JPH07507143A - 生物流体中の抗体を測定する為の検定法及びこの方法を実施する為のキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名ＴＶ 生物流体中の抗体を測定する為の検定法及びこの方法を実施する為のキット 本発明二よ生物流体中の抗体の測定の為の免疫検定法、持ζこ、検出することに より自己免疫病の診断が可能となる、自己抗体の測定の為の免疫検定法に間する 。

免疫検定法には、多くの方法があって、医学診断に非常ζ；重要な役割を果して いる。抗原又はハブテン、例え：！ホルモンの定性的及び／又は定量的Ｊす定を 目的とした検定法に加えて、生物流体、特に人の血清中の抗体をＪす定するちの 多くの検定法が存在する。

抗体は免疫グロブリン（１ｇ）と呼ばれている蛋白質であり、抗原と反応する為 に体によって造られる。ある抗原は通常数多くの抗原決定因子を有しているので 、抗体は、ポリクローナルな性質のものであり、従って、抗体が向けられている 抗原に間し、異なる結合性を有している蛋白質の集合体をなしている。抗体は通 常は対応する抗原決定因子を有している物質から体を保護するために、外的な抗 原に対して形成される。しかし、もし体の免疫系がある種の内的細胞又は細胞構 造体を誤って外的なものと認識する場合には、抗体は内的な要素の抗原決定因子 に対して形成され得る。従って、そのような内的要素は、自己抗原と呼ばれ、そ れらユニ対し形成される抗体が自己抗体と呼ばれる。

抗体に対する知られた検定法は、種々の基礎的原理をある一つの形態又は別の形 態として実現するものであって、それらの二つは例えば米国特許８１３．Ｇ５４ ，０９０中の第３Ｎの一番上に図解されている。古典的なラジオイミュノ７ノセ イ（ＲＩＡ）にλ１応する変法に於ては、必要とされる量未満の固定された抗原 が使用され、測定しようとする抗体の標識化された形態のものを、既知の瓜で調 べられるべき試ｒ↓に加える。標識された抗体の固定された抗原に刻する結合の 程度から、間違する抗体の存在又は１度についての情報を１′４ることが可能で ある。競７＃的原理：こよってなされる二の試験では、抗原は非常に純粋な形態 のものが要求される。

第二の原理に基づいた手順では、測定されるべき既ｙ口の量の抗体又はその適当 な誘導体が固体の基体上に固定され、次に、調べられるべき試料中に存在する抗 体と、固定された抗体とが、反応系に加えられる標識抗原との反応について競争 させられる。被測定抗体の存在又は量は、１２　ｍされた抗原の固定された抗体 、即ち同相に２１する結合の減少により示される。

最後に述へた測定法に於ては、関連した高度に純粋な抗原の標識杉が必要とされ 、標識された抗原に対する親和性か完全に同一でない、という事実を必要ならば 考慮しつつ、固定された抗体と調べられるへき試料の抗体との間に効果的な競争 が起こり１りる量て、被測定抗体と固定された抗体とが存在しなければならない 。

更に別の原理に従うと、抗原測定によく知られ、抗体の測定で使用されているサ ンドイッチ試験と類似の手順に於て、通常は固定された形態の、過剰の抗原を最 初に用い、これを被ｉｌｌ定抗体の全量に結合させ、そしてこの第一段階で結合 したその抗体に対する第二の標識されたバインダーとの続く第二の免疫反応によ って、結合した抗原と抗体はサンドイッチ様の免疫複合体の形成で標識される。

第二のバインダーはしばしば抗−抗体（二重抗！４：法）であるか、又；よ標識 された特異的でないバインダー、例えば所謂プロティンＡ又はＧ＄を使用して標 識化が実行される。プロティンＡ又はＧは細菌から得られ、多くのＩｇＧ抗体に 非特異的に結合する蛋白質である。

この変法の選択性は、固定された抗原とこの抗原に対する抗体の結合の選択性に よって確保され、その抗体が被測定抗体であり、一方標識化反応はむしろ非特異 的である。

サンドイッチ原理に従う別の抗体測定の変法は、特に自己抗体の測定の為に使用 されるものであって、この出願の基礎として使用される最も近い関連する先行技 術を構成している。この変法は、すく上にのべた変法とは、次の点てπなる。即 ち、退択的抗原の代りに、抗体に対するかなり非特異的なバインダーが被測定抗 体との定量的な結合（試料溶くαからの抽出）の為に使用されること、そして検 定法の選択性は、正しく結合した抗体に対して使用される標識が、その抗体に刻 する非常に純粋な標識化抗原であるという事実によって確保されることである。

