JPH11507547A

JPH11507547A - 免疫グロブリンドメインと融合したキメラレプチンおよびその用途

Info

Publication number: JPH11507547A
Application number: JP9502784A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，マイケル・ジョゼフ; チャップマン，コンラッド・ジェラルド; クリンケンバード，ヘレン・エリザベス; ロビンソン，ジェフリー・ヒュー
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
Priority date: 1995-06-13
Filing date: 1996-06-11
Publication date: 1999-07-06
Also published as: WO1997000319A3; WO1997000319A2; CA2224646A1; AU6011096A; GB9511935D0; EP0832219A2

Abstract

(57)【要約】ヒト免疫グロブリンドメインと融合したレプチンまたはその変異体ましくは変種からなる蛋白質であるキメラレプチン。１つの好ましい免疫グロブリンドメインは、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである。レプチンのキメラ誘導体は、その大きなサイズにもかかわらず、持続性のクリアランス率を伴う良好な薬理活性を有する。したがって、レプチンのこれら誘導体は、肥満症およびアテローム性動脈硬化症、高血圧症およびＩＩ型糖尿病のような肥満症に伴う疾患の治療および予防に特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】免疫グロブリンドメインと融合したキメラレプチンおよびその用途本発明は、新規蛋白質である新規化合物、そのような化合物の製造法、そのような化合物を含んでなる医薬組成物およびそのような化合物の医薬、特に、肥満症およびその関連疾患における用途に関する。ヨーロッパ特許出願公開番号０４６４５３３は、免疫グロブリン分子の定常部の種々の部分と、他のヒト蛋白質またはその部分が一緒になってなる融合蛋白質を開示している。ヨーロッパ特許出願公開番号０２９７８８２は、プラスミノーゲン分子の種々の部分と他のヒト蛋白質の部分からなる融合蛋白質を開示している。 Zhang et al.(Nature: 372，425-432; 1994)は、マウス肥満遺伝子およびそのヒト相同体のポジショナル・クローニングを記載している。マウス遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列は、１６７アミノ酸のポリペプチドを予測しており、Zhang et al.は１４６残基のマチュア蛋白質の産生を導くシグナル配列の存在を予測した。ヒト相同体は、そのマチュア蛋白質に関して１４６アミノ酸の同様なサイズを有するものとして開示された。Zhang et al.は、ミクロソーム膜の付加により１６キロダルトン（ｋＤ）生成物へトランケーション（ truncation）される、およそのサイズが１８ｋＤの一次翻訳生産物の存在を示しており、プレプロテインの産生およびＮ−末端シグナル配列の除去と一致している。Zhang et al.はまた、肥満症の治療におけるヒト肥満遺伝子産物（以下、レプチン（leptin）と称する）の使用も開示している。効率のよい、実際的な肥満症の治療に、特に望まれる肥満症剤の性質は、患者が許容できる治療療法、特に、注射治療による療法と調和するヒトにおけるクリアランス率である。Zhang et al.は、マウスおよびヒトのいずれにおいても、活性分子のクリアランス率に関する情報を開示していない。現在、レプチンの作用の正確な機序は不明であるが、観察された薬理効果を与えるためには、レプチンは、脳における１つ以上の受容体と相互作用するはずであると考えられる。本発明者らは、この度、その大きな分子サイズにかかわらず、意外にも、持続性のクリアランス率を伴う良好な薬理活性を有するレプチンのある種のキメラ誘導体を見いだした。これらのレプチンのキメラ誘導体は、それ故、肥満症の治療または予防に、また、肥満症に伴う、アテローム性動脈硬化症、高血圧症、特に、ＩＩ型糖尿病のような疾患や症状の治療および予防に特に有用であることを示している。特に、これらの化合物は、注射による投与に有用であると考えられる。これらの化合物はまた、身体外観の改善のための美容用処置にも有用であると考えられる。したがって、本発明は、キメラレプチンまたはレプチンのキメラ変異体もしくは誘導体を提供する。１つの特有のキメラレプチンは、ヒト免疫グロブリンドメインまたはその変異体もしくは変異と融合したレプチンまたはその変異体もしくは変種からなる。好適には、該キメラ蛋白質は１つのヒト免疫グロブリンドメインを含む。好ましくは、ヒト免疫グロブリンドメインは、レプチンおＣ−末端と融合している。１つの好ましいヒト免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンＦｃドメインである。ヒト免疫グロブリンＦｃドメインの一例は、ＩｇＧ４ＰＥ変異、特に、ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ₂−ＣＨ₃ＰＥである。