PL216534B1 - Środek terapeutyczny do leczenia młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów o początku układowym i środek terapeutyczny do leczenia choroby Stilla wieku dorosłego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku środek terapeutyczny do leczenia młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów o początku układowym oraz środek terapeutyczny do leczenia choroby Stilla wieku dorosłego.

Stan techniki

IL-6 jest cytokiną zwaną czynnikiem stymulującym komórki B 2 (BSF2) lub interferonem β2. IL-6 odkryto jako czynnik różnicowania odpowiedzialny za pobudzenie komórek limfatycznych B (Hirano, T. i wsp., Nature (1986) 324, 73-76). Następnie stwierdzono, że IL-6 jest cytokiną o wielu funkcjach wpływającą na czynność różnych komórek (Akira, S. i wsp., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78). Opisywano, że IL-6 wpływa na dojrzewanie komórek limfatycznych T (Lotz, M. i wsp., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258).

IL-6 wywiera swą aktywność biologiczną za pośrednictwem dwóch białek na komórce. Jednym z nich jest białko wiążące się z ligandem, receptor IL-6, o masie cząsteczkowej ok. 80 kDa, z którym wiąże się IL-6 (Taga, T. i wsp., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981; Yamasaki, K. i wsp., Science (1987) 241, 825-828). Receptor IL-6 występuje nie tylko w postaci związanej z błoną, przenikającej błonę komórkową i ulegającej w niej ekspresji, lecz również jako rozpuszczalny receptor IL-6 utworzony głównie z regionu pozakomórkowego.

Drugim z tych białek jest związane z błoną komórkową białko niewiążące się z ligandami gp130 o masie cząsteczkowej ok. 130 kDa uczestniczące w przekazywaniu sygnałów. IL-6 i receptor IL-6 tworzą kompleks IL-6/receptor IL-6, z którym wiąże się gp130, przez co dochodzi do rozprzestrzenienia się aktywności biologicznej IL-6 do komórki (Taga i wsp., Cell (1989) 58, 573-581).

Antagoniści IL-6 są to substancje hamujące przekazywanie aktywności biologicznych IL-6. Dotychczas znane były przeciwciała skierowane przeciwko IL-6 (przeciwciała anty-IL-6), przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi IL-6 (przeciwciała anty-IL-6R), przeciwciała przeciwko gp130 (przeciwciała anty-gp130, IL-6 o zmienionym kształcie, częściowe peptydy IL-6 lub receptora IL-6 itp.

Wielokrotnie opisywano przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi IL-6 (Novick D. i wsp., Hybridoma (1991) 10, 137-146; Huang, Y.W. i wsp., Hybridoma (1993) 12, 621-630; międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 95-09873; francuskie zgłoszenie patentowe FR 2694767; patent Stanów Zjednoczonych 5216128). Humanizowane przeciwciało PM-1 wytwarzano poprzez implantację regionu determinującego dopasowanie (CDR) przeciwciała mysiego PM-1 (Hirata i wsp., J. Immunology (1989), jednego z przeciwciał skierowanych przeciwko receptorowi IL-6, 143, 2900-2906) do przeciwciała ludzkiego (międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 92-19759).

Przewlekłe zapalenia stawów w przebiegu chorób wieku dziecięcego obejmują przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego, chorobę Stilla itp. Przewlekłe zapalenie stawów wieku dziecięcego jest to grupa chorób obejmująca głównie przewlekłe zapalenie stawów pojawiające się przed ukończeniem 16 roku życia; ta grupa chorób występuje najczęściej spośród chorób kolagenowych występujących u dzieci. W przeciwieństwie do reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) u dorosłych, tej grupy nie uważa się za jednorodną chorobę i występuje wiele typów tych chorób, tak więc zwykle traktuje się je jako jednostkę chorobową odmienną od reumatoidalnego zapalenia stawów u dorosłych.

Przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego zwane są w Japonii „młodzieńczym reumatoidalnym zapaleniem stawów (ang. juvenile rheumatoid arthritis - JRA) zgodnie z kryteriami diagnostycznymi przyjętymi w Stanach Zjednoczonych, natomiast w Europie stosuje się zwykle termin „młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów (ang. juvenile chronic arthritis - JCA). Od niedawna używa się terminów takich jak idiopatyczne przewlekłe zapalenie stawów (ang. idiopathic chronic arthritis - ICA) i młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów (ang. juvenile idiopathic arthritis - JIA).

Typy chorób z grupy przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego klasyfikowano na wiele sposobów. Według Amerykańskiego Kolegium Reumatologii (American College of Rheumatology ACR) dzieli się je, jako zapalenia stawów powstające u dzieci poniżej 16 roku życia utrzymujące się przez co najmniej 6 tygodni, na trzy typy: 1) JRA o początku ogólnoukładowym, 2) typ wielostawowy, 3) typ ubogostawowy (klasyfikacja ARA) (Podkomitet do Spraw Kryteriów JRA Komitetu do Spraw Kryteriów Rozpoznawania i Leczenia Amerykańskiego Stowarzyszenia Reumatologów, Arthritis Rheum 20 (Suppl) : 195, 1977). W Europie Europejska Liga Przeciwko Reumatyzmowi (ang. European League Against Rheumatism - EULAR) opracowała klasyfikację, w której; mimo że różni się ona od wyżej wspomnianej klasyfikacji ARA tym, że czas trwania zapalenia stawów wynosi co najmniej

PL 216 534 B1 miesiące i z grupy tej wykluczono zapalenie stawów w przebiegu łuszczycy, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa itp.; trzy typy choroby są podobne (Biuletyn 4, Nomenclature and classification of Arthritis in Children. Bazylea, National Zeitung AG, 1977).

Niedawno usiłowano dokonać modyfikacji tej klasyfikacji i Międzynarodowa Liga Stowarzyszeń Reumatologów (ang. International League of Associations for Rheumatology - ILAR) zaproponowała w 1995 r. plan klasyfikacji idiopatycznych zapaleń stawów wieku dziecięcego (Fink CW, Proposal for the development of classification criteria for idiopathic arthritides of childhood. J. Rheumatol., 22: 1566 (1955)); w 1997 roku zaproponowano zmiany jako plan ILAR (Southwood TR, Classifying childhood arthritis, Ann. Rheum. Dis. 56: 79 (1997)). W klasyfikacji tej proponuje się podział na: 1) ogólnoukładowe zapalenia stawów, 2) zapalenia wielostawowe z obecnością RF, 3) zapalenia wielostawowe bez obecności RF, 4) zapalenia niewielu stawów (skąpostawowe), 5) rozszerzone zapalenie niewielu stawów (skąpostawowe), 6) zapalenie stawów związane z zapaleniem przyczepów ścięgnistych 7) łuszczycowe zapalenie stawów i 8) inne.

Ponadto, twórcy niniejszego wynalazku zaproponowali sposób klasyfikacji przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego na następujące grupy:

1) pierwotne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (1) zespół SPRASH (SPRASH: gorączka z pikami, zapalenie osierdzia, wysypka, zapalenie stawów, powiększenie śledziony, powiększenie wątroby)

Choroba rozpoczyna się od uczucia gorąca w spoczynku i wysypki skórnej, a następnie dochodzi do zapalenia błon surowiczych i powiększenia wątroby oraz jednoczesnego opóźnionego pojawienia się zapalenia stawów; niekiedy zapalenie stawów nie występuje.

(2) idiopatyczne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego

Rozwijają się one bez podłoża innej choroby: zapalenie stawów jest główną patologią. a) typ z obecnością czynnika reumatoidalnego (RF) b) typ z obecnością przeciwciał przeciwjądrowych (ANA)

c) typ bez obecności RF/ANA

2) wtórne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego

Zapalenie stawów towarzyszy wielu chorobom genetycznym lub niegenetycznym (Shunpei Yokota, „Advances in recent therapeutic methods for chronic arthritides diseases of childhood, Rheumatism, 39: 860 (1999)).

Opisywano, że w patogenezie przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego biorą udział różne cytokiny. W szczególności uważa się, że chorobie tej towarzyszy brak równowagi cytokin zapalnych IL-1, IL-6, IL-12 i TNF -a, cytokin przeciwzapalnych IL-1ra (antagonista receptora IL-1), IL-10, IL-13, sTNFR (rozpuszczalny receptor TNF).

W leczeniu przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego stosowano niesteroidowe leki przeciwzapalne, kortykosteroidy, leki przeciwreumatyczne (związki złota itd.), środki immunosupresyjne, metotreksat (MTX itp.). Jednakże, ze względu na to, że efekt terapeutyczny jest różny u poszczególnych pacjentów, nadal istnieją oczekiwania co do rozwoju skuteczniejszych sposobów leczenia.

Choroba Stilla, po raz pierwszy opisana przez brytyjskiego pediatrę, dr Stilla, w 1897 r., cechuje się obrazem klinicznym wyraźnie odmiennym niż reumatoidalne zapalenie stawów wieku dorosłego i jest chorobą występującą zarówno u dorosłych, jak i u dzieci (zwłaszcza u młodzieży). Do głównych objawów należą: gorączka, rumień skóry, zapalenie stawów, zapalenie błon surowiczych itp. W tej grupie chorób typ z początkiem w wieku dorosłym określa się jako chorobę Stilla z początkiem w wieku dorosłym. W chorobie Stilla nie stwierdza się zwykle obecności czynnika reumatoidalnego.

Choroba Stilla u dzieci jest inną nazwą ogólnoukładowego typu młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów (młodzieńcze reumatoidalne zapalenie stawów (JRA), JCA (młodzieńcze przewlekłe zapalenie stawów), młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów (JIA)), które jest przewlekłym zapaleniem stawów pojawiającym się u dzieci poniżej 16 roku życia. Jeżeli chodzi o przyczyny choroby Stilla, sugerowano udział czynników środowiskowych, takich jak wirusy, czynników związanych z organizmem gospodarza, takich jak HLA i nieprawidłowości immunologicznych, lecz etiologia pozostaje nadal nieznana.

Choroba Stilla u dorosłych i u dzieci wydaje się w zasadzie tą samą chorobą mimo istnienia niewielkich różnic w obrazie klinicznym, a nie tylko różnic dotyczących wieku wystąpienia choroby. Choroba Stilla u dzieci jest podobna do JRA typu ogólnoukładowego, jak to opisywano powyżej. Jednakże JRA i reumatoidalne zapalenie stawów (rheumatoid arthritis - RA) u dorosłych wykazują wiele

PL 216 534 B1 różnic klinicznych i uważa się je za różne choroby, tak więc chorobę Stilla u dorosłych często traktuje się jako niezależną jednostkę chorobową w grupie chorób reumatycznych.

Jeżeli chodzi o kryteria rozpoznawania choroby Stilla u dorosłych, znane są kryteria Yamaguchi (Journal of Rheumatology 19(3): 424-30, 1992), Reginato (Seminars in Arthritis & Rheumatism 17(1): 39-57, 1987), Cush (Rheumatology Grand Rounds, University of Pittsburgh Medical Center; Jan. 30, 1984), Goldman (Southern Medical Journal 73: 555-563, 1980) itp.

W odniesieniu do związku choroby Stilla i cytokin opisywano jej związek z cytokinami takimi jak IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, TNF-α i IFN-γ; spośród nich cytokiny zapalne takie, jak: IL-1, IL-6, TNF -α i IFN-γ, wiązano z patologią choroby Stilla.

