CZ2001975A3 - Způsob stanovení kobalaminu - Google Patents
Způsob stanovení kobalaminu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2001975A3 CZ2001975A3 CZ2001975A CZ2001975A CZ2001975A3 CZ 2001975 A3 CZ2001975 A3 CZ 2001975A3 CZ 2001975 A CZ2001975 A CZ 2001975A CZ 2001975 A CZ2001975 A CZ 2001975A CZ 2001975 A3 CZ2001975 A3 CZ 2001975A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- holo
- ligand
- immobilized
- cobalamin
- binding
- Prior art date
Links
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 title claims abstract description 120
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 54
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 175
- 102100040423 Transcobalamin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 126
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 27
- 102000011409 Transcobalamins Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108010023603 Transcobalamins Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 83
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 26
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 21
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 19
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 claims description 6
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 125000003346 cobalamin group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 claims 1
- 108091009686 cobalamin binding proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 69
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 30
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 20
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 20
- 208000002670 vitamin B12 deficiency Diseases 0.000 description 14
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 9
- PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N [125I][125I] Chemical compound [125I][125I] PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N 0.000 description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 102100040396 Transcobalamin-1 Human genes 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 description 4
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 description 4
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N potassium cyanide Chemical compound [K+].N#[C-] NNFCIKHAZHQZJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 101000891321 Homo sapiens Transcobalamin-2 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010037180 Psychiatric symptoms Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- ZIYVHBGGAOATLY-UHFFFAOYSA-N methylmalonic acid Chemical compound OC(=O)C(C)C(O)=O ZIYVHBGGAOATLY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 2
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- OAJLVMGLJZXSGX-NDSREFPTSA-L (2r,3s,4s,5r)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-methanidyloxolane-3,4-diol;cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12 Chemical compound [Co+3].O[C@H]1[C@H](O)[C@@H]([CH2-])O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1.C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O OAJLVMGLJZXSGX-NDSREFPTSA-L 0.000 description 1
- MZFOKIKEPGUZEN-AGCMQPJKSA-N (R)-methylmalonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)[C@@H](C(O)=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MZFOKIKEPGUZEN-AGCMQPJKSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-amino-6-iminoxanthen-9-yl)benzoic acid;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 3-[dimethyl-[3-[[(4r)-4-[(3r,5s,7r,8r,9s,10s,12s,13r,14s,17r)-3,7,12-trihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]pentanoyl]amino]propyl]azaniumyl]-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)CS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 GUQQBLRVXOUDTN-XOHPMCGNSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010002065 Anaemia megaloblastic Diseases 0.000 description 1
- 102100037293 Atrial natriuretic peptide-converting enzyme Human genes 0.000 description 1
- 101710133555 Atrial natriuretic peptide-converting enzyme Proteins 0.000 description 1
- 208000004300 Atrophic Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108050001427 Avidin/streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 235000000177 Indigofera tinctoria Nutrition 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000000682 Megaloblastic Anemia Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000008457 Neurologic Manifestations Diseases 0.000 description 1
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000031845 Pernicious anaemia Diseases 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710124862 Transcobalamin-2 Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000000987 azo dye Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 1
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 1
- 239000001752 chlorophylls and chlorophyllins Substances 0.000 description 1
- 208000016644 chronic atrophic gastritis Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001867 cobalamins Chemical class 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical group [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-UHFFFAOYSA-M cobalt(2+);[5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] 1-[3-[2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7,12,17-tetrahydro-1h-corrin-21-id-3-yl]propanoylamino]propan-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].OCC1OC(N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)C(O)C1OP(O)(=O)OC(C)CNC(=O)CCC1(C)C(CC(N)=O)C2[N-]\C1=C(C)/C(C(C\1(C)C)CCC(N)=O)=N/C/1=C\C(C(C/1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\1=C(C)/C1=NC2(C)C(C)(CC(N)=O)C1CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011549 displacement method Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N dodecyldimethylamine N-oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] SYELZBGXAIXKHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- -1 filters Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229940097275 indigo Drugs 0.000 description 1
- COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N indigo powder Natural products N1C2=CC=CC=C2C(=O)C1=C1C(=O)C2=CC=CC=C2N1 COHYTHOBJLSHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229940029329 intrinsic factor Drugs 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- SRJOCJYGOFTFLH-UHFFFAOYSA-N isonipecotic acid Chemical compound OC(=O)C1CCNCC1 SRJOCJYGOFTFLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 231100001016 megaloblastic anemia Toxicity 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000007672 methylcobalamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011585 methylcobalamin Substances 0.000 description 1
- JEWJRMKHSMTXPP-BYFNXCQMSA-M methylcobalamin Chemical compound C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O JEWJRMKHSMTXPP-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 1
- 238000002816 microbial assay Methods 0.000 description 1
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 150000003901 oxalic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000004893 oxazines Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000005234 proximal tubule cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012205 qualitative assay Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000002821 scintillation proximity assay Methods 0.000 description 1
- 238000012206 semi-quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N succinyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 VNOYUJKHFWYWIR-ITIYDSSPSA-N 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000004897 thiazines Chemical class 0.000 description 1
- 150000005075 thioxanthenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000003918 triazines Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003732 xanthenes Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Lubrication Of Internal Combustion Engines (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Cable Accessories (AREA)
- Liquid Developers In Electrophotography (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Devices For Conveying Motion By Means Of Endless Flexible Members (AREA)
- Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
- Polyamides (AREA)
Description
Předkládaný vynález se týká testovacích metod pro stanovení kobalaminu nebo vitaminu B12 v tělesné tekutině a zvláště testovacích metod pro metabolicky aktivní zásobu kobalaminu.
Dosavadní stav techniky
Kobalamin nebo vitamin B12 je vitamin rozpustný ve voděf který tvoří část komplexu vitaminů B, které se nacházejí v potravinách. Jádro molekuly se skládá z korinového kruhu složeného ze čtyř pyrrolových jednotek, které obklopují nezbytný atom kobaltu. Kobalamin je jediný vitamin, který nemohou syntetizovat zvířata ani rostliny a musí být absorbován z potraviny ve střevě. Může však být uchováván v játrech. Je syntetizován mikroorganismy, zvláště anaerobními bakteriemi a kvasinkami.
Kobalamin funguje in vivo jako koenzym a kobalaminové enzymy katalyzují tři typy reakcí: (i) intramolekulární přeuspořádání, například tvorba sukcinyl CoA z L-methylmalonyl CoA, (ii) methylace, například tvorba methioninu methylací homocysteinu a (iii) redukce ribonukleotidů na deoxyribonukleotidy v některých mikroorganismech. U savců jsou známy pouze dvě enzymatické reakce vyžadující kobalamin jako koenzym, a to reakce konkrétně uvedené v částech (i) a (ii) výše.
Při procesu trávení váže protein slin nazývaný haptokorin, dále označovaný jako HC (který se také v oboru označuje jako látka vázající R, neboli R-binder nebo souhrnně transkobalaminy I a III) kobalamin v hodním gastrointestinálním traktu za vytvoření komplexu, který prochází přes žaludek. Pankreatické enzymy štěpí komplex • ·· • · · · *4 · · · ·· · · • · · · · * · « · ···· ·· ·· e«* ·«
-2 kobalamin-haptokorin (holo-HC) v ileu, přičemž je uvolňován kobalamin, který se potom váže na protein nazývaný „vnitřní (intrinsic) factor“, který je sekrenován žaludeční sliznicí, za vytvoření dalšího komplexu. Komplex kobalamin - vnitřní factor se váže na specifický 5 receptor ve výstelce terminálního ilea a potom je štěpen uvolňujícím faktorem (releasing factor) a kobalamin je aktivně transportován přes membránu ilea do krevního oběhu.
Kobalamin necirkuluje v těle ve významném množství ve volné formě, Pravděpodobně přibližně 99 % kobalaminu je vázáno jedním io z transkobalaminových proteinů (TC l-lll) nebo albuminem.
Protein, o kterém se předpokládá, že je odpovědný za transport kobalaminu do cílových tkání, se transkobalamin II (TC II), kritický stopový protein, bez kterého nemůže kobalamin procházet buněčnými membránami. Přes tuto důležitou metabolickou funkci je pouze 15 přibližně 6 až 25 % kobalaminu v séru navázáno na TC II, a většina je přenášena HC. TC II je jednořetězcový polypeptid s molekulovou hmotností 45 kDa (45 000), který se primárně nalézá v séru, semenné kapalině a cerebrospinální tekutině. Kobalamin navázaný na TC II nebo holo-TC II, se váže na specifické receptory na buněčných 2o membránách, a jakmile je navázán, komplex holo-TC II se do buněk převádí mechanismem pinocytózy.
TC II je syntetizován v játrech, cévním endotheliu, enterocytech, makrofázích a fibroblastech a cirkuluje převážně ve formě apo-TC II, tj. bez navázaného kobalaminu. Má kratší poločas, přibližně 90 min.
S TC II je spojena pouze méně než jedna čtvrtina celkového kobalaminu v plasmě. Zbytek je navázán na jiné transkobalaminy nebo albumin, jak bylo uvedeno výše.
Protože kobalamin musí být absorbován z potravy, jakýkoli stav, jehož důsledkem je například nesprávná žaludeční funkce, 30 gastroenteritida nebo stavy vedoucí k atrofii žaludku, nebo neschopnost produkovat funkční haptokorin, vnitřní faktor, uvolňující • *· * ·*« ·« ·
-3(releasing) faktor, TC II nebo receptory TC II, může vést k nesprávnému příjmu kobalaminu a k jeho deficienci.
Některé populační podskupiny, například starší osoby, těhotné ženy, pacienti s chronickým nebo akutním gastrointestinálním onemocněním, osoby trpící určitými autoimunitními onemocněními, osoby s rodinnou historií perniciózní anemie a osoby trpící AIDS, jsou k deficienci kobalaminu zvláště náchylné.
Klinické projevy deficience kobalaminu jsou různé a početné, ale primárně zahrnují anemii, megaloblastickou hematopoézu a funkční a strukturní poruchy nervového systému. Přibližně 60 % jednotlivců, u kterých je deficience kobalaminu diagnostikována, je anemických, ale u mnoha jsou jedinými pozorovanými klinickými příznaky neurologické projevy. Přibližně 10% pacientů má psychiatrické příznaky a přibližně 40 % má jak neurologické, tak i psychiatrické příznaky.
Časná diagnóza deficience kobalaminu je klíčová pro zajištění dobré prognózy pro pacienty, protože některé z projevů deficience kobalaminu, zvláště neuropsychiatrické projevy, jsou ireverzibilní, jestliže nejsou rychle detekovány a léčeny kobalaminovou terapií.
Proto je žádoucí přesně zjistit hladinu kobalaminu u jednotlivce rychlým a účinným způsobem, s cílem zjistit, zda může jednotlivec trpět deficienci kobalaminu nebo ne.
