BRPI0708677A2 - ensaio de anticorpo antifármaco - Google Patents

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Kay-Gunnar Stubenrauch
Rudolf Vogel
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Abstract

ENSAIO DE ANTICORPO ANTIFáRMACO. A presente invenção refere-se a um método para a determina- ção imunoíógióa de um anticorpo contra um anticorpo-fármaco em uma a- mostra, usando um imunoensaio de formação de ponte dupla com antígeno, compreendendo um anticorpo-fármaco de captura e um anticorpo-fármaco rastreador, caracteriazado pelo fato de que o anticorpo-fármaco de captura é uma mistura do dito anticorpo-fármaco conjugado à fase sólida em pelo me- nos dois sítios diferentes do anticorpo e o anticorpo-fármaco rastreador é uma mistura do dito anticorpo-fármaco conjugado ao marcador detectável em pelo menos dois sítios diferentes do anticorpo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENSAIO DEANTICORPO ANTIFÁRMACO".
A presente invenção refere-se um método para a determinaçãode anticorpos antifármacos e kits para o uso destes ensaios.
Antecedentes da Invenção
Os imunoensaios em fase sólida padronizados com anticorposmonoclonais envolvem a formação de um complexo entre um anticorpo ad-sorvido/imobilizado sobre uma fase sólida (anticorpo de captura), o antígeno,e um anticorpo para outro epitopo do antígeno conjugado de antígeno comuma enzima (anticorpo rastreador). Assim sendo, forma-se um sanduíche:fase sólida/anticorpo de captura/antígeno/anticorpo rastreador. Na reaçãocatalisada pelo sanduíche, a atividade da enzima conjugada ao anticorpo éproporcional à concentração de antígeno no meio de incubação. O métododo sanduíche padrão é denominado também imunoensaio de formação deponte de antígeno dupla porque os anticorpos de captura e rastreador seligam a epitopos diferentes do antígeno. Hoesel, W. et al., em J. Immunol.Methods 294:101-110 (2004), relatam um ensaio de formação de formaçãode ponte dupla de antígeno anti-EPO, pelo qual foi usada uma mistura derhEPO imobilizado acoplado a grupos amino e a grupos carboidrato. Os i-munoensaios como ELISA com ponte dupla de antígeno são tipos comunsde ensaios na investigação de uma resposta imunogênica de um paciente aum fármaco-anticorpo. Mire-Sluis, A.R., et ai, J. Immunol. Methods 289:1-16(2004), resumem as recomendações para o desenho e otimização de imu-noensaios usando detecção de anticorpos do hospedeiro contra produtos debiotecnologia. De acordo com Mire-Sluis et ai, os formatos de ensaio de an-ticorpo antifármaco bem- conhecidos apresentam desvantagens considerá-veis. Os ensaios de anticorpo antifármaco são mencionados, por exemplo,nos documentos n- WO 2005/045058 e WO 90/006515. Os ensaios de anti-corpo antiidiotípico são mencionados, por exemplo, nos documentos n— US5.219.730; WO 87/002778; EP 0 139 389; e EP 0 170 302. Wadhwa, M., etai, em J. Immunol. Methods 278:1-17 (2003) relatam estratégias para a de-tecção, medição e caracterização de anticorpos indesejados induzidos porprodutos biológicos terapêuticos.
Sumário da Invenção
A invenção fornece métodos e meios para a determinação imu-nológica de um anticorpo contra um anticorpo-fármaco em uma amostra,usando um imunoensaio com ponte formação de dupla de antígeno.
A invenção fornece um método para a determinação imunológicade um anticorpo contra! um anticorpo-fármaco em uma amostra, usando umimunoensaio com formação de ponte dupla de antígeno, compreendendo umanticorpo-fármaco de captura e um anticorpo-fármaco rastreador, caracteri-zado distinguido pelo fato de que o anticorpo-fármaco de captura é uma mis-tura do dito anticorpo-fármaco que compreende pelo menos dois dos ditosanticorpos-fármaco que diferem no sítio do anticorpo no qual eles estão con-jugados à fase sólida, e o anticorpo-fármaco rastreador é uma mistura dodito anticorpo-fármaco que compreende pelo menos dois dos ditos anticor-pos-fármacos que diferem no sítio de anticorpo no qual eles estão conjuga-dos ao marcador detectável.
De preferência, a conjugação do anticorpo-fármaco ao seu par-ceiro de conjugação é realizada aglutinando quimicamente por intermédio doterminal N e/ou grupos ε-amino (lisina), grupos ε-amino de diferentes lisinas,grupos funcionais carbóxi, sulfidrila, hidroxila e/ou fenólicos da cadeia princi-pal de aminoácidos do anticorpo-fármaco e/ou grupos álcool de açúcares daestrutura de carboidrato do anticorpo-fármaco.
De preferência, a mistura de anticorpo-fármaco de captura com-preende o anticorpo-fármaco conjugado por intermédio de um grupo amino epor intermédio de uma estrutura de carboidrato ao seu parceiro de conjugação.
De preferência, a mistura de anticorpo-fármaco de captura e/oua mistura de anticorpo-fármaco rastreador compreende o anticorpo-fármacoconjugado por intermédio de pelo menos dois grupos amino diferentes aoseu parceiro de conjugação. Este acoplamento por intermédio de gruposamino diferentes pode ser realizado por acilação de uma parte dos grupos ε-amino com agentes químicos protetores, por exemplo, citraconilação, emuma primeira etapa. Em uma segunda etapa, a conjugação é realizada porintermédio dos grupos amino remanescentes. Subseqüentemente, a citraco-nilação é removida e o anticorpo-fármaco é conjugado ao parceiro de conju-gação por intermédio aos grupos amino livres remanescentes, isto é, o anti-corpo-fármaco obtido é conjugado ao parceiro de conjugação por intermédiodos grupos amino que não foram protegidos pela citraconilação.
