CN106841017B - 一种评价辐照或热处理对钴胺素-蛋白结合体影响的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种评价辐照或热处理对钴胺素‑蛋白结合体影响的方法，包括配制钴胺素及蛋白储备液、钴胺素与蛋白配位结合、辐照处理或热处理影响评价的步骤，本发明结合钴胺素对人体的重要作用，以蛋白作为保护剂，建立一种评价辐照及热处理过程对钴胺素‑蛋白结合体影响的方法，可用于钴胺素‑蛋白结合体的稳定性检测。利用钴胺素与蛋白结合，可最大程度的减少钴胺素在贮藏、使用过程中因外界因素导致的有效成分的损失。
Description
技术领域
本发明属于功能性食品评价方法领域，具体涉及一种评价辐照或热处理过程对钴胺素-蛋白结合体影响的办法。
背景技术
钴胺素(C63H88CoN14P，分子量为1355.37)，又称VB12，是人体膳食中一种不可缺少的水溶性维生素。这类维生素在生物体生长发育过程中发挥着极其重要的作用，例如促进红细胞的发育和成熟，预防恶性贫血，以辅酶的形式增加叶酸的利用率，代谢脂肪酸，以及促进蛋白质的合成等。钴胺素缺乏会导致有丝分裂障碍，神经病变，神经系统疾病和恶性贫血等疾病。为了避免钴胺素不足，日常膳食中推荐摄入2.4μg钴胺素。
与叶酸类似，钴胺素具有不耐热和易光解的性质，因此将其单纯添加到食品中是很难稳定存在的。然而，目前很少有研究关注抑制食品中维生素损失。因此，设法开展保护食品中钴胺素的研究以减少其损失在当下食品行业具有极其重要的现实意义。
目前已有研究表明，蛋白质的配位结合能力能够显著地延缓叶酸由于紫外辐照造成的损失。其中，β-乳球蛋白的保护能力最强，牛血清白蛋白次之，而α-乳白蛋白最弱。
α-乳白蛋白是由乳腺腺泡上皮合成的特殊蛋白质，广泛存在于哺乳动物，是必需氨基酸和支链氨基酸的极好来源，是唯一能结合钙的乳清蛋白；其成分接近人乳，不易过敏，该蛋白在婴儿生长发育中具有积极的促进作用。
β-乳球蛋白是牛奶中主要乳清蛋白的成分，约占鲜奶蛋白质的7％-12％，是由乳腺上皮细胞合成分泌的一种乳清蛋白。乳清蛋白被认为是老年人的优质蛋白来源。首先，它是牛奶中可溶的蛋白，富含人体所需的各种氨基酸成分，易消化吸收；其次，可提高谷胱甘肽的合成，从而增强人体的免疫力。
因此，α-乳白蛋白与β-乳球蛋白被认为是安全而健康的食品添加剂，对人体无任何毒副作用，可以被广泛应用到功能性食品中。然而，采用α-乳白蛋白与β-乳球蛋白配位结合钴胺素，以实现延缓钴胺素由于热或辐照等而导致的损失的研究至今还鲜有报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于评价辐照及热处理过程对钴胺素和蛋白结合体影响的办法。
一种评价辐照过程对钴胺素-蛋白结合体影响的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制钴胺素及蛋白储备液：取钴胺素标准品，溶于pH＝6.0的PBS中，配成1mg/L的钴胺素储备液；取α-乳白蛋白或β-乳球蛋白，溶于pH＝6.0的PBS中，配成2μM的蛋白储备液，并将蛋白储备液按梯度稀释成0.25、0.5和0.75μM浓度的蛋白稀释储备液；
(2)钴胺素与蛋白配位结合：在包裹铝箔纸的烧杯中加入体积比为1:1的钴胺素储备液、α-乳白蛋白或β-乳球蛋白稀释储备液，制成不同浓度梯度的蛋白-钴胺素缓冲溶液体系，于室温下暗处静置1h；
(3)辐照处理影响评价：将步骤(1)中的钴胺素储备液及步骤(2)中不同浓度梯度的蛋白-钴胺素缓冲溶液体系置于距离紫外灯15～20cm处，辐照时长为2h，每间隔15～20min进行紫外吸收测定，并以未经辐照的钴胺素储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算钴胺素-蛋白结合体的分解率：
最后对辐照处理影响做出评价。
进一步地，步骤(3)中，紫外吸收扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm。
本发明还提供了一种评价热处理过程对钴胺素-蛋白结合体影响的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制钴胺素及蛋白储备液：取钴胺素标准品，溶于pH＝6.0的PBS中，配成1mg/L的钴胺素储备液；取α-乳白蛋白或β-乳球蛋白，溶于pH＝6.0的PBS中，配成2μM的蛋白储备液，并将蛋白储备液按梯度稀释成0.25、0.5和0.75μM浓度的蛋白稀释储备液；