W odniesieniu do IL-6 de Benedetti i wsp. opisywali, że w chorobie Stilla u dzieci poziom IL-6 w surowicy jest podwyższony (Arthritis Rheum. 34: 1158, 1991), i że w surowicy chorych z chorobą Stilla wieku dziecięcego obecny jest w dużych ilościach kompleks IL-6/rozpuszczalny receptor IL-6 (sIL-6R), jak również można zaobserwować korelację między poziomem tego kompleksu a wartościami CRP (J. Clin. Invest. 93: 2114, 1994). Ponadto, Rooney i wsp. opisywali podwyższenie poziomu IL-6 i TNF-α w osoczu u chorych z chorobą Stilla wieku dziecięcego (Br. J. Rheumatol. 34: 454, 1995).

W leczeniu choroby Stilla stosuje się niesteroidowe leki przeciwzapalne, kortykosteroidy, leki przeciwreumatyczne (związki złota itd.), środki immunosupresyjne, preparaty gammaglobulin, metotreksat (MTX) itd. Jednakże, ze względu na to, że efekt terapeutyczny bywa różny u różnych pacjentów, dogodne byłoby opracowanie bardziej skutecznych sposobów leczenia.

Ujawnienie wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest środek terapeutyczny do leczenia młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów o początku układowym, charakteryzujący się tym, że jako składnik czynny zawiera przeciwciało przeciwko receptorowi interleukiny 6 (IL-6).

Korzystnie przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonaInym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6.

Korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6.

Korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6.

Korzystnie przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem rekombinowanym.

Korzystniej przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało PM-1.

Korzystniej przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało MR16-1.

Korzystnie przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim skierowanym przeciwko receptorowi IL- 6.

Korzystniej przeciwciałem humanizowanym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6 jest humanizowane przeciwciało PM-1.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto środek terapeutyczny do leczenia choroby Stilla wieku dorosłego, charakteryzujący się tym, że jako składnik czynny zawiera przeciwciało przeciwko receptorowi interleukiny 6 (IL-6).

Korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6.

Jeszcze korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6.

Jeszcze korzystniej przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6.

Korzystniej przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem rekombinowanym.

Korzystniej przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało PM-1.

Korzystniej przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało MR16-1.

PL 216 534 B1

Korzystnie przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim skierowanym przeciwko receptorowi IL-6.

Korzystniej przeciwciałem humanizowanym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6 jest humanizowane przeciwciało PM-1.

Najlepszy sposób wykonania wynalazku

Wyżej wspomniany antagonista IL-6 jest, korzystnie, przeciwciałem przeciwko receptorowi IL-6, korzystnie monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 lub monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6. Takim monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 może być przeciwciało PM-1, a takim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 może być zilustrowane przeciwciało MR16-1.

Powyższe przeciwciało jest, korzystnie, przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim, np. humanizowanym przeciwciałem PM-1.

Do przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego, które można leczyć środkiem terapeutycznym według wynalazku, należą wszystkie choroby wymienione w powyżej wspomnianych klasyfikacjach ARA, EULAR i ILAR i w klasyfikacji twórców niniejszego wynalazku. W miarę postępu serologicznych metod diagnostycznych oraz sposobów leczenia klasyfikacja typów chorób w grupie przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego jest obecnie poddawana rewizji na skalę globalną i można powiedzieć, że jest ona niepewna. Zalecane jest leczenie środkiem terapeutycznym według wynalazku następujących chorób: według klasyfikacji ARA - zapaleń ogólnoukładowych, wielostawowych i obejmujących niewiele stawów; według klasyfikacji EULAR - chorób o początku ogólnoukładowym, wieIostawowych i ubogostawowych; według klasyfikacji ILAR - chorób o początku ogólnoukładowym, wielostawowych (RF-dodatnich), wielostawowych (RF-ujemnych), zapaleń obejmujących niewiele stawów i rozszerzonych zapaleń obejmujących niewiele stawów, i w klasyfikacji twórców niniejszego wynalazku - pierwotnych przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego (zespół SPRASH, idiopatyczne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (a. typ z obecnością czynnika reumatoidalnego (RF), b. typ z obecnością przeciwciał przeciwjądrowych (ANA), c. typ z nieobecnością RF/ANA)). Najbardziej zalecanymi chorobami, które można leczyć środkami terapeutycznymi według wynalazku są: według klasyfikacji ARA choroby o początku ogólnoukładowym i wielostawowe, według klasyfikacji EULAR - choroby o początku ogólnoukładowym i wielostawowe; według klasyfikacji ILAR choroby o początku ogólnoukładowym, wielostawowe (RF-dodatnie), wielostawowe (RF-ujemne) i rozszerzone zapalenia obejmujące niewiele stawów, natomiast w klasyfikacji twórców niniejszego wynalazku, pierwotne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (zespół SPRASH, idiopatyczne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (a. typ z obecnością czynnika reumatoidalnego (RF), b. typ z obecnością przeciwciał przeciwjądrowych (ANA)). Bardziej zalecanymi chorobami, które można leczyć środkami według wynalazku, są: według klasyfikacji ARA - choroby o początku ogólnoukładowym i wielostawowe; według klasyfikacji EULAR - choroby o początku ogólnoukładowym i wielostawowe; według klasyfikacji ILAR - choroby o początku ogólnoukładowym wielostawowe (RF-dodatnie) i rozszerzone zapalenia obejmujące niewiele stawów, natomiast w klasyfikacji autorów niniejszego wynalazku - pierwotne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (zespół SPRASH, idiopatyczne przewlekłe zapalenia stawów wieku dziecięcego (a. typ z obecnością czynnika reumatoidalnego (RF)).

Antagoniści IL-6 do zastosowania tu opisanego mogą pochodzić z dowolnego źródła, mogą być dowolnego typu i w dowolnej postaci, o ile wykazują wpływ terapeutyczny na przewlekłe zapalenia stawów w przebiegu chorób wieku dziecięcego.

Antagoniści IL-6 są to substancje blokujące przekazywanie sygnałów przez IL-6 i hamujące aktywność biologiczną IL-6. Antagoniści IL-6 są to substancje dogodnie hamujące działanie na wiązanie z dowolną z następujących substancji: IL-6, receptor IL-6 lub gp130. W odniesieniu do antagonistów IL-6 można wymienić na przykład przeciwciała anty-IL-6, przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6, przeciwciała anty-gp130, IL-6 o zmienionym kształcie, rozpuszczalny receptor IL-6 o zmienionym kształcie lub częściowe peptydy IL-6 lub receptora IL-6, jak również substancje o małej masie cząsteczkowej wykazujące podobne do nich aktywność.

Przeciwciała anty-IL-6 do zastosowania tu opisanego można wytwarzać jako przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne sposobami znanymi ze stanu techniki. Korzystne do zastosowania tu opisanego w roli przeciwciał anty-IL-6 są przeciwciała monoklonalne, zwłaszcza pochodzące od ssaków. Do przeciwciał monoklonalnych pochodzących od ssaków należą przeciwciała wytwarzane przez hy6

PL 216 534 B1 brydomy oraz przeciwciała wytwarzane przez organizm gospodarza, przekształcony techniką inżynierii genetycznej, zawierający wektor ekspresyjny zawierający gen przeciwciała. Przeciwciała te, poprzez wiązanie się z IL-6, blokują wiązanie IL-6 z receptorem IL-6 i przez to blokują rozprzestrzenianie się aktywności biologicznej IL-6 do komórki.

Przykładami takich przeciwciał są: przeciwciało MH166 (Matsuda i wsp., Eur. J. Immunology (1988) 18, 951-956) i przeciwciało SK2 (Sato i wsp., The 21^st General Meeting of the Japanese Society for Immunology, Gakujutu Kiroku (1991) 21, 166) itd.

Hybrydomę wytwarzającą przeciwciała IL-6 można w zasadzie skonstruować opisanymi poniżej sposobami znanymi ze stanu techniki. I tak, stosuje się IL-6 jako antygen uczulający, którym immunizuje się konwencjonalnym sposobem immunizacji i tak uzyskane komórki immunologiczne poddaje się fuzji ze znanymi komórkami macierzystymi w konwencjonalnym procesie fuzji komórek, a następnie dokonuje się konwencjonalnym sposobem przeszukiwania w celu selekcji komórek wytwarzających przeciwciała monoklonalne.

Bardziej szczegółowo, przeciwciała anty-IL-6 można wytworzyć w następujący sposób. Na przykład ludzkie IL-6, które ma być stosowane jako antygen uczulający do uzyskiwania przeciwciał można wytworzyć stosując gen IL-6/sekwencję aminokwasową opisaną w Eur. J. Biochem. (1987) 168, 543-550; J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541 lub Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688.

Po wprowadzeniu sekwencji genowej IL-6 do znanego wektora ekspresyjnego w celu przekształcenia odpowiedniej komórki gospodarza, dogodne białko IL-6 można oczyszczać z komórki gospodarza lub z nadsączu jej hodowli znanym sposobem, a oczyszczone białko IL-6 można stosować jako antygen uczulający. Zamiast tego jako antygen uczulający można stosować białko fuzyjne, białka IL-6 i inne białka.

Przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6 do zastosowania tu opisanego można wytwarzać jako przeciwciało poliklonalne lub monoklonalne znanymi sposobami. Jako przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6 do zastosowania tu opisanego szczególnie korzystne są przeciwciała monoklonalne, zwłaszcza pochodzące od ssaków. Do przeciwciał monoklonalnych pochodzących od ssaków należą przeciwciała wytwarzane przez hybrydomy, przeciwciała wytwarzane przez organizm gospodarza przekształcony technikami inżynierii genetycznej z zastosowaniem wektora ekspresyjnego zawierającego gen przeciwciała. Przeciwciała te poprzez wiązanie się z IL-6 blokują wiązanie IL-6 z receptorem IL-6, przez co blokują rozprzestrzenianie się aktywności biologicznej IL-6 do komórki.

Przykładami takich przeciwciał są: przeciwciało MR16-1 (Tamura, T. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), przeciwciało PM-1 (Hirata, Y. i wsp., J. Immunology (1989) 143, 2900-2906), przeciwciało AUK12-20, AUK64-7 lub AUK-146-15 (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 92-19759) itp. Najbardziej korzystne z nich jest przeciwciało PM-1.

Nawiasem mówiąc, linię komórek hybrydomy wytwarzającą przeciwciało PM-1 złożono w międzynarodowym depozycie zgodnie z zasadami Traktatu Budapesztańskiego jako PM-1 dnia 12 lipca 1988 w Międzynarodowej Instytucji Depozytowej Opatentowanych Drobnoustrojów Narodowego Instytutu Nauk Przemysłowych i Techniki (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., 305-5466 Japonia) pod numerem FERM BP-2998. Również linia komórek hybrydomy wytwarzająca przeciwciało MR16-1 została złożona zgodnie z zasadami Traktatu budapesztańskiego jako hybrydoma szczurzo-mysia MR16-1 dnia 13 marca 1997 w Międzynarodowej Instytucji Depozytowej Opatentowanych Drobnoustrojów Narodowego Instytutu Nauk Przemysłowych i Techniki (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., 305-5466 Japonia) pod numerem FERM BP-5875.

Hybrydomę wytwarzającą przeciwciało monoklonalne przeciwko receptorowi IL-6 można, w zasadzie, wytworzyć znanymi sposobami opisanymi poniżej. I tak, jako antygen uczulający wykorzystuje się receptor IL-6, którym immunizuje się konwencjonalnym sposobem immunizacji i w ten sposób wytworzone komórki immunologiczne poddaje się fuzji ze znanymi komórkami macierzystymi, w konwencjonalnym procesie fuzji komórkowej, po którym prowadzi się konwencjonalne przeszukiwanie w celu wyselekcjonowania komórek wytwarzających przeciwciało monoklonalne.