Os agentes químicos protetores apropriados formam ligaçõesem aminas de cadeias laterais desprotegidas e são menos estáveis do que ediferentes daquelas ligações no terminal N. Muitos desses agentes químicosprotetores são conhecidos (vide, por exemplo, o Pedido de Patente Europeun2 EP 0 651 761). Os agentes químicos protetores preferidos incluem anidri-dos de ácido dicarboxílico cíclicos, tais como os anidridos do ácido maléicoou citraconílico.
De preferência, o anticorpo-fármaco de captura é conjugado àfase sólida por adsorção passiva, e portanto, é conjugado à fase sólida empelo menos dois sítios diferentes do anticorpo. A adsorção passiva está des-crita, por exemplo, por Butler, J.E., em "Solid Phases in Immunoassay" 205-225; Diamandis, E.P., e Christopoulos, T.K. (editores): Immunoassays (1996)Academic Press, San Diego.
De preferência, a mistura de anticorpo-fármaco rastreador com-preende o anticorpo-fármaco conjugado por intermédio de um grupo amino epor intermédio de uma estrutura de carboidrato ao seu parceiro de conjuga-ção.
De preferência, a razão do anticorpo-fármaco de captura para oanticorpo-fármaco rastreador é 1:10 a 50:1 (razão significa a razão de molé-culas de anticorpo independentemente do peso molecular dos conjugadosque podem ser diferentes).
De preferência, a razão de anticorpo-fármaco conjugado comamino (anticorpo de fármaco rastreador ou de captura) para o anticorpo-fármaco conjugado com carboidrato (anticorpo-fármaco rastreador ou decaptura) nessa mistura é 1:10 a 10:1 (razão significa a razão de moléculasde anticorpo independentemente do peso molecular dos conjugados quepodem ser diferentes).
Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo-fármacode captura é conjugado (imobilizado) por intermédio de um par de aglutina-ções específico. Esse par de aglutinações (primeiro componente/segundocomponente) é, por exemplo, estreptavidina ou avidina/biotina, anticor-po/antígeno (vide, por exemplo, Hermanson, G.T. et ai., "Bioconjugate Tech-niques", Academic Press, 1996), lectina/polissacarídeo, esteróide/proteínaaglutinante de esteróide, hormônio/receptor de hormônio, enzima/substrato,IgG/Proteína A e/ou G, etc. De preferência, o anticorpo-fármaco de captura éconjugado à biotina, e a !mobilização é realizada por intermédio de avidinaou estreptavidina imobilizada.
Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo-fármacorastreador é conjugado a um marcador detectável, de preferência conjugadopor intermédio de um par de algutinações específico. Tal par de aglutinações(primeiro componente/segundo componente) é, por exemplo, estreptavidinaou avidina/biotina, anticorpo/antígeno (vide, por exemplo, Hermanson, G.T.,et ' ai, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1996), lecti-na/polissacarídeo, esteróide/proteína aglutinante de esteróide, hormô-nio/receptor de hormônio, enzima/substrato, IgG/Proteína A e/ou G, etc. Depreferência, o anticorpo-fármaco rastreador é conjugado por intermédio dedigoxigenina e um anticorpo contra digoxigenina para o marcador detectável.Alternativamente, o anticorpo-fármaco rastreador é conjugado a um marca-dor eletroquimioluminescente, tal como um complexo de rutênio bispiridila.
Descrição Detalhada da Invenção
O termo "anticorpo-fármaco", de acordo com a invenção, denotaum anticorpo que pode ser administrado a um indivíduo, de tal modo queuma amostra do dito indivíduo seja suspeita de compreender o dito anticor-po-fármaco depois da administração. Dentro de um ensaio realizado de a-cordo com a invenção, o anticorpo-fármaco, o anticorpo-fármaco de capturae o anticorpo-fármaco rastreador compreendem a "mesma" molécula de an-ticorpo, produzida, por exemplo, de forma recombinante com o mesmo vetorde expressão e compreendendo a mesma seqüência de aminoácidos. Osanticorpos-fármaco (anticorpos monoclonais terapêuticos) estão sendo am-plamente utilizados para o tratamento de várias doenças, tais como doençasoncológicas (por exemplo, malignidades hematológicas e sólidas, incluindolinfoma de não-Hodgkin, câncer mamário e câncer colorretal). Tais anticor-pos estão descritos, por exemplo, por Levene, A.P., et ai, Journal of the Ro-yal Society of Medicine 98:146-152 (2005). Esses anticorpos são, por exem-plo, anticorpos contra CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250,GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, antígeno Levis Y, receptorde IL-6 ou receptor de IGF-1. Os anticorpos terapêuticos estão descritostambém por Gróner, B., et ai, Curr. Mol. Med. 4:539-547 (2004); e Harris,M., Lancet Oncol. 5:292-302 (2004).
Um anticorpo exemplificativo (de preferência, monoclonal) é umanticorpo contra o receptor de IL-6 (mAb IL-6R). Tal anticorpo está descrito,por exemplo, por Mihara et aí., Clin. Immunol. 98:319-326 (2001); Nishimoto,N., et ai, Blood 106:2627-2632 (2005); no ensaio clínico NCT00046774; ouno documento n2 WO 2004/096274.
Um anticorpo exemplificativo (de preferência, monoclonal) é umanticorpo contra o receptor de IGF-1 (mAb IGF-1R). Tal anticorpo está des-crito, por exemplo, nos documentos n— WO 2004/087756 ou WO2005/005635.
Os anticorpos antifármaco são anticorpos que são direcionadoscontra qualquer região do anticorpo-fármaco, como a região variável, a regi-ão constante ou a glicoestrutura do anticorpo-fármaco. Tais anticorpos anti-fármaco podem ocorrer durante a terapia com anticorpo, como uma reaçãoimunogênica de um paciente (vide Pan, Y., et ai, FASEB J. 9:43-49 (1995)).
