NO842501L - Fremgangsmaate og middel for paavisning av antigener og/eller antistoffer. - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte for påvisning av flere antigener eller antistoffer i en væske under anvendelse av partikler i form av en partikkelblanding som inneholder populasjoner av partikler som kan sondres fra hverandre på følgende måte: Hver populasjon fremviser en egen spesifikk kombinasjon med følgende trekk: 1) fluorescensstoffer med forskjellige emisjonsspektra, 2) mengde av disse fluorescensstoffer 3) partikkelstørrelse.Kver partikkelpopulasjon fylles videre med en annen. art antistoffer henhv. antigener. Under anvendelse av denne partikkelblanding kan det gjennomføres samtidig undersøkelse på flere antigen- eller antistoff-typer på tids- og utstyrs-sparende måte. Partikkelblandingen blandes med den væske som inneholder de antistoffer eller antigener som skal påvises. De etterfølgende reaksjonstrinn tilsvarer trinnene med en konvensjonell immunfluorescensmetode. Til slutt måles ved hjelp av et måleapparat (f.eks. et gjennomstrømnings-zytometer) hver partikkel med hensyn til sin fluorescens (emisjonsspektrum og intensitet) og størrelse. På grunn av måledata identifiserer en regnemaskin partikkelen og tilordner den målte immunfluorescens en definert spesifitet.Forskjellige slags partikler og deres fremstilling er beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for påvisning av antigener og/eller antistoffer, og det

særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er

at partikler som er forskjellig markert med fluorescerende stoffer eller farvestoffer og/eller med hensyn til deres størrelse fylles med forskjellige antigener og/eller antistoffer, en blanding av partikler fylt på denne måte blandes med en væske som inneholder de antistoffer og/eller antigener som skal undersøkes henhv. påvises og at etter en reaksjonstid hvor de antistoffer eller antigener som skal påvises bindes til de til partiklene fikserte antigener henhv. antistoffer som partiklene er fylt med, identifiseres antistoffene henhv. antigenene ved etterfølgende reaksjonstrinn og målinger.

Oppfinnelsen vedrører også partikler for utførelse av

den nevnte fremgangsmåte og det særegne ved partiklene i henhold til oppfinnelsen er at de inneholder et eller

flere forskjellige markeringsstoffer, foretrukket fluorescerende stoffer eller farvestoffer.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Det er kjent forskjellige metoder for påvisning av antigener eller antistoffer og som beror på prinsippene

med agglutinering, utfelling, komplement-bindingsreaksjon, immunfluorescens, radioimmunreaksjon, enzymimmunreaksjon med flere. For alle disse metoder er det et felles trekk

at det for hver av dem i en arbeidsgang bare kan konstateres en type av et antigen eller antistoff.

Det dreier seg imidlertid ofte om flere arter av

antigener eller antistoffer, f.eks. for differensial-diagnose av infeksjons- eller andre sykdommer, ved Screening-tester i friske personer, f.eks. ved den serologiske tumordiagnostik (flere tumorantigener), eller ved allergitesting (flere allergener) eller ved bedømmelse av den immunologiske status av organismen. Etter

denne teknikkens stand må det følgelig for hver art av et ettersøkt antigen eller antistoff gjennomføres en separat undersøkelse og dette betyr et stort forbruk av tid og utstyr.

Den oppgave som ligger til grunn for oppfinnelsen er å nedsette forbruket av tid og utstyr ved undersøkelse og påvisning av flere arter av antigener eller antistoffer.

Oppfinnelsen løser denne oppgave. På grunn av de forskjellige markeringer kan partiklene i blandingen identifiseres. På grunn av dette faktum kan også den fluorimetrisk målte immunreaksjon mellom antigen henhv. antistoff ved den utførelsesform hvor partiklene er fylt med disse, og antistoffet henhv. antigenet i den undersøkte væske tilordnes en bestemt spesifitet som tilsvarer kombinasjonen av markeringssignalene for partikkelen.

Fordelaktige og hensiktsmessige utførelsesformer for partiklene fremgår av det følgende.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er det ved tilordning av de reagerende antigener eller antistoffer til de identifiserbare partikler i blandingen ved måling av fluorescens eller ved deteksjon og analyse av markeringene å påvise antigenene eller antistoffene.

Fordelaktige og hensiktsmessige utførelsesformer av fremgangsmåten fremgår av det følgende.

Oppfinnelsen skal nærmere illustreres ved hjelp av etterfølgende eksemplifisering hvor det for tydelig-gjøring vises til den vedføyde tegning.