Bardziej szczegółowo, przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6 można wytworzyć w następujący sposób. Na przykład ludzki receptor IL-6, wykorzystywany jako antygen uczulający do wytwarzania przeciwciała, można uzyskać z zastosowaniem genu receptora IL-6/sekwencji aminokwasowej opisanej w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 325474, natomiast mysi receptor IL-6 można wytworzyć stosując gen receptora IL-6/sekwencję aminokwasową, opisane w japońskiej, niepoddanej badaniu publikacji patentowej (Kokai) nr 3-155795.

PL 216 534 B1

Znane są dwa typy receptora IL-6: receptor IL-6 ulegający ekspresji na błonie komórkowej i receptor IL-6 oderwany od błony komórkowej (rozpuszczalny receptor IL-6; Yasukawa i wsp., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Przeciwciało przeciwko rozpuszczalnemu receptorowi IL-6 utworzone jest z przeważnie zewnątrzkomórkowego regionu receptora IL-6, połączonego z błoną komórkową i różni się od związanego z błoną receptora IL-6 tym, że przeciwciało rozpuszczalne nie zawiera regionu przezbłonowego lub nie zawiera ani regionu przezbłonowego, ani regionu wewnątrzkomórkowego. Białkiem receptora IL-6 może być dowolny receptor IL-6, pod warunkiem, że można go wykorzystać jako antygen uczulający do wytwarzania przeciwciał przeciwko receptorowi IL-6, do zastosowania tu opisanego.

Po wprowadzeniu genu kodującego receptor IL-6 do znanego systemu wektorów ekspresyjnych, w celu przekształcenia odpowiedniej komórki gospodarza, pożądane białko receptorowe IL-6 można oczyszczać z komórki gospodarza lub z nadsączu jej hodowli, znanymi sposobami, i w ten sposób oczyszczone białko receptorowe IL-6 można wykorzystywać jako antygen uczulający. Zamiast tego jako antygen uczulający można wykorzystywać komórki wykazujące ekspresję białka receptorowego IL-6 lub białka fuzyjnego białka receptorowego IL-6 i innego białka.

Escherichia coli (E. coli) zawierająca plazmid pIBIBSF2R zawierający cDNA kodujący ludzki receptor IL-6 została złożona zgodnie z zasadami Traktatu budapesztańskiego pod numerem HB101-pIBIBSF2R 9 stycznia 1989 roku w Międzynarodowej Instytucji Depozytowej Opatentowanych Drobnoustrojów Narodowego Instytutu Nauk Przemysłowych i Techniki (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., 305-5466 Japonia) pod numerem FERM BP- 2232.

Przeciwciała przeciwko gp130 do zastosowania tu opisanego można wytwarzać jako przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne znanymi sposobami. Zalecane jest stosowanie jako przeciwciał przeciwko gp130 do zastosowania tu opisanego przeciwciał monoklonalnych pochodzących w szczególności od ssaków. Do przeciwciał monoklonalnych pochodzących od ssaków należą przeciwciała wytworzone przez hybrydomę oraz przeciwciała wytworzone przez organizm gospodarza przekształcony techniką inżynierii genetycznej wektorem ekspresyjnym, zawierającym gen przeciwciała. Przeciwciała te poprzez wiązanie z gp130 blokują wiązanie gp130 z kompleksem IL-6/receptor IL-6, przez co blokują rozprzestrzenianie się aktywności biologicznej IL-6 do komórki.

Przykładami takich przeciwciał są: przeciwciało AM64 (japońska niepoddana badaniu publikacja patentowa (Kokai) nr 3-219894), przeciwciało 4B11 i 2H4 (US 5571513), przeciwciało B-S12 i przeciwciało B-P8 (japońska niepoddana badaniu publikacja patentowa (Kokai) nr 8-291199) itd.

Hybrydomę wytwarzającą przeciwciało gp130 można w zasadzie wytwarzać znanym sposobem opisanym poniżej. I tak, jako antygen uczulający stosuje się gp-130 immunizowane konwencjonalnym sposobem immunizacji, po czym wytworzone tym sposobem komórki immunologiczne poddaje się fuzji ze znanymi komórkami macierzystymi w konwencjonalnym procesie fuzji komórkowej i następnie stosuje się konwencjonalną metodę przeszukiwania celem wyselekcjonowania komórek wytwarzających przeciwciało monoklonalne.

Bardziej szczegółowo, przeciwciała monoklonalne można wytwarzać w następujący sposób. Na przykład gp130 wykorzystywane jako antygen uczulający do wytwarzania przeciwciała można wytwarzać z zastosowaniem genu gp130/sekwencji aminokwasowej opisanych w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 411946.

Sekwencję genową gp130 można wprowadzać do znanego wektora ekspresyjnego i wektor ten wykorzystywać do przekształcania odpowiedniej komórki gospodarza. Z komórki gospodarza lub z nadsączu hodowli tej komórki można oczyszczać znanymi sposobami białko gp130 i oczyszczone białko IL-6 można stosować jako antygen uczulający. Zamiast tego jako antygen uczulający można stosować komórki wykazujące ekspresję gp130 lub białko fuzyjne białka gp130 i innego białka.

Ssaki, które mają być immunizowane antygenem uczulającym, dogodnie wybiera się pod kątem ich zgodności z komórkami macierzystymi, które będą stosowane do fuzji komórkowej; do ssaków takich zazwyczaj należą, jednak bez ograniczenia, gryzonie, takie jak myszy, szczury i chomiki.

Immunizacji zwierząt antygenem uczulającym dokonuje się znanym sposobem. Ogólnie sposób ten obejmuje na przykład dootrzewnowe lub podskórne podanie antygenu uczulającego ssakowi. Bardziej szczegółowo, antygen uczulający po rozcieńczeniu i zawieszeniu w odpowiedniej ilości soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub soli fizjologicznej itd. miesza się z odpowiednią ilością znanego adiuwantu, takiego jak kompletny adiuwant Freunda. Po zemulgowaniu substancję tę, dogodnie, podaje się ssakowi kilka razy co 4 a 21 dni. Dodatkowo, w momencie immunizacji antygenem uczulającym można zastosować odpowiedni nośnik.

PL 216 534 B1

Po immunizacji i potwierdzeniu zwiększenia poziomu pożądanego przeciwciała w surowicy konwencjonalnym sposobem, komórki immunologiczne pobiera się od ssaka i poddaje fuzji komórkowej. Jako zalecane komórki immunologiczne poddawane fuzji komórkowej można w szczególności wymienić komórki śledziony.

Spośród komórek szpiczaka, pochodzących od ssaków, jako innego rodzaju komórek macierzystych poddawanych fuzji komórkowej z wyżej wymienionymi komórkami immunologicznymi, można, korzystnie, wymienić różne znane linie komórkowe, takie jak: P3x63Ag8.653 (Kearney, J. F. i wsp., J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. i Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. i wsp., Cell (1976) 8, 405-415, SP2/0 (Shulman, M. i wsp., Nature 1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. i wsp., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. i wsp., Nature (1979) 217, 131-133) itp., które można stosować w odpowiedni sposób.

Fuzję komórkową między wyżej wymienionymi komórkami immunologicznymi a komórkami szpiczaka można w zasadzie prowadzić według znanych sposobów, jak to na przykład opisali Milstein i wsp. (Kohler, G i Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), itp.

Bardziej szczegółowo, wyżej wymienioną fuzję komórkową prowadzi się w konwencjonalnym bulionie odżywczym w obecności na przykład substancji przyspieszających fuzję komórek. Jako substancję przyspieszającą fuzję komórek można stosować na przykład glikol polietylenowy (PEG), wirus Sendai (HVJ) i tp.; w celu zwiększenia skuteczności fuzji można dodawać adiuwant, np. dimetylosulfotlenek.

Zalecanym stosunkiem komórek immunologicznych i komórek szpiczaka do zastosowania jest na przykład 1 do 10 razy więcej komórek immunologicznych niż komórek szpiczaka. Przykładowymi pożywkami hodowlanymi, które można stosować do przeprowadzenia powyższej fuzji komórek, są na przykład pożywka RPMI 1640 i pożywka do hodowli MEM, które są odpowiednie do prowadzenia w nich wzrostu wyżej wspomnianych linii komórek szpiczaka oraz konwencjonalna pożywka hodowlana stosowana do tego typu hodowli komórkowej; ponadto można dodawać suplement surowicy, np. płodową surowicę cielęcą (FCS).

W przypadku fuzji komórkowej z góry ustaloną ilość wyżej wymienionych komórek immunologicznych i komórek szpiczaka miesza się dokładnie w powyższej cieczy do hodowli, do której dodaje się roztwór PEG uprzednio ogrzany do temperatury ok. 37°C, np. roztwór PEG o średniej masie cząsteczkowej wynoszącej od 1000 do 6000 w stężeniu od 30 do 60% (stężenie masa/obj.) i całość miesza się w celu wytworzenia pożądanych komórek poddanych fuzji (hybrydoma). Następnie poprzez kolejne sekwencyjne dodawanie odpowiedniej cieczy komórkowej i odwirowanie można usunąć nadsącz, środki użyte do fuzji komórkowej itd., które nie są pożądane dla wzrostu hybrydomy.

Hybrydomę selekcjonuje się poprzez hodowanie w konwencjonalnej pożywce selekcyjnej, np. pożywce hodowlanej HAT (ciecz do hodowli zawierająca hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę). Hodowlę w pożywce hodowlanej HAT prowadzi się zwykle przez czas wystarczający do uzyskania efektu zabicia komórek innych niż pożądana hybrydoma (komórek niepoddanych fuzji), zwykle przez okres od kilku dni do kilku tygodni. Prowadzi się proces konwencjonalnego rozcieńczenia ograniczającego, podczas którego selekcjonuje się i klonuje hybrydomy wytwarzające pożądane przeciwciało.

Oprócz wytworzenia wyżej wymienionej hybrydomy poprzez immunizację antygenem zwierzęcia, innego niż człowiek, można również uczulać limfocyty ludzkie in vitro pożądanym białkiem antygenowym lub komórkami wykazującymi ekspresję antygenu, a następnie uzyskane uczulone limfocyty B poddawać fuzji z komórkami szpiczaka wykazującymi zdolność ustawicznego dzielenia się, np. U266, w celu wytworzenia hybrydomy wytwarzającej pożądane przeciwciało ludzkie, wykazujące aktywność wiązania się z pożądanym antygenem lub komórkami wykazującymi ekspresję antygenu (Japońska Publikacja Patentowa Poddana Ocenie (Kokoku) 1-59878).

Następnie zwierzę transgeniczne posiadające geny przeciwciała ludzkiego immunizuje się antygenem lub komórkami wykazującymi ekspresję antygenu w celu wytworzenia pożądanego przeciwciała ludzkiego sposobami wymienionymi powyżej (zob. międzynarodowe zgłoszenia patentowe nr: WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 oraz WO 96/33735).

Tak wytwarzane hybrydomy wytwarzające przeciwciała monoklonalne można poddawać kolejnej hodowli w konwencjonalnej cieczy do hodowli lub przechowywać przez długi czas w ciekłym azocie.

PL 216 534 B1

W celu wytworzenia z tej hybrydomy przeciwciał monoklonalnych można stosować sposób, w którym tę hybrydomę hoduje się konwencjonalnym sposobem i wytwarza się przeciwciała jako nadsącz lub sposobem, w którym hybrydomę implantuje się ssakowi, w którego organizmie następnie hybrydoma wzrasta, przy czym ssak ten musi wykazywać zgodność z hybrydomą, a przeciwciała uzyskuje się z płynu przesiękowego w jamie brzusznej. Pierwszy z tych sposobów nadaje się do wytwarzania przeciwciał o dużej czystości, natomiast drugi do wytwarzania przeciwciał na dużą skalę.

