa 10% e circa 30%; 3) 1,10-fenantrolina in quantità compresa tra circa 0,06% e circa 0,25%; e 4) azide di un metallo alcalino in quantità compresa tra circa 0,09% e circa 3,0%.
- 11. Serie di reagenti della rivendicazione 10 che comprende inoltre acido naftalen-l-solfonico in quantità compresa tra circa 0,75% e circa 5%.
- 12. Serie di reagenti secondo la rivendicazione 10 oppure 11, in cui l'azide di un metallo alcalino è sodio azide.
- 13. Serie di reagenti secondo la rivendicazione 12 che è un reagente singolo contenente circa 0,85% di acido naftalen-l-solfonico, 20% di sale sodico della idrossipropil beta ciclodestrina, 0,20% di 1,10-fenantrolina monoidrato, 1,25% di dodecil solfato, sale di litio e 0,09% di sodio azide.
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