一つ前に記載した競争的方法の変法におけるように、今日までこの原理を実現す ることが出来るのは問題の抗原が純粋な形態で人手でさる時のみてあった。

外的な抗原に対する抗体の測定において、種々の試験に要求される機能は困難な しに満たされることが多い。

外的抗原に対する抗体１度は、通常は比較的低く、関連する抗原又はハブテンは 、しばし・ば化学的又は生物工学的な方法によって十分な蚤で合成でざるか又は 天！！、物質から単λｔＬ、ａ８てきる。

しかし・、上記の原理の一つニニし・たがって自己抗体をａｌｌ定しようどする 場合は、幾つかの困難性、そしてそれらのうちの幾つかはて：、ｌｔ相当の困難 に遭遇する。その理由は、生しる自己抗体の濃度のため、及び自己抗原の性質の 為である。

自己抗体の測定は、自己免疫病の存在の検出ユニ非常に重要であり、特に［１！ 　Ｕ！Ｉされる病気の症状を正しく解釈する為に、モし・て、有害であり１辱る 間違った処置を避ける為に非常に重要である。幾つかは非常にひといものである 既λ口の自己免疫病；よ例えば、リウマチ様関節炎、Ｉ型Ｐ；尿病、重症性筋無 力症、及びある種の甲状腺と関連する自己免疫病、例えばグレーブス病、ミク七 デマナエミア（…ン＼ｅｔＪ　ｅ　ｒｒ＋　ａ　ｎ　ａ　ｅ　ｍ　ｉ　ａ　＝粘 液水腫又は枯液素血症）及びノ１ノモト甲状腺炎である。甲状腺自己免疫病の場 合には、病気のｆ！類によ一ンて、チリオグロブリン（ｔｈｒｙｅｏｇｌｏｂｕ ｌｉｎ）　、　Ｔ　Ｓ　Ｉ（し七ブタ−及び／又は甲状腺パーオキシダーゼ（Ｔ ＰＯ）が自己抗原として作用し、最近の知識では、後者は所謂ミクロソーム抗原 とおなしである０本発明は、以下に、甲状腺自己抗体の決定に間して特に記載さ れ、特許こ１１　Ｔ　Ｐ　Ｏに刻する抗体について記載される。

しかしながら本発明が基づいている新規な原理は、これらの特定のものの測定に 制限されるのではなく、他の自己抗体の測定についても有益に使用できる。さら に池の抗体の測定においても、個々の場合に於て、既知の原理に従ってなされる 検定法よりも本光明の検定法は利点を有し・得る。

甲状腺自己免疫病の分野に於ける知識の現在の水準のまとめは、例えばマリアン ・ラドゲート及びギルバート・バノサートの自己免疫（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔ ｙ）　１０９０年第７巻２１０〜２１１頁、及びンヤズウイガ・フルマニアツク とヘルナルト・リース・スミスここよる自己免疫（Ａｕｔｏｉａ＋ｍｕｎｉｔン ）１９９０年第７巻６３〜８０頁の記事、及びＰ、Ｎ、シュムトレーガー及び１ １．、Ｊ、Ｃ，ワエニツンユによるＡｋｔ、Ｅｎｄｏｋｒ、Ｓｔｏｆｆｗ、ＩＯ （Ｉ！１８り）　！１〜１０２頁による記事（特別発行）、などの化学文献中に 見る二とが出来、甲状腺自己抗体の検出の為の方法の概要を与えている。

最初に述へた検定型の一つをほぼ使用している、甲状腺の自己抗体の又は自己抗 体の免疫診断測定は、それらの自己抗体が、細胞膜に固定されているそして高純 度かつ慣用手順に要求される量で得るのが困難である、自己抗原に対するもので あるという、基本的な困難性に直面する。例えば、人の甲状腺パーオキシダーゼ （ｈ　Ｔ　Ｐ　Ｏ）、即ち、橋本甲状腺炎の原因となる自己抗原であるところの ＠素は、甲状線膜に結合しているグリコジル化ヘモ蛋白質である。その抗原性は 、その表面に存在するエピトープのＦＩＢを含め、Ｐ、カラコンらにより　Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎ。

ｌｏｇｙ　１２５巻　Ｎｏ、３．１２１１〜！２１８頁の記事に記載されている 。既知の原理に基づく免疫診断検定法に十分な純度と量で、抗原として、この甲 状腺パーオキシダーゼを手に入れることが出来るようにする為には、甲状腺パー オキシダーゼは蛋白分解法によって、又は洗剤の助けを借りて、膜から切リス１ されなければならず、そして免疫吸着剤によって、又は種々の分離用の相上での 、例えばゲル＆ｉ過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性の相互作用によるク ロマトグラフィ、芳香族性の相互作用によるクロマトグラフィ、吸着クロマトグ ラフィ及びコンカナバリンＡを使用するクロマトグラフィ上での慣用のクロマト グラフィ法によって精製されなければならない。これらの方法は高価であり、単 離されるへき３素の意図しない変化の危険も関係し、そして材料のかなりのロス がある。高度に精製された天然の甲状腺パーオキシダーゼ（ＴＰＯ）は従って少 量のみてしか得られず、そして高価である。この事実は、被測定抗体の選択的結 合又は選択的な標識化のいずれかの為に純粋な形態で抗原を使用しなければなら ない上記変法の全てに直接影響を与える。

