CZ292587B6

CZ292587B6 - Osteoprotegerin, jeho multimer, protilátka, která se na tento polypeptid váže, farmaceutická kompozice obsahující tento polypeptid, způsob výroby tohoto polypeptidu a nukleová kyselina, expresní vektor, hostitelská buňka a transgenický savec použitelné při tomto způsobu výroby

Info

Publication number: CZ292587B6
Application number: CZ19972538A
Authority: CZ
Inventors: William J. Boyle; David L. Lacey; Frank J. Calzone; Ming-Shi Chang
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2003-10-15
Also published as: IL121520A; SI0784093T1; PL187408B1; NZ326579A; AR004400A1; EP2332974A3; FR2742767A1; EP0784093B1; KR19980703599A; BG101813A; BG63347B1; US6369027B1; KR100463584B1; WO1997023614A1; ATE409745T1; EP1990415A1; CN1318588C; EP2332974A2; CA2210467C; FR2742767B1

Abstract

Řešení se týká nového sekretovaného polypeptidu, označeného jako osteoprotegerin, který je členem nadrodiny receptoru nádor nekrotizujícího faktoru a který se podílí na regulaci kostního metabolizmu. Rovněž se týká nukleových kyselin kódujících osteoprotegerin, polypeptidů, rekombinantních vektorů a hostitelských buněk pro expresi, protilátek, které se váží na OPG, a farmaceutických kompozic. Polypeptidy se používají pro léčení nemocí kostí, které jsou charakteristické zvýšenou resorpcí, například pro léčení osteoporózy.ŕ

Description

Osteoprotegerin, jeho multimer, protilátka, která se na tento polypeptid váže, farmaceutická kompozice obsahující tento polypeptid, způsob výroby tohoto polypeptidu a nukleová kyselina, expresní vektor, hostitelská buňka a transgenický savec použitelné při tomto způsobu výroby

Oblast techniky

Vynález se obecně týká polypeptidů podílejících se na regulaci kostního metabolizmu. Vynález se zejména týká nového polypeptidu, označeného jako osteoprotegerin, který je členem receptorové nadrodiny faktoru nekrotizujícího tumor. Tento polypeptid se používá při léčení kostních onemocnění, pro která je charakteristická zvýšená ztráta kostní hmoty, například při léčení osteoporózy.

Dosavadní stav techniky

Polypeptidové růstové faktory a cytokiny jsou sekretované faktory, které signalizují specifickým navázáním na diskrétní povrchové vazebné receptoiy široké spektrum změn v růstu, v diferenciaci a v. metabolizmu buněk. Receptory jako třída proteinů mění svou strukturu a způsob transdukce signálu. Jsou charakteristické tím, že mají extracelulámí doménu, která je součástí ligandové vazby a cytoplazmatickou doménu, která přenáší příslušný intracelulámí signál. Expresní vzory receptorů přesně určují, které buňky budou reagovat na daný ligand, zatímco struktura daného receptoru diktuje buněčnou odpověď indukovanou ligandovou vazbou. Ukázalo se, že receptory přenáší intracelulámí signály přes své cytoplazmatické domény aktivací proteinového tyrosinu nebo fosforylací proteinového serinu/threoninu (např. receptoru růstového faktoru odvozeného z krevních destiček (PDGFR)) nebo receptoru-I transformačního růstového faktoru-β, stimulací G-proteinové aktivace (například β-adrenergickým receptorem-I (ΤΰΡβΡ-Ι)) a modulačním spojením s cytoplazmatickými proteiny transdukujícími signál (např. TNPR-1 a Fas/APO) (Heldin, Cell 80, 213-223 (1995)).

Nadrodinou receptoru faktoru nekrotizujícího tumor (TNFR) je skupina transmembránových proteinů typu I, které sdílí konzervovaný motiv bohatý na cystein, který se v intracelulámí doméně opakuje třikrát až šestkrát (Smith a kol., Cell 76, 953-962 (1994)). Tyto repetice společně tvoří ligandové vazebné domény zmíněných receptorů (Chen a kol., Chemistry 270, 2874-2878 (1995)). Ligandy pro tyto receptory jsou tvořeny strukturně příbuznou skupinou proteinů homologických s TNFa. (Goeddel a kol., Cold Spring Harbor Symp. Quart. Biol. 51, 597-609 (1986); Nagata a kol., Science 267. 1449-1456 (1995)). TNFa se váže na distinktní, ale blízce příbuzné receptory, TNFR-1 a TNFR-2. TNFa produkuje celou řadu různých biologických odpovědí v buňkách nesoucích receptor včetně proliferace, diferenciace a cytotoxicity a apoptózy (Beutler a kol., Ann. Rev. Biochem. 57. 505-518 (1988)).

Dá se předpokládat, že TNFa zprostředkovává akutní a chronické zánětlivé odpovědi (Beutler a kol., Ann. Rev. Biochem. 57, 505-58 (1988)). Systemická doprava TNFa indukuje toxický šok a rozsáhlou tkáňovou nekrózu. Díky tomu může být TNFa zodpovědný za vážnou morbiditu a mortalitu, které souvisí s celou řadou infekčních chorob včetně sepse. Mutace ve FasL, ligandu pro TNFR-příbuzný receptor Fas/APO (Suda a kol., Cell 75, 1169-1178 (1993)), jsou spojovány s autoimunitou (Fischer a kol., Cell 81, 935-946 (1995)), zatímco nadprodukce FasL se může podílet na hepatitidě, indukované účinnou látkou. Takže ligandy pro různé proteiny, odvozené z TNFR, často zprostředkovávají vážné důsledky mnoha chorobných stavů, z čehož vyplývá, že činidla, která neutralizují aktivitu těchto ligandů, mají terapeutickou hodnotu. U rozpustných TNFR-1 receptorů a protilátek, které vážou TNFa, se testovala jejich schopnost neutralizovat systémový TNFa (Loetscher a kol., Cancer Cells 3(6), 221-226 (1991)). Nedávno se klonovala přirozeně se vyskytující forma sekretované TNFR-1 mRNA a u jejího produktu se testovala

-1 CZ 292587 B6 schopnost neutralizovat TNFa aktivitu in vitro a in vivo (Kohno a kol., PNAS USA 87, 8331-8335 (1990)). Schopnost tohoto proteinu neutralizovat TNFa svědčí o tom, že rozpustné TNF receptory vážou a čistí TNF a tím blokují cytotoxické vlivy na buňky nesoucí TNFR.

Cílem vynálezu je identifikovat nové členy TNFR nadrodiny. Dá se očekávat, že novými členy rodiny budou transmembránové proteiny nebo jejich rozpustné formy, obsahující extracelulámí domény a postrádající transmembrány a cytoplazmové domény. Byl identifikován nový člen TNFR nadrodiny, který kóduje sekretovaný protein, úzce příbuzný s TNFR-2. Analogicky, jako v případě rozpustného TNFR-1, může od TNFR-2 odvozený protein negativně regulovat aktivitu 10 svého ligandu a může být tedy užitečný při léčení určitých lidských chorob.

Podstata vynálezu

Nový člen nadrodiny receptorů tumorového nekrotického faktoru (TNFR) byl identifikován v knihovně intestinální cDNA, získané z krysího zárodku. Získal se celodélkový cDNA klon, kteiý se sekvencoval. Exprese krysí cDNA v transgenické myši vykazovala vyznačené zvýšení hustoty kostí, zejména u dlouhých kostí, pánevní kosti a obratlů. Tento polypeptid kódovaný cDNA je označen jako osteoprotegerin (OPG) a hraje důležitou roli při aktivaci kostní 20 akumulace.

Vynález poskytuje nukleové kyseliny kódující polypeptid, kteiý má alespoň jednu z biologických aktivit OPG souvisejících s regulací kostního metabolizmu. Vynález rovněž poskytuje nukleové kyseliny, které se hybridizují na nukleové kyseliny, které kódují krysí, myší nebo humánní OPG 25 znázorněný na obr. 2B a 2C (SEQ ID NO: 120) 9A až 9B (SEQ ID NO: 122) a 9C až 9D (SEQ

ID NO: 124). Výhodně je OPG savčí OPG a výhodněji humánní OPG. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají rekombinantní vektory a hostitelské buňky exprimující OPG a způsoby produkce rekombinantního OPG. Protilátky nebo jejich fragmenty, které specificky váží polypeptid, jsou rovněž součástí vynálezu.

Předmětem vynálezu je rovněž použití polypeptidů podle vynálezu pro výrobu léčiva určeného pro léčbu onemocnění kostí. Polypeptidy jsou užitečné při prevenci řídnutí kostí a mohou se použít při léčbě libovolného stavu, který má za následek ztrátu kostní hmoty, například při léčbě osteoporózy, hyperkalcemie, Pagetovy choroby kostí a ztráty kostní hmoty v důsledku kloubního 35 revmatismu nebo osteomyelitidy apod. Kostní onemocnění lze rovněž léčit protismyslnou nebo genovou terapií, využívající nukleové kyseliny podle vynálezu. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají farmaceutické kompozice obsahující OPG nukleové kyseliny a polypeptidy.

Stručný popis obrázků

Obr. 1, FASTA analýza nového EST LORF. Obr. 1A ukazuje odvozenou aminokyselinovou sekvenci zařazenou do humánní TNFR-2 sekvence. Obr. IB znázorňuje profilovou analýzu nového EST LORF, přičemž obrázek znázorňuje odvozenou FRI-1 aminokyselinovou sekvenci 45 zařazenou do TNFR-profilu. Obr. 1C znázorňuje strukturu TNFR nadrodiny ukazující oblast, která je homogenní s novým FRI-1.

Obr. 2 znázorňuje strukturu a sekvence krysího OPG genu v celé jeho délce, jako nového členu TNFR nadrodiny. Obr. 2A ukazuje mapu pMOB-Bl.l inzertu. Rámeček označuje polohu LORF 50 v cDNA sekvenci (tučná čára), černý obdélník označuje signální peptid a šedé elipsy označují pozici opakujících se sekvencí bohatých na cystein). Obr. 2B a 2C ukazuje sekvenci nukleové kyseliny a proteinu cDNA krysího OPG, přičemž předpokládaný signální peptid je podtržen a potenciální místa N-navázané glykosylace jsou označena tučným, podtrženým písmem. Obr. D a E znázorňují srovnání odpovídajících sekvencí (Wisconsin GCG Package, verze 8.1) OPG 55 s dalšími členy TNFR nadrodiny, fas (SEQ ID NO: 128); tnfrl (SEQ ID NO: 129); sfu-t2 (SEQ ID NO: 130); tnfr2 (SEQ ID NO: 131); cd40 (SEQ ID NO: 132); osteo (SEQ ID NO: 133); ngfr (SEQ ID NO: 134); ox40 (SEQ ID NO: 135); 41bb (SEQ ID NO: 136).

Obr. 3 znázorňuje PepPlot analýzu (Winsconsin GCG Package, verze 8.1) předpokládané proteinové sekvence krysího OPG, přičemž obr. 3A schematicky znázorňuje krysí OPG s hydrofobnimi (nahoře) a hydrofilními (dole) aminokyselinami. Obr. 3B znázorňuje aminokyselinové zbytky , které tvoří β-strukturu (nahoře) a lámou β-strukturu (dole) definované podle Choua a Fasmana (Adv. Enz. 47, 45-147 (1948)). Obr. 3C znázorňuje míru ochoty tvořit α-šroubovici a β-strukturu (Chou a Fasman, tamtéž); křivky ležící nad vodorovnou osou 1,00 ukazují ochotu tvořit α-šroubovici nebo β-strukturu; přičemž struktura může být zakončena v oblastech proteinu, ve kterých křivky klesnou pod hodnotu 1,00. Obr. 3D znázorňuje zbytky, které tvoří α-strukturu (nahoře) nebo které lámou α-strukturu (dole). Obr. 3E znázorňuje části proteinové sekvence, která je podobná sekvencím, které se zpravidla nacházejí na aminovém konci a- a β-struktury (Chou a Fasman, tamtéž). Obr. 3F znázorňuje části proteinové sekvence, která se zpravidla nachází na karboxylovém konci a- a β-struktury (Chou a Fasman, tamtéž). Obr. 3G znázorňuje části proteinové sekvence, která je zpravidla sbalená (Chou a Fasman, tamtéž). Obr. 3H znázorňuje šroubovicový hydrofobní moment (Eisenberg a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 140-144 (1984)) v každé pozici v sekvenci. Obr. 31 znázorňuje průměrnou hydropatii Kýta a Doolitla (J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)) a Goldmana a kol. (stručný přehled v Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 321-353 (1986)).

Obr. 4 znázorňuje mRNA expresní vzory pro OPG cDNA v lidských tkáních. Northemové bloty se sondovaly pomocí krysího cDNA inzertu, značeného pomocí 32P (obr. 4A) nebo pomocí inzertu humánní cDNA (obr. 4B).

Obr. 5 znázorňuje vytvoření transgenické myší exprese OPG cDNA v hepatocytech. Northemová blotová exprese HE-OPG transgenu v myších játrech.

Obr. 6 znázorňuje zahuštění kosti u OPG transgenické myši. Obr. 6A až 6F znázorňují kontrolní myši a obr. 6G až 6J znázorňují OPG exprimující myši; při pitvě se provedl rentgen všech zvířat a rentgenové snímky se vyvolaly. Obr. 6A až 6F ukazují rentgenové snímky kontrolních zvířat a jednoho transgenického neexpresního zvířete (č. 28). Na těchto snímcích byla jasně odlišitelná kůra a osvětlená středová dutina kostní dřeně. Na rentgenových snímcích 6H až 6J, tj. OPG exprimujících zvířat, byla kůra špatně definovatelná a v oblasti kostní dřeně byla hustota zvýšena.

Obr. 7 znázorňuje trabekulámí kost v OPG transgenické myši. Obr. 7A až 7D reprezentují fotomikrograíy kostí kontrolních zvířat. Obr. 7A a 7B ukazují obrázky kosti stehenní při malém zvětšení (4x, lOx) (Massonova trichromová skvrna). Skvrny pro kyselinovou fosfatázu, rezistentní proti vinanu (TRAP), demonstrují osteoklasty (viz šipky), které resorbují jak chrupavku (obr. 7C) tak trabekulámí kost (D). Je třeba zmínit zploštělý vzhled osteoklastů na trabekulámí kosti. Obr. 7E až 7H představují fotomikrograíy kostí OPG exprimujících zvířat. Obr. 7E a 7F ukazují obrázky kosti stehenní při malém zvětšení (4x, lOx) (Massonova trichromová skvrna), čirá oblast je chrupavka, modře zabarvená oblast představuje kost a červená oblast představuje kůru. Je třeba poznamenat, že narozdíl od kontrolních vzorků se trabekulámí kost neresorbovala, což vedlo k absenci obvyklé dřeňové dutiny. Výsledná trabekula má rozmanitý vzhled s modrými a čirými plochami. Čiré plochy zobrazují zbytky ploténkové chrupavky, která se nikdy nepřemodelovala. Na základě TRAP zabarvení se zjistilo, že tito živočichové mají na rostoucí destičce (obr. 7G) osteoklasty (viz šipka), které mohou svůj počet redukovat. Nicméně povrchy trabekuly, orientované směrem od růstové destičky, jsou ve skutečnosti prosté osteoklastů (obr. 7H) a toto zjištění je v přímém kontrastu s kontrolními živočichy (viz obr. 7D).

-3CZ 292587 B6

Obr. 8. U HE-OPG expresorů nebyl zaznamenán defektní monocyto-makrofágový vývoj. Příčinou osteoporózy u myší je produkce defektního M-CSF, způsobená místní mutací v M-CSF genu. To způsobuje značný deficit cirkulujících makrofágů a tkáňových makrofágů. Periferní krev OPG expresorů obsahovala monocyty, jak ukázala H1E analýza. K potvrzení přítomnosti tkáňových makrofágů se použila imunohistochemie využívající F480 protilátek, které rozpoznávají antigen buněčného povrchu na myších makrofázích. Obr. 8A a 8C ukazují fotomikrografie (zvětšení 4x) slezin normálních a CR1 přeexpresorů. Je třeba poznamenat, že obě zvířata mají značné množství F480 pozitivních buněk. Monocyto-makrofágy byly rovněž přítomny v dřeni normálních (obr. 8B) a HE-OPG přeexpresorů (obr. 8D) (40x).

Obr. 9 znázorňuje strukturu a sekvenci myších a humánních OPG cDNA klonů. Obr. 9A až obr. 9B znázorňuje myší cDNA a proteinovou sekvenci, zatímco obr. 9C až obr. 9D znázorňuje humánní cDNA a proteinovou sekvenci. Předpokládané signální peptidy jsou podtrženy a možná místa N-navázané glykosylace jsou vyznačena tučným písmem. Obr. 9E a obr. 9F znázorňují sekvenční zarovnání a porovnání krysích, myších a humánních OPG aminokyselinových sekvencí.

Obr. 10 znázorňuje srovnání Zachovalých sekvencí v extracelulámí doméně TNFR-1 a humánního OPG. PrettyPlot (Wisconsin GCG Package, verze 8.1) zarovnání sekvencí TNFR°1 a OPG je popsáno v příkladu 6. Horní řádek uvádí humánní TNFR1 sekvence, kódující domény 1 až 4. Spodní řádek uvádí humánní OPG sekvence, kódující domény 1 až 4. Zachované zbytky jsou zvýrazněny rámečky.

Obr. 11 znázorňuje trojrozměrnou strukturu humánního OPG. Bokorysné zobrazení „Moleskript“ předpokládané trojrozměrné struktury humánních OPG zbytků 25 až 163 (široká čára) ko-krystalizovaných s humánním TNFp (tenká čára). Orientaci (směrem od N-konce k C-konci) označují široké šipky podél OPG polypeptidového hlavního řetězce. Do polypeptidového hlavního řetězce jsou vložena místa jednotlivých postranních řetězců cysteinových zbytků, která pomáhají vymezit samostatné domény bohaté na cystein. TNFP molekula je seřazena způsobem, který popisuje Benner a kol. (1993).

Obr. 12 znázorňuje strukturu OPG cysteinově bohatých domén. Seřazení humánní (horní řádek SEQ ID NO: 136) a myší (spodní řádek) OPG aminokyselinové sekvence ukazuje předpokládanou doménovou strukturu OPG. Polypeptid se rozdělil na dvě poloviny; N-konec (obr. 12A) a C-konec (obr. 12B). Předpokládá se, že N-koncová polovina obsahuje čtyři cysteinově bohaté domény (označení 1 až 4). Předpokládané disulfidové vazby uvnitř řetězce jsou naznačeny tučnými čarami a označeny jako „SSl“, „SS2“ nebo „SS3“. Dále se předpokládá, že tyrosin 28 a histidin 75 (podtržené) tvoří iontovou interakci. Ty aminokyseliny, o který se předpokládá, že vzájemně reagují s OPG ligandem, jsou označeny tečkami nad příslušným zbytkem. Cysteinově zbytky, které se nachází v C-koncové polovině OPG jsou označeny rámečky.

Obr. 13 znázorňuje expresi a sekreci celodélkových a upravených myších OPG-Fc fuzních proteinů. Obr. 13A znázorňuje mapu naznačující body fuze na humánní IgGl Fc doménu, které jsou vyznačeny pomocí šipek. Obr. 13B ukazuje stříbrné zabarvení SDS-polyakrylamidového gelu kondiciovaného média, získaného z buněk exprimujících expresní vektory Fl.Fc (celodélkový OPG, napojený na Fc na Leucinu 401) nebo CT.Fc (C-koncový upravený OPG napojený na Fc na threoninu 180) fúzního proteinu. První řádek uvádí mateřskou buněčnou linii pCEP4 expresního vektoru; druhý řádek uvádí buněčnou linii Fl.Fc vektoru; třetí řádek uvádí buněčnou linii CT.Fc vektoru. Obr. 13C ukazuje westernový blot kondiciovaného média, získaného zFl.Fc a CT.Fc fúzních proteinových expresních vektorů sondovaných Fc doménou anti-humánního IgGl (Pierce). První řádek uvádí výsledky pro buněčnou linii mateřského pCEP4 expresního vektoru; druhý řádek uvádí výsledky pro buněčnou linii Fl.Fc vektoru; a třetí řádek uvádí výsledky pro buněčnou linii CT.Fc vektoru.

-4CZ 292587 B6

Obr. 14 znázorňuje expresi humánního OPG v E. coli Obr. 14A znázorňuje konstrukci bakteriálního expresního vektoru. LORF humánního OPG genu se amplifikoval PCR a následně napojil na oligonukleotidový spojovníkový fragment (horní řetězec je SEQ ID NO:137; spodní řetězec je SEQ ID NO: 127) a íigoval do pAMG21 vektorové DNA. Výsledný vektor je schopen exprimovat OPG zbytky 32—401 navázané naN-koncový methioninový zbytek. Obr. 14B znázorňuje SDSPAGE analýzu neindukovaného a indukovaného bakteriálního prostředí, příznivého pro pAMG21-humánní OPG 32-401 plazmid. První řádek uvádí MW standardy; druhý řádek označuje neindukovanou bakterii; třetí řádek označuje indukci při 30 °C; čtvrtý řádek označuje indukci při 37 °C; pátý řádek označuje celobuněčný lyzát při 37 °C; šestý řádek označuje rozpustnou frakci celobuněčného lyzátu; sedmý řádek označuje nerozpustnou frakci celobuněčného lyzátu; a osmý řádek označuje purifíkovaná inkluzní těla, získaná z celobuněčného lyzátu.

Obr. 15 znázorňuje analýzu rekombinantního myšího OPG, produkovaného vCHO buňkách pomocí SDS-PAGE a westernového blotu. V obou případech se použilo stejné množství CHO kondiciovaného média, při jehož přípravě se použil redukující vzorkový pufr (levý sloupec) nebo neredukující vzorkový pufr (pravý sloupec). Po elektroforéze se rozpuštěné proteiny transfektovaly na nylonovou membránu a následně sondovaly anti-OPG protilátkami. Relativní polohy 55 kd monomemí a 100 kd dimemí formy OPG jsou označeny šipkami.

Obr. 16 znázorňuje „pulse-chase“ analýzu rekombinantního myšího OPG produkovaného v CHO buňkách. CHO buňky se označily pulzováním s ³⁵S-methionin/cysteinem, a následně se vyhledávaly po předem stanovenou dobu. Metabolicky značené kultury se rozdělily jak do kondiciovaného média tak do buněk, které se čistily a následně imunologicky srážely pomocí anti-OPG protilátek, a z obou se připravily extrakty detergentu. Imunologicky získané sraženiny se rozpustily pomocí SDS-PAGE a exponovaly na film. Horní levý a pravý obdélník ukazuje výsledky, získané při analýze vzorků za neredukčních podmínek. Spodní levý a pravý obdélník ukazuje výsledky, získané při analýze vzorků za redukčních podmínek; přičemž levé obdélníky poskytují výsledky pro buněčné extrakty, zatímco pravé obdélníky poskytují výsledky pro extrakty kondiciovaného média. Relativní mobilita 55 kd monomemí a 100 kd dimemí formy OPG jsou označeny pomocí šipek.

Obr. 17 znázorňuje expresi OPG v CTLL-2 buněčné linii. Z CTLL-2 buněk a CHO-mu OPG [1-401] transfektovaných buněk se připravilo séra prosté kondiciované médium, které se následně zahustilo a analyzovalo neredukční SDS-PAGE a westernovým přenosem. Levý pruh označuje CTLL-2 kondiciované médium. Pravý pruh označuje CHO-muOPG kondiciované médium. Relativní mobilita 55 kd monomemí a 100 kd dimemí formy OPG jsou označeny pomocí šipek.

Obr. 18 znázorňuje detekci OPG exprese ve vzorcích séra a jatemích extraktech, získaných z kontrolních a OPG transgenických myší. Vzorky transgenické myši se připravily způsobem popsaným v příkladu 4. OPG exprese se vizualizovala po SDS-PAGE a následně westernovým přenosem za použití anti-OPG protilátek.

Obr. 19 znázorňuje účinky huOPG [22-401]-Fc fůzního proteinu in vitro na tvorbu osteoklastů. Test tvorby osteoklastů se provádí způsobem popsaným v příkladu HA za nepřítomnosti (kontrolní) nebo za přítomnosti naznačených množství huOPG [22-401]-Fc fúze. Tvorba osteoklastů se vizualizovala histochemickým zabarvením vinanově rezistentní kyselinofosfatázy (TRAP). Obr. 19A znázorňuje OPG přidaný do 100 ng/ml. Obr. 19D znázorňuje OPG přidaný do 0,1 ng/ml. Obr. 19E znázorňuje OPG přidaný do 0,01 ng/ml. Obr. 19F znázorňuje OPG přidaný do 0,001 ng/ml. Obr. 19G znázorňuje kontrolní vzorek bez přidání OPG.

Obr. 20 znázorňuje snížení TRAP aktivity osteoklastové kultury, k němuž dochází spolu se zvyšujícím se množstvím OPG. Při testu tvorby osteoklastů se použily naznačené koncentrace huOPG [22-401]-Fc fůzního proteinu a TRAP aktivita se kvantifikovala způsobem popsaným v příkladu 11 A.

-5CZ 292587 B6

Obr. 21 znázorňuje vliv OPG na konečné stadium diferenciace osteoklastů. HuOPG [22-401]-Fc fúze se přidala při provádění testu tvorby osteoklastů v průběhu středního stádia zrání osteoklastů (pátý až šestý den) nebo během konečného stádia zrání osteoklastů (sedmý až patnáctý den;

CTL-OPG). TRAP aktivita se kvantifikovala a porovnala s aktivitou, pozorovanou za absence OPG (CTL-CTL) v přítomnosti OPG v celém testu (OPG-OPG).

Obr. 22 znázorňuje účinky IL-Ιβ, IL-Ια a OPG na krví ionizovaný vápník v těle myší. Hladiny krví ionizovaného vápníku se monitorovaly po aplikaci injekce samotného IL-Ιβ, samotného 10 IL-la, IL-Ιβ plus muOPG [22-401]-Fc, IL-la plus MuOPG [22-401]-Fc a samotného muOPG [22-401]—Fc. Kontrolní myši přijaly pouze injekce fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS). IL-Ιβ experiment je znázorněný na obr. 22A. Experiment II-la je znázorněn na obr. 22B.

Obr. 23 znázorňuje účinky OPG na kalvariální osteoklasty u kontrolních a IL1-ošetřených myší. Histologické metody pro analýzu myších kalvariálních kostních vzorků jsou popsány v příkladu 11B. Šipky ukazují osteoklasty, obsažené ve vzorku myší po dvoudenním ošetřování. Obr. 23A znázorňuje kalvariální vzorky myší, kteiým byly aplikovány denně čtyři injekce PBS. Obr. 23B znázorňuje kalvariální vzorky myší, kterým byly aplikovány denně jedna injekce IL-1 a tři injekce PBS. Obr. 23C znázorňuje kalvariální vzorky myší, kterým byly aplikovány denně jedna injekce PBS a tři injekce OPG a obr. 23D znázorňuje kalvariální vzorky myší, kterým byly aplikovány denně jedna injekce IL-1 a tři injekce OPG.

Obr. 24 znázorňuje radiografickou analýzu kostní akumulace v dřeňové dutině normálních myší. 25 Myši se injektovaly subkutánně fyziologickým roztokem (obr. 24A) nebo muOPG [22-401]-Fc fůzí (5 mg/kg/den) po dobu čtrnácti dní (obr. 24B) a hustota kosti se určila způsobem popsaným v příkladu 11C.

Obr. 25 znázorňuje histomorfometrickou analýzu kostní akumulace v dřeňové dutině normálních 30 myší. Injektáž a histologické testy se prováděly způsobem popsaným v příkladu 11C.

