RO121386B1

RO121386B1 - Osteoprotegerină izolată şi purificată

Info

Publication number: RO121386B1
Application number: RO97-01539A
Authority: RO
Inventors: William J. Boyle; David L. Lacey; Frank J. Calzone; Ming Shi Chang
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2007-04-30
Also published as: ES2316152T3; CN1318588C; BG63347B1; EP2332974A3; GB9626618D0; HK1001526A1; CN1182452A; PL321938A1; GB2312899B; TR199601036A2; KR100463584B1; PT784093E; CZ292587B6; US6369027B1; SI0784093T1; FR2742767A1; EE04643B1; YU69196A; WO1997023614A1; AU1468697A

Abstract

Prezenta invenţie descrie o polipeptidă nouă, numită osteoprotegerină, care este un membru al superfamiliei receptor factor necroză tumorală ?i care este implicată în reglarea metabolismului osului. De asemenea, sunt descri?i acizi nucleici care codifică osteoprotegerină, polipeptide, vectori recombinanţi ?i celule gazdă pentru expresie, anticorpi care leagă OPG ?i compoziţii farmaceutice. Polipeptidele sunt folosite pentru a trata boli ale osului, caracterizate prin resorbţie crescută, precum osteoporoza.

Description

Invenția se referă la osteoprotegerină, o polipeptidă care este un membru al superfamiliei de receptor factor de necroză tumorală, polipeptidă folosită pentru tratarea bolilor osului, caracterizate printr-o pierdere crescută de os, cum ar fi osteoporoza.

Factorii de creștere polipeptidici și citokinele sunt factori secretați care semnalează o varietate largă de schimbări în creșterea celulei, diferențierii și metabolismului prin legare specifică la receptori precizați legați la suprafață. Ca o clasă de proteine, receptorii variază în structura lor și modul de trasducție a semnalului. Ei sunt caracterizați ca având un domeniu extracelular care este implicat în legare ligand și un domeniu citoplasmatic care transmite un semnal intracelular corespunzător. Imaginile expresiei receptor determină în final celulele care vor răspunde la un ligand dat în timp ce un receptor dat dictează răspunsul celular indus prin legare ligand. Receptorii s-au dovedit a transmite semnale intracelulare prin intermediul domeniilor lor citoplasmatice prin activarea proteinei tirozină sau fosforilarea proteinei serină/treonină (de exemplu, receptor factor de creștere derivat plachetă (PDGFR) sau transformarea receptorului-l factor de creștere-β (TGF8R-I) prin stimularea activării proteinei-G (de exemplu, receptor β-adrenergic) și prin modularea asocierilor cu semnalul citoplasmatic care transduce proteine (de exemplu, TNFR-1 și Fas/APO) (Heldin, Ce//80.213-223 (1995)).

Superfamilia receptor factor necroză tumorală (TNFR) este un grup de proteine transmembranare tip I care au în comun un motiv conservat bogat în cisteină care este repetat de 3 până la 6 ori în domeniul extracelular (Smith, et al. Cell 76, 953-962 (1994)). Colectiv, aceste unități repetate formează domeniile legare ligand ale acestor receptori (Chen et al, Chemistrv 270, 2874-2878 (1995)). Liganzii pentru acești receptori sunt o grupare înrudită structural de proteine omoloage la TNFa. (Goeddel et al. Cold Spring Harbor Symp. Quart. Biol. 51,597-609 (1986); Nagata et al. Science 267,1449-1456 (1995)). TNFa se leagă la receptori distincți, dar strâns înrudiți, TNFR-1 și TNFR-2. TNFa produce o diversitate de răspunsuri biologice în celulele care poartă receptori incluzând, proliferarea, diferențierea, citotoxicitâtea și apoptoza (Beutler et al. Ann. Rev. Biochem. 57. 505-518 (1988)).

Se crede că TNFa mediază răspunsuri inflamatoare acute și cronice (Beutler et al. Ann. Rev. Biochem. 57. 508-518 (1988)). Eliberarea sistemică a TNFa induce șoc toxic cu necroză tisulară extinsă. Datorită acesteia, TNFa poate fi responsabil pentru morbiditate severă și mortalitate asociată cu o diversitate de boli infecțioase, inclusiv sepsie. Mutațiile în FasL, ligandul pentru receptorul înrudit TNFR, Fas/APO (Suda et al. Cell 75,1169-1178 (1993)), sunt asociate cu autoimunitatea (Fisher et al. Cell 81, 935-946 (1995)), în timp ce supraproducerea de FasL poate fi implicată în hepatita indusă medicamentos. Astfel, liganzii pentru diferite proteine înrudite TNFR mediază adesea efecte serioase și numeroase stări de boală, ceea ce sugerează că agenți care neutralizează activitatea acestor liganzi ar avea valoare terapeutică. Receptori TNFR-1 solubili și anticorpi care leagă TNFa s-au testat pentru capacitatea lor de a neutraliza sistemic TNFa (Loetscher et al. Cancer Cells 3(6). 221-226 (1991)). O formă întâlnită natural a unui mARN TNFR-1 secretat a fost donată recent și produsul său s-a testat pentru capacitatea sa de a neutraliza in vitro și in vivo activitatea TNFa (Kohno etal. PNAS USA87, 8331-8335 (1990)). Capacitatea acestei proteine de a neutraliza TNFa sugerează că receptori TNF solubili funcționează pentru a lega și îndepărta TNF, prin aceasta blocând efectele citotoxice asupra celulelor purtătoare TNFR.

Un obiect al invenției este identificarea de membri noi ai superfamiliei TNFR. Se anticipează că membrii noi ai familiei pot fi proteine transmembranare sau forme solubile ale acestora care cuprind domenii extracelulare și cărora le lipsesc domenii transmembranare și citoplasmice. Noi am identificat un membru nou al superfamiliei TNFR care codifică o proteină secretată, care este strâns înrudită la TNFR-2. Prin analogie la TNFR-1 solubil, proteina înrudită TNFR-2 poate regla negativ activitatea ligandului său și astfel, poate fi utilă în tratamentul anumitor boli umane.

RO 121386 Β1

S-a identificat un membru nou al superfamifiei receptor factor necroză tumorală 1 (TNFR) de la o bancă cADN de intestin fetal de șobolan. S-a obținut și s-a secvențat o clonă cADN de lungime întreagă. Expresia cADN de șobolan într-un șoarece transgenic a arătat 3 o creștere marcată în densitatea oaselor în special în oase lungi, os pelvian și vertebre. Polipeptida codificată prin cADN este denumită Osteoprotegerină (OPG) și joacă un rol în 5 susținerea acumulării osoase.

Invenția asigură acizi nucleici care codifică o polipeptidă care are cel puțin una dintre 7 activitățile biologice ale osteoprotegerinei. Sunt asigurați, de asemenea, acizi nucleici care hibridizează la acizi nucleici care codifică OPG de șoarece, șobolan sau umană prezentați 9 în fig. 2B-2C (SEQ ID NR: 120), 9A-9B (SEQ ID NR: 122) și 9C-9D (SEQ ID NR: 124). De preferință, osteoprotegerină este osteoprotegerină mamiferă și mai preferat, este osteopro- 11 tegerină umană. De asemenea, sunt cuprinși vectori cecombinanți și celule gazdă care exprimă osteoprotegerină ca și metode de producere a osteoprotegerinei recombinante. 13

De asemenea, sunt dezvăluiți anticorpi sau fragmente ale lor care leagă specific polipeptida. 15

Prezenta invenție prezintă, de asemenea, metode de tratare a bolilor osului. Polipeptidele sunt utile pentru prevenirea resorbției osoase și se pot folosi pentru tratarea oricărei 17 condiții care are ca urmare pierdere de os cum arfi osteoporoza, hipercalcemia, boala Paget a osului și pierderea de os datorată artritei reumatoide sau osteomielitei și altele. Bolile osu- 19 lui pot fi tratate de asemenea cu terapie anti-sens sau genetică, folosind acizii nucleici ai invenției. De asemenea, sunt cuprinse compoziții farmaceutice care conțin acizi nucleici și 21 polipeptide OPG.

S-a identificat un membru nou al superfamiliei factorului de necroză tumorală (TNFR) 23 ca o secvență adăugată exprimată (EST), izolată de la banca cADN de intestin fetal de șobolan. Structurile clonelor cADN de lungime întreagă corespondente de șoarece și umană s-au 25 determinat cum s-a descris în exemplele 1 și 6. Genele de șobolan, șoarece și umană sunt prezentate în fig. 2B-2C (SEQ ID NR: 120), 9A-9B (SEQ ID NR: 122) și respectiv 9C-9D 27 (SEQ ID NR: 124). Toate cele trei secvențe prezintă similaritate puternică la domeniile extracelulare ale membrilor familiei TNFR. Nici una dintre clonele cADN de lungime întreagă izo- 29 late nu a codificat domenii transmembranare și citoplasmatice, ce ar fi de așteptat pentru receptori legați de membrană, sugerând că aceste cADN-uri codifică mai degrabă proteine 31 solubile secretate decât receptori de suprafață celulară. O porțiune a genei umane care înconjoară nucleotidele 1200-1353 prezentată în fig. 9D s-a depozitat în baza de date 33 Genebank pe 22 noiembrie 1995, sub numărul de acces 17188769.

Distribuția tisulară a mARN de șoarece și uman s-a determinat cum s-a descris în 35 exemplul 2. La șobolan, expresia mARN s-a detectat în rinichi, ficat, șobolan și inimă cu expresia cea mai ridicată în rinichi. De asemenea, s-a detectat expresie în mușchiul scheletic 37 și pancreas. La oameni, s-a detectat expresie în aceleași țesuturi alături de modul limfatic, timus, splină și apendice. 39 cADN de șobolan s-a exprimat în șoareci transgenici (exemplul 3) folosind sistemul de expresie promotor ApoE specific ficatului. Analiza expresorilora arătat o creștere marcată 41 în densitatea osului, în special în oase lungi (femure), vertebre și oase plate (pelvis). Analiza histologică a secțiunilor colorate ale osului a prezentat osteoporoză severă (vezi exemplul 4) 43 indicând un dezechilibru marcat între formarea osului și resorbție care a condus la o acumulare marcată de os și cartilaj. O descreștere în numărul osteoclastelortrabeculare din oasele 45 animalelor expresoare OPG arată că o parte semnificativă a proteinei înrudite TNFR poate să prevină resorbția osului, un proces mediat de osteoclaste. în vederea activității în expre- 47 sori transgenici, proteinele înrudite TNFR, descrise aici, sunt denumite OPG.

RO 121386 Β1

Folosind secvența cADN de șobolan, s-au izolat clone cADN de șoarece și umană (exemplul 5). Expresia OPG de șoarece în celule 293 și OPG uman în E.coli este descrisă în exemplele 7 și 8. OPG de șoarece s-a produs ca o fuziune Fc care s-a purificat prin cromatografie de afinitate Proteină A. De asemenea, în exemplul 7 este descrisă expresia polipeptidelor OPG de lungime întreagă și truncate umană și de șoarece în celule CHO și 293, fie ca fuziuni polipeptidice la regiunea Fc a lgG1 umană, fie ca polipeptide nefuzionate. Expresia OPG uman și de șoarece, de lungime întreagă și truncate în E.coli ca polipeptide de fuziune Fc, fie ca polipeptide nefuzionate este descrisă în exemplul 8. Purificarea OPG produsă recombinant de mamifer și bacterian este descrisă în exemplul 10.

Activitatea biologică a OPG s-a determinat folosind o analiză de maturare osteoclast in vitro, un model in vivo de hipercalcemie indusă interleukină-1 (IL-1) și studii de injectare ale densității osului în șoareci normali (vezi exemplul 11). Următoarele proteine OPG recombinante produse în celule CHO și 293 au demonstrat activitate în testul maturării osteoclastuluiîn E.coli: muOPG[22-185]-Fc, muOPG[22-194]-Fc, muOPG[22-401]Fc, muOPG[22-401], huOPG(22-201]-Fc, huOPG[22-401]-Fc. muOPG[22-180]-Fc produsă în celule CHO și huOPG met [32-401] produsă în E.coli nu demonstrează activitate în testul in vitro.

OPG din câteva surse s-a produs ca un dimer și într-o oarecare măsură multimer mai mare. OPG[22-401] de șobolan produs în șoareci transgenici, muOPG[22-401] și huOPG[22-401] produs ca o polipeptidă recombinantă în celule CHO și OPG exprimat ca un produs întâlnit natural la o linie de celule T citotoxică au fost predominant dimeri și trimeri când s-au analizat pe geluri SDS nereducătoare (vezi, exemplul 9). Polipeptide OPG scurtate care au deleții în regiunea aminoacizilor 186-401 (de exemplu, OPG[1-185] și OPG[1-194]) au fost predominant monomerice sugerând că regiunea 186-401 poate fi implicată în autoasocierea polipeptidelor OPG. Cu toate acestea, huOPG met [22-401] produsă în E.coli a fost în mare măsură monomerică.

OPG poate fi important în reglarea resorbției osului. Proteina pare să acționeze ca un receptor solubil al familiei TNF și poate preveni o interacțiune receptor-ligand implicată în calea osteolitică. Un aspect al reglării pare a fi o reducere a numărului de osteoclaste.

Acizi nucleici

Invenția asigură un acid nucleic izolat care codifică o polipeptidă care are cel puțin una dintre activitățile biologice ale OPG. Așa cum s-a descris aici, activitățile biologice ale OPG includ, dar nu sunt limitate la, orice activitate care implică metabolismul osos și în special, includ creșterea densității osului. Acizii nucleici ai invenției sunt aleși de la:

a) secvențele de acid nucleic cum sunt cele prezentate în fig. 2B-2C (SEQ ID NR: 120), 9A-9B(SEQ ID NR: 122) și 9C-9D (SEQ ID NR: 124) sau benzi complementare ale lor;

b) acizi nucleici care hibridizează în condiții stringente cu regiunea de codificare polipeptidă din fig. 2B-2C (SEQ ID NR: 120), 9A-9B (SEQ ID NR: 122) și 9C-9D (SEQ ID NR: 124); și

c) acizi nucleici care hibridizează în condiții stringente cu nucleotidele 148 la 337 inclusiv, cum se prezintă în fig. 1A.

d) secvențele de acid nucleic care sunt degenerate la secvențele din (a) și (b).

Invenția asigură acizi nucleici care codifică OPG de șobolan, șoarece și umană, precum și secvențele de acid care hibridizează la acestea, care codifică o polipeptidă având cel puțin una dintre activitățile biologice ale OPG. De asemenea, sunt asigurați acizi nucleici care hibridizează la o OPG EST de șobolan, cuprinzând nucleotidele 148-337 cum s-au prezentat în fig. 1A. Condițiile de hibridizare sunt în general de stringență ridicată cum ar fi 5xSSC, 50% formamidă și 42°C prezentate în exemplul 1 al descrierii. Stringența echivalentă

RO 121386 Β1 la aceste condiții se poate obține cu ușurință prin ajustarea concentrațiilor de sare și solvent 1 organic și de temperatură. Acizii nucleici din (b) cuprind secvențe care codifică polipeptide înrudite OPG, care nu suferă hibridizare detectabilă cu alți membri cunoscuți ai superfamiliei 3 receptor TNF. într-o realizare preferată, acizii nucleici sunt cum s-au prezentat în fig. 2B-2C (SEQ ID NR: 120), 9A-9B (SEQ ID NR: 122) și 9C-9D (SEQ ID NR: 124). 5

Lungimea hibridizării acizilor nucleici ai invenției poate fi variabilă, deoarece hibridizarea se poate întâlni în parte sau în toate regiunile care codifică polipeptida cum s-a pre- 7 zentat în fig. 2B-2C (SEQ ID NR. 120), 9A-9B (SEQ ID NR: 122) și 9C-9D (SEQ ID NR: 124) și de asemenea, se poate întâlni în regiuni adiacente necodificatoare. Prin urmare, acizii 9 nucleici care hidrolizează pot fi truncheri sau extensii ale secvențelor prezentate în fig. 2B-2C (SEQ ID NR: 120), 9A-9B (SEQ ID NR: 122) și 9C-9D (SEQ ID NR: 124). Acizi nucleici trun- 11 câți sau extinși sunt cuprinși în invenție cu condiția ca ei să rețină una sau mai multe dintre proprietățile biologice ale OPG. Hibridizarea acizilor nucleici poate să includă, de asemenea, 13 regiuni necodificatoare care sunt 5' și/sau 3' la regiunea de codificare OPG. Regiunile necodificatoare includ regiuni regulatoare implicate în expresia OPG, cum ar fi promotori, 15 intesifîcatori, situri de inițiere translațională, situri de terminare transcripție și altele.

Condiții de hibridizare pentru acizi nucleici sunt descrise în Sambrook et al., 17 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, a 2-a ediție, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). 19

ADN care codifică OPG de șobolan s-a asigurat în plasmidul pMO-B1.1 depozitat la ATCC, Rockville, MD, pe 7 decembrie 1995, sub numărul de acces ATCC 69970. ADN care 21 codifică OPG de șoarece s-a asigurat în plasmidul pRcCMV-murin OPG depozitat la ATCC, Rockville, MD, pe 27 decembrie 1995, sub numărul de acce 69971. ADN care codifică OPG 23 umană s-a asigurat în plasmidul pRcCMV-uman OPG depozitat la ATCC, Rockville, MD, pe 27 decembrie 1995 sub numărul de acces 69969. Acizii nucleici ai invenției vor hibridiza în 25 condiții stringente la insertele ADN, ATCC numere de acces 69969,69970 și 69971 și au cel puțin una dintre activitățile biologice ale OPG. 27

De asemenea, prin invenție sunt asigurați derivați ai secvențelor de acid nucleic prezentate în fig. 2B, 9A și 9B. Așa cum s-a folosit aici, derivați includ secvențe de acid nucleic 29 având adiția, substituția, inserția sau deleția unuia sau mai multor resturi astfel că secvențele rezultate codifică polipeptide care au unul sau mai multe resturi aminoacide adăugate, înde- 31 părtate, inserate sau substituite și polipeptida rezultată are activitate OPG. Derivații de acid nucleic pot fi întâlniți natural, cum ar fi prin variația de fragment sau polimorfism, sau pot fi 33 construiți folosind tehnici de mutageneză dirijată în sit, accesibile celor specializați. Un exemplu de variantă întâlnită natural a OPG este un acid nucleic care codifică un schimb lys pen- 35 tru asn la restul 3 din secvența lider (vezi exemplul 5). Se anticipează că derivați de acid nucleic vor codifica schimbări aminoacide în regiuni ale moleculei care sunt puțin probabile 37 să distrugă activitatea biologică. Alți derivați includ un acid nucleic care codifică o formă legată la membrană a OPG care are un domeniu extracelular cum s-a prezentat în fig. 2B-2C 39 (SEQ ID NR: 120), 9A-9B (SEQ ID NR: 122) și 9C-9D (SEQ ID NR: 124) împreună cu domeniile transmembranare și citoplasmatice. 41 într-o realizare, derivați ai OPG includ acizi nucleici care codifică forme scurtate ale

OPG care au unul sau mai mulți aminoacizi îndepărtați de la terminusul carboxi. Acizii 43 nucleici care codifică OPG pot avea de la 1 la 216 aminoacizi îndepărtați de la terminusul carboxi. Opțional, o regiune anticorp Fc se poate extinde de la noul terminus carboxi pentru 45 a da o polipeptida de fuziune OPG-Fc biologic activă (vezi exemplul 11). în realizări preferate, acizii nucleici codifică OPG având secvența aminoacidă de la resturile 22-185,22-189, 47

22-194 sau 22-201 (folosind numerotarea din fig. 9E-F) și opțional, care codifică o regiune

Fc a IgG uman. 49

RO 121386 Β1

De asemenea, sunt incluși acizi nucleici care codifică forme scurtate ale OPG care au unul sau mai mulți aminoacizi îndepărtați de la capătul amino. Forme truncate le includ pe cele cărora le lipsesc în parte sau total cei 21 aminoacizi care cuprind secvența lider. Suplimentar, invenția asigură acizi care codifică OPG care au de la 1 la 10 aminoacizi îndepărtați de la capătul amino matur (la restul 22) și opțional, având de la 1 la 216 aminoacizi îndepărtați de la terminusul carboxi (la restul 401). Opțional, acizii nucleici pot codifica un rest metionină la capătul amino. Exemple de astfel de polipeptide OPG scurtate sunt descrise în exemplul 8.

Exemplele de acizi nucleici ai invenției includ cADN, ADN genomic, ADN și ARN sintetic. cADN se obține de la bănci preparate de la mARN izolat din diverse țesuturi care exprimă OPG. La oameni, surse de țesut pentru OPG includ rinichi, ficat, placentă și inimă. ADN genomic care codifică OPG se obține din bănci genomice care sunt accesibile comercial de la o diversitate de specii. ADN sintetic se obține prin sinteza chimică a fragmentelor oligonucleotidice suprapuse urmată de asamblarea fragmentelor pentru a reconstrui în parte sau total regiunea codificatoare și secvențele de flancare (vezi US 4695623 care descrie sinteza chimică a genelor interferon). ARN se obține cel mai ușor prin vectori de expresie procariotici care dirijează sinteza la nivel ridicat a mARN, astfel de vectori folosind promotori T7 și ARN polimerază.

Secvențele de acid nucleic ale invenției sunt folosite pentru detectarea secvențelor OPG în probe biologice în scopul determinării care celule și țesuturi exprimă mARN al OPG. Secvențele pot fi folosite, de asemenea, pentru a căuta bănci cADN și genomice pentru secvențe înrudite la OPG. Asemenea căutări intră în posibilitățile specialistului în domeniu folosind condiții de hibridizare pentru detectarea secvențelor omoloage. Acizii nucleici sunt de asemenea utili pentru modularea expresiei nivelelor OPG prin terapie OPG sau terapie genetică. Acizii nucleici sunt de asemenea folosiți pentru dezvoltarea animalelor transgenice care pot fi folosite pentru producerea polipeptidei și pentru studiul activității biologice (vezi exemplul 3).

Vectori și celule gazdă

Vectori de expresie care conțin secvențe care codifică OPG, celule gazdă transformate cu numiții vectori și metode pentru producerea OPG sunt, de asemenea, asigurate prin invenție. O vedere de asmblu a proteinelor recombinante este găsită în Methods of Enzymology, v.185, Goeddel, D.V. ed. Academic Press (1990).

Celule gazdă pentru producerea OPG includ celule gazdă procariotice cum ar fi E.coli și celule gazdă de la drojdii, plante, de insecte și mamifere. Tulpini E.coli ca HB101 sau JM101, sunt adecvate pentru expresie. Celule gazdă de mamifere preferate includ celule COS, CHOd-, 293, CV-1, 3T3, celule din rinichi de pui de hamster (BHK) și altele. Celulele gazdă de mamifere sunt preferate când modificări post-translaționale, cum ar fi glicozilare și prelucrarea polipeptidei, sunt importante pentru activitatea OPG. Expresia mamiferă permite producerea polipeptidelor secretate care pot fi recuperate din mediul de creștere.

Vectori pentru expresia OPG conțin un minim de secvențe necesare pentru propagarea vectorului și pentru expresia insertului donat. Aceste secvențe includ o origine de replicare, marker de selecție, promotor, sit de legare ribozom, secvențe intensificator, situri de conexiune ARN și sit de terminare transcripție. Vectori adecvați pentru expresie în celulele gazdă menționate anterior sunt accesibili cu ușurință și acizii nucleici ai invenției sunt inserați în vectori folosind tehnici ADN recombinant standard. De asemenea, sunt incluși vectori pentru expresia specifică țesut a OPG. Astfel de vectori includ promotori care funcționează specific în ficat, rinichi sau alte organe pentru producere în șoareci și vectori virali pentru expresia OPG în celule umane țintite.

RO 121386 Β1

Folosind un sistem corespunzător vector-gazdă, se produce recombinant OPG prin 1 cultivarea unei celule gazdă transformate cu un vector de expresie conținând secvențe de acid nucleic care codifică OPG în astfel de condiții încât să se producă OPG și izolarea pro- 3 dusului expresiei. OPG se produce în supematantul celulelor mamifere transfectate sau în corpi de incluziune ai celulelor bacteriene gazdă transformate. OPG astfel produs poate fi 5 purificată prin procedurile cunoscute de un specialist în domeniu descrise mai jos. Expresia OPG în sisteme gazdă mamifere și bacteriene este descrisă în exemplele 7 și 8. Vectori de 7 expresie pentru gazde mamifere sunt exemplificați prin plasmizi ca pDSRa descriși în cererea PCT 90/14363. Vectori de expresie pentru celule gazdă bacteriene sunt exemplificați prin 9 plasmizi pAMG21 și pAMG22-His descriși în exemplul 8. Plasmidul pAMG21 s-a depozitat laATCC, Rockville, MD pe 24 iulie 1996 cu numărul de acces 98113. Plasmidul pAMG22-His 11 s-a depozitat la ATCC, Rockville, MD, pe 24 iulie 1996 sub numărul de acces 98112. Se anticipează că plasmizii specifici și celulele gazdă sunt pentru scopuri ilustrative și că alți 13 plasmizi accesibili și celule gazdă ar putea fi de asemenea, folosiți pentru a exprima polipeptidele. 15

De asemenea, invenția asigură expresia OPG din acizi nucleici endogeni prin evenimente de recombinare in vivo sau ex vivo pentru a permite modularea OPG din cromozomul 17 gazdei.

Expresia OPG prin introducerea secvențelor regulatoare exogene (de exemplu, pro- 19 motori sau intensificatori) capabile să dirijeze producerea de OPG de la regiuni de codificare OPG endogene este de asemenea cuprinsă. Stimularea secvențelor regulatoare endogene 21 capabile să dirijeze producția OPG (de exemplu, prin expunere la factori de intensificare transcripțională) este de asemenea, asigurată prin invenție. 23

Polipeptide

Invenția asigură OPG, un membru nou al superfamilei receptor TNF, care are o activi- 25 tate asociată cu metabolismul osos și în special având activitatea de inhibare a resorbției osului, prin aceasta crescând densitatea osului. OPG se referă la o polipeptidă care are o 27 secvență aminoacidă de șoarece, de șobolan sau umană, sau un derivat al acestora care are cel puțin una dintre activitățile biologice ale OPG. Secvențele de aminoacizi de la OPG 29 de șobolan, de șoarece și umană sunt prezentate în fig. 2B-2C (SEQ ID NR: 121), 9A-9B (SEQ ID NR: 123) și respectiv, 9C-9d (SEQ ID NR: 125). Un derivat al OPG se referă la o 31 polipeptidă având o adiție, deleție, inserție, sau substituție a unuia sau mai multor aminoacizi astfel că polipeptidă care rezultă are cel puțin una dintre activitățile biologice ale OPG. 33 Activitățile biologice ale OPG includ, dar nu sunt limitate la, activități care implică metabolismul osului. De preferință, polipeptidele vor avea secvența lider amino-terminală de 21 35 aminoacizi îndepărtată.

Polipeptide OPG cuprinse în invenție includ șobolan [1-401], șobolan [22-180], 37 șobolan [22-401], fuziune șobolan [22-401]-Fc, fuziune șobolan [22-180]-Fc, șoarece [1-401], șoarece [1-180], șoarece [22-401], umană [1-401], șoarece [22-180], umană [22-401], umană 39 [22-180], fuziune umană [22-180]-Fc și umană met-32-401. Numerotarea aminoacidă este prezentată în SEQ ID NR: 121 (șobolan), SEQ ID NR: 123 (șoarece) și SEQ ID NR: 125 41 (umană). De asemenea, sunt cuprinși derivați polipeptidici care au deleții sau truncheri carboxi-terminale parțiale sau totale ale resturilor aminoacide 180-401 ale OPG; una sau mai 43 schimbări de aminoacizi în resturile 180-401; deleția parțială sau totală a domeniului bogat în cisteină a OPG, în special deleția domeniului distal (carboxi-terminal) bogat în cisteină; 45 și una sau mai multe schimbări de aminoacizi într-un domeniu bogat în cisteină, în special în domeniul distal (carboxi-terminal) bogat în cisteină. într-o realizare, OPG are de la 1 până 47 la circa 216 aminoacizi îndepărtați de la carboxi-terminus. într-o altă realizare, OPG are de

I

RO 121386 Β1 la 1 la aproximativ 10 aminoacizi deletați de la amino terminal(în care amino terminal matur este la restul 22), și opțional, are de la 1 la aproximativ 216 aminoacizi deletați de la carboxi teminal.

Polipeptide OPG suplimentare cuprinse de invenție includ următoarele: fuziune umană [212-180]-Fc, fuziune umană [22-201 ]-Fc, fuziune umană [22-401]-Fc, fuziune șoarece [22-185]-Fc, fuziune șoarece [22-194]-Fc. Aceste polipeptide sunt produse în celule gazdă mamifere cum ar fi celule CHO sau 293. Polipeptide OPG suplimentare cuprinse de invenție, care sunt exprimate în celulă gazdă procariote le includ pe următoarele: umană met [22-401], fuziune umană-Fc met [22-401] (regiunea Fc este fuzionată la amino terminusul secvenței de lungime întreagă care codifică OPG, cum s-a descris în exemplul 8), fuziune uman met [22-401]-Fc (regiunea Fc fuzionată la secvența OPG de lungime întreagă), fuziune Fc-șoarece met [22-401 ], fuziune șoarece met [22-401 ]-Fc, umană met [27-401], umană met [22-185], umană met [22-189], umană met [22-194], umană met [22-194] (P25A), umană met [22-194] (P26A), umană met [27-185],umană met[27-194], umană met-arg-gly-ser-(his)₆[22401], umană met-lys [22-401], umană met-(lys)₃-[22-401], umană met [22-401 ]-Fc (P25A), umană met [22-401] (P25A), umană met [22-401] (P26A), umană met [22-401] (P26D), șoarece met [22-401], șoarece met lys₇[27-401], șoarece met [32-401], șoarece met [27180], șoarece [22-189], șoarece met [22-194], șoarece met [27-189], șoarece met [27-194], șoarece met-lys [22-401], șoarece HEK [22-401] (A45T), șoarece met(lys-his)₇ [22-401], șoarece met lys[22-401]-(his)₇ și șoarece met [27-401] (P33E, G36S, A45P). Se înțelege că peptida OPG de mai sus, produse în celule gazdă procariote au un rest metionină aminoterminal, chiar dacă un astfel de rest nu este indicat. în exemple specifice, fuziunile OPG-Fc s-au produs folosind o regiune de 227 de aminoaciyi a lgG₄ uman, care are secvența cum s-a prezentat în Ellison et al. (Nuc. Acids Res. 10,4071-4079 (1982)). Cu toate acestea, se pot folosi, de asemenea, variante ale regiunii Fc a IgG uman.

Analiza activității biologice a truncherilor OPG carboxi-terminale fuzionate la regiunea Fc lgG1 uman indică o porțiune a OPG de circa 164 aminoacizi, care este necesară pentru activitate. Această regiune cuprinde aminoacizii 22-185, de preferință cei din fig. 9C-9D (SEQ ID NR: 125) și cuprinde 4 domenii bogate în cisteină caracteristice domeniilor bogate în cisteină ale domeniilor extracelulare TNFR.

Folosind omologia dintre OPG și domeniile de legare ligand extracelulare ale membrilor familiei receptor TNF, s-a generat un model tridimensional al OPG bazat pe structura cristalină cunoscută a domeniului extracelularal TNFR-1 (vezi exemplul 6). Acest model s-a folosit pentru identificarea acelor resturi din OPG care pot fi importante pentru activitate biologică. S-au identificat resturile cisteină care sunt implicate în menținerea structurii celor 4 domenii bogate în cisteină. S-au identificat în modele următoarele punți disulfurice: Domeniul 1: cys 41 la cys 54, cys 44 la cys 62, tyr 23 și his 66 pot acționa pentru stabilizarea structurii acestui domeniu; Domeniul 2: cys 65 la cys 80, cys 83 la cys 98, cys 87 la cys 105; Domeniul 3: cys 107 la cys 118, cys 124 la cys 142; Domeniul 4: cys 145 la cys 160, cys 166 la cys 185. De asemenea, s-au identificat resturile care au fost în vecinătatea imediată la TNFp, cum s-a prezentat în fig. 11 și 12A-12B. în acest model, se presupune că OPG se leagă la un ligand corespondent; s-a folosit TNF8 ca ligand model pentru simularea interacțiunii OPG cu ligandul său. Pe baza acestei modelări, următoarele resturi din OPG pot fi importante pentru legare ligand: glu34, Iys43, pro66 la gln91 (în special, pro66, hid68, tyr69, tyr70, thr71, asp72, ser73, his 76, ser77, asp78, glu79, Ieu81, tyr82, pro85, val86, Iys88, glu90 și gln91), glu153 și seri 55.

Modificări în aceste resturi aminoacide, fie singulare, fie în combinație, pot modifica activitatea biologică a OPG. De exemplu, schimbări în resturile cisteină specifice pot modifica

RO 121386 Β1 structura domeniilor bogate în cisteină individuale, în timp ce schimbări în resturile impor- 1 tante pentru care ligand pot afecta interacțiunile fizice ale OPG cu ligandul. Modelele structurale pot ajuta în identificarea analogilor care au proprietăți mai dorite, cum ar fi activitate 3 biologică intensificată, stabilitate mai mare sau ușurință mai mare pentru formulare.

Invenția asigură de asemenea, un multimer OPG care cuprinde monomeri OPG. OPG 5 pare a fi activă ca un multimer (de exemplu, dimer, trimer, sau un număr mai mare de monomeri). De preferință, multimeri OPG sunt dimeri sau trimeri. Multimeri OPG pot cuprinde 7 monomeri qare au secvență de aminoacizi a OPG suficientă pentru a iniția formarea multimerului sau pot cuprinde monomeri care au secvențe heteroloage, cum ar fi o regiune Fc 9 anticorp. Analiza delețiilor carboxi-terminale ale OPG sugerează că, cel puțin o porțiune a regiunii 186-401 este implicată în asocierea polipeptidelor OPG. Substituția unei părți sau 11 în întregime a regiunii OPG a aminoacizilor 186-401 cu o secvență de aminoacizi capabilă de auto-asociere este de asemenea cuprinsă în invenție. Alternativ, polipeptide OPG sau 13 derivații lor pot fi modificate pentru a forma dimeri sau multimeri prin mutageneză dirijată în sit pentru a crea resturi cisteină nepereche pentru rotirea punții disulfurice intercatenă prin 15 reticulare fotochimică cum ar fi expunere la lumină ultravioletă sau prin reticulare chimică cu molecule linker bifuncționale cum ar fi polietilen glicol bifuncțional și altele. 17

Modificări ale polipeptidelor OPG sunt cuprinse de invenție și includ modificări posttranslaționale (de exemplu, catene carbohidrat N-legate sau O-legate, prelucrarea capetelor 19 N-terminale sau C-terminale), atașarea radicalilor chimici la structura aminoacidă, modificări chimice ale catenelor carboxilat N-legate sau O-legate și adăugarea unui rest metionină N- 21 terminal ca o urmare a expresiei celulei gazdă procariote. De asemenea, polipeptidele pot fi modificate cu un marcaj detectabil, cum ar fi un marcaj enzimatic, fluorescent, izotopic sau 23 de afinitate pentru a permite detectarea lor și izolarea proteinei.

Modificări ulterioare ale OPG includ proteine himerice în care OPG este fuzionată la 25 o secvență aminoacidă heteroloagă. Secvența heteroloagă poate fi orice secvență care permite proteinei de fuziune rezultate să păstreze activitatea OPG. Secvențele heteroloage 27 includ, de exemplu, fuziuni imunoglobulină, cum ar fi fuziuni Fc, care pot ajuta în purificarea proteinei. Este preferată o secvență heteroloagă care inițiază asocierea monomerilor OPG 29 să formeze dimeri, trimeri și alte forme multimerice mai mari.

Polipeptidele invenției sunt izolate și purificate de la alte polipeptide prezente în țesu- 31 turi, linii celulare și celule gazdă transformate care exprimă OPG, sau purificate din componente din culturi celulare care conțin proteina secretată. într-o realizare, polipeptida este 33 liberă de asociere cu alte proteine umane, cum ar fi produsul expresiei unei celule gazdă bacteriene. 35

De asemenea, prin invenție sunt asigurați derivați modificați chimic ai OPG care pot asigura avantaje suplimentare ca stabilitate crescută și timp crescut de circulație al polipep- 37 tidei sau scăderea imunogenității (vezi US 4179337). Radicali chimici pentru derivatizare pot fi aleși de la polimeri solubili în apă ca polietilen glicol, copolimeri etilen glicol/propilen glicol, 39 carboximetilceluloză, dextran, alcool polivinilic și altele. Polipeptidele pot fi modificate la poziții oarecare din moleculă sau la poziții predeterminate din moleculă și pot include unul, 41 doi, trei sau mai mulți radicali chimici atașați.

Polimerul poate fi de orice greutate moleculară și poate fi ramificat sau neramificat. 43 Pentru polietilen glicol, greutatea moleculară preferată este între circa 1 kDa și circa 100 kDa (termenul “circa” arătând că în preparatele de polietilen glicol, unele molecule vor avea greu- 45 tate mai mare, unele mai mică decât greutatea moleculară stabilită) pentru ușurința manevrării și fabricării. Se pot folosi alte mărimi, depinzând de profilul terapeutic dorit (de exemplu, 47 durata eliberării susținute dorite, efectele asupra activității biologice, ușurința în manevrare,

RO 121386 Β1 gradul de sau absența antigenicității și alte efecte cunoscute ale polietilen glicolului pentru o proteină terapeutică sau analog).

Moleculele de polietilen glicol (sau alți radicali chimici) vor fi atașate la proteină ținând cont de efecte asupra domeniilor funcționale sau antigenice ale proteinei. Există numeroase metode de atașare accesibile specialiștilor în domeniu, de exemplu, EP 0401384 încorporat aici prin referire (cuplarea PEG la G-CSF), vezi, de asemenea, Malik et al, Exp. Hematol., 20:1028-1035 (1992) (peg-ilarea GM-CSF folosind clorură de tresil). De exemplu, polietilen glicolul poate fi legat covalent prin resturi aminoacide prin intermediul unei grupări reactive, cum arfi o grupare amino sau caboxi liberă. Grupări reactive sunt cele la care poate fi legată o moleculă de polietilen glicol activată. Resturile aminoacide care au o grupare amino liberă pot să includă resturi lizină și resturi aminoacide N-terminale; cele care au o grupare carboxil liberă pot să includă resturi de acid aspartic, acid glutamic și resturi aminoacide C-terminale. De asemenea, grupările sulfihidril se pot folosi ca o grupare reactivă pentru atașarea moleculei(lor) de polietilen glicol. Pentru scopuri terapeutice, este preferată atașarea la o grupare j amino, cum ar fi atașarea la N-terminus sau grupare lizină.j

Se poate dori proteina modificată chimic specific N-terminal. Folosind polietilen glicolj ca o ilustrare a prezentelor compoziții, se pot selecta dintr-o varietate de molecule polietilenj glicol (prin greutate moleculară, ramificare, etc), proporția moleculelor de polietilen glicol fațăi de molecule de proteină (sau peptidă) în amestecul de reacție, tipul reacției de peg-ilare de realizat și metoda de obținere a proteinei peg-ilate N-terminal aleasă. Metoda de obținereI a preparatului peg-ilat N-terminal (adică separarea acestui radical de alți radicali monopegi-j lăți, dacă este necesar) poate fi prin purificarea materialului peg-ilat N-terminal dintr-o populație de molecule de proteină peg-ilate. Modificarea chimică selectivă N-terminală poate fi realizată prin alchilare selectivă care exploatează reactivitatea diferențială a diferite tipuri de grupări amino primare (lizină față de N-terminal) accesibile pentru derivatizare într-o proteină anume. în condiții de reacție corespunzătoare se obține derivatizarea substanțial selectivă a proteinei la N-terminus cu o grupare carbonil care conține polimer.

Dimeri OPG sintetici se pot prepara prin diverse proceduri chimice de reticulare. Monomeri OPG se pot lega chimic în orice mod care reține sau intensifică activitatea biologică a OPG. Pot fi folosiți o diversitate de reticulanți chimici în funcție de ce proprietăți ale proteinei dimer se doresc. De exemplu, reticulanții pot fi scurți și relativi rigizi, sau mai lungi și mai flexibili, pot fi reversibili biologic și pot asigura imongenicitate redusă sau timp de înjumătățire farmacocinetic mai mare.

într-un exemplu, molecule OPG sunt legate prin amino-terminus printr-o sinteză în două etape (vezi, exemplul 12). în prima etapă, OPG este modificat chimic la amino-terminus pentru a introduce un tiol protejat care, după purificare, este deprotejat și folosit ca un punct de atașare pentru conjugare sit specifică printr-o diversitate de reticulanți cu o a doua moleculă OPG. Legături amino-terminale includ, dar nu sunt limitate la, o punte disulfurică, legături tioeter folosind catena scurtă, reticulanți bis-funcționali alifatici și legături tioeter de lungime variabilă, reticulanți bifuncționali polietilen glicol. De asemenea, din sinteza PEG dumbbell a dimerilor OPG se obține un subprodus denumit monobell. Un monobell OPG constă dintr-un monomer cuplat la un PEG bifuncțional linear cu un terminus polimer liber. Alternativ, OPG poate fi reticulată direct printr-o diversitate de tehnici de reticulare homobifuncționale specifice unei amine, care includ reactivi ca: dianhidridă dietilentriaminpenta- acetică (DTPA), p-benzochinonă (pBQ), sau b/s(sulfosuccinimidil) suberat (BS³), precum și alții cunoscuți în domeniu. De asemenea, este posibilă tiolarea directă a OPG cu reactivi ca iminotiolan în prezența unei diversități de reticulanți bifuncționali, tiol specifici, cum ar fi PEG bismaleimidă și se obține dimerizare și/sau dumbbell într-un procedeu într-o etapă.

RO 121386 Β1

De asemenea, este inclusă o metodă pentru purificarea OPG din surse naturale și 1 din celule gazdă transfectate. Procesul purificării poate folosi una sau mai multe etape standard de purificare a proteinei într-o ordine adecvată pentru obținerea proteinei purificată. 3 Etapele de cromatografie pot include schimb ionic, filtrare în gel, interacțiune hidrofobă, fază inversă, cromatofocalizare, cromatografie de afinitate care folosește un anticorp anti-OPG 5 sau complex de afinitate biotină-streptavidină și altele.