(2)钴胺素与蛋白配位结合：在包裹铝箔纸的烧杯中加入体积比为1:1的钴胺素储备液、α-乳白蛋白或β-乳球蛋白稀释储备液，制成不同浓度梯度的蛋白-钴胺素缓冲溶液体系，于室温下暗处静置1h；
(3)热处理影响评价：将步骤(1)中的钴胺素储备液及步骤(2)中不同浓度梯度的蛋白-钴胺素缓冲溶液体系置于80～85℃的水浴锅中，恒温避光水浴加热2h，每间隔15～20min进行紫外吸收测定，并以未经热处理的钴胺素储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算钴胺素-蛋白结合体的分解率：
最后对辐照处理影响做出评价。
优选地，步骤(3)中，紫外吸收扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm。
本发明中PBS为磷酸盐缓冲液，由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠加蒸馏水配制而成。
本发明结合钴胺素对人体的重要作用，以蛋白作为保护剂，建立一种评价辐照及热处理过程对钴胺素-蛋白结合体影响的方法，可用于钴胺素-蛋白结合体的稳定性检测。利用钴胺素与蛋白结合，可最大程度的减少钴胺素在贮藏、使用过程中因外界因素导致的有效成分的损失。
与现有技术相比，本发明的优点在于：开创性地采用α-乳白蛋白与β-乳球蛋白配位结合钴胺素，以实现延缓钴胺素由于热或辐照等而导致的损失，该技术模型的建立至今未见报道。
附图说明
图1是α-乳白蛋白对氰钴铵(CLB12)光稳定性影响曲线图。
图2是α-乳白蛋白对氰钴铵(CLB12)光稳定性影响曲线图。
图3是α-乳白蛋白对腺钴胺(ADB12)光稳定性影响曲线图。
图4是α-乳白蛋白对腺钴胺(ADB12)热稳定性影响曲线图。
图5是β-乳球蛋白对氰钴铵(CLB12)光稳定性影响曲线图。
图6是β-乳球蛋白对氰钴铵(CLB12)热稳定性影响曲线图。
图7是β-乳球蛋白对腺钴胺(ADB12)光稳定性影响曲线图。
图8是β-乳球蛋白对腺钴胺(ADB12)热稳定性影响曲线图。
具体实施例
以下结合实例来进一步说明本发明。
实施例1
1)配制氰钴胺及蛋白储备液
取适量氰钴胺标品，溶于pH＝6.0的PBS中，配成1mg/L的氰钴胺储备液；取适量α-乳白蛋白，溶于pH＝6.0的PBS中，配成2μM的蛋白储备液，并蛋白储备液按梯度稀释成0.25、0.5和0.75μM的浓度。
2)蛋白/氰钴胺缓冲溶液体系制备
在包裹铝箔纸的烧杯中加入氰钴胺储备液、α-乳白蛋白稀释储备液，加入体积比为1:1，制成不同浓度梯度的蛋白/氰钴胺缓冲溶液体系，于室温下暗处静置1h。
3)辐照处理影响评价
将步骤1)中的氰钴胺储备液及步骤2)中不同浓度梯度的蛋白/氰钴胺缓冲溶液体系置于距离紫外灯15cm处，辐照时长为2h，每间隔15min进行紫外吸收测定，扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm，并以未经辐照的氰钴胺储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算蛋白/氰钴胺结合体的分解率：
做时间与分解率的相关曲线，横坐标为时间，纵坐标为分解率(根据分解率公式计算)，做标准曲线，定量表达分解率与时间之间的关系；
最后对辐照处理影响做出评价。
4)热处理影响评价
将步骤1)中的氰钴胺储备液及步骤2)中不同浓度梯度的蛋白/氰钴胺缓冲溶液体系置于80～85℃的水浴锅中，恒温避光水浴加热2h，每间隔15min进行紫外吸收测定，扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm，并以未经热处理的氰钴胺储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算蛋白/氰钴胺结合体的分解率：
做时间与分解率的相关曲线，横坐标为时间，纵坐标为分解率(根据分解率公式计算)，做标准曲线，定量表达分解率与时间之间的关系；