Na przykład hybrydomę wytwarzającą przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 może stanowić polipeptyd wytwarzany sposobem opisanym w japońskiej niepoddanej badaniu publikacji patentowej (Kokai) nr 3-139293. Można stosować sposób, w którym hybrydomę wytwarzającą przeciwciało PM-1, złożoną w depozycie międzynarodowym zgodnie z Traktatem budapesztańskim z dnia 12 lipca 1988 w Międzynarodowej Organizacji Depozytowej Opatentowanych Drobnoustrojów Narodowego Instytutu Nauk Przemysłowych i Techniki (Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref., 305-5466, Japonia) pod numerem FERM BP-2998, wstrzykuje się dootrzewnowo myszom BALB/c w celu uzyskania u nich płynu przesiękowego w jamie brzusznej, po czym to przeciwciało PM-1 oczyszcza się z płynu przesiękowego; można też stosować metodę, w której hybrydomę hoduje się w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10-procentową płodową surowicę bydlęcą, 5% BM-Codimed H1 (produkcji firmy Boehringer Mannheim), pożywkę SFM hybrydoma (produkcji firmy GIBCO BRL), pożywkę PFHM-II (produkcji firmy GIBCO BRL lub tym podobne, z nadsączu hodowli, z którego można oczyszczać przeciwciało PM-1.

W niniejszym wynalazku jako przeciwciało monoklonalne można stosować przeciwciało rekombinowane wytworzone przez klonowanie genu przeciwciała hybrydoma, po czym gen integruje się do odpowiedniego wektora, który wprowadza się do organizmu gospodarza celem wytworzenia przeciwciała rekombinowanego, stosując technikę rekombinacji genu (zobacz np. Borrebaeck, C.A.K. i Larric, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, opublikowane w Wielkiej Brytanii przez MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990).

Bardziej szczegółowo, z komórki wytwarzającej dane przeciwciało, na przykład komórki hybrydomy izoluje się mRNA kodujący region zmienny (region V) przeciwciała. Izolację mRNA prowadzi się poprzez preparatykę RNA całkowitego znanym sposobem, takim jak metoda ultrawirowania guanidyny (Chirgwin, J.M. i wsp., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), metoda AGPC (Chomczynski, P. i wsp., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), następnie mRNA oczyszcza się z RNA całkowitego, stosując zestaw do oczyszczania mRNA (produkcji firmy Pharmacia) itp. Zamiast tego mRNA można preparować bezpośrednio, stosując zestaw do oczyszczania mRNA Quick Prep (produkcji firmy Pharmacia).

Z tak wytworzonego mRNA można wytwarzać cDNA regionu V przeciwciała, stosując odwrotną transkryptazę. cDNA można wytwarzać za pomocą zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy AMV lub podobnymi sposobami. Zamiast tego można do syntezy i powielania cDNA wykorzystać zestaw 5'-Ampli FINDER RACE (produkcji firmy Clontech) i metodę 5'-RACE (Frohman, M.A. i wsp., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyaysky, A. i wsp., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932), w którym wykorzystuje się PCR. Z wytworzonego produktu PCR oczyszcza się pożądany fragment DNA i można poddać go ligacji z DNA wektora. Następnie, wytwarza się z tego rekombinowany wektor, który następnie wprowadza się do E. coli itd., którego kolonie następnie selekcjonuje się celem wytworzenia pożądanego rekombinowanego wektora. Sekwencję zasad pożądanego DNA można potwierdzić znanymi sposobami, na przykład sposobem dideoksy.

Po wytwarzaniu DNA kodującego region V pożądanego przeciwciała można poddać je ligacji z DNA kodującym region stały (region C) pożądanego przeciwciała, i następnie całość włączyć do wektora ekspresyjnego. Zamiast tego DNA kodujący region V przeciwciała można włączyć do wektora ekspresyjnego, który zawiera już DNA kodujący region C przeciwciała.

W celu wytworzenia przeciwciała do zastosowania tu opisanego gen przeciwciała włącza się do wektora ekspresyjnego tak, aby ulegał on ekspresji pod kontrolą regionu regulacyjnego ekspresji, na przykład wzmacniacza i/lub promotora. Następnie wektor ekspresyjny transformuje się do komórki gospodarza, w której przeciwciało może ulegać ekspresji.

W niniejszym wynalazku w celu obniżenia antygenowości heterologicznej skierowanej przeciwko organizmowi człowieka można stosować sztucznie zmienione przeciwciała rekombinowane, takie jak przeciwciała chimerowe, humanizowane oraz przeciwciała ludzkie. Te zmienione przeciwciała ludzkie mogą być wytwarzane znanymi sposobami.

PL 216 534 B1

Przeciwciało chimerowe można wytwarzać poprzez poddanie ligacji tak otrzymanego DNA kodującego region V przeciwciała z DNA kodującym region C przeciwciała ludzkiego, które następnie włącza się do wektora ekspresyjnego i wprowadza do organizmu gospodarza po to, aby w organizmie tym wytworzyć przeciwciało (zob. europejskie zgłoszenie patentowe EP 125023 i międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 92-19759). Tym znanym sposobem można wytworzyć przeciwciało chimerowe korzystne do zastosowania do zastosowania tu opisanego.

Plazmidy zawierające region V łańcucha L lub region V łańcucha H chimerowego przeciwciała PM-1, oznaczone odpowiednio jako pPM-k3 i pPM-h1, i E. coli zawierające odpowiedni plazmid złożono w depozycie międzynarodowym zgodnie z zasadami Traktatu budapesztańskiego pod numerami NCIMB40366 i NCIMB40362 11 lutego 1991 w depozycie National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (Narodowy Zbiór Bakterii Przemysłowych i Morskich Sp. z o.o.).

Przeciwciało humanizowane, zwane również przeciwciałem ludzkim o zmienionym kształcie, wytworzono poprzez wstawienie regionu determinującego dopasowanie (CDR) przeciwciała ssaka, innego niż człowiek, np. przeciwciała mysiego, do CDR przeciwciała ludzkiego. Ogólna technika wytwarzania rekombinowanego DNA wykorzystywana do wytwarzania takich przeciwciał jest również znana (zob. europejskie zgłoszenie patentowe EP 125023 i międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 92-19759).

Bardziej szczegółowo, sekwencję DNA przeznaczoną do ligacji CDR przeciwciała mysiego z regionem zrębowym (FR) przeciwciała ludzkiego syntetyzuje się z kilku podzielonych oIigonukleotydów, których części zachodzą na siebie nawzajem na końcach. Tak wytworzony DNA poddaje się ligacji i z DNA kodującym region C przeciwciała ludzkiego i następnie włącza do wektora ekspresyjnego, który wprowadza się do organizmu gospodarza celem wytwarzania przeciwciał (zob. europejskie zgłoszenie patentowe EP 239400 i międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 92-19759).

Do FR przeciwciała ludzkiego poddanego ligacji przez CDR dobiera się CDR o dogodnym miejscu wiązania antygenu. Jeżeli jest to pożądane, aminokwasy w FR regionu V przeciwciała można podstawić tak, aby CDR przeciwciała humanizowanego mogło tworzyć odpowiednie miejsce wiązania antygenu (Sato, K. i wsp., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Jako region C przeciwciała ludzkiego można stosować na przykład Cy1 Cy2, Cy3 lub Cy4. Region C przeciwciała ludzkiego można również modyfikować w celu ulepszenia stabilności przeciwciała i jego wytwarzania.

Przeciwciało chimerowe składa się z regionu V przeciwciała pochodzenia ludzkiego innego niż ludzkie i regionu C przeciwciała ludzkiego, a przeciwciało humanizowane składa się z regionu determinującego dopasowanie przeciwciała pochodzenia ludzkiego, innego niż ludzkie, i regionu zrębowego oraz regionu C przeciwciała ludzkiego, przy czym ich antygenowość w organizmie człowieka jest zmniejszona, tak więc są one zalecane do zastosowania jako przeciwciała do zastosowania tu opisanego.

Jako korzystne wykonania przeciwciał humanizowanych do zastosowania tu opisanego można wymienić humanizowane przeciwciało PM-1 (zob. międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO

92-19759).

Jako sposób wytwarzania przeciwciał ludzkich, oprócz sposobów opisanych powyżej, znany jest sposób uzyskiwania przeciwciała ludzkiego za pomocą panningu. Na przykład region zmienny przeciwciała ludzkiego poddaje się ekspresji na powierzchni faga metodą prezentacji na fagach (phage display method) jako przeciwciało jednołańcuchowe (scFv) celem wyselekcjonowania faga wiążącego się z antygenem. Analizując gen wybranego faga można zidentyfikować sekwencję DNA kodującą region zmienny przeciwciała ludzkiego wiążącego się z antygenem. Po znalezieniu sekwencji DNA scFv wiążącego się z antygenem sekwencję tę można wykorzystać do wytworzenia odpowiedniego wektora ekspresyjnego i wytworzenia przeciwciała ludzkiego. Sposoby te są już znane i można je znaleźć w publikacjach WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 i WO 95/15388.

Geny przeciwciał wytworzone w sposób opisany powyżej mogą ulegać ekspresji i można je wytwarzać w znany sposób. W przypadku komórek ssaków ekspresja może zachodzić przy użyciu DNA, w którym powszechnie stosowany zalecany promotor, gen przeciwciała, które ma ulegać ekspresji oraz sygnał poli A łączy się w sposób umożliwiający działanie w stronę końca 3' lub stosując wektor je zawierający. Jako promotor/wzmacniacz można wymienić na przykład bezpośredni wczesny promotor/wzmacniacz cytomegalowirusa człowieka.

PL 216 534 B1

Dodatkowo, jako promotor/wzmacniacz, który można wykorzystać do ekspresji przeciwciała, które ma być stosowane według niniejszego wynalazku, można wykorzystać wirusowe promotory/wzmacniacze, takie jak: retrowirusy, wirusy poliomy, adenowirusy i wirus małpi 40 (SV40) oraz promotory/wzmacniacze pochodzące z komórek ssaczych, takie jak ludzki czynnik elongacyjny 1 a (HEF1 a).

Ekspresję można na przykład łatwo przeprowadzić sposobem opisanym przez Mulligana i wsp. (Mulligan, R. C. i wsp., Nature (1979) 277, 108-114) przy wykorzystaniu promotora/wzmacniacza SV40 oraz sposobem Mizushimy S. i wsp. (Mizushima, S. i Nagata, S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) przy wykorzystaniu promotora/wzmacniacza HEF1 a.

W przypadku E. coli ekspresję można przeprowadzić poprzez połączenie w sposób umożliwiający działanie powszechnie stosowanego promotora sekwencji sygnałowej służącej wydzielaniu przeciwciała i genu przeciwciała, który ma ulegać ekspresji, a następnie poprzez przeprowadzenie ich ekspresji. Jako promotor można na przykład wymienić promotor IacZ i promotor araB. Przy stosowaniu promotora IacZ można wykorzystać sposób opisany przez Warda i wsp. (Ward, E.S. i wsp., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E.S. i wsp., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), a przy stosowaniu promotora araB można wykorzystać sposób opisany przez Bettera i wsp. (Better, M. i wsp., Science (1988) 240, 1041-1043).

Jako sekwencję sygnałową do wydzielania przeciwciała przy wytwarzaniu go w peryplazmie E. coli można zastosować sekwencję sygnałową pelB (Lei, S.P. i wsp., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383). Po wydzieleniu przeciwciała wytworzonego w peryplazmie, a przed zastosowaniem, dokonuje się odtworzenia struktury przeciwciała (zob. np. WO 96-30394).

