ES2314624T3 - Metodo mejorado para el diagnostico del sindrome coronario agudo. - Google Patents
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Abstract
Un método para diagnosticar in vitro el síndrome coronario agudo en una persona utilizando como marcador o bien PAPP-A libre, definida como la proteína A plasmática asociada con el embarazo (PAPP-A) que no forma complejo con la proforma de la proteína básica mayor (proMBP), como tal, o en forma de una proporción - PAPP-A libre/PAPP-A total - PAPP-A libre/PAPP-A que forma complejo con proMBP, o - PAPP-A que forma complejo con proMBP/PAPP-A total.
Description
Método mejorado para el diagnóstico del síndrome
coronario agudo.
Esta invención se refiere a un análisis de
bioafinidad para la determinación cuantitativa en una muestra de
PAPP-A libre, definida como proteína A plasmática
asociada al embarazo (PAPP-A) que no forma complejo
con la proforma de la proteína básica mayor (proMBP). La invención
se refiere adicionalmente a un método para el diagnóstico del
síndrome coronario agudo en una persona utilizando
PAPP-A libre como marcador.
La proteína A plasmática asociada al embarazo
(PAPP-A) fue identificada primero a principios de
los 70 como un constituyente de elevado peso molecular encontrado
en suero de embarazo humano avanzado (1). La concentración en suero
aumenta con el embarazo a término (2). La PAPP-A fue
caracterizada inicialmente como un homotetrámero (1, 3), pero más
tarde se demostró que la PAPP-A circulante en el
embarazo era un complejo heterotetramérico 2:2 de 500 kDa unido por
puentes disulfuro con la proforma de la proteína eosinófila básica
mayor (proMBP), indicado como PAPP-A/proMBP (4).
Sin embargo, también se informó que el suero o plasma en el embarazo
contiene trazas (<10%) de PAPP-A que no forma
complejo (5).
PAPP-A y proMBP son producidas
ambas en la placenta durante el embarazo pero principalmente en
tipos de células diferentes. Mediante hibridación in situ,
se ha revelado que la inmensa mayoría de la PAPP-A
es sintetizada en el sincitiotrofoblasto, y toda la proMBP es
sintetizada en los citotrofoplastos extravellosos (6). Los análisis
del ADNc clonado demuestran que la subunidad de
PAPP-A es un polipéptido de 1547 restos (7).
Contiene un motivo de unión a cinc alargado, tres repeticiones
Lin-notch y cinco repeticiones consenso cortas
(8).
La ProMBP es un proteoglicano glicosilado
compuesto por un pro-fragmento de 90 restos
fuertemente ácidos y una forma madura de 117 restos altamente
alcalinos de MBP (9,10). La última es una proteína citotóxica
presente en los gránulos del leucocito eosinófilo (11). Esta es
liberada del leucocito eosinófilo mediante desgranulación, y juega
múltiples papeles en las funciones efectoras de estas células (12).
Aunque en los eosinófilos la MBP madura es generada mediante
procesamiento proteolítico de proMBP, ninguna evidencia indica que
MBP pueda ser generada a partir de la proMBP del complejo
PAPP-A/proMBP. En términos del papel de la proMBP en
el complejo PAPP-A/proMBP, existen estudios que
muestran que la proMBP actúa in vitro como un inhibidor de
proteinasa de PAPP-A (5,13). Además de
PAPP-A, la proMBP también forma un complejo
covalente con angiotensinógeno o C3dg del complemento (14). Pero la
función de la proMBP en otros complejos continúa siendo
desconocida.
Recientemente, se ha encontrado que
PAPP-A es una proteasa específica para la proteína
de unión a los factores de crecimiento de tipo insulina (IGF)
(IGFBP) -4 así como IGFBP-5 in vitro (15,16).
Notablemente, la escisión de IGFBP-4 se realiza de
una manera dependiente de IGF, mientras la escisión de
IGFBP-5 se realiza de una manera independiente de
IGF. Sin embargo, queda por identificar la función fisiológica de
PAPP-A in vivo. Los factores de crecimiento
de tipo insulina I y II (IGF-I y
IGF-II) juegan un importante papel en la promoción
de la diferenciación y proliferación celular en una variedad de
sistemas biológicos, mediado principalmente por el receptor IGF de
tipo I. Las actividades biológicas de IGF-I
y-II son moduladas por seis proteínas de unión a
IGF de alta afinidad homólogas, que se unen a los IGF y bloquean su
unión al receptor (17). La escisión de IGFBP-4
y-5 por PAPP-A ocasiona la
liberación del IGF unido, aumentando de ese modo el IGF bioasequible
para interacciones con los receptores de membrana de IGF.
Clínicamente, los niveles reducidos de
PAPP-A en suero están asociados con embarazos con
síndrome de Down (SD) (18). Como marcador, la
PAPP-A se utiliza ahora comúnmente para escrutar el
SD en el primer trimestre (19). Solo recientemente, se ha
demostrado que la PAPP-A está presente en placas
ateroscleróticas inestables (coronaria y carótida) (20,21), y que
sus niveles circulantes son elevados en pacientes con síndromes
coronarios agudos (SCA) (20,22). Además, la aparición de
PAPP-A en la circulación es un estratificador
independiente del pronóstico en pacientes con enfermedades
arteriales coronarias (23). Hasta ahora se sabe poco a cerca del
papel de la PAPP-A en las placas. Sin embargo, se ha
sugerido que el incremento de biodisponibilidad de IGF por medio de
la proteolisis de IGFBP-4 observado en el SCA juega
un papel crucial en el progreso tanto de la aterosclerosis coronaria
como de la restenosis (20,24).
Técnicamente, la capacidad para medir
PAPP-A en la circulación está íntimamente asociada
con la estructura de la molécula de PAPP-A. Es
particularmente importante que la estructura molecular de la
PAPP-A encontrada en la sangre de mujeres
embarazadas sea la misma que la encontrada en la sangre del paciente
con SCA. Hasta ahora no existe ningún informe que trate ésta
cuestión crítica. Y todos los análisis utilizados hasta la fecha
para la medición de la PAPP-A en ambas situaciones
se basan en los anticuerpos específicos para la subunidad
PAPP-A del complejo PAPP-A/proMBP
(20, 25, 26, 27). Desde un punto de vista metodológico, este hecho
hace la PAPP-A circulante en el embarazo
indistinguible de la del SCA.
La publicación WO 00/54806 hace referencia al
uso de PAPP-A como marcador para estados de
crecimiento focales en pacientes no embarazadas. Los ejemplos de
los estados que promueven el crecimiento mencionados son la
restenosis, la aterosclerosis, la ovulación, la curación de
heridas, la fibrosis y el cáncer. Se mencionaron tres métodos para
la detección del nivel de PAPP-A, a saber la
detección de la proteína PAPP-A, la detección del
mensaje de PAPP-A y la detección de la actividad de
PAPP-A:
Los autores de la invención describen que la
proteína PAPP-A puede ser detectada mediante
inmunoanálisis con anticuerpos específicos de
PAPP-A. En este documento, se midió la
PAPP-A mediante ELISA en el que se utilizaba un
anticuerpo policlonal específico para el complejo
PAPP-A/proMBP para la captura y se utilizaba
cualquiera de los 6 anticuerpos monoclonales
(234-2,234-3,
234-4,234-5, 234-6 y
234-7 de la página 28 del documento nombrado) o una
mezcla de anticuerpos monoclonales 234-2 y
234-5 (página 18 del documento nombrado) como
trazador. Los análisis detectan la PAPP-A total.
Asimismo mencionan la posibilidad de utilizar métodos normalizados
(página 6 del documento nombrado) para generar anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos que reconocen solamente la forma que no
forma complejo de PAPP-A y su uso en los análisis
para la medida de PAPP-A que no forma complejo. Sin
embargo, no pueden proporcionar un único anticuerpo que reacciona
específicamente con la PAPP-A libre. Además, es
evidente que no reconocen la importancia de la
PAPP-A libre en el SCA debido a que solamente
especulan acerca del uso potencial de un análisis de
PAPP-A que no forma complejo en un contexto
completamente diferente cuando establecen que la "Medición de la
PAPP-A que no forma complejo en suero de embarazo
tiene potencialmente un valor diagnóstico" (página 6 del
documento nombrado).