Anticorpi 7

De asemenea, în invenție sunt cuprinși anticorpi care se leagă specific la OPG. Antigeni pentru generarea anticorpilor pot fi polipeptide de lungime întreagă sau peptide care 9 înconjoară o porțiune a secvenței OPG. Proceduri imunologice pentru generarea anticorpilor policlonali sau monoclonali reactivi cu OPG sunt cunoscute celor cu pregătire în domeniu 11 (vezi, de exemplu, Harlow și Lane, Antibobies. A Laborator* Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988)). Anticorpii astfel produși sunt caracterizați 13 pentru specificitatea legării și recunoașterea epitopilor folosind analize standard imunosorbent legat enzimă. De asemenea, anticorpii includ anticorpi himerici care au regiuni domeniu 15 valabil și constant de la specii diferite. într-o realizare, anticorpii himerici sunt anticorpi umanizați care au domenii variabile murine și domenii constante umane. De asemenea, sunt 17 cuprinse regiuni care determină complementaritate grefate la un cadru uman (așa numiți anticorpi grefați CDR). Anticorpii himerici și grefați CDR sunt obținuți prin metode recombi- 19 nante cunoscute specialistului în domeniu. Sunt cuprinși, de asemenea, anticorpi umani obținuți la șoarece. 21

Anticorpii anti-OPG ai invenției pot fi folosiți ca un reactiv de afinitate pentru purificarea OPG din probe biologice (vezi, exemplul 10). într-o metodă, anticorpul se imobilizează 23 pe Sepharoză activată Cn-Br și se folosește o coloană conjugat anticorp-Sepharoză pentru îndepărtarea OPG din probe lichide. De asemenea, anticorpii sunt folosiți ca reactivi de 25 diagnostic pentru detectarea și cuantificarea OPG în probe biologice prin metode descrise în continuare. 27

Compoziții farmaceutice

Invenția asigură, de asemenea, compoziții farmaceutice care cuprind o cantitate sufi- 29 cientă terapeutic a polipeptidei invenției împreună cu un diluent acceptabil farmaceutic, purtător, solubilizant, emulgator, conservant și/sau adjuvant. Termenul “cantitate eficientă tera- 31 peutic înseamnă o cantitate care asigură un efect terapeutic pentru o condiție și rută de administrare specifică. Compoziția poate fi în formă lichidă sau liofilizată și cuprinde un dilu- 33 ent (tampoane Tris, acetat sau fosfat) care au diferite valori de pH și tării ionice, solubilizanți ca Tween și polisorbat, purtători ca albumină serică umană sau gelatină, conservanți ca 35 timerosal sau alcool benzilic și antioxidanți ca acid ascorbic sau metabisulfit de sodiu. De asemenea, sunt cuprinse compoziții care cuprind OPG modificat cu polimeri solubili în apă 37 pentru creșterea solubilității sau stabilității. Compozițiile pot conține, de asemenea, încorporarea OPG în lipozomi, microemulsii, micele sau vezicule pentru eliberarea controlată pe o 39 perioadă îndelungată de timp. în mod specific, compoziții OPG pot cuprinde încorporarea în materii polimerice ca hidrogeluri, siliconi, polietilene, copolimeri etilenă-acetat de vinii sau 41 polimeri biodegradabili. Exemple de hidrogeluri includ polihidroxialchilmetacrilați (p-HEMA), poliacrilamidă, poimetacrilamidă, polivinilpirolidonă, alcool polivinilic și diverse complexe poli- 43 electrolit. Exemple de polimeri biodegradabili includ acid polilactic (PLA), acid poliglicolic (PGA), copolimeri ai PLA și PGA, poliamide și copolimeri ai poliamidelor și poliesterilor. Alte 45 forme cu eliberare controlată includ microcapsule, microsfere, complexe macromoleculare și bile polimerice care pot fi administrate prin injectare. 47

RO 121386 Β1

Alegerea unei compoziții particulare va depinde de un număr de factori, inclusiv condiția de tratat, calea de adiministrare și parametrii farmacocinetici doriți. O vedere mai largă a componentului adecvat pentru compoziții farmaceutice se găsește în Remington's Pharmacutical Sciences, 18-a ediție, A. R. Gennaro, edit. Mack, Easton, PA (1980).

Compozițiile invenției pot fi administrate fie prin injectare, subcutanată, intravenoasă sau intramusculară, fie prin administrare orală, nazală, pulmonară sau rectală. Calea de administrare eventual aleasă va depinde de un număr de factori și poate fi stabilită de un specialist în domeniu.

De asemenea, invenția asigură compoziții farmaceutice care cuprind o cantitate eficientă terapeutic de acizii nucleici ai invenției împreună cu un adjuvant acceptabil farmaceutic. Compozițiile de acid nucleic vor fi adecvate pentru eliberarea parțială sau în totalitate a regiunii de codificare OPG la celule și țesuturi ca parte a unui regim de terapie anti-sens sau geneice.

Metode de tratament

Țesutul osos asigură suport pentru corp și constă din minerale (în mare măsură calciu și fosfor), o matrice de proteine colagenoase și necolagenoase și celule. Trei tipuri de celule găsite în os, osteocite, osteoblaste și osteoclaste sunt implicate în procesul dinamic prin care osul este format continuu și resorbit. Osteoblastele inițiază formarea țesutului osos, în timp ce osteoclastele sunt asociate cu resorbția. Resorbția sau dizolvarea matricei osoase și minerale este un proces rapid și eficient comparat cu formarea osului și poate elibera cantități mari de minerale din os. Osteoclastele sunt implicate în reglarea remodelării normale a țesutului scheletic și în resorbția indusă prin hormoni. De exemplu, resorbția este stimulată prin secreția hormonului paratiroidian ca răspuns la descreșterea concentrațiilor de ioni de calciu în fluide extracelulare. în contrast, inhibarea resorbției este principala funcție a calcitoninei. Suplimentar, metaboliți ai vitaminei D modifică răspunsul osului la hormon paratiroidian și calcitonină.

După maturizarea scheletică cantitatea de os din schelet reflectă echilibrul (sau dezechilibrul) formării osului și resorbției osului. Maximul masei osoase se întâlnește după maturizarea scheletică înaintea celei de-a patra decade. între a patra și a cincea decadă, echilibrul se schimbă și domină resorbția osoasă. Descreșterea inevitabilă a masei osoase cu avansarea în vârstă începe mai devreme la femei decât la bărbați și este accelerată distinct după menopauză la unele femei (în principal descendente Caucaziene și Asiatice).

Osteopenia este o condiție legată în general de orice descreștere în masa osoasă sub nivele normale. O astfel de condiție poate apare de la o descreștere în rata sintezei osului sau de la o creștere în rata distrugerii osului sau de la ambele. Cea mai comună formă de osteopenie este osteoporoza primară, denumită, de asemenea, osteoporoză postmenopauzală sau senilă. Această formă de osteoporoză este o consecință a pierderii universale de os cu vârsta și este, de obicei, un rezultat al creșterii resorbției osului cu o rată normală de formare a osului. Circa 25 la 30% din toate femeile albe din SUA dezvoltă osteoporoză simptomatică. Există o relație directă între osteoporoză și incidența fracturii de șold, femurale, de gât și inter-trohanterică la femei de 45 ani și peste. Bărbați în vârstă dezvoltă osteoporoză simptomatică între 50 și 70 ani, dar boala afectează inițial femeile.

Cauza osteoporozei postmenopauzale și senile este necunoscută. S-au identificat câțiva factori care pot contribui la afecțiune. Ei includ modificarea nivelurilor hormonale care însoțesc îmbătrânirea și descreșterea absorbției intestinale a calciului și a altor minerale. Tratamentele au inclus de obicei terapie hormonală și suplimente de hrană într-o încercare de întârziere a procesului. Cu toate acestea, până în prezent nu există un tratament eficient pentru pierderea de os.

RO 121386 Β1

Invenția asigură o metodă de tratare a tulburării osoase folosind o cantitate eficientă 1 terapeutic de OPG. Tulburarea osoasă poate fi orice tulburare caracterizată printr-o pierdere netă de os (osteopenie sau osteoliză). în general, tratamentul cu OPG este anticipat când 3 este necesar pentru suprimarea ratei resorbției osoase. Astfel de tratament poate fi făcut pentru reducerea ratei resorbției osului, unde rata resorbției este peste normal sau pentru 5 reducerea resorbției la nivele sub normale în scopul compensării pentru nivele sub normale ale formării osului. 7

Condițiile care sunt tratabile cu OPG includ următoarele:

Osteoporoza, cum ar fi osteoporoza primară, osteoporoza endocrină (hipertiroidism, 9 hiperparatiroidism, sindromul Cushing și acromegalie), forme ereditare și congenitale de osteoporoză (osteogeneză imperfectă, hemocistinurie, sindrom Menkes și sindrom Riley- 11 Day) și osteoporoză datorată imobilizării extremităților.

Boala Paget a osului (osteitis deformans) la adulți și adolescenți. 13

Osteomielita, sau o leziune infecțioasă în os, care duce la pierdere de os.

Hipercalcemia care rezultă de la tumori solide (sân, plămân și rinichi) și malignități 15 hematologice (mielom multiplu, limfom și leucemie), hipercalcemie idiopatică și hipercalcemie asociată cu hipertiroidism și tulburări ale funcției renale. 17

Osteopenia care urmează chirurgiei, indusă prin administrare de steroid și asociată cu tulburări ale intestinului subțire și gros și cu hepatită cronică și boli renale.19

Osteonecroza sau moartea celulei osoase, asociată cu leziune traumatică sau necroză netraumatică asociată cu boala Gaucher, anemie falciformă, lupus eritrematos sistemic 21 și alte condiții.

Pierderea de os datorată artritei reumatoide23

Pierderea de os periodontal

Metastaza osteolitică25

Se înțelege că OPG se poate folosi singură sau în legătură cu alți factori pentru tratamentul tulburărilor osoase. într-o realizare, osteoprotegerina se folosește în conjuncție cu o 27 cantitate eficientă terapeutic a unui factor care stimulează formarea osului. Astfel de factori includ, dar nu se limitează la factori morfogenici osoși desemnați BMP-1 la BMP-12, factorul 29 P de creștere a transformării (TGF-β) și membrii familiei TGF-β, inhibitori interleukină-1, inhibitori TNFa, hormon paratiroidian și analogi ai lui, proteina înrudită paratiroidei și analogi ai 31 ei, prostaglandine seriile E, bifosfonați (ca alendronat și alții) și minerale care sporesc osul cum ar fi fluorul și calciul. 33 în continuare se prezintă fig. care însoțesc invenția în legătură cu exemplele de realizare.35

Fig. 1. A. Analiză FASTA a noului EST LORF. Este prezentată secvența aminoacidă FRI-1 dedusă aliniată la secvența TNFR-2 umană.37

B. Analiza profilului noului EST LORF prezentat, este secvența aminoacidă FRI-1 dedusă, aliniată la profilul TNFR.39

C. Vedere structurală a superfamiliei TNFR indicând regiunea care este omoloagă la noua FRI-1.41

Fig. 2. Structura și secvența genei OPG de lungime întreagă de șobolan, un membru nou al superfamiliei TNFR.43

A. Harta insertului pMOB-B1.1. Căsuța indică poziția LORF în secvența cADN (linie îngroșată). Căsuța neagră indică peptida semnal și elipsele gri indică poziția secvențelor 45 repetate bogate în cisteină.

B, C. Secvența de acid nucleic și de proteină a cADN OPG de șobolan. Peptida sem- 47 nai prezisă este subliniată și siturile potențiale ale glicozilării N-legate sunt indicate în litere îngroșate, subliniate. 49

RO 121386 Β1

D, E. Comparația coliziunii secvenței (Wisconsin, GCG Package, Versiune 8.1) a OPG cu alți membri ai superfamiliei TNFR, fas (SEQ ID NR: 128); tnfrl (SEQ ID NR: 129); sfu-t2 (SEQ ID NR: 130); tnfr2 (SEQ ID NR: 131); cd40 (SEQ ID NR: 132); osteo (SEQ ID NR: 133); ngfr (SEQ ID NR: 134); ox40 (SEQ ID NR: 135); 41 bb (SEQ ID NR: 136).

Fig. 3. Analiză PepPIot (Wisconsin, GCG Package, Versiune 8.1) a secvenței prezise proteină OPG de șobolan.

A. Reprezentare schematică a OPG de șobolan care arată aminoacizii hidrofobi (sus) și hidrofili (jos). Sunt prezentați, de asemenea, aminoacizi bazici (sus) și aminoacizi hidrofili (jos).

B. Prezintă resturile aminoacide care formează fascicule beta (sus) și care degradează fascicule beta (jos), așa cum s-au definit de către Chou și Fasman (Adv. Enz. 47, 45-147 (1948)).

C. Prezintă măsurile predilecției pentru alfa-helix sau fascicul-beta (Chou și Fasman, ibid). Curbe peste 1,00 arată predilecție pentru structura alfa-helix sau fascicul-beta.

Structura se poate termina în regiuni ale proteinei unde curbele cad sub 1,00.

D. Prezintă resturile care formează-alfa (sus) sau degradează-alfa (jos).

E. Prezintă porțiuni ale secvenței proteinei care se aseamănă secvențelor găsite de obicei la capătul carbonil al structurilor alfa și beta (Chou și Fasman, ibid).

G. Prezintă porțiuni ale secvenței proteinei găsite de obicei în schimb (Chou și Fasman, ibid).

H. Prezintă momentul hidrofob helical (Eisenberg et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,140-144 (1984)) la fiecare poziție din secvență.

I. Prezintă hidropatia medie bazată pe Kyte și Doolittle (J. Mol. Biol. 157.105-132 (1982)) și Goldman et al. (revăzut în Ann. Rev. Biophys. Chem. 15, 321-353 (1986)).

Fig. 4. Imaginile expresiei mARN pentru cADN OPG în țesuturi umane. Northern Bloturile s-au sondat cu un insert de șobolan, marcat 32P (A, stânga 2 imagini), sau cu insertul cADN uman (B, imagine dreapta).

Fig. 5. Crearea șoarecilor transgenici care exprimă cADN OPG în hepatocite. Northern blot-ul expresiei HE-OPG transgenice în ficat de șoarece.

Fig. 6. Creșterea densității osului în șoareci OPG transgenici. Imagine A-F. Șoareci de control. G-J, șoareci care exprimă OPG. La necropsie, toate animalele s-au radiografiat și s-au prezentat fotografii. în A-F, sunt prezentate radiografiile animalelor de control și ale unui animal transgenic care nu exprimă (#28). De remarcat că oasele au un cortex puțin definit și densitate crescută în zona medulară.

Fig. 7. Creșterea în os trabecular la șoareci transgenici OPG.

A-D. Micrografii reprezentative de la animale de control. în A și B sunt prezentate imagini cu putere redusă (4x,1 OOx) ale femurelor (colorație Masson tricrom). Colorații pentru tartrat rezistent fosfatază acidă (TRAP) demonstrează osteoclaste (vezi, săgeți) care resorb atât cartilaj (C) cât și os trabecular (D). De remarcat apariția plată a osteoclastelor pe os trabecular.

E-H. Fotomicrografii reprezentative ale oaselor de la animale care exprimă OPG. în E și F sunt prezentate imagini de putere redusă (4x, 10x) ale femurelor (colorație Masson tricrom). Regiunea clară este creșterea cartilajului plat, zona colorată albastru este os și zona colorată roșu este măduvă. De remarcat că, spre deosebire de animalele de control, osul trabecular nu s-a resorbit rezultând absența cavității medulare obișnuite. De asemenea, trabeculele rezultate au o apariție eterogenă cu zone albastre și incolore. Zonele incolore sunt resturi ale plăcii de creștere a cartilajului care nu au fost niciodată remodelate. Pe baza colorațiilor TRAP, aceste animale trebuie să aibă osteoclaste (vezi, săgeți) la placa de creștere

RO 121386 Β1 (G), care pot fi reduse la număr. Totuși, suprafețele trabeculelor depărtate de placa de creș- 1 tere sunt virtual lipsite de osteoclaste (H), o constatare care stă în contrast direct cu animalele de control (vezi, D). 3

Fig. 8. Expresorii HE-OPG nu au un defect în dezvoltarea monocit-macrofag. O cauză pentru osteoporoză la șoareci este producerea M-CSF deficientă datorită unei mutații 5 punctuale în gena M-CSF. Aceasta rezultă într-un deficit marcat al macrofagelor din circulație și pe bază de țesut. Sângele periferic al expresorilor OPG a conținut monocite așa cum s-a 7 testat prin analiză HIE. Pentru a afirma prezența macrofagelor tisulare, s-a realizat imunochimia folosind anticorpi F480, care recunosc un antigen de suprafață celulară pe macrofage 9 murine. Fotomicrografiile de putere redusă (4x) A și C prezintă spline de la CRI normali și supraexpresori. De remarcat că ambele animale au numeroase celule F480 pozitive. 11 Monocite-macrofage au fost, de asemenea prezente în măduva normalilor (B) și supraexpresorilor HE-OPG (D) (40x). 13

Fig. 9. Structura și secvența cADN OPG de șoarece și umană.

A, B. Secvența cADN și de proteină de șoarece.15

C, D. Secvența cADN și de proteină umană. Peptidele semnal prezise sunt subliniate și siturile potențiale ale glicozilării N-legate sunt indicate îngroșat.17

E, F. Alinierea secvenței și comparația secvențelor aminoacide OPG de șobolan, șoarece și umană.19

Fig. 10. Comparația secvențelor conservate în domeniul extracelularTNFR-1 și OPG umană. Pretty Plot (Wisconsin GCG Package, Versiune 8.1) al alinierii TNFR-1 și OPG des- 21 crise în exemplul 6. Traseul de sus, secvențe TNFR1 umane care codifică domeniile 1-4. Traseul de jos, secvențe OPG umane care codifică domeniile 1-4. Resturile conservate sunt 23 evidențiate prin căsuțe dreptunghiulare.

Fig. 11. Reprezentare tridimensională a OPG umană. Vedere laterală a prezentării 25 Molescript a structurii tridimensionale prezise a resturilor OPG umane 25 la 163 (linia groasă), co-cristalizate cu TNFp uman (linia subțire). Ca o referință pentru orientare, săgețile 27 îngroșate alături de polipeptida OPG principală pentru a ajuta în demonstrarea domeniilor bogate în cisteină, separate. Molecula TNFP este aliniată cum s-a descris de Banner et al. 29 (1993).

Fig. 12. Structura domeniilor bogate în cisteină ale OPG. Alinierea secvențelor amino- 31 acide umane (traseu de sus SEQ ID NR: 136) și de șoarece (traseu de jos) care evidențiază structura prezisă a domeniului OPG. Polipeptida este împărțită în 2 jumătăți; N-terminus (A) 33 și C-terminus (B). Jumătatea N-terminală este prezisă ca, având 4 domenii bogate în cisteină (marcate 1.4). Legăturile disulfurice intercatenă prezise sunt indicate prin linii îngroșate, mar- 35 cate SS1, SS2 sau SS3. Tirozina 28 și histidina 75 (subliniat) sunt prezise a forma o interacțiune ionică. Acei aminoacizi preziși a interacționa cu un ligand sunt indicați prin 37 puncte îngroșate deasupra restului corespunzător. Resturile cisteină localizate înjumătățea C-terminală a OPG sunt indicate prin căsuțe dreptunghiulare. 39

Fig. 13. Expresia și secreția proteinelor de fuziune OPG-Fc de șoarece de lungime întreagă și truncate. 41

A. Hartă care indică prin vârfuri de săgeți punctele fuziunii la domeniul lgG1 Fc.

B. Colorație argint a gelului poliacrilamidic SDS a mediilor condiționate obținute de 43 la celule care exprimă fie FI.Fc (OPG de lungime întreagă fuzionat la Fc la leucina 401), fie CT.Fc (OPG truncată carboxi-terminal, fuzionată la Fc la treonina 180). Traseu 1, linia de 45 celule vector de expresie parental pCEP4; traseu 2, linie de celule vector FI.Fc; traseu 3, linie de celule vector CT.Fc. 47

RO 121386 Β1

C. Western blot al mediilor condiționate obținute de la vectorii expresiei proteinei de fuziune FI.Fc și CT.Fc, sondați cu domeniu anti-uman IgGI Fc (Pierce). Traseu 1, linie de celule vector expresie parental pCEP4; traseu 2, linie de celule vector fl.Fc; traseu 3, linie de celule vector CT.Fc.

Fig. 14. Expresia OPG uman în E.coli.

A. Construcția unui vector de expresie bacterian. LORF al genei OPG umane s-a amplificat prin PCR, apoi s-a unit la un fragment linker oligonucleotidic (banda de sus este SEQ ID NR: 137; banda de jos este SEQ ID NR: 127) și s-a ligat în vectorul ADN pAMG21. Vectorul rezultat este capabil să exprime resturile OPG 32-401 legate la un rest metionină N-terminal.

B. Analiză SDS-PAGE a bacteriilor neinduse și induse care conțin plasmidul Pamg21-uman OPG-32-401. Traseu 1, standarde greutate moleculară; traseu 2, bacterii neinduse; traseu 3, inducție 30C; traseu 4, inducție 37’C; traseu 5, lizat celular integral de la inducție 37°C; traseu 6, fracție solubilă a lizatului celular integral; traseu 7, fracție insolubilă a lizatului celular integral; traseu 8, corpi de incluziune purificați, obținuți din lizat celular integral.

Fig. 15. Analiza OPG murin recombinant produs în celule CHO prin SDS-PAGE și Western blott. S-a aplicat o cantitate egală de medii condiționate CHO la fiecare traseu prezentat și s-a preparat prin tratament, fie cu probă de tampon reducător (traseu stânga), fie probă de tampon nereducător (traseu dreapta). După electroforeză, proteinele separate s-au transferat la o membrană nylon, apoi s-au sondat cu anticorpii anti-OPG. Pozițiile relative ale formelor monomerice 55 kd și dimerice 100 kd ale OPG sunt indicate prin vârfuri de săgeți.

Fig. 16. Analiza impulsului-depus al OPG recombinant murin produs în celule CHO. Celule CHO s-au marcat prin impuls cu metionină/cisteină ³⁵S, pentru timpul indicat

Culturile marcate metabolic s-au separat în ambele medii condiționate și s-au preparat celule extracte detergent de la fiecare, s-au limpezit apoi s-au imunoprecipitat cu anticorpi anti-OPG. Imunoprecipitatele s-au separat prin SDS-PAGE și s-au expus la film. Imaginile de sus, stânga și dreapta; probele s-au analizat în condiții nereducătoare. Imagini mai jos, stânga și dreapta; probe analizate în condiții reducătoare. Sus și jos, imagini stânga; extracte de celule. Sus și jos, imagini dreapta; extracte medii condiționate. Mobilitatea relativă a formelor monomerice 53 kd și dimerice 100 kd ale OPG este indicată prin vârfuri de săgeți.

Fig. 17. Expresia OPG în linia celulară CTLL-2. S-au preparat medii condiționate libere de ser de la celule transfectate CTLL-2 și CHO-mu OPG[1-401], s-au concentrat, apoi s-au analizat prin SDS-PAGE nereducător și Western blot. Traseu stânga; medii condiționate CTLL-2. Traseu dreapta; medii condiționate CHO-muOPG. Mobilitatea relativă a formelor monomerice 55 kd și dimerice 100 kd ale OPG este indicată prin vârfuri de săgeți.

Fig. 18. Detectarea expresiei OPG în probe de ser și extracte de ficat obținute de la control și șoareci transgenici OPG. Șoareci transgenici s-au obținut cum s-a descris în exemplul 4. Expresia OPG s-a vizualizat după SDS-PAGE urmat de Western blot, folosind anticorpi anti-OPG.

Fig. 19. Efectele proteinei de fuziune huOPG[22-401]-Fc asupra formării osteoclastului in vitro. Analiza formării osteoclastului s-a realizat cum s-a descris în exemplul 11 în absența (control) sau prezența cantităților indicate ale fuziunii huOPG[22-401]-Fc. Formarea osteoclastului s-a vizualizat prin colorare histochimică pentru tartrat acid fosfatază (TRAP).

A. OPG adăugată la 100 ng/ml.

D. OPG adăugată la 0,1 ng/ml.

E. OPG adăugată la 0,01 ng/ml.

F. OPG adăugată la 0,001 ng/ml.

G. Control. Nu s-a adăugat OPG.

RO 121386 Β1

Fig. 20. Descreșterea activității TRAP în cultură osteoclast cu cantități crescute de 1 OPG.

S-au adăugat concentrațiile indicate ale proteinei de fuziune de huOPG[22-401 ]-Fc 3 la analiza de formare osteoclast și activitatea TRAP s-a cuantificat cum s-a descris în exemplul Ila.5

Fig. 21. Efectul OPG asupra unui stadiu terminal al diferențierii osteoclastului. S-a adăugat fuziune huOPG[22-401]-Fcla analiza formării osteoclastului în timpul stadiului inter-7 mediar al maturării osteoclastului (zile 5-6; OPG-CTL) sau în timpul stadiului terminal al maturării osteoclastului (zile 7-15; CTL-OPG). Activitatea TRAP s-a cuantificat și s-a compa-9 rat cu activitatea observată în absența OPG (CTL-CTL) în prezența OPG(OPG-OPG).

Fig. 22. Efectele IL-1 β, IL-1 a și OPG asupra calciului sanguin ionizat la șoareci. Nive-11 iurile calciului sanguin ionizat s-au urmărit după injectare IL-1 β singur, IL-1 a singur, IL-Ιβ plus muOPG[22-401]-Fc, IL-1a plus MuOPG[22-401]-Fc și muOPG[22-401]-Fc singur. 13 Șoarecii de control au primit numai injecții de fosfat tamponat salin (PBS). Experimentul IL-1 β s-a prezentat în A; experimentul IL-1 a s-a prezentat în B. 15

Fig. 23. Efectele OPG asupra osteoclastelor craniene în șoareci de control și tratați

IL-1. 17

Metode histologice pentru analizarea probelor de os cranian sunt descrise în exemplul 11B. Săgețile indică osteoclastele prezente în ziua 2 la șoareci tratați. Probe craniene 19 ale șoarecilor care au primit 4 injecții zilnice de PBS(A), o injecție de IL-1 și 3 injecții zilnice de PBS(B), o injecție de PBS și 3 injecții zilnice de OPG(C), o injecție de IL-1 și 3 injecții 21 zilnice de OPG.

Fig. 24. Analiza radiografică a acumulării osului în cavitatea medulară a șoarecilor 23 normali. Șoarecii s-au injectat subcutanat cu soluție salină (A) sau fuziune muOPG[22-401ΙΡο (5 mg/kg/zi) timp de 14 zile (B) și densitatea osului s-a determinat cum s-a descris în 25 exemplul 11C.

Fig. 25. Analiza histomorfometrică a acumulării osului în cavitatea medulară a șoa- 27 recilor normali. Experimentele de injectare și histologia osului s-au realizat cum s-a descris în exemplul 11C.29

Fig. 26. Analiza histologică a acumulării osului în cavitatea medulară a șoarecilor normali.31

Experimentele de injectare și histologia osului s-au realizat cum s-a descris în exemplul 11C.33

A. Injectare soluție salină. B. Injectarea fuziunii muOPG-[22-401]-Fc.

Fig. 27. Activitate OPG administrat la șobolani ovariectomizați. în acest experiment 35 de 2 săptămâni tendința spre os de densitate redusă pare să fie blocată prin OPG sau alte terapii anti-resorbtive. Măsurători DEXA s-au făcut la momentul ovariectomiei și în 37 săptămâna 1 și 2 de tratament. Rezultatele sunt exprimate ca schimbare % de la densitatea inițială a osului (Medie +/- SEM). 39

Fig. 28. Densitatea osului în metafize femurale măsurată prin metode histomorfometrice, tinde să fie mai scăzută la șobolani ovariectomizați (OVX) decât la animale operate 41 simulat (SHAM), 17 zile după ovariectomie. Acest efect a fost blocat prin OPG-Fc, cu șobolani ovariectomizați tratați OPG-Fc (OVX + OPG) având densitatea osului semnificativ mai 43 mare decât șobolani ovariectomizați tratați cu vehicul (OVX). (Medie +/- SEM).

Exemplul 1. Identificarea și izolarea cADN OPG de șobolan 45

Materiale și metode pentru donarea cADN și analită sunt descrise în Maniatis et al, ibid. Reacțiile polimerazice de catenă (PCR) s-au realizat folosind un termacicler Perkin- 47 Elmer 9600, amestecul de reacție PCR (Boehringer-Mannheim) și concentrațiile de primer

RO 121386 Β1 specificate de către fabricant. în general, s-au denaturat 25-50 pl reacții la 94*C, urmate de 20-40 cicluri de 94*C 5 s, 50-60*0 5 s și 72*C 3-5 min. Apoi reacțiile s-au analizat prin elecroforeză în gel cum s-a descris în Maniatis et al., ibid.

S-a construit o bancă cADN folosind mARN izolat din intestin d20 pentru analiză EST (Adams etal. Sc/ence 252.1651-1656 (1991)). S-au disecat embrioni de șobolan și s-a îndepărtat în întregime intestinul subțire și gros în dezvoltare și s-a spălat cu PBS. S-a purificat ARN celular total prin extracție acid guanidium tiocianat-fenol-cloroform (Chomczynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162,156-159 (1987)). S-a obținut fracțiunea poli (+A) mARN de la preparatul de ARN total prin adsorbție la, și eluție de la, Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Corp) folosind procedurile recomandate de fabricant. S-a preparat o bancă cADN inițiată randomic folosind Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, Md). Primerul cADN random care conține un sit intern Not I de restricție s-a folosit pentru inițierea sintezei primei benzi și a avut următoerea secvență: 5'-AAAGGAAGGAAAAAAGCGGCCGCTAC ANNNNNNNNT-3' (SEQ ID NR: 1)

Notl

Pentru sinteza primei benzi s-au asamblat 3 reacții separate care au conținut 2,5 pg de poli(A) ARN și 120 ng, 360 ng, 1,080 ng de primer random. După sinteza celei de-a doua benzi, produsele reacției s-au extras cu un amestec de fenol:cloroform:alcool izoamilic (25:24:1) și apoi s-au precipitat etanol. Produsele cADN dublu bandă (ds)ale celor trei reacții s-au combinat și ligat la următorul adaptor ds oligonucleotidic: 5'-TCGACCCACGCGTCCG-3‘ (SEQ ID NR: 2)

3'-GGGTGCGCAGGCp-5' (SEQ ID NR: 3)

După ligare cADN s-a digerat la definitivare cu Notl, s-a extras cu fenol:cloroform:alcool izoamilic (25:24:1) și s-a precipitat etanol. cADN resuspendat s-a fracționat apoi după mărime prin filtrare în gel folosind coloane precondiționate furnizate cu Superscript Plasmid System (Gibco BRL, Gaithersburg, Md) cum s-a recomandat de producător. Cele două fracții care conțin cele mai mari produse cADN s-au colectat, s-au precipitat etanol și apoi s-au ligat direcțional în vectorul ADN pMOB digerat Notl și Sall (Strathmann et al, 1991). S-a introdus cADN ligat în E.coli ElectroMAX DH10B competentă (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) prin electroporare. Pentru analiza automată a secvenței s-au etalat aproximativ 10.000 de transformanți pe plăci de agar 20 cm x 20 cm, care conțin medii nutritive LB suplimentate ampicilină. Coloniile care au apărut s-au cules și s-au așezat pe plăci de microtitrare 96 godeuri care conțin 200 ml de bulion L, 7,5% glicerol și 50 pg/ml ampicilina. Culturile s-au crescut peste noapte la 37°C, s-a obținut un set duplicat de plăci de microtitrare folosind un instrument steril de replicare cu 96 de vârfuri, apoi ambele seturi s-au depozitat la -80’C pentru analiză ulterioară. Pentru donarea cADN de lungime întreagă, s-au etalat aproximativ 1 milion de transformanți pe plăci bacteriene 96 conținând circa 10.000 clone fiecare. Plasmidul ADN din fiecare depozit s-a izolat separat folosind Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen Corp., Germania) și s-a așezat în plăci 96 de microtitrare pentru analize PCR.

Pentru secvența random, clonele cADN din intestin fetal de șobolan, stocurile în glicerol, s-au dezghețat și alicote mici s-au diluat 1:25 în apă distilată. S-au adăugat aproximativ 3,0 μΙ de culturi bacteriene diluate la amestecul de reacție PCR (Boehringer-Mannheim) care conține următoarele oligonucleotide:

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID NR: 4)

5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEQ ID NR: 5)

Reacțiile s-au incubat într-un termocicler (Perkin-Elmer 9600) cu următoarele condiții ale ciclului: 94’C, 2 min; 30 cicluri de 94°C pentru 5 s, 50’C pentru 5 s și 72’C pentru 3 min;

RO 121386 Β1

72’C pentru 4 min. După incubare în termocicler, reacțiile s-au diluat cu 2,0 ml apă; Frag- 1 mentele ADN amplificate s-au purificat în continuare folosind coloane Centricon (Princeton Separations) urmând procedurile recomandate de producător. Produsele reacției PCR s-au 3 secvențat pe un secvențer ADN automat Applied Biosystems 373A folosind primerT3 (oligonucleotidă 353-23; 5'-CAATTAACCCTCACTAAAGG-3') (SEQ ID NR: 6) reacții Taq termina- 5 tor-colorant (Applied Biosystems) urmând procedurile recomandate de producător.

Secvența 5’ rezultată, obținută de la clone cADN culese randomic s-a translat și apoi 7 s-a comparat la baza de date existentă de secvențe proteice cunoscute folosind o versiune modificată a programului FASTA (Pearson etal. Meth. Enzymol. 183, (1990)). De asemenea, 9 secvențele translate s-au analizat pentru prezența unui motiv bogat în cisteină, specific proteinei, găsit la toți membri cunoscuți ai superfamiliei factor receptor necroză tumorală 11 (TNFR) (Smith et al. Cell 76, 959-962 (1994)), folosind metoda profilul secvenței a lui Gribskov et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,4355-4359(1987)), modificată de Luethy et 13 al. (Protein Sc/ence 3,139-146 (1994)).

Folosind FASTA și datele cercetării Profile, s-a identificat un EST, FRI-1 (Fetal Rat 15 lntestine-1), ca un posibil membru nou al superfamiliei TNFR. FRI-1 a conținut un insert de aproximativ 600 bp cu un LORF de circa 150 aminoaacizi. Potrivirea cea mai apropiată în 17 baza de date a fost TNFR uman tip II (TNFR-2). Regiunea comparată a prezentat o analogie de -43% între TNFR-2 și FRI-1 pe acest LORF de 150 aa. Analiza profilului folosind prima 19 și a doua repetiție bogată în cisteină a superfamiliei TNFR, a dat un scor 2 de ~8, indicând că gena FRI-1 este posibil să codifice un membru nou al familiei. Pentru a deduce structura 21 produsului FRI-1, banca cADN din intestin fetal de șobolan s-a căutat pentru clone de lungime întreagă. S-au derivat următoarele oligonucleotide de la secveța FRI-1 originală: 23

5'-GCATTATGACCCAGAAACCGGAC-3' (SEQ ID NR: 7)

5'-AGGTAGCGCCCTTCCTCACATTC-3' (SEQ ID NR: 8) 25

Acești primeri s-au folosit în reacții PCR pentru a căuta 96 depozite de plasmid ADN, fiecare depozit conținând plasmid ADN de la 10.000 clone cADN independente. S-a ampli- 27 ficat aproximativ 1 pg de depozit plasmid ADN într-un amestec de reacție PCR (BoehringerMannheim) folosind un ciclertermic Perkin-Elmer96 godeuri cu următoarele condiții pe ciclu: 29 min la 94’C, 1 ciclu; 15 s la 94’C, apoi 45 s la 65’C, 30 cicluri; 7 min la 65’C, 1 ciclu. Produsele reacție PCR s-au analizat prin electroforeză în gel. Din cele 96 depozite de 31 plasmid ADN, 13 au dat naștere la produse ADN amplificate cu masa moleculară relativă așteptată. 33

ADN de la un depozit pozitiv s-a folosit pentru transformarea E.coli ElectroMAX

DH10B competentă (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) cum s-a descris mai sus. Aproximativ 35 40.000 transformanți s-au etalat pe filtre de nitroceluloză sterile (BA-85, Scheliecher and Schuell), și apoi s-au căutat prin hibridizarea coloanei folosind o versiune marcată ³²P-dCTP, 37 a produsului PCR obținut mai sus. Filtrele s-au prehibridizat în 5xSSC, 50% formamidă deionizată, 5x soluție Denhardt, 0,5% SDS și 100 pl ADN spermatic denaturat de somon, 39 timp de 2-4 h la 42’C. Apoi filtrele s-au hibridizat în 5xSSC, 50% formamidă deionizată, 2x soluție Denhardt, 0,1% SDS, 100 pg/ml ADN spermatic denaturat de somon și ~5 ng/ml de 41 sondă marcată pentru -18 h la 42C. Apoi filtrele s-au spălat în 2xSSC 10 minute la temperatura camerei, 1xSSC 10 min la 55’C și în final în 0.5XSSC 10-15 min la 55’C. Clonele care 43 hibridizează s-au selectat după autoradiografie și apoi s-au re-etalat pe filtre de nitroceluloză pentru căutare secundară. La căutarea secundară, s-a izolat un plasmid clonă (pB1.1), apoi 45 s-a amplificat în mediu bulion L care conține 100 pg/ml ampicilina și s-a obținut plasmidul

ADN. S-au secvențat ambele benzi ale insertului pB1.1 de 2,4 kb. 47

RO 121386 Β1

Secvența insert pB1.1 s-a folosit pentru o cercetare FASTA a bazelor de date publice pentru detectarea oricărei împerecheri de secvență existentă și/sau similarități. Nu s-a găsit împerechere la nici o genă sau EST cunoscut, deși a existat o similaritate de aproximativ 45% la gene TNFR-2 uman și de șoarece. Un codon de start metionină se găsește la bp 124 a secvenței nucleotidice, urmat de un LORF care codifică 401 de resturi aa care se termină la bp 1327. Produsul de 401 resturi aa este prezis a avea o peptidă semnal hidrofobă de aproximativ 31 resturi la N-terminusul său și 4 situri potențiale de glicozilare N-legate. Folosind programul PepPIot (Wisconsin GCG Package, Versiune 8.1) nu s-a identificat nicio hidrofobie care să înconjoare secvența transmembranară. Secvența 401 aa dedusă s-a folosit apoi pentru a cerceta baza de date de proteină. Din nou, nu au existat împerecheri, deși a apărut o similaritate puternică la numeroși membri ai superfamiliei TNFR, cel mai remarcabil TNFR-2 uman și de șoarece. S-a preparat o aliniere de secvență a acestei proteine noi cu membrii cunoscuți ai superfamiliei TNFR folosind programul Pileup și apoi modificat prin PrettyPlot (Wisconsin GCG Package, Versiune 8.1). Această aliniere arată o omologie clară între produsul genei FRI-1 de lungime întreagă și toți ceilalți membri ai familiei TNFR. Se configurează regiunea omoloagă la domeniul extracelular al membrilor familiei TNFR, și corespunde celor 3 sau 4 repetiții bogate în cisteină, găsite în domeniul legare ligand al acestor proteine. Aceasta a sugerat că gena FRI-1 a codificat un nou membru al familiei TNFR. Deoarece nu s-a detectat nici o regiune care să înconjoare domeniul transmembranar, noi am prezis că acesta poate fi un receptor secretat similar receptorilor solubili TNFR-1 (Kohno et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87.8331-8335 (1990)). Datorită activității biologice aparente a genei FRI-1 (vide infra), produsul s-a numit Osteoprotegerină (OPG).

Exemplul 2. Imaginile expresiei mARN OPG în țesuturi

S-au sondat multiple northem blot-uri de țesut uman (Clonetech) cu un produs PCR FRI-1 marcat ³²P-dCTP pentru a detecta mărimea transcriptului uman și pentru determinarea imaginilor expresiei. Northern blot-urile s-au prehibridizat în 5xSSPE, 50% formamidă, 5x soluție Denhardt, 0,1 & SDS, 100 pg/ml ADN spermatic denaturat de somon și 5 ng/ml sondă marcată pentru 18-24 h la 42°C. Apoi blot-urile s-au spălat în 2xSSC 10 min la temperatura camerei, 1xSSC 10 min la 50C, apoi în 0,5xSSC 10-15 min.

Folosind o sondă derivată de la gena de șobolan, se detectează o specie mARN predonimantă cu o masă moleculară reletivă de circa 2,4 kb în câteva țesuturi, inclusiv rinichi, ficat, placentă și inimă. Cele mai ridicate niveluri s-au detectat în rinichi. O specie mARN mare de Mr 4,5 și 7,5 kb s-a detectat în mușchi scheletic și pancreas. în țesut uman fetal, rinichiul s-a dovedit a exprima niveluri ridicate de mARM 2,4 kb. Folosind o sondă umană (vide infra), în aceste aceleași țesuturi se detectează numai transcriptul de 2,4 kb. Suplimentar, niveluri relativ ridicate ale transcriptului de 2,4 kb s-au detectat în nodul limfatic, timus, splină și apendice. Mărimea transcriptului detectat prin gena Osteoprotegerină, atât umană cât și de șobolan, este aproape identică lungimii insertului pB1.1 FRI-1 de șobolan, sugerând că a fost o clonă cADN de lungime întreagă.

Exemplul 3. Eliberarea sistemică a OPG la șoareci transgenici

Clona OPG de șobolan pB1.1 s-a folosit ca matriță pentru amplificarea PCR a regiunii de codificare pentru subclonare într-un vector de expresie ApoE specific ficat (Simonet et al. J. Clin. Invest. 94, 1310-1319 (1994) și cerere PCT US94&11675 și cererea co-titularului 08/221.767. Pentru amplificare PCR s-au folosit următorii primeri oligonucleotidici 5' și respectiv 3':

5'-GACTAGTCCCACAATGAACAAGTGGCTGTG-3' (SEQ ID NR: 9)

5'-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATGAAAACAGCCCAGTGACCATTC-3' (SEQ ID NR: 10)

RO 121386 Β1

Amestecul reacției PCR (Boehringer-Mannheim) s-a tratat după cum urmează: 94’C 1 pentru 1 min. 1 ciclu; 94‘C pentru 20 s 62’C pentru 30 s și 74’C pentru 1 min, 25 cicluri. După amplificare, probele s-au purificat pe coloane Qiagen PCR și s-au digerat peste noapte 3 cu enzime de restricție Spel și Notl. Produsele digerate s-au extras și precipitat și s-au subclonat în vectorul de expresie promotor ApoE. înainte de microinjectare, clona rezultată HE- 5 OPG, s-a secvențat pentru asigurare că a fost lipsită de mutație.