Et serum skal undersøkes på antistoffartene 2 henhv. 16 f. eks. Ak^, Ak,,, ..., Akj , ... , Ak^ . Grupper (populasjoner) av små partikler 4, foretrukket i form av kuler med omtrent 10 pm diameter av et egnet bærer- material (syntetisk- eller polysakkarid-polymer, f.eks. agar) fylles hver med en antigenart 6 henhv. 12 enten direkte eller som partikkel-antistoff-antigen. Hver antigenart ble bundet til en separat partikkeltype som først var markert på følgende måte.

Partiklene 4 markeres med en kombinasjon av stoffer 8

med definert fluorescensspektrum som kan bestemmes fluorimetrisk. Markeringen kan også skje på enkel måte ved at de enkelte partikkelpopulasjoner markeres med bare et fluorescerende markeringsstoff med bestemt, men likevel fra partikkelpopulasjon til partikkelpopulasjon forskjellig konsentrasjon eller med flere markeringsstoffer med bestemt, men likevel fra partikkelpopulasjon til partikkelpopulasjon forskjellige konsentrasjoner. Denne type av markering (markering med forskjellige konsentrasjoner av det samme fluorescerende stoff) kan kombineres med markering ved kombinasjon med fluorescerende stoffer med forskjellige emisjonsspektra. Bedømmelsen skjer da på

basis av spektrum og/eller intensiteten av den emiterte fluorescens. På denne måte kan man med et markeringsstoff, anvendt i to forskjellige konsentrasjoner (0% og 100%

av en bestemt konsentrasjon) sondre mellom 2<1>=2 partikkel-populas joner (partikler med stoffet og partikler uten stoffet). Når stoffet ved markeringen anvendes med tre forskjellige konsentrasjoner, f.eks. 0%, 50% og 100% av en gitt konsentrasjon, kan det sondres mellom 3=3 partikkelpopulasjoner. Med n markeringsstoffer med forskjellig emisjonsspektrum, anvendt i det enkelte tilfelle i m forskjellige konsentrasjoner, utgjør tallet av markeringsmuligheter rn<11>, f.eks. med tre markeringsstoffer hvert med ti forskjellige konsentrasjoner kan 10 3= 1000 forskjellige partikkelpopulasjoner karakteriseres og identifiseres. Markeringen av partiklene skjer ved deres fremstilling eller deretter. For hver antigenart

(Ag^) anvendes en fluorescens-spektrofotometrisk og/eller

på grunn av dens størrelse definerbar partikkel-

populasjon P^. Antigenet henhv. antistoffet bindes kjemisk eller fysikalsk til partiklene. Dette skjer separat

for hver antigenart henhv. antistoffart. Deretter sammenblandes alle partiklene i den ønskede sammensetning. Således dannes en blanding av partikler P^, P^,.,

P., ..., P , som er ladet med de tilsvarende antigener

j n

Ag17Ag2, ..., Ag^, ..., Ag^.

Denne partikkelblanding sammenblandes med væsken

(f.eks. blodserum) som inneholder de antistoffer som skal påvises. Etter en reaksjonstid bindes de antistoffer 16 henhv. 2 som skal påvises spesifikt til de tilsvarende antigener 12 henhv. 6. Etter en vasking av partiklene med en vaskevæske for fjernelse av de ikke bundne substanser blandes partiklene med en løsning av fluoresoin-markerte antistoffer 10 som reagerer spesiesspesifikt med de antistoffer som skal påvises. Disse fluoressin-

markerte antistoffer reagerer med alle antistoffer (enhver antigen-spesifitet) av dyrespesiene hvorfra de antistoffer som skal undersøkes stammer. Etter en reaksjonstid hvor antistoffene 10 bindes til antigenene 16 henhv. 2, vaskes partiklene på nytt for fjernelse av de ikke bundne fluorescin-markerte antistoffer. Deretter måles både fluorescensen av de på hver enkelt partikkel bundne antistoffer 10 (immunfluorescens som måle-parameter for den immunreaksjon som har foregått) såvel som de markeringsfluorescenser som identifiserer partikkelen såvel som størrelsen av partikkelen med en tilsvarende måleinnretning. For dette er et gjennom-strømnings-zytometer som måler fluorescensdata (og også størrelsen) av hver enkelt partikkel. Måledataene behandles i en regnemaskin hvor immunfluorescensene tilordnes de tilsvarende partikkelpopulasjoner. På

denne måte oppstilles en profil for de forskjellige antigen-antistoff-reaksjoner Ag.AK-,...., Ag Ak .