Obr. 26 znázorňuje histologickou analýzu kostní akumulace v dřeňové dutině normálních myší. Injektáž a histologické testy se prováděly způsobem popsaným v příkladu 11C. Obr. 26A znázorňuje injektáž fyziologickým roztokem a obr. 26B znázorňuje injektáž muOPG 35 [22-401]-Fc fúzí.

Obr. 27 znázorňuje aktivitu OPG podaného krysám, kterým byly odňaty vaječníky. Tento jednotýdenní experiment ukázal, že OPG má tendenci blokovat řídnutí kostí a rovněž ukázal, že OPG má tendenci blokovat řídnutí kosti a rovněž ukázal další anti-resorpční terapie. DEXA 40 měření se provedla v okamžiku ovariektomie a jeden a dva týdny po ošetření. Výsledky se vyjádřily jako % změna počáteční kostní hustoty (průměrná hodnota +/- SEM).

Obr. 28 znázorňuje kostní hustotu ve femorální metafyze, měřenou histomorfometrickými metodami, která, jak se zjistilo, je u krys zbavených vaječníků (OVX) nižší než u zvířat, 45 u kterých byla tato operace pouze předstírána (SHAM) 17 dní po ovarioektomii. Tento vliv byl blokován OPG-Fc, přičemž OPG-Fc ošetřené krysy zbavené vaječníků (OVX+OPG) mají podstatně vyšší hustotu kosti než krysy zbavené vaječníků a ošetřené vehikulem (OVX) (střední hodnota +/- SEM).

Nový člen nadrodiny receptorů faktoru nekrotizujícího tumor (TNFR) byl identifikován jako exprimované sekvenční zakončení (EST), izolované z intestinální cDNA knihovny zárodku krysy. Struktury celodélkových krysích cDNA klonů a odpovídajících myších a humánních cDNA klonů byly určeny a popsány v příkladech 1 a 6. Krysí, myší a humánní geny jsou znázorněny na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO: 120), 9A až 9B (SEQ ID NO: 122), resp. 9C až 9D 55 (SEQ ID NO: 124). Všechny tři sekvence vykazovaly vysokou podobnost s extracelulámími

-6CZ 292587 B6 doménami členů TNFR rodiny. Žádný z izolovaných celodélkových cDNA klonů nekódoval transmembránové a cytoplazmatické domény, jak by se u membránu vážících receptorů očekávalo, z čehož vyplývá, že tyto cDNA kódující spíše rozpustné sekretované proteiny než buněčné povrchové receptory. Část nukleotidů 1200—1353 tvořících humánní gen, znázorněných na obr. 9D, byla uložena do databáze Genové banky 22. listopadu 1995 pod přírůstkovým číslem 17188769.

Příklad 2 popisuje zjištěnou tkáňovou distribuci krysí a humánní mRNA. mRNA exprese u krys byla detekována v ledvinách, játrech, placentě a srdci, přičemž nej vyšší exprese byla zjištěna v ledvinách. Rovněž byla zjištěna exprese v kosterním svalu a slinivce. U lidí byla detekována exprese ve stejných tkáních a rovněž v lymfatických uzlinách, brzlíku, slezině a slepém střevě.

Krysí cDNA se exprimovala v transgenických myších (příklad 3) za použití ApoE promotorového expresivního systému, specifického pro játra. Analýza expresorů ukázala podstatné zvýšení hustoty kosti, zejména u dlouhých kostí (stehenních kostí), obratlů a plochých kostí (pánve). Histologická analýza zabarvených částí kosti ukazovala na závažnou osteoporózu (viz příklad 4) naznačující značnou nerovnováhu mezi tvorbou kostní hmoty a resorpcí, která vedla k značné akumulaci kosti a chrupavky. Snížení počtu trabekulámích osteoklastů v kostech OPG expresorových zvířat naznačuje, že podstatnou část aktivity TNFR-příbuzného proteinu může představovat ochrana před kostní resorpcí, která je procesem zprostředkovaným osteoklasty. Z pohledu aktivity v transgenových expresorech jsou zde popsány TNFR-příbuzné proteiny, označené jako OPG.

Za použití krysí cDNA sekvence se izoloval myší a humánní cDNA klon (příklad 5). Exprese myšího OPG v 293 buňkách a humánního OPG v bakterii E. coli je popsána v příkladech 7 a 8. Myší OPG se produkoval jako Fc fúze, která se čistila afinitní chromatografií (protein A). Příklad 7 rovněž popisuje expresi celodélkového a seříznutého humánního a myšího OPG polypeptidů v HO a 293 buňkách buď jako expresi fúzních polypeptidů na Fc oblast humánního IgGl nebo jako expresi nekondenzovaných polypeptidů. Exprese celodélkového a seříznutého humánního a myšího OPG v E. coli buď jako Fc fúzních polypeptidů nebo jako nekondenzovaných polypeptidů je popsána v příkladu 8. Purifikace rekombinantně produkovaného savčího a bakteriálního OPG je popsána v příkladu 10.

Biologická aktivita OPG se určila za použití in vitro testu osteoklastového zrání, in vivo modelu interleukinu-1 (IL-1) indukovaného hyperkalcemií a injekčních studií hustoty kosti u normálních myší (viz příklad 11). Následující OPG rekombinantní proteiny produkované v CHO nebo 293 buňkách demonstrovaly v testu osteoklastového zrání aktivitu v E. coli: muOPG [22—185]—Fc, muOPG [22-194]-Fc, muOPG [22-401]-Fc, huOPG [22-201]-Fc, huOPG [22-401]-Fc. muOPG [22—180]—Fc produkovaný v CHO buňkách a huOPG met [32-401] produkovaný v E. coli nedemonstrovaly aktivitu v in vitro testu.

OPG, získaný z několika zdrojů, se produkoval jako dimer a do určité míry jako vyšší multimer. Krysí OPG [22-401] produkovaný v transgenických myších, muOPG [22-401] a huOPG [22-401] produkovaný jako rekombinantní polypeptid v CHO buňkách a OPG exprimovaný jako přirozeně se vyskytující produkt cytotoxické T buněčné linie tvořily převážně dimery a trimery, jak ukázala analýza na neredukčních SDS gelech (viz příklad 9). Seříznuté OPG polypeptidy mající delece v oblasti aminokyselin 186-401 (např. OPG [1-185] a OPG [1-194]) byly převážně monomemí z čehož vyplývá, že oblast 186-401 může být součástí samospojování OPG polypeptidů. Nicméně huOPG met[32-401], produkovaný v E. coli. byl z velké části monomemí.

OPG může být důležitý při regulaci kostní resorpce. Zdá se, že protein působí jako rozpustný receptor TNF rodiny a může bránit interakci mezi receptorem a ligandem, který se podílí na osteolytické dráze. Zdá se, že jedním aspektem regulace je redukce počtu osteoklastů.

-7CZ 292587 B6

Nukleové kyseliny

Vynález poskytuje izolovanou nukleovou kyselinu, kódující polypeptid, který má alespoň jednu biologickou aktivitu OPG. Jak je zde uvedeno, biologické aktivity OPG zahrnují neomezujícím 5 způsobem veškeré aktivity zahrnující kostní metabolizmu a zejména zahuštění kostí. Nukleové kyseliny podle vynálezu se zvolí z následujícího výčtu kyselin:

a) sekvence nukleových kyselin, které jsou znázorněny na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO: 120), obr. 9A až 9B (SEQ ID NO: 122), resp. obr. 9C až 9D (SEQ ID NO: 124) nebo jejich komplementární řetězce;

b) nukleové kyseliny, které hybridizují za přísných podmínek s polypeptid-kódující oblastí, znázorněnou na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO: 120), obr. 9A až 9B (SEQ ID NO: 122), resp. obr. 9C až9D (SEQ ID NO: 124);

c) nukleové kyseliny, které hybridizují za přísných podmínek s nukleotidy 148 až 337 včetně těch, které znázorňuje obr. 1 A; a

d) sekvence nukleových kyselin, které tvoří degenerované formy sekvencí (a) a (b).

Vynález poskytuje nukleové kyseliny, které kódují krysí, myší a humánní OPG stejně jako nukleové sekvence hybridizující na sekvence, které kódují polypeptid mající alespoň jednu biologickou aktivitu OPG. Vynález rovněž poskytuje nukleové kyseliny, které hybridizují na krysí OPG EST zahrnující nukleotidy 148-337, jak ukazuje obr. IA. Podmínkami pro hybridizaci 25 jsou zpravidla vysoká přísnost, například 5xSSC, 50% formamid a 42 °C, což jsou podmínky popsané v příkladu 1. Ekvivalentní přísnost s těmito podmínkami lze snadno získat nastavením koncentrací soli a organického rozpouštědla a nastavením teploty. Nukleové kyseliny v (b) zahrnují sekvence, kódující OPG-odvozené polypeptidy, které nepodléhají detekovatelné hybridizaci s dalšími známými členy TNF receptorové nadrodiny. U výhodného provedení jsou 30 nukleovými kyselinami kyseliny, znázorněné na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO: 120), 9A až 9B (SEQ ID NO: 122), resp. 9C až 9D (SEQ ID NO: 124).

Délka hybridizujících nukleových kyselin podle vynálezu může být různá, protože hybridizace může probíhat v části polypeptid-kódujících oblastí nebo ve všech polypeptid-kódujících 35 oblastech, které jsou znázorněny na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO: 120), 9A až 9B (SEQ ID NO: 122), resp. 9C až 9D (SEQ ID NO: 124) a může rovněž probíhat v sousedících nekódujících oblastech. Hybridizující nukleové kyseliny mohou tedy představovat seříznutí nebo rozšíření sekvencí znázorněných na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO: 120), 9A až 9B (SEQ ID NO: 122) resp. 9C až 9D (SEQ ID NO: 124). Sestřižené nebo rozšířené nukleové 40 kyseliny jsou součástí vynálezu, pokud si zachovávají jednu nebo několik biologických vlastností

OPG. Hybridizující nukleové kyseliny mohou rovněž zahrnovat sousední nekódující oblasti, které jsou 5' a/nebo 3' vzhledem k OPG kódující oblasti. Nekódující oblasti zahrnují regulační oblasti, které se podílí na OPG expresi, například promotory, zesílení, translační iniciační místa, transkripční terminační místa apod.

Hybridizační podmínky pro nukleové kyseliny popsal Sambrook a kol. v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989).

DNA, kódující krysí OPG byla poskytnuta v plazmidů pMO-Bl.l, který byl uložen Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, 27. prosince 1995, pod ATCC přírůstkovým číslem 69970. Myší OPG-kódující DNA byla poskytnuta ve formě plazmid pRcCMV-myší OPG, uložené v Američan Type Culture Collection, Rockville, MD, 27. prosince 1995, pod přírůstkovým číslem 69971. Humánní OPG-kódující DNA byla poskytnuta ve formě 55 plazmidového pRcCMV-humánního OPG a uložena v Američan Type Culture Collection,

-8CZ 292587 B6

Rockville, MD. 27. prosince 1995, pod přírůstkovým číslem 69969. Nukleové kyseliny podle vynálezu budou hybridizovat za přísných podmínek na DNA inzerty, uložené pod ATCC přírůstkovými čísly 69969, 69970 a 69971, a mají alespoň jednu biologickou aktivitu OPG.

Vynález rovněž poskytuje deriváty sekvencí nukleových kyselin, které jsou znázorněny na obr. 2B, 9A a 9B. Jak je zde uvedeno, deriváty zahrnují sekvence nukleových kyselin mají adice, substituce, inzerty nebo delece jednoho nebo více zbytků, takže výsledné sekvence kódují polypeptidy mající jednu nebo více aminokyselinových zbytků, které byly přidány, vynechány, vloženy nebo substituovány a výsledný polypeptid má aktivitu OPG. Deriváty nukleových kyselin mohou tvořit přirozeně se vyskytující kyseliny, například variantu vzniklou sestřihem, nebo polymorfismus, nebo mohou být zkonstruovány pomocí technik místně směrované mutageneze, které jsou odborníkům v daném oboru dostupné. Příkladem přirozeně se vyskytující varianty OPG je nukleová kyselina, kódující změnu lys na asn na 3. zbytku vedoucí sekvence (viz příklad 5). Dá se předpokládat, že deriváty nukleových kyseliny budou kódovat aminokyselinové změny v oblastech molekuly, ve kterých je nejméně pravděpodobné, že by došlo k narušení biologické aktivity. Další deriváty zahrnují nukleovou kyselinu, kódující formu OPG vážící membránu, která má extracelulární doménu, jak ukazují obr. 2B až 2C (SEQ ID NO: 120), 9A až 9B (SEQ ID NO: 122), resp. 9C až 9D (SEQ ID NO: 124) spolu s transmembránovou a cytoplazmovou doménou.

U jednoho provedení zahrnují deriváty OPG nukleové kyseliny, kódující seříznuté formy OPG z jejichž karboxylového konce byla odstraněna jedna nebo více aminokyselin. Nukleové kyseliny, kódující OPG, mohou postrádat na karboxylovém konci 1 až 216 aminokyselin. Oblast protilátky Fc může případně vybíhat z nového karboxylového konce a poskytovat tak biologicky aktivní OPG-Fc fúzní polypeptid (viz příklad 11). U výhodných provedení nukleové kyseliny kódují OPG, který má aminokyselinovou sekvenci, totožnou se zbytky 22 až 185, 22 až 189, 22 až 194 nebo 22 až 201 (při použití číslování znázorněného na obrázcích 9E až 9F) a případně kódující Fc oblast humánního IgG.

Součástí jsou rovněž nukleové kyseliny, kódující seříznuté formy OPG, který postrádá jednu nebo více aminokyselin na N-konci. Seříznuté formy zahrnují formy postrádající část z 21 aminokyselin nebo všech 21 aminokyselin, obsahujících vedoucí sekvenci. Kromě toho vynález poskytuje nukleové kyseliny kódující OPG, který postrádá 1 až 10 aminokyselin na zralém N-konci (na 22. zbytku) a který postrádá případně 1 až 216 aminokyselin na C-konci (na 401. zbytku). Nukleové kyseliny mohou případně kódovat methioninový zbytek na N-konci. Příklady takových OPG seříznutých polypeptidů jsou popsány v příkladu 8.

Příklady nukleových kyselin podle vynálezu zahrnují cDNA, genomovou DNA, syntetickou DNA a RNA. cDNA se získala z knihoven připravených z mRNA, izolované z různých tkání exprimujících OPG. U lidí jsou tkáňovými zdroji OPG ledviny, játra, placenta a srdce. Genomová DNA, kódující OPG se získala zgenomových knihoven, které jsou komerčně dostupné pro celou řadu druhů. Syntetická DNA se získala chemickou syntézou vzájemně se překrývajících oligonukleotidových fragmentů, po které následovalo sestavení fragmentů do rekonstituované části kódovací oblasti nebo do celé kódovací oblasti a lemovacích sekvencí (viz patentu US 4,695,623, který popisuje chemickou syntézu interferonových genů). RNA se nejsnáze získala pomocí prokaryotických expresivních vektorů, které řídí vysokoúrovňovou syntézu mRNA, například pomocí vektorů používajících T7 promotory a RNA polymerázu.

Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu se používají pro deleci OPG sekvencí v biologických vzorcích při určování buněk a tkání, které exprimují OPG mRNA. Sekvence mohou být rovněž použity k prohledávání sekvencí příbuzných s OPG v cDNA a v genomových knihovnách. Takové prohledávání patří mezi metody, které jsou odborníci v oblasti, zabývající se deleci homologických sekvencí za vhodných hybridizačních podmínek, schopni běžně provádět. Nukleové kyseliny jsou rovněž užitečné při modulaci exprese OPG hladin protismyslnou terapií

-9CZ 292587 B6 nebo genovou terapií. Nukleové kyseliny se rovněž používají při vývoji transgenických zvířat, která lze použít při produkci polypeptidu a při studii biologické aktivity (viz příklad 3).

Vektory a hostitelské buňky

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají expresní vektory, obsahující sekvence nukleových kyselin kódující OPG, hostitelské buňky, transformované uvedenými vektory, a způsoby přípravy OPG. Přehled exprese rekombinantních proteinů lze nalézt v Methods of Enzymology sv. 185, Goeddel, D. V. ed. Academie Press (1990).

Hostitelské buňky pro přípravu OPG zahrnují prokaryotické hostitelské buňky, například E. coli, kvasinkové, rostlinné, hmyzí a savčí hostitelské buňky. Pro expresi jsou vhodné například bakteriální kmeny E. coli HB101 nebo JM101. Výhodné savčí hostitelské buňky zahrnují COS, CHOd-, 293, CV-1, 3T3, buňky ledvin nedospělého křečka (BHK) a další. Savčí hostitelské buňky jsou výhodné, pokud jsou pro OPG aktivitu důležité post-translační modifikace, například glykosylace a zpracování polypeptidu. Savčí exprese umožňuje produkci sekretovaných polypeptidů, které lze z růstového média izolovat.

Vektory pro expresi OPG obsahují minimální počet sekvencí potřebných pro propagaci vektoru a pro expresi klonovaného inzertu. Tyto sekvence zahrnují počátek replikace, selekční markér, promotor, ribozomové vazebné místo, sekvence zesilovače, místa RNA sestřihu a místa transkripční terminace. Vektory vhodné pro expresi v již zmíněných hostitelských buňkách jsou snadno dostupné. Nukleové kyseliny podle vynálezu se zavedou do vektorů pomocí standardních rekombinantních DNA technik. Součástí jsou rovněž vektory pro tkáňově specifickou expresi OPG. Tyto vektory zahrnují promotory, které fungují při produkci v myších, specificky v játrech, ledvinách anebo dalších orgánech, a virové vektory pro expresi OPG v cílových lidských buňkách.

Při použití vhodného systému hostitel-vektor, se OPG produkuje rekombinantní kultivací hostitelské buňky, transformované expresním vektorem, obsahujícím sekvence nukleových kyselin, které kódují OPG za podmínek, za kterých se produkuje OPG, a izolací produktu exprese. OPG se produkuje v supematantu transfektovaných savčích buněk nebo v inkluzních tělech transformovaných bakteriálních hostitelských buněk. Takto vyprodukované OPG může být purifikováno postupy známými odborníkům v daném oboru, které budou popsány níže. Exprese OPG v savčích a bakteriálních hostitelských systémech je popsána v příkladech 7 a 8. Příkladem expresních vektorů pro savčí hostitele jsou plazmidy, například pDSRa, popsaný v PCT přihlášce č. 90/14363. Příkladem expresních vektorů pro bakteriální hostitelské buňky jsou plazmidy pAMG21 a pAMG22-His, popsané v příkladu 8. Plazmid pAMG21 byl uložen Americal Type Culture Collection, Rockville, MD. 24. července 1996 pod přírůstkovým číslem 98113. Plazmid pAMG22-His byl uložen Americal Type Culture Collection, Rockville, MD. 24. července 1996 pod přírůstkovým číslem 98112. Je zřejmé, že zde popsané specifické plazmidy a hostitelské buňky jsou pouze ilustrativními příklady a pro expresi polypeptidů mohou být použity další dostupné plazmidy a hostitelské buňky.

Vynález rovněž poskytuje expresi OPG z endogenních nukleových kyselin filtrací in vivo nebo ex vivo rekombinacemi, které umožňují modulaci OPG z hostitelského chromozomu. Součástí je rovněž exprese OPG, jejíž podstatou je zavedení exogenních regulačních sekvencí (např. promotorů nebo zesilovačů), které jsou schopny řídit produkci OPG z míst, kódujících endogenní OPG. Vynález rovněž zahrnuje stimulaci endogenních regulačních sekvencí, schopných řídit produkci OPG (např. vystavením transkripčním zesilovacím faktorům).

Polypeptidy

Vynález poskytuje OPG, nový člen TNF receptorové nadrodiny, který vykazuje aktivitu souvisící s kostním metabolizmem. OPG je aktivní zejména při inhibici kostní resorpce, kdy zvyšuje

-10CZ 292587 B6 hustotu kostní hmoty. OPG označuje polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci myšího, krysího nebo humánního OPG nebo jeho derivátu, které mají alespoň jednu z biologických aktivit OPG. Aminokyselinové sekvence krysího, myšího a humánního OPG jsou znázorněny na obrázcích 2B až 2C (SEQ ID NO: 121), 9A až 9B (SEQ ID NO: 123), resp. 9C až 9D (SEQ ID NO: 125). Derivát OPG označuje polypeptid obsahující adici, deleci, inzerci nebo substituci jedné nebo více aminokyselin, takže výsledný polypeptid má alespoň jednu z biologických aktivit OPG. Biologické aktivity OPG zahrnují neomezujícím způsobem aktivity, jejichž součástí je kostní metabolizmus. Tyto polypeptidy budou mít výhodně vN-koncové vedoucí sekvenci vynecháno 21 aminokyselin.

OPG polypeptidy, které spadají do rozsahu vynálezu, zahrnují krysí [1-401], krysí [22-180], krysí [22—401], kry sí [22-401]-Fc fúzi, krysí [1—180]—Fc fúzi, myší [1-401], myší [1-180], myší [22-401], humánní [1—401], myší [22—180], humánní [22-401], humánní [22-180], humánní [1-180], humánní [22-180]-Fc fúzi a humánní met-32-401. Číslování aminokyselin je znázorněno v SEQ ID NO: 121 (krysí), SEQ ID NO: 123 (myší) a SEQ ID NO: 125 (humánní). Součástí jsou rovněž pohpeptidové deriváty, které mají delece nebo seříznuté C-konce, takže postrádají část aminokyselinových zbytků 180-401 OPG nebo všechny tyto zbytky; jednu nebo více aminokyselinových změn ve zbytcích 180 až 401; deleci části nebo celé domény OPG bohaté na cystein, zejména deleci vzdálené (C-koncové) domény bohaté na cystein; a jednu nebo více aminokyselinových změn v doméně bohaté na cystein, zejména na vzdálené (C-koncové) doméně bohaté na cystein. U jednoho provedení má OPG ve zralém N-konci vynechánu 1 až přibližně 10 aminokyselin (přičemž zralým N-koncem je 22. zbytek) a případně 1 až přibližně 216 aminokyselin v C-konci.

Další OPG polypeptidy, které spadají do rozsahu vynálezu zahrnují: humánní [22-180]-Fc fůzi, humánní [22-201]-Fc fúzi, humánní [22-401]-Fc fúzi, myší [22-185]-Fc fúzi, myší [22-194]-Fc fůzi. Tyto polypeptidy se produkují v savčích hostitelských buňkách, například v CHO nebo v 293 buňkách. Dalšími OPG polypeptidy, které jsou součástí vynálezu, jsou následující polypeptidy, které se exprimují v prokaryotických hostitelských buňkách: humánní met[22-401], Fc-humánní met[22-401] fuze (Fc oblast je navázána na N-konec celodélkové OPG kódující sekvence, jak uvádí příklad 8), humánní met[22-401]-Fc fůze (Fc oblast se váže na celodélkovou OPG sekvenci), Fc-myší met[22—401] fuze, myší met[22-401]-Fc fúze, humánní met[27^IOl], humánní met[22-185], humánní met[22-189], humánní met[22-194], humánní met[22-194] (P25A), humánní met[22-194] (P26A), humánní met[27-185], humánní met[27-189], humánní met[27-194], humánní met-arg-gly-ser-(his)6 [22-401], humánní met-lys [22-401], humánní met-lys₃-[22-401], humánní met[22-401]-Fc (P25A), humánní met[22-401] (P25A), humánní met[22-401] (P26A) humánní met[22-401] (P26D), myší met[22—401], myší met[27-401], myší met[32-401], myší met[27-180], myší met[22-189), myší met[22-194], myší met[27-189], myší met[27-194], myší met-lys[22-401], myší HEK[22-401] (A45T), myší met-lys-(his)7[22-401], myší met-lys[27-401]-(his)7 a myší met[27-401] (P33E, G36S, A45P). Je zřejmé, že výše uvedené OPG polypeptidy, produkované v prokaryotických hostitelských buňkách, mají N-koncový methioninový zbytek, pokud není tento zbytek přímo označen. U konkrétních příkladů se při produkci OPG-Fc fúze použila oblast, tvořená 227 aminokyselinami humánního IgGl-γΙ, která měla sekvenci uvedenou Ellisonem a kol. v (Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079 (1998)). Nicméně rovněž mohou být použity další varianty Fc oblasti humánního IgG.

Analýza biologické aktivity C-koncových OPG sestřihů, kondenzovaných s humánní IgGl Fc oblastí, označuje část OPG tvořenou přibližně 164 aminokyselinami, které jsou potřebné pro danou aktivitu. Tato oblast zahrnuje aminokyseliny 22-185, výhodně aminokyseliny znázorněné na obrázcích 9C až 9D (SEQ IDNO:125), a obsahuje čtyři domény, bohaté na cystein, které jsou charakteristické pro domény bohaté na cystein TNFR extracelulámích domén.

Při použití homologie mezi OPG a extracelulámími doménami vážícími ligandy členů rodiny TNF receptorů, se na základě známé krystalické struktury extracelulámí domény TNFR-I vyrobil

-11 CZ 292587 B6 trojrozměrný model OPG (viz příklad 6). Tento model se použil při identifikaci těch zbytků v OPG, které by mohly být důležité pro biologickou aktivitu. Byly identifikovány cysteinové zbytky, které se podílejí na udržení struktury čtyř domén bohatých na cystein. V modelu se identifikovaly následující disulfidové vazby: doména 1: cys41 na cys54, cys44 na cys62, tyr23 5 a his66 mohou stabilizovat strukturu této domény; doména 2: cys65 na cys80, cys83 na cys98, cys87 na cysl05; doména 3: cysl07 na cysl 18, cysl24 na cysl42; doména 4: cysl45 na cyslóO, cysl66 na cysl85. Jak ukazují obrázky 11 a 12A až 12B, rovněž se identifikovaly zbytky, které ležely v těsné blízkosti TNFp. U tohoto modelu se dá předpokládat, že se OPG váže na odpovídající ligand; TNFβ se použije jako modelový ligand pro simulaci interakce OPG sjeho ío ligandem. Na tomto modelu se ukázalo, že pro návaznost ligandů jsou důležité následující zbytky v OPG: glu34, lys43, pro66 až gln91 (zejména pro66, his68, tyr69, tyr70, thr71, asp72, ser73, his76, ser77, asp78, glu79, leu81, tyr82, pro85, val86, lys88, glu90 a gln91), glul53 a serl55.

Změny v těchto aminoky selinových zbytcích, buď samostatně nebo v kombinaci, mohou ovlivnit 15 biologickou aktivitu OPG. Například změny specifických cysteinových zbytků mohou změnit strukturu jednotlivých domén bohatých na cystein, zatímco změny zbytků, které jsou důležité pro vaznost ligandů, mohou ovlivnit fyzikální interakce OPG s ligandy. Strukturní modely mohou pomoci při identifikaci analogů, které mají žádanější vlastnosti, například zvýšenou biologickou aktivitu, vyšší stabilitu nebo snazší způsob formulace.

Vynález rovněž poskytuje OPG multimer, který obsahuje OPG monomery. Zdá se, že OPG je aktivní jako multimer (například dimer, trimer, multimer obsahující vyšší počet monomerů). Výhodně jsou OPG multimery dimery nebo trimery. OPG multimery mohou obsahovat monomery, které mají aminokyselinovou sekvenci OPG, dostačující pro podporu multimemí 25 formace, nebo mohou obsahovat monomeiy, které mají heterologické sekvence, například oblast protilátky Fc. Z analýzy C-koncových delecí OPG vyplývá, že alespoň část oblasti 186-401 je ve spojení sOPG polypeptidy. Substituce části oblasti OPG aminokyselin 186-401 nebo celé této oblasti aminokyselinovou sekvencí, která je schopna samospojení, spadá rovněž do rozsahu vynálezu. Alternativně mohou být OPG polypeptidy nebo jejich deriváty modifikovány za vzniku 30 dimeru nebo multimerů místně cílenou mutagenezí, která vede k vytvoření nezpárovaných cysteinových zbytků pro rotaci meziřetězcové disulfidové vazby, fotochemickým zesíťováním, například vystavením UV světlu, nebo chemickým zesíťováním dvoufunkčními spojovacími molekulami, například dvoufunkčním polyethylenglykolem apod.