Plasmidul HE-OPG s-a purificat prin 2 runde de centrifugare gradient de densitate 7 CsCI. Plasmidul ADN purificat s-a digerat cu Xhol și Asel și insertul transgenic s-a purificat prin electoforeză în gel. Fragmentul purificat s-a diluat la o soluție de injectare stoc de lug/ml 9 în 5mM Tris, pH 7,4,0,2 mM EDTA. Embrionii celulă singulară de la șoareci hibrizi BDFIxBDFI-s-au injectat în esență cum s-a descris (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11 82, 4338 (1985)), cu excepția faptului că acele de injectare au fost teșite și siliconizate înaintea folosirii. Embrionii s-au cultivat peste noapte într-un incubator CO₂ și 15 la 20 de 13 embrioni 2-celule s-au transfectat la oviductele șoarecilor femele CD1.

După termenul de gestație s-au obținut 49 de urmași din implantarea embrionilor 15 microinjectați. Urmașii s-au sortat prin amplificarea PCR a transgenei integrate în probe ADN genomic. Regiunea vizată pentru amplificare a fost o regiune de 369 bp a intronului ApoE 17 uman care s-a inclus în vectorul de expresie. Oligonucleotidele folosite pentru amplificare PCR au fost: 19

5-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3'

5-CGC CGT GTT CCATTT ATG AGC-3' (SEQ ID NR: 11) (SEQ ID NR: 12)

Condițiile pentru PCR au fost: 94’C pentru 2 min, 1 ciclu; 94’C pentru 1 min 63’C pentru 20 s și 72’C pentru 30 s, 30 cicluri. Din cei 49 de urmași inițiali, s-au identificat 9 ca 23 purtători trasgenici pozitivi PCR.

La vârsta de 8-10 săptămâni, cinci controale (1,12,15,18 și 20) s-au sacrificat pen- 25 tru necropsie și analize patologice. S-a izolat ficat de la cei 4 purtători hepatectomie parțială, șoarecii s-au anesteziat și un lob al ficatului s-a îndepărtat chirurgical. S-a izolat din ficat 27 cum s-a descris (McDonald et al. Meth. Enzymol. 152, 219 (1987)). S-a realizat analiză 29 Northern blot pe aceste probe pentru cercetarea nivelului transgenei. Aproximativ 10 pg de ARN total din ficatul fiecărui animal s-a separat prin electroforeză în geluri de denaturare 31 (Ogden et al. Meth. Enzymol 152. 61 (1987)), apoi s-a transferat la membrană de nylon HYBOND-N (Amersham) și s-a sondat cu insert ADN pB1.1 marcat ³²P-dCTP. Hibridizarea 33 s-a realizat peste noapte la 42*C în 50% formamidă, 5xSSPE, 0,5% SDS, 5x soluție Denhardt, 100 pg/ml ADN spermatic denaturat de somon și 2-4x10⁶ cpm sondă marcată/ml 35 de tampon de hibridizare. După hibridizare, blot-urile s-au spălat de 2 ori în 2xSSC, 0,1% SDS la temperatura camerei câte 5 min fiecare și apoi de 2 ori în 0,1xSSC, 0,1 SDS la 55’C 37 pentru 5-10 min fiecare. Expresia transgenei în purtător și control din aceeași generație s-a determinat după autoradiografie. 39

Datele northern blot arată că 7 din purtătorii! transgenici exprimă nivele detectabile de mARN transgenă (animal #2,11, 16, 17, 22, 33 și 45). Șoarecii control negativ și unul 41 dintre purtători (#28) nu au exprimat mARN legat de transgenă. Deoarece OPG este prezis a fi o proteină secretată, supraexpresia mARN transgenă ar fi un prim indiciu pentru nivelul 43 produsului genei eliberat sistemic. Șoarecii pozitivi PCR și northern blot, animal 2,17 și 22 au exprimat cele mai ridicate niveluri de mARN transgenă și pot prezenta efecte biologice 45 mai extinse asupra celulelor gazdă și țesuturilor.

Exemplul 4. Activitatea biologică a OPG 47

Cinci dintre șoarecii transgenici (animalele 2, 11, 16, 17 și 28) și 5 controale din aceeași generație (animalele 1,12,15,18 și 30) s-au sacrificat pentru necropsie și analize 49 patologice folosind următoarele proceduri:

RO 121386 Β1 înainte de eutanasiere, la toate animalele s-au verificat numerele de verificate apoi au fost cântărite, anesteziate și s-a recoltat sânge. Sângele s-a păstrat atât ca ser, cât și ca sânge integral pentru o chimie serică completă și tablou hematologic. Radiografia s-a realizat chiar după terminarea anesteziei prin inhalare letală de CO₂ și înainte de disecție grosieră. După aceasta, s-au îndepărtat țesuturi și s-au fixat în 10% formalină, tamponată Zn pentru examinare histologică. Țesuturile colectate au inclus ficat, splină, pancreas, stomac, duoden, ileum, colon, rinichi, organe reproducătoare, piele și glande mamare, os, creier, inimă, plămân, timus, trahee, esofag, tiroidă, jejun, cec, rect, adrenale, vezică urinară și mușchi scheletic. înaintea fixării s-au determinat greutățile organelor întregi pentru ficat, stomac, rinichi, adrenale, splină și timus. După fixare, țesuturile s-au prelucrat în blocuri de parafină și s-au obținut secțiuni de 3 pm. Țesutul osos s-a decalcificat folosind o soluție de acid formic și toate secțiunile s-au colorat cu hematoxilină și eozină. Suplimentar, pe unele țesuturi s-au realizat colorații cu reticulină Gomori și trieram Masson. S-a realizat biochimie enzimatică pentru determinarea tartratului rezistent fosfatază acidă (TRAP), o enzimă exprimată strict de osteoclaste, celule multinucleate care resorb os, ale liniei monocit-macrofag. S-a realizat, de asemenea, imunochimia pentru antigen de suprafață monocit-macrofag BrdU și F480 pentru detectarea celulelor care replică și respectiv, celule ale liniei monocit-macrofag. Pentru detectarea antigenului de suprafață F480, secțiuni de 4 um fixate formalină și imersate în parafină s-au deparafinizat și s-au hidratat la apă deionizată. Secțiunile s-au stopat cu apă oxigenată 3%, s-au blocat cu Protein Block (Lipshaw, Pittsburg, PA) și s-au incubat în monoclonal de șobolan anti-șoarece F480 (Harlan, Indianopolis, IN). Acest anticorp s-a determinat prin imunoglobuline iepure anti-șobolan biotinilate și peroxidază conjugată streptavidină (BioGenex San Ramon, CA) cu cromogen DAB (BioTek, Santa Barbara, CA). Secțiunile s-au contracolorat cu hematoxilină.

La disecția grosieră și observarea țesuturilor viscerale nu s-au găsit anormalități în expresorii transgenei sau controalele născute în aceiași generație. Analiza greutății organului a arătat că mărimea splinei a crescut cu aproximativ 38% la șoareci transgenici relativ la controale. A existat o creștere ușoară a mărimii plachetelor și creșterea celulelor albe din circulație la expresorii transgenei. A existat o descreștere marginală în nivelurile plachetare la expresorii transgenici. Suplimentar, nivelurile acidului uric seric, azotului ureic și fosfatazei alcaline au avut toate tendința să scadă la expresorii transgenici. Expresorii s-au dovedit a avea radiodensitate crescută a scheletului, incluzând oasele lungi (femure), vertebre și oase plate (pelvis). Mărimea relativă a femurelor la expresori nu a fost diferită de cea de la șoarecii de control.

Analiza histologică a secțiunilor de os colorate de la expresori OPG arată osteopetroză severă cu prezența cartilajului rămas de la spongioasa primară observată în os trabecular în diafiza femurului. Nu s-a putut identifica un cortex definit clar în secțiuni de femur. La animale normale, diafiza centrală este umplută cu măduvă osoasă. De asemenea, secțiuni de vertebră prezintă schimbări osteopetrotice induse OPG care arată că schimbările scheletice au fost sistemice. Măduva osoasă reziduală prezintă predominant elemente mieloide. Au fost prezente megacariocite. Colorațiile reticulină nu arată dovada depozitării reticulinei. Imunochimia pentru F480, un antigen de suprafață al celulei exprimat de celulele derivației monocit-macrofag la șoarece, a arătat prezența celulelor F480 pozitive în spațiile medulare. Prin concentrare, celule F480 pozitive, plate, s-au putut observa adiacente direct la suprafețe de os trabecular.

Celulele mezenchimale care mărginesc trabeculele osoase au fost plate și aparent inactive. Pe baza colorațiilor Η & E și TRAP, osteoclastele s-au găsit rar pe suprafețele osului trabecular în expresori OPG. în contrast, s-au văzut osteoclaste și/sau condroclaste

RO 121386 Β1 în regiunea de creștere a resorbției cartilajului plat, dar numărul lor poate fi redus comparat 1 la controale. De asemenea, osteoclastele au fost prezente pe suprafața corticală a metafizei unde activitatea de modelare este de obicei robustă. Diferența predominantă dintre expresor 3 și controale a fost descreșterea profundă în osteoclaste trabeculare, atât în vertebre, cât și în femure. Extinderea acumulării de os a fost corelată direct cu nivelul mARN transgenă 5 OPG detectat prin northern blot-ul ARN-ului total din ficat.

Splinele de la expresori OPG au avut o cantitate crescută de pulpă roșie cu expan- 7 siune datorată hematopoiezei crescute. Sunt reprezentate toate liniile hematopoietice. Celule F480 pozitive au fost prezente atât la control, cât și la expresori OPG în pulpa roșie. Doi 9 dintre expresori (2 și 17) au avut focare de hematopoieză extramedulară în ficat și aceasta este datorat, probabil, măduvei osteopetrotice. 11

Nu s-au observat anormalități în timus, nod limfatic, tract gastrointenstinal, tract pancreato-hepatobiliar, tract respirator, sistem reproducător, sistem genito-urinar, piele, 13 sistem nervos, inimă și aortă, sân, mușchi scheletic și grăsime.

Exemplul 5. Izolarea cADN OPG de șoarece și umană 15

S-a izolat o clonă cADN corespondentă capătului 5' al mARN OPG de șoarece dintr-o bancă cADN de rinichi de șoarece (Clontech) prin amplificare PCR. Oligonucleotidele s-au 17 derivat de la secvența cADN de șobolan și sunt prezentate mai jos: 5'-ATCAAAGGCAGGGCATACTTCCTG-3’ (SEQ ID NR: 13) 19

5'-GTTGCACCCZGTTTCACGGTCTG-3’ (SEQ ID NR: 14)

5'-CAAGACACCTTGAAGGGCCTGATG-3' (SEQ ID NR: 15)

5'-TAACTTTTACAGAAGAGCATCAGC-3' (SEQIDNR:16) 23

5'-AGCGCGGCCGCATGAACAAGTGGCTGTGCTGCG-3‘ (SEQ ID NR: 17) 25

5'-AGCTCTAGAGAAACAGCCCAGTGAACCATTCC-3' (SEQ ID NR: 18)

Produsele cADN parțială și de lungime întreagă obținute în acest proces au fost sec- 27 vențate. Produsul de lungime întreagă s-a digerat cu Notl și Xbal, apoi s-a donat direcțional în vectorul plasmid pRcCMV (Invitrogen). Vectorul rezultant s-a numit pRcCMV-Mu-OPG. 29 Secvența nucleotidică a produsului donat s-a comparat la secvența cADN OPG de șobolan. Pe regiunea de 1300 bp care înconjoară LORP OPG, secvențele ADN de șobolan și șoarece 31 sunt aproximativ 88% identice. Secvența cADN de șoarece a conținut un LORP de 401 aa, care s-a comparat la secvența proteinei OPG de șobolan și s-a găsit a fi -94% identică fără 33 goluri. Aceasta arată că secvența izolată cADN de șoarece codifică proteina OPG murină și că secvența și structura au fost strict conservate în evoluție. Secvența proteinei OPG de 35 șoarece conține o peptidă semnal probabilă identică la N-terminusul său și toate 4 șirurile potențiale de glicozilare N-legate sunt conservate. 37

Un cADN OPG uman parțial s-a donat de la o bancă cADN din rinichi uman folosind oligonucleotide specifice șobolan: 39

5'-GTG AAG CTG TGC AAG AAC ATG-3' (SEQ ID NR: 19)

5'-ATC AAA GGC AGG GCA TAC TTC CTG-3' (SEQ ID NR: 20) 41

Acest produs PCR s-a secvențat și folosit pentru desemnarea primerilor pentru amplificarea capătului 3' a cADN uman folosind o clonă genomică OPG umană în lambda ca 43 matriță: 5'-TCCGTAAGAAACAGCCCAGTGACC-3' (SEQ ID NR: 29) 45

5’-CAGATCCTGAAGCTGCTCAGTTTG-3' (SEQ ID NR: 21)

Produsul PCR s-a secvențat și împreună cu secvența capătului 5' s-a folosit pentru 47 desemnarea primerilor 5' și 3' specifici umani, utili pentru amplificarea secvențelor care codifică cADN OPG uman de lungime întreagă: 49

RO 121386 Β1

5'-AGCGCGGCCGCGGGGACCACAATGAACAAGTTG-3' (SEQ ID NR: 22)

5'-AGCTCTAGAATTGTGAGGAAACAGCTCAATGGC-3' (SEQ ID NR: 23)

Produsul PCR uman de lungime întreagă s-a secvențat, apoi s-a donat direcțional în plasmidul vector pRcCMV (Invitrogen) folosind Notl și Xbal. Plasmidul rezultat s-a numit pRcCMV-OPG uman. Secvența nucleotidică a produsului donat s-a comparat la secvențele cADN OPG de șobolan și șoarece. Pe regiunea de 1300 bp care înconjoară LORF OPG, secvențele ADN de șobolan și șoarece sunt aproximativ 78-88% identice la cADN OPG uman. Secvența cADN OPG uman a conținut, de asemenea, un LORF de 401 aa și s-a comparat la secvențele proteinei de șobolan și șoarece. Proteina OPG umană prezisă este aproximativ 85% identică și -90% identică la proteinele de șobolan și respectiv, șoarece. Alinierea secvenței proteinelor de șobolan, șoarece și umană arată că ele au fost strict conservate în timpul evoluției. Proteina umană este prezisă a avea o peptidă semnal N-terminală și 5 situri potențiale de glicozilare N-legată din care 4 sunt conservate între proteinele OPG de șobolan și șoarece.

Secvențele de ADN și de aminoacizi a OPG de șoarece sunt prezentate în fig. 9A și 9B (SEQ ID NR: 122). Secvența ADN și aminoacidă prezisă a OPG umană este prezentată în fig. 9C și 9D (SEQ ID NR: 124). O comparație a secvențelor aminoacide OPG de șobolan, șoarece și umană este prezentată în fig. 9E și 9F.

Izolarea de clone cADN OPG umană suplimentare a arătat prezența unei schimbări de bază G pentru C la poziția 103 a secvenței ADN prezentate în fig. 9C. Această schimbare nucleotidică are ca urmare substituția unei asparagine pentru o lizină la poziția 3 a secvenței aminoacide prezentate în fig. 9C. Restul secvenței din clone care au această schimbare a fost identic celui din fig. 9C și 9D.

Exemplul 6. Modelarea structurii tridimensionale a OPG

Porțiunea amino-terminală a OPG are omologie la porțiunea extracelulară a tuturor membrilor cunoscuți ai superfamiliei TNFR (fig. IC). Motivul cel mai remarcabil din acesta regiune a genelor înrudite TNFR este o secvență repetată bogată în cisteină de -40 aminoacizi care se pliază în structuri distincte (Banner et al., Cell, 73,431-445 (1993)). Acest motiv este prezentat de obicei în 4 (domeniul 3-6) repetiții tandem (vezi, fig. IC) și este cunoscut a fi implicat în legare ligand (Beutler și van Huffer, Science 264. 667-663 (1994)). Fiecare repetiție conține obișnuit 6 resturi cisteină interspațiate, care sunt implicate în formarea a 3 punți disulfurice intradomeniu, denumite SS1, SS2 și SS3 (Banner et al., ibid). în unii receptori, ca TNFR2, CD30 și CD40, unele domenii repetate conțin numai 2 punți disulfurice intracatenă (SS1 și SS3).

Secvența proteinei OPG umană s-a aliniat la profilul domeniului extracelularTNFRI folosind metode descrise de Luethy et al, ibid., și rezultatele s-au afișat grafic folosind programul PrettyPlotdin Wisconsin Package, versiune 8.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wl) (fig. 10). Alinierea indică o conservare clară a resturilor cisteină implicate în formarea domeniilor 1 -4. Această aliniere s-a folosit apoi pentru construirea unui model tridimensional (3-D) al domeniului N-terminal OPG umană folosind structura 3-D cunoscută a domeniului extracelular p55 TNFR1 (Banner et al, ibid.) ca matriță. Pentru a face aceasta, coordonatele atomice ale peptidei principale și catenele laterale de resturi identice s-au copiat de la coordonatele structurii cristaline TNFR1. După aceasta, s-au generat coordonatele rămase pentru inserții și diferite catene laterale folosind programul LOOK (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA). Apoi, modelul 3-D s-a rafinat pentru reducerea energiei sale conformaționale folosind LOOK.

Prin analogie cu alți membri ai familiei TNFR, se presupune că OPG se leagă la un ligand. Pentru scopul modelării interacțiunii OPG cu ligandul său, s-a folosit structura cristalină a TNF-β pentru a simula o reprezentare tridimensională a unui ligand OPG. Aceste

RO 121386 Β1 date s-au afișat grafic (vezi, fig. 11), folosind Molscript (Kraulis, J. Appl. Cryst. 24, 946- 1

950,1991). S-a construit un model pentru complexul OPG/ligand cu trei molecule TNF-β și 3 molecule OPG unde pozițiile relative ale OPG sunt identice la TNFR1 în structura crista- 3 lină. Apoi, acest model s-a folosit pentru a găsi resturile OPG care ar putea interacționa cu ligandul său folosind următoarea abordare: s-au calculat suprafața accesibilă solventului a 5 tuturor resturilor din complex și un model unic OPG. Resturile care au accesibilitate diferită în complex decât în monomer sunt probabile să interacționeze cu ligandul. 7

Secvențele aminoacide OPG umană și de șoarece au fost realiniate folosind această informație pentru a evidenția secvențele care cuprind fiecare dintre domeniile bogate în 9 cisteină 1-4 (fig. 12A și 12B). Fiecare domeniu are caracteristici structurale individuale care pot fi prezise: 11

Domeniul 1

Conține 4 cisteine implicate în legăturile disulfurice SS2 (C41 la C54) și SS3 (C44 la 13 C62). Cu toate că nu este evidentă nici o legătură SS1 bazată pe punți disulfurice, tirozina conservată la poziția 28 este omoloagă la Y20 în TNFR1, care este cunoscută a fi implicată 15 în interacțiunea cu H66 pentru a ajuta la formarea domeniului. OPG are o histidină omoloagă la poziția 75, sugerând că Y28 și H75 la OPG sunt grupate în proteina nativă la fel cum fac 17 resturile omoloage în TNFR1. Prin urmare, ambele din aceste resturi pot fi importante în schimb pentru activitate biologică și truncările OPG N-terminale până la și dincolo de Y28 19 pot avea activitate modificată. Suplimentar, resturile E34 și K43 sunt prezise a interacționa cu o legătură ligand pe baza modelului nostru tridimensional. 21

Domeniul 2

Conține 6 cisteine și este prezis a conține legături disulfurice SS1 (C65 la C80), SS2 23 (C83 la C98) și SS3 (C87 la C105). Această regiune a OPG conține de asemenea, o regiune care se întinde de la P66-Q91 care se aliniază la porțiunea domeniului 2 TNFR1 care for- 25 mează contacte strânse cu TNF-β (vezi, mai sus) și poate interacționa cu un ligand OPG.

In special resturile P66, H68, Y69, Y70, T71, D72, S73, H75, T76, S77, D78, E79, L81, Y82,27

P85, V86, K88, E89, L90 și Q 91 sunt prezise a interacționa cu o ligare ligand pe baza datelor noastre structurale.29

Domeniul 3

Conține 4 cisteine implicate în legături disulfurice SS1 (C107 la C118) și SS3 (C12431 la C142), dar nu și o legătură SS2. Pe baza datelor noastre structurale, resturile E115, L118 și K118 sunt prezise a interacționa cu un ligand OPG.33

Domeniul 4

Conține 4 cisteine implicate în legături disulfurice SS1 (C145 la C160) și SS3 (C16635 la C185), darnici o legătură SS2, similar domeniului 3. Datele noastre structurale prezic că E153 și S155 interacționează cu un ligand OPG.37

Astfel, modelul structural prezis pentru OPG identifică un număr de resturi puternic conservate care probabil sunt importante pentru activitatea sa biologică.39

Exemplul 7. Producerea proteinei OPG recombinante secretate în celule mamifere Pentru a determina dacă OPG este într-adevăr o proteină secretată, cADN OPG de 41 șoarece s-a fuzionat la domeniul Fc IgGI uman ca un capăt (Capon et al., Nature 337, 525531 (1989)) și s-a exprimat în fibroblaste umane 293. Fuziunile Fc s-au realizat folosind 43 vectorul pFc-A3. pFc-A3 conține regiunea care codifică porțiunea Fca catenei grele a imunoglobulinei umane IgG-yl (Ellison et al., ibid.) de la primul aminoacid al domeniului principal 45 (Glu-99) la terminusul carboxil și este flancat printr-un sit de fuziune 5'-Notl și situri 3'-Sall și Xbal. Plasmidul s-a construit prin amplificarea PCR a băncii cADN din splină umană 47 (Clontech). Reacțiile PCR au fost într-un volum final de 100 pl și au folosit 2 unități de Vent

RO 121386 Β1

ADN polimerază (New England Biolabs) în 20 mM Tris-HCI (pH 8,8), 10 mM KC1,10 pM (NH₄)₂SO₄,2 mM MgSO₄,0,1% Triton X-100 cu 400 pM fiecare dNTP și 1 ng de bancă cADN de amplificat, împreună cu 1 pM din fiecare primer. Reacțiile s-au inițiat prin denaturare la 95C pentru 2 min, urmat de 30 cicluri de 95°C pentru 30 s, 55’C pentru 30 s și 73‘C pentru 2 min. Primerul 5'

5' ATAGCGGCCGCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC 3' (SEQID NR: 24) a încorporat un sit Notl imediat 5' față de primul rest (Glu-99) al domeniului principal al IgGγ1. Primerul

3*. 5'-TCTAGAGTCGACCTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT-3' (SEQID NR: 25) a încorporat situri Sall și Xbal. Produsul PCR de 717 bp s-a digerat cu Notl și Sall, s-a izolat prin electroforeză prin agaroză 1 % (FMC Corp.), s-a purificat prin procedura Geneclean (BI0101, Inc.) și s-a donat în vectorul pBluescript IIKS (Stratagene) digerat Sall în Notl. Insertul din plasmidul rezultat, pFc-A3, s-a secvențat pentru confirmarea fidelității reacției PCR.

S-a amplificat cADN donat de șoarece în plasmid pRcCMV-MuOPG folosind următoarele 2 seturi de perechi primer:

Pereche 1

5'-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3' (SEQ ID NR:26)

5'-CCTCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTCACGGATTGAACCTG-3’ (SEQ ID NR: 27) Pereche 2

5'-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3' (SEQ ID NR:28)

5'-CCTCTGCGGCCGCTGTTGCATTTCCTTTCTG-3’ (SEQ ID NR:30)

Prima pereche amplifică întregul LORF OPG și crează un sit de restricție Notl care este compatibil cu situl Notl în cadru din vectorul fuziunii Fc, pFcA3. S-a preparat pFcA3 prin ingineria unui sit de restricție Notl 5' față de restul acid aspartic 216 al cADN Fc IgGI uman. Acest construct introduce un linker care codifică 2 aminoacizi nerelevanți care au înconjurat joncțiunea dintre proteina OPG și regiunea Fc IgG. Acest produs, legat la porțiunea Fc, va codifica toate cele 401 resturi OPG direct urmate de toate cele 227 resturi aminoacide ale regiunii Fc IgGI uman (FI.Fc). A doua pereche de primeri amplifică secvențele ADN care codifică primele 180 resturi aminoacide ale OPG, care cuprind domeniul său probabil de ligare ligand. Ca mai sus, primenii 3' creează un sit de restricție Notl artificial, care fuzionează LORF OPG truncată C-terminal la poziția treonină 180 direct la domeniul Fc lgG1 (CT.fc).

Joncțiunea secvenței aminoacide care leagă restul 401 OPG și restul acid aspartic 221 al regiunii Fc umană se poate modifica după cum urmează: ADN-ul care codifică resturile 216-220 ale regiunii Fc umană poate fi deletat cum s-a descris mai jos, sau restul cisteină corespunzător la C220 al regiunii Fc umană poate fi mutat fie la serină, fie la alanină. Proteina de fuziune OPG-Fc codificată prin acești vectori modificați se poate transfecta în celule 293 umane sau celule CHO și proteina de fuziune recombinantă OPG-Fc purificată cum s-a descris mai jos.

Ambele produse s-au donat direcțional în plasmidul vector pCEP4 (Invitrogen). pCEP4 conține originea replicării virusului Epstein-Barr și este capabil de replicare epizomală în celule 293-EBNA-1. Vectorii parental pCEP4, pCEP4-Fl.fc și pCEP4-CT.Fc s-au lipofectat în celule 293-EBNA-1, folosind metodele recomandate de producător. Apoi, celulele transfectate s-au selectat în 100 pg/ml higromicină pentru a selecta vector de expresie și masa culturilor rezultate rezistente medicament s-a crescut la confluență. Apoi, celulele s-au cultivat în medii lipsite de ser 72 h și mediul condiționat s-a îndepărtat și analizat prin SDSPAGE. O colorație argint a gelului poliacrilamidic detectează proteinele principale din mediul

RO 121386 Β1 condiționat produse de culturi 293 rezistente medicament. în mediile condiționate pCEP4- 1 FI.Fc și pCEP4-CT.fc, benzile unice ale mărimilor prezise au fost secretate abundent (vezi fig. 13B și 13C). Proteina de fuziune Fc de lungime întreagă s-a acumulat la o concentrație 3 ridicată arătând că ea poate fi stabilă. Ambele proteine de fuziune Fc s-au detectat prin anticorpi anti-uman lgG1 Fc (Pierce) pe western blot-uri, arătând că ele sunt produse OPG 5 recombinante.

Proteina de fuziune OPG-Fc de lungime întreagă s-a purificat prin cromatografie de 7 coloană Proteină-A (Pierce) folosind procedurile recomandate de producător. Apoi proteina s-a supus la analiza secvenței N-terminale prin degradare automată cu Edman cum s-a 9 descris în esență de Matsudaiara et al. (J. Biol. Chem. 262,10-35 (1987)). După 19 cicluri s-a citit următoarea secvență aminoacidă: 11

NH₂-E TLPPKYLHYDPETGHQLL -CO₂H (SEQ ID NR: 31)

Această secvență a fost identică la secvența aminoacidă OPG de șoarece prezisă 13 începând la restul aminoacid 22, sugerând că situl de clivaj lider mamifer natural este între resturile aminoacide Q21-E22 nu între Y31-D32, așa cum s-a prezis inițial. Experimentele 15 expresiei realizate în celule 293-EBNA cu pCEP4-FI.Fc și pCEP4-CT.Fc demonstrează că OPG este o proteină secretată și poate acționa sistemic pentru legarea ligandului său. 17

Proceduri similare celor folosite pentru construirea și exprimarea fuziunilor muOPG[22-180]-Fc și muOPG[22-401]-Fc s-au folosit pentru proteine de fuziune OPG-Fc 19 suplimentare de șoarece și umane.

cADN OPG murină care codifică aminoacizii 1-185 fuzionat la regiunea Fc a lgG1 21 uman [muOPG Ct(185).Fc] s-a construit după cum urmează. S-a amplificat cADN OPG murină de la plasmidul pRcCMV Mu Osteoprotegerină (descris în exemplul 5) folosind 23 următoarea pereche primer într-o reacție polimerazică de catenă cum s-a descris mai sus: 1333-82: 25

5-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NR: 32)

1133-80: 27

5-CTTCTGCGGCCG CAC ACA CGT TGT CAT GTG TTG C-3' (SEQ ID NR: 33)

Această pereche primer amplifică regiunea cADN OPG murină care codifică resturile 29 aminoacide 63-185 (corespondente la bp 278-645) ale cadrului de citire OPG cum s-a prezentat în fig. 9A. Primerul 3' conține un sit de restricție Notl care este compatibil cu situl Notl 31 în cadru al vectorului fuziunii Fc, pFcA3. De asemenea, produsul înconjoară un sit restricție unic localizat la bp 436. Produsul PCR amplificat s-a purificat, s-a clivat cu Notl și EcoRI, și 33 fragmentul restricției rezultate EcoRI-Notl s-a purificat. Vectorul pCEP4 care are insertul fuziunii OPG-Fc 1-401 murine s-a clivat cu EcoRI și Notl s-a purificat și s-a ligat la produsul 35 PCR generat mai sus. Vectorul de expresie rezultat bazat pCEP4 codifică resturi OPG 1-185 urmate direct de toți cei 227 resturi aminoacide ale regiunii Fc lgG1 uman. Vectorul fuziune 37 OPG Ι-185-Fc murină s-a transformat în celule 293, s-a selectat medicament și s-a produs mediu condiționat cum s-a descris mai sus. Produsul fuziunii OPG l-185.Fc secretat care 39 rezultă s-a purificat prin cromatografie de coloană Proteină-A (Pierce) folosind procedurile recomandate de producător. ADN OPG murin care codifică resturile aminoacide 1-194 41 fuzionat la regiunea Fc a lgG1 (muOPG Ct(194).Fc) s-a construit după cum urmează. S-a amplificat cADN OPG de șoarece de la plasmid pRcCMV Mu-Osteoprotegerină folosind 43 următoarele perechi de primeri:

1333-82: 45

5-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NR: 34)

1333-81: 47

5'-CCT CTG CGG CCG CCT TTT GCG TGG CTT CTC TGT T-3' (SEQ ID NR: 35)

I

RO 121386 Β1

Această pereche de primeri amplifică regiunea cADN OPG murină care codifică resturile aminoacide 70-194 (corespondente la bp 298-672) ale cadrului de citire OPG. Primerul 3' conține un sit de restricție Notl care este compatibil cu situl Notl în cadru al vectorului de fuziune Fc, pFcA3. Produsul, de asemenea înconjoară un sit unic EcoRI localizat la bp 436. Produsul PCR amplificat s-a donat în vectorul fuziunii OPG murin [1 -401] Fc cum s-a descris mai sus. Vectorul de expresie rezultat bazat pCEP4 codifică resturi OPG 1-194 urmate direct de toate cele 227 resturi aminoacide ale regiunii Fc lgG1 uman. Vectorul fuziunii OPG 1-194 murin.Fc s-a transfectat în celule 293, s-a selectat medicament și s-a produs mediu condiționat. Produsul fuziunii rezultate secretat, s-a purificat prin cromatografie de coloană Proteină-A (Pierce) folosind proceduri recomandate de producători.

ADN OPG uman care codifică aminoacizii 1-401 fuzionat la regiunea Fc a lgG1 uman ș-a construit după cum urmează. ADN OPG uman în plasmidul pRcCMV-hu osteoprotegerină (descris în exemplul 5) s-a amplificat folosind următorii primeri oligonucleotidici: 1254-90:

5-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3' (SEQ ID NR: 36) 1254-95:

5'-CCT CTG CGG CCG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG AAT GG-3' (SEQ ID NR: 37)

Produsul PCR rezultat codifică proteina OPG umană de lungime întreagă și crează un sit de restricție Notl care este compatibil cu situl Notl în cadru vectorul fuziunii Fc, FcA3. Produsul PCR s-a donat direcțional în vectorul plasmid pCEP4 cum s-a descris mai sus. Vectorul de expresie rezultat codifică resturile OPG umane 1-401 urmate direct de 227 resturi aminoacide ale regiunii Fc lgG1 uman. S-a produs mediu condiționat de la celule transfectate și selectate și produsul fuziunii huOPG FI.Fc s-a purificat prin cromatografie de coloană Proteină-A (Pierce) folosind procedurile recomandate de producători.

ADN OPG uman care codifică resturi aminoacide 1-201 fuzionate la regiunea Fc a lgG1 [huOPG Ct(201 ).Fc] s-a construit după cum urmează. S-a amplificat cADN OPG uman donat de la plasmidul pRcCMV-hu osteoprotegerină prin PCR folosind următoarea pereche de primer: 1254-90:

5'-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3' (SEQ ID NR: 38) 1254-92:

5-CCTCTG CGG CCG CCA GGG TAA CATCTA TTC CAC-31 (SEQ ID NR: 39)

Această pereche de primeri amplifică regiunea cADN OPG uman care codifică resturile aminoacide 1-201 ale cadrului de citire al OPG și creează un sit de restricție Notl la capătul 3' care este compatibil cu situl Notl în cadru al fuziunii Fc, FcA3. Acest produs când s-a legat la porțiunea Fc, codifică resturi OPG 1-201 urmate direct de toate cele 221 resturi aminoacide ale regiunii Fc lgG1 uman. Produsul PCR s-a donat direcțional în plasmidul vector pCEP4, cum s-a descris mai sus. S-a produs mediu condiționat de la celule transfectate și selectate medicament și produsele fuziunii hu OPG Ct(201).Fc s-au purificat prin cromatografie de coloană ProteinăA (Pierce) folosind procedurile recomandate de producător.

Următoarele proceduri s-au folosit pentru a construi și exprima OPG de șoarece și umană nefuzionată.

S-a generat un plasmid pentru expresie mamiferă a OPG murină de lungime întreagă (resturi 1-401) prim amplificare PCR a insertului cADN OPG murină de la pRcCMV MuOsteoprotegerină și s-a subclonat în vectorul de expresie pDSRa (DeClerck et al, J. Biol. Chem. 266, 3893 (1991)). S-au folosit următorii primeri oligonucleotidici: 1295-26: 5'- CCG AAG CTT CCA CCA TGA ACA AGT GGC TGT GCT GC-3’ (SEQ ID NR: 40) 1295-27:

5'-CCT CTG TCG ACT ATT ATA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G-3’ (SEQ ID NR: 41)

RO 121386 Β1

Cadrul de citire OPG murină de lungime întreagă a fost amplificat prin PCR cum s-a 1 descris mai sus. Produsul PCR s-a purificat și s-a digerat cu endonucleaze de restricție HindiII și Xbal (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN) în condițiile recomandate de produ- 3 cători, apoi s-a ligat la pDSRa digerat Hindlll și Xbal. Clonele recombinante s-au detectat prin digestie endonucleazică de restricție apoi s-au secvențat pentru a se asigura că nu s-au 5 produs mutații în timpul etapelor de amplificare PCR.

Plasmidul rezultat, pDSRoc-muOPG s-a introdus în celule ovariene de hamster 7 chinezesc (CHO) prin transfecție mediată calciu (Wigler et al., Cell, 11., 233 (1977)). S-au selectat colonii individuale pe baza expresiei genei dihidrofolat reductază (DHFR) în plasmi- 9 dul vector și s-au izolat câteva clone. Expresia proteinei recombinante OPG murină s-a monitorizat prin analiză western blot a mediului condiționat de celulă CHO. S-au selectat celule 11 cu expresie ridicată și expresia OPG a fost amplificată ulterior prin tratament cu metotrexat cum s-a descris (DeClerck et al., ibid). Mediul condiționat de la liniile de celule CHO a fost 13 produs pentru purificarea în continuare a proteinei recombinante OPG murină secretată.

S-a generat un plasmid pentru expresia mamiferă a OPG umană de lungime întreagă 15 (aminoacizi 1 -401) prin subclonarea insertului cADN din pRcCMV-hu Osteoprotegerină direct în vector pDSRa (DeClerck et al, ibid). Plasmidul pRcCMV-OPG s-a digerat până la termi- 17 nare cu Notl, s-a teșit la capete cu Klenow, apoi s-a digerat la terminare cu Xbal. Vectorul ADN s-a digerat cu Hindlll, s-a teșit la capete cu Klenow, s-a digerat cu Xbal și s-a ligat la 19 insertul OPG. Apoi, s-au secvențat plasmizi recombinanți pentru confirmarea orientării corecte a cADN OPG umană. 21

Plasmidul pDSRa-huOPG rezultat s-a introdus în celule ovariene de hamster chinezesc (CHO) cum s-a descris mai sus. S-au selctat colonii individuale pe baza expresiei 23 genei dihidrofolat reductază (DHFR) în plasmidul vector și s-au izolat câteva clone. Expresia proteinei recombinante OPG umană s-a monitorizat prin analiza western blot a mediului con- 25 diționat de celulă CHO. S-au selectat clone de expresie crescută și expresia OPG s-a amplificat în continuare prin tratament cu metotrexat. S-a produs mediu condiționat de la linii de 27 celule CHO pentru purificarea proteinei.

S-au construit vectori de expresie pentru OPG murină care codifică resturile 1-18529 după cum urmează. S-a amplificat cADN OPG murină de la pRcCMV-Mu OPG folosind următorii primeri oligonucleotidici: 1333-82:31

5-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-31 (SEQ ID NR: 42) 1356-12:33

5-CCT CTG TCG ACT TAACAC ACG TTG TCATGT GTT GC-31 (SEQ ID NR: 43)

Această pereche de primeri amplifică regiunea cADN OPG care codifică aminoacizii 35 63-185 ai cadrului de citire OPG (bp 278-645) și conține un codon stop artificial direct după codonul cisteină (C185), care este urmat de un sit de restricție endonucleazică Sall artificial. 37

Produsul prezis conține un sit de restricție intern EcoRI, util pentru subclonare într-un vector preexistent. După amplificare PCR, produsul purificat rezultat s-a clivat cu endonucleaze de 39 restricție EcoRI și Sall și fragmentul mare s-a purificat în gel. Apoi, produsul purificat s-a subclonat în fragmentul de restricție mare al unui digest EcoRI și Sall al pBluescript-muOPG 41 FI.Fc descris mai sus. Plasmidul rezultat s-a digerat cu Hindlll și Xhol și fragmentul mic s-a purificat în gel. Acest fragment, care conține un cadru de citire care codifică resturi 1-185 a 43 fost subclonat apoi într-un digest Hindlll și Xhol al vectorului de expresie pCEP4. Vectorul rezultat, pmuOPG [1-185] codifică o polipeptidă OPG truncată care se termină la un rest 45 cisteină localizat la poziția 185. S-a produs cum s-a descris mai sus mediu condiționat de la celule transfectate și selectate medicament. 47

RO 121386 Β1

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-31 (SEQ ID NR: 44) 1356-13:

5'-CCT CTG TGC ACT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TT-3' (SEQ ID NR; 45)

Această pereche de primeri amplifică regiunea cADN OPG murină care codifică aminoacizii 70-194 ai cadrului de citire (bp 298-672) și conține un codon stop artificial direct după codonul lizină (K194), care este urmat de un sit artificial endonuclează de restricție Sall. Produsul prezis conține un sit de restricție intern EcoRI util pentru subclonare într-un vector preexistent. După amplificare PCR, produsul rezultat purificat s-a clivat cu endonucleaze de restricție EcoRI și Sall și fragmentul mare s-a purificat în gel. Apoi, produsul purificat a fost subclonat într-un fragment de restricție mare al unui digest EcoRI și Sall al pBluescriptmuOPG FI.Fc descris mai sus. Plasmidul rezultat s-a digerat cu HindiiI și Xhol și fragmentul mic s-a purificat în gel. Acest fragment, care conține un cadru de citire deschis care codifică resturi 1-185, a fost apoi subclonat într-un digest Hindlll și Xhol al vectorului de expresie pCEP4. Vectorul care rezultă, pmuOPG [1-185], codifică o polipeptidă OPG truncată care se termină la o lizină la poziția 194. S-a produs mediu condiționat de la celule transfectate și selectate medicament cum s-a descris mai sus.

S-au generat câteva mutații la capătul 5' al genei huOPG [22-401 ]-Fc, care introduc fie substituții aminoacide, fie deleții aminoacide ale OPG între resturile 22 la 32. Toate mutațiile s-au generat cu QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA) folosind condițiile recomandate de producător. Pe scurt, s-au tratat amestecul de reacție conținând plasmid huOPG [22-401]-Fc matriță ADN și primerii mutagenici cu polimerază Pfu în prezența deoxinucleotidelor, apoi s-a amplificat într-un termocicler cum s-a descris mai sus. Apoi, o alicotă din reacție este transfectatăîn E.coliXLI-Blue competentă prin șoc termic și s-a etalat. Pentru verificarea mutației s-a secvențat ADN plasmid de la transformanți.

S-au folosit următoarele perechi de primeri pentru îndepărtarea resturilor 22-26 ale genei OPG umane rezultând producerea unei proteine de fuziune huOPG [27-401]-Fc: 143611:

5'-TGG ACC ACC CAG AAG TAC CTT CAT TAT GAC-3' (SEQ ID NR: 140) 1436-12:

5-GTC ATA ATG AGG GTA CTT CTG GGT GGT CCA-31 (SEQ ID NR: 141)

S-a folosit următoarea pereche de primeri pentru a îndepărta resturile 22-28 ale genei OPG umane, rezultând producerea unei proteine de fuziune huOPG [29-401]-Fc: 1436-17: 5'-GGA CCA CCC AGC TTC ATT ATG ACG AAG AAA C-3' (SEQ ID NR: 142) 1436-18:

5'-GTT TCT TCG TCA TAA TGA AGC TGG GTG GTC C-3' (SEQ ID NR: 143)

S-a folosit următoarea pereche de primeri pentru a îndepărta resturile 22-31 ale genei OPG umane, rezultând producerea unei proteine de fuziune huOPG [32-401]-Fc: 1436-27: 5'-GTG GAC CAC CCA GGA CGA AGA AAC CTC TC-3' (SEQ ID NR: 144) 1436-28:

5'-GAG AGG TTT CTT CGT CCT GGG TGG TCC AC-3' (SEQ ID NR: 145)

Următoarea pereche de primeri s-a folosit pentru schimbarea codonului pentru restul tirozină 28 la fenilalanină al genei OPG umane rezultând producerea unei proteine de fuziune huOPG [22-401]-Fc Y28F: 1436-29:

5-CGT TTC CTC CAA AGT TCC TTC ATT ATG AC-3' (SEQ ID NR: 146) 1436-30:

5'-GTC ATA ATG AAG GAA CTT TGG AGG AAA CG-3' (SEQ ID NR: 147)

RO 121386 Β1

Următoarea pereche de primeri s-a folosit pentru schimbarea codonului pentru restul 1 pralină 28 la alanină al genei OPG umane rezultând producerea unei proteine de fuziune huOPG [22-40 IJ-FcP26A: 1429-83: 3

5-GGA AAC GTT TCC TGC AAA GTA CCT TCATTATG-3' (SEQ ID NR: 148) 1429-84: 5

5-CAT AAT GAA GGT ACT TTG CAG GAA ACG TTT CC-3' (SEQ ID NR: 149)

Fiecare plasmid rezultat muOPG [22-401]-Fc care conține mutația corespunzătoare 7 a fost apoi transfectat în celule umane 293 și proteina de fuziune mutantă OPG-Fc s-a purificat din mediu condiționat cum s-a descris mai sus. Activitatea biologică a fiecărei proteine 9 s-a analizat în testul in vitro de formare osteoclast descris în exemplul 11.