Měření celkové koncentrace kobalaminu v plasmě, tj. kobalaminu (a látek podobných kobalaminu) navázaného na některý z transkobalaminových (TC) proteinů I, II a III, již bylo ve snaze zjistit deficienci kobalaminu používáno. Tento způsob vede k široké distribuci koncentrací u populace, která je považována za normální a tím se získá široké referenční rozmezí. U jednotlivce však je rozmezí dostupného kobalaminu považované pro tohoto jednotlivce za normální velmi úzké. Bylo pozorováno, že i když se u jednotlivce posunula koncentrace metabolicky aktivního kobalaminu mimo jeho
I «tt φ Φ· · • φ · · · « φ · φ φ φ • · · · · 9«·· ••«4 *· ΦΦ ΦφΦ ΦΦ φφφ
-4 vlastní referenční rozmezí, celková hladina kobalaminu zůstává v rozmezí, které je považováno pro populaci za normální. Za těchto podmínek může zůstat deficience kobalaminu nedetekována. Taková nespolehlivá metoda je jasně nežádoucí a je dobře zjištěno, že taková měření kobalaminu v séru nebo plasmě mají nízkou diagnostickou citlivost a specificitu.
Pro měření koncentrace kobalaminu v plasmě byly vyvinuty a používány mikrobiální testy zahrnující mikroorganismy, jejichž růst je závislý na kobalaminu, avšak navíc k obtížím při odhadování vhodného referenčního rozmezí vyžadují tyto metody extrakci a konverzi kobalaminů, která je velmi časově náročná, obtížná a zcela nevhodná pro rychlé laboratorní vyšetření.
Alternativní metody pro zjišťování deficience kobalaminu zahrnují měření akumulace metabolitů v plasmě, které vyžadují pro svou konverzi kobalamin. Hodnoty methylmalonátu v plasmě a homocysteinu v plasmě se u jednotlivců s deficiencí kobalaminu zvyšují (Chanarin, The megaloblastic anaemia; London, Blackwell Scientific Publications, 1991) a a tyto látky jsou proto dobrými zástupci molekul vhodných pro korelaci s deficiencí vitaminu B12· Ukázalo se však, že metody založené na zjišťování homocysteinu jsou komplikované, nepraktické a mají špatnou specificitu a citlivost. I když metody založené na měření methylmalonátu jsou přesné a spolehlivé, jsou nákladné a vyžadují analýzu kombinací plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie, a jsou tedy drahé a opět nevhodné pro rudinní klinický screening (Nexo a další (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 61 - 76).
Bylo také navrhováno, že spolehlivý klinický ukazatel deficience kobalaminu může být měření kobalaminu navázaného na TC II jako protiklad celkové koncentrace kobalaminu v plasmě (Herbert a další (1990) Am. J. Hematol. 34: 132 - 139; Wickramasinghe a Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537 - 539; US patent 4680273). Tyto snahy • · • ··· • · ··· · · · · « · • * · · · · · · * ··♦· «· ·· ·«· ·· ··· -5o stanovení koncentrace holo-TC II však byly dosud většinou nepřímé, tedy odhadující koncentraci holo-TC II jako rozdíl mezi celkovou koncentrací kobalaminu v plasmě a koncentraci kobalaminu v plasmě zbavené TC II.
Toto odstraňování TC II se může provádět adsorpcí na síran amonný (Carmel (1974) Am. J. Clin. Pathol. 62: 367 - 372), mikročástice silikagelu (Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest. 58: 332 337: Wíckramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537 - 539), mikrojemné sklo (Vu a další (1993) Am. J. Hematol. 42: 202 - 211) nebo imobilizované polyklonální protilátky anti-TC II (Lindemans a další (1983) Clin. Chim. Acta 132: 53 - 61). Koncentrace kobalaminu v celkové plasmě a frakci zbavené TC II se provádí metodami dobře známými v oboru, jako jsou radioaktivně nebo enzymaticky značené imunologické testy. Tyto metody jsou nevhodné pro rutinní automatizovaný i neautomatizovaný screening, protože jsou složité a časově náročné, a protože nízký stupeň specificity použitých adsorpčních materiálů vede k nedostatečné separaci holo-TC II a holo-HC, což má za následek nadhodnocení holo-TC II. Variace od šarže k šarži adsorpčního materiálu zavádí další chyby, a co je nejdůležitější, odečítání jednoho velkého objemu od dalšího velkého objemu vede k nepřijatelným nepřesnostem a nespolehlivosti.
Další pokusy o stanovení TC II zahrnovaly separaci TC II od dalších složek séra, včetně TC I a TC III, založenou na lipofilním charakteru TC II. Tak například Kapel a další (1988) Clin chim. Acta 172: 297 - 310, Benhayoun a další (1993) Acta Haematol. 89: 195 199 a Toft a další (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 popisují metody pro separaci TC II od jiných transkobalaminů s použitím materiálu heparin-sepharose, silikagelu, popřípadě celulózy. Tyto metody však mají stejné nevýhody jako nepřímé metody, protože jsou založeny na stejných adsorpčních materiálech. Rovněž nízká koncentrace holo-TC II v plasmě způsobuje nevhodnost těchto metod pro kombinaci s existujícími metodami kvantitativního stanovení • *· • · ··· • · · · · · · * ···· · ·· ··· ·· ··· -6 kobalaminu. Normální rozmezí koncentraci holo-TC II je 35 až 160 pM a jako ukazatelé deficience kobalaminu jsou obecně považovány již hodnoty nižší než 35 pM. Uváděná analytická citlivost většiny rutinných metod pro stanovení kobalaminu v plasmě je přibližně 40 pM, ale v praxi je často mnohem vyšší, typicky v okolí 90 pM. Proto jsou normální plasmatické koncentrace holo-TC II nižší než mez citlivosti nebo v blízkosti této meze pro rutinní metody pro kvantifikaci kobalaminu.
Nejpřesnější současná metoda pro zjišťování kobalaminu navázaného na TC II zahrnuje adsorpci TC II na oxid křemičitý a potom testováni navázané frakce na obsah kobalaminu s použitím bucf imunologického testu, jak je například popsán v Kuemmerle a další (1992) Clin. Chem, 38/10: 2073 - 2077, nebo mikrobiologického testu, který zřejmě poskytuje nejlepší výsledky. Tato metoda vyžaduje pro provedení pouze dvaceti analýz celý pracovní den. Je velmi nákladná a nepraktická a špatně se hodí pro rutinní klinická diagnostická laboratorní vyšetření.
Existuje tedy velká potřeba zlepšených metod pro testování hladiny metabolicky aktivního kobalaminu v tělesné tekutině, s ohledem na korelaci hladiny kobalaminu s pravděpodobností deficience kobalaminu, které jsou použitelné v rutinních klinických diagnostických aplikacích.
Podstata vynálezu
Podle prvního provedení tedy předkládaný vynález popisuje testovací metodu pro stanovení kobalaminu navázaného na transkobalamin II v tělesném vzorku, který zahrnuje přivedení bezbuněčného vzorku tělesné tekutiny do styku s imobilizovaným nebo imobilizovatelným specifickým vazebným ligandem pro TC II nebo holo-TC II, oddělení frakce navázané na ligand od frakce nenavázané * *· • ··· ····· ···· ···· ·· *· ··· ·· ««·
- 7 na ligand a měření holo-TC II nebo kobalaminu navázaného na TC II v této frakci.
Pod specifickým vazebným ligandem se míní ligand, který se váže na TC II (tj. apo-TC II a holo-TC II) nebo holo-TC II působením specifické chemické struktury nebo konformace a nejen jednoduše působeném všeobecných fyzikálně-chemických vlastností (jako je lipofilicita), které mohou být společné mnoha složkám vzorku tělesné tekutiny. Vazebná afinita a specificita ligandů vhodných pro použití v předkládané metodě s výhodou umožňuje trojnásobné, výhodněji pětinásobné a ještě výhodněji desetinásobné a nejvýhodněji více než desetinásobné zakoncentrování TC II nebo holo-TC II ve vzorku, a tím je taková metoda schopna poskytnout přesné a spolehlivé hodnoty pro holo-TC II v dolní hranici normálního rozmezí holo-TC II a také v subnormální oblasti. Tato separace a zakoncentrování cílových molekul není běžnými existujícími metodami, které nejsou schopny účinné separovat TC II nebo holo-TC II od HC nebo holo-HC, možná. Schopnost zakoncentrovat TC II nebo holo-TC II alespoň trojnásobně umožňuje použití automatického analytického vybavení při provádění testu. Bez takového kroku zakoncentrování bude množství analytu přítomné ve vzorku pravděpodobně nižší než dolní detekční limit. Takové automatické analytické zařízeni typicky vyžaduje pro svůj provoz mezi 40 a 100 μ! vzorku v celkovém objemu typicky 150 pí nebo vyšším. Analyt s nízkou koncentrací se tedy pro analýzu ještě dále ředí. Použitím testovací metody podle vynálezu je však analyt zakoncentrován alespoň trojnásobně. Protože použití takového automatického analytického zařízeni typicky zahrnuje rozmezí 100 až 700 pM s dolním limitem citlivosti přibližně 40 pM, ale praktickým dolním limitem přibližné 90 pM, pětinásobné zakoncentrování umožňuje měření holo-TC II již v koncentraci do 18 pM a desetinásobné zakoncentrování umožní měření až do koncentrace 9 pM holo-TC II. Protože předkládaný vynález umožňuje zakoncentrování více než desetinásobné, odborník v oboru snadno • ·· • ···
-8porozumí míru zvýšení citlivosti za získání velmi výkonné analytické metody.
Schopnost zakoncentrování analytu takovým způsobem, že je umožněna jeho analýza těmito automatizovanými postupy, je důležitou výhodou předkládané testovací metody. Bude vytvořeno s výhodou od 600 μΙ výchozího vzorku tělesné kapaliny, objemu až do 150 μΙ, výhodněji až do 100 μΙ a nejvýhodněji méně než 60 μΙ, který může být analyzován, popřípadě s použitím automatických postupů. Při způsobu podle vynálezu může být použit jakýkoli ligand, který se specificky váže na TC II, bud jako zachycující, koncentrující a separující ligand nebo detekční ligand, a v závislosti na konkrétním provedení vynálezu se může vázat na TC II jak v apoformě tak i holoformě, nebo se může specificky nebo přednostně vázat na holoformu. Ligand, který se váže na TC II, bude s výhodou vykazovat vysoký stupeň selektivity a specificity vzhledem k TC II a bude mít s výhodou nízkou, nebo výhodněji v podstatě žádnou afinitu k jiným proteinům TC, tj. TC I nebo III, jak v apoformě, tak i holoformě, nebo jakémukoli jinému proteinu vázajícímu kobalamin. Jestliže ligand vázající TC II je ligand specificky vázající holo-TC II, dalším požadavkem je, aby vykazoval nízkou nebo s výhodou žádnou aktivitu vzhledem k apo-TC II.