Součástí vynálezu jsou i modifikace OPG polypeptidů, přičemž tyto modifikace zahrnují post-translační modifikace (např. N-navázaný nebo O-navázaný uhlohydrátový řetězec, zpracování N-konce nebo C-konce), přichycení chemických zbytků na aminokyselinový hlavní řetězec, chemické modifikace N-navázaného nebo O-navázaného uhlohydrátového řetězce a přidání N— koncového methioninového zbytku v důsledku exprese prokaryotické hostitelské buňky.

Polypeptidy mohou být rovněž modifikovány tak, aby je bylo možné detekovat, například enzymaticky, pomocí fluorescenční látky, pomocí izotopu nebo afinitním značením, které umožní detekovat a izolovat protein.

Další modifikace OPG zahrnují chimérické proteiny, ve kterých je OPG kondenzován na 45 heterologickou aminokyselinovou sekvenci. Heterologickou sekvencí může být libovolná sekvence, která umožní výslednému fúznímu proteinu ponechat si aktivitu OPG. Heterologové sekvence zahrnují například imunoglobulinové fúze, například Fc fúze, které mohou pomoci při purifíkaci tohoto proteinu. Výhodná je heterologická sekvence, která podporuje spojení OPG monomerů do formy dimeru, trimerů a dalších vyšších multimemích forem.

Polypeptidy podle vynálezu se izolují a purifíkují od dalších polypeptidů přítomných ve tkáních, buněčných liniích a transformovaných hostitelských buňkách exprimujících OPG, nebo jsou purifikovány od složek buněčných struktur obsahujících sekretovaný protein. U jednoho provedení je polypeptid uvolněn ze spojení s dalšími humánními proteiny jako expresní produkt 55 bakteriální hostitelské buňky.

-12CZ 292587 B6

Vynález rovněž poskytuje chemicky modifikované deriváty OPG, které mohou poskytovat další výhody, například zvýšení stability a cirkulační doby polypeptidu, nebo snížení imunogenicity (viz patent US 4,179,337). Chemické zbytky pro derivaci lze zvolit z vodou rozpustných polymerů, například polyethylenglykolu, kopolymerů ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulózy, dextranu, polyvinylalkoholu apod. Polypeptidy mohou být modifikovány v nahodilých polohách molekuly nebo v předem stanovených polohách molekuly a mohou zahrnovat jeden, dva, tři nebo více navázaných chemických zbytků.

Polymerem může být polymer s libovolnou molekulovou hmotností a může být větvený nebo přímý. Pro polyethylenglykol je z důvodu snadné manipulace a výroby výhodnou molekulovou hmotností přibližně 1 kDa až 100 kDa (výraz „přibližně“ označuje, že v přípravcích polyethylenglykolu budou některé molekuly těžší a některé lehčí než stanovená molekulová hmotnost). Je zřejmé, že lze použít polymery s jinou molekulovou hmotností, přičemž jejich velikost bude závislá na požadovaném terapeutickém profilu (například na požadované době trvání dlouhodobého uvolňování, účincích, biologické aktivitě, obtížnosti manipulace, stupni nebo nedostatku antigenicity a dalších známých vlivech polyethylenglykolu na terapeutický protein nebo jeho analog).

Při navázání molekul polyethylenglykolu (nebo dalších chemických zbytků) na protein by se měly zvážit všechny možné vlivy a funkční nebo antigenní domény proteinu. Odborníci v daném oboru mají k dispozici celou řadu možných způsobů navázání, například způsob popsaný v dokumentu EP 0 401 384 (navázání PEG na G-CSF), viz rovněž Malík a kol., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (popisující pegylaci GM-CSF pomocí tresylchloridu). Polyethylenglykol lze například kovalentně navázat pomocí aminokyselinových zbytků přes reakční skupinu, například přes volnou aminoskupinu nebo karboxylovou skupinu. Reakčními skupinami jsou ty skupiny, na které lze navázat molekuly aktivovaného polyethylenglykolu. Aminokyselinové zbytky, které mají volnou aminoskupinu, mohou zahrnovat lysinové zbytky a N-koncové aminokyselinové zbytky; a ty, které mají volnou karboxylovou skupinu mohou zahrnovat zbytky tvořené kyselinou asparágovou, zbytky tvořené kyselinou glutamovou a C-koncový aminokyselinový zbytek. Jako reakční skupinu pro navázání molekuly (molekul) polyethylenglykolu lze rovněž použít merkaptoskupiny. Pro terapeutické účely je výhodné navázání na aminoskupinu, například navázání na N-konec nebo lysinovou skupinu.

Někdy může být žádoucí konkrétní N-terminačně chemicky modifikovaný protein. Při použití polyethylenglykolu jako ilustrativního příkladu kompozic podle vynálezu lze polyethylenglykol zvolit z celé řady polyethylenglykolových molekul (s různou molekulovou hmotností, různým větvením, atd.). Rovněž lze zvolit různé poměry polyethylenglykolových molekul ku molekulám proteinu (nebo peptidu) v reakční směsi, typy pegylačních reakcí, které se mají provést a způsoby získání zvoleného N-terminačně pegylovaného proteinu. Způsobem získání N-terminačně pegylátového přípravku (tj. separování tohoto zbytku od dalších monopegylátovaných zbytků v případě potřeby) může být purifikace N-terminačně pegylovaného materiálu z populace pegylovaných proteinových molekul. Selektivní N-terminační chemickou modifikaci lze provádět redukční alkylací, která využívá různou reaktivitu různých typů primárních aminoskupin (lysin versus N-zakončení) dostupných pro derivatizaci v konkrétním proteinu. Za vhodných reakčních podmínek je možné pomocí polymeru, obsahujícího karbonylovou skupinu, dosáhnout v podstatě selektivní derivatizace proteinu na N-konci.

Syntetické OPG dimery mohou být připraveny celou řadou různých způsobů chemického síťování. OPG monomery mohou být chemicky spojeny libovolným způsobem, který zachová nebo zvýší biologickou aktivitu OPG. Pro tyto účely lze použít široké spektrum chemických síťovacích činidel, přičemž tato činidla se zvolí v závislosti na požadovaném proteinovém dimerů. Síťovací činidla mohou být například krátká a relativně tuhá nebo delší a pružnější, mohou být biologicky reverzibilní a mohou poskytovat sníženou imunogenicitu nebo delší farmakokinetický poločas života.

-13CZ 292587 B6

U jednoho příkladu se OPG molekuly naváží přes N-konec dvoustupňovou syntézou (viz příklad 12). V prvním stupni se OPG chemicky modifikuje na N-konci tak, že se na tento konec zavede chráněná thiolová skupina, která se po purifikaci zbaví ochranné skupiny a použije jako místo navázání při místně specifické konjugaci, při které se druhá OPG molekula může navázat přes celou řadu různých síťovacích činidel. N-koncové příčné vazby zahrnují neomezujícím způsobem disulfidovou vazbu, thioetherové vazby využívající bis-funkční alifatická síťovací činidla s krátkým řetězcem a thioetherové vazby na dvoufunkční polyethylenglykolová síťovací činidla s různými délkami (PEG „dumbbells“). Součástí PEG „dumbbells“ syntézy OPG dimerů je rovněž vedlejší produkt této syntézy, který se označuje jako „monobell“. OPG „monobell“ je tvořen monomerem, navázaným na lineární dvoufunkční PEG přes volný polymemí konec. Alternativně lze OPG zesíťovat přímo přes celou řadu pro amin specifických homobifunkčních síťovacích technik, které zahrnují použití reakčních činidel, jakými jsou například: dianhydrid kyseliny diethylentriamin-pentaoctové (DTPA), p-benzochinon (pBQ) nebo bis(sulfosukcinimidyl)suberát (BS'’) a rovněž dalších v daném- oboru známých činidel. Je rovněž možné navázat reakční činidla, jakým je například iminothiolan, v přítomnosti různých dvoufunkČních, pro thiol specifických, síťovacích Činidel, například bismaleinimidu, na thiolit OPG a dosáhnout tak dimerace a/nebo vytvoření „dumbbells“ v jediném provozním kroku.

Součástí vynálezu je rovněž způsob purifikace OPG z přírodních zdrojů a z transfektovaných hostitelských buněk. Purifikační proces lze provádět v jednom nebo více standardních proteinových purifíkačních krocích, prováděných v pořadí vhodném pro získání purifikovaného proteinu. Chromatografické kroky mohou obsahovat výměnu iontů, gelovou filtraci, hydrofobní interakci, reverzní fázi, chromatografické zaměření, afinitní chromatografií používající anti-OPG protilátku nebo biotin-streptavidinový afinitní komplex apod.

Protilátky

Součástí vynálezu jsou rovněž protilátky, specificky se vážící na OPG. Antigeny pro generování protilátek mohou být celodélkové peptidy nebo peptidy tvořené částí OPG sekvence. Imunologické postupy pro generování polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, reagujících s OPG, jsou odborníkům v daném oboru známy (viz například Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N. Y. (1988)). Takto vyráběné protilátky jsou charakteristické vazebnou specifičností a jsou epitopově rozlišitelné pomocí standardních imunosorpčních testů, využívajících navázání enzymu. Protilátky rovněž zahrnují chimérické protilátky, které mají variabilní doménové oblasti a konstantní doménové oblasti, odvozené z různých druhů. U jednoho provedení jsou chimérickými protilátkami humanizované protilátky, které mají myší variabilní domény a humánní konstantní doménu. Součástí vynálezu jsou rovněž komplementární určovací oblasti, naroubované na humánní síť (tak zvané CDR-roubované protilátky). Chimérické a CDR-roubované protilátky jsou vyrobeny rekombinantními způsoby, které jsou odborníkům v daném oboru známy. Součástí jsou rovněž lidské protilátky vyprodukované v myších.

Anti-OPG protilátky podle vynálezu mohou být použity jako afinitní reakční činidlo při purifikaci OPG z biologických vzorků (viz příklad 10). U jednoho způsobu se protilátka imobilizuje na CnBr-aktivované Sepharose a sloupec konjugátu protilátka-Sepharosa se použije při odstraňování OPG z kapalných vzorků. Protilátky se rovněž používají jako diagnostická reakční činidla pro detekci a kvantifikaci OPG v biologických vzorcích v případě, že se detekce a kvantifikace provádí níže popsaným způsobem.

-14CZ 292587 B6

Farmaceutické kompozice

Vynález rovněž poskytuje farmaceutické kompozice obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidu podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným ředidlem, nosičem, rozpouštědlem, emulgátorem, konzervační látkou a/nebo adjuvansem.

Výraz ..terapeuticky účinné množství“ znamená množství, které poskytuje terapeutický účinek pro specifikovaný stav a způsob podání. Kompozice může být v kapalné nebo lyofilizované formě a obsahuje ředidlo (Tris, acetát nebo fosfátové pufiy), které na různé pH hodnoty a iontové síly, rozpouštědlo, například Tween nebo Polysorbát, nosiče, například albumin lidského séra nebo želatinu, konzervační látky⁷, například kyselinu askorbovou nebo pyrosiřičitan sodný. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají kompozice, obsahující OPG modifikovaný vodou rozpustnými polymery, které zvyšují jejich rozpustnost nebo stabilitu. Kompozice mohou rovněž obsahovat zabudování OPG do liposomů, mikroemulzí, micel nebo vehikul, které umožní dlouhodobou kontrolovanou dopravu účinné látky. OPG kompozice mohou konkrétně obsahovat zabudování do polymemích matric, například hydrogelů, silikonů, polyethylenů, kopolymerů ethylenu a vinylacetátu nebo biologicky' degradovatelných polymerů. Použitelnými hydrogely jsou například polyhydroxyalkylmethakryláty (p-HEMA), polyakrylamid, polymethakrylamid, polyvinylpyrrolidon, polyvinylalkohol a různé polyelektrolytové komplexy. Příkladem biologicky degradovatelných polymerů jsou například kyselina poly(2-hydroxypropanová) (PLA), kyselina polyglykolová (PGA), kopolymery PLA a PGA, polyamidy a kopolymery polyamidů a polyesterů. Další kontrolované se uvolňující formulace zahrnují mikrokapsle, mikrokuličky, makromolekulám! komplexy a polymemí perličky, které lze podávat formou injekcí.

Volba příslušné kompozice bude záviset na množství faktorů včetně stavu, který je léčen, způsobu podání a požadovaných farmakokinetických parametrech. Rozsáhlejší přehled složek vhodných pro farmaceutické kompozice lze nalézt v Remingtoďs Pharmaceutical Sciences, 18. vydání A. R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980).

Kompozice podle vynálezu lze podávat formou injekce, buď subkutánní, intravenózní nebo intramuskulámí, nebo orální, nazální, pulmonámí nebo rektální cestou. Volba způsobu podání může eventuálně záviset na řadě faktorů a pro odborníka v daném oboru by neměl být problém zvolit v konkrétních případech nejvhodnější způsob aplikace.

Vynález rovněž poskytuje farmaceutické kompozice obsahující terapeuticky účinné množství nukleových kyselin podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným adjuvansem. Kompozice nukleových kyselin budou vhodné pro dopravu části oblasti kódující OPG nebo celé této oblasti do buněk a tkání jako část protismyslového nebo genového terapeutického režimu.

Způsob léčení

Kostní tkáň tvoří oporu těla a je tvořena minerálem (z velké části vápníkem a fosforem), matricí tvořenou kolagenovými a nekolagenovými proteiny, a buňkami. V kosti se nachází tři typy buněk, tj. osteocyty, osteoblasty a osteoklasty, které se podílí na dynamickém procesu, pomocí kterého se kost kontinuálně tvoří a resorbuje. Osteoblasty podporují tvorbu kostní tkáně, zatímco osteoklasty jsou spojovány s resorpcí. Resorpce, neboli rozpouštění kostní matrice a minerálu, je rychlý a efektivní proces ve srovnání s tvorbou kosti a může z kosti uvolňovat velké množství minerálů. Osteoklasty se podílí na regulaci normálního přetváření kosterní tkáně a resorpci, indukované hormony. Resorpce je například stimulována sekrecí parathyroidového hormonu v odpovědi na zvýšení koncentrace vápníkových iontů v extracelulámích tekutinách. Na druhé straně, inhibice resorpce je základní funkcí kalcitoninu. Kromě toho metabolity vitaminu D ovlivňují citlivost kosti na parathyroidový hormon a kalcitonin.

Po dozrání skeletu množství kosti v kostře odráží rovnováhu (nebo nerovnováhu) tvorby kosti a resorpce kosti. Maxima kostní dřeň dosahuje po dozrání kostry, před čtvrtou dekádou. Mezi

-15CZ 292587 B6 čtvrtou a pátou dekádou se rovnováha posouvá a dominuje kostní resorpce. Nevyhnutelné snížení kostní hmoty, k němuž dochází s rostoucím věkem, se projevuje dříve u žen než u mužů a u některých žen dochází k jejímu podstatnému zrychlení po menopauze (zejména u Evropanek a Asiatek).

Osteopenie je chorobným stavem obecně se týkajícím jakéhokoliv snížení kostní hmoty pod normální úroveň. Tento chorobný stav může vznikat v důsledku zpomalení syntézy kosti nebo urychlení destrukce kosti, nebo obojího. Nejběžnější formou osteopenie je primární osteoporóza, která je rovněž označována jako postmenopauzální a senilní osteoporóza. Tato forma osteoporózy je stav projevující se celkovou ztrátou kostní hmoty, ke které dochází s rostoucím věkem a vzniká zpravidla v důsledku zvýšení resorpce kostní hmoty při normální rychlosti tvorby kostní hmoty. Přibližně u 25 až 30 % všech bělošek ve Spojených státech amerických se vyvinula symptomatická osteoporóza. Rovněž byl zjištěn přímý vztah mezi osteoporózou a výskytem fraktury kyčelní kosti, stehenní kosti, fraktury krčku a intertrochanterické fraktury u žen, starších 45 let. U mužů se symptomatická osteoporóza vyvíjí mezi 50. až 70. rokem věku, nicméně bylo zjištěno, že tato choroba postihuje převážně ženy.

Příčina postmenopauzální a senilní osteoporózy není známa. Bylo identifikováno několik faktorů, které se podílí na vývoji tohoto chorobného stavu. Mezi těmito faktory lze například zmínit změnu hladiny hormonů, která doprovází stárnutí a neadekvátní spotřebu vápníku, která se podílí na snížení intestinální absorpce vápníku a dalších minerálů. Léčení zpravidla zahrnuje hormonální terapii nebo podávání dietetických doplňků, které mají zpomalit tento proces. Nicméně do současné doby nebyl nalezen efektivní způsob léčení řídnutí kosti.

Vynález poskytuje způsob léčení kostních onemocnění, jehož podstata spočívá v podání terapeuticky účinného množství OPG. Kostním onemocněním může být libovolné onemocnění charakteristické celkovou ztrátou kostní hmoty (osteopenie nebo osteolýza). Léčení pomocí OPG se zpravidla nasadí v případě, kdy je třeba potlačit resorpci kosti. Léčením lze tedy redukovat resorpci kosti, pokud tato resorpce převyšuje normální stav, nebo lze tímto způsobem léčení snížit resorpci pod normální hodnotu a kompenzovat tak nižší úroveň tvorby kostní hmoty.

Chorobné stavy, které lze léčit pomocí OPG jsou následující:

osteoporóza, například primární osteoporóza, endokrinní osteoporóza (hyperthyroidismus, hyperparathryoidismus, Cushingova nemoc a akromegalie), dědičné a vrozené formy osteoporózy (vrozená lomivost kostí, homocystinurie, Menkesův syndrom a Riley-Dayův syndrom) a osteoporóza, způsobená imobilizací končetin;

Pagetovo onemocnění kosti (deformující zánět kostí) u dospělých a adolescentů;

osteomyelitida nebo infekční léze v kosti, vedoucí ke ztrátě kostní hmoty;

hyperkalcemie, která je výsledkem pevných nádorů (prsu, plic a ledvin) a hematologická zhoubná bujení (mnohotný myelom, lymfom a leukemie), idiopatická hyperkalcemie a hyperkalcemie spojovaná s hyperthryoidismem a onemocnění renálních funkcí;

pooperační osteopenie indukovaná podání steroidů a spojovaná s chorobami tenkého a tlustého střeva a chronickými hepatickými a renálními chorobami;

osteonekróza, neboli smrt kostních buněk, spojovaná s traumatickým úrazem nebo netraumatickou nekrózou, souvisící s Gaucherovou chorobou, srpkovitost, systemický lupus erythematosus a další chorobné stavy;

ztráta kostní hmoty způsobená kloubním revmatismem;

-16CZ 292587 B6 periodontální ztráta kostní hmoty;

osteolytická metastáze.

Je zřejmé, že OPG lze použít samotný nebo ve spojení s dalšími faktory při léčení kostních onemocnění. U jednoho provedení se použije osteoprotegerin ve spojení s terapeuticky účinným množstvím faktoru, který stimuluje tvorbu kostní hmoty. Tyto faktory zahrnují neomezujícím způsobem kostní morfogenní faktory označené BMP-1 až BMP-12, transformační růstový faktor-β (TGF-β) a členy TGF-β rodiny, interleukinové-1 inhibitory, TNFa inhibitory, parathyroidový hormon a jeho analogy, protein odvozený od parathyroidu a jeho analogy, E série prostaglandinů, bisfosfonáty (například alendronát a další) a kost-obohacující minerály, například fluorid a vápník.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Identifikace a izolace krysí OPG cDNA

Materiály a způsoby klonování a analýzy cDNA jsou popsány vManiatis a kol., tamtéž. Polymerázové řetězové reakce (PCR) se prováděly za použití termocykleru Perkin-Elmer 9600 a PCR reakční směsi (Boehringer-Mannheim) a koncentracích příměru specifikovaných výrobcem. Zpravidla se 25 až 50 μΐ reakční směsi denaturovalo při 94 °C, načež následovalo 20 až 40 cyklů, při kterých se směs ohřála na pět sekund na 94 °C, posléze ochladila na 5 sekund na 50 až 60 °C a opět ohřála na 3 až 5 minut na 72 °C. Po skončení zmíněných cyklů se směs ohřála na 3 až 5 minut na teplotu 72 °C. Potom se reakční směs analyzovala gelovou elektroforézou, jak popisuje Maniatis a kol., tamtéž.

Pro potřeby EST analýzy (Adams a kol., Science 252, 1651-1656 (1991)) se za použití mRNA izolované z zárodečného d20 střeva zkonstruovala cDNA knihovna. Zárodkům krys se při pitvě odebralo celé tenké a tlusté střevo a promylo se v PBS. Celá buněčná RNA se purifikovala kyselinovou guanidinium thiokyanát-fenol-chloroformovou extrakcí (Chomczynski a Sacchi, Anal. Biochem. 162, 156-159, (1987)). Póly (A+) mRNA frakce se získala z celkového RNA preparátu adsorpci na Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Corp) a elucí z Dynabeads Oligo (dT)25 (Dynal Corp) za použití výrobcem doporučených postupů. cDNA knihovna nahodilých primerů se připravila za použití systému „Superscript Plazmid Systém“ (Gibco BLR, Gaithersburg, Md). Nahodilý cDNA primer obsahující vnitřní restrikční místo, který se použil pro iniciaci syntézy prvního řetězce, měl následující sekvenci:

5'-AAAGGAAGGAAAAAAGCGGCCGCTACANNNNNNNNT-3' (SEQ ID NO: 1)

Not I

Pro syntézu prvního řetězce se připravily tři samostatné reakční směsi, které obsahovaly 2,5 pg poly(A) RNA a 120 ng, 360 ng nebo 1,080 ng nahodilého primeru. Po syntéze druhého řetězce se reakční produkty samostatně extrahovaly směsí fenolu, chloroformu a izoamylalkoholu (poměr 25:24:1), načež se vysrážel ethanol. Dvouřetězcová (ds) cDNA produkty tří reakčních směsí se sloučily a ligovaly na následující ds oligonukleotidový adaptér:

-17CZ 292587 B6

5'-TCGACCCACGCGTCCG-3' (SEQ ID NO: 2)

3'-GGGTGCGCAGGCp-5' (SEQ ID NO: 3)

Po ligaci se cDNA kompletně digerovala pomocí Not I, extrahovala směsí fenolu, chloroformu aizoamylu (poměr 25:24:1) za vysrážení alkoholu a ethanolu. Resuspendovaná cDNA se následně frakcionalizovala podle velikosti gelovou filtrací za použití předem připravených sloupců opatřených předepsaným plazmidovým systémem (Superscript Plazmid Systém) (Gibco BLR, Gaithersburg, Md) způsobem doporučeným výrobcem.

Byly odebrány dvě frakce obsahující největší cDNA produkty, a po vysrážení ethanolu se přímo ligovaly do Notl a Sal I digerovaných pMOB vektorem DNA (Strathmann a kol., 1991). Ligovaná cDNA se elektroporací zavedla do kompetentní ElectroMAX DH10B E. coli (Gibco BLR, Gaithersburg, MD). Pro účely automatické sekvenční analýzy se přibližně 10 000 transformantů umístilo do 20 cm x 20 cm agarových ploten obsahujících ampicilinem obohacené LB živné médium. Vzrostlé kolonie se sklidily a uspořádaly na 96jamkové mikrotitrové plotny obsahující 200 ml L-živné půdy, 7,5 % glycerol a 50 pg/ml ampicilinu. Kultury, které vzrostly přes noc při 37 °C a duplikační sada mikrotitrových ploten, které se připravily použitím sterilního 96kolíkového replikačního nástroje, se pro účely další analýzy uložily při -80 °C. Při klonování celodélkové cDNA se na 96 bakteriálních ampicilinových ploten, z nichž každá obsahovala přibližně 10 000 klonů, umístil přibližně jeden milion transformantů. Plazmidová DNA z každé jamky se samostatně izolovala za použití sady Qiagen Plazmid Maxi Kit (Qiagen Corp., Germany) a rozmístila se do 96mikrotitrových ploten pro účely PCR analýzy.

Pro sekvencování nahodilých fetálních krysích intestinálních cDNA klonů se glycerolové sady roztály a malé alikvótní podíly se naředily destilovanou vodou v poměru 1:25. Přibližně 3,0 μΐ naředěných bakteriálních kultur se přidaly do PCR reakční směsi (Boehringer-Mannheim), která obsahovala následující oligonukleotidy:

5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID NO: 4)

5'CAGGAAACAGCTATGACC-3' (SEQ ID NO: 5)

Reakční směs se inkubovaly v termocykleru (Perkin-Elmer 9600) za následujících cyklických podmínek: 94 °C po dobu 2 minut; 30 cyklů zahrnujících 5 sekund při 94 °C, 5 sekund při 50 °C a 3 minuty při 72 °C; a na závěr 4 minut při 72 °C. Po inkubaci v termocykleru se reakční směsi naředily 2,0 ml vody. Amplifikované DNA fragmenty se dále purifikovaly za použití sloupců Centricon (Princeton Separations) a postupů doporučených výrobcem. PCR reakční produkty se sekvenovaly na automatizovaném DNA sekvenceru Applied Biosystems 373A za použití reakcí T3 primeru (oligonukleotid 353-23; 5'-CAATTAACCCTCACTAAAGG-3') (SEQ ID NO: 6) Taq barvivo-terminátoru (Applied Biosystems) prováděných podle doporučení výrobce.

Výsledná 5' nukleotidová sekvence, získaná z nahodile sebraných cDNA klonů, se translatovala a následně porovnávala s existující databází známých proteinových sekvencí za použití modifikované verze programu FASTA (Pearson a kol., Meth. Enzymol. 183, (1990)). Translatované sekvence se rovněž analyzovaly z hlediska přítomnosti specifického, na cystein bohatého, proteinového motivu, nalezeného ve všech známých členech nadrodiny tumor nekrotizujícího faktorového receptoru (TNFR) (Smith a kol., Cell 76,959-962 (1994)) za použití sekvenční profilové metody Gribskova a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83, 4355^4359 (1987)), modifikované Leuthem a kol. (Protein Science 3,139-146 (1994)).

Za použití dat získaných analýzou FASTA a Profilové analýzy se jako možný nový člen TNFR nadrodiny identifikoval EST, FRI-1 (fetální krysí intestin-1). FRI-1 obsahoval přibližně 600bp

-18CZ 292587 B6 inzert s LORF přibližně 150 aminokyselin. Nejblíže odpovídajícím TNFR byl v databázi humánní typ II TNFR (TNFR-2). Porovnávaná oblast v rozsahu této přibližně 150 ak LORF vykazovala přibližně 43% homologii mezi TNFR-2 a FRI-1. Profilová analýza, využívající první a druhou cysteinem obohacenou repetici TNFR nadrodiny, poskytla Z skoré přibližně 8, což naznačuje, že FRI-1 gen možná kóduje nový člen rodiny. Za účelem zjištění dedukce struktury FRI-1 produktu se fetální krysí intestinální cDNA knihovna prohledávala s cílem určit celodélkové klony. Následující oligonukleotidy se odvodily z původní FRI-1 sekvence:

5'-GCATTATGACCCAGAAACCGGAC-3' (SEQ ID NO: 7)

5'-AGGTAGCGCCCTTCCTCACATTC-3' (SEQ ID NO: 8)

Tyto primery se použily v PCR reakcích při prohledávání 96 jamek plazmidové DNA, přičemž každá jamka obsahovala plazmidovou DNA z 10 000 nezávislých cDNA klonů. Přibližně 1 pg plazmidové jamkové DNA se amplifikoval v PCR reakční směsi (Boehringer-Mannheim) za použití Perkin-Elmerova 96jamkového termocykleru za následujících cyklických podmínek: 2 minuty při 94 °C, jeden cyklus; 15 sekund při 94 °C, následně 45 sekund při 65 °C, 30 cyklů; 7 minut při 65 °C, 1 cyklus. PCR reakční produkty se analyzovaly gelovou elektroforézou. 13 z 96 plazmidových DNA jamek dalo vzniknout amplifikovaným DNA produktům s očekávanou relativní molekulovou hmotností.