甲状腺から甲状腺パーオキシダーゼを単離する別法として、ＴＰＯをｉ１法子工 学手順りこより造ることが出来るような実験が実施されており、方法が開発され ている。しかしながらこの方法で得られるＴＰＯもまた限られた量でのみ人手出 来、高価であり、遺伝子工学によって得られた物質が天然の甲状腺パーオキシダ ーゼといずれの場合に置いても同一であるかどうか、とくに抗原性に対して同一 であるかどうかについては確かではない。

さらに、化学的な効果、特に三次元ｔＩＩＩ造が変化した場合、及び／またはそ の結果としてジスルフィド架橋が破壊された場合（Ｔ、カラコンの記事に述へら れていることを参照）に、ＴＰＯの抗原性が非常に損われ得る、という事実から 、困難が生しる。しかも古典的な抗体測定方法での標識化抗原としてＴＰＯを使 用出来る為には、標識がＴＰＯに化学的に結合されなければならない、純粋なＴ Ｆ’Ｏを得る困難性の池に、この段階で、ＴＰＯがもはや天然のＴＰＯと対応せ ず自己抗体検出の抗原としての適合性が限られる点て、標識化と聞達する反応て ＴＰＯの抗原性が影響され得るという危険が存在する。例えばＴＰＯの単離及び ／又は標識化よって生しる変化によって、そのような標識化ＴＰＯとはポリクロ ーナルＴＰＯ自己抗体の一部のみしか反応しないこととなり得る。

ＴＰＯの単離と標識化に関連する問題の少なくとも幾つかを避ける為に、ＴＰＯ が高度゛に精製されず粗製型で使用される試験もサンドイッチ試験の変法として 開発された。これは抗体の測定について、はじめに記載した通りである。しかし 、この試験に於ては、抗原性を有する他の物質も固定されたｉＩＩ！！ＴＰＯ中 に存在し・、そして要求されるもの以外の抗体の固定化につながるという危険が 有り、そしてこれらが、二重抗体法に従う又はｖＡ識電化プロティンＡよる、あ との比較的非特異的な標識化で標識化され、そし、て１＾りの陽性結果を与える という危険がある。

既知の免疫診断検定法による自己抗体の測定に間し記載される困難性に化みて、 生物流体中の抗体の安全な定性的測定を可能とする、又、方法パラメータの調節 と最適化の結果としての信頼ある定量的な抗体測定にも適する、又、被測定抗体 に対する高度精製抗原の有意義量の使用を必要としない、生物流体中の自己抗体 の免疫診断測定の為の、改良方法の必要性が緊急に存在する。以前に公開されて ない特＝１出願Ｄ　Ｅ　４１２０４１２．３又こ！ズ」応するＰＣＴ出願、ＰＣ Ｔ／Ｅｌ”り２１０１３４８に記載された出願人の方法は、抗体の決定、特に自 己抗体の検定の場合に於けるこれら及びその他の目的を達成する。その方法では 聞達する自己抗体の存在は同相に対する標識化された抗体の結合の撹乱として表 われ、そして自己抗原、特にＴＰＯは高純度形では必要とされず粗製の天然の有 機抽出物形で使用できる。

サンドイツチ法に従って行われ、そして被測定抗体、特に自己抗体がバインダー との比較的非特異的な結合によって抽出される変法においては、方法の選択性は 関連する抗体に対する標識の選択性に依存するので、高度に精製された標識化さ れた抗原の使用、従って記載された全ての欠点を受入れる事を余儀なくされるこ とはこの変法の場合に限っては避けることが出来ないよってあった。

本発明の目的は、自己抗体が非特異的なバインダーに結合することによって反応 溶液から抽出され、次に特異的に標識化される自己抗体を測定する方法、及び高 度に精製され標識化された抗原の使用に関連する問題が解決できる自己抗体を測 定する方法の開発である。

この目的は請求項１に記載される免疫検定法によって達成される。

好ましい具体例はサブフレイム中に含められる。

本発明に？１′ｔって抗体（Ａｋ）、特に自己抗体、例えば甲状腺パーオキシダ ーゼ（ｈ　Ｔ　Ｐ　Ｏ）に対する人の自己抗体なとの自己抗体が次の手順によっ てよす定される。その手順とは、被測定抗体が非特異的なバインダーの使用によ り慣用の方法て固相又は溶解していない相に結合され、次に後の測定の為に選択 的に標識化される。その選択的な標識化とは、粗製抗原：Ａ型物との、そしてさ らに抗原に対して特異的であるがバインダーによって結合されないか又は有意義 に結合されない標識化された抗体又は抗体断片との反応によって選択的に標識化 される。被測定抗体の存在は同相又は非溶解層に結合した標識の杉態て現れ、そ の標識化の量は試料中で測定されるへき抗体の量と比例する。