Os anticorpos monoclonais contêm como proteínas inúmerascadeias laterais reativas. Tais grupos químicos reativos dos anticorpos são,por exemplo, grupos amino (lisinas, grupos alfa-amino), grupos tiol (cistinas,cisteína, e metionína), grupos ácido carboxílico (ácido aspártico, ácido glu-tâmico), e grupos alcoólicos de açúcares.
Os suportes sólidos para os imunoensaios, de acordo com a in-venção, estão amplamente descritos no estado da técnica (vide, por exem-pio, Butler, J.E., Methods 22:4-23 (2000)).
Os princípios de diferentes imunoensaios estão descritos, porexemplo, por Hage, D.S., em Anal. Chem. 71:294R-304R (1999). Lu, B .,etal., Analyst 121:29R-32R (1996), relatam a imobilização orientada de anti-corpos para uso em imunoensaios. Os imunoensaios mediados por avidina-biotina estão relatados, por exemplo, por Wilchek, M., e Bayer1 E.A., Me-thods Enzymol. 184:467*469 (1990).
Os anticorpos monoclonais e seus domínios constantes contêmcomo proteínas inúmeras cadeias laterais reativas para acoplar a um parcei-ro de aglutinação, tal como uma superfície, uma proteína, um polímero, taiscomo PEG, celulose ou poliestireno, uma enzima, ou um membro de um parde aglutinação. Os grupos químicos reativos de anticorpos são, por exemplo,grupos amino (lisinas, grupos alfa-amino), grupos tiol (cistinas, cisteínas, emetioninas), grupos ácido carboxílico (ácido aspártico, ácido glutâmico), egrupos alcoólicos de açúcares. Tais métodos estão descritos, por exemplo,por Aslam, M., e Dent, A., "Bioconjugation", MacMiIIan Ref. Ltd., 1998, pági-nas 50-100.
Um dos grupos reativos mais comuns de proteínas é a ε-aminaalifática do aminoácido lisina. Em geral, quase todos anticorpos contêm Iisi-na abundante. As aminas da lisina são nucleófilos razoavelmente bons aci-ma de pH 8,0 (pKa = 9,18) e, portanto, reagem facilmente e inteiramentecom uma serie de reagentes, para formar ligações estáveis.
Outro grupo reativo comum em anticorpos é o resíduo tiol doaminoácido que contém enxofre, cistina, e seu produto de redução, cisteína(ou meia cistina). A cisteína contém um grupo tiol livre que é mais nucleofíli-co do que as aminas e é geralmente o grupo funcional mais reativo em umaproteína. Os tióis são garalmente reativos em pH neutro, e portanto, podemser acoplados a outras moléculas seletivamente na presença de aminas.
Como os grupos sulfidrila livres são relativamente reativos, asproteínas com estes grupos existem freqüentemente com eles em sua formaoxidada como grupos dissulfeto ou ligações dissulfeto. A imunoglobulina M éum exemplo de um pentâmero ligado por dissulfeto, enquanto que as subu-nidades de imunoglobulina G são ligadas por pontes dissulfeto internas. Emtais proteínas, a redução das ligações dissulfeto com um reagente tal comoditiotreitol (DTT) é necessária para gerar o tiol livre reativo. Entretanto, estemétodo divide também a ligação da cadeia nesses anticorpos e a remonta-gem das cadeias para permitir a dobragem apropriada pode não ser possí-vel. Além da cistina e cisteína, algumas proteínas têm também o aminoácidometionina que contém enxofre em uma ligação tioéter. A modificação seleti-va da metionina é geralmente difícil de conseguir e é raramente usada comoum método de anexar fármacos e outras moléculas a anticorpos. A literaturarelata o uso de vários reagentes reticulantes tiolantes, tais como o reagentede Traut (2-iminotiolano), (acetiltio)-acetato de succinimidila (SATA), e 6-[3-(2-piridildi-tio)-propionamido]-hexanoato de sulfossuccinimidila (sulfo-LC-SPDP), para produzir maneiras eficientes para introduzir múltiplos grupossulfidrila por intermédio de grupos amino reativos.
A química de bioconjugação é a união de biomoléculas a outrasbiomoléculas, moléculas pequenas, e polímeros por meios químicos ou bio-lógicos. Isto inclui a conjugação de anticorpos e seus fragmentos, ácidosnucléicos e seus análogos, e componentes lipossômicos (ou outras molécu-las biologicamente ativas) entre si ou com qualquer grupo molecular que a-diciona propriedades úteis. Estes grupos moleculares incluem radionuclí-deos, fármacos, toxinas, enzimas, quelatos de metais, fluoróforos, haptenos,e outros.
Outro grupo reativo comum em anticorpos são ácidos carboxíli-cos (ácido aspártico, ácido glutâmico). As proteínas contêm grupos ácidocarboxílico na posição do terminal C e dentro das cadeias laterais do ácidoaspártico e ácido glutâmico. A reatividade relativamente baixa de ácidos car-boxílicos em água usualmente torna difícil usar estes grupos para modificarseletivamente as proteínas e outras biomoléculas. Quando isto é feito, ogrupo ácido carboxílico é usualmente convertido em um éster reativo pelouso de uma carbodiimida solúvel em água, e reagido com um reagente nu-cleofílico, tal como uma amina, hidrazida ou hidrazina. O reagente que con-tém amina deve ser fracamente básico para reagir seletivamente com o áci-do carboxílico ativado na presença de outras aminas na proteína. A rêticula-ção da proteína pode ocorrer quando o pH é elevado acima de 8,0.
Periodato de sódio pode ser usado para oxidar a parte de álcoolde um açúcar dentro de uma porção carboidrato para um aldeído. Cada gru-po aldeído pode ser reagido com uma amina, hidrazida ou hidrazina, comodescrito para ácidos carboxílicos. Como a porção carboidrato é predominan-temente encontrada na região do fragmento cristalizável (Fc) de um anticor-po, a conjugação pode ser conseguida através da modificação direcionadapara sítio do carboidrato longe do sítio de aglutinação de antígeno.