\vskip1.000000\baselineskip
Esto se refiere realmente a la detección del ARN
mensajero mediante análisis que utilizan la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR). Sin embargo, tales análisis no pueden
distinguir las moléculas de PAPP-A libres de las
moléculas de PAPP-A que forman complejo. Solamente
se pueden correlacionar generalmente con la cantidad de proteína
PAPP-A total e incluso aquí las relaciones
cuantitativas no son en absoluto simples ya que el ARNm mensajero
puede ser traducido con eficacias ampliamente variables y también
porque los ARN mensajeros son inherentemente inestables. La
formación de complejos es un evento
post-transcipcional y la secuencia del ARN
mensajero no contiene información capaz de distinguir entre las
formas de PAPP-A que forman complejo y que no forman
complejo.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de PAPP-A hace
referencia teóricamente a cualquier forma de PAPP-A
que sea enzimáticamente activa. Se espera que la
PAPP-A intacta que no forma complejo sea
enzimáticamente activa pero se sabe generalmente que muchas
proteasas si bien aparecen en forma libre pueden carecer todavía de
actividad enzimática debido p. ej., a que tienen escisiones
internas o representan una proforma de la proteasa (Chua BT, Guo K,
Li P., J. Biol. Chem. 2.000 Feb
18:275(7):5131-6; Borgoño CA, Michael IP,
Diamandis EP, Mol. Cancer Res. 2004
May:2(5):257-80; Wu et al., Prostate.
2004:58:345-53). La determinación de la actividad se
apoya fuertemente en la especificidad de los sustratos utilizados.
Se pueden diseñar inmunoanálisis para medir la
PAPP-A libre no importa si ésta es
proteolíticamente activa o no, mientras los análisis de proteasas
determinan solamente las formas proteolíticamente activas. En el
caso en el que la PAPP-A forma parcialmente un
complejo con proMBP, significando que solamente una subunidad de
proMBP forma complejo con dos subunidades de PAPP-A
(Overgaard MT et al., J. Biol. Chem. 2002;
275:31128-33), los análisis de actividad pero no los
inmunoanálisis pueden proporcionar resultados que llevan a
conclusiones erróneas. Importantemente, el valor clínico de la
PAPP-A en el SCA solamente ha sido revelado por
inmunoanálisis y no por análisis de la actividad de
PAPP-A. Los datos clínicos (incluyendo esta
solicitud de patente) para demostrar el valor de los análisis de
actividad en el SCA simplemente no existen. Además se conocen
análisis enzimáticos que son inherentemente menos sensibles que los
inmunoanálisis que emplean un diseño de análisis sándwich no
competitivo con un sistema informador de elevada actividad
específica. Los métodos para detectar los incrementos relacionados
con el SCA en la PAPP-A que no forma complejo
necesitan ser extremadamente sensibles y rápidos (debido a la
naturaleza aguda de la enfermedad) y los análisis de la actividad
enzimática pueden no satisfacer ninguno de estos requerimientos.
De este modo, la publicación de patente WO
00/54806 no ha proporcionado datos que muestren la relación entre
la PAPP-A y el SCA, ni menciona el papel y las
aplicaciones clínicas de la PAPP-A en el SCA. Estos
han descrito los métodos convencionales utilizados para originar
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos solamente para
la PAPP-A que no forma complejo, pero no han
fracasado al producir semejante anticuerpo con los métodos. La
detección del mensaje de PAPP-A mencionado no puede
distinguir la PAPP-A que no forma complejo de la
PAPP-A del complejo con proMBP. El análisis de las
proteasas por definición solamente detecta las formas
proteolíticamente activas de PAPP-A. Desde un punto
de vista teórico, éste no se iguala a la detección inmunológica de
PAPP-A que no forma complejo o libre. Por otra
parte, no se ha establecido en absoluto el uso del análisis de
proteasas en el SCA.
Aquí, los autores de la presente invención
proporcionan, por primera vez, datos que muestran que la molécula
de PAPP-A circulante en el embarazo es diferente de
la de SCA. Estos descubrimientos tienen importantes implicaciones
clínicas para la detección más temprana y más específica de la
PAPP-A relacionada con la aterosclerosis en la
circulación.
El objeto de esta invención es proporcionar un
método más sensible y específico para diagnosticar individuos en
riesgo de síndrome coronario agudo en una fase temprana.
Concretamente, el propósito es lograr un método de diagnóstico
superior al análisis utilizado comúnmente basado en la troponina I
cardíaca y al análisis basado en el uso de la PAPP-A
total como marcador.
De este modo, de acuerdo con un aspecto, esta
invención se refiere a un método de diagnóstico in vitro del
síndrome coronario agudo en una persona utilizando como marcador o
bien la PAPP-A libre, definida como la proteína A
plasmática asociada con el embarazo (PAPP-A) que no
forma complejo con la proforma de la proteína básica mayor (proMBP),
como tal o en forma de una proporción
- -
- PAPP-A libre/PAPP-A total,
- -
- PAPP-A libre/PAPP-A que forma complejo con pro MBP, o
- -
- PAPP-A que forma complejo con proMBP/PAPP-A total.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con otro aspecto, la invención se
refiere a un método de análisis de bioafinidad para la determinación
cuantitativa en una muestra de la PAPP-A libre,
definida como la proteína A plasmática asociada con el embarazo
(PAPP-A) que no forma complejo con la proforma de la
proteína básica mayor (pro-BMP), donde la
PAPP-A libre se determina
- i)
- como la diferencia calculada entre la PAPP-A total medida y la PAPP-A que forma complejo con proMBP medida, o
- ii)
- mediante un método de análisis de bioafinidad directo que mide solamente la PAPP-A libre, elaborando PAPP-A que forma complejo con proMBP incapaz de participar en la reacción de bioafinidad en la cual la muestra está expuesta a un conector que se une a la PAPP-A total.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra un mapa epitópico
esquemático del complejo PAPP-A/proMBP. Los círculos
solapantes indican una no posible formación de sándwich. Los
círculos en contacto indican una formación de sándwich dificultada.
Los círculos separados indican epítopos independientes. Los Mab que
definen los epítopos accesibles solamente en proMBP están marcados
con círculos gruesos, mientras los Mab que definen epítopos
accesibles en PAPP-A están marcados con círculos
finos.
La Figura 2 muestra curvas de calibrado y
perfiles de imprecisión para el análisis T (análisis T = análisis
para la PAPP-A total) configurado con dos
anticuerpos monoclonales específicos para la subunidad
PAPP-A (A1/B4) y el análisis C (análisis C =
análisis para la PAPP-A que forma complejo con
proMBP) realizado a partir de un anticuerpo monoclonal específico
para la subunidad proMBP para la detección y un anticuerpo
monoclonal específico para la subunidad PAPP-A para
la captura (A1/A11). Se utilizaron cuatro réplicas para cada
concentración. Las curvas con los caracteres rellenos hacen
referencia a los recuentos y las curvas con los caracteres abiertos
hacen referencia a la concentración de CV.
La Figura 3 muestra la filtración en gel de una
muestra de suero del primer trimestre en una columna de precisión
Superose® 6 (PC3. 2/30). Se detectó PAPP-A por medio
del análisis T, y por medio del análisis C. El
PAPP-A/proTMB eluyó en forma de un único pico en la
posición en la que eluía la tiroglobulina (669 kDa).
La Figura 4 muestra la cinética de
PAPP-A en suero para pacientes con SCA. La
PAPP-A se detectó por medio del análisis T, y por
medio del análisis C.
La Figura 5 muestra la comparación mediante
filtración en gel de 4 sueros de SCA con dos muestras de suero del
primer trimestre en una columna de precisión Superpose® 6
(PC3.2/30). Se detectó PAPP-A por medio del análisis
T. La PAPP-A de SCA eluyó en forma de un único pico
en la posición en la que eluía la apoferritina (481 kDa).
La Figura 6 muestra la comparación mediante
filtración en gel de 1 muestra de suero de SCA (caracteres rellenos)
con 1 muestra de suero del primer trimestre (caracteres abiertos) en
una columna de precisión Superpose® 6 (PC3.2/30). La
PAPP-A se detectó por medio del análisis T.