Exemplul 8. Expresia OPG în E.coli A. 11

Vectori bacterieni de expresie PAMG21

Plasmidul de expresie pAMG21 poate fi derivat de la vectorul de expresie Amgen 13 pCFM1656 (ATCC #69576) care în schimb poate fi derivat de la sistemul de expresie Amgen descris în brevetul US 4710473. Plasmidul pCFM1656 poate fi derivat de la plasmidul 15 pCFM836 (US 4710473) prin: (a) distrugerea celor 2 situri de restricție endogene Ndel prin completarea capătului cu enzimă T4 polimerază urmată de teșirea capătului și ligare; (b) 17 înlocuirea secvenței ADN dintre siturile de restricție unice Aatll și Clal care conțin promotorul sintetic PL cu un fragment similar obținut de la pCFM636 (brevet 4 710 473) care conține 19 promotorul PL

Aatll 21

5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT3'TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGT 23

ATA25 -AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAATTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT- 27

-TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3' (SEQID NR: 53)29

-ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC 5' (SEQ ID NR: 54)

Clal31 și apoi (c) substituirea secvenței ADN mici dintre siturile de restricție unice Clal și Kpnl cu următoarea oligonucleotidă:33

5' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3' (SEQ ID NR: 48)35

3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' (SEQ: ID NR: 49)37

Clal Kpnl

Plasmidul de expresie pAMG21 poate fi derivat apoi de la pCFM1656 făcând o serie 39 de schimbări de bază direct în sit prin oligo mutageneză PCR de suprapunere și substituții de secvență AND. începând cu situl Bgll (bp #180 plasmid) imediat 5' la promotorul PcopB 41 al replicării plasmidului și procedând spre genele replicării plasmidului, schimbările de perechi de baze sunt după cum urmează: 43

RO 121386 Β1

DAMG21bp#	bp în pCFM1656	bp schimbată la în pAMG21
#204	T/A	C/G
#428	A/T	G/C
#509	G/C	A/T
#617		insert 2 bp G/C
#679	G/C	T/A
#980	T/A	C/G
#994	G/C	A/T
#1004	A/T	C/G
#1007	C/G	T/A
#1028	A/T	T/A
#1047	C/G	T/A
#1178	G/C	T/A
#1466	G/C	T/A
#2028	G/C	deleție bp
#2187	C/G	T/A
#2480	A/T	T/A
# 2499-2502	AGTG TCAC	GTCA CAGT
#2642	TCCGAGC AGGCTCG	deleție 7 bp
#3435	G/C	A/T
#3446	G/C	A/T
#3643	A/T	T/A

Secvența ADN dintre siturile de restricție unice Aatll (poziția # 4364 din pCFM1656) și Sacii (poziția # 4585 din pCFM1656) este substituită cu următoarea secvență ADN:

RO 121386 Β1 [capfit adeziv Aatll] 5' GCGTAACGTATGCATGGTCTCC(poziție # 4358 în pAMG21) 3TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGG5

-CCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT-GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA7

-GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGC-CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCG-CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGC-GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG-11

-CATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGT-GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTACCGG AAAAACGCA-13

Aatll -TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC- AAG ATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCATGAATTG- ¹⁵

-TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACTTTGGCAGC--| 7

-AAAAITrCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATnTAACGAAATCTTTATGAAACGTCG-GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGCGCTTAC-19

-CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCACGCGAATG-TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTnTCCTTCGCATGCCCACGCTAAAC- ²¹ .ATGTCGGATTATAAAAACTTTATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGOTGCGATTTG-ATTCTTTTTCTCTTrTGGTTAAATCGTTGTTTGATTTATTATTTGCTATATTTATTTTTC- ²³

-TAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGCAACAAACTACCCTAATAAACGATATAAATAAAAAG-

-GATAATTATCAACTAGAGAAGGAACAATTAATGGTATGTTCATACACGCATGTAAAAATA-CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACATTTTTAT-

-AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT-TTGATAGATATATCAACAOAAAGAGACTTACACGTTTTGATTCGTAAGGCTTCGGTAATA-29

-TAOCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACCTGATGATTTCGCTTCTTTAA-ATCGTCATACTTATCCCTTTGATTTGGGTCACTATTCTGGACTACTAAGCGAAGAAATT-31

-TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTGAATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTCGTAACAAAAGTTTATATAAGGTTATTAGCCAC-AATGATTGGAGTTAGâATAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTCATCAT-TTACTAACCTCAATCTTATTAG ATGATATCCTAGTATAAAΑΤΑATITAATCGC AGTAGT A-AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAG-37

-TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTTGGTATC-AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG-39

-TTACTCCTATTTACTAGCGTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTC-AT AAGCATTGATTAATATC ATTATTGCTTCTAC AGGCTTTAATTTTATTAATTATTCTGT-TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATGTCCGAAATTAAAATAATTAATAAOACA43 -AAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCTTTATCCTTACCTATTGTTTGTC-TTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG45

RO 121386 Β1

-GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAACGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAA-CGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT-ATTGGATTTTTGTCaCaCTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTG-TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTACAAATTGTATTCATGGAC-TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATT-ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA-CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGA-GATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTSacii -GACTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAA-CGAGTGATCACAOCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTT-GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATA-CTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTAT-ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTnTTTGCTGAAAGGAGG-TGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCTCC-AACCGCTCTTCACGCTCTTCACGC 3' (Sacii capăt adeziv] (SEQ ID NR.50)

-TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5· (poziție #5904 în pAMG21) (SEQIDNR:46) în timpul ligării capetelor adezive ale acestei secvențe ADN de substituție siturile exterioare Aatll și Sacii sunt ditruse. Există situri unice Aatll și Sacii în ADN-ul substituit.

pAMG22-His

Plasmidul de expresie pAMG22-His poate fi derivat de la vectorul de expresie Amgen, pAMG22 prin substituirea secvenței ADN mici dintre siturile de restricție unice Ndel (#4795) și EcoRI (#4818) ale pAMG22 cu următorul duplex oligonucleotidic: Ndel Nhel EcoRI

5' TATGAAACATCATCACCATCACCATCATGCTAGCGTTAACGCGTTGG 3' (SEQ ID NR: 51)

3' ACTTTGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACGATCGCAATTGCGCAACCTTAA 5' (SEQ ID NR: 52)

MetLysHisHisHisHisHisHisHisAlaSerValAsnAlaLeuGlu (SEQ ID NR: 168)

PAMG22

Plasmidul de expresie pAMG22 poate fi derivat de la vectorul de expresie Amgen, pCFM1656 (ATCC #69576) care în schimb poate fi derivat de la sistemul vector de expresie Amgen descris în brevetul US 4710473 acordat pe 1 decembrie 1987. Plasmidul pCFM1656 poate fi derivat de la plasmidul pCFM836 descris (US 4710 473) prin: (a) distrugerea celor două situri de restricție Ndel endogene prin completarea capătului cu enzimă T4 polimerază urmată de teșirea capătului și ligare; (b) înlocuirea secvenței ADN dintre siturile de restricție unice Aatll și Clal, care conțin promotorul PL sintetic cu un fragment similar obținut de la pCFM636 (brevet 4 710 473) care conține promotorul PL

Aatll

5’ CTAAITCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT3’TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGAAACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA-AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA-TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT-TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3' (SEQ ID NR:53)

-ATGGTGACCGCCACTATGACTGGTGTAGC 5’ (SEQIDNR:54)

Clal

RO 121386 Β1 și apoi (c) substituirea secvenței ADN mici dintre siturile de restricție unice Clal și Kpnl cu următoarea oligonucleotidă:

5’ CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3’ (SEQIDNR.-55)

3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' (SEQ ID NR:56)

Clal Kpnl

Plasmidul de expresie pAMG22 poate fi apoi derivat de la pCFM1656 făcând o serie de schimbări de bază direct în sit prin oligo mutageneză PCR de suprapunere și substituții de secvență ADN. începând cu situl Bglll (bp #180 plasmid) imediat 5' la promotorul PcopB replicării plasmidului și procedând spre genele de replicare plasmid schimbările de perechi de baze sunt după cum urmează:

pAMG22bp#	bp în pCFM1656	bp schimbată la în pAMG22
#204	T/A	C/G
#428	A/T	G/C
#509	G/C	A/T
#617	--	insert 2 bp G/C
#679	G/C	T/A
#980	T/A	C/G
#994	G/C	A/T
#1004	A/T	C/G
#1007	C/G	T/A
#1028	A/T	T/A
#1047	C/G	T/A
#1178	G/C	T/A
#1466	G/C	T/A
#2028	G/C	deleție bp
#2187	C/G	T/A
#2480	A/T	T/A
# 2499-2502	AGTG TCAC	GTCA CAGT
#2642	TCCGAGC AGGCTCG	deleție 7 bp
#3435	G/C	A/T
#3446	G/C	A/T
#3643	A/T	T/A

RO 121386 Β1

Secvența ADN dintre siturile de restricție unice Aatll (poziție #4364 în pCFM1656) și Sacii (poziție #4585 în pCFM1656) este substituită cu următoarea secvență ADN: [capăt adeziv Aatll] (poziție #4358 în pAMG22)

5’ gcgtaacgtatgcatggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaa3’TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGGGGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTT-ATAAAACGAAAGGATCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCrGTTGTTTGTCGGTG-TATTTTGCTTTCCGAGTCAGCITTCTGACCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCAC-AACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGG-TTGCGAGAGGACTCATCCrGTTTAGGCGGCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCC-CCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCGGTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTC-GCCATCCTGACGGATGGCCTrnTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAAT-CGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAGATTTAAatll

-ACATTCAAATATGGACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTC-TGTAAGTTTATACCTGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAG-TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGTTT-AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGATCTAAACrCA-TAACTAATTAAAGGAGGAAT/KACATATGGTTAACGGGTTGGAATTCGAGCTCACTAGTGT-ATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCACASacii

-CGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAGAA-GCTGGACGTCCCATGGTACX2TTCOAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTTCTTCTTCTTCTT-GAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACC-CTTTCGGGCnTCCrrcGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATTGG-CCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTTCA-GGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCCTTGGCGAGAAGT-CGCTCTTCACGC 3' (SEQIDNR:58)

-GCGAGAAGTG 5’ (SEQIDNR:57) [Sacii capăt adeziv] (poziția # 5024 în pAMG22) în timpul ligării capetelor adezive ale acestei substituții de secvență ADN siturile exterioare Aatll și Sacii sunt distruse. Există situri unice Aatll și Sacii în ADN-ul substituit.

B. OPG Met r32-4011 umană în exemplu, s-a folosit vectorul de expresie pAMG21, un derivat al pCFM1656 (ATCC # 69576) care conține situri de restricție corespunzătoare pentru inserția genelor în aval de promotorul lux PL. (Vezi US 5169318 pentru descrierea sistemului de expresie lux). Celula gazdă folosită a fost GM120 (ATCC număr de acces 55764). Această gazdă are promotorul laclQ și gena Iaci integrate într-un al doilea sitîn cromozomul a unei gazde prototrofice E.coli K12. Alți vectori de expresie E.coli folosiți de obicei și celule gazdă sunt de asemenea adecvate pentru expresie.

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și aminoacizii 32-401 ai polipeptidei OPG umană sub controlul promotorului luxPRîn plasmidul vector de expresie pAMG21 după cum urmează. Pentru a realiza aceasta, PCR folosind oligonucleotidele #1257-20 și #1257-19 ca primeri s-a realizat folosind ca o matriță plasmid ADN pRcCMV-Hu OPG care conține cADN OPH umană și termociclare 30 de cicluri fiecare ciclu fiind: 94°C pentru 20 s, urmat de 37”C pentru 30 s, urmat de 72°C pentru 30 s. Proba PCR rezultată s-a separat pe un gel de agaroză, produsul PCR s-a excizat, s-a purificat și s-a

RO 121386 Β1 restricționat cu endonucleaze de restricție Kpnl și BamHI și s-a purificat. Oligonucleotidele 1 sintetice #1257-21 și #1257-22 s-au fosforilat individual folosind T4 polinucleotid kinază și ATP și apoi s-au amestecat, s-au încălzit la 94*C și s-au lăsat să se răcească încet la 3 temperatură camerei pentru a forma un duplex oligonucleotidic linker care conține capete adezive Ndel și Kpnl. Duplexul linker fosforilat format între oligonucleotide #1257-21 și 5 #1257-22, conținând capete coezive Ndel și Kpnl (vezi, fig. 14A) și produs PCR digerat Kpnl și BamHI generat folosind primeri oligonucleotidici #1257-20 și #1257-19 (vezi mai sus) s-a 7 inserat direcțional între 2 situri ale plasmidului vector pAMG21, și anume, situl Ndel și BamHI folosind metodologia ADN recombinant standard (vezi, fig. 14A și secvențele de mai jos). 9 Linkerul sintetic a utilizat codoni E.coli și a asigurat o metionină N-terminală.

S-au selectat 2 clone și s-a izolat plasmid ADN și insertului OPG umană I s-a 11 confirmat în continuare secvența ADN. Plasmidul rezultat pAMG21 care conține aminoacizi 32-401 ai polipeptidei OPG umană precedați imediat în cadru printr-o metionină este denumit 13 pAMG21-huOPG met [32-401] sau pAMG21-huOPG met [32-401].

Oligo# 1257-1915

5'-TACGCACTGGATCCTTATAAGCAGCTTATTTTTACTGATTGGAC-3' (SEQ ID NR: 59) Oligo #1257-2017

5'-GTCCTCCTGGTACCTACCTAAAACAAC-3‘ (SEQ ID NR: 60)

Oligo #1257-2119

5'-TATGGATGAAGAAACTTCTCATCAGCTGCTGTGTGATAAATGTCCGCCGGGTAC-3' (SEQ IDNR: 61)21

Oligo #1257-22 5'-CCGGCGGACATTTATCACACAGCAGCTGATGAGAAGTTTCTTCATCCA-3'23 (SEQ ID NR: 47)

Culturile pAMG21 -huOPG met [32-401 ] în E.coliGM120 în mediu 2XYT care conține25 ug/ml kanamicină s-au incubat la 30*C înaintea inducției. Inducția expresiei produsului genei huOPG met [32-401] de la promotorul luxPR s-a atins după adăugarea autoindu- 27 cătorului sintetic N-(3-oxohexanoil)-DL-homoserin lactonă la mediu de cultură la o concentrație finală de 30 ng/ml și culturile s-au incubat fie la 30*C, fie la 37*C pentru încă 6 h. După 29 6 h, culturile bacteriene s-au examinat prin microscopie pentru prezența corpilor de incluziune și apoi au fost peletați prin centrifugare. S-au observat corpi de incluziune refractili în 31 culturi induse arătând că s-a produs ceva din produsul genei recombinante huOPG met [32401] insolubil în E.coli. Câteva pelete bacteriene s-au resuspendat în 10 mM Tris-HCI/pH 33 8,1 mM EDTA și s-au lizat direct prin adăugare de 2x tampon probă Laemlli la la Ix final și p-mercaptoetanol la o concentrație finală 5% și s-au analizat prin SDS-PAGE. S-a observat 35 o bandă colorată coomassie substanțial mai intens de aproximativ 42 kDa pe un gel SDSPAGE conținând lizate celulare totale al culturilor induse 30‘C și 37’C, față de traseu 2 care 37 este un lizat celular total al unei culturi de 30’C neinduse (fig. 14B). Produsul așteptat al genei va fi de 370 aminoacizi în lungime și are o greutate moleculară așteptată de circa 39 42,2 kDa. După inducere la 37’C pentru 6 h o cultură suplimentară s-a peletat și fie s-a prelucrat pentru izolarea corpilor de incluziune (vezi mai jos), fie s-a prelucrat prin microfluidi- 41 zare. Peletul prelucrat pentru microfluidizare s-a resuspendat în 25 mM Tris-HCI/pH 8, tampon NaCI 0,5M și s-a trecut de 20 ori printr-un Microfluidizer Model 1108 (Microfluidics 43 Corp.) și s-a colectat. S-a îndepărtat un alicot din proba colectată (lizat total microfluidizat) și restul s-a peletat la 20000xg pentru 20 min. Supernatantul după centrifugare s-a îndepărtat 45 (fracție solubilă microfluidizată) și peletul s-a resuspendat într-o soluție 25 mM T ris-HCI/pH 8, 0,5 M NaCI, 6M uree (fracțiune microfluidizată insolubilă). La un alicot al fracției totale 47

RO 121386 Β1 solubile s-a adăugat fracțiunea insolubilă la un volum egal 2x tampon probă Laemlli și P-mercaptoetanol, la concentrație finală 5%. Apoi, probele s-au analizat prin SDS-PAGE. O cantitate semnificativă de produs al genei recombinante huOPG met [32-401] s-a găsit în fracțiunea insolubilă. Pentru purificarea proteinei recombinante corpii de incluziune s-au purificat după cum urmează: celule bacteriene s-au separat de mediu prin centrifugare gradient de densitate într-o centrifugă Beckman J-6B echipată cu un rotor JS-4,2 la 4900xg pentru 15 min la 4*C. Peletul bacterian s-a resuspendat în 5 ml apă și apoi s-a diluat la un volum final de 10 ml cu apă. Această suspensie s-a transferat la o cupă din oțel inoxidabil răcită în gheață și s-a supus la distrugere sonică folosind un Branson Sonifier echipat cu o duză standard (putere reglată=5, sarcină ciclu=95%, 80 impulsuri). Suspensia celulară sonicată s-a centrifugat într-o ultracentrifugă Beckman Optima TLX echipată cu un rotor TLA 100,3 la 195000xg pentru 5 la 10 min la 23’C. Supernatantul s-a aruncat și peletul s-a clătit cu un curent de apă dintr-un balon cu jet. Peletele s-au colectat prin radare cu o microspatulă și s-au transferat la un omogenizator de sticlă (capacitate 15 ml). S-au adăugat 5 ml de soluție Percoll (75% lichid Percoll, 0,15 M clorură de sodiu) la omogenizator și conținuturile s-au omogenizat până când s-au suspendat uniform. Volumul s-a crescut la 19,5 ml prin adăugare de soluție Percoll, s-au amestecat și repartizat în 3 eprubete Beckman Quick-Seal (13x32 mm). Eprubetele s-au închis urmând instrucțiunile producătorilor. Eprubetele s-au rotit într-un rotor Beckman TLA 100,3 la 23’C, 20000 rpm (21600xg), 30 min. Eprubetele s-au examinat pentru aspectul de sedimentare corespunzător. Pentru recuperarea corpilor refractili s-au recuperat fracțiuni de gradient și s-au colectat, apoi s-au diluat cu apă. Corpii de incluziune s-au peletat prin centrifugare și s-a estimat concentrația proteinei după SDSPAGE.

Un alicot al corpilor de incluziune izolat cum s-a descris mai jos s-a dizolvat în Ix tampon probă Laemlli cu 5% β-mercaptoetanol și s-a separat pe un gel SDS-PAGE și corpii de incluziune izolați asigură un produs al genei recombinante huOPG met [32-401] înalt purificat. Banda principală de -42 kDa observată după separarea corpilor de incluziune pe un gel SDS-poliacrilamină s-a excizat dintr-un gel separat și s-a determinat secvența aminoacidă N-terminală în esență așa cum s-a descris (Matsudaiara et al., J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). După 19 cicluri s-a determinat următoarea secvență:

NH₂-MDEETSHQLLCDKCPPGTY-COOH (SEQ ID NR: 62)

Această secvență s-a dovedit a fi identică primilor 19 aminoacizi codificați prin vectorul de expresie pAMG21 Hu-OPG met [32-401], produs printr-un rest metionină asigurat de către vectorul de expresie bacterian.

C. OPG met r22-4011 umană

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și aminoacizii 22 la 401 ai OPG umană sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotic pAMG21 după cum urmează. Plasmid ADN izolat al pAMG21-huOPG [32-401] (vezi Secțiunea B) s-a clivat cu endonucleaze de restricție Kpnl și BamHI și fragmentele separate s-au separat pe un gel de agaroză. Fragmentul B (fragmentul de -1064 bp) s-a izolat din gel folosind metodologia standard. S-au fosforilat individual oligonucleotidele sintetice (oligos) #1267-06 și #1267-07 și s-au lăsat să formeze un duplex oligo linker, care a conținut capete coezive Ndel și Kpnl, folosind metode descrise în Secțiunea B. Duplexul linker sintetic a utilizat codoni E.coli și a asigurat o metionină N-terminală. Oligo linkerul fosforilat care conține capete coezive Ndel și Kpnl și fragmentul izolat de -1064 bp al pAMG21-huOPG met [32-401] digerate cu endonucleaze de restricție Kpnl și BamHI s-au inserat direcțional între siturile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind metodologia

RO 121386 Β1

ADN recombinant standard. Ligarea amestecului s-a transformat în gazdă E.coli 393 prin 1 electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei huOPG-met [22- 3

401],

Oligo #1267-065

5'-TAT GGA AAC TTT TCC TCC AAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TTC TCA TCAGCTGCTGTGTGATAAATGTCCGCCGGGTAC-3’ (SEQ ID NR: 63)7

Oligo #1267-07

5'-CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAG AAG TTT CTT CAT CAT AAT 9 GAA GAT ATT TTG GAG GAA AAG TTT CCA-3* (SEQ ID NR: 64)

Culturi de pAMG21-huOPG-met [22-401] în gazdă Ecoli 393 s-au plasat în mediu11

2XYT care conține 20 pg/ml kanamicină și s-au incubat la 30‘C înainte de inducție. Inducția expresiei produsului genei recombinante de la promotorul luxPR al vectorului s-a atins după 13 adăugarea autoinducătorului sintetic N-(3-oxohexanoil)-DL-homoserin lactonă la mediul de cultură la o concentrație finală de 30 ng/ml și incubare fie la 30’C, fie la 37’C pentru încă 6 h. 15 După 6 h, culturile bacteriene s-au peletat prin centrifugare (=30*C 1 +6 sau 37’C 1 +6). Culturile bacteriene au fost, de asemenea peletate fie chiar înaintea inducerii (=30*C Prel) fie 17 alternativ, nu s-a adăugat autoinducător la o cultură separată care s-a lăsat la incubat la 30’C pentru încă 6 h pentru a obține o cultură neindusă (UI) (=30*C UI). Peletele bacteriene 19 ale culturilor, fie 30’C Prel, 30*C UI, 30’C 1+6, fie 37’C 1+6 s-au resuspendat, s-au lizat și s-au analizat prin electroforeză SDS-gel poliacrilamidă (PAGE) cum s-a descris în Secțiunea 21

B. Gelurile poliacrilamidice, s-au colorat cu coomassie blue și/sau Western, s-au transferat la nitroceluloză și s-au imunosondat cu anticorp policlonal iepure anti-mu OPG-Fc, cum s-a 23 descris în exemplul 10. Nivelul produsului genei după inducție s-a comparat, fie la o probă neindusă (30’C UI), fie la o probă pre-indusă (30’C Prel). 25

D. OPG met [22-401] murină

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și 27 aminoacizii 22 la 401 ai polipeptidei (mu) OPG (OPG) murină sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. S-a 29 realizat PCR folosind ca primeri oligonucleotidele #1257-16 și #1257-15, plasmid ADN pRcCMV-Mu OPG ca o matriță și condiții de termociclare cum s-au descris în Secțiunea B. 31 Produsul PCR s-a purificat și clivat cu endonucleaze de restricție Kpnl și BamHI cum s-a descris în Secțiunea B. Oligonucleotidele sintetice #1260-61 și #1260-82 s-au fosforilat 33 individual și s-au lăsat să formeze un oligo duplex linker cu capete coezive Ndel și Kpnl folosind metode descrise în Secțiunea B. Duplexul linker sintetic a folosit codoni E.coli și a 35 asigurat o metionină N-terminală. Duplexul linker fosforilat format între oligonucleotidele #1260-61 și #1260-82 care conține capete coezive Ndel și Kpnl și produsul PCR digerat Kpnl 37 și BamHI și purificat generat folosind primeri oligo #1257-16 și #1257-15 s-au inserat direcțional între șirurile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind metodologia standard. 39 Amestecul de ligare s-a transformat în gazdă E.coli393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN 41 pentru verificarea secvenței ADN a genei MuOPG met [22-401].

Expresia polipeptidei recombinante muOPG met [22-401] din culturi de celule 39343 care adăpostesc plasmid pAMG21-MuOPG met [22-401] după inducție s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.45

Oligo #1257-15 5'-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTC ACG GAT TGA AC-3'47 (SEQ ID NR: 65)

RO 121386 Β1

Oligo #1257-16

5-GTG CTC CTG GTACCT ACC TAA AAC AGC ACT GCACAGTG-3' (SEQ ID NR: 66) Oligo #1260-61

5'-TAT GGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA CGA TCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC GGG TAC-3' (SEQ ID NR: 67) Oligo #1260-82

5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CCA-3' (SEQ ID NR: 68)

E. OPG met [32-401] murină

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și aminoacizii 32 la 401 ai OPG murine sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. Pentru a realiza aceasta, oligonucleotidele sintetice #1267-08 și #1267-09 s-au fosforilat individual și s-au lăsat să formeze un oligo duplex linker cu capete coezive Ndel și Kpnl folosind metode descrise în Secțiunea B. Duplexul linker sintetic a folosit codoni E.coliși a asigurat o metionină N-terminală. Duplexul linker fosforilat format între; oligonucleotidele #1267-08 și #1267-09 care conține capete coezive Ndel și Kpnl și produsul PCR digerat Kpnl și BamHI și purificat descris mai devreme s-au inserat direcțional între siturile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind metodologia standard. Amestecul de ligare s-a transformat în gazdă E.coli393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei muOPG met [32-401].

Expresia polipeptidei recombinante muOPG met [32-401] din culturi de celule 393 care adăpostesc plasmid pAMG21-MuOPG met [22-401] după inducție s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.

Oligo #1267-08 5-TAT GGACCC AGA AAC TGG TCATCAGCT GCT GTG TGATAA ATG TGCTCC GGG TAC-3' (SEQ ID NR: 69)

Oligo #1267-09 5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CTG GGT CCA-3' (SEQ ID NR: 70)

F. OPG met-lys [22-401] murină

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală urmată de un rest Uzină și aminoacizii 22 la 401 ai OPG murine sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. Oligonucleotidele sintetice #1282-95 și #1282-96, s-au fosforilat individual și s-au lăsat să formeze un oligo duplex linker folosind metode în Secțiunea B. Duplexul linker sintetic a folosit codoni E.coliși a asigurat o metionină N-terminală. Duplexul linker fosforilat format între oligonucleotidele #1282-95 și #1282-96 care conține capete coezive Ndel și Kpnl și produsul PCR digerat Kpnl și BamHI și purificat descris în Secțiunea D, s-au inserat direcțional între siturile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind metodologia standard. Amestecul de ligare s-a transformat în gazdă E.coli 393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei MuOPG- -Met-Lys [22-401].

Expresia polipeptidei recombinante MuOPG Met-Lys [22-401] din celule 393 transformate care adăpostesc plasmid pAMG21 după inducție s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.

RO 121386 Β1

Oligo #1282-951

5'-TAT GAA AGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA CGA TCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC TCC GGG TAC-3' (SEQ ID NR: 71)3

Oligo #1282-96

5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT5

GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT TCA-3' (SEQ ID NR: 72)

G. OPG met-lys-(his), [22-401] murină7

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru resturi N-terminale Met-Lys-His-HisHis-His-His-His-His (=MKH) urmate de aminoacizii 22 la 401 ai OPG murine sub controlul 9 promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. S-a realizat PCR folosind ca primeri oligonucleotidele #1300-50 și #1257-15, plas- 11 mid ADN pAMG21 -muOPG-met [22-401 ] ca o matriță. Condițiile de termociclare au fost cum s-au descris în Secțiunea B. Proba PCR rezultată s-a separat pe un gel de agaroză, produsul 13

PCR s-a excizat, s-a purificat și clivat cu endonucleaze de restricție Ndel și BamHI și s-a purificat. Produsul PCR digerat Ndel și BamHI și purificat generat folosind primeri oligonu- 15 cleotidici #1300-50 și #1257-15 s-a inserat direcțional între siturile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind metodologia standard. Amestecul de ligare s-a transformat în gazdă E.coli 17

393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei 19 muOPG-MKH [22-401].

Expresia polipeptidei recombinante MuOPG-MKH [22-401] din culturi de celule 39321 care adăpostesc plasmid pAMG21 după inducție s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.23

Oligo #1300-50

5'-GTT CTC CTC ATA TGA AAC ATC ATC ACC ATC ACC ATC ATG AAA CTC TGC CTC25

CAA AAT ACC TGC ATT ACG AT-3' (SEQ ID NR: 73)

Oligo #1257-15 (vezi, Secțiunea D)27

H. OPG met-lys [22-401] (MsY, murină

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru resturi Met-Lys N-terminale, 29 aminoacizii 22,1a 401 ai OPG murine și 7 resturi histidină care urmează aminoacidul 401 (=muOPG MK [22.401]¾). sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie 31 procariotică pAMG21 după cum urmează. S-a realizat PCR folosind ca primeri oligonucleotidele #1300-49 și #1300-51 și plasmid ADN pAMG21-muOPG-met [22-401] ca o matriță. 33 Condițiile de termociclare au fost cum s-au descris în Secțiunea B. Proba PCR rezultată s-a separat pe un gel de agaroză, produsul PCR s-a excizat, s-a purificat, s-a restricționat cu 35 endonucleaze de restricție Ndel și BamHI și s-a purificat. Produsul PCR digerat Ndel și BamHI și purificat s-a inserat direcțional între siturile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind 37 metodologia standard. Amestecul de ligare s-a transformat în gazdă E.coli 393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a 39 realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei muOPG-MK [22-401 ]-H₇.

Expresia polipeptidei recombinante muOPG-MK-[22-401]-H₇ din celule 393 transfer-41 mate care adăpostesc plasmid pAMG21 după inducție s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.43

Oligo #1300-49 5'-GTT CTC CTC ATA TGA AAG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC A-3'45 (SEQ ID NR: 74)

Oligo #1300-5147

5'-TAC GCA CTG GAT CCT TAA TGA TGG TGA TGG TGA TGA TGT AAG CAG CTT ATT TTC ACG GAT TGA ACC TGA TTC CCT A-3' (SEQ ID NR: 75)49

RO 121386 Β1

I. OPG met [27-401] murină

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și aminoacizii 27 la 401 ai OPG murine sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. S-a realizat PCR folosind cu oligonucleotidele #13 09-74 și #1257-15 și plasmid ADN pAMG21-muOPG-met [22-401] ca matriță. Condițiile de termociclare au fost cum s-au descris în Secțiunea B. Proba PCR rezultată s-a separat pe un gel de agaroză, produsul PCR s-a excizat, s-a purificat și clivat cu endonucleaze de restricție Ndel și BamHI și s-a purificat. Produsul PCR digerat Ndel și BamHI și purificat s-a inserat direcțional între siturile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind metodologia standard. Amestecul de ligare s-a transformat în gazdă E.coli 393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei muOPG-met [27-401].

Expresia polipeptidei recombinante MuOPG-met [27-401] din culturi 393 transfectate care adăpostesc plasmid pAMG21 după inducție s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C. Oligo #1309-74

5-GTT CTC CTC ATA TGA AAT ACC TGC ATT ACG ATC CGG AAA CTG GTC AT-3' (SEQ ID NR: 76)

Oligo #1257-15 (vezi Secțiunea D)

J. OPG met T27-4011 umană

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și aminoacizii 27 la 401 ai OPG umane sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. S-a realizat PCR folosind ca primeri oligonucleotidele #1309-75 și #1309-76, plasmid ADN pAMG21-huOPG-met [22-401] ca matriță. Condițiile de termociclare au fost cum s-au descris în Secțiunea B. Proba PCR rezultată s-a separat pe un gel de agaroză, produsul PCR s-a excizat, s-a purificat și s-a restricționat cu endonucleaze de restricție Asel și BamHI și s-a purificat. Produsul PCRde mai sus, digerat Asel și BamHI și purificat s-a inserat direcțional între siturile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind metodologia standard. Amestecul de ligare s-a transformat în gazdă E.coli 393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei huOPG-met [27-401].

Expresia polipeptidei recombinante huOPG-met [27-401] după inducția celulelor 393 transfectate care adăpostesc plasmid pAMG21 s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.

Oligo #1309-75

5'-GTT CTC CTA TTA ATG AAA TAT CTT CAT TAT GAT GAA GAA ACT T-3' (SEQ ID NR: 77) Oligo #1309-76 5'-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTT ACT GAT T-3' (SEQ ID NR: 78)

K. OPG met [22-180] murină

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și aminoacizii 22 la 180 ai OPG murine sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. S-a realizat PCR cu oligonucleotidele #1309-72 și #1309-73 și plasmid ADN pAMG21-muOPG-met [22-401] ca matriță. Condițiile de termociclare au fost cum s-au descris în Secțiunea B. Proba PCR rezultată s-a separat pe un gel de agaroză, produsul PCR s-a excizat, s-a purificat, s-a restricționat cu endonucleaze de restricție Ndel și BamHI și s-a purificat. Produsul PCR, de mai sus, digerat Ndel și

RO 121386 Β1

BamHI și purificat s-a inserat direcțional între șirurile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind 1 metodologia standard. Ligarea s-a transformat în gazdă E.co//393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat 3 secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei muOPG-met [22-180].

Expresia polipeptidei recombinante muOPG-met [22-180] din culturi 393 transformate5 care adăpostesc plasmid recombinant pAMG21 după inducție, s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.7

Oligo #1309-72

5-GTT CTC CTC ATA TGG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC A-3’9 (SEQ ID NR: 79)

Oligo #1309-7311

5-TAC GCA CTG GAT CCTTAT GTT GCATTT CCT TTC TGA ATT AGC A-3’ (SEQ ID NR: 80)13

L. OPG met T27-1801 murină

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și amino- 15 acizii 27 la 180 ai OPG murine sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. S-a realizat PCR folosind oligonucleoti- 17 dele #1309-74 (vezi Secțiune I) și #1309-73 (vezi Secțiunea K) ca primeri și plasmid ADN pAMG21 -muOPG-met [22-401 ] ca matriță. Condițiile de termociclare au fost cum s-au des- 19 cris în Secțiunea B. Proba PCR rezultată, s-a separat pe un gel de agaroză, produsul PCR s-a excizat, s-a purificat, s-a restricționat cu endonucleaze de restricție Ndel și BamHI și s-a 21 purificat. Produsul PCR, de mai sus, digerat Ndel și BamHI și purificat s-a inserat direcțional între siturile Ndel și BamHI ale pAMG21 folosind metodologia standard. Amestecul de ligare 23 s-a transformat în gazdă E.co//393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea 25 secvenței ADN a genei muOPG met [27-180],

Expresia polipeptidei recombinante muOPG met [27-180] din culturi de celule 393 27 transformate care adăpostesc plasmid recombinant pAMG21 după inducție, s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C. 29

M. OPG met [22-189] și met [22-194] murine

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și, fie 31 aminoacizii 22 la 189, fie 22 la 194 ai OPG murine sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. Perechea de oligo- 33 nucleotide sintetice #1337-92 și #1337-93 (linker =muOPG-189) sau #1333-57 și #1333-58 (linker =muOPG-194) s-au fosforilat individual și s-au lăsat să formeze o pereche oligo 35 duplex linker folosind metode descrise în Secțiunea B. Plasmidul ADN purificat s-a clivatcu endonucleaze de restricție Kpnl și BspEI și fragmentele ADN rezultate s-au separat pe un 37 gel de agaroză. Fragmentul B de -413 bp s-a izolat folosind metodologia ADN recombinant standard. Duplexurile oligo linker fosforilate formate, fie între oligonucleotidele #1337-92 și 39 #1337-93 (linker muOPG-189), fie între oligonucleotidele #1333-57 și #1333-58 (linker muOPG-194) care conțin capete coezive BspEI și BamHI și fragmentul B izolat de -413 bp 41 al plasmidului pAMG21-muOPG- met [22-401] digerat cu enzimele de restricție de mai sus, Kpnl și BspEI, s-a inserat direcțional între siturile Kpnl și BamHI ale pAMG21-muOPG met 43 [22-401] folosind metodologia standard. Fiecare amestec de ligare s-a transformat în gazdă E.co//393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat 45 plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței AND, fie a genei muOPG-met [22-189], fie a genei muOPG-met [22-194]. 47

RO 121386 Β1 (SEQ ID NR: 83) (SEQ ID NR: 84)

Expresia polipeptidelor recombinările muOPG-met [22-189] și muOPG-met [22-194] din plasmizi recombinanți pAMG21 transformați în celule 393, s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.

Oligo #1337-92 5'-CCG GAA ACA GAT AAT GAG-3' (SEQ ID NR: 81) Oligo #1337-93 5'-GAT CCT CAT TAT CTG TTT-3' (SEQ ID NR: 82)

Oligo #1333-57 5-CCG GAA ACA GAG AAG CCA CGC AAA AGT AAG-3' Oligo #1333-58 5'-GAT CCT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TTT-3’

N. OPG met [27-189] și met [27-194] murine

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și, fie aminoacizii 27 la 189, fie 27 la 194 ai OPG murine sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. Linkerii fosforilați, fie linker muOPG-189, fie linker muOPG-194 (vezi, Secțiunea M) care conțin capete coezive Bspl și Bamhl și fragmentul B de -413 bp izolat al plasmidului pAMG21 -muOPG-met [22-401] digerat cu enzimele de restricție Kpnl și BspEI, s-au inserat direcțional între siturile Kpnl și BamHI ale plasmidului pAMG21-muOPG-met [27-401] folosind metodologia standard. Fiecare ligare s-a transformat în gazdă E.coli 393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței AND, fie a genei muOPG met [27-189], fie a genei muOPG met [27-194].

Expresia polipeptidelor recombinante muOPG met [27-189] și muOPG met [27-194] după inducerea celulelor 393, care adăpostesc plasmizi recombinanți, s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.

O. OPG met T22-1851, met [22-189], met [22-194] umane

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și, fie aminoacizii 22 la 185, fie 22 la 189, fie 22 la 194 ai OPG umane sub controlul promotorului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează. Perechea de oligonucleotide sintetice #1331 -87 și #1331-88 (linker =huOPG-185), #1331 -89 și #1331-90 (linker =huOPG-189), sau #1331-91 și #1331-92 (linker=huOPG-194) s-au fosforilat individual și fiecare s-a lăsat să formeze o pereche oligo duplex linker folosind metode descrise în Secțiunea B. Plasmidul ADN purificat al pAMG21-huOPG-met [27-401] s-a restricționat cu endonucleaze de restricție Kpnl și Ndel și fragmentele ADN rezultate s-au separat pe un gel de agaroză. Fragmentul B de -407 bp s-a izolat folosind metodologia ADN recombinant standard. Duplexurile oligo linker fosforilate formate, fie între oligonucleotidele #1331-87 și #1331-88 (linker huOPG-185), fie între oligonucleotidele #1331-89 și #1331-90 (linker huOPG-189), fie între oligonucleotidele #1331-91 și #1331-92 (linker hu-194) [fiecare linker conține capete coezive Ndel și BamHI], și fragmentul B izolat de -407 bp al al plasmidului pAMG21-huOPG-met [27-401] digerat cu endonucleazele de restricție de mai sus, Kpnl și Ndel, s-a inserat direcțional între șirurile Kpnl și BamHI ale plasmidului pAMG21-huOPG-met [22-401] folosind metodologia standard. Fiecare ligare s-a transformat în gazdă E.coli 393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței AND, fie a genei huOPGmet [22-185], a genei huOPG-met [22-189], fie a genei huOPG-met [22-194].

Expresia polipeptidelor recombinante huOPG-met [22-185], huOPG-met [22-189] sau huOPG-met [22-194] celule 393 transformate care adăpostesc plasmizi recombinanți pAMG21, după inducție, s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.

RO 121386 Β1

Oligo #1331-871

5-TAT GH AAT GAG-3' (SEQ ID NR: 85)

Oligo #1331-883

5-GAT CCT CATTAA CA-3' (SEQ ID NR: 86)

Oligo #1331-895

5'-TAT GTT CCG GAA ACA GTT AAG-3' (SEQ ID NR: 87)

Oligo #1331-907

5'-GAT CCT TAA CTG TTT CCG GAA CA-3’ (SEQ ID NR: 88)

Oligo #1331-919

5'-TAT GTT CCG GAA ACA GTG AAT CAA CTC AAA AAT AAG-3’ (SEQ ID NR: 89) Oligo #1331-9211

5'-GAT CCT TAT TTT TGA GTT GAT TCA CTG TTT CCG GAA CA-3' (SEQ ID NR: 90)

P. OPG met [27-185], met [27-189], met [27-194] umane13

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și, fie aminoacizii 27 la 185, fie 27 la 189, fie 27 la 194 ai polipeptidei OPG umane sub controlul promo- 15 torului luxPR într-un plasmid vector de expresie procariotică pAMG21 după cum urmează.

Oligo linkerii fosforilați linker huOPG-185^M, linker huOPG-189 sau linker huOPG-194 17 (vezi, Secțiunea O), fiecare conținând capete coezive Ndel și BamHI și fragmentul B izolat de -407 bp al al plasmidului pAMG21-huOPG- met [27-401] digerat cu endonucleazele de 19 restricție Kpnl și Ndel (vezi Secțiunea O) s-a inserat direcțional între siturile Kpnl și BamHI ale plasmidului pAMG21-huOPG-met [27-401] (vezi Secțiunea J), folosind metodologia 21 standard. Fiecare ligare s-a transformat în gazdă E.coli 393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea 23

ADN pentru verificarea secvenței ADN, fie a genei huOPG-met [27-185], a genei huOPG-met [27-189], fie a genei huOPG-met [27-194].25

Expresia polipeptidelor recombinante huOPG-met [27-185], huOPG-met [27-189] și huOPG-met [27-194] de la plasmizi recombinanțî transformați în celule 393 transformate, s-a27 determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.

