DE3322373C2 - Testmittel und Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder Antikörpern - Google Patents
Testmittel und Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/oder AntikörpernInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Partikel sowie ein Verfahren zum simultanen Nachweis von mehreren Antigenen oder Antikörpern in einer Flüssigkeit unter Verwendung dieser Partikel. Das Partikelgemisch enthält Populationen von Partikeln, die voneinander auf folgende Weise unterscheidbar sind: Jede Population weist eine für sie spezifische Kombination folgender Merkmale auf: 1) Fluoreszenzstoffe unterschiedlichen Emissionsspektrums, 2) Quantität dieser Fluoreszenzstoffe, 3) Partikelgröße. Jede Partikelpopulation wird ferner mit einer anderen Art von Antikörpern oder Antigenen beladen. Unter Verwendung dieses Partikelgemisches ist die gleichzeitige Untersuchung auf mehrere Antigen- oder Antikörperarten in Zeit und Aufwand ersparender Weise durchführbar. Das Partikelgemisch wird mit der die nachzuweisenden Antikörper oder Antigene enthaltenden Flüssigkeit gemischt. Die nachfolgenden Reaktionsschritte entsprechen den Schritten eines konventionellen Immunfluoreszenzverfahrens. Zum Schluß wird durch ein Meßgerät (z. B. Durchflußzytometer) jedes Partikel auf seine Fluoreszenz (Emissionsspektrum und Intensität) und Größe gemessen. Aufgrund der Meßdaten identifiziert ein Rechner das Partikel und ordnet die gemessene Immunfluoreszenz einer definierten Spezifität zu.
Description
und 100% einer gegebenen Konzentration, dann können 31 = 3 Partikelpopulationen unterschieden werden.
Mit η Markierungsstoffen unterschiedlichen Emissionsspektrums, angewandt jeweils in m unterscheidbaren
Konzentrationen, beträgt die Zahl der Markierungsmöglichkeiten m", z. B. mit drei Markierungsstoffen in
jeweils zehn unterscheidbaren Konzentrationen können 103 = 1000 unterschiedliche Partikelpopulationen gekennzeichnet und identifiziert werden. Die Markierung
der Partikel geschieht bei ihrer Herstellung oder danach. Für jede Antigenart (Ag1) wird eine fluoreszenzspektrophotometrisch und/oder durch ihre Größe definierbare Partikelpopulation Pj verwendet Das Antigen
bzw. der Antikörper wird chemisch oder physikalisch an das Partikel gebunden. Dies geschieht für jede Antigenart bzw. Antikörperart gesondert Danach werden alle
Partikel in der gewünschten Zusammensetzung zusammengemischt So entsteht ein Gemisch von den Partikeln Pu P2,.., Pj. ■ ■ ·, Pn, die mit den entsprechenden
Antigenen Agu Ag2,.., Agj,.., Agn beladen sind.
Dieses Partikelgemisch wird mit der Flüssigkeit (z. B. Blutserum) vermischt, die die nachzuweisenden Antikörper enthält Nach einer Reaktionszeit binden sich die
nachzuweisenden Antikörper 16 bzw. 2 spezifisch an den korrespondierenden Antigenen 12 bzw. 6. Nach einem Waschvorgang der Partikel mit einer Waschflüssigkeit zur Entfernung der nicht gebundenen Substanzen
werden die Partikel mit einer Lösung von Fluoreszeinmarkierten Antikörpern 10 vermischt, die mit den nachzuweisenden Antikörpern speziesspezifisch reagieren.