Początek replikacji może pochodzić z SV40 wirusa polioma, adenowirusa, bydlęcego wirusa brodawczaka (BPV) itp. Ponadto, do wektorów ekspresji wykorzystywanych do powielenia pewnej liczby kopii genów w układzie komórkowych organizmu gospodarza należą, jako markery podlegające selekcji, gen transferazy aminoglikozydowej (APH), gen kinazy tymidynowej (TK), gen transferazy guaninofosforybozyloksantyny E. coli (Ecogpt), gen reduktazy dihydrofolanu (dhfr) itp.

Do wytwarzania przeciwciała do zastosowania tu opisanego można wykorzystać dowolny system wytwarzania; systemy wytwarzania stosowane przy preparatyce przeciwciał obejmują systemy wytwarzania in vitro i in vivo. W odniesieniu do systemu wytwarzania in vitro można wymienić systemy wytwarzania wykorzystujące komórki eukariotyczne i systemy wytwarzania wykorzystujące komórki prokariotyczne.

W odniesieniu do komórek eukariotycznych w systemach wytwarzania można wykorzystywać komórki zwierzęce, roślinne i komórki grzybów. Do znanych komórek zwierzęcych należą: (1) komórki ssaków, takie jak: komórki CHO, COS, komórki szpiczaka, komórki nerek noworodków chomiczych (BHK), komórki HeLa i komórki Vero, (2) komórki płazów, takie jak oocyty Xenopus, albo (3) komórki owadów takie jak sf9, sf21 i Tn5. Do znanych komórek roślinnych należą np. komórki pochodzące z Nicotiana tabacum hodowane na kallusie. Do znanych komórek grzybów należą komórki drożdży, np. z rodzaju Saccharomyces, bardziej szczegółowo Saccharomyces cerevisiae lub grzyby nitkowate, takie jak Aspergillus, a dokładnie Aspergillus niger.

W odniesieniu do komórek prokariotycznych w systemach wytwarzania wykorzystuje się komórki bakteryjne. Do znanych komórek bakteryjnych należą komórki Escherichia coli i Bacillus subtilis.

Poprzez wprowadzenie przez transformację genu pożądanego przeciwciała do tych komórek i hodowanie transformowanych komórek in vitro można wytworzyć przeciwciało. Hodowlę prowadzi się znanymi sposobami. Na przykład jako ciecz do hodowli komórek ssaczych można stosować pożywki DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM itp., jak również można do tych cieczy dodawać suplementy surowicy, takie jak płodowa surowica cielęca (FCS), w połączeniu. Ponadto przeciwciała można wytwarzać in vivo poprzez wszczepianie komórek do jamy brzusznej zwierzęcia, i tym podobne.

Jako systemy wytwarzania in vivo można wymienić systemy wykorzystujące zwierzęta i systemy wykorzystujące rośliny. Jeżeli chodzi o wykorzystanie zwierząt, można wymienić systemy wytwarzania z wykorzystaniem ssaków i z wykorzystaniem owadów.

Jako ssaki można wykorzystywać kozy, świnie, owce, myszy i bydło (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Jako owady można również wykorzystywać jedwabniki, natomiast jako rośliny - na przykład tytoń.

Geny przeciwciał wprowadza się do tych zwierząt i roślin, w których geny są wytwarzane i w których są następnie zbierane. Na przykład geny przeciwciał wprowadza się do środka genu kodującego białko, które jest zwykle wytwarzane w mleku, takie jak na przykład kozia kazeina β, w celu

PL 216 534 B1 wytworzenia genów fuzyjnych. Fragmenty DNA zawierające gen fuzyjny, do którego wprowadzono gen przeciwciała wstrzykuje się zarodkom kozim, a następnie zarodki wprowadza się do organizmu samicy kozy. Pożądane przeciwciało uzyskuje się z mleka wytwarzanego przez transgeniczną kozę, to znaczy kozę, której wszczepiono zarodek lub jego potomstwo. W celu zwiększenia ilości mleka zawierającego pożądane przeciwciało, wytwarzanego przez transgeniczną kozę, można ewentualnie transgenicznej kozie podawać hormony (Ebert, K.M. i wsp., Bio/TechnoIogy (1994) 12, 699-702).

Przy stosowaniu jedwabników, jedwabnika zakaża się bakulowirusem, do którego wprowadzono pożądany gen przeciwciała, i pożądane przeciwciało można wytwarzać z płynów ustrojowych jedwabnika (Maeda, S. i wsp., Nature (1985) 315, 592-594). Ponadto, przy stosowaniu tytoniu pożądany gen przeciwciała wprowadza się do wektora ekspresyjnego dla roślin, na przykład pMON 530, po czym wektor wprowadza się do bakterii, na przykład Agrobacterium tumefaciens. Następnie bakterię wykorzystuje się do zakażenia tytoniu, na przykład Nicotiana tabacum, celem wytworzenia z liści tytoniu pożądanego przeciwciała (Julian, K.C. Ma i wsp., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Przy wytwarzaniu przeciwciała w systemach produkcji in vitro lub in vivo, jak to wspomniano powyżej, DNA kodujące łańcuch ciężki (łańcuch H) lub łańcuch lekki (łańcuch L) przeciwciała wprowadza się oddzielnie do wektora ekspresji i organizmy gospodarzy transformuje się jednocześnie lub też DNA kodujące łańcuch H i łańcuch L przeciwciała wprowadza się do pojedynczego wektora ekspresyjnego, którym transformuje się organizm gospodarza (zob. międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 94-11523).

Przeciwciała do zastosowania tu opisanego mogą być fragmentami przeciwciał lub ich zmodyfikowanymi wersjami, pod warunkiem, że są odpowiednie do stosowania w niniejszym wynalazku. Na przykład jako fragmenty przeciwciał można wspomnieć Fab, F(ab')2, Fv lub jednołańcuchowy Fv (scFv), w którym fragmenty Fv łańcucha H i łańcucha L połączono odpowiednim łącznikiem.

Bardziej szczegółowo, przeciwciała traktuje się enzymem, na przykład papainą lub pepsyną, w celu uzyskania fragmentów przeciwciał lub wytwarza się geny kodujące te fragmenty przeciwciał, po czym wprowadza się je do wektora ekspresyjnego, który ulega ekspresji w odpowiedniej komórce gospodarza (zob. na przykład Co, M.S. i wsp., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. i Horwitz, A.H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Plucktrun, A. i Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. i wsp., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. i wsp., TI BTECH (1991) 9, 132-137).

scFv można wytwarzać poprzez połączenie regionu V łańcucha H i regionu V łańcucha L przeciwciała. W scFv region V łańcucha H i region V łańcucha L łączy się, dogodnie, za pośrednictwem łącznika, dogodnie łącznika peptydowego (Huston, J.S. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). Region V łańcucha H i region V łańcucha L w scFv mogą pochodzić z dowolnego z wyżej wymienionych przeciwciał. Jako łącznik peptydowy do połączenia regionów V można wykorzystać dowolny peptyd jednołańcuchowy zawierający na przykład 12-19 reszt aminokwasowych.

DNA kodujący scFv można wytwarzać stosując DNA kodujący łańcuch H lub region V łańcucha H wyżej wymienionego przeciwciała oraz DNA kodujące łańcuch L lub region V łańcucha L wyżej wymienionego przeciwciała jako matrycę, poprzez powielenie części DNA kodującej pożądaną sekwencję aminokwasową, spośród wyżej wspomnianych sekwencji, metodą PCR, przy czym para starterów jest swoista dla obu końców, i następnie poprzez powielenie kombinacji DNA kodującej część łącznikową peptydu i pary starterowej, definiującej to, że oba końce tego DNA mają być połączone, odpowiednio, z łańcuchem H i łańcuchem L.

Po wytworzeniu odcinków DNA kodujących scFv można konwencjonalnymi sposobami wytworzyć wektor ekspresyjny je zawierający oraz organizm gospodarza transformowany tym wektorem ekspresyjnym; można również konwencjonalnym sposobem wytworzyć scFv wykorzystując uzyskany organizm gospodarza.

Te fragmenty przeciwciał można wytwarzać poprzez wytworzenie ich genu w sposób podobny do opisanego powyżej i poprzez umożliwienie ich ekspresji w organizmie gospodarza. „Przeciwciało w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje takie zmodyfikowane przeciwciała. Jako przeciwciała modyfikowane można wykorzystywać przeciwciała związane z różnymi cząsteczkami, np. glikolem polietylenowym (PEG). „Przeciwciało w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje takie zmodyfikowane przeciwciała. Takie zmodyfikowane przeciwciała można wytwarzać poprzez chemiczną modyfikację tak wytworzonych przeciwciał. Sposoby te znane są już ze stanu techniki.

Przeciwciała, które uległy ekspresji i zostały wytworzone w sposób opisany powyżej, można oddzielać od wnętrza lub zewnętrznej części komórki lub organizmu gospodarza, i następnie oczyszczać

PL 216 534 B1 aż do uzyskania jednorodności. Rozdzielenia i oczyszczenia przeciwciał do zastosowania tu opisanego można dokonać wykorzystując chromatografię powinowactwa. Spośród kolumn stosowanych do chromatografii powinowactwa można wymienić kolumnę z białkiem A i kolumnę z białkiem G. Przykłady nośników, które można wykorzystać do kolumny z białkiem A to na przykład: Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia) i tym podobne. Ponadto można bez ograniczeń stosować powszechnie znane sposoby rozdzielania i oczyszczania białek.

Można wybrać chromatografię inną niż wspomniana chromatografia powinowactwa, i dobrać filtry, filtrację żelową, wysalanie, dializę i tym podobne i odpowiednio łączyć te sposoby, w celu rozdzielenia i oczyszczenia przeciwciał, które mają być stosowane według niniejszego wynalazku. Do metod chromatograficznych należą na przykład chromatografia jonowymienna, chromatografia hydrofobowa, filtracja żelowa i tym podobne. Te sposoby chromatografii można wykorzystać w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Można również zastosować HPLC z odwróconymi fazami (rpHPLC).

Stężenie przeciwciał wytworzonych w powyższy sposób można określić poprzez pomiar absorbancji lub metoda. ELISA i tym podobnie. I tak, przy wykorzystaniu pomiaru absorbancji, wytworzone przeciwciało odpowiednio rozcieńcza się PBS(-), po czym mierzy się absorbancję przy 280 nm, i dokonuje obliczeń stosując współczynnik absorpcji 1,35 OD przy 1 mg/ml. Przy wykorzystaniu metody ELISA pomiary przeprowadza się w następujący sposób: na 96-studzienkową płytkę (produkcji firmy Nunc) nakłada się 100 μl koziego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiej IgG (produkcji firmy TAGO) rozcieńczonej do 1 ąg/ml w 0,1 M buforze dwuwęglanowym, pH 9,6, i inkubuje się przez noc w temperaturze 4°C, w celu unieruchomienia przeciwciała. Po blokowaniu dodaje się po 100 μl odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała wykorzystywanego w niniejszym wynalazku lub próbek zawierających przeciwciało lub ludzką IgG (produkcji firmy CAPPEL) jako wzorzec, i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

Po płukaniu dodaje się 100 μl rozcieńczonego 5000 razy, wyznakowanego fosfatazą zasadową przeciwciała skierowanego przeciwko IgG ludzkiej (produkcji firmy BIO SOURCE) i całość inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po płukaniu dodaje się roztwór substratu i całość inkubuje, po czym mierzy się absorbancję przy 405 nm, stosując urządzenie MICROPLATE READER, model 3550 (produkcji firmy Bio-Rad) celem obliczenia stężenia pożądanego przeciwciała.