Ligand vázající TC II nebo holo-TC II bude obecně bud protilátka nebo fragment protilátky nebo sloučenina s afinitou pro TC II nebo holo-TC II, jako je receptor na povrchu buňky, polypeptid nebo oligopeptid, malá organická molekula apod. Dalšími vazebnými ligandy mohou být specifické vázající se sloučeniny vybrané z knihovny kombinační chemie nebo knihovny prezentované fágem nebo specificky se vázající sekvence DNA nebo RNA.
Jestliže je vazebným ligandem protilátka, může být polyklonální, ale s výhodou bude monoklonální. Monoklonální protilátky mohou být vytvářeny s mnohem vyšší specificitou a stejnorodostí než polyklonální protilátky, což snižuje křížovou reaktivitu s jinými složkami tělesné • ·· • ··· • ·
-9tekutiny, zvláště jinými transkobalaminy, a kde je to vhodné, alternativní konformací, tj. apoformou cílového analytu. Stejnorodost a reprodukovatelnost poskytovaná monoklonálními protilátkami vzhledem k polyklonálním protilátkám zajišťuje vyšší přenosí, která je klíčová pro jakýkoli test, při kterém má analyt tak nízkou koncentraci. Alternativně může být ligandem fragment protilátky, například F(ab), F(ab’)2 nebo F(v) fragment. Protilátky nebo fragmenty protilátek mohou být monovalentní nebo divalentní a mohou být protukovány hybridomovou technologií nebo mohou být syntetického původu, a mohou být vytvářeny technologií rekombinantní DNA nebo chemickou syntézou. Mohou být například používány jednořetězcové protilátky a jiné deriváty protilátek, nebo látky, které je napodobují. Protilátka může být podle potřeby vytvořena nebo směrována proti jakémukoli epitopu, složce nebo struktuře proteinu TC II nebo holo-TC II.
Vhodné protilátky pro použití jako vazebné ligandy v rámci předkládaného vynálezu se popisují například v Quadros a další (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222: 149 - 154; McLean a další (1997) Blood 89(1): 235 - 242.
Podobně mohou být použity receptorové molekuly schopné vázat apo a holoformy TC II, nebo preferenčně nebo specificky vázat formu holo-TC II. Vhodné receptory jsou receptory pro TC II nebo holo-TC II navázané na povrch buněk nebo membránu, a křížová druhová reaktivita znamená, že mohou být použity receptorové molekuly z jakéhokoli savčího druhu, i když s výhodou pocházející z těchto receptorů člověka nebo skotu. I když jsou molekuly receptorů s výhodou izolovány v relativně purifikované formě, možné je také použití buněčných membrán nebo smíšených membránových frakcí obsahujících receptory, s výhodou v koncentrované formě. Tyto receptory nebo membrány s obsahem receptorů nebo membránové frakce s obsahem receptorů mohou být výhodně izolovány z ledviny, placenty nebo tumorových buněk. Jako zdroj těchto receptorů by obecně neměly být použity buňky z tkáňových kultur. Buňky • ·· * ·»· • · • · · · » · · v « ··♦· ·· ·· ··· »·
- 10 z tkáňových kultur však mohou být použity jako zdroj haptokorinových receptorů.
Membránová frakce obohacená o receptor TC II může být získána podle popisu v Seligman a další, J. Biol. Chem. 253: 1766 1772 (1978) a Nexo a další, Biochem. Biophys. Act. 628: 190 - 200 (1980). Tkáň, například lidská placenta nebo králičí ledvina, se v podstatě nakrájí na malé kousky a homogenizuje se v tris pufru, pH 7,4, obsahujícím 0,15M NaCI a 10 mM EDTA, potom se provede centrifugace při 25 000 x g 30 min. Pro odstranění zbytkové krve se ještě alespoň jednou opakuje proces homogenizace/centrifugace. Tato membránová frakce se dále extrahuje detergentem, například Ammonyx-LO, Triton X-100 nebo Chapso, a vyčeří centrifugací při 100 000 x g 30 min při 4 °C. Supernatant se použije jako zdroj pro receptor TC II.
Jako příklad vhodné receptorové molekuly, která se preferenčně váže na komplex holo-TC II, je možno uvést jednořetězcový glykoprotein s molekulovou hmotností 62 kDa (62 000), který existuje jako nekovalentní homodimer, a nachází se na buněčném povrchu všech tkání (Rothenberg & Quadros (1996) Balliere’s Clinical Haematology 8(3) 499 - 514; WO 96/085150). Další protein vhodný pro použití v testovací metodě podle vynálezu je protein gp300, membránový protein umožňující endocytózu s molekulovou hmotností 600 kDa (600 000), který je exprimován v absorptivních epitheliálních buňkách, například v buňkách ledvinových proximálních tubulů, jak se popisuje v Moestrup a další (1996) Proceedings National Academy Science 93: 8613 - 8617. Tento receptor je receptor LDL a váže jak apo, tak i holoformy TC II. Jestliže se použije receptor buněčného povrchu, může být imobilizován konjugací k povrchu, například kuličkám nebo vrstvě, nebo může být alternativně frakce buněčné membrány obsahující receptory upravena do váčků nebo vrstev, které na povrchu vystavují receptory.
• »· • · ··· • ·
- 11 Jestliže je ligand imobilizovaný, může být imobilizován například na povrchu pevné látky, například filtračního filmu nebo vrstvy, nebo v záhybu nebo trubici, i když zvláště výhodná je imobilizace na částicích, například mikrokuličkách, které vyrábí firma Dyno Industrier ASA, Norsko. Tyto částice mohou být porézní nebo neporézní, a v případě potřeby mohou být opatřeny prostředky, které umožňují jejich oddělení, například zahrnutím částic s magnetickou odezvou, například superparamagnetických krystalů oxidu železa. Tyto mikrokuličky reagující na magnetické pole jsou dostupné u firmy Dyno Industrier ASA stejně jako u firmy Dynal AS, Norsko, Bang Particles, USA a Prolabo, Francie. Jestliže má být ligand imobilizovatelný, na rozdíl od imobilizovaného, může to být provedeno vazbou ligandu na člena specifického vazebného páru (např. biotin/streptavidin) a použitím dalšího členu vazebného páru, popřípadě navázaného na substrát, pro aglomeraci nebo jinou imobilizaci ligandu nebo komplexu ligand : TC II nebo ligand : holo-TC II, před separací frakce navázané na ligand od frakce nenavázané na ligand při provádění metody podle vynálezu.
Způsob imobilizace afinitních molekul, například protilátek a fragmentů protilátek pro separační účely je v oboru dobře známý, a provádí se například vazbou nebo reakcí ligandů, popřípadě pomocí propojovací molekuly, k jakémukoli dobře známému pevnému nosiči nebo matrici, které jsou v současnosti běžně používané nebo navrhované pro separaci nebo imobilizaci na kolonách, a může být použito jakékoli v oboru známé metody. Tyto pevné fáze mohou mít formu částic, vrstev, gelů, filtrů, membrán, vláken nebo kapilár nebo mikrotitračních proužků, trubiček nebo destiček, jamek apod., a vhodně mohou být vyráběny ze skla, oxidu křemičitého, latexu nebo polymerního materiálu. Způsoby vazby ligandu na pevný nosič jsou rovněž extrémně dobře známé a široce popisované v literatuře.
Vazba ligandu na substrát nebo jeden člen specifického vazebného páru může být provedena použitím běžných způsobů.
• · ··· ····· · · · » ···· « ·· ·· ·* ···
-12Metoda podle vynálezu, jestliže se test provádí jako kompetitivní vazebný test, bude obecně shrnovat přidání značené sloučeniny, která soutěží o vazbu na ligand, ke vzorku. Obecně bude výhodné používat v této souvislosti značený holo-TC II. Použitá značka může být jakákoli značka, kterou je možno přímo nebo nepřímo stanovit, například chromofor (tento termín zahrnuje také fluorofor), radioaktivní značka (obecně navázaná kovalentně nebo prostřednictvím chelátu), enzym nebo substrát enzymu, magnetická značka apod.
Výhodné provedení metody podle předkládaného vynálezu zahrnuje uvedení imobilizovaného nebo imobilizovatelného ligandu vázajícího TC II nebo holo-TC II do styku se zkoumaným vzorkem;
oddělení frakce navázané na ligand od frakce nenavázané na ligand;
odštěpení navázaného kobalamínu z molekul holo-TC II v navázané frakci a stanovení koncentrace uvolněného kobalamínu, s výhodou při taklovém provedení odštěpení, že koncentrace uvolněného kobalamínu je alespoň třikrát, s výhodou pětkrát a ještě výhodněji desetkrát vyšší než koncentrace holo-TC II v počátečním vzorku.
Podstata tohoto provedení vynálezu je oddělení a zakoncentrování TC II nebo holo-TC II, což umožňuje úspěšné použití standardních metod stanovení kobalamínu při této metodě. Jak je uvedeno výše, v nepřítomnosti takového kroku zakoncentrování nejsou metody podle dosavadního stavu techniky vhodné pro stanovení kobalamínu, protože je přítomen ve velmi nízké koncentraci. Pro uvolnění kobalamínu z holo-TC II mohou být použity jakékoli vhodné prostředky, ale s výhodou se bude uvolňování provádět teplem nebo změnou pH okolního prostředí. Různé formy kobalamínu mohou být převedeny na kyanokobalamin méně citlivý na světlo působením KCN. V rámci metody podle vynálezu mohou být použity jakékoli vhodné • ·· • · ··* • · ····· ··· ··♦· *· ·· «·* «· ··
- 13 prostředky pro stanovení volného kobalaminu, například kompetitivní test prováděný uvedením imobilizovaného vazebného partnera kobalaminu do styku s disociovaným kobalaminem ze vzorku v přítomnosti značeného ligandu, který s izolovaným kobalaminem soutěží o vazbu na imobilizované vazebné partnery, Vhodný může být například způsob popisovaný v Kuemmerk a další (1992) Clin. Chem. 38: 2073 - 2077. Alternativní způsob pro stanovení volného kobalaminu se popisuje v US patentu No. 5 451,508 a zahrnuje imunologické stanovení.
V tomto provedení vynálezu je výhodné, jestliže jsou vazebné ligandy pro TC II imobilizovány, a vážou se jak na holo, tak i apo-TC II.