DNA z jedné pozitivní jamky se použila pro transformaci kompetentní ElectroMAX DH10B E. coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), která byla popsána výše. Přibližně 40 000 transformantů se umístilo na sterilní nitrocelulózová vlákna (BA-85, Schleicher a Schuell) a následně prohledávalo hybridizací kolonií za použití ³²p-dCTP značené verze PCR produktu, získaného výše. Filtry se předhybridizovaly 2 až 4 hodiny při 42 °C v 5X SSC, 50% deionizovaném formamidu, 5X Denhardtově roztoku, 0,5% SDS a 100pg/ml denaturované lososí semenné DNA. Filtry se následně hybridizovaly přibližně 18 hodin při 42 °C v 5X SSC, 50% deionizovaném formamidu, 2X Denhardtově roztoku, 0,1% SDS, 100 pg/ml denaturované lososí semenné DNA a přibližně 5 ng/ml značené sondy. Potom se filtry promývaly 10 minut při pokojové teplotě ve 2X SSC, 10 minut při 55 °C v IX SSC a konečně 10 až 15 minut při 55 °C v 0,5X SSC. Hybridizační klony se detekovaly následující autoradiografií a následně se přemístily na nitrocelulózové filtry pro účely druhého prohledávání. Po druhém prohledávání se izoloval plazmidový klon (pBl.l), který se následně amplifikoval v L-růstovém médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu za vzniku plazmidové DNA. Sekvencovaly se oba řetězce 2,4 kb pBl.l inzertu.

Pro detekci libovolné existující sekvence, která by odpovídala a/nebo vykazovala určitý stupeň podobnosti se použila FASTA analýza veřejné databáze, ke které se použila pBl.l inzerční sekvence. Zjistilo se, že žádná sekvence neodpovídá žádnému známému genu nebo EST, nicméně se ukázala přibližně 45% podobnost s humánním a myším TNFR-2 genem. Methioninový výchozí kodon se nacházel na bp 124 nukleotidové sekvence, za ním následoval LORF kódující 401 ak zbytky, která končí na bp 1327. Dá se předpokládat, že 401 ak zbytkový produkt má hydrofobní signálový peptid, tvořený přibližně 31 zbytky na svém N-konci a 4 potenciální místa N-vázané glykosylace. Pomocí programu PepPlot nebyla identifikována žádná hydrofobní sekvence, která by překrývala transmembránu (Wisconsin GCG package, verze 8.1). Předpokládaná 401 ak sekvence se následně použila pro průzkum proteinové databáze. Opět nebyly zjištěny žádné existující odpovídající sekvence, i když se ukázalo, že je zde silná podobnost s mnoha členy TNFR nadrodiny, nejznatelnější s humánním a myším TNFR-2. Sekvenční vyrovnání tohoto nového proteinu se známými členy TNFR nadrodiny se připravilo za použití programu Pileup a následně se modifikovalo pomocí programu PrettyPlot (Wisconsin GCG package, verze 8.1). Toto vyrovnání ukazuje čistou homologii mezi dlouhým FRI-1 genovým produktem a všemi dalšími členy TNFR rodiny. Homologická oblast mapuje extracelulámí doménu členů TNFR rodiny a odpovídá třem nebo čtyřem repeticím bohatým na cystein, které se nachází v ligandu vážícím doménu těchto proteinů. Z toho vyplývá, že FRI-1

-19CZ 292587 B6 gen kóduje nový člen TNFR rodiny. Protože nebyla zjištěna žádná transmembránová oblast, předpokládá se, že se může jednat o sekretovaný receptor podobný rozpustným receptorům odvozeným od TNFR-1 (Kohno a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8331-8335 (1990)). Díky zřejmé biologické aktivitě FRI-1 genu (viz výše) byl produkt označen jako osteoprotegerin 5 (OPG).

Příklad 2

Expresní vzory OPG mRNA ve tkáních

Za účelem určení velikosti humánního transkriptu a vzorů exprese se mnohočetné northemové bloty lidské tkáně (Clonetech) sondovaly pomocí ³²p-dCTP značeného FRI-1 PCR produktu. Northemové bloty se 2 až 4 hodiny předhybridizovaly při teplotě 42 °C v 5X SSPE, 50% 15 formamidu, 5X Denhardtově roztoku, 0,5% SDS a 100pg/ml denaturované lososí semenné

DNA. Bloty se následně hybridizovaly 18 až 24 hodin při teplotě 42 °C v 5X SSPE, 50% formamidu, 2X Denhardtově roztoku, 0,1% SDS a 100 pg/ml denaturované lososí semenné DNA a 5 ng/ml značené sondy. Bloty se potom deset minut promývaly při pokojové teplotě v 2X SSC, deset minut při 50 °Č IX SSC a následně 10 až 15 minut v 0,5X SSC.

Použitím sondy odvozené z kry sího genu se v několika tkáních detekovaly převládající mRNA druhy s relativní molekulovou hmotností 2,4 kb. Těmito tkáněmi byly ledviny, játra, placenta a srdce. Nejvyšší hladiny byly detekovány v ledvinách. Velké mRNA druhy 4,5 a 7,5 kb byly detekovány v kosterním svalu a slinivce. Bylo zjištěno, že v lidské fetální tkáni, ledvinách, 25 dochází k exprimaci relativně vy sokých hladin 2,4 kb mRNA. Pomocí humánní sondy (viz níže) byl zjištěn ve stejných tkáních pouze 2,4 kb transkript. Relativně vysoké hladiny 2,4 kb transkriptu bylo zjištěno rovněž v lymfatických uzlinách, brzlíku, slezině a slepém střevě. Velikost transkriptu, určená jak pomocí krysího, tak pomocí humánního osteoprotegerinového genu, je většinou identická s délkou krysího pBl.l FRI-1 inzertu, z čehož vyplývá, že 30 představuje celodélkový cDNA klon.

Příklad 3

Systemická doprava OPG v transgenické myši

Krysí OPG klon pBl.l se použil jako matrice pro PCR amplifikaci kódovací oblasti pro subklonování do ApoE-jatemího specifického expresního vektoru (Simonet a kol., J. Clin. Invest. 94, 1310-1319 (1994) a PCR přihláška WO 95/11308. Následující 5' a 3' oligonukleoti40 dové primery se použily pro PCR amplifikaci:

5' -GACTAGTCCCACAATGAACAAGTGGCTGTG-3' (SEQ ID NO: 9)

5' -ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATGAAACAGCCCAGTGACCATTC~3' (SEQ ID NO: 10)

PCR reakční směs (Boehringer-Mannheim) se ošetřila následujícím způsobem: 1 minutu při 94 °C, 1 cyklus; 20 sekund při 94 °C, 30 sekund při 62 °C a 1 minutu při 74 °C, 25 cyklů. Po amplifikaci se vzorky čistily na Qiagen PCR sloupcích a digerovaly přes noc pomocí Spěl a Notl 45 restrikčních enzymů. Digerované produkty se extrahovaly, vysrážely a subklonovaly do ApoE promotorového expresního vektoru. Před mikroinjektáží výsledného klonu, HE-OPG, se tento klon sekvencoval, čímž se zajistila absence mutací.

-20CZ 292587 B6

HE-OPG plazmid se purifikoval dvěma cykly CsCl hustotně gradientního odstřeďování. Purifikovaná plazmidová DNA se digerovala pomocí Xhol a Ase I, a 3,6 kb transgenní inzert se purifikoval gelovou elektroforézou. Purifikovaný fragment se naředil, čímž se vytvořil zásobní injekční roztok 1 pg/ml v 5 mM Tris, pH 7,4, 0,2 mM EDTA. Jednobuněčná embrya zBDFl x BDF1-vypěstovaných myší se injektovaly v podstatě způsobem, který popsal Brinster a kol. v Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82.4338 (1985)) s tou výjimkou, že injekční jehly se před použitím seřízly a silikonizovaly. Embrya se pěstovala přes noc v CO₂ inkubátoru a 15 až 20 dvoubuněčných embryí se přeneslo do vejcovodů pseudogravidních CD1 myších samiček.

Po určení těhotenství bylo z implantace mikroinjektovaných embryí získáno 49 potomků. Potomci se prohledávali PCR amplifikací integrovaného transgenu v genomových DNA vzorcích. Cílenou oblast pro amplifikací tvořila 369 bp oblast humánního Apo E intronu, která je součástí expresního vektoru. Oligomemími proteiny použitými pro PCR amplifikací byly:

5'-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3' (SEQ ID NO: 11)

5'-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3' (SEQ ID NO: 12)

Pro PCR se použily následující podmínky: dvě minuty při 94 °C, 1 cyklus; jednu minutu při 94 °C, 20 sekund při 63 °C a 30 sekund při 72 °C, 30 cyklů. Z původních 49 potomků bylo jako PCR pozitivně transgenických identifikováno 9.

Pět transgenických osmi- až desetidenních jedinců (2, 11, 16, 17a 28) a pět kontrolních jedinců (1, 12, 15, 18 a 30) se usmrtilo a provedla se jejich pitva a patologická analýza. Ze zbývajících čtyř transgenických jedinců se játra izolovala parciální hepatektomií. Při parciální hepatektomii se myši znecitlivěly a jatemí lalok se vyjmul chirurgickým způsobem. Z jater všech transgenických mláďat a pěti negativních kontrolních mláďat se izolovala celková celulámí RNA způsobem, který popsal McDonald a kol. v Meth. Enzymol. 152. 219 (1987). Na těchto vzorcích se provedla analýza northemových blotů, která se zaměřovala na určení hladiny transgenní exprese. Přibližně 10 pg celkové RNA z jater každého zvířete, které se rozpustily pomocí elektroforézových denaturačních gelů (Ogden a kol., Meth. Enzymol 152, 61 (1987)), se následně přenesly na HYBOND-N nylonovou membránu (Amersham) a sondovaly pomocí ²p dCTP-značené pBl.l inzerční DNA. Hybridizace se prováděla přes noc při 42 °C v 50% formamidu, 5 x SSPE, 0,5% SDS, 5 x Denhardtově roztoku, 100 pg/ml denaturované lososí semenné DNA a 2-4 x 10⁶ cpm značené sondy/ml hybridizačního pufru. Po ukončení hybridizace se bloty promývaly dvakrát pět minut při pokojové teplotě v 2 x SSC a následně stejnou dobu v 0,1% SDS a potom dvakrát 5 až 10 minut při 55 °C v 0,1 xSSC a 0,1% SDS. Exprese transgenu v testovaných a kontrolních mláďatech se stanovila následující autoradiografií.

Data northemového blotu naznačují, že 7 z transgenických jedinců exprimuje detekovatelné hladiny transgenní mRNA (zvíře č. 2, 11, 16, 17, 22, 33 a 45). Negativní kontrolní myši a jedna z transgenických myší (č. 28) neexprimovaly žádnou s transgenem příbuznou mRNA. Vzhledem k tomu, že se dá předpokládat, že OPG je sekretovaný protein, přeexprimování transgenní mRNA by mělo zastupovat hladinu systemicky dopraveného genového produktu. Myši 2, 17 a 22, které byly pozitivní na PCR a northemový blot exprimovaly vysoké hladiny transgenní mRNA a mohly větší měrou biologicky ovlivňovat hostitelské buňky a tkáně.

-21 CZ 292587 B6

Příklad 4

Biologická aktivita OPG

Pět z transgenických myší (zvířata 2, 11, 16, 17 a 28) a 5 kontrolních mláďat (zvířata 1, 12, 15, 18 a 30) bylo utraceno pro účely pitvy a patologické analýzy. Před provedením eutanázie se ověřila správnost identifikačních čísel všech zvířat, zvířata se zvážila, znecitlivěla a odebrala se jim krev. Krev se uložila jak ve formě krevního séra, tak ve formě kompletní krve pro kompletní chemické a hematologické vyšetření. Bezprostředně po ukončení anestezie letální CO₂ inhalací ío a ještě před oddělením velkých celků se provedla radiografie. Potom se odstranily tkáně a fixovaly v 10% pufrovaném Zn-formalinu pro účely histologického výzkumu. Shromážděné tkáně zahrnovaly játra, slezinu, slinivku, žaludek, dvanáctemík, kyčelník, střevo, slezinu, reprodukční orgány, kůži a prsní žlázy, kost, mozek, srdce, plíce, brzlík, průdušnici, štítnou žlázu, lačník, konečník, nadledviny, močový měchýř a kosterní sval. Před fixací se stanovila hmotnost 15 jater, žaludku, ledvin, nadledvin, sleziny a brzlíku. Po fixaci se tkáně zpracovaly do parafinových bloků a získaly se 3 pm řezy. Kostní tkáň se dekalcifikovala pomocí roztoku kyseliny mravenčí a všechny řezy se obarvily hematoxylinem a eosinem. U některých tkání se rovněž provedlo zabarvení Gomoriho retikulinem a Massonovým trichromem. Pro stanovení exprese vinanově rezistentní kyselinové fosfatázy (TRAP), tj. enzymu vysoce exprimovaného mnohojademými 20 buňkami monocyto-makrofágového původu, které resorbují kostní hmotu, tak zvanými osteoklasty, se použila enzymatická histochemie. Pro detekci replikujících buněk, resp. buněk monocyto-makrofágového původu se rovněž použila imunohistochemie monocyto-makrofágového povrchu BrdU a F480 antigenu. Pro detekci exprese F480 povrchového antigenu se formalinem fixované, parafínem zapouzdřené 4 pm řezy deparafinovaly a hydratovaly 25 deionizovanou vodou. Řezy se ochladily 3% peroxidem vodíku, blokovaly pomocí produktu Protein Block (Lisphaw, Pittsburgh, PA) a inkubovaly v krysí monoklonální anti-myší F480 protilátce (Harlan, Indianopolis, IN). Tato protilátka se detekovala pomocí biotinylem značených králičích anti-krysích imunoglobulinů, peroxidázou konjugovaného strepavidinu (BioGenex San Ramon, CA) s DAB jako chromagenem (BioTek, Santa Barbara, CA). Řezy se obarvily 30 kontrastní barvou, hematoxylinem.

Oddělení velkých celků a ohledání viscerálních tkání, neobjevilo u transgenických expresorů nebo kontrolních mláďat žádné abnormality. Analýza hmotnosti orgánů naznačila, že u transgenických myší došlo přibližně k 38% zvětšení sleziny v porovnání s kontrolními jedinci. U 35 transgenických expresorů došlo rovněž k mírnému zvětšení velikosti krevních destiček a cirkulujících nezbarvených buněk. U transgenických receptorů bylo dále zjištěno podstatné snížení hladin krevních destiček. Kromě toho byla u transgenických receptorů zjištěna tendence snižovat hladinu kyseliny močové v séru, hladinu dusíku v moči a hladinu alkalinfosfatázy. Zjistilo se, že kostry expresorů včetně dlouhých kostí (kostí stehenních), obratlů a plochých kostí 40 (pánevní kosti) vykazují zvýšenou radiohustotu. Relativní velikost stehenních kostí u expresorů se nelišila od velikosti kontrolních myší.

Histologická analýza zabarvených řezů kosti OPG expresorů ukázala vážnou osteopetrózu s přítomností chrupavkových zbytků primární spongiózy patrné v kostní trabekule, ve střední 45 části stehenní kosti. Jasně vymezená kůra nebyla v řezech stehenní kosti identifikovatelná.

U normálních zvířat je středová část kosti vyplněna kostní dření. Řezy obratle rovněž ukazují osteopetrotické změny, z čehož vyplývá, že kosterní změny indukované OPG byly systemické. Zbývající kostní dřeň vykazovala převážně myeloidní prvky. Přítomny byly rovněž megakaryocyty. Retikulinové skvrny neukazovaly na ukládání retikulinu. Imunohistochemie pro 50 F480 buněčný povrchový antigen, exprimovaný buňkami monocyto-makrofágové derivace u myši, ukazovala na přítomnost F480 pozitivních buněk v dřeňových prostorách. Přímo vedle trámčitých kostních povrchů je možné vidět zploštěné F480 pozitivní buňky.

Mesenchymální buňky, vážící stehenní kost, byly zploštěné a jevily se jako inaktivní. 55 Z rozmístění H&E a TRAP skvrn se zjistilo, že u OPG expresorů se osteoklasty nachází na

-22CZ 292587 B6 površích stehenní kosti pouze zřídka. Osteoklasty a/nebo chondroklasty se nacházely spíše v oblasti chrupavky resorbující růstové ploténky, ale jejich poct}· mohou být v porovnání s kontrolními jedinci nižší. Osteoklasty byly rovněž přítomny na kortikálním povrchu metafýzy, kde je zpravidla značná stavební aktivita. Hlavní rozdíl mezi expresory a kontrolními jedinci představovalo podstatné snížení trámčitých osteoklastů jak v obratlech, tak ve stehenních kostech. Rozsah kostní akumulace byl přímo úměrný hladině OPG transgenní mRNA, detekované northemovým přenosem celkové jatemí RNA.

U sleziny OPG expresorů bylo zjištěno zvýšené množství červené dřeně. Tato expanze je způsobena zvýšenou krvetvorbou. Zastoupeny jsou všechny krvetvorné linie. F480 pozitivní buňky byly přítomny v červené dřeni jak kontrolních jedinců, tak OPG expresorů. Dva z expresorů (2 a 17) měly ložiska extramedulámí krvetvorby v játrech, což je pravděpodobně důsledek osteopetrotické dřeně.

Pokud jde o brzlík, lymfatické uzliny, gastrointestinální trakt, pankreatohepatobiliámí trakt, dýchací trakt, reprodukční systém, močopohlavní systém, kůži, nen ový systém, srdce a aortu, prsa, kosterní sval a tuk, nebyly pozorovány žádné abnormalit}·.

Příklad 5

Izolace myší a humánní OPG cDNA

Z myší ledvinové cDNA knihovny (Clonetech) se PCR amplifikací izoloval cDNA klon odpovídající 5' konci myší OPG mRNA. Z krysí OPG cDNA sekvence se odvodily následující oligonukleotidy:

5' -ATCAAAGGCAGGGCATACTTCCTG-3 ·

5' -GTTGCACTCCTGTTTCACGGTCTG-3'

5' -CAAGACACCTTGAAGGGCCTGATG-3'

5' -TAACTTTTACAGAAGAGCATCAGC-3'

(SEQ	ID	NO:	13)
(SEQ	ID	NO:	14)
(SEQ	ID	NO:	15)
(SEQ	ID	NO:	16)

5'-AGCGCGGCCGCATGAACAAGTGGCTGTGCTGCG-3' (SEQ ID NO: 17)

5'-AGCTCTAGAGAAACAGCCCAGTGACCATTCC-3' {SEQ ID NO: 18)

Parciální a celodélkové cDNA produkty získané tímto postupem se sekvencovaly. Celodélkový produkt byl digerován Not I a Xba I a následně směrované nakloňován do plazmidového vektoru pRcCMV (Invitrogen). Výsledný plazmid byl označen jako pRcCMV-Mu-OPG. Nukleotidová sekvence klonovaného produktu se porovnala s krysí OPG cDNA sekvencí. V rozsahu 1300 bp úseku překrývajícího OPG LORF byly krysí a myší DNA sekvence přibližně z 88% identické. Myší cDNA sekvence obsahovala 401 ak LORF, což je srovnatelné se sekvencí krysího OPG proteinu, a ukázalo se, že je přibližně z 94% identická bez mezer. To ukazuje, že izolovaná myší cDNA sekvence kóduje myší OPG protein a že sekvence a struktura je po celou dobu evoluce do značné míry zachována. Myší OPG proteinová sekvence obsahuje na svém N-konci identický pravděpodobný signální peptid a všechna čtyři potenciální místa N-navázané glykosylace jsou zachována.

-23CZ 292587 B6

Parciální humánní OPG cDNA se klonovala z humánní ledvinové cDNA knihovny za použití následujících, pro krysu specifických, oligonukleotidů:

5'-GTG AAG CTG TGC AAG AAC CTG ATG-3' (SEQ ID NO: 19)

5'-ATC AAA GGC AGG GCA TAC TTC CTG-3' (SEQ ID NO: 20)

Tento PCR produkt se sekvencoval a použil pro sestavení primerů pro amplifikaci 3' konce humánní cDNA využívající humánní OPG genomový klon v lambdě jako matrici:

5'-TCCGTAAGAAACAGCCCAGTGACC-3' (SEQ ID NO: 29)

5' -CAGATCCTGAAGCTGCTCAGTTTG-3' (SEQ ID NO: 21)

Amplifikovaný PCR produkt se sekvencoval a společně se sekvencí 5' konce se použil pro navržení 5' a 3' humánně-specifických, primerů použitelných při amplifikaci celých humánních OPG cDNA kódovacích sekvencí:

5'-AGCGCGGCCGCGGGGACCACAATGAACAA3TTG-3' (SEQ ID NO: 22)

5'-AGCTCTAGAATTGTGAGGAAACAGCTCAATGGC-3' (SEQ ID NO: 23)

Celodélkový humánní PCR produkt se sekvencoval, potom přímo klonoval na plazmidový vektor pRcCMV (Invítrogen) pomocí Not I a Xba I. Výsledný plazmid byl označen jako pRcCMV-humánní OPG. Nukleotidová sekvence klonovaného produktu se porovnala s krysí a myší OPG cDNA sekvencí. V rozsahu 1300 bp úseku překrývajícím OPG LORF byly krysí a myší sekvence DNA přibližně ze 78 až 88 % identické s humánní OPG cDNA. Humánní OPG cDNA sekvence rovněž obsahovala 401 ak LORF, což bylo srovnatelné s krysí a myší proteinovou sekvencí. Předpokládaný humánní OPG protein byl přibližně z 85 %, resp. přibližně z 90 %, identický s krysím a myším proteinem. Seřazení sekvencí krysího, myšího a humánního proteinu ukázalo, že u nich během vývoje nedošlo k podstatnějším změnám. Předpokládá se, že humánní protein má N-koncový signální peptid a 5 potenciálních míst N-navázané glykosylace, z nichž 4 zůstaly mezi krysím a myším OPG proteinem zachovány.

DNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence myšího OPG jsou znázorněny na obrázcích 9A a 9B (SEQ ID NO: 122). DNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence humánního OPG jsou znázorněny na obrázcích 9C a 9D (SEQ ID NO: 124). Porovnání krysí, myší a humánní OPG aminokyselinové sekvence je znázorněno na obrázcích 9E až 9F.

Izolace dalších humánních OPG cDNA klonů odhalila přítomnost záměny báze C za G v poloze 103 DNA sekvence, znázorněné na obrázku 9C. Tato nukleotidová změna má za následek substituci lysinu asparáginem v poloze 3 aminokyselinové sekvence, znázorněné na obrázku 9C. Zbytek sekvence v klonech obsahujících tuto změnu byl identický s odpovídajícími úseky, znázorněnými na obrázcích 9C a 9D.

Příklad 6

Modelování OPG trojrozměrné struktury

N-koncová část OPG má homologii s extracelulámí částí všech známých členů TNFR nadrodiny (obrázek 1C). Nejvýznamnější motiv v tomto úseku TNFR-odvozených genů je přibližně 40aminokyselinová na cystein bohatá repetiční sekvence, která se balí do distinkčních struktur

-24CZ 292587 B6 (Banner a kol., Cell 73, 431—445 (1993)). Tento motiv se zpravidla zobrazil ve čtyřech (rozmezí 3 až 6) tandemových repeticích (viz obrázek 1C) a je známo, že je součástí ligandové vazby (Beutler a van Huffel Science 264, 667-663 (1994)). Každá repetice zpravidla obsahuje šest vzájemně odsazených cysteinových zbytků, které se podílí na tvorbě tří intradoménových disulfidových vazeb, označených jako SS1, SS2 a SS3 (Banner a kol., tamtéž). V některých receptorech, například TNFR2, CD30 a CD40, některé z repetičních domén obsahují pouze dvě intrařetězcové disulfídové vazby (SS1 až SS3).

Humánní OPG proteinová sekvence se seřadila s profilem TNFR1 extracelulámí domény za použití metod, které popsal Leuthy a kol., tamtéž, a výsledky se graficky znázornily pomocí programu PrettyPlot z Wisconsin Package, verze 8.1 (Genetics Computer Group, Madison, WI) (obrázek 10). Toto seřazení sekvencí se následně použilo pro sestrojení trojrozměrného (3-D) modelu humánní OPG N-koncové domény. Pro sestrojení se jako matrice použila známá 3-D struktura extracelulámí domény p55 TNFR1 (Banner a kol., tamtéž). Atomové koordináty peptidového hlavního řetězce a postranních řetězců identických zbytků se zkopírovaly z krystalických strukturních koordinát TNFR1. Potom se zbývající koordináty pro inzerce a různé postranní řetězce generovaly za použití programu LOOK (Molecular Applications Group, Palo Alto, CA). 3-D model se následně čistil minimalizováním své konformační energie pomocí programu LOOK.

Dá se předpokládat, že OPG se bude analogicky s dalšími členy TNFR rodiny vázat na ligand. Pro účely modelování interakce OPG se svým ligandem se ke stimulaci 3-D modelu „OPG ligandu“ použila krystalická struktura TNF-β. Tento údaj byl graficky znázorněn (viz obrázek 11) pomocí Molscriptu (Kraulis, J. Appl. Cryst. 24, 946-950,1991). Byl zkonstruován model pro OPG komplex OPG/ligand s 3 ΤΝΡβ a 3 OPG molekulami, ve kterém byly relativní polohy OPG identické s TNFR1 v krystalické struktuře. Tento model se následně použil pro nalezení zbytků OPG, které by mohly vzájemně reagovat se svým ligandem. Pro průzkum se zvolil následující přístup. Vypočetla se oblast všech zbytků v komplexu, která je přístupná rozpouštědlu a jeden OPG model. Zbytky, které měly jinou přístupnost v komplexu než v monomeru budou pravděpodobně reagovat s ligandem.

Humánní a myší OPG aminokyselinové sekvence se přeuspořádaly za použití této informace do nej významnějších sekvencí, z nichž každá obsahovala domény 1-4 bohaté na cystein (obr. 12A a 12B). Každá doména měla jedinečné strukturní vlastnosti, které lze předpokládat.

Doména 1

Obsahuje 4 cysteinové zbytky obsažené v SS2 (C41 až C54) a SS3 (C44 až C62) disulfídové vazby). Ačkoliv z disulfidových můstků není zřejmá žádná SS1 vazba, tyrosin zachovaný v poloze 28 je homologický sY20 vTNFRl, o němž se ví, že se podílí na interakci s H66 a napomáhá tak formování domény. OPG má v poloze 75 homologový histidin, z čehož vyplývá, že se OPG Y28 a H75 hromadí společně v nativním proteinu stejně jako to dělají homologické zbytky vTNFRl. Oba tyto zbytky mohou být tedy ve skutečnosti důležité pro biologickou aktivitu, a N-koncové OPG úpravy až k Y28 a za Y28 mohou aktivitu měnit. Na základě studie výše popsaného trojrozměrného modelu se dá předpokládat, že zbytky E34 a K43 vzájemně reagují s vazebným ligandem.

Doména 2

Obsahuje šest cysteinových zbytků a dá se předpokládat, že obsahuje SS1 (C65 až C80), SS2 (C83 až C98) a SS3 (C87 až Cl05) disulfídové vazby. Tento úsek OPG rovněž obsahuje úsek P66-Q91, který je seřazen s částí TNFR1 domény 2, která tvoří těsné kontakty s ΤΝΡβ (viz výše) a může vzájemně reagovat s OPG ligandem. Na základě získaných strukturních dat se předpokládá, že s vazebným ligandem vzájemně reagují zejména následující zbytky P66, H68, Y69, Y70, T71, D72, S73, H75, T76, S77, D78, E79, L81, Y82, P85, V86, K88, E89, L90 a Q91.