^1 1 ^n n

Den ovenfor beskrevne metode er likeledes anvendbar for påvisning av antigener 12 i den væske som undersøkes. Derved tilføres etter den første reaksjon og vaskeprosess en blanding av antistoffer 16 mot alle de antigener som skal undersøkes. Disse antistoffer stammer foretrukket fra en annen dyreart enn antistoffene 14. Etter fornyet reaksjon og vasking tilføres de med antistoffene 16 spesies-spesifikt reagerende fluoresciru*— markerte antistoffer 10. Målingen skjer som ved undersøkelsen på antistoffer.

Fremgangsmåten kan også gjennomføres på følgende måte

som avviker fra gjennomstrømnings-zytometrien.

Partikkelblandingen fikseres på en objektbærer, f.eks.

på bunnen av en mikrotiterplate. Det serum som skal undersøkes påføres deretter på denne objektbærer (partikkelmosaikk). Etter en reaksjonstid binder de antistoffer som er tilstede i serumet til de tilsvarende antigener som befinner seg på partiklene. De ikke bundne substanser fjernes ved etterfølgende vasking.

I et annet trinn påføres et fluoressin-markert globulin-antistoff som er spesifikt for den dyreart hvorfra de antistoffer 12 henhv. 16 stammer. Ved denne annen reaksjon bindes de fluorescin-markerte globulin-antistoffer 10 til antistoffene (globulin) 2 henhv. 16 som ble bundet på partiklene 4 i det første reaksjonstrinn. Etter en ytterligere vasking fjernes det ikke-bundne material.

Preparatet undersøkes nå fotometrisk ved hjelp av et fluorescens-fotomikroskop som er utstyrt med filtere slik at det bare kan oppfatte spektrum og intensitet av den fluoressensstråling som emiteres av bare en partikkel og måling av denne. Ved undersøkelsen føres synsflekken av et fluorescensmikroskop hensiktsmessig langs forut gitte baner, f.eks. linjeformet, over den partikkelblanding som skal undersøkes og som befinner seg på en objektbærer. Dette kan også skje automatisk ved hjelp av en tilsvarende innretning.

I en regnemaskin bearbeides måledataene. Den undersøkte partikkel identifiseres på grunn av fluoreseens-spektrummét av den i partikkelen inneholdte markør, f.eks. som partikkel . Derved kan den målte fluorescens som stammer fra globulin-antistoffet (immunfluoressens) tilordnes den immunologiske reaksjon Ag^ Ak^. På denne måte opptas automatisk og i rekkefølge emmisjonsdataene for et større antall partikler og bearbeides av regne-maskinen. Ved den statistiske fordeling av partiklene detekteres data for alle partikkelpopulasjoner og bearbeides. Deretter kan det stilles opp en profil for de forskjellige antigen-antistoff-reaksjoner Ag^Ak^,