La Figura 7A muestra la PAPP-A
en 3 muestras de suero normales (indicadas como S1, S2 y S3) antes y
después del tratamiento de adsorción con mabA1. La Figura 7B
muestra la PAPP-A en 2 muestras de suero de SCA
(indicadas como SCA1 y SCA2) antes y después del tratamiento de
adsorción con mabA1.
\newpage
La Figura 8A muestra la PAPP-A
en 3 muestras de suero normales (indicadas como S1, S2 y S3) antes y
después del tratamiento de adsorción con mabA11. La Figura 8B
muestra la PAPP-A en 2 muestras de suero de SCA
(indicadas como SCA1 y SCA2) antes y después del tratamiento de
adsorción con mabA11. Los niveles de PAPP-A se
midieron por medio del análisis T.
La Figura 9 muestra la filtración en gel de 4
muestras de suero de SCA (indicadas como S1, S2, S3 y S4) y una
muestra de suero del primer trimestre en una columna de precisión
Superpose® 6 (PC3.2/30). Las fracciones se analizaron utilizando el
análisis C.
La Figura 10 ilustra el gráfico de caja y
bigotes que muestra las distribuciones de las concentraciones de
PAPP-A y los valores de delta (definidos como la
diferencia entre los valores de PAPP-A obtenidos por
medio del análisis T y el análisis C) en sujetos normales. Gráfico
1, concentraciones de PAPP-A determinadas por medio
del análisis T. Gráfico 2, concentraciones de PAPP-A
determinadas por medio del análisis C. Gráfico 3, valores de Delta
derivados de las concentraciones de PAPP-A medidos
por medio de los dos análisis. Las cajas indican los percentiles
25º-75º; indicando los bigotes los percentiles 5º y 95º. Todos los
valores por encima del percentil 95º y por debajo del percentil 5º
se trazan como *. Las líneas horizontales indican las medianas; y
las cajas sombreadas indican las medias.
La Figura 11 muestra la aplicación de los
valores de delta (líneas con círculos abiertos) en pacientes con SCA
en comparación con el uso de concentraciones de
PAPP-A total (líneas con círculos rellenos). Los
valores de delta y el límite de decisión relevante se normalizan de
acuerdo con el límite de referencia superior del 97,5% para
concentraciones de PAPP-A total. La línea
discontinua indica el límite de decisión tanto para los valores de
delta como para las concentraciones de PAPP-A
total.
Se debe interpretar que el término
"PAPP-A libre" incluye cualquier
PAPP-A que no forma complejo con la preforma de la
proteína básica mayor (proMBP). De este modo, la
"PAPP-A libre" incluirá la
PAPP-A absolutamente libre así como la
PAPP-A unida a cualquier sustancia excepto
proMBP.
Se debe interpretar que el término
"conector" incluye especialmente anticuerpos y sus fragmentos
(opcionalmente diseñados genéticamente), aptámeros y conectores
derivados de armazones de proteínas, tales como aficuerpos (en
inglés "affibodies") o fluorocuerpos (en inglés
"fluorobodies"). No obstante, el término "conector" no
está restringido a los ejemplos anteriormente mencionados. Se debe
entender que cualquier conector útil en un análisis de bioafinidad
está abarcado por la definición.
De acuerdo con una realización preferible, la
PAPP-A libre se determina como la diferencia
calculada entre la PAPP-A total medida y la
PAPP-A que forma complejo con proMBP medida.
Esta alternativa se puede realizar, por ejemplo,
mediante el uso de dos análisis separados, donde una alícuota de la
muestra se expone a un conector que une la PAPP-A
total y el conector es detectado para dar la PAPP-A
total. Otra alícuota de la muestra se expone a un conector que une
solamente la PAPP-A que forma complejo con proMBP.
El conector se detecta para dar la PAPP-A que forma
complejo con proMBP. Finalmente, la cantidad de
PAPP-A libre se calcula como la diferencia entre la
PAPP-A total determinada y la PAPP-A
que forma complejo con proMBP. Los dos análisis pueden ser análisis
competitivos, o más preferiblemente análisis sándwich no
competitivos, donde los conectores específicos son o bien conectores
de captura o bien conectores de detección (marcados).
Alternativamente, se puede medir la
PAPP-A libre y la PAPP-A que forma
complejo con proMBP en un único análisis de analitos dual. Se puede
exponer la muestra a un conector de captura, que se une a la
PAPP-A total, y a dos conectores de detección
marcados con etiquetas diferentes, de manera que el primer conector
de detección marcado con la primera marca está dirigido a un
epítopo presente en cualquier molécula de PAPP-A,
donde la señal de la primera marca se utiliza para dar la
PAPP-A total. El segundo conector de detección
marcado con una segunda marca está dirigido a un epítopo de la
subunidad proMBP de la molécula, donde la señal de la segunda marca
se utiliza para dar exclusivamente la PAPP-A que
forma complejo con proMBP.
Se debe entender que la palabra "epítopo de la
subunidad proMBP de la molécula" abarca los epítopos solamente
en dicha subunidad proMBP así como los epítopos que están
parcialmente localizados en la subunidad proMBP y parcialmente en
otra parte de la molécula de PAPP-A. De este modo,
también se puede medir específicamente la PAPP-A
que forma complejo con proMBP por medio de conectores que reaccionan
solamente con epítopos que están localizados parcialmente en la
subunidad proMBP y parcialmente en otra parte de la molécula de
PAPP-A.
No estando incluido en esta invención se puede
determinar la PAPP-A libre por medio de un análisis
de bioafinidad directo que mide solamente la PAPP-A
libre. Esto se puede realizar exponiendo la muestra a un anticuerpo
(incluyendo fragmentos de anticuerpo tales como Fab y fragmentos de
cadena variable sencilla (scFv)) u otro conector que se une a la
PAPP-A libre pero no a la PAPP-A que
forma complejo con proMBP y detectando el anticuerpo u otro
conector para dar la PAPP-A libre. Semejante
anticuerpo u otro conector podría, por ejemplo, ser originado para
un epítopo de PAPP-A que se encuentra solamente
disponible en las moléculas no unidas a proMBP, por ejemplo en la
región de aminoácidos 381 a 652. Se puede originar un anticuerpo
policlonal específico para la PAPP-A libre
inmunizando un animal anfitrión tal como un conejo u oveja con
PAPP-A libre y un coadyuvante inmunitario. Aunque
se puede obtener un anticuerpo monoclonal específico para la
PAPP-A libre utilizando la tecnología del hibridoma
y el mismo inmunógeno (aquí el animal anfitrión para la inmunización
es normalmente un ratón). Adicionalmente, se puede generar un
anticuerpo o sus fragmentos tales como Fab y fragmentos variables de
cadena sencilla (scFv) específicos para la PAPP-A
libre utilizando la presentación en fagos a partir de una genoteca
de anticuerpos sintéticos o vírgenes. La PAPP-A
libre puede estar disponible a partir de placas de SCA o de
PAPP-A de embarazo que está libre de proMBP o de la
expresión recombinante de una secuencia de ADN que codifica la
PAPP-A.
De acuerdo con otra realización preferible, el
análisis de bioafinidad que mide solamente la PAPP-A
libre se podría realizar elaborando una PAPP-A que
forma complejo con proMBP no capaz de participar en la reacción de
bioafinidad en la cual se expone la muestra a un anticuerpo u otro
conector que se une a la PAPP-A total. Existen dos
enfoques para lograr este objetivo. Uno hace referencia al uso de la
adsorción como ya se ha demostrado en la Figura 8B, la
PAPP-A que no forma complejo con proMBP se separa en
una etapa precedente mediante adsorción con mAb11, que después
permite la medida de la PAPP-A libre. El otro hace
referencia al uso de una estrategia de bloqueo en la cual se
bloquea el acceso para cierto anticuerpo específico de la subunidad
PAPP-A u otro conector a su epítopo debido a la
unión de un anticuerpo reactivo con proMBP/otro conector esté
transformado con un grupo especial o no. El bloqueo puede tener
lugar en una etapa precedente o simultáneamente al análisis. De este
modo, la PAPP-A libre también se puede medir
eficazmente.