-25CZ 292587 B6

Doména 3

Obsahuje 4 cysteinové zbytky, které jsou součástí SS1 (C107 až Cl 18) a SS3 (C124 až C142) disulfidových vazeb, ale nikoliv vazby SS2. Na základě získaných strukturních dat lze předpokládat, že zbytky El 15, LI 18 a KI 19 vzájemně reagují s OPG ligandem.

Doména 4

Obsahuje 4 cysteinové zbytky, které jsou součástí SS1 (C145 až Cl60) a SS3 (Cl66 až Cl85) disulfidových vazeb ale nikoliv vazby SS2. Na základě získaných strukturních dat lze předpokládat, že zbytky El53 a S155 vzájemně reagují s OPG ligandem.

Předpokládaný strukturní model OPG tedy identifikoval celou řadu vysoce Zachovalých zbytků, které jsou pravděpodobně důležité pro jeho biologickou aktivitu.

Příklad 7

Produkt rekombinantního sekretovaného OPG proteinu v savčích buňkách

Aby se určilo, zdali je OPG skutečně sekretovaným proteinem, fúzovala se myší OPG cDNA na humánní IgGl Fc doménu tvořící značení (Capon a kol., Nátuře 337. 525-531 (1998)) a exprimovala se v humánních 293 fíbroblastech. Fc fůze se prováděly za použití vektoru pFc-A3. vektor pFc-A3 obsahuje úsek kódující Fc oblast humánního imunoglobulinového IgG-γΙ těžkého řetězce (Ellison a kol., tamtéž) z první aminokyseliny pantové domény (Glu-99) na karboxylový konec a je lemován 5'-NotI fúzním místem a 3'—Sáli a Xbal místy. Plazmid se konstruoval PCR amplifikací humánní slezinové cDNA knihovny (Clontech). PCR reakce se prováděly v konečném objemu 100 μΐ a využily 2 jednotky Vent DNA polymerázy (New England Biolabs) ve 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM KC1, 10 μΜ (NFL^SO^ 2 mM MgSCh, 0,1% Triton X-100 se 400 μΜ jednotlivých dNTP a 1 ng cDNA knihovny, která se měla amplifikovat společně s 1 μΜ každého primeru. Reakce se iniciovaly dvouminutovou denaturací při 95 °C, načež následovalo 30 cyklů, zahrnujících 30 sekund při 95 °C, třicet sekund při 55 °C a dvě minuty při 73 °C. 5' primer

5' ATAGCGGCCGCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC 3' (SEQ ID NO:24) zabudoval Notl místo bezprostředně za 5' na první zbytek (Glu-99) pantové domény IgG-γΙ. 3' primer

5' -TCTAGAGTCGACTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT-3' (SEQ ID NO:25) zabudoval Sáli a Xbal místa. 717-bp PCR produkt se digeroval Notl a Sáli, izoloval elektroforézou přes 1% agarózu (FMC Corp.), purifíkoval postupem Geneclean (BIO 101 lne.) a klonoval na Notl, Sall-digerovaný pBluescript II KS vektor (Stratagene). Inzert ve výsledném plazmidu, pFcA3, se sekvencoval s cílem potvrdit přesnost PCR reakce.

Klonovaná myší cDNA v plazmidu pRcCMV-MuOPG se amplifikovala za použití následujících dvou sad příměrových párů:

-26CZ 292587 B6

Pár 1

5'-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3' (SEQ ID NO: 26) ' -CCTCTGCGGCCGCTAAGCAGCTTATTTTCACGGATTGAACCTG-3' (SEQ ID NO:27)

Pár 2

5'-CCTCTGAGCTCAAGCTTCCGAGGACCACAATGAACAAG-3' (SEQ ID NO:28)

5'-CCTCTGCGGCCGCTGTTGCATTTCCTTTCTG-3' (SEQ ID NO:30)

První pár amplifikoval celou OPG LORF a vytvářel Notl restrikční místo, které bylo slučitelné sNot I místem vFc fúzním vektoru pFcA3. Vektor pFcA3 se připravil vytvořením Not I restrikčního místa 5' na zbytku kyseliny asparágové 216 humánní IgGl Fc cDNA. Tento konstrukt zavádí spojovník, který kóduje dvě irelevantní aminokyseliny, které překrývají spoj mezi OPG proteinem a IgG Fc úsekem. Tento produkt, pokud je navázán na Fc části, by mohl přímo kódovat všech 401 OPG zbytků a následně všech 227 aminokyselinových zbytků humánní IgGl Fc oblasti (Fl.Fc). Druhý příměrový pár amplifikuje DNA sekvence, kódující prvních 180 aminokyselinových zbytků OPG, které zahrnují svou pravděpodobnou ligandovou vazebnou doménu. Jak již bylo uvedeno výše, 3' primer tvoří umělé Not I restrikční místo, které váže C-koncový upravený OPG LORF v poloze threoninu 180 přímo na IgGl Fc doménu (CT.fc).

Spoj aminokyselinové sekvence vážící OPG zbytek 401 a zbytek aseptické kyseliny 221 humánní Fc oblasti může být modifikován následujícím způsobem: DNA, kódující zbytky 216-220 humánní Fc oblasti, lze výše popsaným způsobem deletovat, nebo lze cysteinový zbytek odpovídající C220 humánní Fc oblasti mutovat buď na serin nebo na alanin. OPG-Fc fůzní protein, kódovaný těmito modifikovanými vektory, může být transfektován do humánních 293 buněk nebo CHO buněk a rekombinantní OPG-Fc fůzní protein purifikován níže uvedeným způsobem.

Oba produkty se přímo klonovaly do plazmidového vektoru pCEP4 (Invitrogen). Vektor pCEP4 obsahuje zdroj replikace, kterým je virus Epsteina a Bárrové, a je schopen episomální replikace ve 293-EBNA-l buňkách. Rodičovské pCEP4, pCEP4-Fl.Fc a pCEP4-CT.Fc vektory byly lipofektovány do 293-EBNA-l buněk za použití metod doporučovaných výrobcem. Transfektované buňky se následně vybraly ve 100 pg/ml hygromycinu za účelem vybrání vektorové exprese a výsledné, vůči účinné látce rezistentní, hmotové kultury rostly až do okamžiku, kdy vytvořily celek. Buňky se následně pěstovaly 72 hodin v médiu prostém séra, načež se kondiciované médium odstranilo a analyzovalo SDS-PAGE. Stříbrné zabarvení polyakrylamidového gelu detekovalo hlavní proteiny kondiciovaného média produkovaného pro účinnou látku rezistentními 293 kulturami. VpCEP4-Fl.Fc a pCEP4-CT.Fc kondiciovaného média byly vydatně sekretovány jedinečné pásy předpokládaných velikostí (viz obrázky 13B a 13C). Celodélkový Fc fuzní protein se hromadil do vysoké koncentrace, z čehož vyplývá, že může být stabilní. Oba Fc fůzní proteiny byly detekovány anti-humánními IgGl Fc protilátkami (Pierce) na westernových blotech, což naznačuje, že tvořily rekombinantní OPG produkty.

Celodélkový OPG-Fc fuzní protein se purifikoval Protein-A sloupcovou chromatografíí za použití postupů doporučených výrobcem. Protein se vystavil analýze N-terminační sekvence, k níž se použila automatizovaná Edmannova degradace, kterou v podstatě popsal Matsudaira a kol. (J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). Po 19 cyklech byla odečtena následující aminokyselinová sekvence:

-27CZ 292587 B6

NH2-E TLPPKYLHYDPETGHQL L-02H (SEQ ID NO:31)

Tato sekvence je identická s předpokládanou myší OPG aminokyselinovou sekvenci počínaje aminokyselinovým zbytkem 22, z čehož vyplývá, že u savců se hlavní místo přirozeného štěpní nachází mezi aminokyselinovými zbytky Q21-E22 a nikoliv mezi Y31-D32, jak se původně 5 předpokládalo. Expresní experimenty prováděné v 293-EBNA buňkách pomocí pCEP4-Fl.Fc apCEP4-CT.Fc ukazují, že OPG je sekretovaný protein a může působit systémicky. pokud jde o navázání na svůj ligand.

Postupy, podobné postupům použitým při konstrukci a expresi muOPG[22-180]-Fc ío a muOPG[22-401]-Fc fůzí se použily i pro další myší a humánní OPG-Fc fúzní proteiny.

Myší OPG cDNA, kódující aminokyseliny 1-185 navázané na Fc úsek humánní IgGl [muOPG Ct(185).Fc], se konstruovala následujícím způsobem. Myší OPG cDNA zplazmidu pRcCMV Mu osteoprotegerinu (popsaná v příkladu 5) se amplifíkovala výše popsaným 15 způsobem za použití následujícího příměrového páru v polymerázové řetězové reakci:

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:32)

1333-80:

5'-CCT CTG CGG CCG CAC ACA CGT TGT CAT GTG TTG C-3' (SEQ ID NO:33)

Tento primerový pár amplifikuje myší OPG cDNA oblast, kódující aminokyselinové zbytky 63-185 (odpovídající bp 278-645) OPG čtecímu rámci, jak ukazuje obr. 9A. 3' primer obsahuje Not I restrikční místo, které je kompatibilní s ohraničeným Not I místem Fc fuzního vektoru 20 pFcA3. Produkt rovněž překrývá jedinečné EcoRI restrikční místo, lokalizované na bp 436.

Amplifikovaný PCR produkt se purifikoval, rozštěpit Notl a EcoRI a výsledný EcoRI-Notl restrikční fragment se purifikoval. Vektor pCEPP4, který měl myší 1-401 OPG-Fc fúzní inzert, se rozštěpil pomocí EcoRI a Notl, purifikoval a sekvenčně se seřadil s výše generovaným PCR produktem. Výsledný expresní vektor na bázi pCEP4 přímo kóduje OPG zbjtky 1-185 25 a následně 227 aminokyselinových zbytků humánního IgGl Fc úseku. Myší OPG l-185.Fc fúzní vektor se transfektoval do 293 buněk, zvolila se účinná látka a výše popsaným způsobem se připravilo kondiciované médium. Výsledný sekretovaný myší OPG l-185.Fc fúzní produkt se purifikoval Protein-A sloupcovou chromatografií (Pierce) za použití postupů doporučených výrobci.

Myší OPG DNA, kódující aminokyselinové zbytky 1-194, nakloňovaná do Fc úseku humánní IgGl (muOPG Ct(194).Fc), se konstruovala následujícím způsobem. Myší OPG cDNA zplazmidu pRcCMV Mu-osteoprotegerinu se amplifíkovala za použití následujících příměrových párů:

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:34)

1333-81:

5'-CCT CTG CGG CCG CCT TTT GCG TGG CTT CTC TGT T-3' (SEQ ID NO:35)

-28CZ 292587 B6

Tento příměrový pár amplifikuje myší OPG cDNA úsek, kódující aminokyselinové zbytky 70-194 (odpovídající bp 298-672) OPG čtecího rámce. 3' primer obsahuje Not I restrikční místo, které je kompatibilní s ohraničeným Not I místem Fc fúzního vektoru pFcA3. Produkt rovněž přesahuje jedinečné EcoRI restrikční místo, lokalizované na bp 436. Amplifikovaný PCR produkt se klonoval do výše popsaného myšího OPG[1-401] Fc fúzního vektoru. Výsledný expresní vektor na bázi pCEP4 přímo kóduje OPG zbytky 1 až 194 a následně 227 aminokyselinových zbytků humánního IgGl Fc úseku. Myší OPG l-194.Fc fúzní vektor se transfektoval do 293 buněk, zvolila se účinná látka a výše popsaným způsobem se připravilo kondiciované médium. Výsledný sekretovaný tužní produkt se purifikoval Protein-A sloupcovou chromatografií (Pierce) za použití postupů doporučených výrobci.

Humánní OPG DNA, kódující aminokyseliny 1—401, nakloňovaný do Fc úseku humánního IgGl se zkonstruovala následujícím způsobem. Humánní OPG DNA v plazmidů pRcCMV-hu osteoprotegerinu (popsaná v příkladu 5) se amplifikovala za použití následujících oligonukleotidových primerů:

1254-90:

5'-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3' (SEQ ID NO:36)

1254-95:

5' -CCT CTG CGG CCG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG AAT GG-3' (SEQ ID NO:37)

Výsledný PCR produkt kóduje celodélkový humánní OPG protein a tvoří Not I restrikční místo, které je slučitelné s ohraničeným Not I místem Fc fúzního vektoru FcA3. PCR produkt se přímo klonoval do výše popsaného plazmidového vektoru pCEP4. Výsledný expresní vektor přímo kóduje humánní OPG zbytky 1—401 a následně 227 aminokyselinové zbytky humánního IgGl Fc úseku. Z transfektovaných a pro účinnou látku vybraných buněk se připravilo kondiciované médium a huOPGFl.Fc fúzní produkt se purifikoval Protein-A sloupcovou chromatografií (Pierce) za použití postupů doporučovaných výrobci.

Humánní OPG DNA, kódující aminokyselinové zbytky 1 až 201, nakódovaná do Fc úseku humánní IgGl [huOPG Ct(201).Fc] se zkonstruovala následujícím způsobem. Humánní OPG cDNA, nakloňovaná z plazmidového pRcCMV-hu osteoprotegerinu, se amplifikovala PCR za použití následujícího oligonukleotidového příměrového páru:

1254-90:

5'-CCT CTG AGC TCA AGC TTG GTT TCC GGG GAC CAC AAT G-3' (SEQ ID NO:38)

1254-92:

5'-CCT CTG CGG CCG CCA GGG TAA CAT CTA TTC CAC-3' (SEQ ID NO:39)

Tento primerový pár amplifikuje humánní OPG cDNA úsek, kódující aminokyselinové zbytky 1-201 OPG čtecího rámce, a vytváří Not I restrikční místo na 3' konci, které je kompatibilní s ohraničeným Not I místem Fc íúzního vektoru FcA3. Tento produkt, pokud se naváže na Fc úsek, přímo kóduje OPG zbytky 1-201 a následně všech 221 aminokyselinových zbytků humánního IgGl Fc úseku. PCR produkt se výše popsaným způsobem směrově nakloňoval do

-29CZ 292587 B6 plazmidového vektoru pCEP4. Z transfektovaných a pro účinnou látku zvolených buněk se připravilo kondiciované médium a hu OPG Ct(201).Fc fúzní produkty se purifikovaly Protein-A sloupcovou chromatografií (Pierce) za použití postupů doporučených výrobci.

Pro konstrukci a expresi nekondenzovaného myšího a humánního OPG se použily následující postupy.

Plazmid pro savčí expresi celodélkového myšího OPG (zbytky 1 až 401) se generoval PCR amplifikaci myšího OPG cDNA inzertu zpRcCMV Mu-osteoprotegerinu a subklonoval do ίο expresního vektoru pDSRa (DeClerck a kol., J. Biol. Chem. 266. 3893 (1991)). Pro tyto účely se použily následující oligonukleotidové primery:

1295-26:

5'-CCG AAG CTT CCA CCA TGA ACA AGT GGC TGT GCT GC-3' (SEQ ID NO:40)

1295-27:

5'-CCT CTG TCG ACT ATT ATA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G-3' (SEQ ID NO:41)

Myší OPG celodélkový čtecí rámec se amplifikoval výše popsanou PCR. PCR produkt se 15 purifikoval a digeroval restrikční endonukleázou Hind III a Xba I (Boehringer Mannheim,

Indianapolis, IN) za výrobcem doporučených podmínek a potom se ligoval pomocí Hind III a Xba I na digerovaný pDSRa. Rekombinantní klony se detekovaly digerací restrikční endonukleázou a následně sekvencovaly, což mělo vyloučit vznik mutací během PCR amplifikačních kroků.

Výsledný plazmid, pDSRa-muOPG, se zavedl do (CHO) buněk vaječníků čínského křečka transfekcí mediovanou vápníkem (Wigler a kol., Cell 11, 233 (1977)). Jednotlivé kolonie se zvolily na základě exprese dihydrofolátreduktázového (DHFR) genu v plazmidovém vektoru a několik klonů se izolovalo. Exprese myšího OPG rekombinantního proteinu se monitorovala 25 westernovým přenosem kondiciovaného média CHO buněk. Vybraly se vysoce exprimující buňky a OPG exprese se dále amplifíkovala methotrexátem způsobem, který popsal DeClerck a kol., tamtéž. Kondiciované médium z CHO buněčných linií se připravilo i pro další purifikaci rekombinantního sekretovaného myšího OPG proteinu.

Plazmid pro savčí expresi celodélkového humánního OPG (aminokyseliny 1 až 401) se generoval subklonováním cDNA inzertu vpRcCMV-hu osteoprotegerinu přímo do vektoru pDSRa (DeClerck a kol., tamtéž). Plazmid pRcCMV-OPG se zcela digeroval Not I, s konci zarovnanými pomocí Klenowa a potom se zcela digeroval pomocí Xba I. Vektor DNA se digeroval pomocí Hind ΙΠ, s konci zarovnanými pomocí Klenowa, potom se digeroval pomocí Xba I a následně se 35 ligoval na OPG inzert. Rekombinantní plazmidy se potom sekvencovaly, aby se potvrdila správná orientace humánní OPG cDNA.

Výsledný plazmid pDSRa-huOPG se, jak již bylo uvedeno, zavedl do vaječníkových (CHO) buněk křečka. Jednotlivé kolonie se zvolily na základě exprese dihydrofolátreduktázového 40 (DHFR) genu v plazmidovém vektoru a několik klonů se izolovalo. Exprese humánního OPG rekombinantního proteinu se monitorovala westernovým přenosem kondiciovaného média CHO buněk. Vybraly se vysoce exprimující klony a OPG exprese se dále amplifíkovala methotrexátem. Pro proteinovou purifikaci se připravilo kondiciované médium z CHO buněčných linií, exprimujících humánní OPG.

-30CZ 292587 B6

Expresní vektory pro myší OPG, kódující zbytky 1 až 185, se konstruovaly následujícím způsobem. Myší OPG cDNA zpRcCMV-Mu OPG se amplifikovala pomocí následujících oligonukleotidových primerů:

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO: 42)

1356-12:

5'-CCT CTG TCG ACT TAA CAC ACG TTG TCA TGT GTT GC-3' (SEQ ID NO:43)

Tento příměrový pár amplifikuje myší OPG cDNA úsek kódující aminokyseliny 63 až 185 OPG čtecího rámce (bp 278-645) a obsahuje umělý koncový kodon přímo za cysteinovým kodonem (C 185), za kterým následuje umělé Sal I restrikční endonukleázové místo. Předpokládaný produkt obsahuje vnitřní Eco RI restrikční místo použitelné při subklonování do již existujícího vektoru. Po PCR amplifikaci se výsledný purifikovaný produkt rozštěpil pomocí Eco RI a Sal I restrikční endonukleázy a velký fragment se gelově purifikoval. Purifikovaný produkt se následně subklonuje do velkého restrikčního fragmentu Eco RI a Sal I výše popsaného digestu pBluescript-muOPG Fl.Fc. Výsledný plazmid se digeroval pomocí Hind III a Xho I a malý fragment se gelově purifikoval. Tento fragment, který obsahuje otevřený čtecí rámec, kódující zbytky 1 až 185, se následně subklonoval do Hind III a Xho I digestu expresního vektoru pCEP4. Výsledný vektor, pmuOPG [1 až 185], kóduje upravený OPG polypeptid, který terminuje na cysteinovém zbytku, lokalizovaném v poloze 185. Jak již bylo uvedeno, připravilo se kondiciované médium z transfektovaných a pro účinnou látku zvolených buněk.

1333-82:

5'-TCC CTT GCC CTG ACC ACT CTT-3' (SEQ ID NO:44)

1356-13:

5'-CCT CTG TCG ACT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TT-3' (SEQ ID NO:45)

Tento příměrový pár amplifikuje myší OPG cDNA úsek kódující aminokyseliny 70 až 194 OPG čtecího rámce (bp 298-672) a obsahuje umělý koncový kodon přímo za lysinovým kodonem (K194), za kterým následuje umělé místo Sal I restrikční endonukleázy. Předpokládaný produkt obsahuje Eco RI restrikční místo, použitelné při subklonování do již existujícího vektoru. Po PCR amplifikaci se výsledný purifikovaný produkt rozštěpil pomocí Eco RI a Sal 1 restrikční endonukleázy a velký fragment se gelově purifikoval. Purifikovaný produkt se následně subklonuje do velkého restrikčního fragmentu Eco RI a Sal I výše popsaného digestu pBluescript-muOPG Fl.Fc. Výsledný plazmid se digeroval pomocí Hind III a Xho I a malý fragment se gelově purifikoval. Tento fragment, který obsahuje otevřený čtecí rámec, kódující zbytky 1 až 185, se následně subklonoval do Hind III a Xho I digestu expresního vektoru pCEP4. Výsledný vektor, pmuOPG [1 až 185], kóduje upravený OPG polypeptid, který terminuje na cysteinovém zbytku, lokalizovaném v poloze 185. Jak již bylo uvedeno, připravilo se kondiciované médium z transfektovaných a pro účinnou látku zvolených buněk.

Několik mutací se generovalo na 5' konci huOPG [22-401 ]—Fc genu, který zavádí buď aminokyselinové substituce nebo delece OPG mezi zbytky 22 až 32. Všechny mutace se

-31 CZ 292587 B6 generovaly pomocí sady „QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit“ (Stratagene, San Diego, CA) za použití výrobcem doporučených podmínek. Stručně řečeno, reakční směs, obsahující huOPG [22—401]—Fc, plazmidová DNA matrice a mutagenové primery se ošetřily Pfu polymerázou v přítomnosti deoxynukleotidů a potom amplifikovaly výše popsaným způsobem 5 v termocykleru. Alikvotní podíl reakční směsi se následně tepelným šokem transfektoval do kompetentní E. coli XLl-modři a následně se provedlo ověření mutací. Plazmidová DNA z transformantů se následně sekvencovala na různé mutace.

Následující příměrové páry se použily pro deleci zbxtků 22 až 26 humánního OPG genu, která to měla za následek vznik huOPG [27-401 ]—Fc fúzního proteinu:

1436-11:

5'-TGG ACC ACC CAG AAG TAC CTT CAT TAT GAC-3' (SEQ ID NO:140)

1436-12:

5'-GTC ΑΤΆ ATG AAG GTA CTT CTG GGT GGT CCA-3' (SEQ ID NO:141)

Následující primerové páry se použily pro deleci zbjtků 22 až 28 humánního OPG genu, která měla za následek vznik huOPG [29-401]-Fu fuzního proteinu:

1436-17:

5'-GGA CCA CCC AGC TTC ATT ATG ACG AAG AAA-3' (SEQ ID NO:142)

1436-18:

5'-GTT TCT TCG TCA TAA TGA AGC TGG GTG GTC C-3' (SEQ ID NO:143)

Následující primerové páry se použily pro deleci zbytků 22 až 31 humánního OPG genu, která měla za následek vznik huOPG [32-401]-Fc fuzního proteinu:

1436-27:

5'-GTG GAC CAC CCA GGA CGA AGA AAC CTC TC-3' (SEQ ID NO:144)

1436-28:

5' -GAG AGG TTT CTT CGT CCT GGG TGG GGT TCC-3' (SEQ ID NO:145)

-32CZ 292587 B6

Následující primerové páry se použily pro změnu kodonu pro tyrosinový zbytek 28 na fenylalaninu humánního OPG genu, což mělo za následek produkci huOPG [22-401 ]—Fc Y28F fúzního proteinu:

1436-27:

5'-CGT TTC CTC CAA AGT TCC TTC ATT ATG AC-3' (SEQ ID NO:146)

1436-30:

5'-GTC ATA ATG AAG GAA CTT TC-G AGG AAA CG-3' (SEQ ID NO:147)

Následující primerové páry se použily pro změnu kodonu pro tyrosinový zbytek 26 na alaninu humánního OPG genu, což mělo za následek produkci huOPG [22-401]—Fc P26A fúzního proteinu:

1429-83:

5' -GGA ACC GTT TCC TC-C AAA GTA CCT TCA TTA TG-3 (SEQ ID NO:148)

1429-84:

5'-CAT AAT GAA GGT ACT TTG CAG GAA ACG TTT CC -3' (SEQ ID NO:149)

Každý výsledný muOPG [22—401]—Fc plazmid, obsahující příslušnou mutaci, se následně transfektoval do humánních 293 buněk a mutantní OPG-Fc fúzní protein se purifíkoval z výše zmíněného kondiciovaného média. Biologická aktivita každého proteinu se testovala in vitro testem tvorby osteoklastu, který je popsán v příkladu 11.

Příklad 8

Exprese OPG v E. coli

A. Bakteriální expresní vektory pAMG21

Expresní plazmidový pAMG21 může být odvozen z Amgenova expresního vektorového systému pCFM1656 (ATCC #69576), který může být zase odvozen z Amgenova expresního vektorového systému, popsaného v patentu US 4 710 473. Plazmid pCFM1656 může být odvozen z popsaného pCFM36 plazmidu (patent US 4 710 473): (a) zničením dvou endogenových Ndel restrikčních míst koncovým plněním T4 polymerázovým enzymem a následným upravením konce ligací; (b) replikací DNA sekvence mezi jedinečnými AatlI a Clal restrikčními místy obsahujícími syntetický P_L promotor s podobným fragmentem získaným z pCFM636 (patent US 4,710,473) obsahujícího PL promotor

-33CZ 292587 B6

AatlI

5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCAT AT3' TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA-AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA-jTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT-TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3' (SEQ ID NO:53)

-ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC5' (SEQ ID NO: 54)

Clal a následně (c) substitucí malé DNA sekvence mezi výjimečnými Clal a Kpn\ restrikčními místy následujícími oligonukleotidy:

5' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3' (SEQ ID NO:48)

3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' (SEQ ID NO:49)

Clal KpnI

Expresní plazmid může být následně odvozen zpCFM1656 připravením série místně směrovaných bazických změn PCR, vzájemným překryvem oligomutageneze a DNA sekvenčních substitucí. Počínaje BglII místem (plazmid bp# 180) bezprostředně za 5' k plazmidovému replikačnímu promotoru PcopB směrem k plazmidovým replikačním genům došlo k následujícím změnám bazických párů:

pAMG21 bp #bp v pCFM1656 bp v pAMG21 změněný na

#204	T/A	C/G
#428	A/T	G/C
#509	G/C	A/T
#617	—	dva inzerty G/C bp
#679	G/C	T/A
#980	T/A	C/G
#994	G/C	A/T
# 1004	A/T	C/G
# 1007	C/G	T/A
#1028	A/T	T/A
# 1047	C/G	T/A
#1178	G/C	T/A
# 1466	G/C	T/A
#2028	G/C	bp delece
#2187	C/G	T/A
#2480	A/T	T/A
# 2499-2502	AGTG	GTCA
	TCAC	CAGT
#2624	TCCGAGC AGGCTCG	7 bp delece
#3435	G/C	A/T
#3446	G/C	A/T
#3643	A/T	T/A

-34CZ 292587 B6

DNA sekvence mezi unikátními AatlI (pozice #4364 vpCFM1656) a SacII (pozice # 4585 v pCFM1656) restrikčních místech je substituována následujícím DNA sekvencí:

[AatlI kohezní konec] 5· GCGTAACGTATGCATGGTCTCC(pozice #4358 v pAMG21) ³* TGCA^GCATTGCATACGTACCAGAGG-CCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT-GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA-GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGC“CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCG-CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGC-GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG-CATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGT-GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGGCTACCGGAAAAACGCAAatlI -TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC-AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCATGAATTG-TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACTTTGGCAGC-AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG-GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGCGCTTAC-CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCACGCGAATG- ⁵

-35CZ 292587 B6

-TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTTTTCCTTCGCATGCCCACGCTAAAC-ATGTCGGATTATAAAAACTTTATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGCGATTTG-ATTCTTTTTCTCTTTTGGTTAAATCGTTGTTTGATTTATTATTTGCTATA7TTATTTTTC-TAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGCAACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAAAAAG-GATAATTATCAACTAGAGAAGGAACAATTAATGGTATGTTCATACACGCATGTAAAAATA-CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACATTTTTAT-AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT-TTGATAGATATATCAACAGAAAGAGACTTACACGTTTTGATTCGTAAGGCTTCGGTAATA-TAGCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACCTGATGATTTCGCTTCTTTAA-ATCGTCATACTTATCCCTTTGATTTGGGTCACTATTCTGGACTACTAAAGCGAAGAAATT-TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTG-aatgtaaacctctaaaaaataaatgtcgtaacaaaagtttatataaggttaattagccac-AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTCATCAT-TTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATTTAATCGCAGTAGTA-AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAG-TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTGGTATC-AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG-TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTC-ATAAGCATTGATTAATATCATTATTGCTTCTACAGGCTT7AATTTTATTAATTATTCTGT-TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATGTCCGAAATTAAAATAATTAATAAGACA-aagtgtcgtcggcatttatgtctttcatacccatctctttatccttacctattgtttgtc-TTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG-GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAA-CGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT-ATTGGATTTTTGTCACACTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTG-TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC-TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATT-ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA-CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGA-GATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTSacII

-GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAÁ-CGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGC7CCTAGGCGCCT xTCTT-GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATA-CTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTAT-'ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGG-TGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCC-MCCCCTCTTCACGCTCTTCACGC 3’ ^{ISaCl1 kohekní konecl ID NO:50}>

-TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5’ (pozice #5904 v pAMG21)(SEQ ID NO:46)

Během ligace kohezního konce této substituované DNA sekvence jsou zničeny vnější AatlI 5 a SacII místa. V substituované DNA existují jedinečná AatlI a SacII místa.