最后对辐照处理影响做出评价。
5)结果分析
由图1中可以看出，经α-乳白蛋白结合的氰钴铵在光辐照影响下，分解率明显低于未经任何保护的对照组，说明利用α-乳白蛋白结合氰钴铵能有效地提高氰钴铵的稳定性，其中用0.5μMα-乳白蛋白和0.75μMα-乳白蛋白结合组保护作用较强。
由图2中可以看出，经α-乳白蛋白结合的氰钴铵在热处理过程中，分解率明显低于未经任何保护的对照组，说明利用α-乳白蛋白结合氰钴铵能有效地提高氰钴铵的稳定性，从整体上看，0.75μMα-乳白蛋白结合组保护作用较强。
实施例2
1)配制腺钴胺及蛋白储备液
取适量腺钴胺标品，溶于pH＝6.0的PBS中，配成1mg/L的腺钴胺储备液；取适量α-乳白蛋白，溶于pH＝6.0的PBS中，配成2μM的蛋白储备液，并蛋白储备液按梯度稀释成0.25,0.5,0.75μM的浓度。
2)蛋白/腺钴胺缓冲溶液体系制备
在包裹铝箔纸的烧杯中加入腺钴胺储备液、α-乳白蛋白稀释储备液，加入体积比为1:1，制成不同浓度梯度的蛋白/腺钴胺缓冲溶液体系，于室温下暗处静置1h。
3)辐照处理影响评价
将步骤1)中的腺钴胺储备液及步骤2)中不同浓度梯度的蛋白/腺钴胺缓冲溶液体系置于距离紫外灯15cm处，辐照时长为2h，每间隔15min进行紫外吸收测定，扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm，并以未经辐照的腺钴胺储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算蛋白/腺钴胺结合体的分解率：
做时间与分解率的相关曲线，横坐标为时间，纵坐标为分解率(根据分解率公式计算)，做标准曲线，定量表达分解率与时间之间的关系；
最后对辐照处理影响做出评价。
4)热处理影响评价
将步骤1)中的腺钴胺储备液及步骤2)中不同浓度梯度的蛋白/腺钴胺缓冲溶液体系置于80～85℃的水浴锅中，恒温避光水浴加热2h，每间隔15min进行紫外吸收测定，扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm，并以未经热处理的腺钴胺储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算蛋白/腺钴胺结合体的分解率：
做时间与分解率的相关曲线，横坐标为时间，纵坐标为分解率(根据分解率公式计算)，做标准曲线，定量表达分解率与时间之间的关系；
最后对辐照处理影响做出评价。
5)结果分析
由图3中可以看出，经α-乳白蛋白结合的腺钴胺在光辐照影响下，分解率明显低于未经任何保护的对照组，说明利用α-乳白蛋白结合腺钴胺能有效地提高腺钴胺的稳定性，其中用浓度为0.25、0.5和0.75μM的α-乳白蛋白结合腺钴胺的保护作用均较强。
由图4中可以看出，经α-乳白蛋白结合的腺钴胺在热处理过程中，分解率明显低于未经任何保护的对照组，说明利用α-乳白蛋白结合腺钴胺能有效地提高腺钴胺的稳定性，其中用浓度为0.25、0.5和0.75μM的α-乳白蛋白结合腺钴胺的保护作用均较强，0.75μMα-乳白蛋白结合组保护作用最强。
实施例3
1)配制氰钴胺及蛋白储备液
取适量氰钴胺标品，溶于pH＝6.0的PBS中，配成1mg/L的氰钴胺储备液；取适量β-乳球蛋白，溶于pH＝6.0的PBS中，配成2μM的蛋白储备液，并蛋白储备液按梯度稀释成0.25,0.5,0.75μM的浓度。
2)蛋白/氰钴胺缓冲溶液体系制备
在包裹铝箔纸的烧杯中加入氰钴胺储备液、β-乳球蛋白稀释储备液，加入体积比为1:1，制成不同浓度梯度的蛋白/氰钴胺缓冲溶液体系，于室温下暗处静置1h。
3)辐照处理影响评价
将步骤1)中的氰钴胺储备液及步骤2)中不同浓度梯度的蛋白/氰钴胺缓冲溶液体系置于距离紫外灯15cm处，辐照时长为2h，每间隔15min进行紫外吸收测定，扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm，并以未经辐照的氰钴胺储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算蛋白/氰钴胺的分解率：
做时间与分解率的相关曲线，横坐标为时间，纵坐标为分解率(根据分解率公式计算)，做标准曲线，定量表达分解率与时间之间的关系；
最后对辐照处理影响做出评价。