他の例は、ＩｇＧ４、ＩｇＧ１およびＩｇＧ１ＧＴ、特に、各々のヒンジ−ＣＨ₂−ＣＨ₃領域である。ここで個々の蛋白質について使用する「変異体もしくは変種」なる語は、ヒトにおいて、関連した蛋白質と実質的に同じ活性を保持する関連蛋白質のトランケーションされた、もしくは他の誘導体のいずれをも包含する。そのような他の誘導体は、アミノ酸の付加、欠失、置換または再配置により、あるいはその化学的修飾により調製することができる。免疫グロブリンは、いずれのサブクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）のものでもよいが、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のようなＩｇＧが好ましい。その定常ドメインまたはフラグメントは、重鎖、軽鎖または両方から誘導されてよい。本発明は、Ｆｃ受容体結合のような天然免疫グロブリンの望ましくない性質を除き、および／または安定性のような望ましい性質を誘発する免疫グロブリン成分の変異を含む。例えば、Angal S.，King D.J.，Bodmer M．W.，Tumer A.，Lawson A.D.G.，Roberts G.，Pedley B.およびAdair R.，Mol ecular Immunology，130，105-108，1993は、残基第２４１（Kabatナンバリング）がセリンからプロリンに変化しているＩｇＧ４分子を記載している。この変化は、ＩｇＧ４分子の血清半減期を増加させる。Canfield S．M.およびMorrison S ．L.，Journal of Experimental Medicine，173，1483-1491は、ＩｇＧ３における残基２４８（Kabatナンバリング）のロイシンからグルタメートへの変化、マウスＩｇＧ２ｂにおけるグルタメートからロイシンへの変化を記載している。前者のロイシンのグルタメートへの置換は、関係する免疫グロブリン分子のＦｃγ ＲＩに対する親和性を減少し、後者のロイシンのグルタメートへの置換は、該親和性を増加させる。ＥＰ０３０７４３４は、ＩｇＧの残基２４８（Kabatナンバリング）におけるＬからＥへの変異を含む種々の変異を記載している。定常ドメイン（類）またはそのフラグメントは、好ましくは、ヒトＩｇＧの重鎖の定常部の全体または実質的部分である。ＩｇＧ成分は、好適には、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインと、重鎖間のジスルフィド結合に関与する複数のシステイン残基を含むヒンジ領域からなる。例えば、ＩｇＧ成分がＩｇＧ４から誘導される場合、ＩｇＧ４ヒンジ領域のシステイン残基８および１１を含む（Pinck J．R.およびMilstein C.，Nature，21 6 ，941-942，1967）。好ましくは、ＩｇＧ４成分は、Ellison J.，Buxbaum J.およびHood L.，DNA，1，11-18，1981に記載されるＩｇＧ４のヒンジの残基１−１２、ＣＨ２の残基１−１１０およびＣＨ３の残基１−１０７に相当するアミノ酸からなる。ＩｇＧ４における好適な変異の一例は、ヒンジの残基１０（残基２４１、Kabatナンバリング）が、野生型におけるセリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）に変わり、ＣＨ２の残基５（残基２４８、Kabatナンバリング）が、野生型におけるロイシン（Ｌ）からグルタメート（Ｅ）に変わるものである。ヒト免疫グロブリンの変異体または変種をコードするＤＮＡポリマーは、好ましくは、G．Winter et al.，Nature，1982，299，756-758およびSmith，1982，N ucl．Acids Res.，10，6485-6500に記載されるような常法による、所望の蛋白質をコードするｃＤＮＡの部位特異的突然変異により、またはChanおよびSmith, N ucl．Acids Res.，1984，12，2407-2419またはG．Winter et al.，Biochem．Soc ．Trans.，1984，12，224-225に記載される欠失突然変異あるいはMikaelianおよびSergeant，Nucleic Acids Research，1992，20，376に記載されるようなＰＣＲ（polymerase chain reaction）により調製できる。ここで用いる「本発明の化合物」または「本発明の化合物類」なる語は、上記したキメラに関してのものである。さらなる態様において、本発明は、本発明の化合物をコードするＤＮＡを組換体宿主細胞において発現させ、生成物を回収することからなる該化合物の製造法を提供する。該化合物をコードする核酸配列を含むＤＮＡポリマーも、本発明の一部である。本発明の製造法は、Maniatis et al.，Molecular Cloning‐A Laboratory Man ual; Cold SpringHarbor，1982およびDNA Cloning vols I，IIおよびIII（D. M ．Glover ed.，IRL Press Ltd）に記載されるような通常の組み換え技術によって行うことができる。