La invención se aclarará por medio de la
siguiente Sección Experimental no restrictiva.
\vskip1.000000\baselineskip
El quelato fluorescente
ITC-TEKES Eu3+ de
4-[2-(4-isotiocianatofenil)etinil]-2,6-
bis[N,N-bis(carboximetil)amino]metil}piridina
y el isotiocianato de biotina (BITC) se obtuvieron de Innotrac
Diagnostics Oy. El tampón de análisis DELFIA y la solución de
lavado se prepararon como se ha descrito previamente (28). El tampón
de análisis con un suplemento de IgG de ratón desnaturalizada al
0,01% e IgG de ratón nativa al 0,02% fue referido como tampón de
análisis modificado. Las tiras de microtitulación Maxisorp de 12
pocillos de baja fluorescencia (ultravioleta extinguido) se
adquirieron de NUNC.
Los pocillos individuales y las tiras
recubiertos con estreptavidina fueron obtenidos de Innotrac
Diagnostics Oy. La seralbúmina bovina (BSA) se adquirió de
Intergen. Las columnas NAP-5® y
NAP-1® fueron de Pharmacia Biotech. Todos los demás
productos químicos utilizados fueron de calidad analítica.
Seis anticuerpos monoclonales indicados como
mabB 1, 2, 3, 4, 5, y 6, específicos para el complejo
PAPP-A/proMBP, fueron donaciones del Dr. Michael
Christiansen del State Serum Institute, Dinamarca. Otros once
anticuerpos monoclonales indicados como mabA 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, y 11, también específicos para el complejo
PAPP-A/proMBP, fueron donaciones de la Dra. Maria
Severina de HyTest Oy, Finlandia.
Los calibradores se prepararon diluyendo una
reserva filtrada (a través de un filtro con un tamaño de poro de
0,22 \mum) de diez sueros de embarazo en el tercer trimestre que
contenían 60 g/L de seralbúmina bovina, 50 mmoles/L de
Tris-HCl (pH 7,75), 15 mmoles/L de NaCl, y 0,5 g/L
de NaN3, y se calibraron frente a IRP WHO derivadas de suero
reunido de embarazo en el tercer trimestre 78/610 para las proteínas
asociadas al embarazo (WHO International Laboratory for Biological
Standards, Statens Serum Institut, Copenague, Dinamarca). Los
niveles de PAPP-A y proMBP se expresaron en
miliunidades por litro. Los calibradores se almacenaron a -20ºC
hasta su uso.
Ocho pacientes (4 hombres de 57\pm5 años y 4
mujeres de 81\pm3 años) con SCA tuvieron dolor prolongado en el
pecho acompañado por elevación de ST y niveles anormalmente elevados
de CKMB y cTn I. De estos pacientes, se tomaron muestras de suero
en la admisión en el Departamento de Cardiología, Turku University
Central Hospital y a las 1, 2, 4, 6, 24, 48 y 72 horas. Además, se
incluyeron en este estudio 2 muestras de suero del primer trimestre
(edad gestacional: 9 y 11 semanas). Todas las muestras de suero se
obtuvieron con consentimiento informado. Los procedimientos
seguidos estuvieron de acuerdo con la declaración de Helsinki de
1975 revisada en 1996. Todas las muestras se almacenaron a -20ºC
(muestras de embarazo) o a -70ºC (muestras de SCA) antes de la
medida.
Se utilizó quelato de europio intrínsecamente
fluorescente para el marcaje de los anticuerpos (29). Las reacciones
de marcaje se realizaron como se ha informado previamente (25).
Brevemente, se marcó el anticuerpo durante la noche
(16-20 h) a la temperatura ambiente con un exceso
molar de 100 veces de quelato en 50 mmoles/L de tampón carbonato de
sodio (pH 9,6). Los anticuerpos marcados se separaron del quelato
libre en exceso y las proteínas agregadas en una columna de
filtración en gel Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech, Suecia)
que funciona con 50 mmoles/L de Tris-HCl (pH 7,75),
15 mmoles/L de NaCl, 0,5 g/L de NaN_{3} a 25 mL/h. Se recogieron
fracciones de 0,45 mL. Las fracciones que contenían anticuerpo
marcado se reunieron, y se determinó el grado de marcaje con una
solución de calibrado de europio. Los grados de marcaje de los
anticuerpos estuvieron entre 5 y 15 de quelatos de Eu^{3+} por
molécula de IgG.
La biotinilación de los anticuerpos se realizó
con un exceso molar de 50 veces de
biotina-isocianato en 50 mmoles/L de tampón
carbonato de sodio (pH 9,6) a la temperatura ambiente durante 3
horas. El anticuerpo biotinilado se separó del reactivo de
biotinilación libre haciendo pasar la mezcla de reacción a través de
columnas NAP-5 y NAP-1 (Amersham
Biosciences AB) con 50 mmoles/L de Tris-HCl (pH
7,75), 15 mmoles/L de NaCl, 0,5 g/L de NaN3 como eluyente. Se
añadió BSA a una concentración final de 1 g/L, y la solución se
filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 \mum y
se almacenó a 4ºC.
Todos los anticuerpos contra el complejo
PAPP-A/proMBP se sometieron a ensayo por pares
utilizando cada uno como anticuerpo de captura o de detección. Se
utilizó un formato de análisis sándwich de una etapa junto con 100
mUI/L de calibrador de PAPP-A y una solución blanco.
El procedimiento utilizado fue similar al descrito antes (30).
Brevemente, se añadieron 10 \muL de calibrador de
PAPP-A o solución blanco y 100 ng de anticuerpo
marcado con Eu^{3+} en 20 \muL de tampón de análisis, por
triplicado, a pocillos recubiertos directamente con 0,4 \mug de
anticuerpo. La incubación posterior se realizó a 37ºC durante 10
minutos y 60 minutos con movimiento oscilatorio (900 rpm,
Incubadora/Aparato de movimiento oscilatorio iEMS, Labsystems Oy,
Finlandia). Después de eso, los pocillos se lavaron seis veces y se
secaron con una corriente de aire caliente durante 5 minutos;
después se midió la fluorescencia con un contador Victor 1420
Multilabel (Perkin-Elmer Life Sciences, Wallac Oy,
Finlandia).
Se utilizaron dos inmunoanálisis en este
estudio. Uno indicado como análisis T, configurado con el mabA1
biotinilado y mabB4 marcado con europio; y el otro indicado como
análisis C, configurado con el mabA1 biotinilado y mabA11 marcado
con europio, se llevaron a cabo en un formato de análisis de
microplaca convencional con la Incubadora/Aparato de Movimiento
Oscilatorio iEMS. Para ambos análisis, primero, se inmovilizó el
mabA1 biotinilado sobre la superficie de pocillos de
microtitulación recubiertos con estreptavidina incubando 300 ng de
mab A1 biotinilado en 50 \muL de tampón de análisis DELFIA por
pocillo durante 60 minutos a RT con movimiento oscilatorio lento.
El anticuerpo biotinilado no unido se separó lavando los pocillos.
Después, para el análisis T, se añadieron 10 \muL de calibrador o
muestra y 200 ng de mabB4 marcado con Eu^{3+} en 20 \muL de
tampón de análisis modificado por pocillo. Los pocillos se
incubaron durante 30 minutos a 37ºC con movimiento oscilatorio lento
y se lavaron 6 veces. Después de eso, los pocillos se secaron
durante 5 minutos y la fluorescencia del europio resuelta con el
tiempo se midió directamente de la superficie seca con el contador
Victor® 1420 Multilabel. Las concentraciones de las muestras
desconocidas se obtuvieron calibrando sus señales de fluorescencia
frente a una curva de calibración derivada de los pocillos del
calibrador por medio del programa de inmunoanálisis MultiCalc
(Perkin-Elmer Life Sciences, Wallac Oy, Finlandia)
con el uso de un algoritmo spline sobre datos transformados
logarítmicamente. Para el análisis C, se añadieron 10 \muL de
calibrador o muestra y 20 \muL del tampón de análisis modificado
a cada pocillo. Los pocillos se incubaron durante 30 minutos a 37ºC
con movimiento oscilatorio lento, y se lavaron dos veces. Después,
se añadieron 300 ng de mabA11 macado con Eu^{3+} en 30 \muL del
tampón de análisis modificado por pocillo, y los pocillos se
incubaron durante 30 minutos a 37ºC con movimiento oscilatorio
lento, y se lavaron 6 veces. Las siguientes etapas fueron las mismas
que para el análisis T.