Q. OPG met [27-401] (P33E, G36S, A45P) murină29

S-a plasat o secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și aminoacizii 27 la 48, ai OPG umane sub controlul promotorului luxPR al sistemului vector de expre-31 sie procariotică pAMG21 după cum urmează. Plasmid ADN purificat al pAMG21-huOPG-met [27-401] (vezi Secțiunea J) s-a clivat cu endonucleaze de restricție Aatll și Kpnl și s-a izolat 33 un fragment ADN B de -1075 bp de la un gel de agaroză folosind metodologia ADN recombinant standard. Suplimentar, plasmidul ADN pAMG21-muOPG-met [22-401] (vezi Secțiunea 35

D) s-a digerat cu endonucleazele de restricție Kpnl și BamHI și s-a izolat fragmentul B de ~1064 cum s-a descris mai sus. Fragmentul de restricție izolat -1075 bp pAMG21-huOPG- 37 met [27-401], fragmentul de restricție care conține capete coezive Aatll și Kpnl (vezi mai sus) fragmentul de restricție -1064 bp pAMG21-muOPG-met [22-401], fragmentul de restricție 39 care conține capete adezive Kpnl și BamHI și un fragment de restricție de -5043 bp care conține capete coezive Aatll și BamHI și corespunde la secvența de acid nucleic a pAMG21 din- 41 tre Aatll și BamHI, s-au folosind metodologia ADN recombinant standard. Ligarea s-a transformat în gazdă E.coli 393 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat 43 clone și s-a verificat prezența insertului recombinant, gena muOPG-27-401 (P33E, G36S, A45P), în plasmid folosind metodologia ADN standard. Shimbările aminoacide în muOPG 45 de la prolină-33 la acid glutamic-33, glicină-36 la serină-36 și alanină-45 la prolină-45, rezultă de la înlocuirea resturilor muOPG 27 la 48 cu resturi huOPG umane 27 la 48. 47

RO 121386 Β1

Expresia recombinantului muOPG-met [27-401] (P33E, G36S, A45P) de la celule transformate care adăpostesc plasmid recombinant pAMG21 s-a determinat folosind metode descrise în Secțiunea C.

R. OPGmet-lys-(his)₇-ala-ser-(asp)₄-lys [22-401] (A45D murină)

O secvență ADN care codifică pentru un capăt N-terminal His și secvența de recunoaștere enterokinază care este (NH₂ spre terminus COOH): Met-Lys-His-His-His-His-HisHis-His-Ala-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (=HEK), urmată de aminoacizii 22 la 401 ai polipeptidei OPG murină s-a plasat sub controlul represorului lac reglat promotor Ps4 după cum urmează. S-a digerat pAMG22-His (vezi, Secțiunea A) cu endonucleaze de restricție Nhel și BamHI și fragmentul mare (fragmentul A) s-a izolat de la un gel de agaroză folosind metodologia ADN recombinant standard. Oligonucleotidele #1282-91 și #1282-92 s-au fosforilat individual și s-au lăsat să formeze un oligo duplex linker folosind metode descrise anterior (vezi, Secțiunea B). Duplexul linker fosforilat format între oligonucleotidele #1282-91 și #1282-92 care conține capete coezive Nhel și Kpnl, produsul PCR descris digerat Kpnl și BamHI (vezi Secțiunea D) și fragmentul A al vectorului pAMG22-His digerat cu Nhel și BamHI s-au ligat folosind metodologia ADN recombinant standard. Ligarea s-a transformat în gazdă E.coli GM120 prin electroporare folosind protocolul producătorului. S-au selectat clone, s-a izolat plasmid ADN și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei muOPG-HEK [22-401]. Secvențarea ADN a evidențiat o mutație falsă în secvența muOPG naturală care a rezultat într-o singură schimbare aminoacidă a alaninei-45 a polipeptidei muOPG la o treonină.

Expresia recombinantului muOPG-HEK [22-401] (A45T) de la celule GM120 care adăpostesc plasmid recombinant pAMG21 s-a determinat folosind metode similare celor descrise în Secțiunea C, cu excepția că în locul adăugării autoinducătorului sintetic, s-a adăugat IPTG la 0,4 mM final pentru a obține inducția.

Oligo #1282-91

5-CTA GCG ACG ACG ACG ACA AAG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC ATT ACG ATC CGG AAA CTG GTC ATC AGC TGC TGT GTG ATA AAT GTG CTC CGG GTAC-3' (SEQIDNR: 91) Oligo #1282-92

5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT TGT CGT CGT CGT CG-3' (SEQ ID NR: 92)

S. OPG met-arg-glv-ser(his)₆ [22-401] umană

S-au desemnat 8 oligonucleotide (1338-09 la 1338-16, prezentate mai jos) pentru a produce un fragment ADN dublu bandă de 175 baze ca suprapunere. Oligonucleotidele s-au normalizat, s-au ligat și oligonucleotidele 5' și 3' s-au folosit ca primeri PCR pentru a produce cantități mari de fragment de 175 baze. Produsele genei PCR finale s-au digerat cu endonucleaze de restricție Clal și Kpnl pentru a obține un fragment care înlocuiește 28 codoni Nterminali ai OPG umane. Produsul PCR digerat Clal și Kpnl s-a inserat în pAMG21-huOPG [27-401] care, de asemenea, fusese clivat cu Clal și Kpnl. S-a transformat ADN ligat în celule gazdă competente E.colitulpina 393. S-au căutat clone pentru capacitatea de a produce produsul proteină recombinantă și să posede gena de fuziune având secvența nucleotidică corectă. Nivelurile expresiei proteinei s-au determinat de la studii în balon agitat de 50 ml. S-au analizat lizat celular total și pelet sonicat pentru expresia constructului prin geluri SDS colorate Coomassie și analiză Western cu anticorp murin anti-OPG. Expresia huOPG Met-ArgGly Ser-(His)₆ [22-401] care are ca urmare producerea de corpi de incluziune mari a fost localizată la fracțiunea insolubilă (pelet).

RO 121386 Β1

1338-091

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA CA (SEQ ID NR: 93)

1338-103

TTT GTT TTA ACT AAT TAA AGG AGG AAT AAA ATA TGA GAG GAT CGC ATC AC (SEQ ID NR; 94)5

1338-11

CAT CAC CAT CAC GAA ACC TTC CCG CCG AAA TAC CTG CAC TAC GAC GAA GA 7 (SEQ ID NR: 95)

1338-129

AAC CTC CCA CCA GCT GCT GTG CGA CAA ATG CCC GCC GGG TAC CCA AAC A (SEQIDNR:96)11

1338-13

TGT TTG GGT ACC CGG CGG GCA TTT GT (SEQ ID NR: 97)13

1338-14

CGC ACA GCA GCT GGT GGG AGG TTT CTT CGT CGT AGT GCA GGT ATT TCG GC15 (SEQ ID NR: 98)

1338-1517

GGG AAG GTT TCG TGA TGG TGA TGG TGA TGC GAT CCT CTC ATA TTT TAT T (SEQ ID NR: 99)19

1338-16

CCT CCT TTA ATT AGT TAA AAC AAA TCT AGT ATC AAA ACG ATT GTG TTT GT21 (SEQ ID NR: 100)

T. OPG met-lys [22-401] și met-lys₃[22-401] umane23

Pentru a construi versiunile met-lys și met-(lys)₃ ale OPG [22-401] umane, s-au desemnat oligonucleotide de acoperire pentru adăugarea numărului corespunzător de resturi 25 lizină. S-au desemnat 2 oligonucleotide pentru fiecare construct pentru acoperire, permițând 2 runde ale PCR pentru producerea produsului final. Matrița pentru prima reacție PCR a fost 27 un plasmid ADN preparat conținând gena OPG 22-401 umană. Prima reacție PCR a adăugat restul(le) lizină. A doua PCR a folosit produsul primei runde și a adăugat secvența înapoi la 29 primul sit de restricție, Clal.

Produsele genei PCR finale s-au digerat cu endonucleaze de restricție Clal și Kpnl, 31 care înlocuiesc 28 de codoni N-terminali ai hu OPG și apoi s-a ligat în plasmid pAMG21-hu OPG [27-401] care, de asemenea, fusese digerat cu cele 2 endonucleaze de restricție. S-a 33 transformat ADN ligat în celule gazdă competente de E.coli tulpină 393. S-au cercetat clone pentru capacitatea de a produce produsul proteină recombinantă și să posede gena de fuzi- 35 une având secvența nucleotidică corectă. Nivelurile expresiei proteinei s-au determinat de la studii în balon agitat de 50 ml. S-au analizat pentru expresie lizat celular total și pelet soni- 37 cat prin geluri colorate Coomassie și analiză Western cu anticorp murin anti-OPG. Nici un construct nu a avut un nivel detectabil al expresiei proteinei și nu au fost vizibili corpi de 39 incluziune. Secvențele ADN s-au confirmat prin secvențarea AND. Primerii oligonucleotidici pentru prepararea Met-Lys huOPG [22-401]: 1338-17 41

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAATG (SEQIDNR: 101)43

1338-18

CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAG AAA CTT TTC CTC CAA AAT ATC45 (SEQ ID NR: 102)

1338-2047

TGT TTG GGT ACC CGC CGG ACA TTT ATC ACA C (SEQ ID NR: 103)

RO 121386 Β1

Primeri oligonucleotidici pentru prepararea Met-(Lys)₃-huOPG [22-401]: 1338-17

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAATG (SEQ ID NR: 104) 1338-19

CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TG A AAA AAA AAG AAA CTT TTC CTC CAA AAT ATC (SEQ ID NR: 105) 1338-20

TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (SEQ ID NR: 106)

U. Fuziuni QPG [22-401]/Fc umane si murine

S-au construit 4 fuziuni OPG-Fc unde regiunea Fc a IgGI a fost fuzionată la N-terminusul Osteoprotegerină, fie umană, fie murină aminoacizii 22 la 401 (denumite ca Fc/OPG [22-401]) sau la C-terminus (denumite ca OPG [22-401]). Fuziunile Fcs-au construit folosind vectorul de fuziune pFc-A3 descris în exemplul 7.

Toate genele de fuziune s-au construit folosind tehnologia ADN standard. Cu ajutorul matriței pentru reacții PCR au fost preparate plasmide care conțin gene țintă. S-au desemnat oligonucleotide de acoperire pentru combinarea porțiunii C-terminală a unei gene cu porțiunea N-terminală a altei gene. Acest proces permite fuzionarea celor 2 gene împreună în cadrul de citire corect după ce s-au realizat reacții PCR corespunzătoare. Inițial o fuziune oligo pentru fiecare genă s-a pus într-o reacție PCR cu un primer universal care conține gena țintă. S-a folosit fuziune oligo complementară cu un primer universal pentru PCR altă genă. La sfârșitul acestei prime reacții PCR, s-au obținut 2 produse separate, cu fiecare genă individuală având prezent situl de fuziune, care crează suficientă suprapunere pentru a conduce a doua rundă a PCR și creează fuziunea dorită. în a doua rundă a PCR, primele 2 produse PCR s-au combinat împreună cu primeri universali și, prin intermediul regiunilor de suprapunere, s-a produs secvența ADN de fuziune de lungime întreagă.

Produsele genei PCR finale s-au digerat cu endonucleaze de restricție Xbal și BamHI și apoi s-au ligat în vectorul pAMG21 care, de asemenea a fost digerat cu cele 2 endonucleaze de restricție. S-a transformat ADN ligat în celule gazdă competente de E.colitulpina 393. S-au căutat clone pentru capacitatea de a produce produsul proteină recombinantă și să posede gena de fuziune având secvența nucleotidică corectă. Nivelurile expresiei de proteină s-au determinat de la studii în balon agitat de 50 ml. S-au analizat lizat celular total, pelet sonicat și supernatant pentru expresia fuziunii prin geluri PAGE colorate Coomassie și analiză Western cu anticorp murin anti-OPG.

Fc/huOPG [22-401]

Expresia peptidei de fuziune Fc/hu OPG [22-401] s-a detectat pe un gel PAGE colorat Coomassie și pe un Western blot. Celulele au corpi de incluziune foarte mari și majoritatea produsului este în fracțiunea insolubilă (pelet). Pentru construirea acestei fuziuni OPG-Fc s-au folosit următorii primeri:

1318-48

CAG CCC GGG TAA AAT GGA AAC GTT TCC TCC AAA ATA TCT TCA TT (SEQ ID NR: 107) 1318-49

CGT TTC CAT TTT ACC CGG GCT GAG CGA GAG GCT CTT CTG CGT GT (SEQ ID NR: 108)

Fc/muOPG r22-4011

Expresia peptidei de fuziune s-a detectat pe un gel colorat Coomassie și pe un Western blot. Celulele au corpi de incluziune foarte mari și majoritatea produsului este în fracția insolubilă (pelet). Pentru construirea acestei fuziuni OPG-Fc s-au folosit următorii primeri:

RO 121386 Β1

1318-501

CGC TCA GCC CGG GTA AAA TGG AAA CGT TGC CTC CAA AAT ACC TGC (SEQ ID NR: 109)3

1318-51 CCA TTT CCG GGC TGA GCG AGA GGC TCT TCT GCG TGT (SEQ ID NR: 110)5 muOPG T22-4011 /Fc

Expresia peptidei de fuziune s-a detectat pe un gel colorat Coomassie și pe un 7 Western blot. Cantitatea de produs recombinant a fost mai mică decât cea a proteinelor de fuziune OPG care au regiunea Fc în poziție N-terminală. Evident, nu s-au detectat corpi de 9 incluziune. Majoritatea produsului a apărut a fi în fracțiunea insolubilă (pelet). Pentru construirea acestei fuziuni OPG-Fc s-au folosit următorii primeri: 11

1318-54

GAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC (SEQ ID NR: 111) 13

1318-55

CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G (SEQ ID NR: 112) 15 huOPG [22-401]/Fc

Expresia peptidei de fuziune nu s-a detectat pe un gel colorat Coomassie, deși a fost 17 prezent un semnal pozitiv slab Western. Evident, nu s-au detectat corpi de incluziune. Pentru prepararea acestei fuziuni OPG-Fc s-au folosit următorii primeri: 19

1318-52

AAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC (SEQ ID NR: 113)21

1318-53

CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG ATT GG (SEQ ID NR: 114)23

V. Fuziune OPG met [22-401]-Fc (P25A) umană

Acest construct combină o schimbare aminoacidă prolină la alanină la poziția 2525 (P25 A) cu fuziunea huOPG met [22-401 ]-Fc. Plasmidul s-a digerat cu endonucleaze de restricție Clal și Kpnl care îndepărtează 28 codoni N-terminali ai genei și fragmentul mic rezultat27 (mai mic de 200 bp) s-a purificat în gel. Acest fragment care conține schimbarea prolină la alanină a fost apoi ligat în plasmidul de fuziune pAMG21-huOPG [22-401]-Fc care a fost 29 digerat cu cele 2 endonucleaze de restricție. S-a transformat ADN ligat în celule gazdă competente de E.coli tulpina 393. S-au căutat clone pentru capacitatea de a produce produsul 31 proteină recombinantă și să posedă gena de fuziune care are secvența nucleotidică corectă. Nivelurile expresiei proteinei s-au determinat de la studii în balon agitat de 50 ml. S-au ana- 33 lizat pentru expresie Uzat celular total și pelet sonicat ale constructului prin geluri PAGE colorate Coomassie și analiză Western cu anticorp murin anti-OPG. Nivelul expresiei peptidei 35 de fuziune s-a detectat pe un gel PAGE colorat Coomassie și pe un Western blot. Proteina a fost în fracția insolubilă (pelet). Celulele au avut corpi de incluziune mari. 37

W. OPG met [22-401] (P25A) umană

O secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și aminoacizii 22 la 401 39 ai OPG umane cu prolină la poziția 25 fiind substituită prin alanină plasată sub controlul promotorului lux P_R în vectorul de expresie procariotă pAMG21 s-a construit după cum urmează: 41 s-au normalizat oligonucleotidele sintetice # 1289-84 și 1289-85 pentru a forma un oligo duplex linker cu capete coezive Xbal și Kpnl. Duplexul linker sintetic a folosit optim codoni 43 E.coli și a codificat o metionină N-terminală. De asemenea, linkerul a inclus un sit de restricție Spel care nu a fost prezent în secvența originală. Duplexul linker s-a inserat direcțional 45 între șirurile Xbal și Kpnl în pAMG21-huOPG-22-401 folosind metode standard. Amestecul de ligare s-a introdus în gazdă E.coli GM221 prin transformare. Inițial, clonele s-au cercetat 47 pentru producerea proteinei recombinante. S-a izolat plasmid ADN de la clone pozitive și s-a

RO 121386 Β1 realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei HuOPG-Met [22-401] (P25A). S-au folosit următoarele oligonucleotide pentru generarea linkerului Xbal - Kpnl: Oligo #1289-84

5'-CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TGC TCC AAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TAG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TCC GCC GGG TAC-3' (SEQIDNR: 115) Oligo #1289-85

5'-CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC TAG TTT CTT CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG CAA AAG TTT CCA TAT GTT ATT CCT CCT T-3' (SEQIDNR: 116)

X. OPG met [22-4011 (P26A) și (P26D) umane

O secvență ADN care codifică pentru o metionină N-terminală și aminoacizii 22 la 401 ai OPG umane cu prolina la poziția 26 fiind substituită prin aianină plasată sub controlul promotorului lux P_R în vectorul de expresie procariotă pAMG21 s-a construit după cum urmează: s-au normalizat oligonucleotidele sintetice # 1289-86 și 1289-87 pentru a forma un oligo duplex linker cu capete coezive Xbal și Spel. Duplexul linker sintetic a folosit optim codoni E.coli și a codificat o metionină N-terminală. Duplexul linker s-a inserat direcțional între siturile Xbal și Spel în pAMG21-huOPG [22-401] folosind metode standard. Amestecul de ligare s-a introdus în gazdă E.coli GM221 prin transformare. Inițial, clonele s-au cercetat pentru producerea proteinei recombinante. S-a izolat plasmid ADN de la clone pozitive și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei huOPG-met [22-401] (P26A). Una dintre clonele secvențate s-a dovedit a avea prolina la poziția 26 substituită prin acid aspartic mai degrabă decât aianină și această clonă s-a desemnat huOPG-met [22-401] (P26D). S-au folosit următoarele Oligonucleotide pentru generarea linkerului Xbal - Spel: Oligo #1289-86

5-CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TCC TGC TAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AA-3' (SEQ ID NR: 117)

Oligo #1289-87

5-CTA GTT TCT TCA TCA TAATGA AGATAT TTA GCA GGA AAA GTT TCC ATA TGT TAT TCC TCC TT-3' (SEQ ID NR: 118)

Y. OPG met [22-194] (P25A) umană

O secvență ADN care codifică o metionină N-terminală și aminoacizii 22 la 194 ai OPG umane cu prolina la poziția 25 substituită prin aianină sub controlul promotorului lux P_Rîn vectorul de expresie procariotică pAMG21 s-a construit după cum urmează: plasmizii pAMG21-huOPG [27-194] și pAMG21-huOPG [22-401] (P25A) s-au digerat fiecare cu endonucleaze de restricție Kpnl și BamHI. Fragmentul de 450 bp s-a izolat de la pAMG21-huOPG [27-194] și fragmentul de 6,1 kbp s-a izolat de lapAMG21-huOPG [22-401] (P25A). Aceste fragmente s-au ligat împreună și s-au introdus în gazdă E.coli GM221 prin transformare. Inițial, clonele s-au cercetat pentru producerea proteinei recombinante. S-a izolat plasmid ADN de la clone pozitive și s-a realizat secvențarea ADN pentru verificarea secvenței ADN a genei huOPG-Met [22-194] (P25A).

Exemplul 9. Asocierea monomerilor OPG

S-au folosit celule CHO prelucrate prin inginerie pentru a supraexprima muOPG [22401] pentru generarea de mediu condiționat pentru analiza OPG recombinantă secretată folosind anticorpi policlonali anti-OPG. Un alicot al mediului condiționat s-a concentrat de 20 ori, apoi s-a analizat prin SDS-PAGE reducător și nereducător (fig. 15). în condiții reducătoare, proteina a migrat ca o polipeptidă Mr 50-55 kd, cum s-ar fi prezis dacă produsul matur ar fi fost glicozilat la unul sau mai multe dintre siturile sale de consens de glicozilare N-legată.

RO 121386 Β1 în mod surprinzător, când aceleași probe s-au analizat prin SDS-PAGE nereducător, majo- 1 ritatea proteinei a migrat ca o polipeptidă de aproximativ 100 kd, de 2 ori mărimea proteinei reduse. în plus, a existat o cantitate mai mică de polipeptidă Mr 50-55 kd. Această imagine 3 a migrării pe SDS-PAGE a fost în consens cu noțiunea că produsul OPG a fost formator de dimeri prin oxidarea unei grupări(i) sulfhidril libere. 5

Polipeptidă OPG matură prezisă conține 23 resturi cisteină, din care 18 sunt prezise ca fiind implicate în formarea punților disulfurice intracatenă care cuprind 4 domenii bogate 7 în cisteină (fig. 12A). Cele 5 resturi cisteină C-terminale rămase nu sunt implicate în structura secundară care poate fi prezisă pe baza omologiei cu alți membri ai familiei TNFR. In total 9 există un număr net inegal de resturi cisteină și, formal, este posibil ca cel puțin 1 rest să fie liber pentru a forma o legătură disulfurică între 2 monomeri OPG. 11

Pentru a ajuta în elucidarea cineticii OPG și asocieri monomerului, s-a realizat un studiu de marcare-urmărire puls. Celule CHO care exprimă muOPG [22-401] s-au marcat meta- 13 bolic cum s-a desris mai sus în mediu fără ser conținând ³⁵metionină și cisteină pentru 30 minute. După această perioadă, s-a îndepărtat mediu și s-a înlocuit cu mediu complet con- 15 ținând metionină nemarcată și cisteină la niveluri de aproximativ 2 000 ori exces față de concentrația inițială a aminoacizilor radioactivi. La 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h și 12 h post adăuga- 17 re, s-au recoltat culturi prin îndepărtarea mediului condiționat și s-au preparat lizate ale mediului condiționat și monostraturi aderente. Mediul de cultură și lizatele celulare s-au clarificat 19 cum s-a descris mai sus și apoi s-au imunoprecipitat folosind anticorpi anti-OPG cum s-a descris mai sus. După ce s-au spălat imunoprecipitatele, ele s-au eliberat prin fierbere în 21 tampon nereducător SDS-PAGE, apoi s-au desfăcut în 2 jumătăți. La o jumătate, s-a adăugat agentul reducător (3-mercaptoetanol la 5% (v/v) concentrație finală menținând în același 23 timp cealaltă jumătate în condiții nereducătoare. Ambele seturi de imunoprecipitate s-au analizat prin SDS-PAGE cum s-a descris mai sus, apoi s-au prelucrat pentru autoradiografie și 25 s-au expus la film. Rezulatele sunt prezentate în fig. 16. Probele analizate prin SDS-PAGE reducător sunt ilustrate în cele două tablouri de jos. După sinteză, polipeptidă OPG este pre- 27 lucrată rapid la o polipeptidă puțin mai mare, care reprezintă, probabil, modificare prin glicozilare N-legată. După aproximativ 1-2 h, nivelul OPG din celulă descrește dramatic și, con- 29 comitent, apare în supernatantul culturii. Acesta pare a fi rezultatul transportului vectoral al OPG din celulă în mediu în timp, consecvent cu noțiunea că OPG este o proteină secretată 31 în mod natural. Analiza acelorași imunoprecipitate în condiții nereducătoare arată relația dintre formarea dimerilor OPG și secreția în mediu condiționat (fig. 16, tablouri superioare). 33 în primele 30-60 min, monomerii OPG sunt prelucrați în celulă prin glicozilare aparentă, urmată de formarea dimerului. în timp, volumul de monomeri OPG este condus în dimeri, 35 care în continuare dispar din celulă. începând la circa 60 min. după sinteză, dimerii OPG apar în mediu condiționat și se acumulează pe durată experimentului. După această peri- 37 oadă se formează dimeri OPG care sunt apoi secretați în mediul de cultură. Monomerii OPG persistă la un nivel scăzut în interiorul în timp și cantități mici apar, de asemenea în mediu. 39 Aceasta nu pare a fi rezultatul degradării dimerilor OPG covalenți, ci mai degrabă producerea de cantități substoichiometrici de monomeri în celulă și secreția subsecventă. 41

OPG produsă recombinant de la celule CHO transfectate pare a fi predominant un dimer. Pentru a determina dacă dimerizarea este un proces natural în sinteza OPG, noi am 43 analizat mediul condiționat al unei linii de celule găsită a exprima natural OPG. Linia de celule CTLL-2, o linie de celule murine limfocitare T citotoxice (ATCC număr de acces TIB-214), 45 s-a dovedit a exprima mARN OPG într-o căutare ARN de țesut și linie celulară. Transcriptul OPG s-a dovedit a fi același cu ARN-ul de 2,5-3,0 kb donat și secvențat identificat din rinichi 47 și găsit a codifica o moleculă secretată. Analiza Western blot a mediului condiționat obținut

RO 121386 Β1 de la celule CTLL-2 arată că cea mai mare parte, dacă nu toată, proteina OPG secretată este un dimer (fig. 17). Aceasta sugerează că dimerizarea și secreția OPG nu este un artefact al supraexpresiei într-o linie celulară, ci trebuie să fie forma principală a produsului așa cum este el produs prin expresia celulelor.

Au fost analizate țesuturi și ser de șoarece normal și transgenic pentru a determina natura moleculei de OPG exprimată în șoareci transgenici. Deoarece cADN OPG de șobolan s-a exprimat sub controlul unui element de control hepatocitar, s-au analizat extracte obținute din parenchimul șoarecilor de control și transgenici în condiții nereducătoare (fig. 18). în extract de la șoareci transgenici, nu și normali, dimerii OPG sunt detectați cu ușurință alături de cantități substoichiometrice de monomeri. Dimerii și monomerii OPG apar identic proteinei recombinante murine exprimate în celule CHO prelucrate prin inginerie. Aceasta sugerează puternic că dimerii OPG sunt în schimb o formă naturală a produsului genei și sunt probabil componenți activi cheie. Probe de ser obținute de la șoareci de control și transgenici au fost analizate similar prin analiză western blot. La șoareci de control, majoritatea proteinei OPG migrează ca un dimer, în timp ce sunt detectate, de asemenea cantități mici de monomer. în plus, sunt detectate cantități semnificative ale unei proteine mai mari, care migrează cu o masă moleculară relativă consecventă cu mărimea prezisă a unui trimer legat covalent. Astfel, OPG recombinant este exprimat predominant ca o proteină dimerică în șoareci transgenici OPG și forma dimer poate fi baza pentru fenotipul osteopetrotic la șoareci OPG. Proteina OPG recombinantă poate exista, de asemenea, în forme trimerice de greutate moleculară mai mare.

Pentru a determina dacă cele 5 resturi cisteină C-terminală ale OPG joacă un rol în homodimerizare, codonii OPG murini pentru resturi cisteină 195 (C195), C202, C277, C319 și C400 s-au schimbat la serină folosind QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA) cum s-a descris mai sus. Gena muOPG a fost subclonată între siturile Notl și Xbal ale vectorului pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, San Diego, CA). Plasmidul rezultat, pcDNA3.1-muOPG și primeri mutagenici s-au tratat cu Pfu polimerazăîn prezența deoxinucleotidelor, apoi s-a amplificat într-un termocicler cum s-a descris mai sus. Un alicot al reacției este transfectat apoi în E.coli XLI-Blue competentă prin șoc termic, apoi etalată. Plasmid ADN de la transformanți a fost apoi secvențat pentru verificarea mutațiilor.

S-au folosit următoarele perechi de primeri pentru a schimba codonul pentru restul cisteină 195 la serină al genei OPG, rezultând producerea unei proteine muOPG [22-401] C195: 1389-19:

5-CAC GCA AAA GTC GGG AAT AGATGT CAC-3* (SEQ ID NR: 150) 1406-38:

5-GTG ACA TCT ATT CCC GAC TTT TGC GTG-3' (SEQ ID NR: 151)

S-au folosit următoarele perechi de primeri pentru a schimba codonul pentru restul cisteină 202 la serină al genei OPG murine, rezultând producerea unei proteine muOPG [22401] C202: 1389-21:

5'-CAC CCT GTC GGA AGA GGC CTT CTT C-3' (SEQ ID NR: 152) 1389-22:

5-GAA GAA GGC CTC TTC CGA CAG GGT G-3' (SEQ ID NR: 153)

S-au folosit următoarele perechi de primeri pentru a schimba codonul pentru restul cisteină 277 la serină al genei OPG murine, rezultând producerea unei proteine muOPG [22401] C277S:

RO 121386 Β1

1389-23:1

5-TGA CCT CTC GGA AAG CAG CGT GCA-3' (SEQ ID NR: 154)

1389-24:3

5'-TGC ACG CTG CTT TCC GAG AGG TCA-3' (SEQ ID NR: 155)

S-au folosit următoarele perechi de primeri pentru a schimba codonul pentru restul 5 cisteină 319 la serină al genei OPG murine, rezultând producerea unei proteine muOPG [22401JC319S:7

1389-17:

5-CCT CGA AAT CGA GCG AGC AGC TCC-3' (SEQ ID NR: 156)9

1389-18:

5-CGA TTT CGA GGT CTT TCT CGT TCT C-3' (SEQ ID NR: 157)11

S-au folosit următoarele perechi de primeri pentru a schimba codonul pentru restul cisteină 400 la serină al genei OPG murine, rezultând producerea unei proteine muOPG [22-13

401] C400S: 1406-72:15

5-CCG TGA AAA TAA GCT CGT TAT AAC TAG GAATGG-3* (SEQ ID NR: 158) 1406-75:17

5*-CCA TTC CTA GTT ATA ACG AGC TTA TTT TCA CGG-3' (SEQ ID NR: 159)

Fiecare plasmid muOPG [22-401] rezultat care conține mutația corespunzătoare a19 fost transfectat apoi în celule umane 293 și proteina mutantă de fuziune OPG-Fc s-a purificat din mediu condiționat cum s-a descris mai sus. Activitatea biologică a fiecărei proteine s-a 21 cercetat în testul de formare osteoclast in vitro descris în exemplul 11. Mediul condiționat de la fiecare transfectant s-a analizat prin SDS-PAGE nereducător și western blotting cu 23 anticorpi anti-OPG.

Mutația oricăruia dintre cele 5 resturi cisteină C-terminale rezultă în producerea pre- 25 dominant de molecule OPG monomere 55 kd (>90%). Aceasta sugerează puternic că resturile cisteină C-terminale joacă un rol în homodimerizarea OPG. 27

S-au construit mutante de deleție OPG C-terminale pentru a configura regiunea(ile) domeniului OPG C-terminal care sunt importante pentru homodimerizarea OPG. Aceste 29 mutante OPG s-au construit prin amplificare PCR folosind primeri care introduc semnale premature de stop a translației în regiunea C-terminală a OPG murină. S-au desemnat oligo 5' 31 pentru codonul de start MuOPG (conținând un sit de restricție Hindi11) și oligonucleotide 3' (conținând un codon stop și un sit Xhol) pentru regiunea C-terminală truncată a muOPG care33 se termină fie la restul treonină 200 (CT200), prolină 212 (CT212), acid glutamic 293 (CT293), fie serină 355 (CT-355).35

S-au folosit următorii primeri pentru construirea muOPG [22-200]:

1091-39:37

5'-CCT CTG AGC TCA AGC TCC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (SEQ ID NR: 160)39

1391-91:

5'-CCT CTC TCG AGT CAG GTG ACA TCT ATT CCA CAC TTT TGC GTC GC-3'41 (SEQ ID NR: 161)

S-au folosit următorii primeri pentru a construi muOPG [22-212]:43

1091-39:

5-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3' (SEQIDNR: 162)45

1391-90:

5'-CCT CTC TCG AGT CAA GGAACA GCAAAC CTG AAG AAG GC-3' (SEQ ID NR: 163)47

RO 121386 Β1

S-au folosit următorii primeri pentru a construi muOPG [22-293]: 1091-39:

5'-CCTCTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA AG-3' (SEQIDNR: 164) 1391-89:

5'-CCT CTC TCG AGT CAC TCT GTG GTG AGG TTC GAG TGG CC-3' (SEQ ID NR: 165)

S-au folosit următorii primeri pentru a construi muOPG [22-355]: 1091-39:

5-CCTCTG AGCTCA AGCTTC CGAGGACCACAATGAACA AG-3' (SEQ ID NR: 166) 1391-88:

5-CCTCTCTCG AGTCAG GATGTTTTC AAGTGCTTG AGG GC-3' (SEQ ID NR: 167)

Fiecare plasmid muOPG-CT rezultat care conține truncarea corespunzătoare a fost transfectat apoi în celule umane 293 și proteina mutantă de fuziune OPG-Fc s-a purificat din mediu condiționat cum s-a descris mai sus. Activitatea biologică a fiecărei proteine s-a cercetat în testul de formare osteoclast in vitro descris în exemplul 11. De asemenea, mediile condiționate s-au analizat prin SDS-PAGE nereducătorși western blotting folosind anticorpi anti-OPG.

Truncarea regiunii C-terminale a OPG afectează capacitatea OPG de a forma homodimeri. CT 355 este predominant monomerică, cu toate că se formează ceva dimer. Forme C293 care apar în cantități molare egale de monomer și dimer și de asemenea, agregate de greutate moleculare mare. Totuși, CT212 și CT200 sunt monomerice.

Exemplul 10. Purificarea OPG

A. Purificarea proteinelor de fuziune OPG-Fc mamifere

S-au preparat 51 de mediu condiționat de la celule 293 care exprimă o proteină de fuziune OPG-Fc, după cum urmează. S-a dezghețat o probă de celule înghețate în 10 ml de mediu 293S (DMEM-glucoză crescută, 1 x L-glutamină, ser bovin fetal (FBS) inactivat termic și 100 Hg/ml higromicină) și s-a alimentat cu mediu proaspăt după 1 zi. După 3 zile, celulele s-au despărțit în 2 baloane TI75 la diluții 1:10 și 1:20. S-au făcut 2 despărțiri suplimentare 1:10 pentru a ridica la 200 baloane TI75. La acest moment celulele au fost la 5 zile post dezghețare. Celulele s-au crescut până aproape de confluență (circa 3 zile) moment la care s-a aspirat mediu care conține ser, celulele s-au spălat 1 dată cu 25 ml PBS per balon și s-au adăugat 25 ml mediu SF (DMEM-glucoză crescută, 1 x L-glutamină) la fiecare balon. S-au menținut celulele la 5% CO₂ timp de 3 zile, moment în care s-a recoltat mediul, s-a centrifugat prin filtre azotat de celuloză 0,45 m (Corning).

Proteinele fuziunii OPG-Fc s-au purificat folosind o coloană Protein G Sepharose (Pharmacia) echilibrată în PBS. Mărimea coloanei a variat depinzând de volumul mediului de start. Mediu condiționat preparat cum s-a descris mai sus s-a încărcat pe coloană, coloana s-a spălat cu PBS și proteina pură a eluat folosind 10 mM glicină pH 2,7. S-au colectat fracțiuni în eprubete conținând IM Tris pH9,2 în scopul neutralizării cât mai repede posibil. Fracțiunile conținând proteină s-au colectat, s-au concentrat fie într-un Amicon Centricon 10, fie Centriprep 10 și s-au diafiltrat în PBS. Proteina pură se depozitează la -80’C.

S-au purificat prin această procedură Murină [22-401]-Fc, Murină [22-180]-Fc, Murină [22-194]-Fc, umană [22-401]-Fc și umană [22-201]-Fc. Murină [22-185]-Fc este purificată prin această procedură.

B. Prepararea anticorpilor anti-OPG

S-au injectat subcutanat 3 iepuri albi de Noua Zeelandă (greutate inițială 5-8 Ibs) cu proteina de fuziune muOPG [22-401]-Fc. Fiecare iepure s-a imunizat în ziua 1 cu 50 pg antigen emulsionat într-un volum egal de adjuvant Freunds complet. S-au realizat rapeluri ulterioare (zilele 14 și 28) prin aceeași procedură cu substituirea de adjuvant Freunds incomplet.

RO 121386 Β1

Titrurile anticorpului s-au monitorizat prin EIA. După al doilea rapel, antiserurile au arătat 1 titruri ridicate de anticorp și s-au obținut 25 ml sânge de la fiecare animal. Serul s-a trecut întâi pe o coloană de afinitate la care a fost imobilizat OPG-Fc. S-au eluat anticorpi anti-OPG 3 cu Pierce Gentle Elution Buffer care conține 1% acid acetic glacial. Proteina eluată a fost dializată apoi în PBS și s-a trecut pe o coloană Fc pentru a îndepărta orice anticorpi specifici 5 pentru porțiunea Fc a proteinei de fuziune OPG. Migratul de la fracțiunile care conțin anticorpi specifici anti-OPG s-au dializat în PBS. 7

C. Purificarea OPG Γ22-4011 murină

Cromotografie de afinitate anticorp 9

Anticorpi anti-OPG purificați afinitate s-au diafiltrat în tampon de cuplare (0,1 M carbonat de sodiu pH 8,3, 0,5M NaCI) și s-au amestecat cu bile de Sepharose activate CNBr 11 (Pharmacia) pentru 2 h la temperatura camerei. Apoi, rășina s-a spălat extensiv cu tampon de cuplare înaintea blocării siturilor neocupate cu 1 M etanolamină (pH 8,0) pentru 2 ore la 13 temperatura camerei. Apoi, rășina s-a spălat cu pH scăzut (0,1 M acetat de sodiu, pH 4,0, 0,5M NaCI), urmată de o spălare pH ridicat (0,1M Tris-HCI pH 8,0,0,5M NaCI). Ultimele spă- 15 lări s-au repetat de trei ori. în final, rășina a fost echilibrată cu PBS înainte de încărcare într-o coloană. O dată încărcată, rășina s-a spălat cu PBS. S-a realizat o eluție blanc cu 0,1 M 17 glicină-HCI, pH 2,5, urmată de reechilibrare cu PBS.

S-a aplicat mediu condiționat concentrat de la celule CHO care exprimă muOPG[22- 19 401] la coloană la o rată de curgere lentă. Coloana s-a spălat cu PBS până când absorbanta măsurată la 280 nm a revenit la linia de bază. Proteina s-a eluat din coloană întâi cu 0,1 M 21 glicină-HCI (pH 2,5), s-a reechilibrat cu PBS și s-a eluat cu al doilea tampon (0,1 M CAPS, pH 10,5,1 M NaCI). Cele două depozite de eluție s-au diafiltrat separat în PBS și s-au filtrat 23 steril înainte de înghețare la -20’C.

Cromatografie convențională 25

Mediul condiționat celulă CHO s-a concentrat 23x într-un cartuș înfășurat spiralat Amicon (S10Y10) și s-a diafiltrat în 20 raM Tris pH 8,0. Apoi, s-a aplicat mediu diafiltrat la 27 o coloană Q-sepharose HP (Pharmacia) care a fost echilibrată cu 20 mM Tris pH 8,0. După aceea, coloana a fost spălată până când absorbanta la 280 nm a atins linia de bază. Prote- 29 ina s-a eluat cu un volum gradient 20 coloane de 0-300 mM NaCI în Tris pH 8,0. Proteina OPG a fost detectată folosind un western blot al fracțiunilor coloanei. 31

Fracțiunile care conțin OPG s-au colectat și s-au adus la o concentrație finală de 300 mM NaCI, 0,2 mM DTT. S-a echilibrat o coloană NiNTA superose (Qiagen) cu 20 mM 33 Tris pH 8,0,300 mM NaCI, 0,2 mM DTT, după care s-au aplicat fracțiunile colectate. Coloana s-a spălat cu tampon de echilibrare până când s-a atins absorbanta liniei de bază. Proteinele 35 s-au eluat din coloană cu un gradient 0-30 mM Imidazol în tampon de echilibrare. Proteinele rămase s-au eliminat prin spălarea coloanei cu IM Imidazol. Din nou, s-a folosit un western 37 blot pentru detectarea fracțiunilor care conțin OPG.

Fracțiunile strânse de la coloana NiNTA s-au dializat în 10 mM fosfat de potasiu 39 pH 7,0,0,2 mM DTT. Colectatul dializat s-a aplicat apoi la o coloană ceramică hidroxiapatită (Bio-Rad), care a fost echilibrată în tampon 10 mM fosfat. După spălarea coloanei, proteina 41 s-a eluat cu un gradient 10-100 mM fosfat de potasiu pe 20 volume coloană. Apoi, aceasta a fost urmată de un gradient volum 20 coloane de fosfat 100-400 mM. 43

S-a detectat OPG prin colorație coomassie blue a gerurilor SDS-poliacrilamidă și prin western blotting. Fracțiunile s-au strâns și s-au diafiltrat în PBS și s-au înghețat la -80’C. Pro- 45 teina purificată migrează ca un monomer și va rămâne astfel după diafiltrare în PBS. Monomerul este stabil când se păstrează înghețat sau la pH 5 la 4*C. Totuși, dacă se depozitează 47 la 4’C în PBS, dimeri, și ceea ce pare a fi trimeri și tetrameri se vor forma după o săptămână.

RO 121386 Β1

D. Purificarea OPG met [22-401] umană de la E.coli

Pasta de celule bacteriene a fost suspendată în 10 mM EDTA la o concentrație de 15% (g/v) folosind un omogenizator cu forfecare redusă la 5’C. Apoi, celulele s-au distrus prin 2 omogenizări la 15000 psi fiecare la 5’C. Omogenatul rezultat s-a centrifugat la 5000xg pentru 1 h la 5’C. Peletul centrifugal s-a spălat prin omogenizare cu forfecare redusă la volumul de omogenizare inițial, urmată de centrifugare ca mai înainte. Peletul spălat a fost solubilizat la 15% (g/v) printr-o soluție de (concentrație finală) 6M guanidină HCI.10 mM ditiotreitol, 10 mM Tris-HCI, pH 8,5 la temperatura ambiantă pentru 30 min. Această soluție s-a diluat de 30 ori în 2M uree conținând 50 mM CAPS, pH 10,5,1 mM glutation redus și apoi s-a agitat 72 h la 5’C. OPG s-a purificat din această soluție la 25’C prin ajustarea mai întâi la pH 4,5 cu acid acetic și apoi cromatografie pe o coloană de rășină SP-HP Sepharose echilibrată cu 25 mM acetat de sodiu, pH 4,5. Eluția coloanei s-a realizat cu un gradient linear de clorură de sodiu de la 50 mM la 550 mM în același tampon folosind 20 volume coloană la o rată de curgere de 0,1 volume coloană/minut. Maximul fracțiunilor care conțin numai forma OPG dorită s-a colectat și depozitat la 5’C sau tampon schimbat în fosfat tamponat salin, s-a concentrat prin ultrafiltrare și apoi s-a depozitat la 5’C. Acest material s-a analizat prin HPLC fază inversă, SDS-PAGE, test Uzat amebocitar limulus pentru prezența endotoxinei și s-a secvențat N-terminal. De asemenea, suplimentar, pot fi folosite tehnici ca spectrometria de masă, stabilitate pH, temperatură, fluorescență, dicroismul circular, calorimetria de scanare diferențială și analizele de profilare protează pentru examinarea natura pliată a proteinei.