本発明に従う方法では、例えばｈＴＰｏなとの精製された抗原は要求されない。

そしてこの抗原は直接標識される必要もない、方法の選択性は、測定の為の正し いサンドインチが免疫複合体から選択されるという事大によって確保される。即 ち、その免疫複合体とは、比較的非特異的な一連の反応で形成され、バインダー ／（被測定抗体も含んでいる結合抗体）、そして必要なら（粗製抗原とそれに伴 う物質類）であって抗原にのみ特異的な標識化された抗体又は抗体断片で標識化 されているものからなっている。バインダーによる抗体の抽出においても粗製抗 原で生じる免疫複合体の反応においても、バインダー／被測定抗体／抗原からな る正しいサンドイッチが測定に十分な選択性を有するように形成されるというこ とも仮定されない。しかし、結合した抗体のみが後ての測定の為：こ選択的に検 出される方法で標識を実施することにより、一般的に非常に特異的な検定法が得 られる。

実際的な理由、即ち末端ユーザーに供給される試藁の数を減少する為に、粗製抗 原：＋ｉ製型物その抗原に対し特異的なトレーサーの間の反応は、測定が実際の 抗原のみが標識を有しているＷｉ製抗原：ｌｌ！！物を使用して実施できるよう に、別個に実施されることが好ましい、しかし、この方法は原則として、バイン ダー、試料流体、及び粗製抗原調製物の間の反応が最初に実施され、別の段階て は本化がその後で実施される方法でも、又は全ての述べられた試藁が同時に培養 される方法でも、実施することが出来る。

二の記載中で抗原という用２は狭い意味、即ち、同時に抗体を表わしかつ免疫プ ロブリン的性質を有している、ということのない物質のみについて使用される。

しかし抗体は抗原として作用することも出来、抗抗体を形成することが出来るこ とはよくグロられている０本発明の記載の目的の為には、抗原とは、とりわけ最 初に述べたように自己抗原とし・で作用しそして自己抗体を形成することが出来 る内因的な物質である。

被測定抗体を抽出する為に使用されるバインダーとのクロス反応を避ける為に、 使用トレーサーは、好ましくはモノクローナル抗体Ｆ（ＡｌＯ−の標識化された 断片、例えばＦ　（ａｂ）２又はＦ　（ａｂ）と命名される種類の断片、又は抗 原の自己抗体により認識されない領域に対するものである他の断片である。Ｆｃ 部分を有さない抗体断片が好ましい、そのような抗体断片の使用がより好ましい 理由は、例えばプロティン、へ又はプロティンＧなどの非特異的なバインダーは 、異なる抗体についても本質的に同しであるそのようなＦ。断片を経由して抗体 を認識し・抗体に結合する為である。選択的標識１ヒ用の抗原にス１する抗体が このＦｃ断片を有さないことが５［されるならば、トレーサーがバインダーに直 接結合することにより生しる測定結果の誤りが防止出来る。しかしながら本発明 の目的の為には、抗原に選択的であり測定を誤らせるはとへインダーに結合する 二とがなければ、トレーサーとして、ポリクローナル抗体の抗体断片を含め、他 の抗体断片を使用することも可能であり、また無（「の抗体を使用することも含 まれる。

本発明はより詳細に以下の好ましい具体例を参照して説明される。

図面は次のことを示し・ている。

図１は本発明に従う方法を表わす略図を示す、この方法ユニ使用されている基本 的な成分には容易に理解できるように記号が１１けられており、記号は特許請求 の範囲でも使用されているが、特定の検定成分をこれらの記号によってとんな物 質に制限する！図もない。

図２；よ実施例に記載される方法の典型的な標準曲線を示している。

区３は本発明に１にう方法、及び出願人の１ＭＭＵｔｅｓＬ抗−ＴＰｏとして市 販されている基本的な方法を比較したグラフを示している。

図４は本発明に従う方法と、出願人のＤＹＮＯｔｅｓｔＲ抗−ＴＰＯとして市販 されている検定法とを比較したグラフを示している。

実施例 次の実施例は、人の甲状腺パーオキシダーゼ（ｈＴＰＯ）：こズ１する人自己抗 体の検出と関連する好ましい具体例を参照して、本発明の方法が実現される検定 法の手順と実際的な利点を示している。