V alternativním výhodném provedení zahrnuje testovací metoda podle předkládaného vynálezu uvedení pevného nosiče s imobilizovaným vazebným ligandem TC II nebo holo-TC II do styku se zkoumaným vzorkem a také s neimobilizovaným ligandem, přičemž uvedený imobilizovaný ligand je schopný vazby na TC II nebo holo-TC II, na uvedený neimobilizovaný ligand nebo na komplex uvedeného TC II nebo holo-TC II a uvedeného neimobilizovaného ligandu, a uvedený neimobilizovaný ligand je schopný vazby na alespoň jeden z uvedených imobilizovaných ligandů, TC II nebo holoTC ll a komplexů uvedeného imobilizovaného ligandu a TC II nebo holo-TC II;
přičemž jestliže je tato testovací metoda sendvičový test, alespoň jeden z uvedených ligandů je specifický pro holo-TC II, a jestliže je tento test kompetitivní test, uvedený imobilizovaný ligand je specifický pro holo-TC II a látky, které s ním soutěží;
přičemž podíl uvedeného imobilizovaného ligandu vázaného TC II nebo holo-TC II, uvedeným neimobilizovaným ligandem nebo komplexy uvedeného neimobilizovaného ligandu a TC II nebo holoTC II, je závislý na množství holo-TC II přítomného v uvedeném vzorku, a • ·· • ··· t
····· ·*·· ··*« >» *· »·· ·· ···
- 14 uvedený neimobilizovaný ligand je schopný vytvářet přímo nebo nepřímo detekovatelný signál, jestliže je navázaný nebo jestliže je nenavázaný;
navázaná frakce se oddělí od nenavázané frakce; a přímo nebo nepřímo se stanoví neimobilizovaný ligand navázaný na imobilizovaný ligand (navázaná frakce) nebo nenavázaný a v roztoku (nenavázaná frakce);
přičemž uvedení vzorku a uvedeného neimobilizovaného ligandu s pevným nosičem může být prováděno odděleně, současně nebo postupně, a pokud se provádí odděleně nebo postupně, může být prováděno v jakémkoli pořadí.
Alternativní výhodné provedení metody podle vynálezu tedy v podstatě zahrnuje stanovení neimobilizovaného ligandu, který se přímo nebo nepřímo navázal nebo se alternativně přímo nebo nepřímo nenavázal na imobilizovaný ligand. Jestliže neimobilizovaný ligand soutěží o vazbu na imobilizovaný ligand s holo-TC II, vysoká hladina nenavázaného neimobilizovaného ligandu je ukazatelem vysoké koncentrace hoío-TC II ve vzorku, a nízká hladina nenavázaného neimobilizovaného ligandu je ukazatelem nízké koncentrace holo-TC II ve vzorku. Jestliže se neimobilizovaný ligand váže na TC II nebo holoTC II, který se zase váže na imobilizovaný ligand, potom je vysoká hladina navázaného neimobilizovaného ligandu ukazatelem vysoké koncentrace holo-TC II ve vzorku a nízká hladina navázaného neimobilizovaného ligandu je ukazatelem nízké koncentrace holo-TC II ve vzorku.
Při metodě podle předkládaného vynálezu se proto stanovuje metabolicky aktivní zásoba (pool) kobalaminu měřením koncentrace komplexu holo-TC II nebo měřením množství kobalaminu navázaného na molekuly TC II přítomné v tělesném vzorku, který obsahuje směs jak apo, tak i holo-TC II a apo a holo-HC (haptokorin nebo TC I a III), * · · » · I·· 9 v * ······ · < · 9 « *··«· · · · ♦ ·«·· Η ·· ·«· »· ···
-15Předběžný krok separace se může provádět použitím imobílizovaného kobalaminu nebo analogu nebo fragmentu kobalaminu, který se selektivně váže na apoformy jak TC II, tak i haptokorinu (HC). V takovém předběžném kroku se navážou 5 imobilizovaným kobalaminem, jeho analogem nebo fragmentem apoformy proteinů TC II a HC, a oddělí se od komplexů holo-TC II a holo-HC.
V tomto případě probíhá analýza oddělených holoforem TC II podle jakéhokoli provedení vynálezu tak jak bylo popsáno výše, ale je io zřejmé, že je užitečnější, jestliže stanovení komplexu holo-TC II probíhá jinak než disociací komplexu a následným stanovením uvolněného kobalaminu. Odborníkům v oboru bude zřejmé, že jestliže před uvedeným alternativním výhodným provedením předchází takový předběžný krok, požadavek na specificitu alespoň jednoho ligandu 15 sendvičového testu pro holo-TC II proti TC II a požadavek na specificitu imobílizovaného ligandu v kompetitivním testu pro holoTC II a s ním soutěžící látky proti TC II již není relevantní, protože apoforma TC II již byla zachycena a není již dostupná. Imobilizované nebo neimobilizované ligandy mohou být tedy specifické pro holo-TC II 20 nebo TC II nebo s nimi soutěžící látky.
Imobilizovaný kobalamin by neměl mít jakoukoli významnou tendenci k disociací od svého nosiče, protože to by mohlo vést k vazbě apo-TC II a jeho transformaci na holo-TC II. Biotinylovaný kobalamin se velmi stabilně váže na pevný povrch s navázaným 25 avidinem/streptavidinem a navázáni kobalaminu na nosič tímto způsobem je pro provedení tohoto kroku vhodné. Ve skutečnosti, jestliže se používá biotinylovaný kobalamin, může být přidán do analyzovaného vzorku v neimobilizované formě, jestliže se váže na apoformy TC II a HC. Vzorek potom může být uveden do styku 30 s pevným povrchem obsahujícím imobílizovaného vazebného partnera, pro příklad biotinu avidin. Vytvoří se komplex avidin - biotinylovaný kobalamin - TC II, který může být snadno ze vzorku izolován.
• *. · » ··· > * · ««·*·* ·«·* « ···· ·**· ··«* ·· ·· ··* ·· ··· -16-
V jednom provedení vynálezu, jestliže probíhá tento předběžný separační krok, zásoba holo-TC II je v podstatě stanovena přivedením vzorku do styku s ímobilizovaným ligandem TC II, který zachytí komplex holo-TC II a ponechá haptokorin v roztoku, a potom uvedením imobilizovaného holo-TC II do styku s druhým ligandem TC II, který je značený a tím detekovatelný. Příklady vhodných vazebných ligandů TC II by byly nepřekrývající se monoklonální protilátky nebo samozřejmě polyklonální protilátka specifická pro TC II, které by byly v tomto provedení vhodné jak pro zachycení, tak i detekci, protože jsou na molekulách TC II rozpoznávány různé epitopy.
V dalším provedení vynálezu, kde probíhá tento krok předběžné separace, soutěží molekuly holo-TC II se značeným neimobilizovaným ligandem o vazbu na imobilizovaný ligand, a množství holo-TC II je vypočteno ve vztahu k množství značeného neimobilizovaného ligandu navázaného nebo nenavázaného na imobilizovaný ligand.
Ve výhodném provedení, v předběžném separačním kroku, probíhá vazba apo TC II a apo HC na kobalamin, jeho fragmenty nebo analogy, na takovém místě nebo takovým způsobem, že dojde k inhibici následného rozpoznání a vazby TC II na imobilizovaný kobalamin neimobilizovaným ligandem nebo vazebným partnerem TC II. V tomto provedení není nutné izolovat od navázaných apoforem holo-TC II a holo-HC před provedením testu podle vynálezu. V tomto provedení je velmi důležité místo, proti kterému je neimobilizovaný vazebný partner nebo ligand zaměřen, a mělo by jít o epitop na TC II, který se stane maskovaný nebo zastíněný nebo jinak nedostupný pro vazbu, jestliže dojde k imobilizaci apo-TC II a apo-HC na kobalamin, jeho analog nebo fragment.
Ať už počáteční krok separace zahrnuje použití vazebného ligandu pro TC II, neboje před ním zařazen předběžný krok využívající imobilizovaného kobalaminu, jeho analogů nebo fragmentů, není úplná separace, tj. separace veškerých proteinů apo a holo TC II ze vzorku
- 17****** *··· · «···· ···· ·*·· ·· ·· ··· ·· ··· požadavkem metody a stačí, jestliže se od vzorku oddělí frakce, která obsahuje alespoň část požadované „podmnožiny proteinů TC II“.
V některých provedeních mohou být tedy vazební partneři nebo ligandy a vazebné podmínky voleny tak, aby bylo dosaženo oddělení v podstatě veškeré zvolené „podmnožiny“. V tomto případě může být nenavázaná frakce považována za v podstatě prostou proteinů TC II nebo holo-TC il, tj. z alespoň 80 %, 90 % nebo 95 % prostou buď TC II nebo holo-TC II, v závislosti na tom, která složka je zvolena jako základ pro frakcionaci.
V alternativních provedeních jsou vazebný partner a podmínky reakce voleny tak, aby se do frakce oddělila pouze část proteinů TC II ve vzorku. V tomto případě by měla být věnována pozornost částečnému oddělení při konstrukci standardní kalibrační křivky pro test. V tomto ohledu je vytvoření standardní kalibrační křivky, podle které je možno určit koncentraci detekovaného proteinu holo-TC II, standardní technikou dobře známou v oboru.
Při kroku frakcionace, jestliže se používá ligand vázající TC II, bude umístěna alespoň část kobalaminu navázaného TC II v navázané frakci, a jakýkoli kobalamin přítomný ve vzorku, navázaný na molekuly jiné než TC II, například HC nebo albuminu, budou v nenavázaných (tj. neseparovaných) frakci nebo frakcích. TC II v navázané frakci může být buď apo nebo holoforma a může být v komplexu s látkami podobnými kobalaminu nebo jeho analogy navíc ke kobalaminu.
V případě potřeby může zahrnovat způsob podle vynálezu další krok předběžné separace, při kterém se vzorek uvede do styku s imobilizovaným nebo imobilizovatelným specifickým vazebným ligandem pro haptokorin (v apo a holoformách nebo v samotné holoformě). Tímto způsobem může být snížen příspěvek k chybám při určení kobalaminu navázaného na TC II pocházejícím z holo-HC a mohou být použity specifické vazebné ligandy pro TC il nebo holoTC II, které mají určitou vazebnou afinitu pro haptokoriny.
• ··· • ’··' * • · » » » ···· ··· *« «·· .· ··*
- 18 Jinými slovy, jak je uvedeno výše, protože koncentrace TC II jak v apoformě, tak i v holoformě je v séru velmi nízká, jsou pro funkci vynálezu nezbytné ligandy nebo vazební partneři se zvláště vysokou specificitou a afinitou.
Afinitní konstanty požadované u ligandů podle předkládaného vynálezu také závisí na tom, zda je ligand specifický pro TC II nebo holo-TC II a také na jeho použití jako zachycovacího nebo detekčního ligandu, protože koncentrace TC II v séru je přibližně 0,5 až 1 nM, ale koncentrace holo-TC II je pouze 35 až 160 pM. Pro zachycovací ligand TC II je tedy žádoucí afinitní konstanta alespoň 109M'1, s výhodou vyšší než 2 x 109M'1 a výhodněji 101oM‘1. Pro zachycovací ligand holoTC II je žádoucí afinitní konstanta alespoň 101°M'1, s výhodou 2 x 101°M'1, výhodněji vyšší než 2 x 101°M'1 a nejvýhodněji vyšší než 1011M'1. Je jasné, že afinitní konstanta nutná pro detekční vazebnou látku může být nižší než afinitní konstanta pro vazebný ligand, což je způsobeno koncentračním efektem tohoto testu.