Exemplul 11. Activitatea biologică a OPG-recombinant

Pe baza histologiei și histomorfometriei, a apărut că supraexpresia hepatică a OPG în șoareci transgenici a scăzut marcat numărul osteoclastelor conducând la o creștere marcată în țesut osos (vezi, exemplul 4). Pentru câștigarea ulterioară a vederii mecanismului(lor) potențiale care subliniază acest efect in vivo, s-au testat diverse forme ale OPG recombinante într-un model de cultură in vitro al formării osteoclastului (test de formare osteoclast). Acest sistem de cultură a fost inițial stabilit de Udagawa (Udagawa et al., Endocrinology 125, 1805-1813 (1989), Proc. Nat/. Acad. Sci. USA 87,7260-7264 (1990)) și folosește o combinație de celule de măduvă osoasă și celule din linii de celule stromale de măduvă osoasă. O descriere a modificării acestui sistem de cultură folosit pentru aceste studii a fost publicat anterior (Lacey et al., Endocrinoloav 136. 2367-2376 (1995)). în această metodă, celulele de măduvă osoasă desprinse din femure și tibii de șoareci sunt cultivate peste noapte în mediu de cultură (alfa MEM cu 10% ser bovin fetal inactivat termic) suplimentat cu 500 U/ml CSF-1 (factor 1 stimulator de colonie denumit de asemenea, M-CSF), un factor de creștere hematopoietică specific pentru celulele liniei familiei monocit/macrofag. După această incubare, s-au colectat celule neaderente, s-au suspus la purificare gradient și apoi s-au co-cultivat cu celule din linia de celule de măduvă osoasă ST2 (1x10⁶ celule neaderente: 1x10⁵celule ST2/ml mediu). Mediul este suplimentat cu dexametazon (100 nM) și metabolitul biologic activ al vitaminei D3 cunoscut ca 1,25 dihidroxivitamină D3 (1,25 (OH)₂ D3.10 nM). Pentru intensificarea apariției osteoclastului la unele culturi se adaugă prostaglandină E2 (250 nM). Perioada de co-cultură este de obicei în domeniul de la 8 la 10 zile și mediul, cu toate suplimentele adăugate proaspăt, se reînoiește la fiecare 3-4 zile. La diverse intervale, culturile sunt analizate pentru prezența tartat fosfatază acidă (TRAP) folosind fie o colorație histochimică (Sigma Kit # 387A, Sigma, St. Louis, MO), fie soluție de test TRAP. Metoda histochimică TRAP permite identificarea fenotipică de osteoclaste care sunt celule multinucleate (^3 nudei) care sunt de asemenea, TRAP+. Soluția de testat implică lizarea culturilor care conțin osteoclastul într-un tampon citrat (100 mM, pH 5,0) conținând 0,1% Triton X-100. Activitatea tartrat rezistent fosfatază acidă este măsurată apoi pe baza conversiei p-nitrofenilfosfatului (20 nM) la p-nitrofenol în prezență de 80 mM tartrat de sodiu care are loc în timpul

RO 121386 Β1 unei incubații de 3-5 min la temperatura camerei. Reacția se termină prin adăugare de NaOH 1 la o concentrație finală de 0,5 M. Se măsoară densitatea optică la 405 nm și rezultatele sunt marcate. 3

Studii anterioare (Udagawa et al. ibid) care folosesc testul formării osteoclastului au demonstrat că aceste celule exprimă receptori pentru ¹²⁵l-calcitonină (autoradiografie) și pot 5 face cavități pe suprafețele osului, care atunci când se combină cu pozitivitate TRAP confirmă că, celulele multinucleate au un fenotip osteoclast. Dovada suplimentară în sprijinul feno- 7 tipului osteoclast a celulelor multinucleate care apare in vitro în testul de formare osteoclast este că celulele exprimă integrine αν și β3 prin imunocitochimie și receptor calcitonină și 9 mARN TRAP prin hibridizare in situ (ISH).

Fuziunea huOPG [22-401]-Fc s-a purificat din mediul condiționat celulă CHO și s-a 11 utilizat în continuare în testul formării osteoclastului. La 100 ng/ml de huOPG [22-401]-Fc, formarea osteoclastului a fost virtual inhibată 100% (fig. 19A). Nivelurile TRAP măsurate în 13 culturi lizate în godeurile plăcii de microtitru au fost de asemenea inhibate în prezența OPG cu o IDgo de aproximativ 3 ng/ml (fig. 20). Nivelul activității TRAP în lizate pare să se coreleze 15 cu numărul relativ al osteoclastelor observate prin citochimie TRAP (compară fig. 19A-19G și 20). De asemenea, IgGI uman purificat și TNFbp au fost testate în acest model și s-au 17 dovedit a nu avea efecte inhibitoare sau stimulatoare sugerând că efectele inhibitoare ale huOPG [22-401]-Fc s-au datorat porțiunii OPG a proteinei de fuziune. Forme suplimentare 19 ale moleculelor umane și murine au fost testate și datele cumulative sunt rezumate în tabelul 1. 21

Tabelul 1 23

Efectele diverselor forme OPG asupra formării osteoclastului in vitro

Construct OPG	Bioactivitate relativă in vitro
muOPG [22-401 ]-Fc	+++
muOPG [22-194]-Fc	+++
muOPG [22~185]-Fc	++
muOPG[22-180]-Fc	-
muOPG [22-401]	+++
muOPG [22-401 ] C195	+++
muOPG [22-401] C202	+
muOPG [22-401] C277	-
muOPG [22-401] C319	+
muOPG [22-401] C400	+
muOPG [22-185]
muOPG [22-194]	++
muOPG [22-200]	++
muOPG [22-212]

RO 121386 Β1

Tabelul 1 (continuare)

Construct OPG	Bioactivitate relativă in vitro
muOPG [22-293]	+++
muOPG [22-355]	+++
huOPG [22-401]-Fc	+++
huOPG [22-201]-Fc	+++
huOPG [22-401 ]-Fc P26A	+++
huOPG [22-401 ]-Fc Y28F	+++
huOPG [22-401]	+++
huOPG [27-401]-Fc	++
huOPG [29-401 ]-Fc	++
huOPG [32-401 ]-Fc	+/-

+++, £0^=0,4-2 ng/ml ++, ED5o=2-10 ng/ml +, ED5o=1O-1OO ng/ml -, ED_m> 100 ng/ml

Datele cumulative sugerează că secvențele aminoacide OPG 22^401 murină și umană sunt active pe deplin in vitro, fie când sunt fuzionate la domeniul Fc, fie când sunt nefuzionate. Ele inhibă într-un mod dependent de doză și posedă activități de înjumătățire maxime în domeniul 2-10 ng/ml. Truncarea C-terminusului murin la restul treonină 180 activează molecula, în timp ce truncări la cisteină 185 și în spate au activitatea întreagă. Restul cisteină localizat la poziția 185 este prezis a forma o legătură SS3 în regiunea domeniului 4 al OPG. îndepărtarea acestui rest în alte proteine înrudite TNFR s-a dovedit anterior ca oprind activitatea biologică (Yan et al. J. Bio. Chem. 266.12099-12104 (1994)). Descoperirea noastră că muOPG [22-401]-Fc este inactivă în timp ce muOPG [22-185]-Fc este activă este conformă cu aceste descoperiri. Aceasta sugerează că resturile aminoacide 22-185 definesc o regiune pentru activitatea OPG.

Aceste descoperiri arată că la fel ca OPG exprimată transgenic, proteina OPG recombinantă de asemenea suprimă formarea osteoclastului cum s-a testat în testul formării osteoclastului. Durata experimentelor care examinează apariția celulelor TRAP+, celulelor P3+ și celulelor F480+ în culturi expuse continuu la OPG demonstrează că blochează apariția celulelor TRAP+ și celulelor P3+, dar nu și a celulelor F480+. în contrast, celule TRAP+ și celule P3+ încep să apară cel mai curând la 4 zile după stabilirea culturii în culturi de control, în culturi tratate OPG s-au găsit numai celule F480+ și ele par a fi prezente la calitativ aceleași numere ca și culturile de control. Astfel, mecanismul efectelor OPG in vitro apare a implica o blocadă în diferențirea osteoclastului la o etapă dincolo de apariția monocit-macrofagelor dar înaintea apariției celulelor care exprimă integrine, fie TRAP, fie P3. Colectiv aceste descoperiri arată că OPG nu interferează cu creșterea generală și diferențierea precursorilor monocit-macrofag din măduvă osoasă, ci mai degrabă sugerează că OPG blochează specific diferențierea selectivă a osteoclastelor din precursori monocit-macrofag.

Pentru a determina mai specific când este inhibitoare OPG pe calea diferențierii osteoclastului, s-a folosit o variație a metodei de cultură in vitro. Această variație, descrisă în (Lacey et al, supra). folosește macrofage de măduvă osoasă ca precursori de osteoclast.

RO 121386 Β1

Precursorii osteoclastului sunt derivați luând celule de măduvă osoasă neaderente după o 1 incubare peste noapte în CSF-1/M-CSF și cultivarea celulelor pentru încă 4 zile cu 10002000 U/ml CSF-1. După 4 zile de cultură, denumite faza de creștere, sunt îndepărtate celu- 3 lele neaderente. Celulele aderente, care sunt macrofage de măduvă osoasă, pot fi expuse apoi pentru până la 2 zile la diverse tratamente în prezență de 1000-2000 U/ml CSF-1. 5 Această perioadă de 2 zile este denumită perioadă de diferențiere intermediară. După aceasta, straturile de celule sunt clătite din nou și apoi se adaugă celule ST-2 (1x10⁵ celule/ml), 7 dexametazonă (100 nM) și 1,25 (OH)₂D3 (10 nM) pentru ultimele 8 zile care sunt denumite perioada de diferențiere terminală, în timpul acestei perioade terminale se pot adăuga la fel 9 de bine agenți de testare. Dobândirea markerilor fenotipici ai diferențierii osteoclastului are loc în timpul acestei perioade terminale (Lacey et al„ ibid). 11

S-a testat huOPG [22-401 ]-Fc (100 ng/ml) pentru efectele sale asupra formării osteoclastului în acest model prin adăugarea ei în timpul perioadelor fie intermediară, terminală, 13 fie alternativ, ambele perioade de diferențiere. S-au realizat atât citochimia TRAP, cât și testele în soluție. Rezultatele testului în soluție sunt prezentate în fig. 21. HuOPG [22-401]-Fc 15 a inhibat apariția activității TRAP când s-a adăugat atât la ambele faze intermediară și terminală, cât și numai la faza diferențierii terminale. Când s-a adăugat la faza intermediară și 17 apoi s-a îndepărtat din culturi prin clătire, huOPG [22-401]-Fc nu blochează apariția activității TRAP în lizate de cultură. Rezultatele citochimiei sunt paralele datelor testului în soluție. 19 Colectiv, aceste observații arată că huOPG [22-401 ]-Fc nu mai necesită să fie prezentă în timpul perioadei de diferențiere terminală pentru ca să-și exercite toate efectele sale supre- 21 soare asupra formării osteoclastului.

R. Experimente in vivo provocare IL 1-a și IL1-fi 23

IL1 crește resorbția osului atât sistemic, cât și local, când s-a injectat subcutanat în regiunea oaselor craniene superioare ale șoarecilor (Boyce et al., Endocrinology, 125, 25

1142-1150 (1989)). Efectele sistemice pot fi cercetate prin gradul de hipercalcemie și efectele locale histologic prin cercetarea mărimii relative a răspunsului mediat osteoclast. 27 Scopul acestor experimente a fost să se determine dacă muOPG [22-401]-Fc ar putea modifica acțiunile locale și/sau sistemice ale IL1 când se injectează subcutanat pe aceeași 29 regiune a oaselor craniene superioare ca și IL1.

Experiment IL-1 β 31

Șoareci masculi (ICR Swiss white) în vârstă de 4 săptămâni s-au împărțit în următoarele grupuri de tratament (5 șoareci pe grup): grup de control: animale tratate IL1 (șoarecii 33 au primit 1 injecție/zi de 2,5 pg IL1 -β); animale tratate doză scăzută muOPG [22-401 ]-Fc (șoarecii au primit 3 injecții/zi de 1 pg muOPG [22-401]-Fc); doză scăzută muOPG[22-401]-Fc 35 și ILI-β; animale tratate doză ridicată muOPG [22-401]-Fc (șoarecii primesc 3 injecții/zi de 10 pg muOPG [22-401]-Fc; doză ridicată muOPG [22-401 ]-Fc și IL1 -β. Toți șoarecii au primit37 același număr total de injecții fie de factor activ, fie de vehicul (0,1% albumină serică bovină în fosfat tamponat salin). Toate grupurile s-au sacrificat la 1 zi după ultima injecție. S-au măsu-39 rat greutățile și nivelurile calciului ionizat sanguin înaintea primei injecții, 4 h după a doua injecție și 24 h după a 3-a injecție IL1, chiarînainte ca animalele să fie sacrificate. După sacrificare, 41 s-au îndepărtat oasele craniene superioare și s-au prelucrat pentru secționare în parafină.

Experiment IL1-a43

Șoareci masculi (ICR Swiss whitw) în vârstă de 4 săptămâni s-au împărțit în următoarele grupuri de tratament (5 șoareci pe grup): grup de control: animale tratate ILI-α (șoarecii 45 au primit 1 injecție/zi de 5 pg IL1 -a); animale tratate doză scăzută muOPG [22-401 ]-Fc (șoarecii au primit 1 injecție/zi de 10 pg muOPG [22-401]-Fc; doză scăzută muOPG [22-401]-Fc 47 și IL1 -a (dozare ca mai sus); animale tratate cu doză ridicată muOPG [22-401 ]-Fc (animalele

RO 121386 Β1 au primit 3 injecții/zi de 10 pg muOPG (22-401]-Fc); doză ridicată muOPG [22-401]-Fcși IL1-a. Toți șoarecii au primit același număr total de injecții/zi fie de factor activ, fie de vehicul. Toate grupurile s-au sacrificat la 1 zi după ultima injecție. S-au măsurat nivelurile calciului ionizat sanguin înaintea primei injecții, 4 h după a doua injecție și 24 h după a 3-a injecție IL1, chiar înainte ca animalele să fie sacrificate. S-au măsurat greutățile animalelor înainte de prima injectare, 4 h după a 2-a injectare și 24 h după a 3-a injectare IL1, chiar înainte ca animalele să fie sacrificate. După sacrificare, s-au îndepărtat oasele craniene superioare și s-au prelucrat pentru secționare în parafină.

Metode histologice

Probe de os cranian s-au fixat în zinc formalină, s-au decalcifiat în acid formic, s-au dehidratat cu etanol și s-au montat în parafină. S-au tăiat secțiuni prin osul cranian adiacent suturii lambdoide și s-au colorat fie cu hematoxilină și eozină, fie s-au reacționat pentru activitate tartrat rezistent fosfatază acidă (Sigma Kit # 387A) și s-au contracolorat cu hematoxilină. S-a cercetat resorbția osului la șoareci tratați IL1-a prin metode histomorfometrice folosind Osteomeasure (Osteometrics, Atlanta, GA) prin urmărirea trăsăturilor histologice pe o placă cu indicator numeric, folosind o cameră montată la microscop prin atașare la condensator. S-au determinat numărul osteoclastelor, suprafețele mărginite de osteoclaste și suprafețele erodate în spațiile medulare ale osului. Laturile injectate și neinjectate ale osului cranian s-au măsurat separat.

Rezultate

IL1-a și IL1 -β au produs hipercalcemie la dozele folosite, în special în ziua a 2-a, probabil, prin inducerea resorbției osoase crescute sistemic. Răspunsul hipercalcemie s-a blocat prin muOPG [22-401 ]-Fc la șoareci tratați IL1-beta și s-a diminuat semnificativ la șoareci tratați. IL1 -alfa, un efect cel mai evident în ziua 2 (fig. 22A-22B).

.Analiza histologică a oaselor craniene ale șoarecilor tratați cu IL1-alfa și beta arată că tratamente numai cu IL1 produc o creștere marcată în indiciile resorbției osoase, incluzând: numărul osteoclastelor, suprafața mărginită de osteoclaste și suprafața erodată (suprafețele prezentând zimțuirea adâncă datorate acțiunii osteoclastice (fig. 23B, Tabel 2)). Ca răspuns la IL1-a sau IL1 -β, creșterile în resorbția osului au fost similare pe laturile injectate și neinjectate ale osului cranian. Injecțiile muOPG [22-401]-Fcau redus resorbția osului atât la șoareci tratați IL1-alfa, cât și beta și la șoarecii care au primit numai vehicul, dar această reducere s-a observat numai pe laturile injectate muOPG [22-401 ]-Fc ale oaselor craniene.

Cea mai probabilă explicație pentru aceste observații este că muOPG [22-401]-Fc a inhibat resorbția osului, o concluzie sprijinită de reducerea atât în numărul total al osteoclastelor, cât și în procentul suprafeței de os accesibile supusă resorbției osoasă, în regiunea osului cranian alăturată șirurilor injectării muOPG [22-401]-Fc. Acțiunile muOPG [22-401 ]-Fc au apărut a fi cel mai marcate local prin histologie, dar faptul că de asemenea, muOPG [22-401]-Fc a scurtat hipercalcemia indusă IL1 sugerează că muOPG [22-401]-Fc are efecte mai subtile asupra resorbției sistemice de os.

CM .3 Φ -Q

CO	io	r-.	Oi	V	CO	m
				Y—			T-

RO 121386 Β1

CO CO

Q. O .Φ Φ o £ uj

Număr osteoclaste/ mm² suprafață țesut (medie 1S.D.)	Latură injectată	23,50110,83	60,8915,16	15,2417,54	#47,13124,26		56,03130,70	102,70132,09	#22,65116,68	#66,56115,62
Latură neinjectată	32,511H,O9	71,80118,76	32,731H,09	69,42136,29		51,72123,93	113,60118,04	72,28114,11	146,10142,37
Suprfață erodată % suprafață os (medie 1S.D)	Latură injectată	9,7513,16	37,53110,28	4,1913,61	#25,9416,81		10,0315,13	co io cm 44 O T“ 5	#4,2913,16	# 24,3818,88
Latură neinjectată	8,0713,90	40,6614,28	9,7314,33	44,8718,63		12,6715,04	<0 IO* 44 IO b-* CO	'’t i io τ^- T-	33,6619,21
Suprafață osteoclast % suprafață os (medie ±S.D)	Latură injectată	co CM 44 <5>	16,4012,16	5,0411,66	# 13,2612,50		11,9512,97	I 23,4615,76	# 4,2612,54	# 17,8313,34
Latură neinjectată	12,3613,44	17,1811,30	bco +1 CM o	18,6112,46		11,5614,22	28,8114,84	o CD 44 O 'Φ •rt·	29,5818,80
	Experiment 1	Control	IL1-8 (2,5 ug/zi)	OPG (40 ug/zi)	OPG+ILI-β	Experiment 2	Control	IL1-a (5 \|xg/zi)	OPG (40 ug/zi)	OPG+ILI-a

RO 121386 Β1

C. Efecte sistemice ale muOPG [22-401]-Fc în creșterea șoarecilor

Șoareci masculi BDF1 în vârstă de 3-4 săptămâni, greutate în domeniu 9,2-15,7 g s-au împărțit în grupuri de 10 șoareci pe grup. Acești șoareci s-au injectat subcutanat cu soluție salină sau muOPG [22-401 ]-Fc 2,5 mg/kg bid timp de 14 zile (5 mg/kg/zi). Șoarecii s-au radiografiat înainte de tratament, în ziua 7 și în ziua 14. Șoarecii s-au sacrificat la 24 h după injecția finală. S-a îndepărtat femurul drept, s-a fixat în zinc formalină, s-a decalcifiat în acid formic și s-a imersat în parafină. S-au tăiat secțiuni prin regiunea medie a metafizei femurale distale și axul femural. S-a determinat prin histomorfometrie densitatea osului în 6 regiuni adiacente care se întind de la limita metafizală a plăcii de creștere prin spongioasa primară și secundară și în diafiza femurală (ax). Fiecare regiune a fost de 0,5x0,5 mm².

Schimbări radiografice

După 7 zile de tratament a existat dovada unei zone de densitate osoasă crescută în spongioasa asociată cu plăcile de creștere la șoarecii tratați OPG relativă la cea observată la controale. Efectele au fost surprinzătoare în femurul distal și metafizele tibiale proximale (fig. 24A-24B). Totuși, au fost evidente de asemenea, benzi de densitate crescută în corpurile vertebrale, creasta iliacă și tibia distală. La 14 zile, regiunile de opacitate s-au extins în plus în axele femurale și tibiale, chiar dacă intensitatea radioopacității s-a diminuat. Suplimentar, nu au existat diferențe în lungimea femurelor la sfârșitul experimentului sau în schimbarea în lungime pe durata experimentului implicând că OPG nu modifică creșterea osului.

Schimbări histologice

Metafiza femurală distală a prezentat densitate osoasă crescută într-o regiune de 1,1 până la 2,65 mm distanță de la placa de creștere (fig. 25 și 26A-26B). Aceasta este o regiune în care osul este îndepărtat rapid prin resorbție de os mediată osteoclast la șoareci. La acești șoareci tineri, care cresc rapid, creșterea în os în această regiune observată cu tratament OPG este conformă cu o inhibare a resorbției osului.

L. Efectele Osteoprotegerinei asupra pierderii osului indusă prin ovariectormie la șobolan

Șobolani femele Fisherîn vârstă de 12 săptămâni s-au ovariectomizat (OVX), sau s-a simulat operația și s-au făcut măsurători raze X absorpțiometrie (DEXA) ale densității osului în metafiza femurală distală. După 3 zile de perioadă de recuperare, animalele au primit injecții zilnice timp de 14 zile după cum urmează: 10 animale operate simulat au primit vehicul (fosfat tamponat salin); 10 animale OVX au primit vehicul (fosfat tamponat salin); 6 animale OVX au primit OPG-Fc 5 mg/kg SC; 6 animale OVX au primit pamidronat (PAM) 5 mg/kg SC; 6 animale OVX au primit estrogen (ESTR) 40 pg/kg SC. După 7 și 14 zile de tratament, animalele au avut măsurată prin DEXA densitatea osului. La 2 zile după ultima injectare animalele s-au omorât și s-au îndepărtat tibia și femurul drept pentru evaluare histologică.

Măsurătorile DEXA a densității osului au arătat o tendință spre reducerea densității osului după ovariectomie care a fost blocată prin OPG-Fc. Efectele sale au fost similare celor cunoscute ale agențilorantiresorptivi estrogen și pamidronat (fig. 27). Analiza histomorfometrică a confirmat aceste observații cu tratament OPG-Fc producând o densitate a osului care a fost semnificativ mai ridicată la șobolani OVX decât cea observată la șobolani OVX netratați (fig. 28). Aceste rezultate confirmă activitatea OPG în pierderea de os asociată cu retragerea estrogenului endogen după ovariectomie.

Rezumat in vivo

Acțiunile in vivo ale OPG recombinante sunt paralele schimbărilor observate la șoareci OPG transgenici. Reducerea în numărul de osteoclaste observată în transgenici OPG se reproduce prin injectarea OPG recombinante local pe oase craniene atât la șoareci

RO 121386 Β1 normali, cât și șoareci tratați cu IL1-a sau IL1 -β. Șoareci transgenici OPG dezvoltă un fenotip 1 osteopetrotic cu umplerea progresivă a cavității medulare cu os și cartilaj neremodelat care se extinde de la plăcile de creștere din ziua 1 până după naștere. De asemenea, la șoareci 3 normali în vârstă de 3 săptămâni (în creștere), tratamentele OPG conduc la retenția de os și cartilaj neremodelat în regiunile formării osului endocondral, un efect observat radiografie 5 și confirmat histologic. Astfel, OPG recombinantă produce schimbări fenotipice la animale normale similare celor observate la animale transgenice și schimbările sunt conforme cu inhi- 7 barea OPG a resorpției osului. Pe baza testelor in vitro a formării osteoclastului, o porțiune semnificativă a acestei inhibări este datorată formării de osteoclaste necorespunzătoare. 9 Conform cu această ipoteză, OPG blochează la șobolan osteoporoza indusă de ovariectomie. Pierderea de os în acest model este cunoscută ca fiind mediată de osteoclaste activate, 11 sugerând un rol pentru OPG în tratamentul osteoporozei primare.

Exemplul 12. Peg-ilarea derivaților OPG 13

Prepararea conjugaților PEG-OPG N-terminali prin alchilare reductivă

HuOPG met [22-194] P25A s-a schimbat tampon în 25-50 mM NaOAc, pH 4,5-4,8 15 și s-a concentrat la 2-5 mg/ml. Această soluție s-a folosit pentru a dirija alchilarea reductivă OPG cu aldehide PEG monofuncționale la 5-7’C. Aldehide PEG monofuncționale, lineare 17 sau ramificate, greutate moleculară 1 la 57 kDa (accesibile de la Shearwater Polymers) s-au adăugat la soluția OPG ca solide care constituie 2-4 moli de aldehidă PEG pe mol de OPG. 19

După dizolvarea polimerului în soluția de proteină, s-a adăugat cianoborohidrură de sodiu pentru a da o concentrație finală de 15 la 20 mM în amestecul de reacție de la soluție stoc 21 1-1,6 M preparată proaspăt în apă rece deionizată. Progresul reacției și mărimea PEG-ilării OPG s-a monitorizat prin HPLC de excludere după mărime pe o coloană G3000SWXL (Toso 23

Haas) eluând cu 100 mM NaPO₄,0,5 M NaCI, 10% etanol, pH 6,9. Tipic, reacția s-a lăsat să se desfășoare 16-18 ore, după care amestecul s-a diluat de 6-8 ori și pH-ul s-a scăzut la 3,5-4. 25

Amestecul de reacție s-a fracționat prin cromatografie de schimb ionic (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia) eluând cu 20 mM NaOAc pH 4, cu un gradient linear la 0,75 M NaCI pe 25 volume 27 coloană, la o rată de curgere de 30 cm/oră. Fracțiunile OPG mono-, di-, sau poli-PEG-ilate s-au strâns și s-au caracterizat prin SEC HPLC și SDS-PAGE. Prin secvențare N-terminală, 29 s-a determinat că conjugatul monoPEG-OPG, produsul principal al reacției în majoritatea cazurilor, a fost 98% OPG modificat PEG N-terminal. 31

Această procedură s-a folosit în general pentru a prepara următorii conjugați OPG-PEG N-terminal (unde OPG este HuOPG met [22-194] P25A): 5 kD monoPEG, 10 kD monoPEG 33 ramificat, 12 kD monoPEG, 20 kD monoPEG, 20 kD monoPEG ramificat, 25 kD monoPEG, 31 kD monoPEG, 57 kD monoPEG, 12 kD diPEG, 25 kD diPEG, 31 kD diPEG, 57 kD diPEG, 35 25 kD triPEG.

Prepararea conjugaților PEG-OPG prin acilare 37

HuOPG met [22-194] P25A s-a schimbat tampon în 50 mM în tampon BICINE, pH 8 și s-a concentrat la 2-3 mg/ml. Această soluție s-a folosit pentru a dirija acilarea 39 OPG cu esteri PEG N-hidroxisuccinimidil monofuncționali la temperatura camerei. Esteri PEG N-hidroxisuccinimidil, lineari sau ramificați, greutate moleculară 1 la 57 kDa (accesi- 41 bili de la Shearwater Polymers) s-au adăugat la soluția OPG ca solide în cantități care constituie 4-8 moli de PEG N-hidroxisuccinimidil ester pe mol de OPG. Progresul reacției 43 și mărimea PEG-ilării OPG s-a monitorizat prin HPLC de excludere după mărime pe o coloană G3000SW_xt (Toso Haas) eluând cu 100 mM NaPO₄, 0,5 M NaCI, 10% etanol, 45 pH 6,9. Tipic, reacția s-a lăsat să se desfășoare 1 h, după care amestecul de reacție s-a diluat de 6-8 ori și pH-ul s-a scăzut la 3,5-4. Amestecul de reacție s-a fracționat prin cro- 47 matografie de schimb ionic (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia) eluând cu 20 mM NaOAc

RO 121386 Β1 pH 4, cu un gradient linear la 0,75 M NaCI pe 25 volume coloană, la o rată de curgere de 30 cm/oră. Fracțiunile OPG mono-, di-, sau poli-PEG-ilate s-au strâns și s-au caracterizat prin SEC HPLC și SDS-PAGE.

Această procedură s-a folosit în general pentru a prepara următorii conjugați OPG-PEG: 5 kD poliPEG, 20 kD poliPEG, 40 kD poliPEG ramificat, 50 kD poliPEG.

Prepararea PEG-OPG dimeric

Se prepară huOPG met [22-194] P25A pentru tiolare la 1-3 mg/ml într-un tampon fosfat aproape de pH neutru. Se adaugă anhidridă S-acetil mercaptosuccinică (AMSA) într-un exces molar de 3-7 ori menținând în același timp pH-ul la 7,0 rxn agitat la 4’C pentru 2. OPG-monotiolată este separată de OPG nemodificată și politiolată prin cromatografie de schimb ionic și tiolul protejat se deprotejează prin tratament cu hidroxilamină. După deprotejare, hidroxilamina este îndepărtată prin filtrare în gel și OPG monotiolată rezultată se supune la diverse reacții de reticulare specifice tiol. Pentru generarea unui dimer legat disulfură, OPG tio lată la >1 mg/ml este lăsată să sufere oxidare la aer prin dializă în tampon fosfat ușor bazic. Dimerul OPG tioeter covalent s-a preparat prin reacția reticulantului b/s-maleimidă, N,N-b/s(3-maleimido-propianil)-2-hidroxi-1,3 propan cu OPG tiolată la >1 mg/ml la 0,6x raport molar de reticulant OPG în tampon fosfat la pH 6,5. în mod similar, s-au produs PEG dumbells prin reacția cantităților substoichiometrice a reticulanților b/s-maleimidă PEG cu OPG tiolată la >1 mg/ml în tampon fosfat la pH 6,5. Oricare dintre conjugații dimerici de mai sus poate fi purificat suplimentar folosind fie cromatografia de schimb ionic, fie cea de excludere după mărime.

Conjugații dimerici OPG-PEG (unde OPG este HuOPG met [22-194] P25A) preparați folosind procedurile de mai sus includ primer OPG legat disulfură, dimer OPG tioeter covalent cu un tip de reticulant amină alifatică, 3,4 kDa și 8 kDa dumbells și monobels PEG.

Conjugații OPG-PEG s-au testat pentru activitate in vitro folosind testul de maturare a osteoclastului descris în exemplul 11A și pentru activitate in vivo prin măsurarea densității oslilui crescut după injectare în șoareci cum s-a descris în exemplul 11C. Activitatea in vivo este prezentată mai jos în tabelul 3.

Tabelul 3

Activitatea biologică in vivo a OPG Peg-ilat

Construct OPG	Creștere în densitatea osului tibial
muOPG met [22-194]
muOPG met [22-194] 5k PEG	+
muOPG met [22-194] 20k PEG	+
huOPG met [22-194] P25A
huOPG met [22-194] P25A 5k PEG	+
huOPG met [22-194] P25 A 20k PEG	+
huOPG met [22-194] P25A 3 Ik PEG	+
huOPG met [22-194] P25A 57k PEG	+
huOPG met [22-194] P25 A 12k PEG	+
huOPG met [22-194] P25 A 20k PEG ramificat	+
huOPG met [22-194] P25 A 8k dimer PEG	+
huOPG met [22-194] P25A reticulat disulfură	+

RO 121386 Β1 în timp ce invenția s-a descris cum s-au considerat a fi realizările sale preferate, ea 1 nu trebuie să fie limitată la realizările descrise ci, din contră, se intenționează să se acopere diverse modificări și echivalente incluse în spiritul și întinderea revendicărilor anexate, 3 întindere căreia îi este acordată cea mai largă interpretare, astfel încât să fie cuprinse toate astfel de modificări și echivalente. 5

LISTA DE SECVENȚE7 (1) INFORMAȚIE GENERALĂ:

(i) SOLICITANT: Amgen Inc.9 (ii) TITLUL INVENȚIEI: OSTEOPROTEGERINĂ (iii) NUMĂR DE SECVENȚE: 16811 (iv) ADRESĂ PENTRU CORESPONDENȚĂ:

(A) ADRESANT: Amgen Inc.13 (B) STRADĂ: 1840 Dehavilland Drive (C) ORAȘ: Thousand Oaks15 (D) STAT: California (E) ȚARĂ: Statele Unite17 (F) ZIP: 91320 (v) FORMA CITIBILĂ PE COMPUTER:19 (A) TIP DE MEDIU: Floppy diks (B) COMPUTER: PC compatibil IBM21 (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versiune#1.3023 (vi) DATE CURENTE ALE CERERII:

(A) NUMĂR CERERE:25 (B) DATA DEPOZITULUI:

(C) CLASIFICARE:27 (viii) INFORMAȚIE MANDATAR/AGENT:

(A) NUME: Winter, Robert B.29 (C) REFERINTĂ/NUMĂR DOSAR: A-378-CIP2 (2) INFORMAȚIE PENTRU SEQ ID NR: 131 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 36 baze perechi33 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă35 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN37 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 1:

AAAGGAAGGA AAAAAGCGGC CGCTACANNN NNNNNT 3639 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 2:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:41 (A) LUNGIME: 16 baze perechi (B) TIP: acid nucleic43 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară45 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 2:47

TCGACCCACG CGTCCG16

RO 121386 Β1 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 3:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 12 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 3: GGGTGCGCAG GC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 4:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 18 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 4: TGTAAAACGA CGGCCAGT (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 5:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 18 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 5:

CAGGAAACAG CTATGACC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 6:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 20 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 6: CAATTAACCC TCACTAAAGG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 7:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 23 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 7: GCATTATGAC CCAGAAACCG GAC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 8:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

RO 121386 Β1 (A) LUNGIME: 23 baze perechi1 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă3 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN5 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 8:

AGGTAGCGCC CTTCCTCACA TTC 237 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 9:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:9 (A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic11 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară13 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 9:15

GACTAGTCCC ACAATGAACA AGTGGCTGTG30 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 10:17 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 45 baze perechi19 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă21 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN23 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 10:

ATAAGAATGC GGCCGCTAAA CTATGAAACA GCCCAGTGAC CATTC 4525 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ IDNR: 11:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:27 (A) LUNGIME: 21 baze perechi (B) TIP: acid nucleic29 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară31 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 11:33

GCCTCTAGAA AGAGCTGGGA C21 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ JD NR.:12:35 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 21 baze perechi37 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă39 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN41 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 12:

GCCGTGTTC CATTTATGAG C 2143 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 13:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:45 (A) LUNGIME: 24 baze perechi (B) TIP: acid nucleic47 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară49

RO 121386 Β1 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 13: ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 14:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 24 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 14: GTTGCACTCC TGTTTCACGG TCTG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 15:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 24 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 15:

CAAGACACCT TGAAGGGCCT GATG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 16: <i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 24 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 16: TAACTTTTAC AGAAGAGCAT CAGC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 17:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 33 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 17: AGCGCGGCCG CATGAACAAG TGGCTGTGCT GCG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 18:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 31 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 18: AGCTCTAGAG AAACAGCCCA GTGACCATTC C

RO 121386 Β1

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 19;	1
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 24 baze perechi	3
(B) TIP: acid nucleic
(B) ÎMPLETIRE: simplă	5
(C) TOPOLOGIE: liniară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN	7
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 19:
GTGAAGCTGT GCAAGAACCT GATG	24 9
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 20:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:	11
(A) LUNGIME: 24 baze perechi
(B) TIP: acid nucleic	13
(C) ÎMPLETIRE: simplă
(D) TOPOLOGIE: liniară	15
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 20:	17
ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG	24
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 21:	19
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 24 baze perechi	21
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă	23
(D) TOPOLOGIE: liniară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN	25
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 21:
CAGATCCTGA AGCTGCTCAG TTTG	24 27
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 22:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:	29
(A) LUNGIME: 33 baze perechi
(B) TIP: acid nucleic	31
(C) ÎMPLETIRE: simplă
(D) TOPOLOGIE: liniară	33
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 22:	35
AGCGCGGCCG CGGGGACCAC AATGAACAAG TTG	33
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 23:	37
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 33 baze perechi	39
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă	41
(D) TOPOLOGIE: liniară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN	43
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 23:
AGCTCTAGAA TTGTGAGGAA ACAGCTCAAT GGC	33 45
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 24:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:	47

RO 121386 Β1 (A) LUNGIME: 39 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE:- simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 24:

ATAGCGGCCG CTGAGCCCAA ATCTTGTGAC AAAACTCAC 39 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 25:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 45 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 25:

TCTAGAGTCG ACTTATCATT TACCCGGAGA CAGGGAGAGG CTCTT 45 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 26:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 26: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 27:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 43 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 27: CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTCA CGGATTGAAC CTG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 28:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 28: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 29:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 24 baze perechi (B) TIP: acid nucleic

RO 121386 Β1 (C) ÎMPLETIRE: simplă1 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN3 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 29:

TCCGTAAGAA ACAGCCCAGT GACC 245 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 30:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:7 (A) LUNGIME: 31 baze perechi (B) TIP: acid nucleic9 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară11 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 30:13

CCTCTGCGGC CGCTGTTGCA TTTCCTTTCT G31 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 31:15 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 19 baze perechi17 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă19 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină21 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 31:

Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His Gin Leu Leu23

1010 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 32:25 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 21 baze perechi27 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă29 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN31 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 32:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 2133 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 33:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:35 (A) LUNGIME: 34 baze perechi (B) TIP: acid-nucleic37 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară39 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 33:41

CCTCTGCGGC CGCACACACG TTGTCATGTG TTGC34 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 34:43 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 21 baze perechi45 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă47 (D) TOPOLOGIE: liniară

RO 121386 Β1 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 34: TCCCTTGCCC TGACCACTCT T (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 35:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 34 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 35: CCTCTGCGGC CGCCTTTTGC GTGGCTTCTC TGTT (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 36:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 37 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 36: CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 37:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 37: CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTTA CTGAATGG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 38:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 37 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 38: CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 39:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 33 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN

RO 121386 Β1

(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 39:	1
CCTCTGCGGC CGCCAGGGTA ACATCTATTC CAC	33
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 40:		3
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 35 baze perechi		5
(B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă		7
(D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN		9
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 40: CCGAAGCTTC CACCATGAAC AAGTGGCTGT GCTGC	35	11
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 41: (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:		13
(A) LUNGIME: 40 baze perechi (B) TIP: acid nucleic		15
(C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară		17
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 41:		19
CCTCTGTCGA CTATTATAAG CAGCTTATTT TCACGGATTG	40
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 42:		21
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 21 baze perechi		23
(B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă		25
(D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN		27
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 42: TCCCTTGCCC TGACCACTCT T	21	29
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 43: (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:		31
(A) LUNGIME: 35 baze perechi (B) TIP: acid nucleic		33
(C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară		35
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 43:		37
CCTCTGTCGA CTTAACACAC GTTGTCATGT GTTGC	35
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 44:		39
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 21 baze perechi		41
(B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă		43
(D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN		45
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 44: TCCCTTGCCC TGACCACTCT T	21	47

RO 121386 Β1 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 45:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 35 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 45:

CCTCTGTCGA CTTACTTTTG CGTGGCTTCT CTGTT 35 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 46:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 1537 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 46:

GTGAAGAGCQ	TGAAGAGCGG	TTCCTCCTTT	CAGCAAAAAA	CCCCTCAAGA	CCCGTTTAGA	60
GGCCCCAAGG	GGTTATGCTA	GTTATTGCTC	AGCGGTGGCA	GCAGCCAACT	CAGCTTCCIT	120
TCGGGCTTTC	TTCTTCTTCT	tcttctttcc	GCGGATCCTC	GAGTAAGCTT	CCATGGTACC	180
CTGCAGGTCG	ACACTAGTGA	GCTCGAATTC	CAACGCGTTA	ACCATATGTT	ATTCCTCCTT	240
TAATTAGTTA	AAACAAATCT	AGAATCAAAT	CGATTAATCG	ACTATAACAA	ACCATTTTCT	300
TGCGTAAACC	TGTACGATCC	TACAGGTACT	TATGTTAAAC	AATTGTATTT	CAAGCGATAT	360
AAÎAGTG1GA	CAAAAATCCA	ATTTATTAGA	AlCAAATGTC	AATCTAITAC	CGTTTTAATG	420
ATATATAACA	CGCAAAACTT	GCGACAAACA	ATAGGTAAGG	ATAAAGAGAT	GGGTATGAAA	480
GACATAAATG	CCGACGACAC	TTACAGAATA	ATTAATAAAA	TTAAAGCCTG	TAGAAGCAAT	340
AATGATATTA	ATCAAIGCTT	ATCTGATATG	ACTAAAATGG	TACATTGTGA	ATATTATTTA	600
CTCGCGATCA	TÎTATCCTCA	TTCTATGGTT	AAATCTGATA	TTTCAATTCT	GGATAATTAC	660
CCTAAAAAAT	GGAGGCAATA	TTATGATGAC	GCTAATTTAA	TAAAATATGA	TCCTATAGTA	720
GATTATTCIA	ACTCCAATCA	TICACCGATT	AA1TGGAATA	TATTTGAAAA	CAATGCTGTA	780
AATAAAAAAT	CTCCAAATGT	AATTAAAGAA	GCGAAATCAT	CAGGTCTTAT	CACTGGGTTT	840
AGTTTCCCTA	TTCATACTGC	TAATAATGGC	TTCGGAATGC	TTAGTTTTGC	ACATTCAGAG	900
AAAGACAACT	ATATAGATAG	TTTATTTTTA	CATGCGTGTA	TGAACATACC	ATTAATTGTT	960
CCTTCTCTAG	TTGATAATTA	TCGAAAAATA	AATATAGCAA	ATAATAAATC	AAACAACGAT	1020