特に、この方法は、（ｉ）該化合物をコードする核酸配列を含むＤＮＡポリマーを、宿主細胞で発現できる複製可能な発現ベクターを調製し、（ｉｉ）該ベクターで宿主細胞を形質転換し、（ｉｉｉ）形質転換された宿主細胞を、該ＤＮＡポリマーの発現条件下で培養して該化合物を産生させ、（ｖ）該化合物を回収する工程からなることができる。本発明はまた、適当なモノ−、ジ−またはオリゴヌクレオチド単位を縮合させることからなる該ＤＮＡポリマーの製造法も提供する。製造は、適宜、in vitroまたはin vivoで、化学的、酵素的または両方の組み合わせで行うことができる。例えば、ＤＮＡポリマーは、D.M．Roberts et al． Biochemistry，1985，24，5090-5098に記載されているような常法により、適当なＤＮＡフラグメントの酵素的結合によって製造できる。ＤＮＡフラグメントは、ヌクレオチドの所望の配列を含むＤＮＡを、適当な制限酵素により消化するか、化学的に合成するか、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型の酵素的重合によるか、またはこれらの方法の組み合わせによって得ることができる。制限酵素による消化は、適当な緩衝液中、温度２０〜７０℃で、一般に、５０ μｌ以下の容量で、０．１〜１０μｇのＤＮＡを用いて行う。ＤＮＡの酵素的重合は、要すればヌクレオシドトリホスフェートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有する適当な緩衝液中、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）のようなＤＮＡポリメラーゼを使用し、１０〜３７℃の温度で、５０μｌ以下の容量で、in vitroにて行うことができる。ＤＮＡフラグメントの酵素的連結は、適当な緩衝液中、４℃から室温の温度で、一般に、５０μｌ以下の容量で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのような、ＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼまたはフラグメントの化学的合成は、Chemical and Enzym atic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual（ed．H.G．Gassen およびA．Land），Verlag Chemie，Weihheim （1982）あるいは、例えば、M.J． GAit，H.W.D．Matthes，M．Singh，B.S．SproatおよびR.C．Titmas，Nucleic Ac ids Research，1982，10，6243; B.S．SproatおよびW．Banwarth，Tetrahedron Letters，1983，24，5771; M.D．MatteucciおよびM.H．Caruthes，Tetrahedron Letters，1980，21，719; M.D．MatteycciおよびM.H．Caruthes，Journal of th e American Chemical Society，1981，103，3185; S.P．Adams et al.，Journal of the American Chemical Society，1983，105，661; N.D．Sinha，J．Bierna t，J．McMannusおよびH．Koester，Nucleic Acids Research， 1984，12，4539およびH.W.D．Matthes et al.，EMBO Journal，1984，3，801のような他の学術的刊行物に記載されるような固相法を用いる通常のホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミダイト化学によって行うことができる。好ましくは、自動ＤＮＡシンセサイザーを使用する。ＤＮＡポリマーは、好ましくは、一緒になって該化合物をコードするＤＮＡ配列をなす２つ以上のＤＮＡ分子を連結して製造する。本発明による１つの具体的方法は、該レプチンまたはその変種をコードする第１のＤＮＡ分子と、該免疫グロブリンドメインまたはそのフラグメントをコードする第２のＤＮＡ分子とを連結することからなる。ＤＮＡ分子は、必要なコーディング配列を有するベクターの適当な制限酵素による消化またはＰＣＲ技術の使用により得ることができる。ＤＮＡ分子の正確な構造およびその取得方法は、所望の生成物の構造による。該化合物をコードするＤＮＡ分子の構築のための適当な手段の設計は、当業者のに日常的な仕事の範囲のものである。組換体宿主細胞における、化合物をコードするＤＮＡの発現は、宿主細胞で、ＤＮＡポリマーを発現できる複製可能な発現ベクターによって行うことができる。該発現ベクターは新規であり、これも本発明の一部を形成する。複製可能な発現ベクターは、本発明に従って、宿主細胞に適合するベクターを切断して無傷のレプリコンを有する直鎖状ＤＮＡセグメントを得、該直鎖状セグメントを、該セグメントと共に該化合物をコードする１つ以上のＤＮＡ分子と、連結条件下で組み合わせるこのにより製造できる。直鎖状セグメントと１つ以上のＤＮＡ分子との連結は、所望に応じて同時または逐次行うことができる。このようにして、所望により、ベクターの構築の間にＤＮＡポリマーを予備形成または形成できる。