Ésta se llevó a cabo en una columna de precisión
Superose® 6 (3,2 x 300 mm) PC3.2/30 (Pharmacia Biotechnology,
Suecia) equilibrada y eluida con 50 mmoles/L de tampón fosfato de
sodio, pH 7,0, que contenía 0,15 moles/L de NaCl, y NaN_{3} al
0,02% a una velocidad de flujo de 0,04 mL/min. Se cargaron 50 \muL
de la muestra (suero diluido 1:2 en tampón de elución y filtrado a
través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 \mum). El
eluyente de la columna se controló a 280 nm, y después de 0,6 ml de
elución inicial, se recogieron fracciones de 100 \muL. El tiempo
de recorrido total fue de 75 min. La columna se hizo funcionar a
10ºC en un sistema SMART de Pharmacia (Pharmacia Biotechnology,
Suecia) y se calibró con las siguientes proteínas: Tiroglobulina
(669 kDa), Apoferritina (481 kDa), Inmunoglobulina G (160 kDa),
Seralbúmina bovina (67 kDa), Quimotripsinógeno A (25 kDa) y
Ribonucleasa A (13,7 Kda). Tanto los especímenes de suero de
embarazo en el primer trimestre como las muestras de suero de SCA
fueron fraccionados mediante cromatografía de filtración en gel.
Ésta se realizó mediante el uso de pocillos de
microtitulación recubiertos con estreptavidina y mabA1 biotinilado
o A11 biotinilado. Se añadieron 30 \muL de muestra de suero a cada
pocillo en el que ya se habían inmovilizado 300 ng de bioA1 o 400
ng de bio-mabA11 sobre la superficie. Para bioA1, se
llevó a cabo la incubación a RT durante 1 h con movimiento
oscilatorio lento. Después de eso, se aplicaron 10 \mul de suero
tratado tomado de cada pocillo a los inmunoanálisis anteriores para
la medida de la PAPP-A. Para bioA11, la incubación
se llevó a cabo a la RT durante 1 h con movimiento oscilatorio
lento, después se transfirió la muestra de suero a otro pocillo
recubierto y la incubación siguió durante 1 h. Después de eso, se
repitió la etapa de transferencia e incubación hasta que se realizó
la tercera incubación.
Finalmente, se aplicaron 10 \mul de suero
tratado a los inmunoanálisis anteriores para la medida de la
PAPP-A.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis estadístico se realizó utilizando
StatView (SAS Institute, Cary, USA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un mapa epitópico esquemático
mostrado en la Figura 1 de acuerdo con los datos obtenidos de cada
posible combinación de dos sitios de los anticuerpos. Las relaciones
de la localización de cada anticuerpo se determinaron basándose en
si la unión de un anticuerpo podría permitir o interferir la unión
independiente de otro anticuerpo. Se había demostrado previamente
que de los 17 mab, B1, 2, 3, y 4 eran específicos para la unión a
la subunidad PAPP-A del complejo
PAPP-A/proMBP, mientras B5 y B6 eran reactivos con
la subunidad proMBP del complejo PAPP-A/proMBP (5,
31). MabA11 fue capaz de formar sándwiches con todos los demás mab
excepto mabB5 y B6, indicando que debería reaccionar con la
subunidad proMBP del complejo PAPP-A/proMBP. Del
resto de los 14 anticuerpos reactivos con la subunidad
PAPP-A del complejo PAPP-A/proMBP,
dos anticuerpos (A10 y B4) no compartieron sus epítopos con otros
anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las curvas de calibrado de los dos análisis
mostradas en la Figura 2 se obtuvieron con un material normalizado
derivado de una reserva de sueros de embarazo en el tercer
trimestre. Ambas curvas fueron lineales a lo largo de las
concentraciones que oscilaban entre 1,0 mUI/L a 300 mUI/L. Para el
análisis T, la imprecisión del análisis fue baja con una
concentración intra-análisis CV de menos de 10 sobre
el intervalo de 1,0 mUI/L a 300 mUI/L. Para el análisis C, la
imprecisión del análisis estuvo por encima de 20% a 1,0 mUI/L y por
debajo de 15 a lo largo del intervalo de 3,0 mUI/L a 300 mUI/L. Más
importantemente, ambas curvas de calibrado fueron paralelas entre
sí, indicando que la PAPP-A en el material
normalizado es detectada igualmente por medio de los dos
análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fraccionó una muestra de suero del primer
trimestre mediante cromatografía de exclusión por tamaños y las
fracciones se analizaron por medio de los dos inmunoanálisis. La
PAPP-A del embarazo revelada por los dos análisis
en forma de un único pico eluyó en la misma posición en la que eluyó
la tiroglobulina (669 kDa) (mostrada en la Figura 3). Además, los
dos picos obtenidos por los dos análisis se solaparon totalmente
entre sí.
Las concentraciones de PAPP-A
medidas mediante el análisis T fueron ligeramente superiores a las
medidas mediante el análisis C.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron los niveles de
PAPP-A en muestras de suero seriadas de 4 pacientes
con SCA mediante los dos análisis. Utilizando el análisis T, se
observaron niveles de PAPP-A por encima del nivel de
referencia de 5,68 mUI/L (22) en los 4 pacientes en diferentes
momentos después del comienzo del dolor de pecho (mostrado en la
Figura 4). Aunque el grado de incremento máximo en los niveles de
PAPP-A era variado, aparecía un marcado incremento
en los niveles de PAPP-A en los 4 pacientes con SCA
tempranamente en las 2 horas después del comienzo del dolor de
pecho. Utilizando el análisis C, no se encontró un incremento
significativo en los niveles de PAPP-A en estos 4
pacientes, en los que las concentraciones de PAPP-A
estuvieron por debajo de 4 mUI/L para todas las muestras de suero.
Los resultados muestran que la PAPP-A específica de
SCA presente en la circulación no es detectable por el anticuerpo
reactivo con proMBP.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fraccionaron cuatro muestras de suero con un
nivel marcadamente incrementado de PAPP-A obtenido
de otros 4 pacientes con SCA mediante cromatografía de exclusión
por tamaños. Las fracciones se analizaron mediante el análisis T.
Un solo pico de inmunorreactividad con PAPP-A eluyó
en una posición en la cual se encontraba la apoferritina (481 kDa)
(mostrado en la Figura 5). Los patrones de elución de las 4 muestras
de suero de SCA fueron los mismos con independencia de las
concentraciones de PAPP-A, y se desplazaron
claramente de las dos muestras de embarazo (669 kDa). La diferencia
en el tamaño molecular entre la PAPP-A de embarazo y
la PAPP-A de SCA se demostró claramente en la
Figura 5, y se hizo mucho más pronunciada en la Figura 6 cuando el
fraccionamiento se llevó a cabo con un volumen de fracción más
pequeño (25 \mul).
Los niveles de PAPP-A en suero
en sujetos normales (n = 130, edades entre 50 y 69 años) fueron
menores de 7,6 mUI/L, con un valor medio de 3,0 mUI/L. Tales
niveles de PAPP-A circulante encontrados en sujetos
normales fueron detectables no solamente por medio del análisis T
si no también por medio del análisis C.
La Figura 7A muestra que los bajos niveles de
PAPP-A circulante encontrados en sujetos normales
eran detectables por medio del análisis T así como por medio del
análisis C. Además, el tratamiento de adsorción se pudo utilizar
para separar la PAPP-A del suero normal por medio
del anticuerpo A1 específico de la subunidad PAPP-A
(Figura 7A) o el anticuerpo A11 específico de proMBP (Figura
8A).