Os reagentes amina reativa reagem principalmente com Iisinas eos grupos α-amino de proteínas. Os ésteres reativos, particularmente os és-teres N-hidróxi-succinimida (NHS), estão entre os reagentes mais comumen-te empregados para a modificação de grupos amina. O pH ótimo para a rea-ção em um ambiente aquoso é pH 8,0 a 9,0. Os isotiocianatos sao reagentesmodifiçadores de amina e formam ligações tiouréia com proteínas. Eles rea-gem com proteína aminas em solução aquosa (idealmente em pH 9,0 a 9,5).
Os aldeídos reagem sob condições aquosas brandas com aminas alifáticase aromáticas, hidrazinas, e hidrazidas, para formar uma imina intermediária(base de Schiff). Uma base de Schiff pode ser reduzida seletivamente comagentes redutores brandos ou fortes (tais como boridreto de sódio ou ciano-boridreto de sódio), para derivar uma ligação alquil-amina estável.
Outros reagentes que foram usados para modificar aminas sãoanidridos ácidos. Por exemplo, o anidrido dietilenotriaminapentaacético (DT-PA) é um agente quelante bifuncional que contém dois grupos anidrido reati-vos com amina. Ele pode reagir com o terminal N e grupos ε-amina de prote-ínas, para formar ligações amida. Os anéis anidrido abrem para criar braçosquelantes de metais polivalentes capazes de se ligar firmemente a metaisem um complexo de coordenação.
Os reagentes reativos com tiol são aqueles que se acoplarão agrupos tiol em proteínas, formando produtos acoplados a tioéteres. Estesreagentes reagem rapidamente em pH ligeiramente ácido a neutro, e portan-to, podem ser reagidos seletivamente na presença de grupos amina.Os derivados de haloacetila, por exemplo, iodo-acetamidas, for-mam ligações tioéter e são reagentes para modificação de tiol. Em anticor-pos, a reação ocorre em grupos cisteína que estão intrinsecamente presen-tes ou que resultam da redução de dissulfetos da cisteína em várias posi-ções do anticorpo.
Outros reagentes úteis são maleimidas. A reação de maleimidascom reagentes reativos com tiol é essencialmente a mesma que com iodoa-cetamidas. As maleimidas reagem rapidamente em pH ligeiramente ácido aneutro.
As aminas, hidrazidas e hidrazinas são reagentes reativos comaldeídos e ácidos carboxílicos (formação de ligações amida, hidrazona oualquil-amina). As aminas, hidrazidas e hidrazinas podem ser acopladas aácidos carboxílicos de proteínas depois da ativação do grupo carboxila poruma carbodiimida solúvel em água. O reagente que contém amina deve serfracamente básico, de tal modo que ele reaja seletivamente com a proteínaativada pela carbodiimida, na presença das ε-aminas mais altamente bási-cas da lisina, para formar uma ligação amida estável.
As aminas, hidrazidas e hidrazinas podem reagir também comgrupos aldeído, que podem ser gerados em anticorpos por oxidação comperiodato dos resíduos carboidrato no anticorpo. Neste cenário, forma-seuma base de Schiff intermediária que pode ser reduzida para uma alquil-amina através da redução do intermediário com agentes redutores solúveisem água, cianoboridreto de sódio (brando e seletivo) ou boridreto de sódio(forte).
O termo "amostra" inclui, porém sem limitações, qualquer quan-tidade de uma substância de um objeto vivo ou um objeto anteriormente vi-vo. Tais objetos vivos incluem, porém sem limitações, seres humanos, ca-mundongos, macacos, ratos, coelhos e outros animais. Tais substâncias in-cluem, porém em limitações, sangue total, soro ou plasma de um indivíduo,que são as fontes mais amplamente utilizadas na rotina clínica.
O termo "fase sólida" significa uma substância não-fluida, e incluipartículas (incluindo micropartículas e contas) fabricadas a partir de materi-ais tais como polímero, metais (partículas paramagnéticas, ferromagnéticas),vidro e cerâmica; substâncias em gel, tais como sílica, alumina e géis depolímero; capilares, que podem ser feitos de polímero, metais, vidro e/oucerâmica; zeólítas e outras substâncias porosas; eletrodos; placas de micro-titulação; fitas sólidas; e cubetas, tubos ou outros recipientes para amostrasde espectrômetros. Um componente de fase sólida de um ensaio é distingui-do de superfícies sólidas inertes com as quais o ensaio pode estar em conta-to pelo fato de que uma "fase sólida" contém pelo menos uma porção sobresua superfície que é intencionada para interagir com anticorpo-fármaco decaptura. Uma fase sólida pode ser um componente estacionário, tal comoum tubo, uma fita, cubeta ou placa de microtitulação, ou pode ser um com-ponente não-estacionário, tais como contas e micropartículas. As micropartí-culas também podem ser usadas como uma fase sólida para formatos deensaios homogêneos. Uma variedade de micropartículas que permitem aanexação não-covalente ou covalente de proteínas e outras substâncias po-dem ser usadas. Tais partículas incluem partículas de polímero, tais comopoliestireno e poli(metacrilato de metila); partículas de ouro, tais como nano-partículas de ouro e colóides de ouro; e partículas de cerâmica, tais comopartículas de sílica, vidro e óxidos metálicos. Vide, por exemplo, Martin,C.R., et ai, Analytical Chemistry- News and Features, 1s de maio de 1998,322a-327a, que é aqui incorporado como referência.
Os cromógenos (grupos e corantes fluorescentes ou Iumines-centes), enzimas, grupos ativos em RMN ou partículas metálicas, haptenos,por exemplo, digoxigenina, são exemplos de marcadores detectáveis. Omarcador detectável pode ser um grupo reticulante fotoativável, como porexemplo, um grupo azido ou azirina. Os quelatos de metais que podem serdetectados por eletroquimioluminescência também são grupos emissores desinais preferidos, sendo dada particular preferência a quelatos de rutênio,por exemplo, um quelato de rutênio (bispiridila)32+. Os grupos marcadores deadequados preferidos estão descritos, por exemplo, nos documentos n— EP0580 979, WO 90/05301, WO 90/11511 e WO 92/14138.