ベクターの選択は、一部、宿主細胞によって決定され、宿主は、イー・コリ(E . coli)のような原核細胞でも、マウスＣ１２７、マウス骨髄腫、チャイニーズ・ハムスター卵巣、Ｃｏｓ１またはＨｅｌａ細胞、糸状菌または単細胞酵母のような菌類あるいはドロソフィラのような昆虫細胞のような真核細胞でもよい。宿主細胞はトランスジェニック動物でもよい。好ましい宿主細胞はＣｏｓ１である。適当なベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミドおよび、例えば、バクロウイルス、ワクシニアまたはセムリキ森林ウイルスから誘導される組換体ウイルスが包含される。複製可能な発現ベクターの調製は、例えば、上記したManiatis et al.に記載されるような方法により、適当な制限酵素を使用し、ＤＮＡの重合および連結により都合よく行うことができる。重合および連結は、ＤＮＡポリマーの調製について上記したとおりに行うことができる。制限酵素での消化は、適当な緩衝液中、２０〜７０℃の温度で、０．１〜１０μｇのＤＮＡを用い、５０μｌ以下の容量で行うことができる。本発明に従い、組換体宿主細胞は、形質転換条件下、宿主細胞を本発明の複製可能なベクターで形質転換することにより、調製できる。適当な形質転換条件は、一般的なものでよく、例えば、上記のManiatis et al.またはDNA Cloning vol II，D．M．Glover ed.，IRL Press Ltd，1985に記載されている。形質転換条件の選択は、宿主細胞によって決まる。すなわち、イー・コリのような細菌細胞は、ＣａＣｌ₂溶液（Cohen et al.，Proc．Nat．Acad．Sci.，1973 , 69，2110）またはＲｂＣｌ、ＭｎＣｌ₂、酢酸カリウムおよびグリセロールの混合物を含む溶液で処理し、ついで、３−［Ｎ−モルホリノ］−プロパン−スルホン酸、ＲｂＣｌおよびグリセロールで処理することができる。培養中の哺乳動物細胞は、ベクターＤＮＡの細胞上へのカルシウム共沈殿により形質転換できる。本発明はまた、本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞まで拡大する。該ＤＮＡポリマーが発現できる条件下での形質転換宿主細胞の培養は、上記の、例えば、Maniatis et al.またはDNA Cloningに記載の一般的な方法で行うことができる。かくして、好ましくは、細胞に栄養を供給し、４５℃以下で培養する。発現生成物は、宿主細胞に応じて、常法により回収できる。すなわち、宿主細胞がイー・コリのような細菌の場合、物理的、化学的または酵素的に溶解し、得られた溶解物から蛋白質生成物を単離する。細菌細胞から生成物が分泌される場合、ペリプラズム空隙または栄養培地から回収できる。宿主細胞が哺乳動物の場合、生成物は、一般に、栄養培地から単離できる。ＤＮＡポリマーは、例えば、ウシ乳頭腫ウイルスベクターまたはチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞中で増幅されたベクターのような、生成物を発現する安定な形質転換哺乳動物セルラインの単離のために設計されたベクターに組み入れることができる（DNA cloning Vol．II，D.M．Glover ed.，IRL Press，1985; Kau fman，R.J.et al.，Molecular and Cellular Biology 5，1750-1759，1985; Pav lakis G.N.およびHammer，D.H.，Proceedings of the National Academy of Sci ence（USA）80，397-401，1983; Goeddel，D.V．et al.，EP 出願0093619，1983 ）。キメラレプチンの活性は、例えば、マウスまたはラットのような齧歯動物、例えば、アカゲザルのような霊長類のテスト動物に腹腔内、静脈内または皮下注射することにより測定できる。活性を最大にするため、テスト動物は、好ましくは、太りすぎであるか、高脂肪または他の嗜好性食餌での飼育によって太りすぎにしたか、加齢過程で脂肪が身につくことにより太りすぎにした肥満動物である。しかし、マウスの場合、理想的な血統は、遺伝的に肥満な（ｏｂ／ｏｂ）マウスである。活性化合物の効果は、食物摂取の減少、代謝率の増加または酸素消費として見られる。１日当たり２回−齧歯動物については１週間または霊長類については１カ月の期間にわたり、活性化合物の複数回の注射によっても、体重および個々の脂肪組織貯蔵部のサイズの減少をもたらす。クリアランス率は、例えば、ＥＬＩＳＡ法のような、ｏｂ抗体を使用する通常の血清分析により測定できる。上記したとおり、本発明の化合物は、有用な薬理活性、特に、抗肥満症活性および、アテローム性動脈硬化症、高血圧症および、特に、ＩＩ型糖尿病のような肥満症に伴う疾患の治療に有用な薬理活性を有する。該化合物を使用するには、通常、ヒトの医薬上許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と合した医薬組成物の形が採用されるが、組成物の具体的な形態は投与形式による。該活性化合物は、適当なルートのいずれにも処方し、投与することができ、好ましくは、投与単位形態である。