4)热处理影响评价
将步骤1)中的氰钴胺储备液及步骤2)中不同浓度梯度的蛋白/氰钴胺缓冲溶液体系置于80～85℃的水浴锅中，恒温避光水浴加热2h，每间隔15min进行紫外吸收测定，扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm，并以未经热处理的氰钴胺储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算蛋白/氰钴胺的分解率：
做时间与分解率的相关曲线，横坐标为时间，纵坐标为分解率(根据分解率公式计算)，做标准曲线，定量表达分解率与时间之间的关系；
最后对辐照处理影响做出评价。
5)结果分析
由图5中可以看出，经β-乳球蛋白结合的氰钴铵在光辐照影响下，分解率明显低于未经任何保护的对照组，说明利用β-乳球蛋白结合氰钴铵能有效地提高氰钴铵的稳定性，其中用0.5μMα-乳白蛋白结合组保护作用最强。
由图6中可以看出，经β-乳球蛋白结合的氰钴铵在热处理过程中，分解率明显低于未经任何保护的对照组，说明利用β-乳球蛋白结合氰钴铵能明显地提高氰钴铵的稳定性，从整体上看，0.75μMβ-乳球蛋白结合组保护作用最强。
实施例4
1)配制腺钴胺及蛋白储备液
取适量腺钴胺标品，溶于pH＝6.0的PBS中，配成1mg/L的腺钴胺储备液；取适量β-乳球蛋白，溶于pH＝6.0的PBS中，配成2μM的蛋白储备液，并蛋白储备液按梯度稀释成0.25,0.5,0.75μM的浓度。
2)蛋白/腺钴胺缓冲溶液体系制备
在包裹铝箔纸的烧杯中加入腺钴胺储备液、β-乳球蛋白稀释储备液，加入体积比为1:1，制成不同浓度梯度的蛋白/腺钴胺缓冲溶液体系，于室温下暗处静置1h。
3)辐照处理影响评价
将步骤1)中的腺钴胺储备液及步骤2)中不同浓度梯度的蛋白/腺钴胺缓冲溶液体系置于距离紫外灯15cm处，辐照时长为2h，每间隔15min进行紫外吸收测定，扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm，并以未经辐照的腺钴胺储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算蛋白/腺钴胺的分解率：
做时间与分解率的相关曲线，横坐标为时间，纵坐标为分解率(根据分解率公式计算)，做标准曲线，定量表达分解率与时间之间的关系；
最后对辐照处理影响做出评价。
4)热处理影响评价
将步骤1)中的腺钴胺储备液及步骤2)中不同浓度梯度的蛋白/腺钴胺缓冲溶液体系置于80～85℃的水浴锅中，恒温避光水浴加热2h，每间隔15min进行紫外吸收测定，扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm，并以未经热处理的腺钴胺储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算蛋白/腺钴胺的分解率：
做时间与分解率的相关曲线，横坐标为时间，纵坐标为分解率(根据分解率公式计算)，做标准曲线，定量表达分解率与时间之间的关系；
最后对辐照处理影响做出评价。
5)结果分析
由图7中可以看出，经β-乳球蛋白结合的腺钴胺在光辐照影响下，分解率明显低于未经任何保护的对照组，说明利用β-乳球蛋白结合腺钴胺能有效地提高腺钴胺的稳定性，其中用浓度为0.25、0.5和0.75μM的β-乳球蛋白结合腺钴胺的保护作用均较强。
由图8中可以看出，经β-乳球蛋白结合的腺钴胺在热处理过程中，分解率明显低于未经任何保护的对照组，说明利用β-乳球蛋白结合腺钴胺能明显地提高腺钴胺的稳定性，从整体上看，0.75μMβ-乳球蛋白结合组保护作用最强。
Claims (4)
1.一种评价辐照过程对钴胺素-蛋白结合体影响的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制钴胺素及蛋白储备液：取钴胺素标准品，溶于pH＝6.0的PBS中，配成1mg/L的钴胺素储备液；取α-乳白蛋白或β-乳球蛋白，溶于pH＝6.0的PBS中，配成2μM的蛋白储备液，并将蛋白储备液按梯度稀释成0.25、0.5和0.75μM浓度的蛋白稀释储备液；
(2)钴胺素与蛋白配位结合：在包裹铝箔纸的烧杯中加入体积比为1:1的钴胺素储备液、α-乳白蛋白或β-乳球蛋白稀释储备液，制成不同浓度梯度的蛋白-钴胺素缓冲溶液体系，于室温下暗处静置1h；