IL-6 o zmodyfikowanym kształcie, wykorzystywane w niniejszym wynalazku, jest substancją wykazującą właściwość wiązania się z receptorem IL-6, bez aktywności biologicznej IL-6. Tak więc, jakkolwiek IL-6 o zmodyfikowanym kształcie współzawodniczy z IL-6 o wiązanie z receptorem IL-6, nie wykazuje ono aktywności biologicznej IL-6, tak więc IL-6 o zmodyfikowanym kształcie blokuje przekazywanie sygnałów przez IL-6.

IL-6 o zmodyfikowanym kształcie można wytwarzać poprzez wprowadzanie mutacji na drodze zastępowania reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej IL-6. IL-6, z którego wytwarza się IL-6 o zmodyfikowanym kształcie może być dowolnego pochodzenia, jednak ze względu na antygenowość itd. dogodnie jest to IL-6 ludzka.

Bardziej szczegółowo można oszacować strukturę drugorzędową sekwencji aminokwasowej IL-6 znanym programem modelowania molekularnego, takim jak WHATIF (Vriend i wsp., J. Mol. Graphics (11990) 8, 52-56) i można ocenić jej wpływ na całość zastępowanych reszt aminokwasowych. Po ustaleniu odpowiednich reszt aminokwasowych można wprowadzać mutację, stosując wektor zawierający sekwencję zasad kodującą ludzki gen IL-6 jako matrycę, w powszechnie stosowanej metodzie PCR tak, aby zastąpić aminokwasy i w ten sposób wytworzyć gen kodujący IL-6 o zmodyfikowanym kształcie. Można ten gen wprowadzać, w miarę potrzeby, do odpowiedniego wektora ekspresyjnego celem wytworzenia IL-6 o zmodyfikowanym kształcie, zgodnie z wyżej wymienionymi sposobami ekspresji, wytwarzania i oczyszczania przeciwciał rekombinowanych.

Swoiste przykłady IL-6 o zmodyfikowanym kształcie ujawnili Brakenhoff i wsp., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, Saviono i wsp., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648 i WO 96-17869.

Peptydy częściowe IL-6 lub peptydy częściowe receptora IL-6, do zastosowania tu opisanego, są substancjami wykazującymi aktywność wiązania, odpowiednio, z receptorem IL-6 lub z IL-6, które jednak nie wykazują aktywności biologicznej IL-6. Tak więc, peptydy częściowe IL-6 lub peptydy częściowe receptora IL-6 wiążą się, odpowiednio, z receptorem IL-6 lub z IL-6 i wychwytują je, przez co swoiście hamują wiązanie IL-6 z receptorem IL-6. W wyniku tego nie umożliwiają rozprzestrzeniania aktywności biologicznej IL-6, przez co blokują przekazywanie sygnałów przez IL-6.

Peptydami częściowymi IL-6 lub peptydami częściowymi receptora IL-6 są peptydy zawierające część lub całość sekwencji aminokwasowej biorącej udział w wiązaniu IL-6 i receptora IL-6 w sek14

PL 216 534 B1 wencjach aminokwasowych IL-6 lub receptora IL-6. Peptydy takie składają się zwykle z 10-80 reszt aminokwasowych, dogodnie z 20-50 reszt aminokwasowych, a zwłaszcza z 20-40 reszt aminokwasowych.

Peptydy częściowe IL-6 lub peptydy częściowe receptora IL-6 zawierają swoiste regiony uczestniczące w wiązaniu IL-6 i receptora IL-6 w sekwencji aminokwasowej IL-6 lub receptora IL-6 i część lub całość sekwencji aminokwasowej można wytwarzać powszechnie znanymi sposobami, takimi jak technika inżynierii genetycznej lub syntezy peptydów.

W celu wytworzenia peptydów częściowych IL-6 lub peptydów częściowych receptora IL-6 na drodze inżynierii genetycznej sekwencję DNA kodującą pożądany peptyd wprowadza się do wektora ekspresyjnego tak, aby wytworzyć IL-6 lub receptor IL-6, wyżej wymienionymi sposobami ekspresji, wytwarzania i oczyszczania przeciwciał rekombinowanych.

W celu wytworzenia peptydów częściowych IL-6 lub peptydów częściowych receptora IL-6 na drodze syntezy peptydów wykorzystuje się powszechnie znane sposoby syntezy peptydów, takie jak synteza fazy stałej lub synteza fazy ciekłej.

Bardziej szczegółowo można wykorzystać sposoby opisane w „Zoku Iyakuhinno Kaihatsu, tom 14: Peptide Synthesis, pod red. Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991. Jako syntezę fazy stałej można wykorzystać sposób, w którym aminokwas odpowiadający końcowi C peptydu, który ma być syntetyzowany, wiąże się z podłożem nierozpuszczalnym w rozpuszczalnikach organicznych, po czym prowadzi się reakcję, w której aminokwasy, których grupę α-aminową i grupę funkcyjną łańcucha bocznego zabezpieczono odpowiednimi grupami zabezpieczającymi, kondensuje się pojedynczo, w kierunku od końca C do końca N i reakcję, w której z produktu eliminuje się grupę zabezpieczającą grupy α-aminowej aminokwasu lub peptydu związanego z żywicą; reakcje te powtarza się na przemian, celem wydłużenia łańcucha peptydowego. Syntezę peptydu w fazie stałej dzieli się z grubsza na metodę Boc i metodę Fmoc w zależności od typu stosowanych grup zabezpieczających.

Po wytworzeniu w ten sposób pożądanego peptydu można przeprowadzić reakcję odłączenia grup zabezpieczających lub reakcję odszczepienia łańcucha peptydowego od podłoża. W reakcji rozszczepienia łańcuchów peptydowych, w metodzie Boc wykorzystuje się fluorowodorek lub kwas trifluorometanosulfonowy, a w metodzie Fmoc zwykle wykorzystuje się TFA. W metodzie Boc wymienioną żywicę z zabezpieczonymi peptydami traktuje się w obecności anizolu we fluorowodorku. Następnie można przeprowadzić eliminację grupy zabezpieczającej i odszczepienie od podłoża, w celu zebrania peptydu. Po liofilizacji uzyskuje się nieoczyszczony peptyd. Z drugiej strony w metodzie Fmoc, można przeprowadzić reakcję odbezpieczenia i reakcję odszczepienia łańcucha peptydowego od podłoża, w sposób podobny do opisanego powyżej.

Wytworzony, nieoczyszczony peptyd można poddać HPLC, celem rozdzielenia i oczyszczenia. Do elucji można zastosować, w optymalnych warunkach, rozpuszczalnik wodnoacetonitrylowy, powszechnie stosowany do oczyszczania białek. Zbiera się, a następnie liofilizuje frakcje odpowiadające maksimom profilu chromatograficznego. Oczyszczone w ten sposób frakcje peptydów poddaje się, celem ich zidentyfikowania, analizie masy cząsteczkowej za pomocą spektroskopii masowej, analizie składu aminokwasowego lub analizie sekwencji aminokwasowej.

Konkretne przykłady peptydów częściowych IL-6 i peptydów częściowych receptora IL-6 opisano w japońskiej niepoddanej badaniu publikacji patentowej (Kokai) nr 2-188600, japońskiej niepoddanej badaniu publikacji patentowej (Kokai) nr 7-324097, japońskiej niepoddanej badaniu publikacji patentowej (Kokai) nr 8-311098 i w publikacji patentowej Stanów Zjednoczonych US 5210075.

Aktywność hamującą przekazywanie sygnałów IL-6 przez antagonistę IL-6 według niniejszego wynalazku można oceniać powszechnie znanym sposobem. Bardziej szczegółowo, hoduje się ludzką linię komórek szpiczaka zależnych od IL-6 (S6B45, KPMM2), ludzką linię chłoniaka z limfocytów T

Lennert KT3 lub IL-6 zależne komórki HN60. Komórki BSF2 hoduje się, dodaje się IL-6 i w tym samym ₃ czasie, w obecności antagonisty IL-6, oznacza się włączanie tymidyny wyznakowanej ³H przez komórki zależne od IL-6. Zamiast tego, w tym samym czasie można dodawać IL-6 i antagonistę IL-6 125 125 wyznakowane ¹²⁵I, po czym celem oceny oznacza się IL-6 wyznakowane ¹²⁵I, wiążące się z komórkami wykazującymi ekspresję IL-6. W tym systemie testowym oprócz grupy, w której obecny jest antagonista IL-6 ustanawia się grupę kontroli ujemnej, nie zawierającą antagonisty IL-6 i uzyskane wyniki porównuje się, celem oceny aktywności hamowania IL-6 przez antagonistę IL-6.

Jak to ukazano w poniższych przykładach, ponieważ przy podawaniu receptora przeciwko IL-6 dzieciom cierpiącym na przewlekłe zapalenie stawów obserwowano efekty terapeutyczne, wykazano,

PL 216 534 B1 że antagoniści IL-6, na przykład przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6, wykazują efekt terapeutyczny w przewlekłych zapaleniach stawów w przebiegu chorób wieku dziecięcego.

Osobnikami, które mogą być leczone jak tu opisano, są ssaki. Zalecanymi leczonymi ssakami są ludzie.

Środki terapeutyczne według wynalazku do leczenia przewlekłych zapaleń stawów w przebiegu chorób wieku dziecięcego można podawać doustnie lub pozajelitowo, ogólnoustrojowo lub miejscowo. Można, na przykład, zdecydować się na wstrzyknięcia dożylne, np. we wlewie ciągłym, wstrzyknięcia domięśniowe, dootrzewnowe, podskórne, zastosowanie czopków, wlewek, tabletek doustnych w powłoce dojelitowej i tym podobne, natomiast schemat dawkowania można odpowiednio dobrać w zależności od wieku i stanu pacjenta. Skuteczną dawkę wybiera się z zakresu od 0,01 mg do 100 mg na kg masy ciała na jedną dawkę. Zamiast tego, można zdecydować się na dawkę od 1 do 1000 mg, dogodnie od 5 do 50 mg na pacjenta.

Zalecaną dawką i sposobem podawania jest, na przykład, w przypadku przeciwciała przeciwko receptorowi IL-6 dawka skuteczna, zapewniająca obecność wolnych przeciwciał we krwi, bardziej szczegółowo od 0,5 mg do 40 mg, dogodnie od 1 mg do 20 mg na 1 kg masy ciała miesięcznie (na 4 tygodnie), przy czym dawkę podaje się jednorazowo lub w dawkach podzielonych na kilka części, podawanych na przykład 2 razy w tygodniu, raz w tygodniu, raz na 2 tygodnie, raz na 4 tygodnie itd., na przykład dożylnie we wlewie kroplowym lub podskórnie. Schemat podawania można zmodyfikować poprzez wydłużenie odstępów między dawkami z 2 razy w tygodniu lub raz w tygodniu na jeden raz na 2 tygodnie, raz na 3 tygodnie, raz na 4 tygodnie itd., w zależności od obserwowanych objawów i profilu badań krwi.

Środki terapeutyczne według wynalazku i do leczenia przewlekłych zapaleń stawów w przebiegu chorób wieku dziecięcego mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne nośniki i środki dodatkowe, w zależności od drogi podawania. Przykładowymi takimi nośnikami lub środkami dodatkowymi są woda, farmaceutycznie dopuszczalny rozpuszczalnik organiczny, kolagen, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon, polimer karboksywinylowy, sól sodowa karboksymetylocelulozy, sól sodowa poIiakrylowa, alginian sodowy, dekstran rozpuszczalny w wodzie, sól sodowa skrobi karboksymetylowej, pektyna, metyloceluloza, etyloceluloza, żywica ksantanowa, guma arabska, kazeina, żelatyna, agar, digliceryna, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, wazelina, parafina, alkohol stearylowy, kwas stearynowy, albumina surowicy ludzkiej (HSA), mannit, sorbit, laktoza, farmaceutycznie dopuszczalne środki powierzchniowo czynne i tym podobne. Środki dodatkowe dobiera się spośród powyższych środków lub ich połączeń, jednak bez ograniczenia, i uzależnia od postaci dawkowania.