この実施例は、本発明に従って、プリーバーらクリニカルケミストリー（Ｃ１ｉ ｎｉｃａｌ　Ｃｔ＋ｅｍｉｓｔｒｙ）　３５．１９８９．１９４９−１９５４の 記事に原理が記載され出願人の市販されているＩＭＭＵｔｅｓｔ抗−ＴＰＯで実 際に実現されている、ｂ　Ｔ　Ｐ　Ｏに対する自己抗体測定の為の基本方法のさ らなる発展である。その基本方法に於ては、自己抗体含有試料、それと結合する 不溶性プロティンＡ（好ましくはパンソルビン（１’ａｎｓｏｒｂｉｎ”）とい う名前の下でカルビオケム（１４１ｂｉｏｃｈｅｍ）社によって販売されている スタフィオコッ力スオーレオスの直接！’、　ｊｍ　ｊα）、及びトレーサーと しての直接標識化精製ＴＰ○が互に接触させられる。プロティンＡは試￥４中二 二存在する全ての抗体と結合する為に十分な過剰量て存在する。ｈＴＰｏに対す る自己抗体の存在下で、サンドイッチが形成され、従ってトレーサーは非溶解相 に結合される。結合されたＴＰＯ）レーサーは次に遠心分離によって溶解したＴ ＰＯから分離され、そして沈殿物が測定される。精製された直接標識されたＴＰ Ｏはこの基礎となる方法に於て今日まで必要とされてきた。

ｌ１人甲状腺からのｈＴＰｏ抽出物の調製凍結した人甲状腺（６０ｇ）を粉砕し ・、緩衝１ｆｆｌ（２０（ｌｎｌのホスフェート緩衝化塩溶液ＰＢＳ）を加えて ホモジナイザー（ＩＫＡヘルケ社のウルトラターラックス）によってホモジナイ ズ化を実施した。ｔｏｏ、０００ｇで１時間遠心したのち上澄み溶液を除去し、 得られたベレットを、粉砕した甲状腺の場合と同し方法で再度ホモジナイズした 。

これに続いてさらに１００，０００ｇで１時間遠心した。ここで得られたペレッ トを、洗剤としてＰＩＥＲＣＥ社（カタログナ’Ｊバー２８３１４）カラ（７） ０．５２（Ｄ）　’）　）ンＸ　１００’Ｅ更に含有している、Ｐ　Ｉ３　Ｃ（ ２００ｍｌ）中で再度ホモジナイズし・、そして撹拌を４℃で１時間実施した。

最後に得られたホモゾネートを１００，０００ｇで２時間遠心した。生しる上澄 み溶液は、ｈ　Ｔ　Ｐ　Ｏに対する自己抗体の測定の為に１本発明に従う方法で ｆＩＩ製天然抗原（Ａ　ｇ　）として使用されるｂ　Ｔ　Ｐ　Ｏ抽出液である。

ｈＴＰｏに結合するがその結合位置が入坑ｈ　Ｔ　Ｐ　Ｏ抗体により認識されな い領域であるモノクローナル抗体（Ｍ　Ａ　Ｂ　）が選沢された。この抗体はＪ ラフら（エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）　１９８９　＋２ ５１２１１−１２１８頁）による刊行物に従って製造及び精製された。

被測定自己抗体用バインダーとして使用するプロティンＡにこの抗体が結合する のを避ける為にＦｃ部分なＭＡＢから除去した。この目的には、それ自体は知ら れている方法で、精製したＭ　Ａ　Ｂ　（２０ｍＮホスフェート緩衝液１１中Ｉ Ｂ）を固定化ペプシン（シグマ製カタログＮｏ、−Ｐ３２ＢＧ）で解裂し、Ｆｃ 断片とＦ　（ａｂ）２断片とにした＊　１ｍｇ抗体あたり１０００単位のペプシ ン／を使用して２４℃で２０峙間培義を実施した。得られた断片をスーパーロー ズ−（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　１２カラム上てＦＴＬＣユニット中でゲルクロマト グラフィによって（ファルマシアシステムを使用）分離した。

次に精製したＦ（ａｂ）２断片を、クロラミンＴ方法によって１２５１で標識し た。この目的には、２８０μｍの２０ｍＭホスフェ−Ｉ・緩衝液中のｌ００７ｚ 　ｇのＦ　（ａｂ）：断片を、　６７ＭＢｑのＮａ１２５１　（アマ−ジャムＮ ｏ、　１Ｍｓ、３０）及び１０ｇｇのクロラミンＴ（メルク社製カタログＮｏ、 ２４２６　）とともに１分間混合した。標識混合物を次にＨＰＬＣて精製し、遊 離の１２５ＩをＦ（ａｈ）２断片に結合した１２５■から分離した。この分離は ゾルバ・ソクス（Ｚｏｒｂａ入）ＧＦ２５０／りカラムを有するＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ ユニット中て実施した。