Se puede clasificar la PAPP-A en
pacientes con SCA en dos categorías, esto es, la forma que forma
complejo con proMBP y la forma que no forma complejo con proMBP,
que forman juntas la PAPP-A total detectada por
medio del análisis T. La forma que forma complejo con proMBP
constituye el nivel basal de PAPP-A y se puede
detectar específicamente por medio del análisis C. La forma que no
forma complejo con proMBP hace referencia al SCA y se puede
determinar específicamente mediante el valor de delta obtenido a
partir del uso de ambos análisis mencionado antes o el análisis de
marca dual o el análisis de bloqueo o, en particular, el análisis
específico de PAPP-A libre.
La Figura 7B muestra que la
PAPP-A (tanto las formas que forman complejo con
proMBP como las que no forman complejo) en pacientes con SCA pudo
ser medida por medio del análisis T, mientras la forma que formaba
complejo con proMBP (irrelevante en SCA) pudo ser medida por medio
del análisis C. La adsorción con mabA1 separó eficazmente tanto las
formas que formaron complejo con proMBP como las formas que no
formaron complejo (Figura 7B), sin embargo, la adsorción con mabA11
solamente separó la forma que forma complejo con proMBP (Figura 8B),
permitiendo de ese modo detectar la forma que no formó complejo,
esto es la PAPP-A libre.
El análisis de las fracciones de muestras de
suero de SCA y de muestras de suero de embarazo revela que las
señales prominentes detectadas por medio del análisis C coincidían
en efecto con aquella de la PAPP-A de embarazo, que
se sabe que es un complejo con proMBP (véase la Figura 9).
Se encontró que las concentraciones de
PAPP-A determinadas por el análisis C se
correspondían con aquellas medidas mediante el análisis T
utilizando solamente anticuerpos específicos de la subunidad
PAPP-A en 130 hombres ancianos normales (Y = 0,6131
+ 0,59669X, R = 0,63, P < 0,001). La Figura 10 muestra gráficos
de cajas de las propiedades de distribución de datos de
concentraciones de PAPP-A en suero medidas por medio
de los dos análisis, respectivamente, y para los valores de delta
con relación a una población con envejecimiento normal. Aparte de
esto, los histogramas indican que la distribución de los valores de
delta está menos desviada y tiene un valor de kurtosis de 0,1
mientras las distribuciones para las concentraciones de
PAPP-A están positivamente desviadas y tienen
valores de kurtosis mucho mayores (3,47 y 1,58, respectivamente).
Debido a la compatibilidad con la distribución Gaussiana, se puede
derivar un límite de decisión adecuado para el valor de delta.
El valor de delta, en principio, refleja
solamente la PAPP-A relevante en SCA. Por lo tanto
no resulta afectado por la influencia de los niveles de
PAPP-A basales. Los niveles de
PAPP-A basales son variables entre paciente y
paciente, lo que puede ser una fuente de interferencia con los
resultados de las medidas (falsos negativos y falsos positivos)
realizadas por medio del análisis utilizando solamente anticuerpos
específicos para la subunidad PAPP-A.
Para estudiar el problema de posibles falsos
negativos, los autores de la presente invención analizaron muestras
de suero seriadas de un subgrupo de 29 pacientes con SCA (cTnI fue
elevada en todos estos pacientes) con los dos análisis. Cuando el
límite de decisión era 97,5% superior al límite de referencia (5,68
mUI/L) derivado de concentraciones de PAPP-A de
sujetos normales con el análisis utilizando solamente anticuerpos
específicos de la subunidad PAPP-A, todos los
pacientes fueron PAPP-A-negativos.
Sin embargo, cuando el límite de decisión basado en los valores de
delta se definía como la media + 3 DT, 20 de los 29 pacientes
resultaron ser PAPP-A-positivos. La
Figura 11 muestra algunos ejemplos de comparaciones entre los usos
de los dos límites de decisión.
Todas las posibles combinaciones de anticuerpos
de dos sitios disponibles en la actualidad fueron caracterizadas
con PAPP-A derivada de embarazo y
PAPP-A relacionada con SCA obtenida de placas
ateroscleróticas (también denominada PAPP-A
derivada de aterosclerosis o de placas). Como se muestra en la Tabla
1, se encontraron tres clases de combinaciones de análisis o
anticuerpos. En primer lugar, las combinaciones de anticuerpos para
la PAPP-A total generaron señales específicas altas
tanto para PAPP-A derivada de embarazo como para
PAPP-A relacionada con SCA, significando que estos
análisis eran igualmente adecuados para la medición de
PAPP-A derivada de embarazo como para
PAPP-A relacionada con SCA. En segundo lugar, las
combinaciones de anticuerpos que reconocían
PAPP-A/proMBP solamente generaron una señal
específica alta con PAPP-A derivada de embarazo
pero no con PAPP-A relacionada con SCA, indicando
que estos análisis solamente son adecuados para la medida de
PAPP-A relacionada con el embarazo. Un tercer tipo
de combinación de anticuerpos (tal como 3C8/7A6) generó una señal
específica baja para la PAPP-A derivada de embarazo,
pero una señal específica alta para la PAPP-A
relacionada con SCA que consiste preferentemente en una forma libre
o que no forma complejo de PAPP-A. Puesto que la
forma molecular de PAPP-A en individuos no
embarazados, sin SCA es similar a la forma (esto es,
PAPP-A/proMBP) encontrada en el embarazo, los
análisis como este son preferiblemente adecuados para la medida
específica de la PAPP-A relacionada con el SCA o la
aterosclerosis.
En resumen, los niveles basales de
PAPP-A, presentes en forma de complejo
PAPP-A/proMBP, fluctúan frecuentemente de muestra
en muestra. En pacientes con SCA la PAPP-A relevante
para la lesión solamente se detectó por medio del análisis total en
lugar del análisis del complejo. Por otra parte la
PAPP-A de nivel basal se puede detectar por medio
de ambos análisis. El hecho establece los fundamentos para el uso de
PAPP-A libre o el valor de delta (que refleja
indirectamente la PAPP-A libre) que elimina la
influencia de la fluctuación de los cambios individuales en los
niveles basales de PAPP-A. El límite de decisión
formado sobre la PAPP-A libre o el valor de delta
es de este modo más racional que aquel basado simplemente en las
concentraciones de PAPP-A total, y permite una
medida exacta de la PAPP-A en la circulación en el
SCA.
Los autores de la presente invención han
demostrado que la PAPP-A circulante en el embarazo
es diferente de la del SCA. Primero confirmaron que la
PAPP-A del embarazo es un complejo con proMBP ya que
puede ser igualmente determinada utilizando anticuerpos contra la
subunidad PAPP-A o la subunidad proMBP como
trazador. Segundo, los autores de la presente invención muestran la
evidencia de que la PAPP-A relacionada con el SCA no
forma complejo con proMBP ya que solamente puede ser determinada
por anticuerpos contra la subunidad PAPP-A. Esto
también fue confirmado por análisis que utilizan otros dos
anticuerpos reactivos con proMBP, esto es, mabB5 y B6 (datos no
mostrados). Tercero, los resultados de los autores de la presente
invención muestran que la PAPP-A relacionada con el
embarazo tiene un tamaño molecular más grande en comparación con la
PAPP-A relacionada con el SCA, que muestra
adicionalmente de manera inequívoca que la PAPP-A
relacionada con el SCA difiere de la PAPP-A del
embarazo.
Existen dos razones que pueden hacer que el
epítopo sea reconocido por el anticuerpo monoclonal A11
indetectable. En primer lugar, el epítopo se pierde o bien por
carencia de la subunidad que porta el epítopo o bien por una
modificación que ocasiona cambios en la conformación molecular. En
segundo lugar, se bloquea la unión del epítopo al anticuerpo o bien
mediante conexión covalente del epítopo a otra sustancia
macromolecular o bien mediante un factor de interferencia que está
presente solamente en las muestras de suero de SCA. Puesto que se
han obtenido resultados de recuperación normales (datos no
mostrados) pinchando PAPP-A de embarazo en las
muestras de suero de SCA, la posibilidad de presencia del factor de
interferencia en las muestras de SCA puede ser excluida. Por otra
parte, debido al descubrimiento de que la PAPP-A de
SCA tiene un tamaño molecular claramente más pequeño que la
PAPP-A de embarazo, la modificación del complejo
PAPP-A/proMBP incluyendo la unión por puentes a una
sustancia adicional parece muy poco probable. De este modo se
evidencia que la PAPP-A de SCA en la circulación no
forma complejo con proMBP.