P r z y k ł a d y

Niniejszy wynalazek zostanie objaśniony bardziej szczegółowo poniżej, w odniesieniu do przykładów roboczych i przykładów referencyjnych, należy jednak zauważyć, że niniejszy wynalazek nie jest w żaden sposób ograniczony tymi przykładami.

P r z y k ł a d r o b o c z y 1

Pacjentowi (chłopcu w wieku 5 lat) z młodzieńczym reumatoidalnym zapaleniem stawów, o początku ogólnoukładowym, z następującą historią choroby, podano leczenie MRA (humanizowanym przeciwciałem skierowanym przeciwko receptorowi IL-6).

Historia choroby

Objawy rozpoczęły się od gorączki spoczynkowej (gorączk a z jednym pikiem, około 40°C przez kolejne dni), bólów stawów obu kolan i uogólnionej wysypki. Po rozpoznaniu choroby na podstawie leukocytozy, nieobecności przeciwciał przeciwjądrowych, nieobecności czynnika reumatoidalnego, podwyższenia OB, podwyższenia poziomu CRP itd., rozpoczęto podawanie aspiryny, jednak nie uzyskano poprawy w zakresie gorączki spoczynkowej i bólów stawów, a ogólny stan chorego pogorszył się. Leczenie zmieniono więc na doustne podawanie w jednej dużej dawce steroidów (prednizolon w dawce 30 mg dziennie) i uzyskano poprawę poszczególnych objawów. Jednak, przy stopniowym zmniejszaniu dawki prednizolonu objawy nawróciły przy dawce 10 mg dziennie, pacjenta ponownie hospitalizowano, podano mu metyloprednizolonową (mPSL) terapię pulsacyjną i wykonano u niego plazmaferezę, a następnie dodano do leczenia cyklosporynę A (CsA), nie uzyskując poprawy. Objawy były ciężkie (leukocytoza 25400/μΙ, CRP 11,2 mg/dl); przeprowadzono plazmaferezę + terapię pulsacyjną mPSL + CsA i chory wszedł w remisję. Po leczeniu podawano prednizolon + froben, w celu opanowania gorączki spoczynkowej, i klinicznie zaobserwowano zmniejszenie gorączki, jednak wyniki testów parametrów zapalnych we krwi pozostawały na wysokim poziomie (CRP > 5 mg/dl) i po wypisaniu ze szpitala okresowo obserwowano gorączkę spoczynkową, jednak leczenie i obserwację pro16

PL 216 534 B1 wadzono głównie ambulatoryjnie. Jednak pacjent zaczął uskarżać się na bóle grzbietu, nasilane przez gorączkę i po dokładnym badaniu z zastosowaniem MBI itd., stwierdzono zmiany destrukcyjne w 4 i 5 kręgu piersiowym, sugerujące obecność złamania kompresyjnego. Ze względu na konieczność odciążenia kręgów piersiowych, kontynuowano przebywanie pacjenta w łóżku przez około 1 rok i doszło do znacznego osłabienia mięśni kończyn dolnych, co całkowicie uniemożliwiło pacjentowi chodzenie. Kontynuowano potrójną terapię prednizolon + froben + CsA, jednak wartości CRP nigdy nie spadały poniżej 5 mg/dl.

Wynik leczenia

Podawanie leku rozpoczęto od dawki 2 mg/kg. Ze względu na to, że nie obserwowano działań niepożądanych, dawkę zwiększono do 4 mg/kg, podawanych raz w tygodniu. Doszło do szybkiego ustąpienia gorączki; około 2 tygodnie później wynik CRP był ujemny. Ustąpiło ogólne uczucie zmęczenia i stan pacjenta nieco poprawił się. Możliwe było stopniowe zmniejszenie dawek prednizolonu i dawki te zmniejszono do 1 mg dziennie.

Na podstawie tych wyników stwierdzono, że MRA wykazuje skuteczność w leczeniu przewlekłych zapaleń stawów wieku dziecięcego, w których niemożliwe jest opanowanie objawów nawet niesteroidowymi lekami przeciwzapalnymi, takimi jak aspiryna i froben, długotrwałym podawaniem steroidów w pojedynczych dużych dawkach (np. predniny i medrolu) i podawaniem środków immunosupresyjnych, takich jak cyklosporyna A i metotreksat. Można zatem stwierdzić, że antagonista IL-6, zwłaszcza przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6, jest skuteczny jako środek terapeutyczny w przewlekłych zapaleniach stawów wieku dziecięcego, zwłaszcza w typach o początku ogólnoukładowym według klasyfikacji ARA, w typach o początku ogólnoukładowym według klasyfikacji EULAR, w typach o początku ogólnoukładowym według klasyfikacji ILAR i zespole SPRASH w klasyfikacji twórców niniejszego wynalazku.

P r z y k ł a d r o b o c z y 2

Kobieta w wieku 22 lat. W kwietniu 1998 roku wystąpił rumień o typie erythema punctatum na kości udowej, okolicy przedsercowej i na palcach rąk; w maju dołączyły się bóle stawu barkowego, łokcia i kolana oraz gorączka od 38 do 39°C. Rozpoczęto podawanie niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), jednak gorączka utrzymywała się; w lipcu przy leukocytozie 18100/μΗ CRP 18,3 mg/dl i poziomie ferrytyny w surowicy 440 ng/ml u chorej rozpoznano chorobę Stilla dorosłych. Od początku stycznia 2000 roku pojawiła się gorączka od 39 do 40°C i bóle stawów, co uznano za nawrót choroby Stilla wieku dorosłego (CRP 15,8 mg/dl, poziom ferrytyny - 205,8 ng/ml).

Ponieważ trudne było zmniejszenie dawki steroidów, do leczenia dołączono metotreksat (MTX) i cyklosporynę A (CsA), jednak nie pozwoliło to opanować postępu choroby; doszło do pogorszenia oddychania i konieczne było rozpoczęcie u chorej sztucznej wentylacji. Podawanie steroidów poprawiło nieco stan chorej; ze względu na powikłanie - ciężką osteoporozę - u chorej rozpoczęto leczenie humanizowanym przeciwciałem przeciwko receptorowi IL-6 (MRA). MRA (200 mg) podawano dożylnie we wlewie kroplowym co 2 tygodnie. Reakcje zapalne stały się ujemne w dniu 6 po rozpoczęciu podawania; bez problemów udało się zmniejszyć dawki kortykosteroidów i nie obserwowano ciężkich działań niepożądanych.

Na podstawie powyższych wyników stwierdzono, że MRA jest skuteczne w leczeniu choroby Stilla wieku dorosłego, w której niemożliwe jest opanowanie objawów, nawet przy zastosowaniu jednocześnie MTX i Cs A. Można zatem powiedzieć, że antagonista IL-6, zwłaszcza przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest skuteczne jako środek terapeutyczny w chorobie Stilla, zwłaszcza w chorobie Stilla wieku dorosłego.

P r z y k ł a d r e f e r e n c y j n y 1

Wytwarzanie ludzkiego, rozpuszczalnego receptora IL-6

Stosując plazmid pBSF2R.236 zawierający cDNA kodujące receptor IL-6 wytworzone metodą Yamasaki i wsp. (Yamasaki i wsp., Science (1988) 241, 825-828), wytworzono metodą PCR rozpuszczalny receptor IL-6. Plazmid pBSF2R.236 strawiono enzymem restrykcyjnym Sph I uzyskując cDNA receptora IL-6, który wprowadzono do mp18 (produkcji firmy Amersham). Za pomocą startera syntetycznego, przeznaczonego do wprowadzania kodonu stop do cDNA receptora IL-6, do cDNA receptora IL-6 wprowadzono mutację metodą PCR w systemie mutagenezy in vitro (produkcji firmy Amersham). W ten sposób w pozycję aminokwasu 345 wprowadzono kodon stop i uzyskano cDNA kodujące rozpuszczalny receptor IL-6.

W celu uzyskania ekspresji rozpuszczalnego receptora IL-6 w komórkach CHO, ten fragment cDNA poddano ligacji z plazmidem pSV (produkcji firmy Pharmacia), celem wytworzenia plazmidu

PL 216 534 B1 pSVL344. cDNA kodujące rozpuszczalny receptor IL-6 poddano trawieniu HindIII-SalI, wprowadzono do plazmidu pECEdhfr, zawierającego cDNA dhfr, w celu wytworzenia komórek CHO wykazujących ekspresję plazmidu pECEdhfr344.

pg plazmidu pECEdhfr344 transfekowano do linii komórek dhfr-CHO DXB-11 (Urlaub, G. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) metodą strącania fosforanu wapnia (Chen, C. i wsp., Mol. Cell. Biol. (1987) 7, 2745-2751). Transfekowane komórki CHO hodowano przez 3 tygodnie w niezawierającej nukleozydów pożywce selekcyjnej aMEM, zawierającej 1 mM glutaminy, 10% dializowanego FCS, 100 U/ml penicyliny i 100 μ/ml streptomycyny.

Wyselekcjonowane komórki CHO poddano przeszukiwaniu, metodą ograniczającego rozcieńczania, celem wytworzenia pojedynczego klonu komórek CHO. Klon komórek CHO powielano z 20 nM - 200 nM metotreksatu w celu zbadania linii 5E27 komórek CHO, produkujących ludzki rozpuszczalny receptor IL-6. Linię komórek CHO 5E27 hodowano w pożywce Dulbecco w modyfikacji Iscov (IMDM, produkcji firmy Gibco) uzupełnionej 5% FBS. Zbierano nadsącz hodowli i metodą ELISA oznaczano stężenie rozpuszczalnego receptora IL-6 w nadsączu z hodowli. Wynik potwierdzał obecność rozpuszczalnego receptora IL-6 w nadsączu z hodowli.

P r z y k ł a d r e f e r e n c y j n y 2. Wytwarzanie przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiemu IL-6

Myszy BALB/c immunizowano 10 pg IL-6 typu tkankowego (Hirano i wsp., Immunol. Lett. (1988) 17, 41) wraz z kompletnym adiuwantem Freunda. Immunizację tę powtarzano co tydzień do momentu, w którym możliwe było wykrycie w surowicy obecności przeciwciała przeciwko IL-6. Komórki immunologiczne usuwano z lokalnych węzłów chłonnych i poddawano fuzji z linią komórek szpiczaka P3U1, stosując glikol polietylenowy 1500. Selekcjonowano hybrydomy sposobem opisanym przez Ci i wsp. (Selective Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco, Stany Zjednoczone, 351, 19080) z wykorzystaniem pożywki hodowlanej HAT, w celu wytworzenia hybrydomy produkującej przeciwciało skierowane przeciwko ludzkiemu IL-6.

Hybrydomę produkującą przeciwciało przeciwko ludzkiej IL-6 poddano testowi wiązania IL-6 w następujący sposób. 96-studzienkową płytkę do mikromiareczkowania (produkcji firmy Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA, Stany Zjednoczone), wykonaną z giętkiego poliwinylu, powlekano przez noc 100 μl koziej IgG skierowanej przeciwko antygenom mysim (10 μ^, produkcji firmy Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA, Stany Zjednoczone) w 0,1 M buforze węglanowo-wodorowęglanowym (pH 9,6) w 4°C. Następnie płytkę traktowano 100 μl PBS zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.