Stupeň křížové reaktivity vazebného ligandu holo-TC II nebo TC Ií s HC by měl být s výhodou nižší než 1 %, výhodněji mezi 0,1 % a 1 % a nejvýhodněji méně než 0,1 %. Podobně vazebný ligand holoTC II by neměl mít s výhodou stupeň křížové reaktivity s apo-TC II vyšší než 1 %, výhodněji mezi 0,1 % a 1 % a nejvýhodněji by měla být křížová reaktivita nižší než 0,1 %.
Použitím ligandů s takto vysokou afinitou přesahuje jejich funkce jednoduchou funkci jako vazebných a/nebo detekčních ligandů, a tyto ligandy mají klíčovou úlohu při schopnosti separace a zakoncentrování proteinu TC II ze vzorku pro analýzu. Vazebné ligandy pro TC II nebo holo-TC II by měly s výhodou ligand zakoncentrovat alespoň trojnásobně, výhodněji pětinásobně a ještě výhodněji alespoň desetinásobně.
V dalším provedení testovací metody, která je příbuznější vytěsňovací metodě než kompetitivní metodě, se vzorek obsahující • ·· • ···
- 19komplex holo-TC II přivede do styku s pevnou fází, na kterou je navázán značený ligand rozpoznávající stejná vazebná místa na imobilizovaných ligandech jako holo-TC II. Holo-TC II ve vzorku soutěží s navázaným značeným ligandem o místa, takže po ekvilibraci systému je přímo úměrný vztah mezi množstvím značeného ligandu vytěsněného z pevného nosiče a detekovatelného v roztoku a množstvím holo-TC II přítomného v původním vzorku. Značený ligand může být detekován přímo nebo nepřímo a může být stanoven jako množství značeného ligandu navázaného nebo nenavázaného na pevný nosič, vždy podle potřeby. Důsledek tohoto provedení je, že neimobilizovaný ligand popisovaný dříve se naváže na imobilizovaný ligand před nanesením vzorku, ale nemělo by to znamenat, že ligand je jakýmkoli způsobem imobilizován.
Další výhodné provedení zahrnuje uvedení vzorku obsahujícího holo-TC II do styku s pevným nosičem, na kterém je imobilizován holoTC II, a značenou neimobilizovanou látkou specificky vázající holoTC II. Volný holo-TC II ve vzorku a imobilizovaný holo-TC II soutěží o vazbu se značeným neimobilizovaným ligandem a stanovení značeného ligandu navázaného na pevnou fázi nebo zbývajícího v roztoku umožní výpočet koncentrace holo-TC II. Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu je značeným neimobilizovaným ligandem vázajícím holo-TC II protilátka.
V ještě dalším provedení se přivede vzorek obsahující analyt, který se stanovuje, do styku se značeným holo-TC II a imobilizovaným ligandem. Značený a neznačený holo-TC II soutěží o vazbu na imobilizovaný ligand a po dosažení ekvilibrace je množství značeného holo-TC II, navázaného na imobilizovaný ligand, nepřímo úměrné množství holo-TC II ve vzorku, o který se zajímáme. Značený holoTC ll může být opět detekován přímo nebo nepřímo a může být stanoven jako množství holo-TC II navázaného nebo nenavázaného na pevný nosič podle potřeby.
» * ♦»*
V dalším provedení předkládaného vynálezu se neimobilizovaný, ale imobilizovatelný ligand specifický pro komplex holo-TC II (například ligand konjugovaný s biotinem nebo jiným členem specifického vazebného páru) přivede do styku se vzorkem za vytvoření komplexu holo-TC ll/neimobilizovaný ligand. Komplex ligand/holo-TC II může být potom z roztoku vysrážen použitím známých prostředků a izolován pro analýzu.
V ještě dalším provedení vynálezu se ke vzorku přidají dva značení vazebné partneři, popřípadě po předběžném kroku jako je odstranění apoforem TC II a HC ze vzorku. Vazební partneři jsou v tomto případě označený holo-TC II nebo jeho analog nebo fragment a jejich značený vazebný partner, například značená protilátka. V tomto provedení se detekovatelný signál vytváří pouze ze značek, které jsou ve vzájemné těsné blízkosti, tj. jestliže se dva značení vazební partneři na sebe navážou. Navíc ke vzorku se tedy značený vazebný partner pro holo-TC II může navázat buď na neznačený holoTC II přítomný ve vzorku, přičemž v tomto případě se nevytvoří žádný detekovaný signál, nebo na značený holo-TC II nebo jeho analog, fragment nebo variantu, který se váže na značeného vazebného partnera TC II, přičemž v tomto případě se detekovatelný signál vytvoří.
Pro zařazení do tohoto provedení jsou vhodné značící látky jako jsou testy Amersham scintillation proximity assays, popisované v US patentu No. 4,568,649, které umožní vysokou citlivost této metody a jsou vhodné pro testy, kde je analyt přítomen v takto nízké koncentraci. Tak například jeden člen vazebného páru by mohl být označen β-emitujícím nuklidem jako je I125 nebo H3 a druhý člen je označen vhodnou scintilační molekulou. Emitované částice β ztrácejí energii v obklopujícím vodném prostředí, pokud není scintilační látka ve vzdálenosti menší než 1,5 pm, což vyžaduje vzájemnou vazbu obou značených partnerů pro vznik detekovatelného signálu. Pravděpodobnost vazby dvou značených partnerů navzájem je * ·· »*· • · *···· ··.· ·»·· ·· ·· ··· ·· ··.
- 21 určována koncentrací holo-TC II přítomného ve vzorku, takže čím vyšší signál se vytváří, tím nižší je koncentrace holo-TC II ve vzorku.
Jak se zde používá, termíny „stanovení“ nebo „zjištění“ zahrnují jak kvantifikaci ve smyslu získání absolutní hodnoty množství nebo koncentrace holo-TC II nebo kobalaminu navázaného na TC II ve vzorku, a také semikvantitativní a kvalitativní zjišťování nebo stanovení. Může být získán index, poměr, procento nebo podobný ukazatel hladiny nebo množství kobalaminu navázaného na TC II, například relativní k celkovému množství kobalaminu.
Tělesný vzorek používaný v testovací metodě podle předkládaného vynálezu může být jakýkoli vzorek s obsahem kobalaminu, například tělesná tekutina nebo vzorek tkáně nebo suspenze atd. S výhodou však bude vzorek tělesná tekutina, například semenná tekutina, cerebrospinální tekutina nebo amniotická tekutina, ale obecně bude vzorek odvozený z krve. Jestliže tomu tak je, vzorek použitý pro analýzu je s výhodou bezbuněčný, například může být použito sérum nebo plasma. Vzorek může být před použitím při testovací metodě zpracován, například může být zředěn přídavkem pufru nebo jiného vodného média a může být před analýzou skladován nebo uchováván například za chlazení nebo mrazení.
Při provádění předkládaného vynálezu, jestliže se navázaná frakce odděluje od nenavázané frakce, může být tato operace prováděna jakýmkoli vhodným způsobem, například srážením, centrifugací, filtrací, chromatografickými metodami apod.
Aby nevznikly pochybnosti, termín „kobalamin“ se zde používá jako synonymum s termínem „vitamin Bi2“ a zahrnuje všechny formy vitaminu B12 (kyanokobalamin; 5,6-dimethylbenzimidazolylkyanokobamid; methylkobalamin; 5’-deoxyadenosylkobalamin), které se mohou vyskytovat a jsou metabolicky aktivní (při vhodné prezentaci) v organismu.
000 • ·· · · ··· 0 0 · 0 0 · · · 0 0 *••00 0 0a _ 22-’..........
Jak je uvedeno výše, při způsobu podle vynálezu může být stanovení kobalaminu navázaného na TC prováděno detekcí ligandu navázaného na oddělený holo-TC II, nebo provedením kompetitivního testu s použitím značeného kompetitora vůči holo-TC II, při kterém holo-TC II soutěží s tímto značeným kompetitorem o vazbu na jeho značený ligand, nebo detekcí kobalaminu uvolněného ze separovaného holo-TC II.
Detekovatelný ligand může být pohodlně označen jakýmkoli vhodným způsobem, například značkou vytvářející signál, který může být stanoven například luminiscencí, chemiluminiscencí, kolorimetrickým testem, fluorescencí, radioaktivně nebo pomocí enzymatické aktivity. Při metodě podle vynálezu může být ve skutečnosti použito jakékoli označení známé v oboru poskytující signál.
Jako příklady je možno uvést některé vhodné příklady barevných nebo fluorescenčních sloučenin, které mohou být použity pro značení vazebného ligandu tak, aby byla umožněna v rámci předkládaného vynálezu detekce: antrachinony, azobarviva, azinová barviva jako jsou oxaziny a thiaziny, triaziny, v přírodě se vyskytující pigmenty jako jsou porfyriny, fykobiliproteiny, včetně fykoerythinů a fykochaninů, chlorofyly a jejich analogy a deriváty, karotenoidy, akrinidiny, xantheny včetně fluoresceinů a rhodaminů, indigová barviva, thioxantheny, kumariny, polymethiny včetně di- a triarylmethinů a jejich derivátů, nebo ftalocyaniny a kovové ftalocyaniny.
Podobně je možno jako značku vytvářející signál v části reakčního činidla použít v rámci předkládaného vynálezu široké rozmezí radioaktivních sloučenin, například sloučeniny značené jodem 125.
Alternativně mohou být vazebné ligandy konjugovány s přírodními nebo syntetickými sloučeninami, které mohou produkovat chemiluminiscenční signál, který může být známým způsobem • ·· • · ··* ····· · * * * ···· ·· ·· ··· *· *·*
-23zjišťován (Cormier, M. J. a další; Chemiluminiscence a Bioluminiscence, Plenům Press, New York 1973). Mezi vhodné chemíluminiscenční sloučeniny patří luciferin, estery kyseliny šťavelové, 1,2-dioxethan, luminol nebo jeho deriváty, ale možné sloučeniny nejsou na uvedené příklady omezeny. Pokud to bude vhodné, mohou být pro získání chemiluminiscenčního signálu z molekul produkujících signál použity například peroxid vodíku, enzymy, například luciferáza nebo další chemická činidla.