(3)辐照处理影响评价：将步骤(1)中的钴胺素储备液及步骤(2)中不同浓度梯度的蛋白-钴胺素缓冲溶液体系置于距离紫外灯15～20cm处，辐照时长为2h，每间隔15～20min进行紫外吸收测定，并以未经辐照的钴胺素储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算钴胺素-蛋白结合体的分解率：
最后对辐照处理影响做出评价。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，紫外吸收扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm。
3.一种评价热处理过程对钴胺素-蛋白结合体影响的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配制钴胺素及蛋白储备液：取钴胺素标准品，溶于pH＝6.0的PBS中，配成1mg/L的钴胺素储备液；取α-乳白蛋白或β-乳球蛋白，溶于pH＝6.0的PBS中，配成2μM的蛋白储备液，并将蛋白储备液按梯度稀释成0.25、0.5和0.75μM浓度的蛋白稀释储备液；
(2)钴胺素与蛋白配位结合：在包裹铝箔纸的烧杯中加入体积比为1:1的钴胺素储备液、α-乳白蛋白或β-乳球蛋白稀释储备液，制成不同浓度梯度的蛋白-钴胺素缓冲溶液体系，于室温下暗处静置1h；
(3)热处理影响评价：将步骤(1)中的钴胺素储备液及步骤(2)中不同浓度梯度的蛋白-钴胺素缓冲溶液体系置于80～85℃的水浴锅中，恒温避光水浴加热2h，每间隔15～20min进行紫外吸收测定，并以未经热处理的钴胺素储备液作为对照，通过紫外吸收强度的差异，计算钴胺素-蛋白结合体的分解率：
最后对热处理影响做出评价。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，紫外吸收扫描波段为300nm到600nm，采样间隔为1nm。
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| US4436658A (en) * | 1981-05-15 | 1984-03-13 | Societe Nationale Elf Aquitaine | Process of extraction of lactoferrine and immunoglobulins of milk |
| US6013279A (en) * | 1994-12-08 | 2000-01-11 | Klett-Loch; Lore Maria | Combination preparation for stimulating the growth of hair and optionally the growth of skin and nails as well as for preventing or eliminating the loss of hair |
| CN1530659A (zh) * | 1998-09-18 | 2004-09-22 | ����-��ϣ�ɷݹ�˾ | 钴胺素的分析方法和试剂盒 |
| CN103575914A (zh) * | 2012-08-02 | 2014-02-12 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 检测维生素b12的酶联免疫试剂盒及其应用 |
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Patent Citations (4)
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| CN103575914A (zh) * | 2012-08-02 | 2014-02-12 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 检测维生素b12的酶联免疫试剂盒及其应用 |
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