Diese Fluoreszein-markierten Antikörper reagieren mit allen Antikörpern (jeder Antigen-Spezifität) der Tierspezies, von der die zu untersuchenden Antikörper
stammen. Nach einer Reaktionszeit, in der die Antikörper 10 an die Antikörper 16 bzw. 2 gebunden werden,
werden die Partikel erneut gewaschen zur Entfernung der nicht gebundenen Fluoreszein-markierten Antikörper. Nun werden sowohl die Fluoreszenz der an jedem
einzelnen Partikel gebundenen Antikörper 10 (Immunfluoreszenz als Meßparameter der stattgefundenen Im-
munreaktion) als auch die das Partikel identifizierenden Markierungsfluoreszenzen sowie die Größe der Partikel durch eine entsprechende Meßvorrichtung gemessen. Dafür geeignet ist ein Durchfluß-Zytometer das die
Fluoreszenzdaten (und auch die Größe) jedes einzelnen Partikels mißt Die Meßdaten werden durch einen Rechner verarbeitet wobei die Immunfluoreszenzen zu den
entsprechenden Partikelpopulationen zugeordnet werden. Auf diese Weise wird ein Profil der verschiedenen
Antigen-Antikörper-Reaktionen Ag-\Ak\, . ., AgnAkn
aufgestellt
Das oben beschriebene Verfahren ist gleichermaßen anwendbar zum Nachweis von Antigenen 12 in der zu
untersuchenden Flüssigkeit Dabei wird nach der ersten Reaktion und Waschvorgang eine Mischung von Antikörpern 16 gegen alle zu untersuchenden Antigene zugegeben. Diese Antikörper stammen vorzugsweise von
einer anderen Tierart als die Antikörper 14. Nach erneuter Reaktion und Waschvorgang werden die mit den
Antikörpern 16 speziesspezifisch reagierenden Fluores- fr
zein-markierten Antikörper 10 zugegeben. Die Messung erfolgt wie bei der Untersuchung auf Antikörper.
Das Verfahren kann auch in folgender, von der Durchfluß-Zytometrie abweichender Weise erfolgen:
Das Partikelgemisch wird auf einem Objektträger, z. B. auf dem Boden einer Mikrotiterplatte, fixiert Das
zu untersuchende Serum wird dann auf diesem Objektträger (Partikelmosaik) aufgetragen. Nach einer Reak
tionszeit binden sich die im Serum vorhandenen Antikörper mit den auf den Partikeln befindlichen korrespondierenden Antigenen. Die nicht gebundenen Substanzen werden durch anschließendes Waschen entfernt.
In einem zweiten Schritt wird ein Fluoreszein-markierter Globulinantikörper 10 aufgetragen, der für die
Tierart spezifisch ist, von der die zu untersuchenden Antikörper 2 bzw. 16 stammen. Bei dieser zweiten Reaktion bindet sich der Fluoreszein-markicrte Globulinantikörper 10 an die Antikörper (Globulin) 2 bzw. 16, die
auf den Partikeln 4 im ersten Reaktionsschritt gebunden wurden. Nach nochmaligem Waschen wird das nicht ' '
gebundene Materia! entfernt.
Das Präparat wird nun durch ein Fluoreszenzphotomikroskop photometrisch untersucht, das mit Filtern
usw. so ausgerüstet ist, daß es das Spektrum und die Intensität der von nur einem Partikel emittierten Fluoreszenzstrahlung erfassen und messen kann. Bei der Untersuchung wird der Sichtfleck eines Fluoreszenzmikroskops zweckmäßigerweise entlang vorgegebener Bahnen, z. B. zellenförmig, über das zu untersuchende, auf
einem Objektträger befindliche Partikelgemisch geführt Dies kann gegebenenfalls auch durch eine entsprechende Vorrichtung automatisch erfolgen.
Durch einen Rechner werden die Meßdaten ausgewertet Das untersuchte Partikel wird aufgrund des
Fluoreszenzspektrums der in dem Partikel enthaltenen Marker identifiziert z. B. als Partikel Pj. Dadurch kann
die gemessene Fluorszenz, die von dem Globulinantikörper stammt (Immunfluoreszenz), der immunologischen Reaktion AgjAkj zugeordnet werden. Auf diese
Weise werden automatisch nacheinander die Emissionsdaten einer größeren Anzahl von Partikeln aufgenommen und vom Rechner ausgewertet Durch die statistische Verteilung der Partikel werden die Daten von allen
Partikelpopulationen erfaßt und verarbeitet Dadurch kann ein Profil der verschiedenen Antigen-Antikörper-Reaktionen Ag\Ak\, Ag2Ak2, ..μ AgnAkn aufgestellt
werden.
Das Emissionsspektrum bzw. die Emissionsspektren der Markierungen der Partikel können durch eine
Strahlung mit breitem Spektrum angeregt werden; es kann aber auch eine bestimmte Linie des Emissionsspektrums durch eine Strahlung einer bestimmten Wellenlänge oder es können mehrere diskrete Linien durch
eine Strahlung mit mehreren bestimmten Wellenlängen angeregt werden.
Claims (17)
1. Testmittel mit Markierung zur Bestimmung einer Vielzahl von verschiedenen Antigenen und/oder
Antikörpern in einer Flüssigkeitsprobe, gekennzeichnet durch neutrale Träger-Partikel, die
einzeln oder gruppenweise jeweils mit wenigstens einem fluoreszierenden Markierungsstoff markiert
und zur Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern mit unterschiedlichen Antikörpern oder
Antigenen beladbar sind.
2. Testmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel etwa kugelförmig
und von gleicher Größe sind.
3. Testniittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Größe etwa 1 μπα bis etwa 100 μηι
ist
4. Testmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Testmittel Trägerpartikel
mit mehreren unterschiedlichen, diskreten Größen enthält, die nach ihrer Größe meßtechnisch
zu voneinander unterscheidbaren Partikelpopulationen zugeordnet werden können, wobei die Größe
der Trägerpartikel als zusätzliches Markierungs- bzw. Unterscheidungsmerkmal dient
5. Testmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel aus
Kunststoff, Gummi, Polysaccharidpolymer (z. B. Agar), anderen Polymeren oder Glas bestehen.
6. Testmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel Zellen,
beispielsweise Erythrozyten sind.
7. Testmittel nach einem der vorhergehenden An-•prüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerpartikel
mit spezifischen Antikörpern beladen sind und daß an diese Antikörper ein nachzuweisendes
Antigen durch immunologische Reaktion gebunden werden kann.
8. Verfahren zum Nachweis von Antigenen und/ oder Antikörpern unter Verwendung eines Testmittels
nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die durch fluoreszierende Stoffe
und/oder ihre Größe unterschiedlich markierten Partikel mit unterschiedlichen Antigenen und/oder
Antikörpern beladen werden, daß ein Gemisch solcher Art beladener Partikel mit einer Flüssigkeit gemischt
wird, die die zu untersuchenden bzw. nachzuweisenden Antikörper und/oder Antigene enthält,
und daß nach einer Reaktionszeit, in der die nachzuweisenden
Antikörper oder Antigene von den an den Partikeln fixierten Antigenen bzw. Antikörpern
gebunden werden, die unbekannten Antikörper bzw. Antigene identifiziert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennleichnet,
daß zur Identifizierung der gebundenen Antikörper folgende Verfahrensschritte durchgeführt
werden:
■) Waschen der Partikel nach Ende der Reaktionszeit zum Entfernen der nichtgebundenen Substanzen,
b) Zugabe einer Flüssigkeit mit fluoreszein-markierten
Antikörpern, die mit den nachzuweisenden oder zu untersuchenden Antikörpern spezies-spezifisch
reagieren (z. B. Antihumanglobuün bei Untersuchung von menschlichem Material),
oder fluoreszein-markierten Antigenen,
c) Waschen zum Entfernen der nichtgebundenen Substanzen und
d) Analyse der Markierungen der einzelnen Partikel.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Identifizierung der gebundenen
Antigene folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden:
a) Waschen der Partikel nach Ende der Reaktionszeit zum Entfernen der nichtgebundenen Substanzen,
b) Zugabe einer Flüssigkeit mit fluoreszein-markierten Antigenen, die mit den nachzuweisenden
oder zu untersuchenden Antigenen speziesspezifisch reagieren (z.B. Antihumanglobulin
bei Untersuchung von menschlichem Material) oder fluoreszein-markierten Antikörpern,
c) Waschen zum Entfernen der nichtgebundenen Substanzen und
d) Analyse der Markierungen der einzelnen Partikel.
11. Verfahren nach den Ansprücher 8 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß die fluoreszein-markierten Antikörper oder Antigene gleichzeitig mit der zu
untersuchenden Flüssigkeit oder nach einer bestimmten Reaktionszeit nach Zugabe der zu untersuchenden
Flüssigkeit zu dem Testmittel ohne vorheriges Waschen der Partikel zugegeben werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11,
dadurch gekenzeichnet, daß die Analyse mit Hilfe der Fluoreszenzphotometrie durchgeführt wird, derart,
daß die Fluoreszenzdaten jedes Partikels ermittelt (Identifizierungsfluoreszenz des Testmittels und
Fluoreszenz der markierten Antikörper) und ausgewertet werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Emissionsspektrum durch eine
Strahlung mit breitem Spektrum angeregt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine bestimmte Linie des Emissionsspektrums
durch eine Strahlung einer bestimmten Wellenlänge angeregt wird oder daß mehrere diskrete
Linien durch eine Strahlung mit mehreren bestimmten Wellenlängen angeregt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Identifizierung der
Partikel das oder die Fluoreszenzspektren hinsichtlich Wellenlänge und/oder Intensitäten der Fluoreszenzstrahlung
und/oder die Partikelgröße gemessen und ausgewertet werden.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe
der Testmittel in einer Dispersion nach Durchlaufen der Reaktions-Verfahrensschritte in einer Einzelmessungen
ermöglichenden Konzentration durch ein dünnes Rohr geleitet und gemessen wird (Durchfluß-Zytometrie).