A invenção fornece um método para a determinação imunológicade um anticorpo contra um anticorpo-fámaco em uma amostra, usando umimunoensaio de formação de ponte dupla de antígeno, compreendendo umanticorpo-fármaco de captura e um anticorpo-fármaco rastreador, onde oanticorpo-fármaco de captura é uma mistura do anticorpo-fármaco que com-preende pelo menos dois dos anticorpos-fármaco que diferem no sítio doanticorpo no qual eles estão conjugados à fase sólida, e o anticorpo-fármacorastreador é uma mistura do anticorpo-fármaco que compreende pelo menosdois dos anticorpos-fármaco que diferem no sítio do anticorpo no qual elesestão conjugados ao marcador detectável.
O anticorpo-fármaco de captura útil em um método de acordocom a invenção é conjugado a uma fase sólida. A conjugação é realizada,de preferência, por aglutinação química por intermédio do terminal N e/ougrupos ε-amino (lisina), grupos ε-amino de Iisinas diferentes, grupos funcio-nais carbóxi, sulfidrila, hidroxila e/ou fenólicos da cadeia principal do amino-ácido do anticorpo-fármaco e/ou grupos álcool de açúcares da estrutura decarboidrato do anticorpo-fármaco. O anticorpo-fármaco de captura útil emum método de acordo com a invenção é uma mistura de pelo menos doisanticorpos-fármaco conjugados a uma fase sólida, onde os ditos pelo menosdois anticorpos-fármaco conjugados a uma fase sólida diferem no sítio noqual eles estão conjugados à fase sólida. Por exemplo, a mistura de pelomenos dois anticorpos-fármaco conjugados a uma fase sólida pode compre-ender um anticorpo-fármaco conjugado por intermédio de um aminoácido dacadeia principal de aminoácidos à fase sólida e um anticorpo-fármaco conju-gado por intermédio de um grupo álcool de um açúcar de uma estrutura decarboidrato do anticorpo-fármaco à fase sólida. Além disso, por exemplo, amistura de pelo menos dois anticorpos-fármaco conjugados a uma fase sóli-da pode compreender anticorpos-fármaco conjugados à fase sólida por in-termédio de resíduos de aminoácidos diferentes da sua cadeia principal deaminoácidos. A expressão "resíduo de aminoácido diferente" denota doistipos diferentes de aminoácidos, tais como, por exemplo, lisina e ácido as-pártico, ou tirosina e ácido glutâmico, ou dois resíduos de aminoácidos nu-méricos diferentes da cadeia principal de aminoácidos do anticorpo-fármaco.Neste último caso, o aminoácido pode ser do mesmo tipo ou de um tipo dife-rente. As expressões "diferem no sítio do anticorpo" e "sítio" denotam umadiferença no tipo de sítio, por exemplo, aminoácido ou grupo álcool de açú-car, ou no número do aminoácido da cadeia principal de aminoácidos naqual o anticorpo-fármaco está conjugado à fase sólida. O mesmo se aplicavice-versa ao anticorpo-fármaco rastreador útil em um método de acordocom a invenção.
Os exemplos e as figuras que se seguem são fornecidos paraauxiliar a compreensão da presente invenção, cujo âmbito verdadeiro estáenunciado nas reivindicações apensas. Deve-se entender que podem serfeitas modificações nos procedimentos enunciados sem fugir do espírito dainvenção.
Descrição das Figuras
A figura 1 representa o ensaio de formação de ponté para detec-ção de anticorpos antifármacos: o anticorpo-fármaco biotinilado (Captura-BI)está ligado a uma placa de microtitulação revestida com esteptavidina (SA-MTP). O anticorpo antifármaco faz ponte com o anticorpo-fármaco de captu-ra (Captura-BI; Bl = biotinilado) com o anticorpo-fármaco rastreador marcadocom digoxigenina (Rastreador-DIG; DIG = digoxinilado). O complexo imobili-zado é detectado pelo conjugado de peroxidase de raiz-forte policlonal anti-digoxigenina (pAB<DIG>-POD). O anticorpo antifármaco policlonal do coelho(rpAb) é usado como padrão.
A figura 2 é uma curva padrão da variante 1 de ELISA formadorade ponte, usando os conjugados dos Exemplos 1 e 4: as densidades ópticas(ODs) são fornecidas para as várias concentrações de rpAb como diluído emtampão de PBS-T (solução salina tamponada com fosfato, 0,05% em volumede Tween® 20) com 5% de soro humano.
A figura 3 é uma curva padrão da variante 2 de ELISA formadorade ponte, usando os conjugados dos exemplos 3 e 5: as densidades ópticas(ODs) são fornecidas para as várias concentrações de rpAb como diluído emtampão de PBS-T com 5% de soro humano.
A figura 4 é uma curva padrão da variante 3 de ELISA formadorade ponte, usando os conjugados dos Exemplos 2 e 6: as densidades ópticas(ODs) são fornecidas para as varias concentrações de rpAb como diluído emtampão de PBS-T com 5% de soro humano.
A figura 5 é uma curva-padrão da variante 4 de ELISA formadorade ponte, usando os conjugados dos Exemplos 1, 3 e 4, 6: as densidadesópticas (ODs) são fornecidas para as várias concentrações de rpAb comodiluído em tampão de PBS-T com 5% de soro humano.
A figura 6 é uma curva padrão da variante 5 de ELISA formadorade ponte, usando os conjugados dos Exemplos 1, 2, 3 e 4, 5, 6: as densida-des ópticas (ODs) são fornecidas para as varias concentrações de rpAb co-mo diluído em tampão de PBS-T com 5% de soro humano.