Silně aniontové molekuly vytvářející signál nemusí být při metodě podle předkládaného vynálezu výhodné, protože mají sklon vázat se na sérové proteiny, jako je lidský sérový albumin (HSA), které mohou být přítomny ve vzorku. Zvláště vhodné příklady, které mohou být použity, jsou fluoresceinisothiokyanát, rhodamin B nebo (N-hydroxysukcinimidester) kyseliny N-(resorufin-4-karbonyl)piperidin-4-karboxylové nebo resolátky.
Podle jednoho provedení metody podle vynálezu může být frakce obsahující alespoň část TC II oddělena od vzorku tělesné tekutiny reakcí telesné tekutiny s vazebným ligandem specifickým pro TC II a potom oddělením frakce navázané na TC II od zbytku vzorku, čímž se cílový analyt ve vzorku izoluje a zakoncentruje. V jednom provedení vynálezu může být pro stanovení komplexu TC ll-kobalamin, přítomného v oddělené navázané frakci, použit detekovatelný vazebný ligand proti holo-TC II. Holo-TC II vazebný ligand může být přiveden do styku s testovaným vzorkem před, současné nebo po styku s vazebným ligandem TC 00 a před nebo po oddělení frakce navázané na TC II od zbytku vzorku.
Odpovídajícím způsobem může být od zbytku vzorku oddělena frakce obsahující kobalamin (například obsahující holo-TC II a holoHC) reakcí testované tělesné tekutiny s imobilizovaným nebo navázaným kobalaminem nebo jeho analogem nebo fragmentem, který váže apo-TC II a apo-HC, a oddělením od navázané frakce zbytku • ·* · *·** * « *
-24• » · ···· ·* vzorku s obsahem holo-TC II a holo-HC. Detekovatelný vazebný ligand TC II může být potom použit pro detekci komplexu TC ll-kobalamin, přítomného v oddělené frakci. Detekovatelný vazebný ligand TC II může být přiveden do styku s testovaným vzorkem před, současně s nebo po kontaktu s navázaným kobalaminem a před nebo po odděleni navázané frakce od zbytku vzorku.
V některých provedeních mohou být imobilizované ligandy pro jednu nebo další složky komplexů apo a/nebo holo TC ll/HC uspořádány do kolony. Tělesná tekutina obsahující komplex TC II kobalamin může být nanesena na kolonu a přivedena do styku s vazebným ligandem nebo ligandy. Kolona může být proplachována nebo promývána a může být použit eluent v případě potřeby pro uvolnění navázané frakce z kolony a její jímání.
Jestliže mají být analyzovány složky nenavázané frakce popřípadě spolu s dalšími složkami, kolona by měla být s ohledem na další složky promyta pufrem nebo médiem použitím kalibrované mikropipety pro zajištěni přesného známého objemu nanesené a jímané tekutiny. Nanesený objem je s výhodou do 3 % požadovaného (tj. kalibračního) objemu, výhodněji 1 nebo 2 %. Podobně, jestliže se má analyzovaná frakce z kolony před detekcí uvolnit, eluent použitý pro uvolnění komplexu by měl být nanášen použitím kalibrované mikropipety.
V alternativním provedení mohou být vazebné ligandy použité pro separaci frakce vzorku imobilizovány na pevné fázi nosiče ve formě částic, například latexových nebo polymerových kuličkách. Aby byla usnadněna manipulace a separace, mohou být samozřejmě ve výhodném provedení předkládaného vynálezu použity magnetické kuličky. Termín „magnetický“, jak se zde používá, znamená, že nosič je schopen při vložení do magnetického pole získat magnetický moment. Jinými slovy, nosič obsahující magnetické částice může být snadno odstraněn shromážděním v magnetickém poli, což poskytne • ·· > · ··♦ ···· ·· ·· ·«« «« ··*
- 25 rychlou, jednoduchou a účinnou cestu pro oddělení frakcí po navázání ligandu.
Použitím metody podie vynálezu mohou být tedy magnetické částice s navázaným komplexem TC II - kobalamin odstraněny na vhodný povrch použitím magnetického pole, například použitím permanentního magnetu. Obvykle dostačuje přiložit magnet na stranu nádoby obsahující směs vzorku, aby bylo dosaženo seskupení částic u stěny nádoby a jejich izolace pro další analýzu.
Zvláště výhodné jsou superparamagnetické částice, například částice popisované Sintefem v EP-A-106873, protože je možno zabránit magnetické agregaci a tvorbě shluků částic při reakci. Pro použití v rámci předkládaného vynálezu mohou být zvláště vhodné známé magnetické kuličky vyráběné firmou Bang Practicles (USA).
Při provádění testovací metody podle vynálezu budou také obecně kromě zkoumaných vzorků testovány kalibrační vzorky se známým obsahem komplexu holo-TC II. Tato stanovení mohou být použita pro vynesení kalibrační křivky, ze které může být určen obsah kobalaminu navázaného na TC II přítomného v testovaném vzorku. Povaha kalibračních vzorků a volba faktorů pro převádění nebo nastavení při stanovení komplexu holo-TC II se může lišit například v závislosti na konkrétních při vazbě použitých ligandech a krocích separace při testu a jiných znacích metody, které ovlivňují vazbu a oddělování ze vzorku, jako jsou například složení pufru, podmínky testu apod. Typicky budou mít kalibrační vzorky obsah holo-TC II 0 až 300 pmol/l. Referenční rozmezí, uvnitř kterého se budou obecně pohybovat nalezené hodnoty pro kobalamin navázaný na TC II, bude 30 až 160 pmol/l.
Kalibrační standard holo-TC II může být typicky lidský, přírodní nebo rekombinantní holo-TC II. Použití holo-TC II jako kalibrátoru v testech holo-TC II je nové a tvoří další provedení vynálezu.
• ·· • ·*» *··*· ···· ··#· ·· *« «·« ·« ««*
-26Z ještě dalšího hlediska poskytuje vynález kit pro diagnostický test podle předkládaného vynálezu, přičemž tento kit obsahuje:
imobilizovaný nebo imobilizovatelný specifický vazebný ligand pro TC II nebo holo-TC II;
s výhodou roztok holo-TC II známé koncentrace a výhodněji sadu takových roztoků s určitým rozmezím koncentrací komplexu holoTC II;
popřípadě uvolňovací činidlo pro uvolnění kobalaminu od holoTC II; a popřípadě značený ligand.
Testovací metoda podle vynálezu určuje metabolicky aktivní zásobu (pool) kobalaminu stanovením komplexu holo-TC II nebo izolací komplexu holo-TC II a potom stanovením s tímto komplexem spojeného kobalaminu, čímž poskytuje pohodlnou metodu pro zjištění deficience kobalaminu před nebo po nástupu klinických projevů této deficience. Testovací metoda může být s výhodou použita před nástupem příznaků, protože má přesnou předpovídací hodnotu negativní rovnováhy kobalaminu.
Předkládaný vynález bude nyní ilustrován na následujících neomezujících příkladech a výkresech.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 je standardní křivka pro holo-TC II;
obr. 2 je vynesení ukazující vztah mezi celkovou koncentrací kobalaminu v séru a koncentrací holo-TC II; a obr. 3 je vynesení ukazující vztah mezi celkovou koncentraci kobalaminu v séru a koncentrací holo-HC.
• ·· « · ··*
-27Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Protilátky (například monoklonální nebo polyklonální protilátky) specifické pro TC II se imobilizují na magnetizovatelné částice. Alikvot séra (100 až 500 μ!) smíchaný se stejným objemem PBS se ponechá reagovat 15 min s nadbytkem imobilizované protilátky a nadbytkem nepřekrývající se protilátky anti-holo-TC II (například monoklonální protilátky) značené I125. Magnetizovatelné částice se pomocí silného magnetu usadí, supernatant se odstraní a částice se promyjí PBS.
Radioaktivita se změří a koncentrace holo-TC II ve vzorku se stanoví interpolací standardní křivky.
Příklad 2
Protilátky (například monoklonální nebo polyklonální protilátky) specifické pro TC II se imobilizují na magnetizovatelných částicích. Alikvot séra (600 μΙ) smíchaný se stejným objemem PBS se ponechá s protilátkou reagovat 30 min. Magnetizovatelné částice se usadí použitím silného magnetu a supernatant se odstraní. Částice se jednou promyjí PBS a potom se na ně působí hydroxidem sodným (0,3 M) s obsahem kyanidu draselného (100 μΜ), dithiothreitolu (15 mM), a pevného množství kyanokobalaminu radioaktivně značeného I125 nebo Co57 v celkovém objemu 100 μΙ po dobu 15 min, pro uvolnění kobalaminu navázaného na imobilizovaný holo-TC II, a současně se všechny formy kobalaminu převedou na kyanokobalamin a smíchají se s pevným množstvím značeného kyanokobalaminu. Přidá se omezené množství vnitřního faktoru ve 100 μΙ borátového pufru a směs se ponechá reagovat 10 min. Magnetizovatelné částice se usadí silným magnetem a 150 μΙ supernatantu se oddělí pro měření radioaktivity. Koncentrace kobalaminu navázaného na TC II ve vzorku séra se určí ze standardní křivky.
• ·· • ♦ ·»· *44
44 •••444
44
4*444
44
444 44
Uvolněný kobalamin může být alternativně měřen použitím metody IMx firmy Abbot nebo podobnými metodami.
Příklad 3
Protilátky (například monoklonální nebo polyklonální protilátky) specifické pro holo-TC II se imobilizují na magnetizovatelných částicích. Se stejným objemem PBS se smíchá alikvot séra (100 až 500 μΙ) a přidá se množství llz5 značeného holo-TC II a omezené množství imobilizované protilátky anti-holo-TC li. Po inkubaci 15 min se magnetizovatelné částice usadí pomocí silného magnetu. Částice se promyjí PBS a měří se radioaktivita. Koncentrace holo-TC II se určí ze standdardni křivky.
Příklad 4
Rekombinantní holo-TC II se imobilizuje na magnetizovatelných částicích. K alikvotu séra (100 až 500 μΙ) smíšenému se stejným objemem PBS se přidá pevné množství imobilizovaného holo-TC II a nadbytek protilátky (například monoklonální nebo polyklonální protilátky) specifické pro holo-TC II a radioaktivně značené I125. Po 15 min inkubace se částice usadí použitím silného magnetu. Částice se promyjí PBS a měří se radioaktivita. Koncentrace holo-TC II se určí ze standardní křivky.
Příklad 5
K alikvotu séra (100 až 500 μΙ) se přidá nadbytek biotinylovaného kobalaminu, tak aby se navázal veškerý apo-TC II a apo-HC. Po inkubaci 10 min se na vzorek séra působí magnetickými částicemi potaženými avidinem 10 min. Částice se ponechají sedimentovat užitím silného magnetu. Supernatant se oddělí a smísí se dvěma nepřekrývajícími se monoklonálními protilátkami anti-TC II,
-29 • ·· • · 0 • > ♦ ·0·0 ·· přičemž jedna je radioaktivně značená I125 a druhá je konjugována s biotinem. Po 10 min se přidají magnetizovatelné částice potažené avidinem a ponechají se vázat na biotinylované addukty 10 minut. Potom se provede sedimentace částic siíným magnetem a promytí PBS. Změří se radioaktivita a koncentrace hoto-TC II se stanoví interpolací na standardní křivce.