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 15,
dadurch gekennzeichnet, daß zur Analyse mit Hilfe der Fluoreszenzphotometrie das Gemisch der durch
fluoreszierende Stoffe und/oder ihre Größe unterschiedlich markierten und mit unterschiedlichen Antigenen
und/oder Antikörpern beladenen Partikel vor der Mischung mit der zu untersuchenden bzw.
nachzuweisenden Antikörper und/oder Antigene
3 4
enthaltenden Flüssigkeit zunächst auf einen Objekt- Diese Aufgabe wird durch die im Kennzeichen des
träger aufgebracht und dort fixiert wird Anspruchs 1 und des Anspruchs 8 angegebenen Lehren
gelöst
Mit Hilfe des erfindungsgemää ausgebildeten Test-
5 mittels können die Trägerpartikel oder Populationen von Partikeln aufgrund unterschiedlicher Markierungen
Die Erfindung betrifft ein Testmittel gemäß Oberbe- in einem Partikelgemisch unterschieden werden. Jedes
griff des Anspruchs 1 sowie ein Verfahren zum Nach- Trägerpartikel oder jede Partikelpopulation ist mit eiweise
von Antigenen und/oder Antikörpern unter Ver- ner anderen Art von Antikörpern oder Antigenen bewendung
dieses Testmittels. io ladbar. Unter Verwendung eines solchen Partikelgemi-
Es sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von sches ist die gleichzeitige Untersuchung auf mehrere
Antigenen oder Antikörpern bekannt, die auf den Prin- Antigen- oder Antikörperarten in Zeit- und Materialzipien
Agglutination, Präzipitation, Komplementbin- aufwand verringernder Weise durchführbar,
dungsreaktion. Immunfluoreszenz, Radioimmunreak- Vorteilhafte und zweckmäßige Weiterbildungen des
tion, Enzymimmunreaktion u. a. beruhen. Allen diesen 15 Tesimittels nach Anspruch 1 sind in den Unteransprü-Verfahren
ist gemein, daß jeweils in einem Arbeitsgang chen 2 bis 7 angegeben.
nur eine Art eines Antigens oder Antikörpers festge- Durch das erfindungsgemäße Verfahren nach An-
stellt werden kann. spruch 8 kann die Immunreaktion, die beispielsweise ge-
Häufig wird jedoch nach mehreren Arten von Antige- maß Anspruch 12 fluorometrisch meßbar ist, zwischen
nen oder Antikörpern gefahndet, z. B. für die Differenti- 20 dem Antigen bzw. Antikörper, mit dem das Trägerpartialdiagnose
von Infektions- oder anderen Krankheiten, kel beladen ist, und dem Antikörper bzw. Antigen in der
bei Screeningtests bei Gesunden, z. B. bei der serologi- untersuchten Flüssigkeit zu einer bestimmten Spezifität,
sehen Tumordiagnostik (mehrere Tumorantigene), oder die der Kombination der Markierungssignale des Partibei
Allergietests (mehrere Allergene) oder bei der Er- kels entspricht, zugeordnet werden. Durch Messung der
fassung des immunologischen Status des Organismus. 25 Immunfluoreszenz und durch Abtastung und Analyse
Nach diesem Stand der Technik muß daher für jede Art der Markierungen können somit die Antigene oder Aneines
gesuchten Antigens oder Antikörpers eine geson- tikörper nachgewiesen werden,
derte Untersuchung durchgeführt werden. Dies bedeu- Vorteilhafte und zweckmäßige Weiterbildungen des
teteinen mehrfachen Zeit-und Materialaufwand. erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den weiteren
Aus der Chemikerzeitung 103,1979, Seite 53 ff. ist ain 30 Unteransprüchen gekennzeichnet
Radioimmunoassay bekannt Es wird u. a. ein Fluores- Anhand eines nachfolgend beschriebenen Beispiels
zenzimmunoassay beschrieben, bei dem als Indikator soll die Erfindung näher erläutert werden, wobei zur
ein fluoreszierender Stoff (z. B. Fluorescein) eingesetzt Verdeutlichung auf die Zeichnung Bezug genommen
wird, der am Antigen oder Antikörper gebildet ist Bei wird.