A figura 7 é uma curva padrão da variante 1 de ELISA formadorade ponte, usando adsorção passiva para imobilização sólida: as densidadesópticas (ODs) são fornecidas para as varias concentrações de rpAb comodiluído em tampão de PBS-T com 5% de soro humano.
Exemplos
Exemplo 1
Biotinilação do anticorpo mAb IL-6R com éster N-hidróxi-succinimida do áci-do D-biotinoil-amino-capróico
O anticorpo contra o receptor de IL-6 (mAb IL-6R) foi dialisadocontra o tampão (tampão de fosfato de potássio 100 mM (doravante referidocomo K-PO4), pH 8,5). Depois disso, a solução foi ajustada para uma con-centração de proteína de 10 mg/ml. O éster N-hidróxi-succinimida do ácidoD-biotinoil-amino-capróico foi dissolvido em DMSO e adicionado à soluçãodo anticorpo em uma razão molar de 1:5. Depois de 60 min, a reação foi in-terrompida adicionando L-lisina. O excesso do reagente marcador foi remo-vido por diálise contra K-PO4 25 mM suplementado com NaCI 150 mM, pH7,5.
Exemplo 2
Biotinilação do mAb IL-6R com éster N-hidróxi-succinimida do ácido D-biotinoil-amino-capróico depois do tratamento com anidrido do ácido citracô-nicomAb IL-6R foi dialisado contra K-PO4 100 mM, pH 8,4. Depoisdisso, a solução foi ajustada para uma concentração de proteína de 20mg/ml. O anidrido do ácido citracônico foi dissolvido em DMSO e adicionadoà solução do anticorpo em uma razão molar de 1:5. Depois de 120 min, areação foi interrompida por cromatografia em uma coluna com Sephadex®G25 equilibrada com K-PO4 100 mM, pH 8,4. A solução do anticorpo foi ajus-tada para uma concentração de proteína de cerca de 4 mg/ml. O éster N-hidróxi-succinimida do ácido D-biotinoil-amino-capróico foi dissolvido emDMSO e adicionado à solução do anticorpo em uma razão molar de 1:5. De-pois de 60 min, a reação foi interrompida adicionando L-lisina. O excesso doreagente marcador foi removido por diálise contra tampão de acetato de só-dio 200 mM, pH 5,0. A solução do anticorpo foi transferida para K-PO4 25mM suplementado com NaCI 150 mM, pH 7,2 por cromatografia em umacoluna com Sephadex® G25.
Exemplo 3
Biotinilação do mAb IL-6R com biotina-hidrazida
mAb IL-6R foi dialisado contra tampão de acetato de sódio 100mM, pH 5,5. Depois disso, a solução foi ajustada para uma concentração deproteína de 20 mg/ml. O periodato de sódio foi dissolvido em tampão de ace-tato de sódio 100 mM, pH 5,5, e adicionado à solução do anticorpo até umaconcentração final de 10 mM. Depois de 30 min, a reação foi interrompidapor cromatografia em uma coluna com Sephadex® G25 equilibrada comtampão de acetato de .sódio 100 mM, pH 5,5. A solução do anticorpo foi ajus-tada para uma concentração de proteína de cerca de 5 mg/ml, A biotina-hidrazida foi dissolvida em DMSO e adicionada à solução do anticorpo emuma razão molar de 1:50. Depois de 120 min, a reação foi interrompida adi-cionando boridreto de sódio até uma concentração final 15 mM. Depois de30 min, a solução do anticorpo foi dialisada contra K-PO4 25 mM suplemen-tado com NaCI 150 mM, pH 7,2.
Exemplo 4
Digoxigenilação de mAb IL-6R com éster N-hidróxi-succinimida do ácido di-goxigenin-3-0-metil-carbonil-e-amino-capróicoO mAb IL-6R foi dialisado contra tampão de digoxigenilação (K-PO4 100 mM, pH 8,5). Depois disso, a solução foi ajustada para uma con-centração de proteína de 10 mg/ml. O éster N-hidróxi-succinimida do ácidodigoxigenin-3-0-metil-carbonil-e-amino-capróico foi dissolvido em DMSO eadicionado à solução do anticorpo em uma razão molar de 1:5. Depois de 60min, a reação foi interrompida adicionando L-lisina. O excesso do reagentemarcador foi removido por diálise contra K-PO4 25 mM suplementado comNaCI 150 mM, pH 7,5.
Exemplo 5
Digoxigenilação de mAb IL-6R com éster N-hidróxi-succinimida do ácido di-goxigenin-3-0-metil-carbonil-8-amino-capróico, depois do tratamento comanidrido do ácido citracônico
mAb IL-6R foi dialisado contra K-PO4 100 mM, pH 8,4. Depoisdisso, a solução foi ajustada para uma concentração de proteína de 20mg/ml. O anidrido do ácido citracônico foi dissolvido em DMSO e adicionadoà solução do anticorpo em uma razão molar de 1:5. Depois de 120 min, areação foi interrompida por cromatografia em uma coluna com Sephadex®G25 equilibrada com K-PO4 100 mM, pH 8,4. A solução do anticorpo foi ajus-tada para uma concentração de proteína de cerca de 4 mg/ml. O éster N-hidróxi-succinimida do ácido digoxigenin-3-0-metil-carbonil-e-amino-capróicofoi dissolvido em DMSO e adicionado à solução do anticorpo em uma razãomolar de 1:5. Depois de 60 min, a reação foi interrompida adicionando L-lisina. O excesso do reagente marcador foi removido por diálise contra tam-pão de acetato de sódio 200 mM, pH 5,0. A solução do anticorpo foi transfe-rida para um tampão com K-PO4 25 mM e NaCI 150 mM, pH 7,2 por croma-tografia em uma coluna com Sephadex® G25.