-36CZ 292587 B6 pAMG22-His

Expresní plazmid pAMG22-His lze odvodit z Amgenova expresního vektoru pAMG22 substitucí malé DNA sekvence mezi jedinečnými Ndel (#4795) a EcoRI (#4818) restrikčními místy následujícím oligonukleotidovým duplexem:

Ndel Nhel EcoRI ’ TATGAAACATCATCACCATCACCATCATGCTAGCGTTAACGCGTTGG 3 ’ (SEQ ID NO:51) ’ ACTTTGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACGATCGCAATTGCGCAACCTTAA 5 ’ (SEQ ID NO:52) MetLysHisHisHisHisHiaHisHisAlaSerValAsnAlaLeuGlu (SEQ ID NO:168) pAMG22

Expresní plazmid pAMG22 lze odvodit z Amgenova expresního vektoru pCFM1656 (ATCC #69576), který může být zase odvozen z Amgenova expresního vektorového systému popsaného v patentu US 4 710 473, uděleném 1. prosince 1987. Plazmid pCFM1656 může být odvozen z popsaného plazmidu pCFM836 (patent US 4 710 473): (a) zničením dvou endogenových Ndel restrikčních míst koncoxým plněním T4 polymerázovým enzymem a následným ztupením konce ligací; (b) replikací DNA sekvence mezi jedinečnými AatlI a Clal restrikčními místy obsahujícími syntetický P_L promotor s podobným fragmentem získaným zpCFM636 (patent US 4 710 473), který obsahuje PL promotor

AatlI ' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCAT AT3' TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA-AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA-TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT-TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3' (SEQ ID NO:53)

-ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC5' (SEQ ID NO: 54)

Clal a následně (c) substitucí malé DNA sekvence mezi výjimečnými Clal a Kpnl restrikčními místy následujícími oligonukleotidy:

5' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3' (SEQ ID NO:55)

3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5' (SEQ ID NO:56)

Clal Kpnl

-37CZ 292587 B6

Expresní plazmid pAMG22 může být následně odvozen zpCFM1656 připravením série místně směrovaných bazických změn PCR vzájemným překryvem oligomutageneze a DNA sekvenčních substitucí. Počínaje BglII místem (plazmid bp # 180) bezprostředně za 5' k plazmidovému replikačnímu promotoru PcopB směrem kplazmidovým replikačním genům, přičemž došlo 5 k následuj ícím změnám bazických párů:

pAMG22 bp #	bpvpCFM1656	bp v pAMG22 změněný na
= 204	T/A	C/G
= 428	A/T	G/C
= 509	G/C	A/T
= 617	—	dva inzerty G/C bp
= 679	G/C	T/A
= 980	T/A	C/G
= 994	G/C	A/T
= 1004	A/T	C/G
= 1007	C/G	T/A
= 1028	A/T	T/A
= 1047	C/G	T/A
= 1178	G/C	T/A
= 1466	G/C	T/A
= 2028	G/C	bp delece
= 2187	C/G	T/A
= 2480	A/T	T/A
= 2499-2502	AGTG TCAC	GTCA CAGT
= 2624	TCCGAGC AGGCTCG	7 bp delece
= 3435	G/C	A/T
= 3446	G/C	A/T
= 3643	A/T	T/A

-38CZ 292587 B6

DNA sekvence mezi unikátními AatlI (pozice #4364 vpCFM1656) a ShcII (pozice = 4585 v pCFM1656) restrikčních místech je substituována následující DNA sekvencí:

[AatlI kohezní konec](pozice #4358 v pAMG22)

5' GCGTAACGTATGCATGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAA3 ' TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGGGGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTT-ATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTG-TATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGACCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCAC-AACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGG-TTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCGGCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCC-CCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAG-GGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCGGTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTC-GCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAAG-CGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTAAatlI

-ACATTCAAATATGGACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTC-TGTAAGTTTATACCTGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAG—TTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGATTTGATTCTAGATTTGTT-AACTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGCTAAACTAAGATCTAAACTCA-TAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGAGCTCACTAGTGT-ATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTCGAGTGATCACASacII

-CGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAAGAAGAAGAAGAA-GCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTTCTTCTTCTTCTT-GAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACC-CTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTATTGATCGTATTGG-CCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACCGCTCTTCA-GGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCCTTGGCGAGAAGG-CGCTCTTCACGC 3' (SEQ ID NO:58)

-GCGAGAAGTG 5’ (SEQ ID NO:57) [SacII kohezní konec](pozice #5024 v pAMG22)

Během ligace kohezního konce této substituované DNA sekvence jsou zničeny vnější AatlI 5 a SacII místa. V substituované DNA existují jedinečné AatlI a SacII místa.

-39CZ 292587 B6

B. Humánní OPG Met [32-401 ]

V příkladu byi použitým expresním vektorem vektor pAMG21, derivát pCFM1656 (ATCC přírůstkové číslo 69576), který obsahoval vhodná restrikční místa pro inzerci genů za lux PR promotorem (popis lux expresního systému lze nalézt v patentu US 5 169318). Použitou hostitelskou buňkou byla GM120 (ATCC přírůstkové číslo 55764). Tento hostitel má lacIQ promotor a láci genb integrovaný ve druhém místě hostitelského chromozomu prototrofického E. coli K12 hostitele. Pro expresi jsou vhodné i další běžně používané E. coli expresní vektory a hostitelské buňky.

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 32-401 humánního OPG polypeptidu, se zavedla pod kontrolou luxPR promotoru do plazmidového expresního vektoru následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1257-20 a #1257-19 jako primery, se prováděla za použití matricového plazmidu pRcCMV-Hu OPG DNA, obsahující humánní OPG cDNA, a třiceticyklové termocyklizace tvořené třiceti cykly: přičemž každý cyklus zahrnoval 20 sekund při 94 °C, 30 sekund při 37 °C a nakonec 30 sekund při 72 °C. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se analyzoval, purifikoval a podrobil restrikci KpnI a BamHI restrikční endonukleázou a purifikoval. Syntetické oligonukleotidy #1257-21 a #1257-22 se jednotlivě fosforylovaly pomocí T4 polynukleotidové kinázy a ATP a následně se smísily, zahřály na 94 °C a nechaly ochladit na pokojovou teplotu za vzniku oligonukleotidového spojovníkového duplexu, který obsahoval Ndel a KpnI kohezní konce. Fosforylovaný spojovníkový duplex, tvořený mezi oligonukleotidy #1257-21 a #1257-22, obsahující Ndel a KpnI kohezní konce (viz obr. 14A) a KpnI a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt, generovaný za použití oligo-primerů #1257-20 a #1257-19 (viz výše) se přímo vřadila mezi dvě místa plazmidového vektoru pAMG21, konkrétně Ndel místo a BamHI místo, pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie (viz obr. 14A a níže uvedené sekvence). Syntetický spojovník použil E. coli kodony a poskytl N-koncový methionin.

Zvolily se dva klony, izolovala se plazmidová DNA a humánní OPG inzert se následně potvrdil DNA sekvencí. Výsledný pAMG21 plazmid, obsahující aminokyseliny 32-401 humánního OPG polypeptidu v rámci bezprostředně následující za methioninem, byl označen jako _PAMG21-huOPG met[32-401] nebo pAMG21-huOPG met[32-401]

Oligo#1257-19

5' -TACGCACTGGATCCTTATAAGCAGCTTATTTTTACTGATTGGAC-3 ¹ (SEQ ID NO:59)

Oligo#1257-20

5'“GTCCTCCTGGTACCTACCTAAAACAAC-3’ (SEQ ID NO: 60)

Oligo#1257-21 ’ -TATGGATGAAGAAACTTCTCATCAGCTGCTGTGTGATAAATGTCC

GCCGGGTAC -3' (SEQ ID NO:61)

01igo#1257-22 *-CCGGCGGACATTTATCACACAGCAGCTGATGAGAAGTTTCTTCATCCA-3 ’ (SEQ ID NO:47)

-40CZ 292587 B6

Kultury pAMG21-huOPG met[32^101] v E. coli GM120 v 2XYT médiu, obsahujícím 20 pg/ml kanamycinu, se před vřazením inkubovaly při 30 °C. Přidáním syntetického autoinduceru N-(3-oxohexanoyl)-DL-homoserinlaktonu do média kultury do konečné koncentrace 30 ng/ml se dosáhlo indukce huOPG met[32-401] genové produkční exprese z luxPR promotoru a kultury se inkubovaly buď při 30 °C nebo 37 °C po dalších 6 hodin. Po šesti hodinách se bakteriální kultury zkoumaly mikroskopicky, přičemž cílem tohoto mikroskopického průzkumu bylo zjistit přítomnost inkluzních těl, a následně peletovaly odstreďováním. Přítomnost lámavých inkluzních těl v indukovaných kulturách naznačovala, že část rekombinantního huOPG met[32-401] genového produktu se produkovala nerozpustně v E. coli. Některé bakteriální pelety se resuspendovaly v lOmM Tris-HCl/pH8, lmM EDTA a lyžovaly přímo přidáním 2X Laemlli vzorkového pufru na IX konečnou koncentraci a β-merkaptoethanolu do 5% konečného koncentrace a analyzovaly pomocí SDS-PAGE. Na SDS-PAGE gelu, obsahujícím celkové buněčné lyzáty kultur indukovaných při 30 °C a 37 °C. bylo možné pozorovat podstatně intenzivněji zabarvený pás (coomassie), přibližně 42 kDa, ve srovnání s linií 2, kterou je celkový buněčný lyzát kultury inkubované při 30 °C (obr. 14B). Délka očekávaného genového produktu by měla být 370 aminokyselin a očekávaná molekulová hmotnost přibližně 42,2 kDa. Po šestihodinové inkubaci při 37 °C se peletovala další kultura, která se dále zpracovala buď izolací inkluzních těl (viz níže) nebo mikrofluidizací. Peleta, zpracovaná mikrofluidizací, se resuspendovala v 25mM Tris-HCl/pH8, 0,5M NaCl pufru a dvacetkrát protáhla mikrofuidizerem Model 1108 (Microfluidics Corp.) a shromáždila. Z nashromážděného vzorku (mikrofluidizovaného celkového lyzátu) se odstranil alikvótní podíl a zbytek se peletoval dvacet minut při 20 000 x g. Vzniklý supematant se odstranil (mikrofluidizovaná rozpustná frakce) a peleta se resuspendovala ve 25mM Tris-HCl/pH8, 0,5M NaCl, 6M roztoku močoviny (mikrofluidizovaná nerozpustná frakce). Do alikvótního podílu celkové rozpustné nebo nerozpustné frakce se přidal Laemalliho vzorkový pufr do dvojnásobné konečné koncentrace a β-merkaptoethanol do 5% konečné koncentrace. Vzorky se následně analyzovaly pomocí SDS-PAGE. Zdá se, že se v nerozpustné frakci nachází podstatné množství rekombinantního huOPG met[32-401] genového produktu. Rekombinantní proteinová inkluzní těla se purifikovala následujícím způsobem. Bakteriální buňky se separovaly z média izopyknickou centrifugací v Beckmanově J-6B odstředivce opatřené JS-4.2 rotorem, která se prováděla patnáct minut při 4 900 x g a při 4 °C. Bakteriální peleta se resuspendovala v 5 ml vody a následně se vodou naředila na konečný objem 10 ml. Tato suspenze se přemístila do kalíšku z nerezavějící oceli, chlazeného v ledu, a podrobila sonifikačnímu rozrušení pomocí Bransonova sonifikátoru opatřeného standardním koncem (power setting=5, duty cycle=95%, 80 bursts). Sonifikovaná buněčná suspenze se odstřeďovala pět až deset minut v supercentrifúze Beckman Optima TLX, vybavené TLA 100.3 rotorem při 195 000 x g při 23 °C. Supematant se odstranil a peleta se propláchla proudem vody ze střičky. Pelety se shromáždily seškrábnutím pomocí mikrošpachtle a transfektovaly do skleněného homogenizéru (15 ml kapacita). Pět ml roztoku Percoll (75% kapalného Percollu, 0,15 M chloridu sodného) se přidalo do homogenizéru a obsahy se homogenizovaly dokud se nedosáhlo rovnoměrné suspenze. Objem se zvýšil přidáním roztoku Percoll na 19,5 ml, smísil a distribuoval do 3 Beckman Quick-Seal zkumavek (13 x 32 mm). Zkumavky se uzavřely podle instrukcí výrobce. Zkumavky se 30 minut odstřeďovaly v rotoru Beckan TLA 100.3 při 23 °C a 20 000 ot./min (21 600 x g). Zkumavky se 30 minut odstřeďovaly v rotoru Bečkám TLA 10.3 při 23 °C a 20 000 ot./min (21 600 x g). Zkumavky se analyzovaly z hlediska příslušného pásmového vzoru. Ke zjištění křehkých těl se izolovaly gradientní frakce a naředily vodou. Inkluzní těla se peletovala centrifugací a proteinová koncentrace se stanovila pomocí SDS-PAGE.

Alikvótní podíl inkluzních těl, izolovaný níže popsaným způsobem, se rozpustil v IX Laemlliově vzorkovém pufru s 5“P-merkaptoethanolem a rozpustil na SDS-PAGE gelu a izolovaná inkluzní těla poskytla vysoce purifikovaný rekombinantní huOPG[32-401] genový produkt. Hlavní ~42 kDa pás, pozorovaný po rozpuštění inkluzních těl na SDS-PAGE polyakrylamidovém gelu se excidoval ze separačního gelu a zjistilo se, že N-koncová aminokyselinová sekvence je v podstatě totožná se sekvencí, kterou popsal Matsudaira a kol., J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). Následující sekvence byla určena po 19 cyklech:

-41 CZ 292587 B6

ΝΉ₂ -MDEETSHQLLCDKCPPGTY-COOH (SEQ ID NO:62)

Zjistilo se, že tato sekvence je identická s prvními devatenácti aminokyselinami, kódovanými pAMG21 Hu-OPG met[32-401] expresním vektorem produkovaným methioninovým zbytkem, který poskytl bakteriální expresní vektor.

C. Humánní OPG met[22-401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 22 až 401 humánního OPG, se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru 10 pAMG21 následujícím způsobem. Izolovaná plazmidová DNA pAMG21-huOPG met[32-401] (viz část B) se rozštěpila pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy a výsledné fragmenty se rozpustily na agarózovém gelu. B. fragment (-1064 bp fragment) se izoloval z gelu za použití standardní metodologie. Syntetické oligonukleotidy #1267-06 a #1267-07 se jednotlivě fosforylovaly a nechaly vytvořit oligonukleotidový spojovníkový duplex, který obsahoval Ndel 15 a KpnI kohezní konce, za použití postupů v části B. Syntetický spojovník použil E. coli kodony a poskytl N-koncový methionin. Fosforylovaný spojovníkový duplex obsahující Ndel a KpnI kohezní konce, a izolovaný -1064 bp fragment pAMG21-huOP met[32-401], digerovaný pomocí Knpl a BamHI restrikční endonukleázy, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21.

Ligační směs se transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli elektroporací postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci huOPG-met[22—401]genu.

Oligo #1267-06

5'-TAT GGA AAC TTT TCC TCC AAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TTC TCA TCA GCT GCT GTG TGA ΤΑΆ ATG TCC GCC GGG TAC-3' (SEQ ID NO:63)

Oligo #1267-07

5’-CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAG AAG TTT CTT CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG GAA AAG TTT CCA-3’ (SEQ ID NO:64)

Kultury pAMG21-huOPG-met[22-401] vE. coli hostiteli 393 se umístily do 2XYT média obsahujícího 20 pg/ml kanamycinu a před indukcí se inkubovaly při 30 °C. Indukce exprese rekombinantního genového produktu z luxPR promotoru vektoru pAMG21 se dosáhlo přidáním syntetického autoinduceru, N-(3-oxohexanoyl)-DL-homoserinlaktonu, do kulturního média do konečné koncentrace 30 ng/ml a další šestihodinovou inkubací buď při 30 nebo 37 °C. Po šesti 30 hodinách se bakteriální kultury peletovaly centrifugací (=30 °C, 1+6 nebo 37 °C 1+6). Bakteriální kultury se rovněž peletovaly buď bezprostředně před indukcí (=30 °C, Přel) nebo se alternativně do separační kultury žádný inducer nepřidal a tato kultura se nechala inkubovat při 30 °C po dobu dalších šesti hodin a poskytla tak neindukovanou (UI) kulturu (=30 °C UI). Bakteriální pelety buď 30 °C Pře I, 30 °C UI, 30 °C 1+6 nebo 37 ° 1+6 kultur se resuspendovaly, lyžovaly a analy35 zovaly SDS-polyakrylamidogelovou elektroforézou (PAGE) za podmínek, popsaných v části B.

Polyakrylamidové gely se buď obarvily modří coomasie a/nebo westernovým přenosem převedly na nitrocelulózu a imunosondovaly králičí anti-mu OPG-Fc polyklonální protilátkou způsobem, popsaným v příkladu 10. Hladina genového produktu, vzniklého následkem indukce, se porovnala s neindukovaným (30 °C UI) nebo předem indukovaným (30 °C Přel) vzorkem.

-42CZ 292587 B6

D. Myší OPG met[22^401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 22 až 401 myšího (mu) OPG polypeptidů, se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1257-16 a #1257-15 jako primery, se prováděla za použití matricového plazmidů pRcCMVMu OPG DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR produkt se štěpil pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy způsobem popsaným v části B. Syntetické oligonukleotidy #1260-61 a #1260-82 se jednotlivě fosforylovaly a nechaly vytvořit oligonukleotidový spojovníkový duplex, který obsahovala Ndel a KpnI kohezní konce za použití postupů v části B. Syntetický spojovník použil E. coli kodony a poskytl N-koncový methionin. Fosforylovaný spojovníkový duplex, vytvořený oligonukleotidy #1260-61 a #1260-82, obsahující Ndel a KpnI kohezní konce a digerovaný pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy a purifíkovaný PCR produkt generovaný za použití oligonukleotidový ch primerů #1257-16 a #1257-15 se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporací transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci MuOPG-met[22-401]genu.

Exprese rekombinantního muOPG met [22-401] polypeptidů z kultur 393 buněk, které obsahovaly plazmid pAMG21-MuOPG met[22-401], která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1257-15

5’-TAC GCA CTG	GAT CCT TAT	AAG	CAG	CTT	ATT	TTC	ACG
GAT TGAAC-3' (SEQ	ID NO:65)
Oligo #1257-16 5’-GTG CTC CTG	GTA CCT ACC	TAA	AAC	AGC	ACT	GCA	CAG

TG-3’ (SEQ ID NO:66)

	Oligo #1260-61
	5'-TAT GGA AAC	TCT	GCC	TCC	AAA	ATA	CCT	GCA	TTA	CGA
TCC	GGA AAC TGG TCA	TCA	GCT	GCT	GTG	TGA	TAA	ATG	TGC	TCC
GGG	TAC-3’ (SEQ ID NO:67)
	Oligo #1260-82
	5'-CCG GAG CAC	ATT	TAT	CAC	ACA	GCA	GCT	GAT	GAC	CAG
TTT	CCG GAT CGT AAT	GCA	GGT	ATT	TTG	GAG	GCA	GAG	TTT	CCA-

3’ (SEQ ID NO:68)

E. Myší OPG met [3 2-401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 32 až 401 myšího OPG polypeptidů, se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Syntetické oligonukleotidy #1267-08

-43CZ 292587 B6 a #1267-09 se jednotlivě fosforylovaly a za použití postupů popsaných v části B nechaly vytvořit oligonukleotidový spojovníkový duplex. Syntetický spojovníkový duplex použil E. coli kodony a poskytl N-koncový methionin. Fosforylovaný spojovníkový duplex, vytvořený mezi oligonukleotidy #1267-08 a #1267-09, obsahující Ndel a KpnI kohezní konce a digerovaný pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy, a purifikovaný PCR produkt, popsaný již dříve (Část D), se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporací transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci MuOPG-met[32-401 Jgenu.

Exprese rekombinantního muOPG met [32^401] polypeptidů z kultur 393 buněk, které obsahovaly rekombinantní plazmid pAMG21 v důsledku indukce, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1267-08

5'-TAT GGA CCC AGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA

TAA ATG TGC TCC GGG TAC-3' (SEQ ID NO:69)

Oligo #1267-09

5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG

TTT CTG GGT CCA-3' (SEQ ID NO:70)

F. myší OPG met-lys[22-401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin následovaný lysinovým zbytkem a aminokyseliny 22 až 401 myšího OPG, se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Syntetické oligonukleotidy #1282-95 a #1282-96 se jednotlivě fosforylovaly a za použití postupů popsaných v části B nechaly vytvořit oligonukleotidový spojovníkový duplex. Syntetický spojovníkový duplex použil E. coli kodony a poskytl N-koncový methionin. Fosforylovaný spojovníkový duplex, vytvořený mezi oligonukleotidy #1282-95 a #1282-96, obsahující Ndel a KpnI kohezní konce a digerovaný pomocí KpnI a BamHI restrikční endonukleázy a purifikovaný PCR produkt, popsaný již dříve (část D), se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporací transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci MuOPG-Met-Lys[22—401 jgenu.

Exprese rekombinantního muOPG Met-Lys[32-401] polypeptidů z kultur 393 buněk, které obsahovaly rekombinantní plazmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

-44CZ 292587 B6

Oligo #1282-95

5' -TAT GAA AGA AAC TCT GCC TCC AAA ATA CCT GCA TTA

CGA TCC GGA AAC TGG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TGC

TCC GGG TAC-3’ (SEQ ID NO:71)

Oligo #1282-96

5’-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG

TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT

TCA-3’ (SEQ ID NO:72)

G. Myší OPG met-lys-(his)₇[22-401 ]

DNA sekvence, kódující N-koncové zbytky Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His (=MKH) následované aminokyselinami 22 až 401 myšího OPG, se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1300-50 a #1257-15 jako primery, se prováděla za použití matricového plazmidu pAMG21-muOPG-met[22—401] DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se excisoval, purifikoval, Štěpil pomocí Ndel a BamHI restrikční endonukleázy a purifikoval. Ndel a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt, generovaný za použití oligonukleotidových primerů #1300-50 a #1257-15, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporací transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencováni DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci MuOPG-MKH[22-401]genu.

Exprese rekombinantního muOPG MKH[22-401] polypeptidů z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly rekombinantní plazmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1300-50

5’-GTT CTC CTC ATA TGA AAC ATC ATC ACC ATC ACC ATC

ATG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC TGC ATT ACG AT-3’ (SEQ

ID NO:73)

Oligo #1257-15 (viz sekce D)

H. Myší OPG met-lys[22-401] (his)₇

DNA sekvence, kódující N-koncový met-lys, aminokyseliny 22 až 401 myšího OPG a sedm histaminových zbytků následujících aminokyselinu 401 (=muOPG MK[22-401]-H₇), se vřadila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1300-49 a #1257-51 jako primery, se prováděla za použití matricového plazmidu pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se excisoval, purifikoval, štěpil pomocí Ndel a BamHI restrikční

-45CZ 292587 B6 endonukleázy a purifikoval. Ndel a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt, generovaný za použití oligonukleotidových příměrů #1300-50 a #1257-15, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21. Ligace se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-MK[22-401]-H7 genu.

Exprese rekombinantního muOPG MK[22-401]-H₇ polypeptidu z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly rekombinantní plazmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1300-49

5'-GTT CTC CTC ATA TGA AAG AAA CTC TGC CTC CAA AAT

ACC TGC A-3’ (SEQ ID NO:74)

Oligo #1300-51

5’-TAC GCA CTG GAT CCT TAA TGA TGG TGA TGG TGA TGA

TGT AAG CAG CTT ATT TTC ACG GAT TGA ACC TGA TTC CCT A-3* (SEQ ID NO:75)

I. Myší OPG met[27-401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 27 až 401 myšího OPG, se umístila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1309-74 a #1257-15 jako primery, se prováděla za použití matricového plazmidu pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se izoloval, purifikoval, štěpil pomocí Ndel a BamHI restrikční endonukleázy a purifikoval. Ndel a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21. Ligace se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muÓPG-met[27-401] genu.

Exprese rekombinantního muOPG-met[27-401] polypeptidu z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly rekombinantní plazmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo#1309-74

5’-GTT CTC CTC ATA TGA AAT ACC TGC ATT ACG ATC CGG

AAA CTG GTC AT-3' (SEQ ID NO:76)

Oligo#l 257—15 (viz Sekce D)

J. Humánní OPG met[27-401]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 27 až 401 humánního OPG, se umístila pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru

-46CZ 292587 B6 pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1309-75 a #1309-76 jako primery, se prováděla za použití matricového plazmidu pAMG21-huOPG-met[22-401]DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se izoloval, purifikoval, štěpil pomocí Asel a BamHI restrikční endonukleázy a purifikoval. Asel a BamHI digerovaný a purifíkovaný PCR produkt se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21. Ligační směs se elektroporaci převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci huOPG-met[27-401] genu.

Exprese rekombinantního huOPG-met[27-401] polypeptidu z transformovaných 393 buněk, které obsahovaly rekombinantní plazmid pAMG21, která následoval po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1309-75

5’-GTT CTC CTA TTA ATG AAA TAT CTT CAT TAT GAT GAA

GAA ACT T-3’ (SEQ ID NO:77)

Oligo #1309-76

5*-TAC GCA CTG GAT CCT TAT AAG CAG CTT ATT TTT ACT

GAT T-3¹ (SEQ ID NO:78)

K. Myší OPG met[22-180]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyselin 22 až 180 myšího OPG, se uvedla pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1309-72 a #1309-73 jako primery, se prováděla za použití matricového plazmidu pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA a termocyklických podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se izoloval, purifikoval, štěpil pomocí Ndel a BamHI restrikční endonukleázy a purifikoval. Ndel a BamHI digerovaný a purifíkovaný PCR produkt se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21. Ligace se elektroporaci transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-met[22-180] genu.