diesem Verfahren werden die Antigene oder Antikör- 35 Ein Serum soll auf die Antikörperarten 2 bzw. 16 z. B.
per unmittelbar selbst markiert, um sie so identifizieren Aki, Ak2,.., Akj,..., Akn hin untersucht werden. Grupzu
können. Bei diesem bekannten Verfahren ist nachtei- pen (Populationen) kleiner Trägerpartikel 4, vorzugslig,
daß in einem Arbeitsgang nur eine Art eines Anti- weise in Form von Kugeln, von etwa 10 μπι Durchmesgens
oder eines Antikörpers feststellbar ist. ser aus einem geeigneten Trägermaterial (Kunststoff
Durch die DE-PS 29 43 648 ist eine spezifische Bin- 40 oder Polysaccharidpolymer, z. B. Agar) werden je mit
dungs-Untersuchungsmethode zur Bestimmung einer einer Antigenart 6 bzw. 12 Ag\, Ag2,.., Agj,.., Ag1.
Vielzahl von verschiedenen Liganden in einer einzigen gemäß Anspruch 12 beladen. Jede Antigenart wird auf
Flüssigkeitsprobe bekannt Die Flüssigkeitsprobe wird einer gesonderten Träger-Partikelart gebunden, die auf
mit Reagenzien für die verschiedenen zu bestimmenden folgende Weise vorher markiert wurde.
Liganden sowie einem markierten Bindungsmittel und 45 Die Partikel 4 werden mit einer Kombination von
einem Festphasenbindungsmittel kombiniert wobei mit Stoffen 8 markiert, deren Fluoreszenzspektrum defidem
Liganden ein Bindungsreaktionssystem mit einer niert und fluorimetrisch bestimmbar ist Die Markierung
festphasengebundenen Spezies und einer freien Spezies kann auch dadurch in einfacher Weise erfolgen, daß die
des markierten Bindungsmittels gebildet wird. Die Mar- einzelnen Partikelpopulationen mit nur einem Flüoreskierung
ist für alle markierten Bindungsmittel in den 50 zierenden Markierungsstoff bestimmter, jedoch von
verschiedenen mit der Probe kombinierten Reagenzien Partikelpopulation zu Partikelpopulation unterscheidgleich.
Das Festphasenbindungsmittel ist für die ver- barer Konzentration oder mit mehreren Markierungsschiedenen
zu bestimmenden Liganden differenzierbar stoffen bestimmter, jedoch von Partikelpopulation zu
und von den anderen Festphasenbindungsmitteln für die Partikelpopulation unterscheidbaren Konzentrationen
anderen zu bestimmenden Liganden abtrennbar. Jede 55 markiert werden. Diese Art der Markierung (Markiegebildete
festphasengebundene Spezies wird von den rung mit unterscheidbaren Konzentrationen desselben
anderen gebildeten festphasengebundenen Spezies und fluoreszierenden Stoffes) kann mit der Markierung
von den freien Spezies abgetrennt Die Menge der Mar- durch Kombination von fluoreszierenden Stoffen unterkierung
wird dann in den jeweils abgetrennten festpha- schiedlichen Emissionsspektrums kombiniert werden,
sengebunderien Spezies einzeln gemessen. Es ist nicht ec Die Auswertung erfolgt dann hinsichtHch des Spekmöglich,
mehrere Arten von Antigenen und Antikör- trums und/oder°der Intensität der emitierten Fluorespern
gleichzeitig in einem Arbeitsgang nachzuweisen. zenz. Auf diese Weise können mit einem Markierungs-
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht dar- stoff, angewandt in zwei unterscheidbaren Konzentrain,
ein Testmittel und ein Verfahren der eingangs ge- tionen (0% und 100% einer bestimmten Konzentration),
nannten Art so auszubilden, daß der Zeit- und Material- 65 2" = 2 Partikelpopulationen unterschieden werden
aufwand bei der Untersuchung und dem Nachweis meh- (Partikel mit dem Stoff und Partikel ohne den Stoff),
rerer Arten von Antigenen und/oder Antikörpern we- Wenn bei der Markierung der Stoff in drei unterscheidsentlich
verringert ist. baren Konzentrationen verwendet wird, z. B. 0%, 50%
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