３、抗１＋　Ｔ　Ｐ　Ｏ自己抗体測定の為のトレーサー複合体のこの場合、ｂ　 Ｔ　Ｐ　Ｏに対する人自己抗体のｔす定の為の、抗原（１，てｂ　Ｔ　Ｐ　Ｏの 抽出物として得た粗製抗原調製物からのＡｇ）及び標識されたＦ（ａｂ）２断片 からなるトレーサー複合体を先ず造った。この目的には、両方の蛋白質をモル比 ｌ二ｌで混合し、２０時間２４℃で培養した。この！１月間内にＦ（ａｂ）２° はＡ　ｇに結合し、そして生しる複合体はある活性（１２５１）に調節され、そ して次こ二本発明にｉにう方法で使用した。培養及び希釈緩衝液は次の組成：２ ０ｍＭ１−リス、＋５０ｍＭ　Ｎａ（：Ｉ、０．１％ツイーン、０．５％Ｂ　Ｓ 　Ａ　（生血清アルアミン）及び３ｍＭ　ＮａＮ、を有していた。

４、入坑ｂ　Ｔ　Ｐ　Ｏ自己抗体の測定の為の試験方法の記載次の手順がｌｌＴ 　Ｐ　Ｏに対する人自己抗体の検出及び調製のために！采用された。

（Ｉ）、各場合、５０μｍの調へられるへき試↑４又は（１準物質又は血清を試 験管にピペットで入れた（４．５ｍｌのテーバ（２）、５０μｍのプロティンｌ ＼息濁τα（カルヒオケム製カタログＮｏ、５０７８５８　）を次にピペットで 入れた。

（３）、ｒｉ後に５０Ｉｚｌの上記３て記載し・たトし一す−痕合体をピペット で入れた。その複合ｔ：ｔ：は上記ｌに１にう人甲状腺からの抽出物の形態ての 抗原Ｉｔ　Ｔ　Ｐ　Ｏ及び上記抗原に結合しているモノクローナル抗ｈＴＰｏ抗 体の標識化されたＦ（ａｂ）２°断片を含有していた。

（４）１反応混合物を手短に振盪し、次に１時間室；Ｈて培１吋　し・　た　。

（５）、培養の後、１１の緩衝液（２０ｍＭ）リス、１５０ｍＭのＮａＣＩ、０ ゜０５％ツイーン洗剤及び３ｍＭのＮａＮ５）を各試験官にピペットて入れた。

（６）、その試験管を次に１５分間２０００　ｇで遠心分離し、傾斜し、そし・ で残っている沈殿物をガンマ計数管中で測定した。

図２はこの方法での漂準曲線を示している。

５、臨床データ 臨床試験に於て、記載の新規方法によって得られる結果を、２００の血清につい てｈＴＰｏに対する自己抗体の測定の為の既存の免疫検定法を使用して得られる 結果と比較した。

結果を表１、そして図３及び４にまとめる。

表１において（ａ）と（ｂ）の欄は以下に詳細に説明する先行技術の検定方法の 結果である。一方、上記の様に実施される′ｉＦＩ現な方法を防用して得られる 値は（Ｃ）の下に示されている。測定の結果は表中で単位／１て記載されている 。

比較方法として本発明に従う方法と比べられる先行技術の方法の詳細は以下の通 りである。

（ａ）抗ｂ　Ｔ　Ｐ　Ｏ抗体が同相上で使用される方法である。放ｑＪ性標識さ れ、そして精製されたｈ　Ｔ　Ｐ　Ｏが競争的な反応で人自己坑体によって固相 から置き換えられる。

使用される試験は出願人のＤＹＮＱｔｅｓｔＲｔｉ’Ｃｈ　Ｔ　Ｐ　Ｏとして市 場に出ている市販の試験である。

（ｂ）上記の基本法に従うこの試験では、プロティンＡが本発明に従う方法と類 似の方法で固相上に固定される。試料中の自己抗体は、それらの固相への結合、 及びその後でそれらを標識化され精製されたｂ　Ｔ　Ｐ　Ｏの助けにより検出す ることによって検出される。特定の場合に於て、出願人の団ＭＵｔｅｓｔ抗ｈＴ Ｐｏにａ　ッて、１２５１ｇ識化され本化　Ｔ　Ｐ　Ｏを使用する（またビーバ ーら、Ｃｌ１ｍ。

Ｃｈｅｌｌｌｌ、１９８０．３５：＋０４９−１０５４も参ｐ５　）　。

自己免疫病の測定の結果の評価に於て、明白な陰性領域と明白な陽性領域との間 に、所謂灰色領域の遷移帯域を定義することが有用であることがわかった。この 領域は本発明に従う方法及び比較方法（ｂ）に於ては、１００単位／ｍｌど２０ ０単泣／１との間にあり、そして方法（ａ）においては７０単位／１と１３０単 位／ｍｌとの間にある。灰色領域が考慮された時は、二つの比較方法の結果が本 発明に従う方法（ｃ）のものと非常ユニよく相間する。もし本発明に位う方よ（ ｃ）が方法（Ｌ、）と比較されるならば、２００人の患者試料のうちのたフた１ つしか不一致を示さないことがわかった。即ち、本発明に従う方法て僅かに陽性 であり（ｂ）ては陰性てあというものである。