Exemplo 6
Digoxigenilação do mAb IL-6R com digoxigenin-X-hidrazida
mAb IL-6R foi dialisado contra tampão de acetato de sódio 100mM, pH 5,5. Depois disso, a solução foi ajustada para uma concentração deproteína de 20 mg/ml. O periodato de sódio foi dissolvido em tampão de ace-tato de sódio 100 mM, pH 5,5, e adicionado à solução do anticorpo até umaconcentração final de 10 mM. Depois de 30 min, a reação foi interrompidapor cromatografia em uma coluna com Sephadex® G25 equilibrada comtampão de acetato de sódio 100 mM, pH 5,5. A solução do anticorpo foi ajus-tada para uma concentração de cerca de 5 mg/mL. A digoxigenin-X-hidrazida foi dissolvida em DMSO e adicionada à solução do anticorpo emuma razão molar de 1:50. Depois de 120 min, a reação foi interrompida adi-cionando boridreto de sódio até uma concentração final de 15 mM. Depoisde 30 min, a solução do anticorpo foi dialisada contra K-PO4 25 mM suple-mentado com NaC1150 mM, pH 7,2.
Exemplo 7
ELISA com formação de ponte para a detecção de anticorpos contra mAb IL-6R
mAb IL-6R biotinilado foi conjugado às (ligados às) cavidades deuma placa de microtitulação revestida com estreptavidina (SA-MTP) na pri- meira etapa. O anticorpo não-conjugado (não-ligado) foi removido lavandocom tampão universal. Depois disso, as amostras e os padrões referenciais(anticorpo anti-mAb IL-6R policlonal do coelho instilado em 5% de soro hu-mano) foram incubados nas cavidades. O anticorpo anti-mAb IL-6R foi ligadoao mAb IL-6R imobilizado. Depois de remover por lavagem as substânciasnão-ligadas, o anticorpo anti-mAb IL-6R ligado foi detectado com mAb IL-6Rdigoxigenilado, e em seguida, incubação com um anticorpo antidigoxigeninamarcado com peroxidase de raiz-forte (vide figura 1). O conjugado anticor-po/enzima catalisou a. reação de cor do substrato de ABTS®. O sinal foi me-dido com uma leitora ELISA a 405 nm (comprimento de onda referencial:490 nm). Os valores da absorvância de cada amostra de soro foram deter-minados em triplicatas.
Cinco variantes diferentes da ELISA com formação de ponte fo-ram realizadas:
- variante 1, usando os conjugados dos exemplos 1 e 4;
- variante 2, usando os conjugados dos exemplos 2 e 5;
- variante 3, usando os conjugados dos exemplos 3 e 6;
- variante 4, usando os conjugados mistos dos exemplos 1 e 3, eos conjugados mistos dos exemplos 4 e 6;
- variante 5. usando os conjugados mistos dos exemplos 1 - 3 eos conjugados mistos dos exemplos 4-6.
Os sinais e curvas-padrão referenciais obtidos nas diferentesvariantes de ELISA estão indicados na Tabela 1 e nas figuras 2-6.
Tabela 1
Sinais-padrão Referenciais nas Diferentes Variantes de ELISA.
<table>table see original document page 18</column></row><table>
A análise das amostras com as diferentes curvas-padrão estáindicada na tabela 2.
Tabela 2 Análise das Amostras de Soro
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Como ilustrado na tabela 1, todos os conjugados podem ser u-sados para a detecção de anticorpos anti-mAb IL-6R. Usando o mesmo anti-corpo anti-mAb IL-6R policlonal do coelho, as curvas-padrão referenciaispara todas variantes do ensaio são muito similares (figuras 2-6).
Exemplo 8
ELISA com formação de ponte para a detecção de anticorpos anti-mAb IGF-1R, usando a interação de estreptavidina/biotina para imobilização em fasesólida
O anticorpo biotinilado contra IGF-1R (mAb IGF-1R, anticorpo-fármaco) foi conjugado às (ligado às) cavidades de uma placa de microtitula-ção revestida com estreptavidina (SA-MTP) na primeira etapa. O anticorponão-conjugado (não-ligado) foi removido lavando com tampão universal. De-pois disso, as amostras e os padrões referenciais (anticorpo anti-mAb IGF-1R policlonal do coelho instilado em 5% de soro humano) foram incubadosnas cavidades. O anticorpo anti-mAb IGF-1R foi ligado ao mAb IGF-1R imo-bilizado. Depois de remover por lavagem as substâncias não-ligadas, o anti-corpo anti-mAb IGF-1R.ligado foi detectado com mAb IGF-1R digoxigenila-do, e em seguida, incubação com um anticorpo antidigoxigenina marcadocom peroxidase de raiz-forte. O conjugado anticorpo/enzima catalisou a rea-ção de cor do substrato de ABTS®. O sinal foi medido com uma leitora ELI-SA a 4Ú5 nm (comprimento de onda referencial: 490 nm). Os valores da ab-sorvância de cada amostra de soro foram determinados em triplicatas.
Três variantes diferentes da ELISA com formação de ponte fo-ram realizadas:
- variante 1. usando os conjugados preparados de acordo comos exemplos 1 e 4
- variante 2. usando os conjugados preparados de acordo comos exemplos 2 e 5
- variante 3. usando os conjugados mistos preparados de acordocom os exemplos 1 e 2 e os conjugados mistos preparados de acordo comos exemplos 4 e 5.
Todas variantes reagentes de mAb IGF-1R biotinilado e digoxi-genilado foram sintetizadas como descrito acima para mAb IL-6R (exemplos1,2, 4 e 5).
Os sinais-padrão referenciais obtidos nas diferentes variantes deELISA estão indicados na Tabela 3.
Tabela 3
Sinais-padrão Referenciais nas Diferentes Variantes de ELISA.
<table>table see original document page 20</column></row><table>
A análise das amostras com as diferentes curvas-padrão estáindicada na tabela 4.
Tabela 4
Análise das Amostras de Soro.