有利には、組成物は、経口、経直腸、局所、非経口、静脈内または筋肉内あるいは呼吸気道経由に適するものである。製剤は、活性成分の遅放を与えるように設計できる。本発明の組成物は、錠剤、カプセル、、バイアル入、サッシェ(sachet)、粉末、顆粒、ロゼンジ、坐剤、復元可能な粉末または、経口または滅菌非経口溶液または懸濁液のような液体製剤の形態とすることができる。適当な場合には、局所処方も考えることができる。しがたって、本発明は、さらに、本発明の化合物および医薬上許容される担体からなる医薬組成物も提供する。本発明の化合物の投与量範囲は、所望の治療効果を生ずる範囲である。用量は、一般に、年齢、疾患の重篤の度合いおよび、もし存在すれば、禁忌によって変化する。例えば、肥満症の治療において、投与単位は、１ｍｇ以下から３００ｍｇまで変化できるが、典型的には、１投与量当たり、１〜２０ｍｇで、１日１回〜６回のような、１回以上投与し、そのような１日当たりの投与量は０．０２〜４０ｍｇ／ｋｇの範囲である。アテローム性動脈硬化症、高血圧症および、特に、ＩＩ型糖尿病のような、肥満症に伴う疾患の治療用の用量および組成物は、肥満症の治療に使用したと同等の範囲から選択される。注射に適した組成物は、溶液、懸濁液または乳液、あるいは使用前に適当なビヒクルに溶解または懸濁する乾燥粉末とすることができる。液体投与単位形は、該化合物およびパイロジェンを含まない滅菌ビヒクルを用いて調製する。用いるビヒクルおよび濃度により、化合物はビヒクルに溶解または懸濁することができる。溶液は、非経口投与の全ての形態に使用でき、特に、静脈内注射に使用できる。溶液の調製において、該化合物は、ビヒクルに溶解し、要すれば塩化ナトリウムの添加により等張化し、適当な滅菌バイアルまたはアンプルに充填し、密封する前に、無菌法により滅菌フィルターで濾過して滅菌することができる。別法として、溶液安定性が適当であれば、密封容器内の溶液を、オートクレーブ滅菌できる。有利には、緩衝剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤、殺菌剤、沈殿防止または乳化剤および／または局所麻酔剤をビヒクルに溶解していてもよい。使用前に適当なビヒクルに溶解または懸濁する乾燥粉末は、予備滅菌された薬剤物質および他の成分を、滅菌区域において無菌法を使用し、滅菌容器に充填することにより調製できる。別法として、薬剤および他の成分を水性ビヒクルに溶解でき、溶液を滅菌濾過し、滅菌区域において無菌法を使用し、適当な容器に分配する。生成物を、ついで、凍結乾燥し、容器を無菌的に密封する。筋肉内、皮下または皮内注射に適した非経口懸濁液は、溶解および滅菌を濾過で行えない代わりに、滅菌化合物を滅菌ビヒクルに懸濁することを除いて、実質的に同様な方法で調製できる。化合物は、滅菌状態で単離でき、あるいは、例えば、γ照射により単離後に滅菌できる。有利には、ポリビニルピロリドンのような沈殿防止剤を組成物に含め、化合物の均一な分散を促進する。呼吸気道を通じて投与するのに適した組成物には、エアゾル噴霧溶液または吸入用の微細粉末が包含される。後者の場合、粒径５０ミクロン以下が好ましく、特に好ましくは１０ミクロン以下である。そのような組成物は、常法により製造でき、通常の投与器具と共に使用できる。さらなる態様において、本発明は、有効量かつ非毒性量の本発明の化合物を患者に投与することからなるヒトまたは非ヒト哺乳動物における肥満症または肥満症に伴う、アテローム性動脈硬化症および、特に、ＩＩ型糖尿病のような疾患の治療法を提供する。好適な非ヒト哺乳動物は、イヌおよびネコのような家畜である。さらに、本発明は、本発明の化合物の活性治療物質としての使用、特に、肥満症または肥満症に伴う、アテローム性動脈硬化症および、特に、ＩＩ型糖尿病のような疾患の治療における使用を提供する。また、本発明は、本発明の化合物の、肥満症または肥満症に伴う、アテローム性動脈硬化症および、特に、ＩＩ型糖尿病のような疾患の治療用の医薬の製造における使用も提供する。上記したごとく、本発明は美容用処置も包含する。したがって、本発明は、本発明の化合物の、ヒトまたは非ヒト哺乳動物の美容用処置における使用も包含する。また、有効量かつ非毒性量の本発明の化合物を、それを必要とするヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与することからなるヒトまたは非ヒト哺乳動物の美容用処置用の使用も提供する。美容用処置には、好ましくは、体重減少処置のような身体外観の改善のための処置が包含される。また、本発明は、本発明の化合物およびその担体からなる化粧料組成物にも拡張される。化粧料組成物を含む本発明の組成物は、例えば、Harry's Cosmeticology，Leo nard Hill Books，Remington's Pharmaceutical Sciences発行、英国および英国局方のような標準的な教科書に記載の公知の方法を用いて処方される。本発明の化合物を本発明に従って投与する場合、何の予期せぬ毒性作用もない。以下の実施例により本発明を説明するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例１融合蛋白質レプチン１−１６７／ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードするＤＮＡの構築ヒトレプチンおよびヒトＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域からなる融合蛋白質をコードする遺伝子を、組み換えＤＮＡ技法、好ましくは、２段階組み換えＰＣＲ法により作成する。