方法（ａ）と方法（ｃ）の相間においては、２００の試ｒ４のうちの４つが（ａ ）において僅が、に陽性であり、一方これらコ、ｔ（ｃ　）において明らかに陰 性であるとみなされる。−万一つの試料は（ｃ）で僅か、に陽性であると認めら れ、（ａ）の助けによれば陰性である。

はじめに既に述へたとおり、この新規な原理はｈＴＰＯに対する自己抗体の測定 に制限・されない。同様な利点が、膜と間違する他の自己抗原に対し形成される 池の自己抗体に対する測定に対しても、得られるよってある。

一般にひどい自己免疫病である重症性筋無力症に典型的に生しるものと一般に考 えられている、ニコチン型のアセチルコリンレセプターに対する１８抗体の測定 は、このような測定に含まれるものとして挙げられる。

もちろん、本発明に従う方法は、自己抗体よりもずっとより低い濃度で生物流体 中に生じ・得る、自己抗体でない抗体の測定についても使用するこ゛とが出来る 。その場合でも本発明に従う方法では、特定の場合に於て、純粋な形態で得るこ とが困難である抗原が、粗製形で使用できるという１１点、及び／又は感受性が あるが及び／又は標識するのが困難な抗原の直接の標識化が避けられるという利 点を有している。

表」 １　７５５　２００　Ｇ５９ ３　７４２　５４Ｇ　５　１　０ Ｇ　２３］１　１Ｂ８１　１８５Ｇ １　０　２　１　８　Ｂ２　１　３４ １７１Ｇ７０　１２１０　１２０７ １！］　４’６０４　３９５５　５０００２３　５３０　１０７Ｇ　９４１ ２５　４３６　Ｇ　１　２　２　１　↓　０２６　１５４３　１Ｂ、５８．　２ １２７３　１　６　７　４　４　１　、ｉｉ５　３　５　０　０　０３３　２４ ２＝１　３８７２　３３３４３　Ｇ　１　９　−１　１　５　７　１　７　８４ ０１４Ｂ［３２２δ　９　２２１６ ４１　１０４３　、　８６５　１９２９４２　Ｇ８　７０　３１１ ４５　１　６　１　５　１　４７２　１　９９Ｂ−１Ｇ　１　０４　７　２０９ ９　４　１　７０５０　８０９　Ｇ２７　１　２７８ ５４６８５１３８［３９７７ ５６３Ｇ３　１　５　１　９　２７３０５　８　１　０　０　ｏ　Ｏ３２２２５ ０００Ｇ　Ｏ２０，１１２１９ Ｇ２　２４４６　３４２３　３６０４ Ｇ３　３３　１　５　２２５５　３３５３６　４　！］　２　１　４−　５　０ 　０　０　５　０　０　０Ｇ７　１２８Ｇ　１３４９　１１１７ Ｇ（３５４１Ｂ　３２８０　４　１　３０（３９４３３６３［３７７３ ７１）　３　１　７　＝１　１　５　７　４　１　Ｄ　１　４７　１　１　ＧＯ ７１３７６１８９１ Ｂ　２　１　０　４　９　２　２　９　４　１　４　０　０Ｂ４　４６５９　５ ０００　２４７１ ８Ｇ　１２７　１１　１０ ９　１　５！’）８　２５３　６６２ ９３　３Ｂ４７　４７９９　４　１　０５り　６　４２７　３４１１　１　３　 Ｇ　２９７　１８２８　、１５１１．　２１１３１００　２２９８　３６６３　 ’　２７５２１０２　２３３９　２２１８　５’０００１０５　３６５！Ｊ　１ ３９８　１４８４１　０Ｇ　７７５４　５０００　１　３８８１　０９　１　９ ８３　２６３２　２２Ｇ９１　１　１　３Ｇ７２　５０００　１４７０１１２　 ３５７８　３５７［３２１６９１１７６５８５（３３１３３Ｇ １１９　５７４Ｇ　４３０１　２９７３１２ｆ５　１６０６　１７９４　１７８ ５１２［３３（３４９５０００５０００ １３０８４Ｂ　２５８　９０７ １３５　６＋３６５　５０００　２０４３１　４７　２２　１　７０２　Ｂ−１ １３１５９８り　１　０　１　０ ＩＧＯ８２１１１０ １（３３’　９０　１０　１０ １　Ｇ６５２　１　０　１　０ １７Ｇ　５３　２３　１０ １Ｂ２　３３　１　０　１　０ １　Ｇ４２９　１　０　１　０ １Ｂ（３１９１０１０ １８９Ｇ３　１１　１０ １９０　４０　＋１１　１０ ＩＪＩ　１２　１０　１０ １　９　Ｂ　２　１　！　Ｅ３　２　７　Ｇ　８　５　０　０　０図１ 輻合（Ｂ／Ｔ）　長髪す勺棟卒色系撃 濃展（年伐／献） 図　３ ０ｄ圓 図　千 卑η゛（ユニット／胤え） フロントページの続き （７２）発明者　トーマス、パルバラ ドイツ国　ベルリン　ディー−１３３５７７−テインーオービツツースドラツセ 　２２（７２）発明者　ストラック、ジョーチムドイツ国　ベルリン　ディー− １２２４７カイザー−ウィルへルムーストラッセ　１３８