<table>table see original document page 20</column></row><table>
A tabela 3 ilustra que todos os conjugados podem ser usadospara a detecção de anticorpos anti-mAb IGF-1R. Usando o mesmo anticorpoanti-mAb IGF-1R policlonal do coelho, os valores-padrão referenciais paratodas as variantes do ensaio são muito similares (Tabela 3).
Exemplo 9ELISA com formação de ponte para a detecção de anticorpos anti-mAb IGF-1R, usando a adsorção passiva para conjugação (imobilização) em uma fasesólida
Uma placa de microtitulação (MTP) (Maxisorb®, Nunc) foi reves-tida com mAb IGF-1 R em tampão de carbonato (pH 9,6) à temperatura am-biente (RT) por 1 h. Depois de lavar três vezes com PBS-Tween® 20, todasas cavidades das MTPs foram bloqueadas com PBS/3% (p/v) de BSA (al-bumina de soro bovino) à temperatura ambiente por 1 h, e depois lavadasnovamente. Depois disso, as amostras e os padrões referenciais (anticorpoanti-mAb IGF-1R policlonal do coelho instilado em 5% de soro humano) fo-ram incubados. O anticorpo anti-mAb IGF-1R foi ligado ao mAb IGF-1 R imo-bilizado. Depois de remover por lavagem as substâncias não-ligadas, o anti-corpo anti-mAb IGF-1 R ligado foi detectado com mAb IGF-1 R digoxigenila-do, e em seguida, incubação com um anticorpo antidigoxigenina marcadocom peroxidase de raiz-forte. O conjugado anticorpo/enzima catalisou a rea-ção de cor do substrato de ABTS®. O sinal foi medido com uma leitora ELI-SA a 405 nm (comprimento de onda referencial: 490 nm). As densidadesópticas de cada amostra de soro foram determinadas em triplicatas.
Três variantes diferentes da ELISA com formação de ponte fo-ram realizadas:
• - variante 1. usando os conjugados preparados de acordo com oExemplo 4
- variante 2, usando os conjugados preparados de acordo com oExemplo 5
- variante 3. usando os conjugados mistos preparados de acordocom os exemplos 4 e 5.
Todas variantes reagentes de mAb IGF-1 R digoxigenilado foramsintetizadas como descrito acima para mAb IL-6R (exemplos 4 e 5). Os si-nais-padrão referenciais nas diferentes variantes de ELISA estão indicadosna Tabela 5 e na figura 7.
Tabela 5
Sinais-padrão Referenciais.<table>table see original document page 22</column></row><table>
Como indicado pela Tabela 5, o ensaio de formação de ponte deacordo com a invenção, usando adsorção passiva para conjugação (imobili-zação) de mAb IGF-1R sobre a fase sólida, pode ser conduzido para detec-tar anticorpos anti-mAb IGF-1R. Usando o mesmo anticorpo anti-mAb IGF-1R policlonal do coelho, os valores-padrão referenciais para todas as trêsvariantes do ensaio são muito similares (Tabela 5).

Claims (11)

1. Método para a determinação imunológica de um anticorpocontra um anticorpo-fármaco em uma amostra, usando um imunoensaio deformação de ponte dupla com antígeno, compreendendo um anticorpo-fármaco de captura e um anticorpo-fármaco rastreador, caracterizado pelofato de que:(i) o anticorpo-fármaco de captura é uma mistura do dito anticor-po-fármaco que compreende pelo menos dois dos ditos anticorpos-fármacosque diferem no sítio do anticorpo no qual eles estão conjugados à fase sólida;e(iii) o anticorpo-fármaco rastreador é uma mistura do dito anti-corpo-fármaco que compreende pelo menos dois dos ditos anticorpos-fármacos que diferem no sítio de anticorpo no qual eles estão conjugados aomarcador detectável.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a conjugação do anticorpo-fármaco ao seu parceiro de conjuga-ção é realizada ligando quimicamente por intermédio do terminal N e/ou gru-pos ε-amino (lisina), grupos ε-amino de diferentes lisinas, grupos funcionaiscarboxila, sulfidrila, hidroxila e/ou fenólicos da cadeia principal de aminoáci-dos do anticorpo-fármaco e/ou grupos álcool de açúcares da estrutura decarboidrato do anticorpo-fármaco.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a mistura de anticorpos-fármacos rastreadores compreendeo anticorpo-fármaco conjugado por intermédio de um grupo amino e por in-termédio de uma estrutura de carboidrato ao seu parceiro de conjugação.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de que a mistura de anticorpos-fármacos de captu-ra compreende o anticorpo-fármaco conjugado por intermédio de um grupoamino e por intermédio de uma estrutura de carboidrato ao seu parceiro deconjugação.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de que a conjugação do anticorpo-fármaco de cap-tura à fase sólida é realizada por adsorção passiva.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de que a razão do anticorpo-fármaco de capturapara o anticorpo-fármaco rastreador é 1:10 a 50:1 (razão significa a razão demoléculas de anticorpos independentemente do peso molecular dos conju-gados que podem ser diferentes).
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a razão do anticorpo-fármaco conjugadopor amino (anticorpo-fármaco rastreador ou de captura) para o anticorpo-fármaco conjugado por carboidrato (anticorpo-fármaco rastreador ou de cap-tura) nessa mistura é 1:10 a 10:1 (razão significa a razão de moléculas deanticorpos independentemente do peso molecular dos conjugados que po-dem ser diferentes).
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 6 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo-fármaco dè captura éimobilizado por intermédio de um par de ligação específico.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o anticorpo-fármaco de captura é conjugado à biotina e a imobili-zação é realizada por intermédio de avidina ou estreptavidina imobilizada.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo-fármaco rastreador é conjugado ao marcador detectável por intermédio de um par de ligação específico.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o anticorpo-fármaco rastreador é conjugado à digoxigeninae a ligação ao marcador detectável é realizada por intermédio de um anti-corpo contra digoxigenina.
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