ヒトｏｂ遺伝子は、Zhang et al.のアミノ酸配列に基づいて合成的に調製し、ｐｃＤＮＡ３ベクターに配置した。ヒトレプチンの全長、ヌクレオチド１〜５０１をコードするｃＤＮＡを、その３’末端で、以下のＤＮＡ配列（表１）におけるヌクレオチド５０２〜１１８８として示されるヒトＩｇＧ４蛋白質をコードするｃＤＮＡのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域の５’末端と連結する。コードされたレプチン／ＩｇＧ４キメラの蛋白質配列を表２に示す。レプチン１−１６７（Y．Zhang，R．Proence，M．Maffei，M．Barone，L．Leopoldおよび J．Freidman，Nature，372:425-432に従ってナンバリング）およびＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３１６８〜３９６（Kabatによる配列）。この融合蛋白質は、国際特許出願ＷＯ９６／０４３８８の記載に従って、ｐＣＤＮベクターを使用し、Ｃｏｓ１細胞で一時的に発現された。マチュア蛋白質は、細胞から培地へ出され、抗レプチン抗体で検出された。還元および非還元の両方の条件下でのウエスタンブロッティング分析により、予測された構造に一致するサイズを有することが示された。実施例２融合蛋白質ｏｂ１−１６７／ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ＰＥ変種をコードするＤＮＡの構築ヒトｏｂ蛋白質およびヒトＩｇＧ４ＰＥ（以下に記載のように変異させたＩｇＧ４形）のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域からなる融合蛋白質をコードする遺伝子を、組み換えＤＮＡ技法、好ましくは２段階組み換えＰＣＲ法により作成する。完全なヒトレプチン、アミノ酸１〜１６７（Y．Zhang，R．Proence，M．Maffe i，M．Barone，L．LeopoldおよびJ．Fiedman，Nature，372: 425-432）をコードするｃＤＮＡを、その３’末端において、以下の蛋白質配列におけるアミノ酸１６８〜３９６として示される、ヒトＩｇＧ４（ＰＥ変種）蛋白質のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域の５’末端と連結する。ヒトｏｂ遺伝子は、Zhang et al.のアミノ酸配列に基づき合成し、ｐｃＤＮＡ３ベクターに配置した。コードされた蛋白質配列を表２に示す。ヒトＩｇＧ４重鎖ＰＥ変種。ＩｇＧ４ＰＥにおいて、ヒンジの残基１０（Kaba tナンバリングで残基２４１）を、野生型のセリン（Ｓ）からプロリン(Ｐ)に変え、ＣＨ２の残基５（Kabatナンバリングで残基２４８）を野生型のロイシン（Ｌ）からグルタメート（Ｅ）にかえる。Angal S.，King D.J.，Bodmer M．W.，T urner A.，Lawson A.D.G.，Roberts G.，Pedley B.およびAdair R.，Molecular Immunology，vol 130，105-198，1993は、残基２４１（Kabatナンバリング）がセリンからプロリンに変わったＩｇＧ４分子を記載している。この変化は、ＩｇＧ４分子の血清半減期を増加させる。ＩｇＧ４ＰＥ変種を、合成ヒトＩｇＧ４重鎖でのＰＣＲ突然変異誘発を用いて作成した。ＩｇＧ４ＰＥ変種の配列を表１に記載する。ＰＥ変種を作成するために変えたＩｇＧ４ヌクレオチド配列の残基はつぎのとおりである。表１参照：残基３２２を、野生型のＴからＰＥ変種のＣに変えた。残基３３３を、野生型のＡからＰＥ変種のＧに変えた。残基３４３−３４４を、野生型のＣＴからＰＥ変種のＧＡに変えた。融合蛋白質は、国際特許出願ＷＯ９６／０４３８８に記載に従って、ｐＣＤＮベクターを使用してＣｏｓ１細胞中で一時的に発現させた。マチュア蛋白質を、細胞から培地へ出させ、抗レプチン抗体で検出した。還元および非還元の両条件下でのウエスタンブロッティング分析により、予測した構造に一致するサイズを有することが示された。実施例３融合蛋白質レプチン１−１６７／ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードするＤＮＡの構築ヒトレプチンおよびヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域からなる融合蛋白質をコードする遺伝子を、組み換えＤＮＡ技法、好ましくは２段階組み換えＰＣＲ法により作成する。ヒトｏｂ遺伝子は、Zhang et al.のアミノ酸配列に基づき合成し、ｐｃＤＮＡ３ベクターに配置した。完全なヒトレプチン、アミノ酸１〜５０１をコードするｃＤＮＡを、その３’ 末端において、以下のＤＮＡ配列（表１）におけるヌクレオチド５０２〜１１９７として示される、ヒトＩｇＧ１蛋白質のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域の５’末端と連結する。コードされたレプチン／ＩｇＧ１キメラの蛋白質配列を表２に示す。