Příklad 6
Stejným způsobem jako v příkladu 5, ale s odstraněným apoTC II, se sérum smísí s pevným množstvím I125 značeného holo-TC II a omezeným množstvím protilátky anti-TC II imobilizované na magnetizovatelných částicích. Po inkubaci 15 min se provede sedimentace částic použitím silného magnetu. Částice se promyji PBS a měří se radioaktivita.
Přiklad 7
Kobalamin se imobilizuje na magnetizovatelné mikročástice, například kovalentní vazbou nebo použitím vazby biotin-(strept)avidin. Typicky se magnetizovatelné mikrokuličky potažené streptavidinem inkubují s 1 μΜ biotinylovaným kobalaminem 30 min při laboratorní teplotě a v temnu. Kuličky se usadí pomocí magnetu, dvakrát promyji PBS a resuspendují v 1% koncentraci v PBS + 5 mg/ml HSA. K alíkvotu séra (100 až 500 μΙ) se přidá stejný objem PBS a 1/10 objemu magnetizovatelných mikrokuliček potažených kobalaminem. Směs se inkubuje 30 min při laboratorní teplotě v temnu, aby se navázal veškerý apoTCII a apoHC. Částice se ponechají sedimentovat pomocí magnetu a supernatant se oddělí a smísí se s nepřekrývajícími se monoklonálními protilátkami proti lidskému TC II, jednou radioaktivně značenou I125 a druhou konjugovanou s biotinem. Po 10 min se přidají (strept)avidinem potažené magnetizované • · mikrokuličky a ponechají se vázat biotinylované addukty po dobu 10 min. Potom se provede sedimentace částic magnetem a promytí PBS. Radioaktivita se měří a koncentrace holo-TC II se stanoví interpolací na standardní křivce.
Příklad 8
Provedení je stejné jako v příkladu 7, ale nadbytek biotinylovaného kobalaminu se přidá přímo ke vzorku séra + PBS, aby se navázal veškerý apoTCII a apoHC. Po inkubaci 10 min se na vzorek séra působí (strept)avidinem potaženými magnetizovatelnými mikrokuličkami 30 minut při laboratorní teplotě v temnu.
Příklad 9
Králičí protilátka specifická pro lidský TC II se zdánlivou vazebnou konstantou >5 x 109 M'1 byla (mobilizována na magnetizovatelných mikrokuličkách o průměru 1 pm potažených kozí protikráličí IgG protilátkou (Indica Diagnostics). Vzorky séra po 400 pl od každého z 49 zdravých dobrovolníků se smíchají se stejným objemem PBS a 40 μΐ imobilizované protilátky (1 %). Směsi byly udržovány při laboratorní teplotě v temnu 1 hod a potom byla provedena sedimentace mikročástic použitím magnetu. Sraženiny byly jednou promyty ledovým promývacim pufrem (PBS plus 0,02% Tween 20) a potom byly resuspendovány v 50 μΙ 50mM dithiothreitolu, 0,001% kyanidu draselného a pevným množstvím látky 57Co-CNCobalamin (Amersham) ve fosfátovém pufru, pH 7,5. Směs byla ponechána stát 30 min při laboratorní teplotě a potom bylo přidáno 25 μΙ 0,5M hydroxidu sodného a o 15 min později 300 μΙ vnitřního vaktoru imobilizovaného na dextranu (dostatečné množství pro navázáni 50 % stopovací látky) v borátovém pufru, pH 8,6. Po 1 hod při laboratorní teplotě v temnu byly vzorky centrifugovány při 1000 g »
a 4 °C 10 min, supernatanty byly opatrně odstraněny a sedimenty byly počítány na přístroji Packard Riastar. Koncentrace kobalaminu navázaného na TC II byla zjišťována ze standardní křivky zkonstruované pomocí osmi kalibrátorú (0 až 500 pM holo-TC II), které byly zpracovány stejným způsobem jako vzorky. Bylo také analyzováno 37 vzorků séra s ohledem na celkové množství kobalaminu v séru použitím testu Abbot IMx B12.
Standardní křivka pro holo-TC II je ukázána na obr. 1 a vztah mezi celkovou koncentrací kobalaminu v séru a koncentracemi holoTC II u 37 zdravých dobrovolníků je ukázán na obr. 2. Je zřejmé, že korelace je nízká, s hodnotou koeficientu r2 = 0,50. Naopak korelace mezi koncentrací holoHC a celkovou koncentrací kobalaminu v séru je vysoká, r2 = 0,96 (obr. 3). Průměrná koncentrace holoTC pro 49 zdravých dobrovolníků byla 64 ± 28 pM a 95% referenční rozmezí je 23 až 127 pM.
U testu je hodnota CV 10 %, analytická citlivost (0 - kalibrátor 3 standardní odchylky) nižší než 10 pM a nedochází ke křížové reakci s haptokorinem.
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Testovací metoda pro stanovení kobalaminu navázaného na transkobalamin II (TC II) v tělesném vzorku, vyznačující se tím, že se bezbuněčný vzorek tělesné kapaliny přivede do styku s imobilizovaným kobalaminem nebo jeho anaiogen nebo fragmentem, který selektivně váže apoformy TC II a haptokorin, a potom se tento vzorek uvede do styku s imobilizovaným nebo imobilizovatelným specifickým vazebným ligandem pro TC II nebo TC II navázaným na kobalamin (holo-TC II), frakce navázaná na ligand se oddělí od frakce nenavázané na ligand a měří se obsah holo-TC II nebo kobalaminu navázaného na TC II ve vzorku.
- 2. Testovací metoda podle nároku 1, vyznačující se tím, že oddělení uvedené frakce navázané na ligand od frakce nenavázané na ligand se provádí tak, že se zvýší koncentrace holo-TC II alespoň trojnásobně.
- 3. Testovací metoda podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že tato metoda je schopna detekovat holo-TC II při koncentraci již 9 pM.
- 4. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že specifický vazebný ligand se volí ze skupiny zahrnující polyklonální nebo monoklonální protilátku, fragment protilátky, polypeptid, oligopeptid, malou organickou molekulu, specifickou vazebnou
• ·· • 4 ··· * · 4 • 4 • · * • • 44 4 4 * • * • • • 4 4 • *··* • 4 • 4 • 4« *4 4*4 molekulu zvolenou z knihovny kombinační chemie nebo prezentované fágem, specifickou vazebnou sekvenci DNA nebo RNA nebo receptor buněčného povrchu. - 5. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že specifický vazebný ligand má vysoký stupeň selektivity a specificity vzhledem k TC II a má nízkou afinitu vzhledem k jiným proteinům TC, buď v apo-, nebi holoformě, nebo jiným proteinům vázajícím kobalamin.
- 6. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že kobalamin se uvolňuje z molekul holo-TC II změnou teploty nebo pH okolního prostředí.
- 7. Testovací metoda podle nároku 6, vyznačující se tím, že uvolněný kobalamin se stanovuje kompetitivním testem prováděným uvedením do styku imobilizovaného vazebného partnera pro kobalamin s disociovaným kobalaminem vzorku v přítomnosti značeného ligandu, který soutěží s izolovaným kobalaminem o vazbu na imobilizované vazebné partnery.
- 8. Testovací metoda podle některého z nároků až 7, vyznačující se tím, že zahrnuje uvedení pevného nosiče, který má na sobě imobilizovaný vazebný ligand TC II nebo holo-TC II, do styku se zkoumaným vzorkem a rovněž s neimobilizovaným ligandem, • · · · « • · · · ·♦ ·· ··« »přičemž tento imobilizovaný ligand je schopný vázat se na TC II nebo holo-TC II, na uvedený neimobilizovaný ligand nebo na komplexy TC II nebo holo-TC II a neimobilizovaného ligandu, a kde uvedený neimobilizovaný ligand je schopen vázat se na alespoň jeden z uvedených imobilizovaných ligandu, TC II nebo holo-TC II a komplexy tohoto imobilizovaného ligandu a TC II nebo holo-TC II;přičemž jestliže je tato testovací metoda sendvičového typu, alespoň jeden z uvedených ligandu je specifický pro holo-TC II, a jestliže je test kompetitivního typu, uvedený imobilizovaný ligand je specifický pro holo-TC II a jeho kompetitory;přičemž podíl uvedeného imobilizovaného ligandu navázaného na TC II nebo holo-TC II uvedeným neimobilizovaným ligandem nebo komplexy uvedeného neimobilizovaného ligandu a TC II nebo holo-TC II je závislý na množství holo-TC II přítomného v uvedeném vzorku, a uvedený neimobilizovaný ligand je schopný vytvářet přímo nebo nepřímo detekovatelný signál v navázaném nebo nenavázaném stavu;navázaná frakce se oddělí od nenavázané frakce; a přímo nebo nepřímo se stanoví neimobilizovaný ligand navázaný na imobilizovaný ligand (navázaná frakce) nebo nenavázaný a v roztoku (nenavázaná frakce);přičemž uvedení vzorku a uvedeného neimobilizovaného ligandu do styku s pevným nosičem se může provádět oddělené, současně nebo postupně, a jestliže se provádí odděleně nebo postupně, může být prováděno v jakémkoli pořadí.
v 99 • · 9*9 • • • • • * • * 9 * * * • 9 9 • 9 • • * * * • 9» ·· 9*9 9« • 99 - 9. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že ligand vázající TC II má afinitní konstantu alespoň 109M'1.
10. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující s e tím, že afinitní konstanta je vyšší než 1011M'1. 11. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že stupeň zkřížené reaktivity vazebného ligandu holo-TC II nebo TC II s HC je mezi 0,1 % a 1 %.12. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že stupeň zkřížené reaktivity vazebného ligandu holo-TC II nebo TC II s HC je méně než 0,1 %.13. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahující komplex holo-TC II se uvede do styku s pevnou fází, na kterou je navázán značený ligand rozpoznávající stejná vazebná místa na (mobilizovaných ligandech jako holo-TC II; holo-TC II v uvedeném vzorku soutěží s uvedeným navázaným značeným ligandem o tato vazebná místa, takže po ekvilibraci systému existuje přímo úměrný vztah mezi množstvím značeného ligandu vytěsněného z tohoto pevného nosiče a detekovatelného v roztoku a množstvím holo-TC II přítomného v původním vzorku; kde uvedený značený ligand se detekuje podle potřeby přímo nebo nepřímo jako množství • ·· * · ··· « · « ······ · · · · · ····· · » · · ···· ·· ·· ··· «* *·*-36značeného ligandu navázaného nebo nenavázaného na uvedený pevný nosič.14. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahující holo-TC II se uvede do styku s pevným nosičem, který má na sobě imobilizován holo-TC II, a značenou neimobilizovanou látkou, která se specificky váže na holoTC II, přičemž volný holo-TC II ve vzorku a imobilizovaný holoTC II soutěží o vazbu se značeným neimobilizovaným ligandem; a provede se stanovení značeného ligandu navázaného na pevnou fázi nebo zbylého v roztoku umožňující určení koncentrace holo-TC II.15. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že vzorek obsahující holoTC II se uvede do styku se značeným holo-TC II a jeho imobilizovaným ligandem; značené a neznačené komplexy holo-TC II soutěží o vazbu na imobilizovaný ligand a po dosažení rovnováhy je množství značeného holo-TC II navázaného na imobilizovaný ligand nepřímo úměrné množství holo-TC II ve vzorku.16. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že uvedený tělesný vzorek se volí ze skupiny vzorku semenné tekutiny, cerebrospinální tekutiny, amniotické tekutiny nebo vzorku odvozeného z krve.- ww w w »·· « v V *····· ·»· · ···· ·· ··· ·· ···17. Testovací metoda podle nároku 16, vyznačující se tím, že tímto vzorkem odvozeným z krve je sérum nebo plasma.18. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že uvedená navázaná frakce se oddělí od uvedené nenavázané frakce srážením, centrifugací, filtrací nebo chromatografickými metodami.19. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že uvedený detekovatelný ligand je značený značkou vytvářející signál, který může být stanoven jako luminiscence, chemiluminiscence, kolorimetrické stanovení, fluorescence, radioaktivita nebo jako enzymatická aktivita.20. Testovací metoda podle některého z nároků 1 až 19, vyznačující se tím, že kalibrace testu se provádí použitím standardu holo-TC II.21. Testovací metoda podle nároku 20, vyznačující se tím, že standardem je lidský, přírodní nebo rekombinantní holo-TC II.22. Kit pro použití v testovací metodě podle některého z nároků 1 až 21, vyznačující se tím, že obsahuje: imobilizovaný kobalamin nebo jeho analog nebo fragment, který selektivně váže apoformy TC II a haptokorin;··**♦· ·»· » *··*· *»·· ·*·· »· *· ·* ·· ·**-38imobilizovaný nebo imobilizovatelný specifický vazebný ligand pro TC II nebo holo-TC II;s výhodou roztok holo-TC II o známé koncentraci nebo soupravu takových roztoků, která obsahuje rozmezí5 koncentrací komplexu holo-TC II;popřípadě uvolňovací činidlo pro uvolnění kobalaminu od holoTC II; a popřípadě značený ligand. - 10 23. Použití holo-TC II jako kalibrátoru při testu na holo-TC II podle některého z nároků 1 až 22.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9820473.8A GB9820473D0 (en) | 1998-09-18 | 1998-09-18 | Assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2001975A3 true CZ2001975A3 (cs) | 2001-11-14 |
| CZ298310B6 CZ298310B6 (cs) | 2007-08-22 |
Family
ID=10839158
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20023143A CZ298381B6 (cs) | 1998-09-18 | 1999-09-20 | Zpusob stanovení holo-transkobalaminu II |
| CZ20010975A CZ298310B6 (cs) | 1998-09-18 | 1999-09-20 | Zpusob stanovení kobalaminu, kit pro provádení zpusobu a použití holo-TC II |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20023143A CZ298381B6 (cs) | 1998-09-18 | 1999-09-20 | Zpusob stanovení holo-transkobalaminu II |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7279283B1 (cs) |
| EP (2) | EP1114323B1 (cs) |
| JP (1) | JP4394285B2 (cs) |
| KR (2) | KR100781014B1 (cs) |
| CN (2) | CN1322330C (cs) |
| AT (2) | ATE283490T1 (cs) |
| AU (1) | AU761498B2 (cs) |
| BR (1) | BR9913770A (cs) |
| CA (1) | CA2344193C (cs) |
| CY (1) | CY1106688T1 (cs) |
| CZ (2) | CZ298381B6 (cs) |
| DE (2) | DE69922225T2 (cs) |
| DK (1) | DK1443328T3 (cs) |
| ES (2) | ES2234299T3 (cs) |
| GB (1) | GB9820473D0 (cs) |
| HU (1) | HU228077B1 (cs) |
| MX (1) | MXPA01002591A (cs) |
| NO (2) | NO327771B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ510766A (cs) |
| PL (2) | PL201360B1 (cs) |
| PT (2) | PT1443328E (cs) |
| WO (1) | WO2000017659A1 (cs) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0016460D0 (en) * | 2000-07-04 | 2000-08-23 | Axis Shield Asa | Assay |
| GB0109925D0 (en) * | 2001-04-23 | 2001-06-13 | Axis Shield Asa | Method |
| CA2890350A1 (en) | 2012-11-06 | 2014-05-15 | Hyundai Motor Company | Method for manufacturing highly heat-resistant sound absorbing and screening material |
| CN104198598B (zh) * | 2014-07-15 | 2016-03-16 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种维生素b12的测定方法 |
| CN106841017B (zh) * | 2017-01-22 | 2019-05-07 | 耐斯检测技术服务有限公司 | 一种评价辐照或热处理对钴胺素-蛋白结合体影响的方法 |
| CN106693443A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-05-24 | 北京美正生物科技有限公司 | 一种维生素b12适配体亲和柱及其制备方法和用途 |
| CN114206367A (zh) * | 2019-08-09 | 2022-03-18 | 美国西门子医学诊断股份有限公司 | 抗猪tcn1单克隆抗体及其生产和使用方法 |
| CN113189252A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-07-30 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种总钴胺素和氰钴胺的检测方法及其检测试剂盒和应用 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4273757A (en) * | 1977-06-02 | 1981-06-16 | Yissum Research Development Company | Determination of transcobalamins |
| US4332785A (en) * | 1980-04-09 | 1982-06-01 | University Patents, Inc. | Immunoassay for measurement of reticulocytes, and immunoreactive reagents for use therein |
| CA1180273A (en) * | 1981-06-22 | 1985-01-02 | Technicon Instruments Corporation | Assay of vitamin b in12 xx |
| US4680273A (en) * | 1985-07-29 | 1987-07-14 | Victor Herbert | Assay for vitamin B12 deficiency |
| US5457055A (en) * | 1986-11-20 | 1995-10-10 | The University Of Colorado Foundation | Diagnostic method for cobalamin deficiency |
| US5374560A (en) * | 1989-04-03 | 1994-12-20 | The University Of Colorado, Inc. | Method for screening and distinguishing between cobalamin and folic acid deficiency based on assay for cystathionine and 2-methylcitric acid |
| DE3900650A1 (de) * | 1989-01-11 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Vitamin-b12-bestimmung |
| US5506109A (en) | 1989-06-26 | 1996-04-09 | Bayer Corporation | Vitamin B12 assay |
| US5310656A (en) | 1989-06-26 | 1994-05-10 | Tritech Partners | Vitamin B12 assay |
| EP0479929B1 (en) * | 1989-06-26 | 1994-04-13 | Tritech Partners | Vitamin b12 assay |
| AU680822B2 (en) * | 1992-05-08 | 1997-08-14 | Receptagen Corporation | Anti-receptor agents to the vitamin B12/transcobalamin II receptor |
| US6274564B1 (en) * | 1996-09-18 | 2001-08-14 | William J. Sarill | Compositions of cobalamin and related corrinoids, and uses thereof |
-
1998
- 1998-09-18 GB GBGB9820473.8A patent/GB9820473D0/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-09-20 AT AT99947642T patent/ATE283490T1/de active
- 1999-09-20 EP EP99947642A patent/EP1114323B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-20 BR BR9913770-4A patent/BR9913770A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-09-20 DE DE69922225T patent/DE69922225T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-20 HU HU0103532A patent/HU228077B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-09-20 MX MXPA01002591A patent/MXPA01002591A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-09-20 CZ CZ20023143A patent/CZ298381B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-09-20 AU AU61026/99A patent/AU761498B2/en not_active Ceased
- 1999-09-20 CZ CZ20010975A patent/CZ298310B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-09-20 EP EP04009702A patent/EP1443328B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-20 CA CA002344193A patent/CA2344193C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-20 WO PCT/GB1999/003127 patent/WO2000017659A1/en active IP Right Grant
- 1999-09-20 DK DK04009702T patent/DK1443328T3/da active
- 1999-09-20 CN CNB2004100055424A patent/CN1322330C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-20 ES ES99947642T patent/ES2234299T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-20 KR KR1020017003485A patent/KR100781014B1/ko active IP Right Grant
- 1999-09-20 ES ES04009702T patent/ES2287607T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-20 PL PL382436A patent/PL201360B1/pl unknown
- 1999-09-20 DE DE69936154T patent/DE69936154T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-20 PT PT04009702T patent/PT1443328E/pt unknown
- 1999-09-20 NZ NZ510766A patent/NZ510766A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-09-20 AT AT04009702T patent/ATE363076T1/de active
- 1999-09-20 PL PL347104A patent/PL198095B1/pl unknown
- 1999-09-20 JP JP2000571269A patent/JP4394285B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-20 PT PT99947642T patent/PT1114323E/pt unknown
- 1999-09-20 KR KR1020047014817A patent/KR100646305B1/ko active IP Right Grant
- 1999-09-20 CN CNB998110396A patent/CN1148580C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-10-04 US US09/679,043 patent/US7279283B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-16 NO NO20011353A patent/NO327771B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-07-02 CY CY20071100864T patent/CY1106688T1/el unknown
-
2008
- 2008-08-21 NO NO20083610A patent/NO331074B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6143510A (en) | Measuring method using whole blood sample | |
| CZ2001975A3 (cs) | Způsob stanovení kobalaminu | |
| JP3935437B2 (ja) | トランスコバラミンｉｉ分析方法 | |
| EP1257830B1 (en) | Assay for measuring holo-transcobalamin and folate | |
| CA1301646C (en) | Method for diagnostic immunoassay by solid phase separation | |
| US7344849B2 (en) | Assay | |
| AU2003203209B2 (en) | Cobalamin assay | |
| JPH08220095A (ja) | 沈殿可能な固相を用いる不均一系イムノアッセイ | |
| NZ525253A (en) | Cobalamin assay | |
| ZA200101937B (en) | Cobalamin assay. | |
| JP2002196000A (ja) | 類縁体に起因する非特異反応を抑制した新規測定法 | |
| JP2001343387A (ja) | 複合体を形成する物質の測定方法及び測定試薬 | |
| JP2003232793A (ja) | 高濃度磁性ビーズ固相迅速測定法 | |
| Diamandis et al. | MC-1 A new generation of time-resolved fluoroimmunoassays with europium chelates as labels |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20190920 |