De media, la PAPP-P de SCA
presente en la circulación esta en torno a 20 mUI/L (22,23), que es
equivalente a aproximadamente 6 \mug/L (26). Tales
concentraciones hacen difícil detectar la PAPP-A de
SCA directamente a partir de muestras de sangre mediante
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) y
análisis de transferencia Western. Por lo tanto, son necesarias
otras tecnologías con elevada sensibilidad y especificidad para las
investigaciones relevantes. La fluorometría resuelta con el tiempo
de los quelatos de lantánidos es una de las tecnologías de
detección más sensibles que existen en la actualidad (27).
Utilizando esta tecnología y anticuerpos específicos, se
constituyeron dos inmunoanálisis para la PAPP-A
total y el complejo de PAPP-A con proMBP. Como se
esperaba, las sensibilidades superiores de estos análisis
permitieron la detección de la PAPP-A total y de la
PAPP-A que forma complejo con proMBP directamente a
partir de las muestras de sangre.
En el embarazo, más de 99% de la
PAPP-A en circulación está presente en forma de un
complejo de 500 kDa 2:2 con pro-MBP unido a
disulfuro, y menos del 1% de la PAPP-A está presente
en forma de un dímero (5). En el complejo
PAPP-A/proMBP, la PAPP-A está
dimerizada por un único enlace disulfuro, y la proMBP está
dimerizada por dos enlaces disulfuro; cada subunidad de
PAPP-A está conectada a una subunidad de proMBP por
dos enlaces disulfuro (32). Estudios recientes muestran que la
unión covalente es necesaria para la inhibición por proMBP de la
actividad catalítica de la PAPP-A, pero el mecanismo
detallado acerca de la formación del complejo sigue siendo
desconocido en gran parte.
Hasta ahora, no se ha encontrado una forma libre
de proMBP en la circulación, aunque los niveles en suero de proMBP
excedieron según se informó los de PAPP-A de 4 a 10
veces sobre una base molar durante todo el embarazo (14). El resto
de proMBP en la circulación en el embarazo está presente en otros
dos tipos de complejos, a saber un complejo unido a disulfuro 2:2
entre la proMBP y el angiotensinógeno y un complejo 2:2:2 entre la
proMBP, el angiotensinógeno, y el C3dg del complemento (14). En este
estudio, se utilizó un formato de dos etapas para el análisis que
implicaba el uso del anticuerpo específico de proMBP como trazador.
El análisis con este formato evitó eficazmente que otros complejos
con proMBP presentes en el suero de embarazo reaccionaran con el
anticuerpo específico de
proMBP marcado con europio, permitiendo de ese modo la determinación específica del complejo PAPP-A-/proMBP.
proMBP marcado con europio, permitiendo de ese modo la determinación específica del complejo PAPP-A-/proMBP.
Fuera del embarazo se ha encontrado que la
PAPP-A es secretada a partir de una variedad de
células humanas cultivadas tales como fibroblastos, osteoblastos
(15), células granulosas de ovario (33), células estromáticas del
endometrio (13) y células de la musculatura lisa vascular de la
arteria coronaria (34). Además, utilizando la inmunohistoquímica y
la hibridación in situ, se ha identificado la expresión de
PAPP-A in vivo en ovario (35), en placas
vasculares (20), y en piel humana en curación (36). No obstante,
solamente se ha demostrado que la PAPP-A aislada de
medio acondicionado con fibroblastos y de expresión recombinante se
presenta en forma de un dímero de 400 kDa (5,15).
Se ha demostrado que la PAPP-A,
secretada por las células mencionadas antes en medio de cultivo
acondicionado, tiene actividad proteolítica. Parece probable que la
PAPP-A producida a partir de todas estas fuentes
in vitro exista en forma de dímero. Sin embargo, extrapolar
la observación in vitro a una situación in vivo no
está justificado. La sola tenencia de actividad proteasa no puede
ser utilizada como evidencia de que la PAPP-A está
presente en forma libre. En el embarazo, aunque más del 99% de la
PAPP-A está presente en forma de complejo, se ha
demostrado que el suero de embarazo y la PAPP-A de
embarazo purificada tienen actividad proteasa (5,15, 37). La razón
de la actividad proteasa medible de suero de embarazo o
PAPP-A de embarazo se atribuye a la presencia de
menos de 1% de un dímero de PAPP-A no inhibido o
quizás de un complejo PAPP-A/proMBP 2:1
incompletamente inhibido (5).
Durante el embarazo, la proMBP es sintetizada en
las células X placentarias, mientras la PAPP-A es
sintetizada principalmente en los sincitiotrofoblastos (6). Por lo
tanto, el complejo PAPP-A/proMBP covalente se debe
formar en el compartimento extracelular después de la secreción. Es
posible que la actividad proteasa de PAPP-A esté
regulada por acciones paracrinas en el medio local (13). Fuera del
embarazo, se ha demostrado que la proMBP está presente solamente en
eosinófilos en desarrollo en lugar de en eosinófilos maduros (38).
Pero recientemente, también se demostró inmunoactividad para proMBP
en el fluido folicular dominante con estrógeno de pacientes de
fertilización in vitro (33) y el origen de la proMBP se
podría relacionar con diversas células ováricas (39). Por otra
parte, se informó de que el tratamiento de
\beta-forbol 12,13-didecanoato
(\beta-PDD) indujo la expresión de proMBP a
partir de fibroblastos humanos cultivados que producían
PAPP-A, conduciendo a la inhibición de la actividad
proteasa de PAPP-A en medio acondicionado celular
(40), sugiriendo que la actividad proteasa de
PAPP-A también puede estar regulada in vivo
por acciones autocrinas. Pero la cuestión de por qué la estructura
compleja es necesaria para el efecto inhibidor de proMBP todavía es
desconocida.
Anteriormente se contemplaba la aterosclerosis
como un problema de "fontanería". Pero la investigación
reciente ha indicado que la inflamación es fundamental en el
desarrollo de las lesiones arteriales (41). En comparación con las
placas estables, las placas desorganizadas contienen muchas células
inflamatorias (42). Se ha demostrado que la PAPP-A
está presente en las placas ateroscleróticas inestables pero ausente
en las estables (20). Su expresión puede ser aumentada
significativamente por citoquinas tales como el TNF\alpha de las
células inflamatorias (43). Probablemente la PAPP-A
juega una parte crucial en las reacciones inflamatorias en la placa
aterosclerótica, contribuyendo de este modo al progreso de la
aterogénesis. Recientemente, los autores de la presente invención
informaron de que el riesgo cumulativo de un acontecimiento cardíaco
primario está asociado positivamente con los niveles de
PAPP-A circulante (23). Los resultados apoyan al
menos indirectamente el criterio de que la PAPP-A
(ya sea sola o por medio de IGF) es una mediadora de los eventos
adversos que promueven la aterogénesis.
El descubrimiento de los autores de la presente
invención de que la PAPP-A derivada de SCA en la
circulación no es un complejo con proMBP puede tener importantes
implicaciones clínicas. En individuos sin SCA, se pueden medir
niveles variables de PAPP-A (22, 26, 44). La fuente
de esta inmunorreactividad no es conocida, pero puede ser originada
a partir de fluido seminal, fluido folicular, cuerpo lúteo,
testículos y otros órganos/tejidos en los que se ha informado de la
expresión de PAPP-A (45). Las concentraciones de
PAPP-A determinadas para 80 sujetos sin SCA con una
edad entre 50 y 69 años variaron de 1,51 a 7,59 mUI/L con un límite
de referencia superior de 97,5% de 5,68 mUI/L (22). El grado de
incremento en las concentraciones de PAPP-A durante
el SCA es ampliamente variable pero normalmente inferior a 30 mUI/L
(22,23). La utilización del límite de referencia superior como
límite de decisión significa que una proporción significativa de
pacientes con SCA se pueden perder. Los autores de la presente
invención informaron previamente (22) de que los valores de
PAPP-A en cinco de catorce pacientes MI estuvieron
por debajo del límite de referencia superior a pesar de mostrar
claros cambios dinámicos a lo largo del tiempo. Idealmente, se debe
identificar un límite de decisión no influido por las diferencias
en las concentraciones de PAPP-A basales
individuales. La observación preliminar mostrada aquí revela que
los valores de PAPP-A basales en ausencia de SCA son
casi igualmente detectados por el análisis T para
PAPP-A total que por el análisis C para
PAPP-A en el complejo con proMBP, implicando que la
inmunorreactividad basal de PAPP-A está ocasionada
por el complejo PAPP-A/proMBP. Los bajos niveles
(<4 mUI/L) de esta forma de PAPP-A que forma
complejo también fueron detectados en pacientes con MI pero
mostraron pocos o ningún cambio dinámico en la condición aguda.