RO 121386 Β1

TTAACCAAAA	GAGAAAAAGA	ATGTTTAGCG	TGGGCATGCG	AAGGAAAAAG	CTCTTGGC-AT	1080
ATTTCAAAAA	TATTAGGCTG	TAGTAAGCGC	ACGGTCACTT	TCCATTTAAC	CAATGCGCAA	1140
ATGAAACTCA	ATACAACAAA	CCGCTGCCAA	AGTATTTCTA	AAGCAATTTT	AACAGGAGCA	1200
ATTGATTGCC	CATACTTTAA	AAGTTAAGTA	CGACGTCCAT	ATTTGAAÎGT	ATTTAGAAAA	1260
ATAAACAAAA	GAGTTTGTAG	AAACGCAAAA	AGGCCATCCG	TCAGGATGGC	CTTCTGCTTA	1320
ATtTGAtGCC	TGGCAGTTTA	TGGCGGGCGT	CCTGCCCGCC	ACCCTCCGGG	CCGTTGCTTC	1380
GCAACGTTCA	AATCCGCTCC	CGGCGGATTT	GTCCTACTCA	GGAGAGCGTT	CACCGACAAA	1440
CAACAGATAA	AACGAAAGGC	CCAGTCTTTC	GACTGAGCCT	TTCGTTTTAT	TTGATGCCTG	1500
GCAGTTCCCT	ACTCTCGCAT	GGGGAGACCA	TGCATAC			1537

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 47:15 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚA:

(A) LUNGIME: 48 baze perechi17 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă19 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN21 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 47:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA 4823 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 48:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:25 (A) LUNGIME: 55 baze perechi (B) TIP: acid nucleic27 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară29 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 48:31

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 49:33 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 49 baze perechi35 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă37 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN39 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 49:

CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 4941 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 50:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:43 (A) LUNGIME: 1546 baze perechi (B) TIP; acid nucleic45

RO 121386 Β1 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 50:

GCGTAACGTA	TGCATGGTCT	CCCCATGCGA	GAGTAGGGAA	CTGCCAGGCA	TCAAATAAAA	60
CGAAAGGCTC	AGTCGAAAGA	CTGGGCCTTT	CGTTTTATCT	GTTGTTTGTC	GGTGAACGCT	120
ctcctgagta	GGACAAATCC	GCCGGGAGCG	GATTTGAACG	TTGCGAAGCA	ACGGCCCGGA	1S0
GGGTGGCGGG	CAGGACGCCC	GCCATAAACT	GCCAGGCATC	AAATTAAGCA	GAAGGCCATC	240
CTGACGGATG	GCCTTTTTGC	GTTTCIACAA	AC1CTTITGT	TTATTTTTCT	AAATACATTC	300
AAATATGGAC	GTCGTACTTA	ACTTTTAAAG	TATGGGCAAT	CAATTGCTCC	TGTTAAAATT	360
gctttagaaa	TACTTTGGCA	GCGGTTTGTT	GTATTGAGTT	TCAÎTTGCGC	ATTGGIIAAA	420
TGGAAAGTGA	CCGTGCGCTT	ACTACAGCCT	AATATTTTTG	AAATATCCCA	AGAGCTTTTT	480
CCTTCGCATG	CCCACGCTAA	ACATTCTTTT	TCTCTTTTGG	ÎTAAATCGTT	GTTTGATTTA	540
TTATTTGCTA	TATTTATTTT	TCGATAATTA	TCAACTAGAG	AAGGAACAAT	TAATGGTATG	600
TTCATACACG	CATGTAAAAA	TAAACTATCT	ATATAGTTGT	CTTTCICTGA	ATGTGCAAAA	660
CTAAGCATTC	CGAAGCCATT	ATTAGCAGTA	tgaataggga	aactaaaccc	AGTGATAAGA	720
CCTGATGATT	TCGCTTCTTT	AATTACATTT	GGAGATTTTT	TATllACAGC	ATTGTTTTCA	780
AATATATTCC	AATTAATCGG	TGAATGATTG	GAGTTAGAAT	AATCTACTAT	AGGATCATAT	840
TTTATTAAAT	TAGCGTCATC	ATAATATTGC	CTCCATTTTT	TAGGGTAATT	ATCCAGAATT	900
GAAATATCAG	ATTTAACCAT	agaatgagga	TAAATGATCG	CGAGTAAATA	ATATTCACAA	960
TGTACCATTT	TAGTCATATC	AGATAAGCAT	TGATTAATAT	CATTATTGCT	TCTACAGGCT	1020
TTAATTTTAT	TAATTATTCT	GTAAGTGTCG	TCGGCATTTA	TGTCTTTCAT	ACCCATCTCT	1080
TTATCCTTAC	CTATTGTTTG	TCGCAAGTTT	TGCGTGTTAT	ATATCATTAA	AACGGTAATA	1140
GATTGACATT	TGATTCTAAT	AAATTGGATT	TTTGTCACAC	TATTATATCG	CTTGAAATAC	1200
AATTGTTTAA	CATAAGTACC	TGTAGGATCG	TACAGGTTTA	CGCAAGAAAA	TGGITTGTTA	1260
TAGTCGATTA	ATCGATTTGA	TTCTAGATTT	GTTTTAACTA	ATTAAAGGAG	GAATAACATA	1320
TGGTTAACGC	GTTGGAATTC	GAGCTCACTA	GTGTCGACCT	GCAGGGTACC	ATGGAAGCTT	1380
ACTCGAGGAT	CCGCGGAAAG	AAGAAGAAGA	AGAAGAAAGC	CCGAAAGGAA	GCTGAGTTGG	1440
CTGCTGCCAC	CGCTGAGCAA	TAACTAGCAT	AACCCCTTGG	GGCCTCTAAA	CGGGTCTTGA	1S00

GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACCGCTC TTCACGCTCT TCACGC 1546 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 51:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 47 baze perechi

RO 121386 Β1 (B) TIP: acid nucleic1 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară3 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 51:5

TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCATGC TAGCGTTAAC GCGTTGG 47 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 52:7 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 49 baze perechi9 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă11 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN13 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 52:

AATTCCAACG CGTTAACGCT AGCATGATGG TGATCGTGAT GATGTTTCA 4915 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 53:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:17 (A) LUNGIME: 141 baze perechi (B) TIP: acid nucleic19 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară21 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 53:23

CTAATTCCGC TCTCACCTAC CAAACAATGC CCCCCTGCAA AAAATAAATT CATATAAAAA60

ACATACAGAT AACCATCTGC GGTGATAAAT TATCTCTGGC GGTGTTGACA TAAATACCAC 120

TGGCGGTGAT ACTGAGCACA T141 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 54:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 147 baze perechi (B) TIP: acid nueleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 54:

CGATGTGCTC AGTATCACCG ccagtggtat TTATGTCAAC ACCGCCAGAG ATAATTTATC accgcagatg gttatctgta tgttttttat atgaatttat TTTTTGCAGG GGGGCATTGT TTGGTAGGTG AGAGCGGÂAT TAGACGT (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 55:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 55 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară

12° 39

147

RO 121386 Β1 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 55:

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 56:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 49 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 56:

CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 57:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 668 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 57:

GTGAAGAGCG TGAAGAGCGG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA CCCGTTTAGA	60 120
GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT	CAGCTTCCTT
TCGGGCTTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTTCC GCGGATCCTC GAGTAAGCTT	CCATGGTACC	180
CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTCGAATTC CAACGCGTTA ACCATATGTT	ATTCCTCCTT	240
TAATTAGTTA ACTCAAATCT AGAATCAAAT CGATAAAÎTG TGAGCGCTCA	CAATTGAGAA	300
TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA tgaatttttt aaaaattatg	AGACGTCCAT	360
ATTTGAATGT AÎTTAGAAAA ATAAACAAAA GAGTTTGTAG AAACGCAAAA	AGGCCATCCG	420
TCAGGATGGC cttctgctta atttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt	CCTGCCCGCC	480
ACCCTCCGGG CCGTTGCTTC GCAACGTTCA AATCCGCTCC CGGCGGAITT	GTCCTACTCA	540
GGAGAGCGTT caccgacaaa caacagataa AACGAAAGGC ccagtctttc	GACTGAGCCT	600

TTCGTTTTAT TTGATGCCTG GCAGTTCCCT ACTCTCGCAT GGGGAGACCA

TGCATACGTT

ACGCACGT (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 58:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 726 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 58:

660

668

RO 121386 Β1

GCGTAACGTA	TGCATGGTCT	CCCCATGCGA	gagtagggaa	CTGCCAGGCA	TCAAATAAAA	60	1
CGAAAGGCTC	AGTCGAAAGA	CTGGGCCTTT	CGTTTTATCT	GTTGTTTGTC	GGTGAACGCT	120	3
CTCCTGAGTA	GGACAAATCC	GCCGGGAGCG	GATTTGAACG	TTGCGAAGCA	ACGGCCCGGA	180	5
GGGTGGCGGG	CAGGACGCCC	GCCATAAACT	GCCAGGCATC	AAATTAAGCA	GAAGGGGCCT	240
CCCACCGCCC	GTCCTGCGGG	CGGTATTTGA	CGGTCCGTAG	TTIAATTCGT	CTTCGCCATC	300	7
ctgacggatg	GCCTTTTTGC	GTTTCTACAA	ACTCTTTTGT	TTATTTTTCT	AAATACATTC	360	9
AAATATGGAC	GTCTCATAAT	TTTTAAAAAA	TTCATTTGAC	AAATGCTAAA	ATTCTTGATT	420	11
AATATTCTCA	ATTGTGAGCG	CTCACAATTT	ATCGATTTGA	TTCTAGATTT	GTTTTAACTA	480	13
ATTAAAGGAG	GAATAACATA	TGGTTAACGC	GTTGGAATTC	GAGCTCACTA	GTGTCGACCT	540
GCAGGGTACC	ATGGAAGCTT	actcgaggat	CCGCGGAAAG	AAGAAGAAGA	AGAAGXAAGC	600	15
CCGAAAGGAA	GCTGAGÎTGG	CTGCTGCCAC	CGCTGAGCAA	TAACIAGCAT	AACCCCTTGG	660	17
GGCCTCTAAA	CGGGTCTTGA	GGGGTTTTTT	GCTGAAAGGA	GGAACCGCTC	TTCACGCTCT	720

TCACGC 726 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 59:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:23 (A) LUNGIME: 44 baze perechi (B) TIP: acid nucleic25 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară27 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 59:29

TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT GGAC44 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 60:31 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 27 baze perechi33 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă35 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN37 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 60:

GTCCTCCTGG TACCTACCTA AAACAAC 2739 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 61:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:41 (A) LUNGIME: 102 baze perechi (B) TIP: acid nucleic43 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară45 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 61:47

RO 121386 Β1

TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG

GTACCCGGCG

GACATTTATC ACACAGCAGC TGATGAGAAG TTTCTTCATC CA 102 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 62:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 19 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 63:

Met Asp Glu Glu Thr Ser His Gin Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro 15 10 15

Gly Thr Tyr (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 65:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 8 4 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 63:

TATGGAAACT TTICCTCCAA AATATCTTCA TTATGATGAA

GAAACTTCTC

ATCAGCTGCT

GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC 84 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 64:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 78 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 64:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCATAA

TGAAGATATT 60TTGGAGGAAA AGTTTCCA (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 65:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 44 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 65:

TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTCACGGATT GAAC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 66:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

RO 121386 Β1

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă	1 3
(D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN		5
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 66: GTGCTCCTGG TACCTACCTA AAACAGCACT GCACAGTG	38	7
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 67: (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:		9
(A) LUNGIME: 84 baze perechi (B) TIP: acid nucleic		11
(C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară		13
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 67:		15
TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA TTACGATCCG	GAAACTGGTC
ATCAGCTGCT 60GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC	84	17
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 68: (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:		19
(A) LUNGIME: 78 baze perechi (B) TIP: acid nucleic		21
(C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară		23
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 68:		25
CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC	CGGATCGTAA

TGCAGGTATT 60TTGGAGGCAG AGTTTCCA 7827 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 69:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:29 (A) LUNGIME: 54 baze perechi (B) TIP; acid nucleic31 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară33 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 69:35

TATGGACCCA GAAACTGGTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC 54 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 70:37 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 48 baze perechi39 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă41 (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN43 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 70:

CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC TGGGTCCA 4845 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 71:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:47

RO 121386 Β1 (A) LUNGIME: 87- baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 71:

TATGAAAGAA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCATTACGAT GTCATCAGCT

GCTGTGTGAT AAATGTGCTC CGGGTAC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 72:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 81 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 72: CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC TGCAGGTATT

TTGGAGGCAG AGTTTCTTTC A (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 73:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 71 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 73: GTTCTCCTCA TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCATGA CCAAAATACC

TGCATTACGA T

CCGGAAACTG

CGGATCGTAA

AACTCTGCCT (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 74:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 43 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 74 GTTCTCCTCA TATGAAAGAA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCA (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 75:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 7 6 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN

RO 121386 Β1

(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 75:	1
TACGCACTGG ATCCTTAATG ATGGTGATGG TGATGATGTA	AGCAGCTTAT
TTTCACGGAT		60	3
TGAACCTGAT TCCCTA		76
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 76:			5
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 47 baze perechi			7
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă			9
(D) TOPOLOGIE: liniară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN			11
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 76:
GTTCTCCTCA TATGAAATAC CTGCATTACG ATCCGGAAAC TGGTCAT	47	13
2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 77:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:			15
(A) LUNGIME: 43 baze perechi
(B) TIP: acid nucleic			17
(C) ÎMPLETIRE: simplă
(D) TOPOLOGIE: liniară			19
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 77:			21
GTTCTCCTAT TAATGAAATA TCTTCATTAT GATGAAGAAA CTT		43
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 78:			23
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 40 baze perechi			25
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă			27
(D) TOPOLOGIE: liniară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN			29
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 78:
TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT		40	31
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 79:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:			33
(A) LUNGIME: 40 baze perechi
(B) TIP: acid nucleic			35
(C) ÎMPLETIRE: simplă
(D) TOPOLOGIE: liniară			37
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 79:			39
GTTCTCCTCA TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA		40
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 80:			41
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 43 baze perechi			43
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă			45
(D) TOPOLOGIE: liniară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN			47

RO 121386 Β1 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 80:

TACGCACTGG ATCCTTATGT TGCATTTCCT TTCTGAATTA GCA 43 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 81:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 18 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 81: CCGGAAACAG ATAATGAG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 82:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 18 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 82: GATCCTCATT ATCTGTTT (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 83:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 83:

CCGGAAACAG AGAAGCCACG CAAAAGTAAG (2) INFORMAȚIA FENTRU SEQ ID NR: 84:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 84: GATCCTTACT TTTGCGTGGC TTCTCTGTTT (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 85:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 12 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 85: TATGTTAATG AG

RO 121386 Β1

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 86:	1
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 14 baze perechi	3
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă	5
(D) TOPOLOGIE: liniară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN	7
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 86:
GATCCTCATT AACA	14 9
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 87:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:	11
(A) LUNGIME: 21 baze perechi
(B) TIP: acid nucleic	13
(C) ÎMPLETIRE: simplă
(D) TOPOLOGIE: liniară	15
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 87:	17
TATGTTCCGG AAACAGTTAA G	21
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 88:	19
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 23 baze perechi	21
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă	23
(D) TOPOLOGIE: liniară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN	25
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 88:
GATCCTTAAC TGTTTCCGGA ACA	23 27
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 89:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:	29
(A) LUNGIME: 36 baze perechi
(B) TIP: acid nucleic	31
(C) ÎMPLETIRE: simplă
(D) TOPOLOGIE: liniară	33
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 89:	35
TATGTTCCGG AAACAGTGAA TCAACTCAAA AATAAG	36
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 90:	37
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 38 baze perechi	39
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă	41
(D) TOPOLOGIE: liniară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN	43
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 90:
GATCCTTATT TTTGAGTTGA TTCACTGTTT CCGGAACA	38 45
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 91:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:	47

RO 121386 Β1 (A) LUNGIME:100 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 91:

CTAGCGACGA CGACGACAAA GAAACTCTGC CTCCAAAATA CCTGCATTAC

GATCCGGAAA

CTGGTCATCA GCTGCTGTGT GATAAATGTG CTCCGGGTAC 100 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 92:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 92 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 92: CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC

TGCAGGTATT

TTGGAGGCAG AGTTTCTTTG TCGTCGTCGT CG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 93:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 26 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 93: ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGA

CGGATCGTAA (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 94:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 50 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 94:

TTTGTTTTAA CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATATGAGAGG ATCGCATCAC 50 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 95:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 50 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 95:

CATCACCATC ACGAAACCTT CCCGCCGAAA TACCTGCACT ACGACGAAGA 50

RO 121386 Β1 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 96:1 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 49 baze perechi3 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă5 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN7 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 96:

AACCTCCCAC CAGCTGCTGT GCGACAAATG CCCGCCGGGT ACCCAAACA 499 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 97:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:11 (A) LUNGIME: 26 baze perechi (B) TIP: acid nucleic13 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară15 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 97:17

TGTTTGGGTA CCCGGCGGGC ATTTGT26 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 98:19 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 50baze perechi21 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă23 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN25 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 98:

CGCACAGCAG CTGGTGGGAG GTTTCTTCGT CGTAGTGCAG GTATTTCGGC 5027 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 99:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:29 (A) LUNGIME: 49 baze perechi (B) TIP: acid nucleic31 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară33 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 99:35

GGGAAGGTTT CGTGATGGTG ATGGTGATGC GATCCTCTCA TATTTTATT 49 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 100:37 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 50 baze perechi39 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă41 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN43 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 100:

CCTCCTTTAA TTAGTTAAAA CAAATCTAGT ATCAAATCGA TTGTGTTTGT 5045 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 101:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:47

RO 121386 Β1 (A) LUNGIME: 59 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 101:

ACAAACACAATCGATTTGATACTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAAAATG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 102:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 31 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 102:

CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAGAAA CTTTTCCTCC AAAATATC 48 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 103:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 31 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 103:

TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C 31 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 104:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 59 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 104:

ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAAATG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 105:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 54 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 105:

CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAAAAA AAGAAACTTT TCCTCCAAAA TATC 54 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 106:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 31 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă

RO 121386 Β1 (D) TOPOLOGIE: lineară1 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 106:3

TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C31 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 107:5 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 44 baze perechi7 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă9 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN11 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 107:

CAGCCCGGGT AAAATGGAAA CGTTTCCTCC AAAATATCTT CATT 413 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 108:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:15 (A) LUNGIME: 44 baze perechi (B) TIP: acid nucleic17 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară19 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 108:21

CGTTTCCATT TTACCCGGGC TGAGCGAGAG GCTCTTCTGC GTGT44 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 109:23 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 45 baze perechi25 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă27 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN29 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 109:

CGCTCAGCCC GGGTAAAATG GAAACGTTGC CTCCAAAATA CCTGC 4531 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 110:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:33 (A) LUNGIME: 39 baze perechi (B) TIP: acid nucleic35 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară37 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 110:39

CCATTTTACC CGGGCTGAGC GAGAGGCTCT TCTGCGTGT39 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 111:41 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 36 baze perechi43 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă45 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN47 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 111:

GAAAATAAGC TGCTTAGCTG CAGCTGAACC AAAATC 3649 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 112:

RO 121386 Β1 (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 34 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 112:

CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTCACGG ATTG 34 (2) - INFORMAȚIA FENTRU SEQ ID NR: 113:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 36 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 113: AAAAATAAGC TGCTTAGCTG CAGCTGAACC AAAATC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 114:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 35 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 114: CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTTACTG ATTGG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 115:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 102 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 115: CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TGCTCCAAAA

TATCTTCATT

ATGATGAAGA 60

AACTAGICAT CAGCTGCTGT GTGATAAATG TCCGCCGGGT AC 102 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 116:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 94 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 116: CCGGCGGACA TTTATCACAC ’ AGCAGCTGAT GACTAGTTTC

TGAAGATATT

TTGGAGCAAA AGTTTCCATA TGTTATTCCT CCTT (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 117:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

TTCATCATAA

RO 121386 Β1 (A) LUNGIME: 62 baze perechi1 (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă3 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN5 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 117:

CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TCCTGCTAAA TATCTTCATT7

ATGATGAAGA AA (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 118:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 62 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 118:

CTAGTTTCTT CATCATAATG AAGATATTTA GCAGGAAAAG

TTTCCATATG

TTATTCCTCC 60

TT 62 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 119:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 51 aminbacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 119:

Tyr 1

His

Tyr

Tyr Asp Gin Asn Gly Arg Met Cys Glu Glu Cys His Met

5

10

15

Cys

Gin

Pro

Gly

His

Phe

Leu

Val

Lys

His

cys

Lys

Gin

Pro

Lys

Arg

20

25

30

Asp

Thr

val

Cys

His

LyS

Pro

Cys

Glu

Pro

Gly

Val

Thr

Tyr

Thr

Asp

35

40

45

Asp Trp His (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 120:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 2432 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/COD: CDS (B) LOCALIZARE: 124...1326 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 120:

RO 121386 Β1

ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTGTTGCCC AGACCTTATA TAAAACGTCA TGTTCGCCTG

60

GGCAGCAGAG AAGCACCTAG CACTGGCCCA GCGGCTGCCG

CCTGAGGTTT CCAGAGGACC

120

ACA

ATG

AAC

AAG

TGG

CTG

TGC

TGT

GCA

CTC

CTG

GTG

TTC

TTG

GAC

ATC

168

Mec

Asn

Lys

Trp

Leu

Cys

Ala

Leu

Val

Phe

Leu

Asp

Ile

1

5

10

15

ATT

GAA

TGG

ACA

ACC

CAG

GAA

ACC

TTT

CCT

CCA

AAA

TAC

TTG

CAT

TAT

216

11«

Glu

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

20

25

30

GAC

CCA

GAA

ACC

GGA

CGT

CAG

CTC

TTG

TGT

GAC

AAA

TGT

GCT

CCT

GGC

264

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

Arg

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

3S

40

45

ACC

TAC

CTA

AAA

CAG

CAC

TGC

ACA

GTC

AGG

AAG

ACA

CTG

TGT

GTC

312

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

val

50

55

60

CCT

TGC

CCT

GAC

TAC

TCT

TAT

ACA

GAC

AGC

TGG

CAC

ACG

AGT

GAT

GAA

360

Pro

Cys

Pro

Asp

Tyr

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

65

70

75

TGC

GTG

TAC

TGC

AGC

CCC

GTG

TGC

AAG

GAA

CTG

CAG

ACC

GTG

AAA

CAG

408

Cys

Val

Tyr

Cys

ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Thr

val

Lys

Gin

80

85

90

95

GAG

TGC

AAC

CGC

ACC

CAC

AAC

CGA

GTG

TGC

GAA

TGT

GAG

GAA

GGG

CGC

456

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

100

105

110

TAC

CTG

GAG

CTC

GAA

TTC

TGC

TTG

AAG

CAC

CGG

AGC

TGT

CCC

CCA

GGC

504

Tyr

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

115

120

125

TTG

GGT

GTG

CTG

CAG

GCT

GGG

ACC

CCA

GAG

CGA

AAC

ACG

GTT

TGC

AAA

552

Leu

Gly

Val

Leu

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

130

135

140

AGA

TGT

CCG

GAT

GGG

TTC

TCA

GGT

GAG

ACG

TCA

TCG

AAA

GCA

CCC

600

Arg

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lya

Ala

Pro

145

150

155

TGT

AGG

AAA

CAC

ACC

AAC

TGC

AGC

TCA

CTT

GGC

CTC

CTG

CTA

ATT

CAG

648

Cys

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Gly

Leu

Ile

Gin

160

165

170

1.75

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAT

GAC

AAT

GTA

TGT

TCC

GGA

AAC

AGA

GAA

GCA

696

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

G1U

Ala

180

165

190

ACT

CAA

AAT

TGT

GGA

ATA

GAT

GTC

ACC

CTG

TGC

GAA

GAG

GCA

TTC

744

Thr

Gin

Asn

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

195

200

205

AGG

TTT

GCT

GTG

CCT

ACC

AAG

ATT

ATA

CCG

AAT

TGG

CTG

AGT

GTT

CTG

792

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

210

215

220

GTG

GAC

AGT

TTG

CCT

GGG

ACC

AAA

GTG

AAT

GCA

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

840

Val

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

225

230

235

RO 121386 Β1

ATA 11« 240

AAA CGG AGA

CAC AGC

TCG CAA GAG

CAA ACT TTC CAG CTA CTT AAG

888

1 3

Lys

Arg

His

Ser 245

Sex

Gin Glu

Gin

Thr Phe 2S0

Gin Leu Leu Lys 255

CTG

TGG

AAG

CAT

CAA

AAC

AGA

GAC

CAG

GAA

ATG

GTG

AAG

ATC

936

5

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

val

Lys

Ile

11«

260

265

270

7

CAA

GAC

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AGC

AGT

GTG

CAA

CGG

CAT

ATC

GGC

CAC

984

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

ser

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

9

275

280

285

GCG

AAC

CTC

ACC

ACA

GAG

CAG

CTC

CGC

ATC

TTG

ATG

GAG

AGC

TTG

CCT

1032

11

Al*

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

Arg

Ile

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

290

295

300

13

GGG

AAG

ATC

AGC

CCA

GAC

GAG

ATT

GAG

AGA

ACG

AGA

AAG

ACC

TGC

1080

Gly

Lys

Ile

Ser

Pro

Asp

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

15

305

310

315

AAA

CCC

AGC

gag

CAG

CTC

CTG

AAG

CTA

CTG

AGC

TTG

TGG

AGG

ATC

AAA

1128

17

Lys

Pro

S«r

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

320

325

330

335

19

AAT

GGA

GAC

CAA

GAC

ACC

TTG

AAG

GGC

CTG

ATG

TAC

GCA

CTC

AAG

CAC

1176

Asn

Gly

ASp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

21

340

345

350

TTG

AAA

GCA

TAC

CAC

ΤΤΪ

CCC

AAA

ACC

GTC

ACC

CAC

AGT

CTG

AGG

AAG

1224

23

Leu

Lys

Ala

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

355

360

365

25

ACC

ATC

AGG

TTC

TTG

CAC

AGC

TTC

ACC

ATG

TAC

CGA

TTG

TAT

CAG

AAA

1272

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

27

370

375

380

CTC

TTT

CTA

GAA

ATG

ATA

GGG

AAT

CAG

GTT

CAA

TCA

GTG

AAG

ATA

AGC

1320

29

Leu

phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gin

val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

385 390 395

TGC TTA TAGTTAGGAA TGGTCACTGG GCTGTTTCTT CAGGATGGGC CAACACTGAT1376

Cys Leu33

400

GGAGCAGATG GCTGCTTCTC CGGCTCTTGA AATGGCAGTT GATTCCTTTC TCATCAGTTG1436

GTGGGAATGA AGATCCTCCA GCCCAACACA CACACTGGGG AGTCTGAGTC AGGAGAGTGA 149637

GGCAGGCTAT TTGATAATTG TGCAAAGCTG CCAGGTGTAC ACCTAGAAAG TCAAGCACCC1556

RO 121386 Β1

TGAGAAAGAG GATAITTTIA TAACCTCAAA CA1AGGCCCT TTCCTTCCTC TCCTTATGGA	1616
TGAGTACTCA GAAGGCTTCT ACTATCTTCT GTGTCAICCC ÎAGATGAAGG CCTCÎTTTAT	1676
TTMTTTTTT ATTCTTTTTT TCGGAGCTGG GGACCGAACC CAGGGCCTTG CGCTKJCGAG	1736
GCAAGTGCTC TACCACTGAG CTAAATCICC AACCCCTGAA GGCCTCTTTC TTTCTGCCTC	1796
TGATAGTCTA TGACATTCTT TTTTCTACAA TTCGTATCAG GTGCACGAGC CTTATCCCAT	1856
TTGTAGGTTT CTAGGCAAGT TGACCGTTAG CTATTTTTCC CTCTGAAGAT TTGATTCGAG	1916
TTGCAGACTT GGCTAGACAA GCAGGGGTAG GTTATGGTAG TTTATTTAAC AGACTGCCAC	1976
CAGGAGTCCA GTGTTTCTTG TTCCTCTGTA GTTGTACCTA AGCTGACTCC AAGTACATTT	2036
AGTATGAAAA ATAATCAACA AATTTTATTC CTTCTATCAA CATTGGCTAG CTTTGITTCA	2096
GGGCACTAAA AGAAACTACT ATATGGAGAA AGAATTGATA TTGCCCCCAA CGTTCAACAA	2156
CCCAATAGTT TATCCAGCTG TCATGCCTGG TTCAGTGTCT ACTGACTATG CGCCCTCTTA	2216
TTACTGCATG CAGTAATTCA ACTGGAAATA GTAATAATAA TAATAGAAAT AAAATCTAGA	2276
CTCCATTGGA TCTCTCTGAA TATGGGAATA TCTAACTTAA GAAGCÎTTGA GATTTCAGTÎ	2336
GTGTTAAAGG CTT7TATTAA AAAGCTGATG CTCTTCTGTA AAAGTTACTA ATATATCTGT	2396
AAGACTA1TA CAGTATTGCT ATTTATATCC ATCCAG	2432

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 121:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 401 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 121:

Met Agn Lys Trp

Leu Cys Cys Ala Leu

Leu Val Phe Leu Asp

Ile Ile

Glu Trp Thr Thr

Gin Glu Thr Phe Pro

Pro Lys Tyr Leu His

Tyr Asp

RO 121386 Β1

pro Glu Thr Gly Arg 35

Gin Leu

Leu Cys Asp Lys 40

Cys Ala Pro Gly Thr

45

Val

Pro

3 5

Tyr

Leu Lys 50

Gin His

Cys

Thr 55

Val

Arg

Arg Lys

Thr 60

Leu

Cys

Pro

Asp

Tyr

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

7

65

70

75

80

Val

Tyr Cys

Ser

Pro

val

Cys

LyS

Glu

Leu

Gin

Thr

Val

Lys

Gin

Glu

9

85

90

95

11

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly Arg

Tyr

100

105

110

13

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Leu

115

120

125

15

Gly

Vel

Leu

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

17

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

19

145

150

155.

160

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

21

165

170

175

23

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

180

185

190

25

Gin

Asn

Cys

Gly

ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

G1U

Glu

Ala

Phe

Arg

195

200

205

27

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

29

210

215

220

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

31

225

230

233

240

Lys

Arg

Hls

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

33

245

250

255

35

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

ile

Gin

2 60

265

270

37

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

Hls

Ile

Gly

HiS

Ala

39

275

280

285

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

Arg

Ile

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

41

290 295 300

RO 121386 Β1

Lys 305

Lys

Ile Ser

Pro

Asp Glu 310

Ile

Glu Arg

Thr Arg Lys Thr Cys Lys

315

320

Pro

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

325

330

335

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

340

345

350

Lys

Ala

Tyr

Hls

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

Hls

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

355

360

365

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

370

375

380

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gin

val

Gin

Ser

val

Lys

Ile

Ser

Cys

385

390

39S

400

Leu (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 122:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚA:

(A) LUNGIME: 1324 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/COD: CDS (3) LOCALIZARE: 90...1292 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 122:

CCTTATATAA ACGTCATGAT TGCCTGGGCT GCAGAGACGC ACCTAGCACT GACCCAGCGG

CTGCCTCCTG AGGTTTCCCG AGGACCACA ATG	AAC	AAG	TGG	CTG	TGC	TGC	GCA	113
Mac 1	Asn	Lys	Trp	Leu 5	Cys	Cys	Ala

CTC

CTG

GTG

CTC

CTG

GAC

ATC

ATT

GAA

TGG

ACA

ACC

CAG

GAA

ACC

CTT

161

Leu

Val

Leu

Asp

Ile

ile

Glu

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

Leu

10

15

20

RO 121386 Β1

CCT CCA Pro Pro 2S

AAG TAC TTG CAT

TAT GAC CCA GAA ACT GGT CAT CAG CTC CTG

209

1 3

Lys

Tyr Leu

His 30

Tyr

Asp

Pro

Glu

Thr Gly His Gin Leu Leu

35

40

TGT

GAC

AAA

TGT

GCT

CCT

GGC

ACC

TAC

CTA

AAA

CAG

CAC

TGC

ACA

GTG

257

5

Cys

Asp

Lys

Cyâ

Ala

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

cys

Thr

Val

45

50

55

7

AGG

AAG

ACA

TTG

TGT

GTC

CCT

TGC

CCT

GAC

CAC

TCT

TAT

ACG

GAC

305

Arg

Arg Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Ser

Tyr

Thr

Asp

9

60

65

70

AGC

TGG

CAC

ACC

AGT

GAT

GAG

TGT

GTG

TAT

TGC

AGC

CCA

GTG

TGC

AAG

353

11

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

75

80

85

13

GAA

CTG

CAG

TCC

GTG

AAG

CAG

GAG

TGC

AAC

CGC

ACC

CAC

AAC

CGA

GTG

401

Glu

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

15

90

95

100

TGT

GAG

TGT

GAG

GAA

GGG

CGT

TAC

CTG

GAG

ATC

GAA

TTC

TGC

TTG

AAG

449

17

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

105

110

115

120

19

CAC

CGG

AGC

TGT

CCC

CCG

GGC

TCC

GGC

GTG

CAA

GCT

GGA

ACC

CCA

497

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

21

125

130

135

GAG

CGA

AAC

ACA

GTT

TGC

AAA

TGT

CCA

GAT

GGG

TTC

TCA

GGT

545

23

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Sar

Gly

140

145

150

25

GAG

ACT

TCA

TCG

AAA

GCA

CCC

TGT

ATA

AAA

CAC

ACG

AAC

TGC

AGC

ACA

593

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

Ile

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Thr

27

155

160

165

TTT

GGC

CTC

CTG

CTA

ATT

CAG

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAT

GAC

AAC

GTG

641

29

Phe

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

170

175

180

31

TGT

TCC

GGA

AAC

AGA

GAA

GCC

ACG

CAA

AAG

TGT

GGA

ATA

GAT

GTC

ACC

689

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

33

185

190

195

200

CTG

TGT

GAA

GAG

GCC

TTC

AGG

TTT

GCT

GTT

CCT

ACC

AAG

ATT

ATA

737

35

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

205

210

215

37

RO 121386 Β1

CCA Pro

AAT TGG CTG AGT GTT

TTG Leu

GTG Val

GAC AGT TTG CCT GGG ACC AAA GTG

785

Asn

Trp

Leu Ser 220

Val

Asp 225

Ser Leu

Pro

Gly Thr 230

Lys Val

AAT

GCC

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

ATA

AAA

CGG

AGA

CAC

AGC

TCA

CAA

GAG

833

Asn

Aia

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

His

Ser

Gin

Glu

235

240

245

CAA

ACC

TTC

CAG

CTG

AAG

CTG

TGG

AAA

CAT

CAA

AAC

AGA

GAC

CAG

881

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

250

255

260

GAA

ATG

GTG

AAG

ATC

CAA

GAC

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AGC

929

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

265

270

275

280

GTG

CAG

CGG

CAT

CTC

GGC

CAC

TCG

AAC

CTC

ACC

ACA

GAG

CAG

CTT

977

Vai

Gin

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

285

290

295

GCC

TTG

ATG

GAG

AGC

CTG

CCT

GGG

AAG

ATC

AGC

CCA

GAA

GAG

ATT

1025

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Ile

Ser

Pro

Glu

Ile

300

305

310

GAG

AGA

ACG

AGA

AAG

ACC

TGC

AAA

TCG

AGC

GAG

CAG

CTC

CTG

AAG

CTA

1073

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

315

320

325

CTC

AGT

TTA

TGG

AGG

ATC

AAA

AAT

GGT

GAC

CAA

GAC

ACC

TTG

AAG

GGC

1121

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

ASp

Thr

Leu

Lys

Gly

330

335

340

CTG

ATG

TAT

GCC

CTC

AAG

CAC

TTG

AAA

ACA

TCC

CAC

TTT

CCC

AAA

ACT

1169

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Thr

Ser

His

Phe

Pro

Lys

Thr

345

350

355

360

GTC

ACC

CAC

AGT

CTG

AGG

AAG

ACC

ATG

AGG

TTC

CTG

CAC

AGC

TTC

ACA

1217

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

Met

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Fhe

Thr

365

370

375

ATG

TAC

AGA

CTG

TAT

CAG

AAG

CTC

TTT

TTA

GAA

ATG

ATA

GGG

AAT

CAG

1265

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Aăn

Gin

380

385

390

GTT

CAA

TCC

GTG

AAA

ATA

AGC

TGC

TTA

TAACTAGGAA

TGGTCACTGG

1312

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Leu

395 400

GCTGTTTCTT CA 1324

RO 121386 Β1 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 123:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 401 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 123:

Met

Asn

Lys

Trp

Leu

Cys

Cys.Ala

Leu

Val

Leu

Asp

Ile

9

1

5

10

15

Glu

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

Leu

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

11

20

25

30

13

Pro

Glu

Thr

Gly

His

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

35

40

45

15

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

Arg Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

17

50

55

60

Cys

Pro

Asp

His

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

19

65

30

75

80

val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cy9

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Gin

Glu

21

85

90

95

23

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr·

100

105

110

25

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Ser

115

120

125

27

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

29

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

31

145

150

155

160

Ile

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Thr

Phe

Gly

Leu

ile

Gin

Lys

33

165

170

175

35

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

180

185

190

37

Gin

Lys

Cys

Gly

ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

19S

200

205

¹

39

RO 121386 Β1

Phe

Ala Val Pro 210

Thr

Lys

Ile Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val

215

220

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

225

230

235

240

Lys

Arg

His

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

245

250

255

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

260

265

270

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

275

280

285

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

290

295

300

Lys

Ile

Ser

Pro

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

cys

Lys

305

310

315

320

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

325

330

335

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

340

345

3S0

Lys

Thr

Ser

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

355

360

365

Met

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

370

375

380

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

385	390	395	400
Leu

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 124:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 1355 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (ix) TRĂSĂTURĂ:

(A) NUME/COD: CDS (B) LOCALIZARE: 94...1296 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 124:

100

RO 121386 Β1

GTATATATAA CGTGATGAGC GTACGGGTGC GGAGACGCAC CGGAGCGCTC GCCCAGCCGC 60

CGCTCCAAGC CCCTGAGGTT TCCGGGGACC ACA ATG AAC AAG TTG CTG TGC TGC Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys 1 5

114

GCG CTC Ala Leu TTT CCT Phe Pro

GTG TTT

CTG Leu TAC Tyr

GAC ATC TCC ATT AAG TGG ACC ACC CAG GAA ACG

162 210

7 9 11

Val 10 CCA Pro

Phe AAG Lys

Asp Ile Ser

Ile Lys Trp GAC GAA GAA

Thr Thr Gin Glu Thr

CTT Leu

CAT His 30

15 TAT Tyr

ACC Thr 35

20 TCT CAT

CAG CTG

Asp

Glu

Ser

His

Gin

Leu

25

TTG

TGT

GAC

AAA

TGT

CCT

GGT

ACC

TAC

CTA

AAA

CAA

CAC

TGT

ACA

258

Leu

Cys

Asp

Lys

cys

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

13

40

45

50

55

GCA

AAG

TGG

AAG

ACC

GTG

TGC

GCC

CCT

TGC

CCT

GAC

CAC

TAC

ACA

306

15

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

Thr

60

65

70

17

GAC

AGC

TGG

CAC

ACC

AGT

GAC

GAG

TGT

CTA

TAC

TGC

AGC

CCC

GTG

TGC

354

ASp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Leu

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

19

75

80

85

AAG

GAG

CTG

CAG

TAC

GTC

AAG

CAG

GAG

TGC

AAT

CGC

ACC

CAC

AAC

CGC

402

21

Lys

Glu

Leu

Gin

Tyr

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

»0

95

100

23

GTG

TGC

GAA

TGC

AAG

GAA

GGG

CGC

TAC

CTT

GAG

ATA

GAG

TTC

TGC

TTG

4S0

val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

25

105

110

115

AAA

CAT

AGG

AGC

TGC

CCT

GGA

TTT

GGA

GTG

CAA

GCT

GGA

ACC

498

27

Lys

His

Arg

Ser

Cys

PrO

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

120

125

130

135

29

CCA

GAG

CGA

AAT

ACA

GTT

TGC

AAA

AGA

TGT

CCA

GAT

GGG

TTC

TCA

546

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

31

140 145 1S0

101

RO 121386 Β1

1 3

AAT GAG Asn Glu

ACG Thr

TCA TCT AAA GCA CCC TGT AGA AAA

CAC ACA AAT TGC

AGT Ser

594

Ser 155

Ser

Lys Ala

Pro

Cys Arg 180

Lys

His

Thr

Asn Cys 165

5

GTC

TTT

GGT

CTC

CTG

CTA

ACT

CAG

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAC

GAC

AAC

642

Vai

Phe

Gly

Leu

Lau

Leu

Thr

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

7

170

175

180

9

ATA

TGT

TCC

GGA

AAC

AGT

GAA

TCA

ACT

CAA

AAA

TGT

GGA

ATA

GAT

GTT

690

Ile

Cys

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Ser

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

ASp

val

11

185

190

19S

ACC

CTG

TGT

GAG

GCA

TTC

AGG

TTT

GCT

GTT

CCT

ACA

AAG

TTT

738

13

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Phe

200

205

210

215

15

ACG

CCT

AAC

TGG

CTT

AGT

GTC

TTG

GTA

GAC

AAT

TTG

CCT

GGC

ACC

AAA

786

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

17

220

225

230

19

GTA

AAC

GCA

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

ATA

AAA

CGG

CAA

CAC

AGC

TCA

CAA

834

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

Gin

His

Ser

Gin

235

240

245

21

GAA

CAG

ACT

TTC

CAG

CTG

AAG

TTA

TGG

AAA

CAT

CAA

AAC

AAA

GCC

882

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Lys

Ala

23

250

2S5

250

25

CAA

GAT

ATA

GTC

AAG

ATC

CAA

GAT

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AAC

930

Gin

Asp

ile

Val

Lys

Ile

Gin

ASp

Ile

ASp

Leu

Cys

Glu

Asn

285

270

275

27

AGC

GTG

CAG

CGG

CAC

ATT

GGA

CAT

GCT

AAC

CTC

ACC

TTC

GAG

CAG

CIT

978

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

Ala

Asn

Leu

Thr

Phe

Glu

Gin

Leu

29

280

285

290

29S

31

CGT

AGC

TTG

ATG

GAA

AGC

TTA

CCG

GGA

AAG

AAA

GTG

GGA

GCA

GAA

GAC

1026

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Asp

300

305

310

33

ATT

GAA

AAA

ACA

ATA

AAG

GCA

TGC

AAA

CCC

AGT

GAC

CAG

ATC

CTG

AAG

1074

35

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Cys

Lys

Pro

Ser

Asp

Gin

Ile

Lau

Lys

315

320

325

37

CTG

CTC

AGT

TTG

TGG

CGA

ATA

AAA

AAT

GGC

GAC

CAA

GAC

ACC

TTG

AAG

1122

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

330

335

340

102

RO 121386 Β1

GGC CTA ATG

CAC GCA His Ala

CTA Leu

AAG CAC TCA AAG ACG TAC CAC TTT CCC AAA

1170

Gly Leu 345

Met

Lys His 350

Ser Lys

Thr

Tyr Hls Phe 355

Pro Lys

ACT

GTC

ACT

CAG

AGT

CTA

AAG

ACC

ATC

AGG

TTC

CTT

CAC

AGC

TTC

1218

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lya

Lys

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

360

365

370

375

ACA

ATG

TAC

AAA

TTG

TAT

CAG

AAG

TTA

TTT

TTA

GAA

ATG

ATA

GGT

AAC

1266

Thr

Mat

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

ile

Gly

Asn

380

385

390

CAG

GTC

CAA

TCA

GTA

AAA

ATA

AGC

TGC

TTA

TAACTGGAAA '