Ag2Ak2, ... AgnAkn-

Emisjons-spektrum henhv. emisj©nspektraene for markeringene av partiklene kan aktiveres ved hjelp av en bred-spektret stråling. En bestemt linje av emisjonspektrummet kan imidlertid også aktiveres ved hjelp av en stråling med en bestemt bølgelengde eller flere separate linjer kan aktiveres ved hjelp av en stråling med flere bestemte bølgelengder.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for påvisning av antigener og/eller antistoffer under anvendelse av partikler som er indentifiserbare ved at de er merket med fluoriserende stoffer og/eller har forskjellige partikkelstørrelser, karakterisert ved at partiklene, som er forskjellig markert med et fluoriserende markeringsstoff med en bestemt bølgelengde, enten i forskjellige forut bestemte mengder eller med flere fluoriserende markeringsstoffer med bestemte forskjellige bølgelengder i bestemt mengde eller i forskjellige, forut bestemte mengder fylles med forskjellige antigener (fastfaseantigener) og/eller at en blanding av med denne type fylte partikler blandes med en væske som inneholder de antistoffer og/eller antigener som skal undersøkes henholdsvis påvises (f.eks. blodserum), og at etter en reaksjonstid hvorunder de antistoffer eller antigener som skal påvises bindes til de til partiklene fikserte antigener henholdsvis antistoffer som partiklene er fylt med, og de antistoffer henholdsvis antigener som skal undersøkes påvises og identifiseres ved etterfølgende reaksjonstrinn og målinger.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at for påvisning for identifisering av de bundne antistoffer gjennomføres følgende frem-gangsmåtetrinn: a) vasking av partiklene etter avsluttet reaksjonstid for fjernelse av ikke-bundne substanser. b) tilsetning av en væske med markerte antistoffer som reagerer spesies-spesifikt med de antistoffer som skal påvises eller undersøkes (f.eks. antihumanglobulin ved undersøkelse av humanmaterial), c) vasking for fjernelse av de ikke-bundne substanser etter en bestemt reaksjonstid og d) analyse av markeringene for de enkelte partikler, eller at man for identifisering av de bundne antigener istedet for trinn b) (tilsetning av væsken med markerte antistoffer) tilsetter en væske med en blanding av ikke-markerte antistoffer som reagerer spesifikt med de antigener som skal påvises, etterfulgt av en vaskeprosess etter forløp av en forut bestemt reaksjonstid, og at de anvendte markerte antistoffer reagerer spesies-spesifikt med de anvendte ikke-markerte antistoffer.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at de med fluoriserende stoffer markerte antistoffer eller antigener tilsettes samtidig til partiklene med den væske som skal undersøkes eller tilsettes til partiklene etter en bestemt reaksjonstid etter tilsetning av den væske som skal undersøkes uten foregående vasking av partiklene.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-3, karakterisert ved at analysen gjennomføres ved hjelp av fluorescens-fotometri ved at partiklene etter å ha gjennomgått fremgangsmåtetrinnene som angitt i det foregående i en konsentrasjon som muliggjør enkeltmålinger føres gjennom et tynt rør og måles (gjennomstrømnings-cytQme.tril/ idet fluorescens-data for hver partikkel detekteres (identifi-serings-fluorescens av partiklene og fluorescens av de markerte antistoffer eller antigener) og bearbeides, idet emisjonsspektrurrimet aktiveres ved hjelp av en bredspektret stråling eller en bestemt linje av emisjon s spektrumet aktiveres ved stråling med en bestemt bølgelengde eller at flere separate linjer aktiveres ved hjelp av en stråling med flere bestemte bølgelengder, idet man for identifisering av partiklene måler og bedømmer fluorescens-spekteret eller spektrene med hensyn til bølgelengde og/eller intensiteter av fluorescens- strålingen av markeringsstoffene og/eller partikkelstørrelsen og at bedømmelsen skjer ut fra tilordning av de immunologiske reaksjoner som har funnet sted til et eller flere antigen/ antikroppsystemer.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-4, karakterisert ved at istedet for gjennom-strømningscytometrien fikseres en blanding av de markerte og fylte partikler på en bærer bestående av et plastmaterial eller glass hvorpå de ytterligere reaksjonstrinn i henhold til krav-ene 1-3 gjennomføres og at bedømmelsen gjennomføres fluorescens-fotometrisk.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, for differensiering av celler (f.eks. laucosyter), karakterisert ved at de med fluoriserende stoffer forskjellig markerte partikler fylles med forskjellige spesifike antistoffer mot antigener i overflaten av celler, en blanding av på denne måte fylte partikler blandes med den cellesuspensjon som skal undersøkes og etter forløp av en bestemt reaksjonstid hvor partiklene bindes til celleoverflaten, detekteres fluorescensen av celle-partikkelkompleksene med et gjennomstrømnings-cytometer som angitt i krav 4 og bedømmes for identifisering av de enkelte celler (f.eks. laucosyt-sub-populasjoner).

7. Identifiserbare partikler for utførelse av den fremgangsmåte som er angitt i krav 1, karakterisert ved at de forskjellige partikler er forsynt med fluorescerende markeringsstoff med en bestemt bølgelengde, enten i forskjellige forut bestemte mengder eller forsynt med flere fluoriserende markeringsstoffer med bestemte forskjellige bølgelengder i bestemt mengde eller i forskjellige, forut bestemte mengder. —8-.

Partikler som angitt i krav 7, karakterisert ved at partiklene er tilnærmet kuleformet og av omtrent lik størrelse eller fremviser flere separate størrelser, idet størrelsen av partiklene ligger i området fra mikrometer- til nanometer-størrelse, og at partiklene når de foreligger i flere separate størrelser etter deres størrelse måleteknisk kan tilordnes partikkelpopulasjoner som kan sondres fra hverandre, idet størrelsen av partiklene tjener som ytterligere markerings- henholdsvis sondringstrekk.

9. Partikler som angitt i krav 7 eller 8, karakterisert ved at de består av et stoff egnet for fylling (kjemisk eller fysikalsk binding) med antigener eller antistoffer, bestående av plastmaterial, gummi, polysasaccarid-polymer som f.eks. algar eller en annen polymer eller glass, eller at partiklene utgjøres av celler, f.eks. erythrozyter.

10. Partikler som angitt i krav 7-9, karakterisert ved partiklene i det enkelte tilfelle er fylt direkte med forskjellige antigener eller antistoffer eller med spesifike antikropper hvortil antigenet er bundet ved immunologisk reaksjon (partikkel-antistoff-antigen).