Evidentemente, la forma de PAPP-A asociada con SCA
no forma complejo con proMBP. No obstante, los análisis de la
PAPP-A utilizados hasta ahora en el SCA miden la
PAPP-A total con independencia de si forma complejo
con proMBP o no. Esto constituye la principal limitación de la
evaluación de la PAPP-A en el SCA. Como ya se ha
mostrado, un enfoque para la determinación de la
PAPP-A relacionada con el SCA consiste en calcular
la diferencia (valor de delta) entre la PAPP-A total
medida y la PAPP-A complejada con proMBP medida. La
otra opción viable consiste en utilizar análisis preferiblemente
para PAPP-A libre como se ilustra en la Tabla 1.
Los autores de la presente invención pronostican que es probable que
los inmunoanálisis diseñados para medir la forma circulante de
PAPP-A liberada específicamente de placas
ateroscleróticas mejoren la especificidad y sensibilidad clínica de
la PAPP-A cuando se utiliza como marcador de riesgo
cardíaco.
\newpage
Como conclusión, los resultados de los autores
de la presente invención proporcionan la primera evidencia de que
la PAPP-A circulante relacionada con SCA es
diferente de la PAPP-A circulante relacionada con el
embarazo ya que ésta no forma complejo con proMBP. Como las
primeras mediciones de PAPP-A circulante pueden
tener valor diagnóstico y prognóstico en pacientes que presentan
sospecha de SCA, estos descubrimientos tienen importantes
implicaciones clínicas para el diseño de análisis para medir
exactamente la proteína A plasmática asociada a la aterosclerosis
(AAPP-A) en la circulación.
Se apreciará que los métodos de la presente
invención pueden ser incorporados en forma de una variedad de
realizaciones, de las cuales solamente algunas se describen en la
presente memoria. Resultará evidente para el experto en el campo
que existen otras realizaciones y que no se apartan del espíritu de
la invención. De este modo, las realizaciones descritas son
ilustrativas y no se deben considerar restrictivas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (17)
1. Un método para diagnosticar in vitro
el síndrome coronario agudo en una persona utilizando como marcador
o bien PAPP-A libre, definida como la proteína A
plasmática asociada con el embarazo (PAPP-A) que no
forma complejo con la proforma de la proteína básica mayor (proMBP),
como tal, o en forma de una proporción
- -
- PAPP-A libre/PAPP-A total
- -
- PAPP-A libre/PAPP-A que forma complejo con proMBP, o
- -
- PAPP-A que forma complejo con proMBP/PAPP-A total.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde la PAPP-A libre se determina mediante un
método de análisis de bioafinidad para la determinación cuantitativa
en una muestra de la PAPP-A libre, o bien
- i)
- como la diferencia calculada entre la PAPP-A total medida y la PAPP-A que forma complejo con proMBP medida, o bien
- ii)
- mediante un análisis de bioafinidad directo que mide solamente la PAPP-A libre.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
donde la PAPP-A libre se determina de acuerdo con la
alternativa i) y se realizan dos métodos de análisis, en los cuales
se expone una alícuota de la muestra a un conector que se une a la
PAPP-A total y se detecta el conector, y otra
alícuota de dicha muestra se expone a un conector que se une
solamente a la PAPP-A que forma complejo con proMBP
y se detecta el conector, y se calcula la cantidad de
PAPP-A libre como la diferencia entre la
PAPP-A total determinada y la PAPP-A
que forma complejo con proMBP.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3,
donde los métodos de análisis son análisis sándwich no
competitivos.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
donde los conectores son o bien conectores de captura o bien
conectores marcados.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
donde la PAPP-A libre se determina de acuerdo con la
alternativa i) como un único método de análisis dual de analitos
donde la muestra se expone a un conector de captura, que se une a la
PAPP-A total, y a dos conectores de detección
marcados con diferentes marcas, de manera que el primer conector de
detección marcado con la primera marca está dirigido a un epítopo
presente en cualquier molécula de PAPP-A, donde la
señal de la primera marca se utiliza para dar la
PAPP-A total, y el segundo conector de detección
marcado con la segunda marca está dirigido a un epítopo de la
subunidad proMBP de la molécula, donde la señal de la segunda marca
se utiliza para dar PAPP-A que forma complejo con
proMBP.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
donde la PAPP-A libre se determina de acuerdo con la
alternativa ii) exponiendo la muestra a un conector que se une a la
PAPP-A libre pero no a la PAPP-A que
forma complejo con proMBP, y se detectar la PAPP-A
libre unida por dicho conector.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
donde la PAPP-A libre se determina de acuerdo con la
alternativa ii) haciendo que la PAPP-A que forma
complejo con proMBP no sea capaz de participar en la reacción de
bioafinidad en la cual la muestra se expone a un conector que se une
a la PAPP-A total.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
donde la PAPP-A que forma complejo con proMBP es
bloqueada o pre-adsorbida.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 3 a 9, donde el conector es un anticuerpo, un
fragmento de anticuerpo o un aptámero.
11. Un método de análisis de bioafinidad para la
determinación cuantitativa en una muestra de PAPP-A
libre, definida como la proteína A plasmática asociada con el
embarazo (PAPP-A) que no forma complejo con la
proforma de la proteína básica mayor (proMBP), donde la
PAPP-A libre se determina o bien
- i)
- como la diferencia calculada entre la PAPP-A total medida y la PAPP-A que forma complejo con proMBP medida, o bien
- ii)
- mediante un método de análisis de bioafinidad directo que mide solamente la PAPP-A libre, haciendo que la PAPP-A que forma complejo con proMBP no sea capaz de participar en la reacción de bioafinidad en la cual la muestra se expone a un conector que se une a la PAPP-A total.
12. El método de análisis de acuerdo con la
reivindicación 11, donde la PAPP-A libre se
determina de acuerdo con la alternativa i) y se realizan dos
métodos de análisis, en los que una alícuota de la muestra se expone
a un conector que se une a la PAPP-A total y se
detecta el conector, y otra alícuota de dicha muestra se expone a un
conector que se une solamente a la PAPP-A que forma
complejo con proMBP y se detecta el conector, y se calcula la
cantidad de PAPP-A libre como la diferencia entre la
PAPP-A total determinada y la PAPP-A
que forma complejo con proMBP.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, donde los métodos son métodos sándwich no competitivos.
14. El método de acuerdo con la reivindicación
13, donde los conectores son conectores de captura o conectores
marcados.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
11, donde la PAPP-A libre se determina de acuerdo
con la alternativa i) en forma de un único método de análisis de
analitos dual donde la muestra se expone a un conector de captura,
que se une a la PAPP-A total, y a dos conectores de
detección marcados con diferentes marcas, de manera que el primer
conector de detección marcado con la primera marca está dirigido a
un epítopo presente en cualquier molécula de PAPP-A,
donde la señal de la primera marca se utiliza para dar la
PAPP-A total, y el segundo conector de detección
marcado con la segunda marca está dirigido a un epítopo en la
subunidad proMBP de la molécula, donde la señal de la segunda marca
se utiliza para dar la PAPP-A que forma complejo con
proMBP.
16. El método de acuerdo con la reivindicación
11, donde la PAPP-A que forma complejo con proMBP es
bloqueada o pre-adsorbida.
17. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 15, donde el conector es un anticuerpo, un
fragmento de anticuerpo o un aptámero.
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