Exprese rekombinantního muOPG-met[22-180] polypeptidu z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly rekombinantní plazmid pAMG21, která následoval po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1309-72

5'-GTT CTC CTC ATA TGG AAA CTC TGC CTC CAA AAT ACC

TGC A-3‘ (SEQ ID NO:79)

Oligo #1309-73

5'-TAC GCA CTG GAT CCT TAT GTT GCA TTT CCT TTC TGA

ATT AGC A-3¹ (SEQ ID NO:80)

-47CZ 292587 B6

L. Myší OPG met[27-180]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 27 až 180 myšího OPG, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického plazmidového expresního vektoru pAMG21 5 následujícím způsobem. PCR, používající oligonukleotidy #1309-74 (viz část I) a #1309-73 (viz část K) jako primery, se prováděla za použití matricového plazmidu pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA a termocyklickych podmínek popsaných v části B. Výsledný PCR vzorek se rozpustil na agarózovém gelu, PCR produkt se vyjmul, purifíkoval, štěpil pomocí Ndel a BamHI restrikční endonukleázy a purifíkoval. Výše uvedený Ndel a BamHI digerovaný a purifikovaný to PCR produkt se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadil mezi Ndel místo a BamHI místo plazmidového vektoru pAMG21. Ligace se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-met[27-180] genu.

Exprese rekombinantního muOPG met[27-180] polypeptidu z transformovaných 393 kultur, které obsahovaly rekombinantní plazmid pAMG21, která následovala po indukci, se určila za použití postupů popsaných v části C.

M. Myší OPG met[22-l 89] a met[22-l94]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a bud’ aminokyseliny 22 až 189 nebo 22 až 194 myšího OPG, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Pár syntetických oligonukleotidů #1337-92 a #1337-93 25 (=muOPG-189 spojovník) nebo #1333-57 a #1333-58 (=muOPG-194 spojovník), se individuálně fosfoiyloval a nechal vytvořit oligo-spojníkový duplexový pár za použití metod popsaných v sekci B. Purifikovaná plazmidová DNA pAMG21-muOPG-met[22-401] se štěpila pomocí KpnI a BspEI restrikčních endonukleáz a výsledné DNA fragmenty se rozpustily na agarózovém gelu. Přibližně 413 bp B fragment se izoloval pomocí standardní rekombinantní DNA 30 metodologie. Fosforylované oligo-spojovníkové duplexy se vytvořily bud’ mezi oligonukleotidy #1337-92 a #13337-93 (muOPG-189 spojovník) nebo mezi oligonukleotidy #1333-57 a #1333-58 (muOPG-194 spojovník) obsahující BspEI a BamHI kohezní konce, a výše zmíněný izolovaný ~413 bp B fragment plazmidového pAMG21-muOPG-met[22-401], digerovaný pomocí KpnI a BspEI restrikčních endonukleáz, se pomocí standardní rekombinantní 35 DNA metodologie přímo vřadil mezi KpnI místo a BamHI místo pAMG21-muOPG met[22-401]. Každá ligační směs se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-met[22-189] genu nebo muOPG-met[22-194] genu.

Exprese rekombinantních muOPG-met[22-189] a muOPG-met[22-194] polypeptidů z rekombinantních pAMG21 plazmidů transformovaných do 393 buněk se detekovala za použití postupů popsaných v části C.

-48CZ 292587 B6

Oligo #1337-92

5’-CCG GAA ACA GAT AAT GAG-3’ (SEQ ID NO: 81)

Oligo #1337-93

5’-GAT CCT CAT TAT CTG TTT-3’ (SEQ ID NO:82)

Oligo #1333-57

5*-CCG GAA ACA GAG AAG CCA CGC AAA AGT AAG-3’ (SEQ ID NO:83)

Oligo #1333-58

5’-GAT CCT TAC TTT TGC GTG GCT TCT CTG TTT-3’ (SEQ ID NO:84)

N. Myší met[27-189] a met[27-194]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a buď aminokyseliny 27 až 189 nebo 27 až 194 myšího OPG, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Fosforylované oligonukleotidové spojovníky, „muOPG189 spojovník“ nebo „muOPG-194 spojovník“ (viz část M) obsahující BspEI a BamHI kohezní konce a izolovaný ~413 bp B fragment plazmidového pAMG21-muOPG-met[22-401], digerovaný pomocí Knpl a BspEI restrikčních endonukleáz, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi KpnI místo a BamHI místo pAMG21-muOPG met[27-401]. Každá ligační směs se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci muOPG-met[27-189] genu nebo muOPG-met[27-194] genu.

Exprese rekombinantního muOPG-met[27-189] a muOPG-met[27-194] polypeptidu z rekombinantních pAMG21 plazmidů transformovaných do 393 buněk se detekovala za použití postupů popsaných v části C.

O. Humánní OPG met[22-l 85], met[22-l 89], met[22-l 94]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a buď aminokyseliny 22 až 185,22 až 189 nebo 22 až 194 humánního OPG, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Pár syntetických oligonukleotidů, #1331-87 a #1331-88 (=huOPG-185 spojovník), #1331-89 a #1331-90 (=huOPG-189 spojovník) nebo #1331-91 a #1331-92 (=huOPG-194 spojovník), se individuálně fosforylovaly a jednotlivě nechaly vytvořit oligo-spojovníkový duplexový pár za použití metod popsaných v sekci B. Purifikovaná plazmidová DNA pAMG21-huOPG-met[27-401] se štěpila pomocí KpnI a Ndel restrikčních endonukleáz a výsledná DNA fragmenty se rozpustily na agarózovém gelu. Přibližně 407 bp B fragment se izoloval pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie. Fosforylované oligo-spojovníkové duplexy, vytvořené buď mezi oligonukleotidy #1331-87 a #1331-88 (=huOPG-185 spojovník), #1331-89 a #1331-90 (=huOPG-189 spojovník) nebo #1331-91 a #1331-92 (huOPG-194 spojovník) [každý spojovník obsahuje Ndel a BamHI kohezní konce], a výše zmíněný izolovaný ~407 bp B fragment plazmidového pAMG21-huOPG-met[27-401], digerovaný pomocí KpnI a Ndel restrikčních endonukleáz, se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily mezi KpnI místo a BamHI

-49CZ 292587 B6 místo plazmidu pAMG21-huOPG met[22-401]. Každá ligace se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci huOPG-met[22-l 85] genu, huOPG-met[22-189] senu nebo huOPG-met[22-194] genu.

Exprese rekombinantního huOPG-met[22-185]. huOPG-met[22-189] nebo huOPG-met[22194] v transformovaných 393 buňkách obsahujících rekombinantní pAMG21 plazmidy se detekovala za použití postupů popsaných v části C.

Oligo #1331-87

5’-TAT GTT AAT GAG-3’ (SEQ ID NO:85)

Oligo #1331-88

5’-GAT CCT CAT TAA CA-3' (SEQ ID NO:86)

Oligo #1331-89

5*-TAT GTT CCG GAA ACA GTT AAG-3' (SEQ ID NO:87)

Oligo #1331-90

5’-GAT CCT TAA CTG TTT CCG GAA CA-3' (SEQ ID NO:88)

Oligo #1331-91

5'-TAT GTT CCG GAA ACA GTG AAT CAA CTC AAA AAT

AAG-3’ (SEQ ID NO:89)

Oligo #1331-92

5'-GAT CCT TAT TTT TGA GTT GAT TCA CTG TTT CCG GAA ₁₀ CA-3' (SEQ ID NO: 90)

P. Humánní OPG met[27-185], met[27-189], met[27-194]

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a buď aminokyseliny 27 až 185, 27 až 189 nebo 27 až 194 humánního OPG polypeptidu, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do 15 prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Fosforylované oligonukleotidové spojovníky „huOPG-185 spojovník, „huOPG-189 spojovník“ nebo „huOPG-194 spojovník“ (viz část O) obsahující Ndel a BamHI kohezní konce a izolovaný ~407 bp B fragment plazmidového pAMG21-huOPG-met[27-401], digerovaný pomocí KpnI a Ndel restrikčních endonukleáz (viz část O), se pomocí standardní rekombinantní DNA metodologie přímo vřadily 20 mezi KpnI místo a BamHI místo plazmidu pAMG21-huOPG met[27—401] (viz část J). Každá ligační směs se elektroporací převedla do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se sekvencování DNA, jehož cílem bylo ověřit DNA sekvenci huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-l 89] nebo huOPG-met[27-194] genu.

Exprese rekombinantního huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189] a huOPG-met[27-194] polypeptidu z rekombinantních pAMG21 plazmidů transformovaných do 393 kultur se detekovala za použití postupů popsaných v části C.

-50CZ 292587 B6

Q. Myší OPG met[27-401] (P33E, FG36S, A45P)

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a bud’ aminokyseliny 27 až 48 humánního a následně aminokyselinové zbytky 49 až 401 myšího OPG, se dala pod kontrolou luxPR promotoru do prokaryotického expresního vektoru pAMG21 následujícím způsobem. Purifikovaný plazmid pAMG21-huOPG-met[27-401] (viz část J) se štěpil pomocí AatlI a KpnI restrikčních endonukleáz a —1075 bp B fragment izolovaný zagarózového gelu se za použití standardní rekombinantní DNA metodologie izoloval zagarózového gelu. Kromě toho se plazmidová pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA (viz část D) digerovala pomocí KpnI aBamHI restrikčních endonukleáz a výše popsaného izolovaného —1064 bp B fragmentu. Izolovaný —1075 bp pAMG21-huOPG-met[27—401] restrikční fragment obsahující AatlI & KpnI kohezní konce (viz výše), -1064 bp pAMG21-muOPG-met[22-401] restrikční fragment obsahující KpnI a BamHI kohezní konce a -5043 bp restrikční fragment obsahující AatlI aBamHI kohezní konce a odpovídající nukleokyselinová sekvence pAMG21 mezi AatlI & BamHI se ligovaly za použití standardní rekombinantní DNA metodologie. Ligace se elektroporací transformovala do hostitelských 393 buněk E. coli postupem doporučeným výrobcem. Klony se vybraly a přítomnost rekombinantního inzertu v plazmidu se ověřila pomocí standardní DNA metodologie. Změny aminokyselin v muOPG z prolinu-33 na kyselinu glutamovou-33, z glycinu-36 na serin-36 a zalaninu-45 na prolin-45 jsou výsledkem náhrady muOPG zbytků 27 až 48 huOPG zbytky 27 až 48.

Exprese rekombinantního muOPG-met[27-401] (P33E, G36S, A45P) z transformovaných 393 buněk obsahujících rekombinantní pAMG21 plazmid se určila způsoby popsanými v části C.

R. Myší OPG met-lys(his)₂-ala-ser-(asp)4-lys[22—401] (A45T)

DNA sekvence, kódující N-koncový His a anterokinázu rozpoznávající sekvenci, kterou je (od NH₂ k COOH konci) Met-Lys-His-His-His-His-His-His-Ala-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (=HEK), a za tuto sekvencí následují aminokyseliny 22 až 401 myšího OPG polypeptidu, se dala následujícím způsobem pod kontrolu lac represoru regulovaného Ps4 promotorem. pAMG22-His (viz část A) se digerovala pomocí Nhel a BamHI restrikčních endonukleáz a velký fragment (fragment A) se izoloval zagarózového gelu za použití standardní rekombinantní DNA metodologie. Oligonukleotidy #1282-91 a #1282-92 se individuálně fosforylovaly a pomocí již popsaných metod nechaly vytvořit oligo-vazebníkový duplex (viz část B). Fosforylovaný vazebný duplex, vytvořený mezi oligonukleotidy #1282-91 a #1282-92, obsahující Nhel a KpnI kohezní konce, popsaný KpnI a BamHI digerovaný a purifikovaný PCR produkt (viz část D) a A fragment vektoru pAMG22-His digerovaného pomocí Nhel a BamHI se ligovaly za použití standardní rekombinantní DNA metodologie. Ligace se pomocí elektroporace, prováděné způsobem doporučeným výrobcem, transformovala do E. coli hostitele GM120. Klony se zvolily, izolovala se plazmidová DNA a provedlo se DNA sekvencování s cílem ověřit DNA sekvenci muOPG-HEK[22-401] genu. DNA sekvencování odhalilo v přirozené muOPG sekvenci nepůvodní mutaci, která vznikla v důsledku změny jediné aminokyseliny alaninu-45 muOPG polypeptidu na threonin.

Exprese rekombinantní muOPG-HEK[22-401] (A45T) zGM120 buněk obsahujících rekombinantní pAMG21 plazmid se určila za použití metod v podstatě shodných s metodami popsanými v části C stou výjimkou, že se namísto přidání syntetického autoinduktoru pro dosažení indukce přidává IPTG do konečné koncentrace 0,4 mM.

-51 CZ 292587 B6

Oligo #1282-91

5’-CTA GCG ACG ACG ACG ACA AAG AAA CTC TGC CTC CAA

AAT ACC TGC ATT ACG ATC CGG AAA CTG GTC ATC AGC TGC TGT

GTG ATA AAT GTG CTC CGG GTA C-3' (SEQ ID NO:91)

Oligo #1282-92

5'-CCG GAG CAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC CAG TTT CCG GAT CGT AAT GCA GGT ATT TTG GAG GCA GAG TTT CTT TGT CGT CGT CGT CG-3' (SEQ ID NO:92)

S. Humánní OPG met-arg-gly-ser-(his)6[22-401]

Pro přípravu fragmentu se 175 bázemi pro vzájemné překrytí dvouřetězcové DNA bylo navrženo 5 osm oligonukleotidů (1338-09 až 1338-16, uvedených níže). Tyto oligonukleotidy se temperovaly, ligovaly a 5' a 3' oligonukleotidy se použily jako PCR primery pro přípravu větších množství fragmentu tvořeného 175 bázemi. Konečné PCR genové produkty se digerovaly restrikčními endonukleázami Clal a KpnI, čímž se získal fragment, který nahradil 28 N-koncových kodonů humánního OPG. Clal a KpnI digerovaný PCR produkt se vřadil do to pAMG21-huOPG [27-401], který byl rovněž štěpen Clal a KpnI. Ligovaná DNA se transformovala do kompetentních hostitelských buněk E. coli 393. Klony se prohledávaly s cílem určit, zda jsou schopny produkovat rekombinantní proteinový produkt a zda obsahují genovou fúzi mající správnou nukleotidovou sekvenci. Úrovně proteinové exprese se určily na základě studií prováděných v 50 ml protřepávačce. U celého buněčného lyzátu a sonifikované pelety se 15 analyzovala exprese konstruktu pomocí barvivém Coomassie zabarvených PAGE gelů a pomocí westernové analýzy za použití myší anti-OPG protilátky. Exprese huOPG Met-Arg-Gly-Ser(His)₆ [22-401], jejímž výsledkem je tvorba velkých inkluzních těl a proteinu, se lokalizovala do nerozpustné (peletové) frakce.

-52CZ 292587 B6

1338-09

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GA (SEQ ID NO: 93)

1338-10

TTT GTT TTA ACT AAT TAA AGG AGG AAT AAA ATA TGA GAG GAT CGC ATC AC (SEQ ID NO:94)

1338-11

CAT CAC CAT CAC GAA ACC TTC CCG CCG AAA TAC CTG CAC TAC GAC GAA GA (SEQ ID NO:95)

1338-12

AAC CTC CCA CCA GCT GCT GTG CGA CAA ATG CCC GCC GGG TAC CCA AAC A (SEQ ID NO:96)

1338-13

TGT TTG GGT ACC CGG CGG GCA TTT GT (SEQ ID NO: 97)

1338-14

CGC ACA GCA GCT GGT GGG AGG TTT CTT CGT CGT AGT GCA GGT ATT TCG GC (SEQ ID NO:98)

1338-15

GGG AAG GTT TCG TGA TGG TGA TGG TGA TGC GAT CCT CTC ATA TTT TAT T (SEQ ID NO:99)

1338-16

CCT CCT TTA ATT AGT TAA AAC AAA TCT AGT ATC AAA TCG ATT GTG TTT GT (SEQ ID NO:100)

T. Humánní OPG met-lys[22X01 ] a met(lys)₃[22-401 ]

Za účelem konstrukce met-lys a met-(lys)₃ verzí humánního OPG[22-401] byly pro přidání příslušného počtu lysinových zbytků navrženy vzájemně se překrývající oligonukleotidy. Pro každý konstrukt byly navrženy dva oligonukleotidy tak, aby překryv umožnil dva cykly PCR pro výrobu konečného produktu. Matricí pro první PCR reakci byl plazmidový DNA přípravek obsahující humánní 22-401 gen. První PCR přidala lysinový zbytek (zbytky). Druhá PCR použila produkt prvního cyklu a přidala sekvenci zpět na první restrikční místo, Clal.

o

Konečné PCR genové produkty se digerovaly restrikčními endonukleázami Clal a KpNI, které nahradily N-koncových 28 kodonů hu OPG a následně se ligovaly do plazmidového pAMG21-hu OPG [27-401], který se rovněž digeroval zmíněnými dvěmi restrikčními endonukleázami. Ligovaná DNA se transformovala do kompetentních hostitelských buněk E. coli

-53CZ 292587 B6 kmene 393. Prohledáváním klonů se zjišťovala jejich schopnost produkovat rekombinantní proteinový produkt a to, zda vykazují genovou fúzi se správnou nukleotidovou sekvencí. Úrovně proteinové exprese se stanovily ze studií 50 ml protřepávačky. Celý buněčný lyzát a sonifikovaná peleta se analyzovaly s cílem stanovit expresi konstruktu za použití coomassiem zabarvených 5 PAGE gelů a westernové analýzy s myší anti-OPG protilátkou. U žádného konstruktu nebyla zjištěna detekovatelná úroveň proteinové exprese ani nebyla pozorována inkluzní těla. DNA sekvence byly potvrzeny DNA sekvencováním.

Pro přípravu Met-Lys huOPG[22-401] se použily následující oligonukleotidové primery:

1338-17

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATT

AAA GGA GGA ATA AAA TG (SEQ ID NO: 101)

1338-18

CTA ATT AAA ‘GGA GGA ATA AAA TGA AAG AAA CTT TTC CTC CAA

AAT ATC (SEQ ID NO:102)

1338-20

TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (SEQ ID NO:103)

Oligonucleotide primers to prepare Met-(Lys)3-huOPG[22401]:

1338-17

ACA AAC ACA ATC GAT TTG ATA CTA GAT TTG TTT TAA CTA ATT

AAA GGA GGA ATA AAA TG (SEQ ID NO: 104)

1338-19

CTA ATT AAA GGA GGA ATA AAA TGA AAA AAA AAG AAA CTT TTC

CTC CAA AAT ATC (SEQ ID NO:105)

1338-20

TGT TTG GGT ACC CGG CGG ACA TTT ATC ACA C (SEQ ID ₁₀ NO: 106)

U. Fúze humánního a myšího OPG [22-401 ]/Fc

Zkonstruovaly se čtyři OPG-Fc fúze, ve kterých se Fc úsek humánního IgGl navázal na N-konec humánních nebo myších osteoprotegerinových aminokyselin 22 až 401 (označený jako 15 Fc/OPG [22-401]) nebo C-konce (označený jako OPG[22-401]/Fc). Fc fúze se konstruovaly za použití fúzního vektoru pFc-A3 popsaného v příkladu 7.

-54CZ 292587 B6

Všechny fúzní geny se konstruovaly za použití standardní PCR technologie. Matricí pro PCR reakce byly plazmidové přípravky obsahující cílové geny. Překrývající oligonukleotidy byly navrženy tak, aby kombinovaly C-koncový úsek genu s N-koncovým úsekem jiného genu. Tento způsob umožňuje po provedení příslušných PCR reakcí vzájemné fúzování dvou genů ve správném čtecím rámci. Nejprve se do PCR reakce zavedl pomocí univerzálního primeru pro vektor, nesoucí cílový gen, pro každý gen jeden „fúzní“ oligonukleotid. Potom se pomocí univerzálního primeru zavedl do PCR reakce druhý komplementární „fúzní“ oligonukleotid, čímž se získal druhý gen. Na konci první PCR reakce se získaly dva samostatné produkty, přičemž v každém jednotlivém genu bylo přítomno fúzní místo, tvořící dostatečný překryv pro provádění druhého cyklu PCR a vytvoření požadované fúze. V druhém cyklu PCR se první dva PCR produkty zkombinovaly s univerzálními primery a prostřednictvím vzájemně se překrývajících úseků se připravila celodélková fúzní DNA sekvence.

Konečné PCR genové produkty se digerovaly restrikčními endonukleázami Xbal a BamHI a následně ligovaly do vektoru pAMG21, který byl rovněž digerován těmito dvěmi endonukleázami. Ligovaná DNA se transformovala do kompetentních hostitelských buněk E. coli bakteriálního kmene 393. Prohledáváním klonů se zjišťovala jejich schopnost produkovat rekombinantní proteinový produkt a to, zda vykazují genovou fúzi se správnou nukleotidovou sekvencí. Úrovně proteinové exprese se stanovily ze studií 50 ml protřepávačky. Celý buněčný lyzát a sonifíkovaná peleta se analyzovaly s cílem stanovit expresi konstruktu za použití coomassiem zabarvených PAGE gelů a westernové analýzy s myší anti-OPG protilátkou.

Fc/huOPG [22-401]

Exprese Fc/hu OPG [22-401] fúzního peptidu se detekovala na coomassiem zabarveným PAGE gelu a na westernovém blotu. Buňky měly velmi velká inkluzní těla a velká část produktu se nacházela v nerozpustné (peletové) frakci. Pro konstrukci této OPG-Fc fúze se použily následující primeiy:

1318-48

CAG CCC GGG TAA AAT GGA AAC GTT TCC TCC AAA ATA TCT TCA

TT (SEQ ID NO:107)

1318-49

CGT TTC CAT TTT ACC CGG GCT GAG CGA GAG GCT CTT CTG CGT

GT (SEQ ID NO:108)

Fc/muOPG [22-401]

Exprese fúzního peptidu se detekovala na coomassiem zabarveném PAGE gelu a na westernovém blotu. Buňky měly velmi velká inkluzní těla a velká část produktu se nacházela v nerozpustné (peletové) frakci. Pro konstrukci této OPG-Fc fúze se použily následující primery:

-55CZ 292587 B6

1318-50

CGC TCA GCC CGG GTA AAA TGG AAA CGT TGC CTC CAA AAT ACC

TGC (SEQ ID NO: 109)

1318-51

CCA TTT TAC CCG GGC TGA GCG AGA GGC TCT TCT GCG TGT (SEQ ID NOíllO) muOPG [22-401]/Fc

Exprese fúzního peptidu se detekovala na coomassiem zabarveném PAGE gelu a na westernovém blotu. Množství rekombinantního produktu bylo menší než OPG fůzních proteinů, které mají Fc úsek vN-koncové poloze. Zřejmá inkluzní těla nebyla detekována. Zdálo se, že většina produktu se nachází v nerozpustné (peletové) formě. Pro konstrukci této OPG-Fc fuze se použily následující primery:

1318-54

GAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC (SEQ ID NOtlll)

1318-55

CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TCA CGG ATT G (SEQ ID NO:112) huOPG [22-401]/Fc

Exprese fúzního peptidu nebyla na coomassiem zabarveném gelu zjištěna, ačkoliv na westernovém blotu byl patrný slabý pozitivní signál. Zřejmá inkluzní těla nebyla detekována. Pro přípravu této OPG-Fc fúze se použily následující primery:

1318-52

AAA AAT AAG CTG CTT AGC TGC AGC TGA ACC AAA ATC (SEQ ID NO:113)

1318-53

CAG CTG CAG CTA AGC AGC TTA TTT TTA CTG ATT GG (SEQ ID NO:114)

V. Fúze humánního OPG met[22-401]-Fc (P25A)

Tento konstrukt kombinuje aminokyselinovou změnu prolinu na alanin v poloze 25 (P25A) s huOPG met[22-401]-Fc fúzí. Plazmid se digeroval restrikčními endonukleázami Clal a KpnI, 20 který odstranily 28 N-koncových kodonů genu a výsledný malý (kratší než 200 bazických párů) fragment se gelově purifikoval. Tento fragment, který obsahoval namísto prolinu alanin, se

-56CZ 292587 B6 následně ligoval do plazmidové pAMG21-huOPG [22—401]-Fc fúze, která se digerovala zmíněnými dvěmi restrikčními endonukleázami. Ligovaná DNA se transformovala do kompetentních hostitelských buněk E, coli bakteriálního kmene 393. Prohledáváním klonů se zjišťovala jejich schopnost produkovat rekombinantní proteinový produkt a to, zda vykazují genovou fúzi se správnou nukleotidovou sekvencí. Úrovně proteinové exprese se stanovily ze studií 50 ml protřepávačky. Celý buněčný lyzát a sonifikovaná peleta se analyzovaly s cílem stanovit expresi konstruktu za použití coomassiem zabarvených PAGE gelů a westernové analýzy smyší anti-OPG protilátkou. Expresní úroveň fúzního peptidu byla detekována na coomassiem zabarveném gelu a westernovém blotu. Protein se nacházel v nerozpustné (peletové) frakci. Buňky měly velká inkluzní těla.

W. Humánní OPG met[22-401] (P25A)

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 22 až 401 humánního OPG s prolinem v poloze 25 substituovaným alaninem se pod kontrolou lux P_r promotoru v prokaryotickém expresním vektoru pAMG21, se konstruovala následujícím způsobem. Syntetické oligonukleotidy # 1289-84 a 1289-85 se temperovaly za vzniku oligonukleotidového vazebníkového duplexu s Xbal a KpnI kohezními konci. Syntetický vazebníkový duplex použil optimální kodony E. coli a kódoval N-koncový methionin. Vazebník rovněž obsahoval Spěl restrikční místo, které nebylo obsaženo v původní sekvenci. Vazebníkový duplex se za použití standardních metod směrově vřadil mezi Xbal a KpnI místo v pAMG21-huOPG-22-401. Ligační směs se pomocí transformace zavedla do E. coli hostitele GM221. Klony se nejprve prohledávaly z hlediska produkce rekombinantního proteinu. Z pozitivních klonů se izolovala plazmidová DNA, u které se provedlo DNA sekvencování s cílem ověřit DNA sekvenci HuOPG-Met[22-401](P25A) genu. Pro generování vazebníku Xbal- KpnI se použily následující oligonukleotidy:

Oligo #1289-84

5'-CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TGC TCC AAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AAC TAG TCA TCA GCT GCT GTG TGA TAA ATG TCC GCC GGG TAC -3' (SEQ ID NO: 115)

Oligo #1289-85

5’- CCG GCG GAC ATT TAT CAC ACA GCA GCT GAT GAC TAG

TTT CTT CAT CAT AAT GAA GAT ATT TTG GAG CAA AAG TTT CCA

TAT GTT ATT CCT CCT T-3' (SEQ ID NO: 116)

X. Humánní OPG met[22-401] (P26A) a (P26D)

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 22 až 401 humánního OPG s prolinem v poloze 26 substituovaným alaninem pod kontrolou lux P_R promotoru v prokaryotickém expresním vektoru pAMG21, se konstruovala následujícím způsobem. Syntetické oligonukleotidy # 1289-86 a 1289-87 se temperovaly za vzniku oligonukleotidového vazebníkového duplexu s Xbal a Spěl kohezními konci. Syntetický vazebníkový duplex použil optimální kodony E. coli a kódoval N-koncový methionin. Vazebníkový duplex se za použití standardních metod směrově vřadil mezi Xbal a Spěl místo v pAMG21-huOPG[22-401] (P25A). Ligační směs se pomocí transformace zavedla do E. coli hostitele GM221. Klony se nejprve prohledávaly z hlediska produkce rekombinantního proteinu. Z pozitivních klonů se izolovala plazmidová DNA, u které se provedlo DNA sekvencování s cílem ověřit DNA sekvenci huOPG-Met[22—401] (P26A) genu. Ukázalo se, že jeden ze sekvencovaných klonů má prolin

-57CZ 292587 B6 v poloze 26 substituovaný spíše kyselinou asparágovou než alaninem a tento klon byl označen jako huOPG-met[22-401] (P26D). Pro generování Xbal- Spěl vazebníku se použily následující oligonukleotidy:

Oligo #1289-86

5' - CTA GAA GGA GGA ATA ACA TAT GGA AAC TTT TCC

TGC TAA ATA TCT TCA TTA TGA TGA AGA AA - 3¹ (SEQ ID N0:117)

Oligo #1289-87

5' - CTA GTT TCT TCA TCA TAA TGA AGA TAT TTA GCA

GGA AAA GTT TCC ATA TGT TAT TCC TCC TT - 3' (SEQ ID NO:118)

Y. Humánní OPG met[22-l94] (P25A)

DNA sekvence, kódující N-koncový methionin a aminokyseliny 22 až 194 humánního OPG s prolinem v poloze 25 substituovaným alaninem pod kontrolou lux P_R promotoru v prokaryotickém expresním vektoru pAMG21, se konstruovala následujícím způsobem. Jak plazmid pAMG21-huOPG[27-194] tak pAMG21-huOPG[22-401] (P25A) se digeroval KpnI a BamHI endonukleázou. 450 bp fragment se izoloval zpAMG21-huOPG[27-194] a 6,1 kbp fragment se izoloval z pAMG21-huOPG[22—401] (P25A). Tyto fragmenty se pomocí transformace vzájemně ligovaly a zavedly do E. coli hostitele GM221. Klony se nejprve prohledávaly z hlediska produkce rekombinantního proteinu. Z pozitivních klonů se izolovala plazmidová DNA, u které se DNA sekvencováním ověřila DNA sekvence huOPG-Met[22-194] (P25A) genu.