TGGCCATTGA

1316

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lya

Ile

Ser

Cys

Leu

395 400

GCTGTTTCCT CACAATTGGC GAGATCCCAT GGATGATAA1355 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 125:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:17 (A) LUNGIME: 401 aminoacizi (B) TIP: aminoacid19 (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină21 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 125:

Met

Asn

Lys

Leu

Cys

Ala

Leu

Val

Phe

Leu

Asp

Ile

Ser

Ile

1

5

10

15

25

Lys

Trp

Thr

Gin

G1U

Thr

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

97

20

25

30

Glu

Thr

Ser

His

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

29

35

40

45

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

31

50

55

60

33

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

70

75

80

35

Leu

Tyr

Cys

Ser

Pro

val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Tyr

Val

Lys

Gin

Glu

85

90

95

37

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

39

100

105

110

103

RO 121386 Β1

Leu

Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg

Ser Cys Pro Pro Gly 125

Phe

115

120

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

Arg

Lys

H1S

Thr

Asn

Cys

Ser

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gin

Lys

165

170

175

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

ile

Cys

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Ser

Thr

180

185

190

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

Asp

vai

Thr

Leu-Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

195

200

205

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Phe

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

210

215

220

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

225

230

235

240

Lys

Arg

Gin

His

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

245

250

255

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Val

Lys

Ile

Gin

260

265

270

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Asn

Ser

val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

Ala

275

280

285

Asn

Leu

Thr

Phe

Glu

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

290

295

300

Lyâ

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Asp

ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Cys

Lys

305

310

315

320

Pro

Ser

Asp

Gin

Ile

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Ly3

Asn

325

330

335

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

His

Ala

Leu

Lys

His

Ser

340

345

350

Lys

Thr

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

353

360

363

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gin

LyS

Leu

370

375

380

Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gin Val Gin Ser Val Lys Ile Ser Cys Leu 385 390 395 400 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 126:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 139 aminoacizi

104

RO 121386 Β1 (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 126:

Cys Pro Gin Gly 1

Lys 5

Tyr Ile His Pro

Gin Asn Asn 10

Ser

Ile

Cys 15

Cys

Thr

Lys

Cys

His

Lys

Gly

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gly

Pro

20

25

30

Gly

Gin

Asp

Thr

Asp

Cys

Arg

Glu

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

Phe

Thr

Ala

35

40

45

Ser

Glu

Asn

His

Leu

Arg

His

Cys

Leu

Ser

Cys

Sex

Lys

Cys

Arg

Lys

50

55

60

Glu

Met

Gly

Gin

Val

Glu

Ile

Ser

Cys

Thr

Val

Asp

Arg

Asp

Thr

65

70

75

80

Vel

Cys

Gly

Cys

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Arg

His

Tyr

Trp

Ser

Glu

Asn

85

90

95

Leu

Phe

Gin

Cys

Phe

Asn

Cys

Ser

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

Val

Hls

100

105

110

Leu

Ser

Cys

Gin

Glu

Lys

Gin

Asn

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

115

120

125

Phe

Leu

Arg

Glu

Asn

Glu

Cys

Val

Ser

Cys

130

135

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 127:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 48 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 127:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA 48 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 128:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 219 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 128:

105

RO 121386 Β1

Met Leu Gly 1

Ile

Trp 5

Thr Leu

Leu

Pro Leu val Leu Thr Ser Val

Ala

10

ÎS

Arg

Leu

Ser

Lys

Ser

Val

Asn

Ala

Gin

Val

Thr

Asp

Ile

Asn

Ser

20

25

30

Lys

Gly

Leu

Glu

Leu

Arg

Lys

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Thr

Gin

Asn

35

40

45

Leu

Glu

Gly

Leu

His

Asp

Gly

Gin

Phe

Cys

His

LyS

Pro

Cys

Pro

50

5S

60

Pro

Gly

Glu

Arg

Lys

Ala

Arg

Asp

Cys

Thr

val

Asn

Gly

Asp

Glu

Pro

65

70

75

80

Asp

Cys

Val

Pro

Cys

Gin

Glu

Gly

Lys

Glu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Ala

His

85

90

95

Phe

Ser

Lys

Cys

Arg

Cys

Arg

Leu

Cys

Asp

Glu

Gly

His

Gly

100

105

110

Leu

Glu

Val

Glu

Ile

Asn

Cys

Thr

Arg

Thr

Gin

Asn

Thr

Lys

Cys

Arg

115

120

125

Cys

Lys

Pro

Asn

Phe

Cys

Asn

Ser

Thr

Val

Cys

Glu

His

Cys

Asp

130

135

140

Pro

Cys

Thr

Lys

Cys

Glu

His

Gly

Ile

Lys

Glu

Cys

Thr

Leu

Thr

145

150

155

160

Ser

Asn

Thr

Lys

Cys

Lys

Glu

Gly

Ser

Arg

Ser

Asn

Leu

Gly

Trp

165

170

175

Leu

Cye

Leu

Pro

Ile

Pro

Leu

Ile

Val

Trp

Val

Lys

Arg

180

185

190

Lys

Glu

val

Gin

Lys

Thr

Cys

Arg

Lys

His

Arg

Lys

Glu

Asn

Gin

Gly

195

200

205

ser

His

Glu

Ser

Pro

Thr

Leu

Asn

Pro

Glu

Thr

210

215

) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 129:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 280 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 129:

106

RO 121386 Β1

Met Gly Leu

Ser Thr Val Pro Asp Leu

Leu Leu Pro 10 Gly Val Ile

Leu Val Leu Leu 15 Gly Leu Val Pro

1 3 5 7

1 Glu Leu

Leu Gly 35

S

Ile Tyr

Pro Ser 25

Val 20 Asp

Gly Arg

Glu

Lys

Pro 45

30

His

Leu

Arg 40

Asp

Ser

Val

Cys

Gin

Gly

Lys

Tyr

Ile

His

Pro

Gin

Asn

Ser

Ile

Cys

Thr

Lys

Cys

His

Lys

9

50

55

60

11

Gly

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gly

Pro

Gly

Gin

Asp

Thr

Asp

65

70

75

80

13

Cys

Arg

Glu

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser

Glu

Asn

His

Leu

85

90

95

15

Arg

His

Cys

Leu

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

lys

Glu

Met

Gly

Gin

Val

100

105

110

17

Glu

Ile

Ser

Cys

Thr

Val

Asp

Arg

Asp

Thr

Val

Cys

Gly

Cys

Arg

19

115

120

125

Lys

Asn

Gin

Tyr

Arg

His

Tyr

Trp

Ser

Glu

Aan

Leu

Phe

Gin

Cys

Phe

21

130

135

140

23

Asn

Cys

Ser

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

Val

His

Leu

Ser

Cys

Gin

Glu

145

1S0

155

160

25

Lys

Gin

Asn

Thr

Vai

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

Phe

Leu

Arg

Glu

165

170

175

27

Asn

Glu

Cys

Val

Ser

Cys

Ser

Asn

Cys

Lys

Ser

Leu

Glu

Cys

Thr

29

180

185

190

31

Lys

Leu

Cys

Leu

Pro

Gin

Ile

Glu

Asn

Val

Lys

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

195

200

205

33

Gly

Thr

Val

Leu

Pro

Leu

Val

Ile

Phe

Gly

Leu

Cys

Leu

210

215

220

35

Leu

Ser

Leu

Phe

Ile

Gly

Leu

Met

Tyr

Arg

Tyr

Gin

Arg

Trp

Lys

37

225

230

2 35

240

Ser

Lys

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Cys

Gly

Lys

Ser

Thr

Pro

Glu

Lys

Glu

39

245

250

255

41

Gly

Glu

Leu

Glu

Gly

Thr

Lys

Pro

Leu

Ala

Pro

Asn

Pro

Ser

260

265

270

43

Phe

Ser

Pro

Thr

Pro

Gly

Phe

Thr

275 280 45

107

RO 121386 Β1 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 130:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 207 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 130:

Met 1

Leu

Arg Leu Ile 5

Ala Leu Leu Val Cys 10

Val

Tyr

val

Tyr 15

Gly

Asp

Val

Pro

Tyr

Ser

Asn

Gin

Gly

Lys

Cys

Gly

His

Asp

20

25

30

Tyr

Glu

Lys

Asp

Gly

Leu

Cys

Ala

Ser

Cys

His

Pro

Gly

Phe

Tyr

35

40

45

Ala

Ser

Arg

Leu

cys

Gly

Pro

Gly

Ser

Asn

Thr

Val

Cys

Ser

Pro

Cys

50

55

60

Glu

Asp

Gly

Thr

Phe

Thr

Ala

Ser

Thr

Asn

His

Ala

Pro

Ala

Cys

Val

65

70

75

80

Ser

Cys

Arg Gly

Pro

Cys

Thr

Gly

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Gin

Pro

Cys

85

90

9S

Asp

Arg

Thr

His

Asp

Arg

Val

Cys

Asn

Cys

Ser

Thr

Gly

Asn

Tyr

Cys

100

105

110

Leu

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly

Cys

Arg

Ile

Cys

Ala

Pro

Gin

Thr

Lys

115

120

125

Cys

Pro

Ala

Gly

Tyr

Gly

Val

Ser

Gly

His

Thr

Arg

Ala

Gly

Asp

Thr

130

135

140

Leu

Cys

Glu

Lys

Cys

Pro

His

Thr

Tyr

Ser

Asp

Ser

Leu

Ser

Pro

145

150

155

160

Thr

Glu

Arg

Cys

Gly

Thr

Ser

Phe

ASn

Tyr

Ile

Ser

Val

Gly

Phe

Asn

165

170

175

Leu

Tyr

Pro

Val

Asn

Glu

Thr

Ser

Cys

Thr

Ala

Gly

His

Asn

180

185

190

Glu

Val

Ile

Lys

Thr

Lys

Glu

Phe

Thr

Val

Thr

Leu

Asn

Tyr

Thr

195

200

205

2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 131:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 227 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 131:

108

RO 121386 Β1

Met 1 Trp

Ala Pro Val Ala Val Trp 5

Ala Ala Leu Ala

Val Gly Leu Glu Leu

Pro

10

Ala

Phe Thr 30

15

3 5

Ala

Ala Ala 20

His

Ala Leu

Ala Gin 25

Val

Pro

Tyr

Ala

Pro

Glu

Pro

Gly

Ser

Thr

Cys

Arg

Leu

Arg

Glu

Tyr

Asp

Gin

7

35

40

45

Thr

Ala

Gin

Met

Cys

Ser

Lys

Cys

Ser

Pro

Gly

Gin

His

Ala

Lys

9

50

55

60

Val

Phe

Cys

Thr

Lys

Thr

Ser

Asp

Thr

Val

Cys

Asp

Ser

Cys

Glu

Asp

11

65

70

75

80

13

Ser

Thr

Tyr

Thr

Gin

Leu

Trp

Asn

Trp

val

Pro

Glu

Cys

Leu

Ser

Cys

15

85

90

95

Gly

Ser

Arg

Cys

Ser

Asp

Gin

Val

Glu

Thr

Gin

Ala

Cys

Thr

Arg

17

100

105

110

19

Glu

Gin

Asn

Arg

Ile

Cys

Thr

Cys

Arg

Pro

Gly

Trp

Tyr

cys

Ala

Leu

115

120

125

21

Ser

Lys

Gin

Glu

Gly Cys

Arg

Leu

Cys

Ala

Pro

Leu

Arg

Lys

Cys

Arg

130

135

140

23

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Ala

Arg

Pro

Gly

Thr

Glu

Thr

Ser

Asp

Val

145

150

155

160

20

Cys

Lys

Pro

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

Phe

Ser

Asn

Thr

Ser

Thr

27

165

170

175

Asp

11«

Cys

Arg

Pro

His

Gin

Ile

Cys

Asn

Val

Ala

Ile

Pro

Gly

29

180

185

190

Asn

Ala

Ser

Arg

Asp

Ala

Val

Cys

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

Thr· Atg

Ser

31

195

200

205

33

Met

Ala

Pro

Gly

Ala

Val

His

Leu

Pro

Gin

Pro

Val

Ser

Thr

Arg

Ser

210

215

220

Gin His Thr

22537 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 132:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:39 (A) LUNGIME: 197 aminoacizi (B) TIP; aminoacid41 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară43 (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 132:45

109

RO 121386 Β1

Met Val Ser Leu Pro

Arg

Leu

Cys Ala Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr

1

5

10

15

Ala

Val

His

Leu

Gly

Gin

Cys

Val

Thr

Cys

Ser

Asp

Lys

Gin

Tyr

Leu

20

25

30

His

Asp

Gly

Gin

Cys

Asp

Leu

Cys

Gin

Pro

Gly

Ser

Arg

Leu

Thr

35

40

45

Ser

His

Cys

Thr

Ala

Leu

Glu

Lys

Thr

Gin

Cys

His

Pro

Cya

Asp

Ser

50

55

60

Gly

Glu

Phe

Ser

Ala

Gin

Trp

Asn

Arg

Glu

Ile

Arg

Cys

His

Gin

His

65

70

75

80

Arg

His

Cys

Glu

Pro

Asn

Gin

Gly

Leu

Arg

val

Lys

Glu

Gly

Thr

85

90

95

Ala

Glu

Ser

Asp

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

Lys

Glu

Gly

Gin

His

Cys

Thr

100

105

110

Ser

Lys

Asp

Cys

Glu

Ala

Cys

Ala

Gin

His

Thr

Pro

Cys

Ile

Pro

Gly

115

120

125

Phe

Gly

Val

Met

Glu

Met

Ala

Thr

Glu

Thr

Asp

Thr

Val

Cys

His

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Val

Gly

Phe

Ser

Asn

Gin

Ser

Leu

Phe

Glu

Lys

145

150

155

160

Cys

Tyr

Pro

Trp

Thr

Ser

Cys

Glu

Asp

Lys

Asn

Leu

Glu

val

Leu

Gin

165

170

175

Lys

Gly

Thr

Ser

Gin

Thr

Asn

Val

Ile

Cys

Gly

Leu

Lys

Ser

Arg

Met

180

185

190

Arg Ala Leu Leu Val

195 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEC ID NR: 133:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 208 arainoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 133:

110

RO 121386 Β1

Met 1 Glu

Asn Lys

Trp Leu Cys

Cys Ala Leu Leu Val Phe Leu Asp ile ile

1 3 5

Thr 20

5 Gin

Glu

10

15

Trp

Thr

Phe

Pro Pro Lys Tyr Leu His

Tyr

Asp

25

30

Pro

Glu

Thr

Gly

Arg

Gin

Leu

Cys

Asp Lys Cys Ala Pro

Gly

Thr

7

35

40

45

π

Tyr

Leu

Lys

Gin

Hls

Cys

Thr

Val

Arg

Arg Lys Thr Leu Cys

Val

Pro

y

50

55

60

11

Cys

Pro

Asp Tyr

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp His Thr Ser Asp

Glu

Cys

€5

70

75

80

13

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu Gin Thr Val Lys

Gin

Glu

15

85

90

95

1 u

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu Cys Glu Glu Gly

Arg

Tyr

17

100

105

110

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg Ser Cys Pro Pro

Gly

Leu

19

115

120

12S

21

Gly

Val

Leu

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg Asn Thr Val Cys

Lys

Arg

130

135

140

23

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr Ser Ser Lys Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

25

Arg

Lys

Hls

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Gly Leu Leu Leu ile

Gin

Lys

165

170

175

27

Gly

Asn

Ala

Thr

Hls

Asp

Asn

Val

Cys

Ser Gly Asn Arg Glu

Ala

Thr

29

180

185

190

Gin

Asn

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys Glu Glu Ala Phe

Phe

Arg

31

195

200

205

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 134:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:35 (A) LUNGIME: 224 aminoacizi (B) TIP: aminoacid37 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară39 (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 134:41

111

RO 121386 Β1

Met 1

Gly Ala Gly

Ala 5

Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu

Leu

10

15

Leu

Gly

Val

Ser

Leu

Gly

Ala

Lys

Glu

Ala

Cys

20

25

30

Pro

Thr

Gly

Leu

Tyr

Thr

His

Ser

Gly

Glu

Cys

Lys

Ala

Cys

Asn

35

40

4S

Leu

Gly

Glu

Gly

val

Ala

Gin

Pro

Cys

Gly

Ala

Asn

Gin

Thr

Val

Cys

50

55

60

Glu

Pro

Cys

Leu

Asp

Ser

Val

Thr

Phe

Ser

Asp

Val

Vai

Ser

Ala

Thr

65

70

75

80

Glu

Pro

Cys

Lys

Pro

Cys

Thr

Glu

Cys

Val

Gly

Leu

Gin

Ser

Met

Ser

85

90

$5

Ala

Pro

Cys

val

Glu

Ala

Asp

Ala

Val

Cys

Arg

Cys

Ala

Tyr

Gly

100

105

110

Tyr

Gin

Asp

Glu

Thr

Gly

Arg

Cys

Glu

Ala

Cys

Arg

Val

Cys

115

120

125

Glu

Ala

Gly

Ser

Gly

Leu

val

Phe

Ser

cys

Gin

Asp

Lys

Gin

Asn

Thr

130

135

140

Val

Cys

Glu

Cys

Pro

Asp

Gly

Thr

Tyr

Ser

Asp

Glu

Ala

Asn

His

145

150

155

160

Val

Asp

Pro

Cys

Leu

Pro

Cys

Thr

Val

Cys

Glu

Asp

Thr

Glu

Arg

Gin

165

170

175

Leu

Arg

Glu

Cys

Thr

Arg

Trp

Ala

Asp

Ala

Glu

Cys

Glu

Ile

Pro

180

185

190

Gly

Arg

Trp

Ile

Thr

Arg

Ser

Thr

Pro

Glu

Gly

Ser

Asp

Ser

Thr

195

200

205

Ala

Pro

Ser

Thr

Gin

Glu

Pro

Glu

Ala

Pro

Glu

Gin

Asp

Leu

Ile

210 215 220 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 135:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 205 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 135:

112

RO 121386 Β1

Met

Tyr

Val

Trp

Val

Gin

Pro

Thr

Ala

Phe

Leu

Gly

Leu

1

5

10

15

3

Ser

Leu

Gly

Val

Thr

Val

Lys

Leu

Asn

Cys

Val

Lys

Asp

Thr

Tyr

Pro

20

25

30

5

Ser

Gly

His

Lys

Cys

Arg

Glu

Cys

Gin

Pro

Gly

His

Gly

Met

Val

7

35

40

45

Ser

Arg

Cys

Asp

His

Thr

Arg

Asp

Thr

Val

Cys

His

Pro

Cys

Glu

Pro

9

50

55

50

11

Gly

Phe

Tyr

Asn

Glu

Ala

Val

Asn

Tyr

Asp

Thr

Cys

Lys

Gin

Cys

Thr

¢5

70

75

80

13

Gin

Cys

Asn

His

Arg

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Gin

Asn

Cys

Thr

Pro

85

90

95

15

Thr

Glu

ASp

Thr

Val

Cys

Gin

Cys

Arg

Pro

Gly

Thr

Gin

Pro

Arg

Gin

17

100

105

110

I f

Asp

Ser

His

Lys

Leu

Gly

Val

Asp

Cys

val

Pro

Cys

Pro

Gly

19

115

120

125

His

Phe

Ser

Pro

Gly

Ser

Asn

Gin

Ala

Cys

Lys

Pro

Trp

Thr

Asn

Cys

21

.130

135

140

23

Thr

Leu

Ser

Gly

Lys

Gin

île

Arg

His

Pro

Ala

Ser

Asn

Ser

Leu

Asp

145

150

155

150

25

Thr

Val

Cys

Glu

Asp

Arg

Ser

Leu

Ala

Thr

Leu

Trp

Glu

Thr

155

170

175

27

Gin

Arg

Thr

Phe

Arg

Pro

Thr

Val

Pro

Ser

Thr

Val

Trp

29

180

185

190

Pro

Arg

Thr

Ser

Gin

Leu

Pro

Ser

Thr

Pro

Thr

Leu

Val

31

195

200

205

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 136:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:35 (A) LUNGIME: 191 aminoacizi (B) TIP: aminoacid37 (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară39 (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 136:41

113

RO 121386 Β1

Met

Gly

Asn

Cys

Tyr

Asn

Val

Ile

Val

Leu

val

3

1

S

10

15

5

Gly

cys

Glu

Lys

Val

Gly

Ala

Val

Gin

Asn

Ser

Cyx

Asp

Asn

Cys

Gin

20

25

30

7

Pro

Gly

Thr

Phe

Cys

Arg

Lys

Tyr

Asn

Pro

Val

Cys

Lys

Ser

Cys

Pro

35

40

45

9

Pro

Ser

Thr

Phe

Ser

Ile

Gly

Gin

Pro

Asn

Cys

Asn

Ile

Cys

11

50

55

60

Arg

Val

Cys

Ala

Gly

Tyr

Phe

Arg

Phe

Lys

Phe

cys

Ser

Thr

13

65

70

75

80

4 K

Hls

Asn

Ala

Glu

Cys

Glu

Cys

Ile

Glu

Gly

Phe

His

Cys

Leu

Gly

Pro

1 O

85

90

95

17

Gin

Cys

Thr

Arg

Cys

Glu

Lys

Asp

Cys

Arg

Pro

Gly

Gin

Glu

Leu

Thr

100

105

110

19

Lys

Gin

Gly

Cys

Lys

Thr

Cys

Ser

Leu

Gly

Thr

Phe

Asn

Asp

Gin

Asn

115

120

125

21

Gly

Thr

Gly

Val

Cys

Arg

pro

Trp

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg

23

130

135

140

Ser

Val

Leu

Lys

Thr

Gly

Thr

Glu

Lys

Asp

Val

Cys

Gly

Pro

25

145

150

155

160

97

Pro

Val

val

Ser

Phe

Ser

Pro

Ser

Thr

Ile

Ser

Val

Thr

Pro

Glu

LI

165

170

175

29

Gly

Pro

Gly

His

Ser

Leu

Gin

Val

Leu

Thr

Leu

Phe

Leu

180

185

190

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 137:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚA:

(A) LUNGIME: 54 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 137:

TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC 54 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 138:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 380 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină

114

RO 121386 Β1 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 138:

Glu 1 Gin

Thr Leu

Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp

Pro Tyr

Glu Thr Gly His

Leu Cys 20

5 Asp

Lys Cys

10

Leu Lys 30

15

5 7

Ala

Pro 25

Gly Thr

Gin

His

Cys

Thr

val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Ser

9

35

40

45

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

val

Tyr

Cys

Ser

Pro

11

50

55

60

13

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

65

70

75

80

15

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

85

90

95

17

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

val

Gin

Ala

4 Λ

100

105

110

iy

Gly

Thr

Pro

G1U

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

21

115

120

125

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

ile

Lys

His

Thr

Asn

23

130

135

140

25

Cys

Ser

Thr

Phe

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

145

150

155

160

27

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

165

170

17S

29

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

31

180 18S 190

115

RO 121386 Β1

Lys Ile

Ile Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val Asp Ser Leu Pro Gly

195

200

205

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

His

Ser

210

21S

220

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

225

230

235

240

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

245

250

255

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

Asn

Leu

Thr

Glu

260

265

270

Gin

Leu

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Ile

Ser

Pro

275

280

285

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys

Ser

Glu

Gin

Leu

290

295

300

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

305

310

315

320

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Thr

Ser

His

Phe

325

330

335

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

Met

Arg

Phe

Leu

His

340

345

350

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

3S5

360

365

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Leu

370

375

380

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 139:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 380 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 139:

116

RO 121386 Β1

Glu

Thr

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Glu. Glu

Thr

Ser

His

1

5

10

15

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

3

20

25

30

5

Cys

Thr

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

35

40

45

7

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Leu

Tyr

Cys

Ser

Pro

50

55

60

9

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Tyr

val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

11

65

70

75

80

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

13

85

90

95

15

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Gin

Ala

100

105

110

17

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

115

120

125

19

Phe

Ser

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

Arg

Lys

His

Thr

Asn

21

130

135

140

Cys

Ser

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

23

145

150

155

160

Asp

Asn

Ile

Cys

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Ser

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

25

165

170

175

27

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

A1A

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

180

185

190

29

Lys

Phe

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

val

Leu

Val

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

31

195

200

205

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

Gin

His

Ser

33

210

215

220

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

35

22S

230

235

240

37

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Val

Lys

Ile

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

245 250 255

117

RO 121386 Β1

Glu Asn Ser Val Gin Arg His 260

Ile

Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu

265

270

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

275

280

285

Glu

Asp

Ile

Glu

Lys

Thr

ile

Lys

Ala

Cys

Lys

Pro

Ser

Asp

Gin

Ile

290

295

300

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

305

310

315

320

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

His

Ala

Leu

Lys

His

Ser

Lys

Thr

Tyr

HiS

Phe

325

330

335

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

His

340

345

350

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

355

360

365

Gly

Asn

Gin

Vai

Gin

Ser

Val

lys

ile

Ser

Cys

Leu

370

37S

380

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 140:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 140: TGGACCACCC AGAAGTACCT TCATTATGAC 30 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 141:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 30 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 141:

GTCATAATGA AGGTACTTCT GGGTGGTCCA 30 (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 142:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 31 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 142:

GGACCACCCA GCTTCATTAT GACGAAGAAA C 31

118

RO 121386 Β1

(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 143:	1
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 31 baze perechi	3
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă	5
(D) TOPOLOGIE: lineară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN	7
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 143:
GTTTCTTCGT CATAATGAAG CTGGGTGGTC C	31 9
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 144:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:	11
(A) LUNGIME: 29 baze perechi
(B) TIP: acid nucleic	13
(C) ÎMPLETIRE: simplă
(D) TOPOLOGIE: lineară	15
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 144:	17
GTGGACCACC CAGGACGAAG AAACCTCTC	29
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 145:	19
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 29 baze perechi	21
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă	23
(D) TOPOLOGIE: lineară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN	25
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 145:
GAGAGGTTTC TTCGTCCTGG GTGGTCCAC	29 27
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 146:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:	29
(A) LUNGIME: 29 baze perechi
(B) TIP: acid nucleic	31
(C) ÎMPLETIRE: simplă
(D) TOPOLOGIE: lineară	33
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 146:	35
CGTTTCCTCC AAAGTTCCTT CATTATGAC	29
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 147:	37
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:
(A) LUNGIME: 29 baze perechi	39
(B) TIP: acid nucleic
(C) ÎMPLETIRE: simplă	41
(D) TOPOLOGIE: lineară
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN	43
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR147:
GTCATAATGA AGGAACTTTG GAGGAAACG	29 45
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 148:
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:	47

119

RO 121386 Β1 (A) LUNGIME: 32 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 148:

GGAAACGTTT CCTGCAAAGT ACCTTCATTA TG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 149:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 31 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 149:

CATAATGAAG GTACTTTGCA GGAAACGTTT CC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 150:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 27 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 150: CACGCAAAAG TCGGGAATAG ATGTCAC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 151:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 27 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 151: GTGACATCTA TTCCCGACTT TTGCGTG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 152:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 25 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 152:

CACCCTGTCG GAAGAGGCCT TCTTC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 153:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 25 baze perechi (B) TIP: acid nucleic

120

RO 121386 Β1

(C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 153:	1 3
GAAGAAGGCC TCTTCCGACA GGGTG	25	5
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 154: (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:		7
(A) LUNGIME: 24 baze perechi (B) TIP: acid nucleic		9
(C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară		11
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 154:		13
TGACCTCTCG GAAAGCAGCG TGCA	24
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 155:		15
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 24 baze perechi		17
(B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă		19
(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN		21
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 155: TGCACGCTGC TTTCCGAGAG GTCA	24	23
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 156: (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:		25
(A) LUNGIME: 24 baze perechi (B) TIP: acid nucleic		27
(C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară		29
(ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 156:		31
CCTCGAAATC GAGCGAGCAG CTCC	24
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 157:		33
(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ: (A) LUNGIME: 25 baze perechi		35
(B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă		37
(D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN		39
(xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 157: CGATTTCGAG GTCTTTCTCG TTCTC	25	41
(2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 158: (i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:		43
(A) LUNGIME: 33 baze perechi (B) TIP: acid nucleic		45
(C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară		47

121

RO 121386 Β1 (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 158: CCGTGAAAAT AAGCTCGTTA TAACTAGGAA TGG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 159:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 33 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 159:

CCATTCCTAG TTATAACGAG CTTATTTTCA CGG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 160:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 160: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 161:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 44 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 161: CCTCTCTCGA GTCAGGTGAC ATCTATTCCA CACTTTTGCG TGGC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 162:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 162: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG (2) INFORMAȚIA FENTRU SEQ ID NR: 163:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 163:

122

RO 121386 Β1

CCTCTCTCGA GTCAAGGAAC AGCAAACCTG AAGAAGGC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 164:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 164: CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 165:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 165: CCTCTCTCGA GTCACTCTGT GGTGAGGTTC GAGTGGCC

2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 166:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 166:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 167:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 38 baze perechi (B) TIP: acid nucleic (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: cADN (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 167: CCTCTCTCGA GTCAGGATGT TTTCAAGTGC TTGAGGGC (2) INFORMAȚIA PENTRU SEQ ID NR: 168:

(i) CARACTERISTICI DE SECVENȚĂ:

(A) LUNGIME: 16 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) ÎMPLETIRE: simplă (D) TOPOLOGIE: lineară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NR: 168:

Met Lys His His His His His His His Ala Ser Val Asn Ala Leu Glu 1 5 10 15

Claims

1. Osteoprotegerină izolată și purificată caracterizată prin aceea că crește densitatea osoasă sau diminuează resorbția osoasă, și cuprinde o secvență de aminoacizi aleasă dintre:

a. secvența de aminoacizi prezentată în fig. 2B-2C: secv. Id. Nr. 121, fig. 9A-9B: secv. Id. Nr. 123 sau fig. 9C-9D: secv. Id. Nr. 125 de la resturile 1 la 401 inclusiv;

b. secvența de aminoacizi prezentată în fig. 2B-2C: secv. Id. Nr. 121, fig. 9A-9B: secv. Id. Nr. 123 sau fig. 9C-9D: secv. Id. Nr. 125 de la resturile 22 la 401 inclusiv;

c. o secvență de aminoacizi care cuprinde un fragment conform a sau b.

2. Osteoprotegerină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este osteoprotegerină de mamifer.

3. Osteoprotegerină conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că este osteoprotegerină umană.

4. Osteoprotegerină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este substanțial liberă de alte proteine umane.

5. Osteoprotegerină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că are secvența de aminoacizi cum s-a prezentat în fig. 9C-9D: secv. Id. Nr. 125 de la resturile 22 la 401 inclusiv.

6. Osteoprotegerină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că are secvența de aminoacizi cum s-a prezentat în fig. 9C-9D secv. Id. Nr. 125 de la resturile 32 la 401 inclusiv.

7. Osteoprotegerină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că este produsul expresiei unei secvențe ADN exogene.

8. Osteoprotegerină conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că ADN este ADNc, ADN genomic sau ADN sintetic.

9. Osteoprotegerină, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că a fost modificată cu un polimer solubil în apă.

10. Osteoprotegerină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că polimerul solubil în apă este polietilenglicol.

11. Osteoprotegerină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că cuprinde o secvență de aminoacizi de cel puțin 164 aminoacizi care cuprinde patru domenii bogate în cisteină caracteristice domeniilor bogate în cisteină ale regiunilor extracelulare ale receptorului factorului necrozei tumorale, în care secvența este o parte sau în totalitate secvența prezentată în fig. 2B-2C: secv. Id. Nr. 121, fig. 9A-9B. secv. Id. Nr. 123 sau fig. 9C-9D: secv. Id. Nr. 125; și are activitate de creștere a densității osoase.

12. Osteoprotegerină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că cuprinde secvența de aminoacizi prezentată în fig. 2B-2C: secv.ld. Nr. 121, fig. 9A-9B: secv. Id. Nr. 123 sau fig. 9C-9D: secv. Id. Nr. 125 care are o grupare amino terminală la restul 22 și între 1 și 216 aminoacizi sunt selectați de la gruparea carboxi-terminală și în care polipeptidă are activitate biologică de scăderea resorbției osoase.

13. Osteoprotegerină conform revendicării 12, caracterizată prin aceea că cuprinde secvența de aminoacizi de la resturile 22-185, 22-189, 22-194 sau 22-201 inclusiv.

14. Osteoprotegerină, conform revendicării 13, caracterizată prin aceea că cuprinde în plus o regiune Fc a lgG1 umane care se extinde de la capătul carboxi-terminal.

124

RO 121386 Β1

15. Osteoprotegerină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că cuprinde 1 secvența de aminoacizi prezentată în fig. 2B-2C: secv.ld. Nr.121, fig. 9A-9B: secv. Id. Nr.

123 sau fig. 9C-9D: secv. Id. Nr. 125, care are o grupare amino terminală la restul 22, în care 3 aminoacizii de la 1 la 10 sunt deletați de la capătul amino terminal și în mod opțional, aminoacizii de la 1 la 216 sunt deletați de la capătul carboxi terminal și în care polipeptida are 5 activitate biologică de scădere a resorbției osoase.

16. Osteoprotegerină conform revendicării 15, caracterizată prin aceea că cuprinde 7 secvența de aminoacizi de la resturile 27-185, 27-189, 27-194, 27-401 sau 32-401.

17. Osteoprotegerină conform revendicării 16, caracterizată prin aceea că cuprinde 9 în plus o regiune Fc a lgG1 umane care se extinde de la capătul carboxi-terminal.

18. Osteoprotegerină conform revendicării 1 caracterizată prin aceea că este selec- 11 tată din grupul care constă din:

huOPG[22-201]-Fc13 huOPG[22-401]-Fc huOPG[22-180]-Fc15 huOPG met [22-401]-Fc huOPG Fc-met [22-401]17 huOPG met[22-185] huOPG met[22-189]19 huOPG met[22-194] huOPG met[27-185]21 huOPG met [27-189] huOPG met[27-194]23 huOPG met[32-401] huOPG met-lys[22-401]25 huOPG met[22-401] huOPG met[22-401 ]-Fc (P25A)27 huOPG met[22-401](P25A) huOPG met[22-401](P26A)29 huOPG met[22-401](P26D) huOPG met[22-194](P25A)31 huOPG met[22-194](P26A) huOPG met met (lys)3[22-401]33 huOPG met met-arg-gly-ser-(his)6[22-401]

19. Acid nucleic izolat care codifică o polipeptida definită la revendicarea 1, caracteri- 35 zat prin aceea că cuprinde cel puțin una din activitățile biologice ale osteoprotegerinei și este ales dintre:37

a. acidul nucleic prezentat în fig. 2B-2C: secv. Id. Nr. 120, fig. 9A-9B: secv. Id. Nr.122 sau fig. 9C-9D: secv. Id. Nr. 124 sau catene complementare ale acestora;39

b. acidul nucleic care cuprinde regiunea codificatoare de polipeptidă prezentată în fig. 2B-2C: secv. Id. Nr. 120, fig. 9A-9B: secv. Id. Nr. 122 sau fig. 9C-9D: secv. Id. Nr. 12441 sau catene complementare ale acestora;

c. acidul nucleic care cuprinde o porțiune din regiunea codificatoare de polipeptidă 43 prezentată în fig. 2B-2C: secv. Id. Nr. 120, fig. 9A-9B: secv. Id. Nr. 122 sau fig. 9C-9D: secv.

Id. Nr. 124 sau care codifică o polipeptidă având activitatea biologică de scădere a resorbției45 osoase; și

125

RO 121386 Β1

d. acidul nucleic care este degenerat față de acidul nucleic conform a, b și c.

20. Acid nucleic conform revendicării 19, caracterizat prin aceea că este ADNc, ADN genomic, ADN sintetic sau ARN.

21. Acid nucleic conform revendicării 19, caracterizat prin aceea că include unul sau mai mulți codoni preferați pentru expresia în Escherichia coli.

22. Acid nucleic conform revendicării 19, caracterizat prin aceea că are un marcaj detectabil atașat de el.

23. Acid nucleic conform revendicării 19, caracterizat prin aceea că cuprinde regiunea codificatoare de polipeptidă din fig. 2B-2C: secv. Id. Nr. 120, fig. 9A-9B: secv. Id. Nr. 122 sau fig. 9C-9D: secv. Id. Nr. 124.

24. Acid nucleic conform revendicării 23, caracterizat prin aceea că care are secvența cum s-a prezentat în fig. 9C-D: secv. Id. Nr. 124 intre nucleotidele 158-1297.

25. Acid nucleic conform revendicării 19, caracterizat prin aceea că acesta codifică polipeptidă conform revendicării 18.

26. Vector de expresie ales dintre plasmidele pAMG21 și pAMG22-His conținute în E.coli și regăsite sub nr. de acces ATGC 98113, respectiv 38112 caracterizat prin aceea că cuprinde acidul nucleic definit la revendicarea 19.

27. Vector de expresie, conform revendicării 26, caracterizat prin aceea că acidul nucleic cuprinde regiunea codificatoare de polipeptidă așa cum s-a prezentat în fig. 9C-9D: Secv. Id. Nr. 124.

28. Celulă gazdă de E.colialeasă dintre Escherichia colipRcCMV-huCrl; Escherichia coli pMOB B1.1, Escherichia coli pRc CMV-MuCr1 regăsite sub nr. de acces 69969,69970, 69971 caracterizată prin aceea că este transformată sau transfectată cu vectorul de expresie definit la revendicarea 26.

29. Celulă gazdă conform revendicării 28, care este o celulă procariotă.

30. Celulă gazdă conform revendicării 28, care este o celulă eucariotă.

31. Celulă gazdă conform revendicării 30, care este selectată din grupul care constă din celule CHO, COS, 293, 3T3, CV-1 și BHK.

32. Mamifer transgenic, care este un rozător, caracterizat prin aceea că cuprinde vectorul de expresie conform revendicării 26 în care mamiferul prezintă densitate osoasă crescută sau resorbție osoasă scăzută.

33. Mamifer transgenic, conform revendicării 32, caracterizat prin aceea că este un șoarece.

34. Multimer de osteoprotegerină, caracterizat prin aceea că, constă din monomeri de osteoprotegerină în care monomerii cuprind secvența de aminoacizi așa cum este prezentată în fig. 9C-9D: secv. Id. Nr.: 125 de la resturile 22 la 401 sau un fragment al acesteia care are o activitate biologică de scădere a resorbției osoase.

35. Multimer conform revendicării 34, caracterizat prin aceea că este un dimer.

36. Multimer conform revendicării 34, caracterizat prin aceea că este format prin introducerea inter lanțuri a legăturilor disulfidice.

37. Multimer conform revendicării 34, caracterizat prin aceea că este format prin asocierea regiunilor Fc derivate de la imunoglobulină umană lgG1.

38. Multimer conform revendicării 34, caracterizat prin aceea că este în mod substanțial lipsit de monomeri de osteoprotegerină și multimeri inactivi.

39. Multimer conform revendicării 34, caracterizat prin aceea că monomerii cuprind secvența de aminoacizi așa cum este arătată în fig. 9C-9D: secv. Id. Nr.: 125 de la resturile 22 până la 194.

126

RO 121386 Β1

40. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că cuprinde o cantitate efici-1 entă terapeutic într-un purtător, adjuvant, solubilizator, stabilizator și/sau anti-oxidant acceptabil farmaceutic.3

41. Compoziție conform revendicării 40, caracterizată prin aceea că este osteopro- tegerină umană.5

42. Compoziție conform revendicării 40, caracterizată prin aceea că are secvența de aminoacizi așa cum este prezentată în fig. 9C-9D SECV. ID. NR.: 125.7

43. Utilizare pentru tratarea unei afecțiuni osoase prin administrarea unei cantități eficiente terapeutic de polipeptidă în conformitate cu revendicarea 1.9

44. Utilizare conform revendicării 43, caracterizată prin aceea că polipeptidă este umană.11

45. Utilizare conform revendicării 43, caracterizată prin aceea că afecțiunea osoasă este aleasă dintre: osteoporoză, boala Paget a osului, hipocalcemie, hiperparatiroidism, 13 osteopenie indusă de steroizi, pierderile de os datorată artritei reumatoide, pierdere de os datorată osteomielitei, metastază osteolitică și pierdere de os periodontală. 15

46. Utilizare conform revendicării 43, caracterizată prin aceea că la tratament se poate administra în mod suplimentar o cantitate eficientă terapeutic dintr-o substanță selec- 17 tată dintre: proteine morfogenice ale osului de la BMP-1 până la BMP-12, membrii familiei TGF-β, inhibitori de IL-1, inhibitori de TNF-α, hormon paratiroidian și analogi ai acestuia, 19 proteină înrudită cu hormonul paratiroidian și analogi ai acesteia, prostaglandine din seriile E, bisfosfonați și minerale care cresc osul. 21

47. Procedeu pentru producerea OPG, care cuprinde:

- creșterea într-un mediu de cultivare a celulelor gazdă transformate sau transfectate 23 cu acidul nucleic conform revendicării 1; și

- izolarea produselor polipeptidice ale expresiei acidului nucleic prin una sau mai 25 multe etape cromatografice, care cuprinde cromatografie de schimb ionic, cu interacțiune hidrofobă, cu fază inversă, separare prin cromatofocus și cromatografie de afinitate. 27