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．生物流体を （ａ）反応混合物中に不溶であるか又は固相又はミクロ固相に結合されている、 被測定抗体の型をした抗体用のバインダー及び （ｂ）トレーサー機能を果す、被測定抗体（ＡＫ）に対する抗原（Ａｇ） と反応させ、 その後液相から固相を分離し、 抗原（Ａｇ）によって不溶性バインダーに結合した標識の量又は液相に残ってい る標識の量を測定し、次に生物試料中の被測定抗体の存在又はその量を定性的な 評価又は較正曲線を使用する得られる結果のコンピューター評価により測定する 、該生物流体中の抗体（ＡＫ）の測定の為の免疫検定法に於て、 該抗原（Ａｇ）を標識化ざれない形態の粗製抗原調製物として使用すること、 検出可能な標識を有し、該抗原（Ａｇ）に特異的に結合するがバインダーとは結 合しないか又は有意義に結合しない、第３の抗体又は抗体断片（Ｆ（ＡＫ）■） を測定中で使用すること、及び 該生物流体中の被測定抗体（ＡＫ）の存在及び／又は量が、固相又は非溶解相に 結合されている該標識化抗体又は抗体断片（Ｆ（ＡＫ）■）の量から測定される ことを特徴とする方法。
2. ２．被測定抗体が人の抗体であって、該バインダーがブロテインＡ、ブロテイン Ｇ及び人起源ではない抗人抗体からなる群から選択される非特異的バインダーで ある請求項１に記載の検定法。
3. ３．標識化された抗体及び標識化された抗体断片（Ｆ（ＡＫ）■）が被測定抗体 （ＡＫ）で認識されない、そして抗原（Ａｇ）の被測定抗体（ＡＫ）への結合に より影響を受けない抗原の領域に結合されていることを特徴とする請求項１に又 は２に記載の検定法。
4. ４．被測定抗体が自己抗体であり、その検出が自己免疫病の診断を可能とする請 求項１、２又は３に記載の検定法。
5. ５．被測定抗体が甲状腺バーオキシダーゼ（ＴＰＯ）に対する自己抗体である請 求項４に記載の検定法。
6. ６．粗製抗原（Ａｇ）が高純度にされていない粗製の天然の抗原であることを特 徴とする請求項１〜５のいずれか１に記載の検定法。
7. ７．粗製天然抗原が人又は動物の臓器抽出物である請求項６に記載の検定法。
8. ８．抗原（Ａｇ）が粗製天然ｈＴＰＯであることを特徴とする請求項６又は７に 記載の検定法。
9. ９．抗原として使用される粗製天然ｈＴＰＯが、粉砕された人の甲状腺の抽出物 の形態で用いられる請求項８に記載の検定法。
10. １０．標識化された抗体又は標識生された抗体断片（Ｆ（ＡＫ）■）が、それぞ れ、抗原（Ａｇ）に対するモノクローナル抗体又はモノクローナル抗体断片であ ることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１に記載の検定法。
11. １１．標識化された抗体または標識化された抗体断片（Ｆ（ＡＫ）■）に結合さ れた検出可能な標識が放射性同位元素、酵素、螢光性又は化学発光性の標識又は 酵素的検出反応の為の物質又は免疫検定法で使用ざれる別の既知標識である請求 項１〜１０のいずれか１に記載の検定法。
12. １２．粗製抗原（Ａｇ）が前の段階中で標識化された抗体又は抗体断片（Ｆ（Ａ Ｋ）■）と反応され、粗製抗原調製物（Ａｇ）中の実際の抗原の部分がこの方法 で間接的に標識化され、次に標識化された粗製抗原（Ａｇ）が、バインダーによ り固相又は非溶解相に結合されている被測定抗体（ＡＫ）を含有している予備培 養反応混合物に加えられる、請求項１〜１１のいずれか■に記載の検定法。
13. １３．請求項１〜１２のいずれか１に従う免疫検定法による生物流体中の抗体（ ＡＫ）測定用のキットの製造の為の粗製天然抗原（Ａｇ）の用途。