レプチン１〜１６７（Y．Zhang，R．Proence，M．Maffei，M．Barone，L． Le opoldおよびJ．Fiedman，Nature，372: 425-432に従ってナンバリング）およびアミノ酸１６８〜３９９として示されるＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３。ヒトＩｇＧ１をコードする遺伝子は、Ellison J.W.，Berson B.J.oおよびHood L.E.，Nucleic Acids Research vol 10 No．13 4079，1982に記載されているＩｇＧ１分子と比較して、多くのヌクレオチド置換を含んでいる。Ellison J.W．e t al.によって発表された配列と相違する該ＩｇＧ１ヌクレオチドおよびその結果のアミノ酸置換はつぎのとおりである（表１と同様なヌクレオチドナンバリング）。この変種におけるヌクレオチド５１３のＧが、Ellison et al.の配列のＴに匹敵する（サイレント変異）。この変種におけるヌクレオチド５１４〜５１６のＧＣＣが、Ellison et al.の配列のＴＧＴに匹敵する（Ａｌａが、この変種におけるＣｙｓに置換、表２のアミノ酸１７２）。この変種におけるヌクレオチド７５９のＴが、Ellison et al.の配列のＧに匹敵する（サイレント変異）。この変種におけるヌクレオチド９２４のＧが、Ellison et al.の配列のＴに匹敵する（Ｇｌｕが、この変種におけるＡｓｐに置換、表２のアミノ酸３０８）。この変種におけるヌクレオチド９２８のＡが、Ellison et al.の配列のＣに匹敵する（Ｍｅｔが、この変種におけるＶａｌに置換、表２のアミノ酸３１０）。この変種におけるヌクレオチド１０７７のＴ、Ellison et al.の配列のＣに匹敵する（サイレント変異）。この変種におけるヌクレオチド１１９７のＧ、Ellison et al.の配列のＡに匹敵する（サイレント変異）。融合蛋白質は、国際特許出願ＷＯ９６／０４３８８に記載に従って、ｐＣＤＮベクターを使用してＣｏｓ１細胞中で一時的に発現させた。マチュア蛋白質を、細胞から培地へ出させ、抗レプチン抗体で検出した。還元および非還元の両条件下でのウエスタンブロッティング分析により、予測した構造に一致するサイズを有することが示された。実施例４融合蛋白質レプチン１−１６７／ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ＧＴリンカー変種をコードするＤＮＡの構築ヒトレプチンおよびヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域からなり、融合分子の２つの間にＧＴの２つのアミノ酸リンカーをゆうする融合蛋白質をコードする遺伝子を、組み換えＤＮＡ技法、好ましくは２段階組み換えＰＣＲ法により作成する。ヒトｏｂ遺伝子は、Zhang et al.のアミノ酸配列に基づき合成し、ｐｃＤＮＡ３ベクターに配置した。完全なヒトレプチン、アミノ酸１〜５０１をコードするｃＤＮＡを、その３’ 末端において、ＩｇＧ１ｃＤＮＡ（ヌクレオチド５０８〜１２０３）のヒンジ− ＣＨ２−ＣＨ３領域の５’末端と連結する。２つの融合部分の間に２つのアミノ酸のリンカーが、ヌクレオチド配列ＧＧＴＡＣＣ（５０２〜５０７）でコードされる。表１参照。コードされたレプチン／ＩｇＧ１（ＧＴ）キメラの蛋白質配列を表２に示す。レプチン１〜１６７（Y．Zhang，R．Proence，M．Maffei，M．Barone，L．Leo poldおよびJ．Fiedman，Nature，372: 425-432に従ってナンバリング）、これにつづいてＧＴリンカー（１６８〜１６９）およびアミノ酸１７０〜４０１のＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３。ヒトＩｇＧ１をコードする遺伝子は、Ellison J.W.，Berson B.J.oおよびHood L.E.，Nucleic Acids Research vol 10 No．13 4079，1982に記載されているＩｇＧ１分子と比較して、多くのヌクレオチド置換を含んでいる。Ellison J.W．e t al.によって発表された配列と相違する該ＩｇＧ１ヌクレオチドおよびその結果のアミノ酸置換はつぎのとおりである（表１と同様なヌクレオチドナンバリング）。この変種におけるヌクレオチド５１９のＧが、Ellison et al.の配列のＴに匹敵する（サイレント変異）。この変種におけるヌクレオチド５２０〜５２２のＧＣＣが、Ellison et al.の配列のＴＧＴに匹敵する（Ａｌａが、この変種におけるＣｙｓに置換、表２のアミノ酸１７４）。この変種におけるヌクレオチド７５９のＴが、Ellison et al.の配列のＧに匹敵する（サイレント変異）。この変種におけるヌクレオチド９２４のＧが、Ellison et al.の配列のＴに匹敵する（Ｇｌｕが、この変種におけるＡｓｐに置換、表２のアミノ酸３０８）。この変種におけるヌクレオチド９２８のＡが、Ellison et al.の配列のＣに匹敵する（Ｍｅｔが、この変種におけるＶａｌに置換、表２のアミノ酸３１０）。この変種におけるヌクレオチド１０７７のＴ、Ellison et al.の配列のＣに匹敵する（サイレント変異）。