Po przepłukaniu płytki w PBS, do każdej studzienki dodano 100 μl nadsączu z hodowli hybrydomy i całość inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Po wypłukaniu płytki, do każdej studzienki

125 dodano wyznakowane ¹²⁵I IL-6 typu rekombinowanego, do stężenia 2000 cpm/0,5 ng/studzienkę i po płukaniu mierzono radioaktywność w każdej studzience w liczniku gamma (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA, Stany Zjednoczone). Spośród 216 klonów hybrydom 32 dały dodatni wynik w teście wiązania IL-6. Z tych klonów wybrano ostatecznie stabilny klon MH166.BSF2. Przeciwciało MH166 skierowane przeciwko IL-6 wykazywało podtyp IgG1 κ.

Następnie, za pomocą zależnego od IL-6 klonu hybrydomy mysiej MH60.BSF2, badano aktywność neutralizującą przeciwciała MH166 w odniesieniu do wzrostu hybrydomy. Z komórek MH60.BSF2 sporządzono próbki, 1x10⁴/200 pl/ studzienkę, do których dodano próbkę zawierającą przeciwciała MH166 i całość hodowano przez 48 godzin. Po dodaniu 0,5 μCi/studzienkę ³H-Lymidyny (New England Nuclear, Boston, MA, Stany Zjednoczone), hodowlę prowadzono przez kolejne 6 godzin. Komórki umieszczano na papierze z filtrem ze spiekanego szkła, i traktowano automatycznym urządzeniem do zbierania (Labo Mash Science Co., Tokio, Japonia). Jako kontrolę zastosowano królicze przeciwciało przeciwko IL-6.

₃

Stwierdzono, że przeciwciało MH166 hamowało włączanie ³H-tymidyny przez komórki MH60.BSF2, wywołane przez IL-6, w sposób zależny od dawki. Oznacza to, że przeciwciało MH166 neutralizuje aktywność IL-6.

P r z y k ł a d r e f e r e n c y j n y 3. Wytwarzanie przeciwciała przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6

Wytworzono przeciwciało MT18 przeciwko receptorowi IL-6 metodą Hirata i wsp. (Hirata, Y. i wsp., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906) i poddawano je sprzęganiu z aktywowaną CNBr kolumną Sepharose 4B (produkcji firmy Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, Stany Zjednoczone), celem oczyszczenia receptora IL-6 (Yamasaki i wsp., Science (1988) 241, 825-828). Ludzką linię komó18

PL 216 534 B1 rek szpiczaka U266 solubilizowano 1 mM fluorochlorowodorku p-paraaminofenylometanosulfonyIowego (bufor digitoninowy) (produkcji firmy Wako Pure Chemicals), zawierającego 1% digitoniny (produkcji firmy Wako Pure Chemicals), 10 mM trietanoloaminy (pH 7,8) i 0,15 M NaCl i mieszano z przeciwciałem MT18 sprzężonym z paciorkami Sepharose 4B. Następnie paciorki płukano sześciokrotnie w buforze digitoninowym, w celu uzyskania częściowo oczyszczonego receptora IL-6.

Myszy BALB/c immunizowano tym częściowo oczyszczonym receptorem IL-6, wytworzonym z 3x10⁹ komórek U266, 4 razy co 10 dni, po czym standardowym sposobem wytworzono hybrydomę. Aktywność wiązania z receptorem IL-6 badano w następujący sposób w nadsączu hodowli z hy7 35 brydomy ze studzienek, które wykazywały wzrost. 5x10⁷ komórek U266 wyznakowano ³⁵S-metioniną (2,5 mCi) i solubilizowano powyższym buforem digitoninowym. Solubilizowane komórki U266 mieszano z 0,04 ml przeciwciała MT18 sprzężonego z paciorkami Sepharose 4B, a następnie płukano sze35 ściokrotnie w buforze digitoninowym. Wyznakowany ³⁵S-metioniną receptor IL-6 eluowano za pomocą 0,25 ml bufora digitoninowego (pH 3,4), po czym receptor zobojętniano 0,025 ml 1 M Tris, pH 7,4.

0,05 ml nadsączu z hodowli hybrydomy mieszano z 0,01 ml Protein G Sepharose (produkcji firmy Pharmacia). Po płukaniu, Sepharose inkubowano w 0,005 ml roztworu receptora IL-6 wyznakowa35 nego ³⁵S. Substancje uzyskane w wyniku immunoprecypitacji, analizowano metodą SDS-PAGE, w celu analizy nadsączu z hodowli hybrydomy reagującej z receptorem IL-6. W wyniku tego, wybrano klon hybrydomy PM-1 dający wynik pozytywny w tej reakcji. Przeciwciało wytwarzane przez hybrydomę PM-1 wykazywało podtyp IgGlK.

Aktywność przeciwciała wytworzonego przez hybrydomę PM-1, w zakresie hamowania wiązania IL-6 z receptorem IL-6 oceniano stosując ludzką linię szpiczaka U266. Z E. coli wytwarzano ludz125 kie, rekombinowane IL-6 (Hirano i wsp., Immunol Lett. (1988) 17, 41-45), po czym znakowano je ¹²⁵I, stosując odczynnik Boltona-Huntera (New England Nuclear, Boston, MA, Stany Zjednoczone) (Taga i wsp., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981).

₅

4x10⁵ komórek U266 hodowano z nadsączem z hodowli 70% (objętościowo) hybrydomy PM-1 125 i 14000 CPM wyznakowanego I IL-6 przez 1 godzinę. Na 300 μΐ FCS w 400 μΐ polietylenowej probówce do mikrowirowania, nakładano warstwami 70 μl próbki, po czym całość odwirowywano i mierzono radioaktywność komórek.

Stwierdzono, że przeciwciało wytwarzane przez hybrydomę PM-1 hamuje wiązanie IL-6 z receptorem IL-6.

P r z y k ł a d r e f e r e n c y j n y 4. Wytwarzanie przeciwciała skierowanego przeciwko mysiemu receptorowi IL-6

Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 wytworzono sposobem Saito, T. i wsp., J. Immunol. (1991) 147, 168-173.

Komórki CHO, produkujące rozpuszczalny mysi receptor IL-6, hodowano w pożywce hodowlanej IMDM uzupełnionej 10% FCS. Z nadsączu hodowli oczyszczano rozpuszczalny mysi receptor IL-6, stosując kolumnę powinowactwa, w której przeciwciało RS-12 przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 (zob. Saito, T. i wsp. jw.) unieruchamiano na żelu Affigel 10 (produkcji firmy Biorad).

ąg tak wytworzonego, rozpuszczalnego, mysiego receptora IL-6 mieszano z kompletnym adiuwantem Freunda, który wstrzykiwano dootrzewnowo szczurom szczepu Wistar. 2 tygodnie później szczury immunizowano (dawka przypominająca) niekompletnym adiuwantem Freunda. W dniu 45 szczurom usuwano komórki śledziony i 2x10⁸ tych komórek poddawano fuzji komórkowej z 1x10⁷ komórek szpiczaka mysiego P3U1, z dodatkiem 50% PEG 1500 (produkcji firmy Boehringer Mannheim), standardową metodą, po czym hybrydomę poddawano przeszukiwaniu z użyciem pożywki HAT.

Po dodaniu nadsączu hodowli do płytki pokrytej króliczym przeciwciałem skierowanym przeciwko szczurzej IgG (produkcji firmy Cappel), do reakcji dodano rozpuszczalny mysi receptor IL-6. Następnie, stosując metodę ELISA z wykorzystaniem przeciwciała króliczego skierowanego przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 i wyznakowanej fosfatazą zasadową owczej IgG skierowanej przeciwko antygenom króliczym, dokonano przeszukiwania w kierunku hybrydom produkujących przeciwciała przeciwko rozpuszczalnemu mysiemu receptorowi IL-6. Klony hybrydom, dla których potwierdzono produkcję przeciwciał, poddawano dwukrotnie następnemu etapowi przeszukiwania, w celu uzyskania jednego klonu hybrydomy. Klon ten oznaczono jako MR16-1.

Aktywność neutralizującą przekazywanie sygnałów przez mysie IL-6, wykazywaną przez prze₃ ciwciało wytwarzane przez tę hybrydomę, badano za pomocą włączania ³H-Tymidyny, z wykorzystaniem komórek MH60.BSF2 (Matsuda, T. i wsp., J. Immunol. (1988) 18, 951-956). Do 96-studzienkowej płytki dodawano komórki MH60.BSF2 w ilości 1x10⁴ komórek/200 μl/studzienkę. Do płytki

PL 216 534 B1 tej dodawano 10 pg/ml mysiego IL-6 i przeciwciała MR16-1 lub przeciwciała RS12 w stężeniu 12,3-1000 ng/ml, i całość hodowano w 37°C, w 5% CO2 przez 44 godziny, po czym dodawano μCi/studzienkę H-tymidyny. 4 godziny później mierzono włączanie H-tymidyny. W wyniku tego ₃ stwierdzono, że przeciwciało MR16-1 hamuje włączanie ³H-tymidyny przez komórki MH60.BSF2.

W ten sposób udowodniono, że przeciwciało wytworzone przez hybrydomę MR16-1 (FERM

BP-5874) hamuje wiązanie IL-6 z receptorem IL-6.

Claims (18)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Środek terapeutyczny do leczenia młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów o początku układowym, znamienny tym, że jako składnik czynny zawiera przeciwciało przeciwko receptorowi interleukiny 6 (IL-6).
2. 2. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6.
3. 3. Środek terapeutyczny według zastrz. 2, znamienny tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6.
4. 4. Środek terapeutyczny według zastrz. 2, znamienny tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6.
5. 5. Środek terapeutyczny według dowolnego z zastrz. 1-4, znamienny tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem rekombinowanym.
6. 6. Środek terapeutyczny według zastrz. 3, znamienny tym, że przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało PM-1.
7. 7. Środek terapeutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało MR16-1.
8. 8. Środek terapeutyczny według dowolnego z zastrz. 1-3, znamienny tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim skierowanym przeciwko receptorowi IL-6.
9. 9. Środek terapeutyczny według zastrz. 8, znamienny tym, że przeciwciałem humanizowanym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6 jest humanizowane przeciwciało PM-1.
10. 10. Środek terapeutyczny do leczenia choroby Stilla wieku dorosłego, znamienny tym, że jako składnik czynny zawiera przeciwciało przeciwko receptorowi interleukiny 6 (IL-6).
11. 11. Środek terapeutyczny według zastrz. 10, znamienny tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6.
12. 12. Środek terapeutyczny do leczenia choroby Stilla według zastrz. 11, znamienny tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6.
13. 13. Środek terapeutyczny według zastrz. 11, znamienny tym, że przeciwciało przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6.
14. 14. Środek terapeutyczny według dowolnego z zastrz. 10-13, znamienny tym, że przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem rekombinowanym.
15. 15. Środek terapeutyczny według zastrz. 12, znamienny tym, że przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko ludzkiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało PM-1.
16. 16. Środek terapeutyczny według zastrz. 13, znamienny tym, że przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko mysiemu receptorowi IL-6 jest przeciwciało MR16-1.
17. 17. Środek terapeutyczny według dowolnego z zastrz. 10-12, znamienny tym, że przeciwciało skierowane przeciwko receptorowi IL-6 jest przeciwciałem chimerowym, przeciwciałem humanizowanym lub przeciwciałem ludzkim skierowanym przeciwko receptorowi IL-6.
18. 18. Środek terapeutyczny według zastrz. 17, znamienny tym, że przeciwciałem humanizowanym skierowanym przeciwko receptorowi IL-6 jest humanizowane przeciwciało PM-1.