この変種におけるヌクレオチド１１９７のＧ、Ellison et al.の配列のＡに匹敵する（サイレント変異）。融合蛋白質は、国際特許出願ＷＯ９６／０４３８８に記載に従って、ｐＣＤＮベクターを使用してＣｏｓ１細胞中で一時的に発現させた。マチュア蛋白質を、細胞から培地へ出させ、抗レプチン抗体で検出した。還元および非還元の両条件下でのウエスタンブロッティング分析により、予測した構造に一致するサイズを有することが示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＮ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チャップマン，コンラッド・ジェラルドイギリス、シーエム19・５エイディ、エセックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コールドハーバー・ロード、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ (72)発明者クリンケンバード，ヘレン・エリザベスイギリス、シーエム19・５エイディ、エセックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コールドハーバー・ロード、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ (72)発明者ロビンソン，ジェフリー・ヒューイギリス、シーエム19・５エイディ、エセックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コールドハーバー・ロード、スミスクライン・ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims

【特許請求の範囲】１．キメラレプチンまたはレプチンのキメラ変異体もしくは誘導体。２．レプチンがヒトレプチンである請求項１記載のキメラ。３．レプチンまたはその変異体もしくは誘導体が、ヒト免疫グロブリンドメインまたはその変異体もしくは誘導体と融合している請求項１または２記載のキメラ。４．キメラ蛋白質が、ヒト免疫グロブリンドメインを含む請求項１〜３いずれか１項に記載のキメラ。５．ヒト免疫グロブリンドメインがレプチンのＣ末端に融合している請求項４記載のキメラ。６．ヒト免疫グロブリンＦｃドメインを含む請求項１〜４いずれか１項に記載のキメラ。７．ヒト免疫グロブリンＦｃドメインが、ＩｇＧ４ＰＥ変種、ＩｇＧ４、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１ＧＴ変種、特に、各々のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域である請求項６記載のキメラ。８．変種がヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３変種である請求項７記載のキメラ。９．レプチン１−１６７／ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、レプチン１−１６７／ＩｇＧ４ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ＰＥ変種、レプチン１−１６７／ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３、およびレプチン１−１６７／ＩｇＧ１ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ＧＴリンカー変種から選択されるキメラレプチン。１０．組換体宿主細胞で、当該キメラをコードするＤＮＡを発現させ、生成物を回収することからなる請求項１〜８いずれか１項記載のキメラの製造法。１１．ｉ）当該キメラをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡポリマーを宿主細胞で発現できる複製可能なベクターを調製し、ｉｉ）宿主細胞をベクターで形質転換し、ｉｉｉ）当該ＤＮＡポリマーの発現をさせる条件下で形質転換した宿主細胞を培養してキメラを産生させ、ｉｖ）当該キメラを回収する工程からなる請求項１０記載の製造法。１２．請求項１〜８いずれか１項に記載のキメラをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡポリマー。１３．請求項１２記載のＤＮＡポリマーを含むベクター。１４．請求項１２のＤＮＡポリマーまたは請求項１３のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。１５．請求項１記載のキメラおよび医薬上許容される担体からなる医薬組成物。１６．活性治療物質として使用する請求項１記載のキメラ。１７．肥満症または肥満症に伴う疾患の治療用である請求項１記載のキメラ。１８．有効かつ非毒性量の請求項１記載のキメラを患者に投与することからなるヒトまたは非ヒト哺乳動物における肥満症または肥満症に伴う疾患の治療法。１９．ヒトまたは非ヒト哺乳動物の美容処置に使用する請求項１記載のキメラ。２０．必要とするヒトまたは非ヒト哺乳動物に、有効かつ非毒性量の本発明の化合物を投与することからなるヒトまたは非ヒト哺乳動物の美容処置方法。