Příklad 9

Spojení OPG monomerů

CHO buňky, uměle připravené pro přeexprimování muOPG [22-401], se použily pro generování kondiciovaného média pro účely analýzy sekretovaného rekombinantního OPG prováděné za použití králičích polyklonálních anti-OPG protilátek. Alikvótní podíl kondiciovaného média se dvacetkrát zahustil a následně analyzoval pomocí redukční a neredukční SDS-PAGE (obr. 15). Za redukčních podmínek protein migroval jako Mr 50-55 kd polypeptid. Toto chování by se dalo předpokládat, pokud by se zralý produkt glykosyloval v jednom nebo několika svých konvenčních N-navázaných glykosylačních místech. Překvapivé zjištění bylo učiněno v případě, kdy se vzorek analyzoval pomocí neredukující SDS-PAGE. V tomto případě protein migroval jako přibližně 100 kd polypeptid, což je dvojnásobek velikosti redukovaného proteinu. Kromě toho zde bylo malé množství Mr 50-55 kd polypeptidu. Tento migrační vzor SDS-PAGE odpovídal teorii, podle které OPG produkt tvořil dimery, které se vytvořily v důsledku oxidací volné sulfhydrylové skupiny (skupin).

Předpokládaný zralý OPG polypeptid obsahuje 23 cysteinových zbytků, z nichž 18, jak se předpokládá, se podílí na tvorbě disulfidových můstků uvnitř řetězce, které obsahují čtyři domény obohacené cysteinem (obr. 12A). Pět zbývajících C-koncových cysteinových zbytků není součástí sekundární struktury, jak lze předpokládat na základě homologie s dalšími členy TNFR rodiny. Předpokládaný zralý OPG polypeptid tedy obsahuje celkově lichý počet cysteinových

-58CZ 292587 B6 zbytků a je teoreticky možné, že alespoň jeden z těchto zbytků je volný pro tvorbu intermolekulámí disulfídové vazby mezi dvěma OPG monomery.

Objasnění vzorů OPG kineze a spojení monomerů napomohly studie „pulse-chase“ značení. CHO buňky, exprimující muOPG [22—401], se metabolicky značily 30 minut výše popsaným způsobem v médiu prostém séru a obsahujícím ³⁵S methionin a cystein. Po uplynutí této časové periody se médium odstranilo a nahradilo kompletním médiem obsahujícím neoznačený methionin a cystein v koncentracích přibližně 2 OOOkrát vyšší než byla původní koncentrace radioaktivních aminokyselin. 30 minut, 1 hodinu, 2 hodiny, 4 hodiny, 6 hodin a 12 hodin po přidání se kultury sklidily odstraněním kondiciovaného média a připravily se lyzáty kondiciovaného média a přilnavé monovrstvy. Kultivační médium a buněčné lyzáty se vyčistily výše popsaným způsobem a následně imunologicky vysrážely za použití ani-OPG protilátek. Pro promytí imunologických sraženin se uvolnily varem v neredukčním SDS-PAGE pufru a následně rozdělily na dvě poloviny. K jedné polovině se přidalo redukční činidlo, β-merkaptoethanol do konečné pětiprocentní (obj./obj.) koncentrace, zatímco druhá polovina se udržovala v neredukujících podmínkách. Obě sady imunologických sraženin se analyzovaly SDS-PAGE výše popsaným způsobem a následně se zpracovaly pro účely autoradiografie a exponovaly na film. Výsledky zachycuje obr. 16. Vzorky analyzované redukční SDS-PAGE jsou znázorněny ve spodní části obrázku. Po provedení syntézy se OPG peptid rychle zpracoval na o něco větší polypeptid, který pravděpodobně reprezentuje modifikaci N-navázané glykosylace. Přibližně po 1 až 2 hodinách se hladina OPG v buňce prudce snížila a současně se objevila v supematantu kultury. Toto je, jak se zdá, způsobeno vektorovým transportem OPG z buňky do média, k němuž v průběhu času došlo, což odpovídá teorii, že OPG je přirozeně sekretovaný protein. Analýza stejných imunologických sraženin za neredukčních podmínek odhaluje vzájemný vztah mezi tvorbou OPG dimerů a sekrecí do kondiciovaného média (obr. 16, horní část). Během prvních 30 až 60 minut se OPG monomery zpracovaly v buňce přímou glykosylací, po které následovala tvorba dimerů. Postupně se objem OPG monomeru rozdělil do dvou dimerů, které následně z buňky zmizely. Přibližně 60 minut po realizování syntézy se OPG dimery objevily v kondiciovaném médiu, kde se hromadily po celou dobu trvání experimentu. Po uplynutí této časově periody se vytvořily OPG dimery, které se následně sekretovaly do kultivačního média. OPG monomery setrvávaly během experimentu v nízké koncentraci uvnitř buňky a malé množství těchto monomerů se rovněž objevilo v médiu. Nezdá se, že by k tomu docházelo v důsledku zlomu kovalentních OPG dimerů, ale spíše v důsledku produkce substechiometrického množství monomerů v buňce a jejich následné sekrece.

Zdá se, že OPG rekombinantně generovaný z transfektovaných CHO buněk má převážně formu dimerů. Za účelem stanovení, zda dimerace je přirozeným procesem probíhajícím v rámci OPG syntézy se zjišťovalo, zda se v kondiciovaném médiu buněčné linie nachází přirozeně exprimovaný OPG. Prohledáváním RNA tkáně a buněčné linie se zjistilo, že CTLL-2 buněčná linie, myší cytotoxická T lymfocytová buněčná linie (ATCC přírůstkové číslo TIB-214) exprimuje OPG mRNA. Ukázalo se, že OPG transkript odpovídá klonované a sekvencované 2,5 až 3,0 kb RNA, identifikované v ledvině, a že kóduje sekretovanou molekulu. Westernová analýza kondiciovaného média, získaného z CTLL-2 buněk, ukázala, že většina sekretovaného OPG proteinu, pokud ne všechen, má formu dimerů (obr. 17). Z tohoto zjištění vyplývá, že OPG dimerace a sekrece není výsledkem přeexprimování v buněčné linii, ale že dimemí forma je pravděpodobně hlavní formou produktu, který je generován expresními buňkami.

Tkáně a sérum normálních a transgenických myší se analyzovaly s cílem stanovit povahu OPG molekuly exprimované v OPG transgenické myši. Vzhledem k tomu, že se krysí OPG cDNA exprimovala pod kontrolou hepatocytového kontrolního prvku, se pro analýzu použily extrakty, připravené zparenchymu kontrolní a transgenické myši za neredukčních podmínek (obr. 18). V extraktu, získaném z transgenických myší, ale nikoliv v extraktu z kontrolních myší, se snadno určily OPG dimery spolu se substechiometrickým množstvím monomerů. OPG dimery a monomery se zdají být identické s rekombinantním myším proteinem, exprimovaným v geneticky uměle připravených CHO buňkách. Z těchto zjištění vyplývá, že OPG dimeiy jsou ve skutečnosti

-59CZ 292587 B6 přirozenou formou genového produktu a že jsou pravděpodobně klíčovými aktivními složkami. Vzorky séra, získané z kontrolních a transgenických myší se rovněž analyzovaly westernovou analýzou. U kontrolních myší většina OPG proteinu migrovala jako dimer a rovněž se analyzovalo malé množství monomeru. Kromě toho bylo detekováno podstatnější množství 5 proteinu, odvozeného od většího OPG, který migroval s relativní molekulovou hmotností, odpovídající předpokládané velikosti kovalentně navázaného trimeru. Rekombinantní OPG je tedy exprimován v OPG transgenických myších převážně jako dimerový protein a tato dimerová forma může být základem pro osteopetrotický fenotyp u OPG myší. OPG rekombinantní protein může rovněž existovat ve vyšší molekulární „trimemí“ formě.

io

Pro účely stanovení toho, zda hraje uvedených pět C-koncových cysteinových zbytků OPG nějakou roli při homodimerizaci, se myší OPG kodony pro cysteinové zbytky 195 (Cl95), C202, C277, C319 a C400 změnily výše popsaným způsobem na serin za použití sady QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, San Diego, CA). MuOPG gen se subklonoval mezi 15 Not I a Xbal místa pcDNA 3.1 (+) vektoru (Invitrogen, San Diego, CA). Výsledný plazmid pcDNA3.1-muOPG a mutagenní primery se ošetřily v přítomnosti deoxynukleotidů Piu polymerázou a následně se výše popsaným způsobem amplifikovaly v termocykleru. Alikvótní podíl reakční směsí se potom tepelným šokem transfektoval do kompetentní E. coli XLl-Blue a nakonec umístil na plotny. Plazmidová DNA z transformantů se následně sekvencovala za 20 účelem ověření mutací.

Následující příměrové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 195 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C195S proteinu:

1389-19:

5* -CAC GCA AAA GTC GGG AAT AGA TGT CAC-3' (SEQ ID NO:150)

1406-38:

5' -GTG ACA TCT ATT CCC GAC TTT TGC GTG-3' (SEQ ID NO:151)

Následující příměrové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 202 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C202S proteinu:

1389-21:

5' -CAC CCT GTC GGA AGA GGC CTT CTT C-3' (SEQ ID NO:152)

1389-22:

5' -GAA GAA GGC CTC TTC CGA CAG GGT G-3' (1389-22) (SEQ ID NO:153)

Následující příměrové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 277 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C277S proteinu:

-60CZ 292587 B6

1389-23:

5⁷ -TGA CCT CTC GGA AAG CAG CGT GCA-3' (SEQ ID NO:154)

1389-24:

5' -TGC ACG CTG CTT TCC GAG AGG TCA-3' (SEQ ID NO:155)

Následující primerové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 319 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C319S proteinu:

1389-17:

5' -CCT CGA AAT CGA GCG AGC AGC TCC-3⁷ (SEQ ID NO: 156)

1389-18:

5' -CGA TTT CGA GGT CTT TCT CGT TCT C-3' (SEQ ID NO:157)

Následující primerové páry se použily pro změnu kodonu pro cysteinový zbytek 400 na serin myšího OPG genu, vedoucí ke vzniku muOPG [22-401] C400S proteinu:

1406-72:

5⁷ -CCG TGA AAA TAA GCT CGT TAT AAC TAG GAA TGG-3⁷(SEQ ID NO:158)

1406-75:

5⁷ -CCA TTC CTA GTT ATA ACG AGC TTA TTT TCA CGG-3⁷ (SEQ ID NO:159)

Každý výsledný muOPG [22-401] plazmid obsahující příslušnou mutaci se následně transfekoval do humánních 293 buněk, a mutantní OPG-Fc fúzní protein se purifíkoval z kondiciovaného média výše popsaným způsobem. Biologická aktivita každého proteinu se stanovila pomocí testu in vitro tvorby osteoklastů, který bude popsán v příkladu 11. Kondiciované médium z každého transfektantu se analyzovala neredukční SDS-PAGE a westernovým přenosem anti-OPG protilátkami.

Mutace libovolného z pěti C-koncových cysteinových zbytků způsobuje produkci převážně (>90%) monomemích 55 kd OPG molekul. Z těchto výsledků vyplývá, že koncové cysteinové zbytky zastávají určitou roli při OPG homodimerizaci.

C-koncové OPG deleční mutace se konstruovaly do mapy úseku (úseků) OPG C-koncové domény, které jsou důležité pro OPPG homodimeraci. Ke konstrukci těchto OPG mutantů se použila PCR amplifíkace využívající primerů, které zavedly nezralé terminační signály pro

-61 CZ 292587 B6 ukončení translace do C-koncového úseku myšího OPG. Na iniciačním kodonu MuOPG (obsahujícím HindlII restrikční místo) se vyznačil 5' oligonukleotid a 3' oligonukleotid (obsahující terminační kodon a Xhol místo) za účelem úpravy C-koncového úseku muOPG zakončení buď na threoninovém zbytku 200 (CT200), prolinu 212 (CT212), kyselině glutamové 293 (CT5 293) nebo na šeřinu 355 (CT-355).

Následující primery se použily pro konstrukt muOPG [22-200]:

1091-39:

5' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA

AG-3' (SEQ ID NO:160)

1391-91:

5' -CCT CTC TCG AGT CAG GTG ACA TCT ATT CCA CAC TTT

TGC GTG GC-3' (1391-91) (SEQ ID NO:161)

Následující primery se použily pro konstrukt muOPG [22-212]:

1091-39:

5' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA

AG-3' (SEQ ID NO:162)

1391-90:

5' -CCT CTC TCG AGT CAA GGA ACA GCA AAC CTG AAG AAG

GC -3' (SEQ ID NO:163)

Následující primery se použily pro konstrukt muOPG [22-293]:

1091-39:

5' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA

AG-3' (SEQ ID NO:164)

1391-89:

5'- CCT CTC TCG AGT CAC TCT GTG GTG AGG TTC GAG TGG

CC-3' (SEQ ID NO:165)

Následující primery se použily pro konstrukt muOPG [22-355]:

1091-39:

5' -CCT CTG AGC TCA AGC TTC CGA GGA CCA CAA TGA ACA

AG-3' (SEQ ID NO:166)

1391-88:

5' CCT CTC TCG AGT CAG GAT GTT TTC AAG TGC TTG AGG GC-3' (SEQ ID NO:167)

-62CZ 292587 B6

Každý výsledný muOPG-CT plazmid obsahující příslušnou úpravu se následně transfektoval do humánních 293 buněk mutantního OPG-Fc fúzního proteinu, purifikovaného z výše popsaného kondiciovaného média. Biologická aktivita každého proteinu se zjišťovala in vitro pomocí testu tvorby osteoklastů, kteiý bude popsán v příkladu 11. Kondiciovaná média se rovněž analyzovala pomocí neredukční SDS-PAGE a westernového přenosu pomocí anti-OPG protilátek.

Úprava C-koncového úseku OPG ovlivňuje schopnost OPG tvořit homodimery. CT 355 je převážně monomemí, ačkoliv rovněž dochází k tvorbě určitého množství monomerů. CT 293 tvoří, jak se zdá, stejné molámí množství monomeru a dimerů a rovněž tvoří agregáty s vysokou molekulovou hmotností. Nicméně CT 212 a CT 200 jsou monomemí.

Příklad 10

Purifikace OPG

A. Purifikace savčích OPG-Fc fuzních proteinů

Pět litrů kondiciovaného média z 293 buněk exprimujících OPG-Fc fúzní protein se připravilo následujícím způsobem. Zmrazený vzorek buněk se nechal roztát v 10 ml 293S média (DMEM-vysoká glukóza, lx L-glutamin, 10% tepelně inaktivované fetální bovinní sérum (FBS) a 100 pg/ml hygromycinu) a následující den se tomuto vzorku poskytlo čerstvé médium. Po třech dnech se buňky rozdělily při naředění 1:10 a 1:20 do dvou TI75 buněk. Provedla se dvě další 1:10 dělení a rozdělila se do 200 baněk T175. Buňky se v tomto okamžiku, tj. pět dní po roztátí buněk, nechaly růst až do okamžiku, kdy dosáhly téměř souvislé vrstvy (přibližně tři dny), odsáním se zbavily se séra, a po promytí 25 ml PBS na baňku se do každé baňky přidalo 25 ml SF média (DMEM-vysoká glukóza, lx L-glutamin). Buňky se udržovaly tři dny na 5% CO2, potom se sklidily, odstředily a přefiltrovaly přes 0,45m filtry na bázi nitrátu celulózy (Coming).

OPG-Fc fúzní proteiny se purifíkovaly za použití sloupce Protein G Sepharose (Pharmacia) uvedeného do rovnovážného stavu v PBS. Velikost sloupce se lišila v závislosti na objemu výchozího média. Kondiciované médium, připravené výše popsaným způsobem, se zavedlo do sloupce, který se promyl PBS, a keluování čistého proteinu se použil lOOmM glycin pH2,7. Frakce se sebraly do zkumavek obsahujících 1M Tris pH 9,2 s cílem co nejrychleji tyto frakce neutralizovat. Frakce obsahující protein se sloučily, zahustily buď v Amicon Centricon 10 nebo Centriprep 10 a diafiltrovaly do PBS. Čistý protein se uskladnil při -80 °C.

Tímto postupem se purifíkovaly myší [22-401]-Fc, myší [22-180]-Fc, myší [22-194]-Fc, humánní [22-401]-Fc a humánní [22-201]Fc a rovněž myší [22—185]-Fc.

B. Příprava anti-OPG protilátek

Třem novozélandským bílým králíkům (počáteční váha 2 268 g až 3 629 g) se subkutánně injektoval muOPG[22-401]-Fc fúzní protein. Každý králík se imunizoval první den 50 pg antigenu emulgovaného ve stejném objemu Freundsova kompletního adjuvansu. Další posilovači dávky se aplikovaly stejným způsobem 14. a 28. den, přičemž kompletní adjuvans byl v případě těchto posilujících dávek nahrazen Freundsovým nekompletním adjuvansem. Titry protilátky se monitorovaly pomocí EIA. Po aplikaci druhé posilující dávky poskytla antiséra titry s vysokou hladinou protilátky a každému zvířeti bylo odebráno 25 ml krve. Sérum se nejprve vedlo přes afinitní sloupec, ve kterém byl imobilizován OPG-Fc. Anti-OPG protilátky se eluovaly pufrem, Pierce Gentle Elution Buffer, obsahujícím 1% ledovou kyselinu octovou. Eluovaný protein se následně dialyzoval do PBS a vedl přes Fc kolonu za účelem odstranění protilátek specifických pro Fc část OPG fúzního proteinu. Běh přes frakce obsahující anti-OPG specifické protilátky se dialyzoval do PBS.

-63CZ 292587 B6

C. Purifikace myšího OPG [22-401 ]

Chromatografická afinita protilátek

Afinitní purifikované anti-OPG protilátky se diafiltrovaly do vazebného pufru (0.1M uhličitan sodný, pH 8,3, 0,5M NaCl) a mísily dvě hodiny při pokojové teplotě s CNBr-aktivovanými sepharózovými kuličkami (Pharmacia). Pryskyřice se před dvouhodinovou blokací neobsazených míst 1M ethanolaminem (pH 8,0), při pokojové teplotě, promyla větším množstvím vazebného pufru. Pryskyřice se následně promyla roztokem s nízkým pH (0,lM octanu sodného pH 4,0, 0,5M NaCl) a následně promývacím roztokem s vysokou hodnotou pH (0,lM Tris-HCl pH 8,0, 0,5M NaCl). Poslední průplachy se třikrát zopakovaly. Pryskyřice se nakonec, před tím než se naplnila do kolony, uvedla do rovnovážného stavu pomocí PBS. Slepá eluce se provedla za použití 0,lM glycin-HCl, pH 2,5, a kolona se následně opět uvedla do rovnovážného stavu pomocí PBS.

Do sloupce se následně při nízké zaváděcí rychlosti aplikovalo kondenzované kondiciované médium z CHO buněk, exprimujících muOPG[22-401]. Kolona se promývala PBS, dokud se měřená UV absorbance při 280 nm nevrátila na výchozí úroveň. Protein se z kolony eluoval nejprve 0,lM glycinem-HCl (pH 2,5), potom se uvedl do rovnovážného stavu pomocí PBS a eluoval druhým pufrem (0,lM CAPS, pH 10,5), 1M NaCl). Uvedené dva eluční odběry se samostatně diafiltrovaly do PBS a před zmrazením na -20 °C sterilně filtrovaly.

Konvenční chromatografie

Kondiciované médium CHO buněk se 23krát zahustilo ve spirálově vinuté patroně Amicon (S10Y10) a diafiltrovalo do 20mM Tris pH 8,0. Diafiltrované médium se následně aplikovalo na Q-sepharosový HP (Pharmacia) sloupec, který se uvedl do rovnovážného stavu 20mM Tris pH 8,0. Sloupec se následně promýval, dokud absorbance při 280 nm nedosáhla opět základní linie. Protein se eluoval dvaceti objemy sloupce eluční soustavy tvořené gradientem 0 až 300mM NaCl v Tris pH 8,0. OPG protein se detekoval pomocí westernového přenosu frakcí eluovaných ze sloupce.

Frakce obsahující OPG se sloučily a doplnily do konečné koncentrace 300mM NaCl, 0,2mM DTT. NiNTA superosový (Qiagen) sloupec se uvedl do rovnovážného stavu 20mM Tris pH 8,0, 300mM NaCl, 0,2mM DTT a následně se do sloupce zavedly sloučené frakce. Sloupec se promýval vyrovnávacím pufrem dokud se opět nedosáhlo základní absorbance. Proteiny se ze sloupce eluovaly 0 až 30mM imidazolovým elučním gradientem ve vyrovnávacím pufru. Zbývající proteiny se ze sloupce vymyly 1M imidazolem. Pro detekci frakcí obsahujících OPG se opět použil westernový přenos.

Sloučené frakce z NiNTA sloupce se dialyzovaly do lOmm fosforečnanu draselného pH 7,0 aO,2mM DTT. Dialyzovaná frakce se následně zavedla do keramického hydroxyapatitového sloupce (Bio-Rad), který se následně uvedl do rovnovážného stavu pomocí lOmM fosfátového pufru. Po promytí sloupce se protein eluoval objemem 10 až lOOmM elučním gradientem fosforečnanu draselného, kteiý představoval dvacetinásobek objemu sloupce. Potom následovala eluce stejným množstvím elučního 100 až 400 mM gradientu fosforečnanu.

OPG se detekoval zabarvením SDS-polyakrylamidových gelů modří coomassie a westernovým přenosem. Frakce se po sloučení diafiltrovaly do PBS a zmrazily na-80 °C. Purifikovaný protein měl formu monomeru a v této formě zůstal i po diafiltraci do PBS. Tento monomer je stabilní, pokud se skladuje ve zmrazeném stavu nebo při pH 5 při 4 °C. Nicméně pokud se skladuje při 4 °C v PBS, po jednom týdnu, jak se zdá, vytvoří dimery, trimery a tetramery.

-64CZ 292587 B6

D. Purifíkace humánního OPG met[22^l0 1 ] z E. coli

Bakteriální buněčná pasta se za použití nízkostřižného homogenizéru při 5 °C suspendovala do 10 mM EDTA, do koncentrace 15 % (hm./obj.). Buňky se následně rozrušily dvojitou homogenizací při 5 °C a 103,35 MPa. Výsledný homogenizovaný vzorek se odstřeďoval jednu hodinu při 5 °C a při 5 000 x g. Odstředěné pelety se vymyly nízkostřižnou homogenizací do vody při původním homogenizačním objemu a následně odstřeďovaly jako v předchozím případě. Promyté pelety se následně solubilizovaly 30 minut při pokojové teplotě do 15 % (hm./obj.) roztokem (konečná koncentrace) 6 M guanidin HC1, 10 mM dithiothreitolu, 10 mM TrisHCl, pH 8,5. Tento roztok se 30krát naředil 2 M močovinou, obsahující 50 mM CAPS, pH 10,5, 1 mM redukovaného glutathionu a následně 72 hodin míchal při 5 °C. OPG se purifikoval z tohoto roztoku, při 25 °C, nejprve nastavením pH hodnoty pomocí kyseliny octové a následně chromatografií přes sloupec SP-HP Sepharosy, který se uvedl do rovnovážného stavu pomocí 25 mM octanu sodného, pH 4,5. Sloupcová eluce se prováděla dvaceti objemy sloupce 50 mM až 550 mM lineárním gradientem chloridu sodného ve stejném pufru, při rychlosti proudění 0,1 objemu sloupce/minutu. Horní frakce, obsahující pouze požadovanou OPG formu, se odebraly a skladovaly při 5 °C nebo se pomocí pufru převedly do fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku, zahustily ultrafíltrací a následně skladovaly při 5 °C. Tento materiál se analyzoval HPLC s reverzní fází, SDS-PAGE. limulus amebocytlyzátovým testem pro ověření přítomnosti endotoxinu a sekvencování N-konce. Kromě toho lze pro určení sbalené povahy proteinu použít i další techniky, například hmotovou spektrometrií, test pH/teplotní stability, fluorescenční test, cirkulámí dichroismus, diferenciální rastrovací kalorimetrii a testy na bázi profilace proteázy.

Příklad 11

Biologická účinnost rekombinantního OPG

Z histologických a histomorfometrických výsledků vyplývá, že hepatické přeexprimování OPG v transgenických myších značně snížilo počet osteoklastů, což způsobilo podstatné zvýšení kostní tkáně (viz například 4). Pro lepší pochopení potenciálního mechanizmu (mechanizmů) tohoto in vivo účinku se analyzovaly různé formy rekombinantního OPG na in vitro kultivačním modelu tvorby osteoklastů (test tvorby osteoklastů). Tento kultivační systém, který původně navrhl Udagawa (Udagawa a kol. Endocrinology 125. 1805-1813 (1989), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 7260-7264 (1990)), využívá kombinaci buněk kostní dřeně a buněk z buněčných linií podpůrné vazivové tkáně kostní dřeně. Popis modifikace tohoto kultivačního systému, použitého v rámci těchto studií, byl již veřejně publikován (Lacey a kol. Endocrinology 136, 2367-2376 (1995)). Při provádění tohoto způsobu se buňky kostní dřeně, které se získaly výplachem ze stehenní a holenní kosti myší, kultivovaly přes noc v kultivačním médiu (alfa MEM s 10% tepelně inaktivovaným fetálním bovinním sérem) obohaceném 500U/ml CSF-1 (kolonii stimulujícím faktorem 1, rovněž označovaným jako M-CSF), tj. hematopoietickým růstovým faktorem specifickým pro buňky monocytově-makrofágové rodinné linie. Po ukončení inkubace se odebraly buňky, které nepřilnuly, a podrobily se gradienční purifikaci a následně opět kultivovaly spolu s buňkami z buněčné linie ST2 kostní dřeně (1 x 10⁶ neadherentních buněk: 1 x 10⁵ ST2 buněk/ml média). Toto médium je obohaceno dexamethasonem (100 nM) a biologicky aktivním metabolitem vitaminu D3, známým jako 1,25 dihydroxyvitamin D3 (1,25 (OH)2 D3, 10 nM). Pro zlepšení osteoklastového zobrazení se do některých kultur přidal prostaglandin E2 (250 nM). Ko-kultivační perioda se zpravidla pohybuje v rozmezí od 8 do 10 dní a každé 3 až 4 dny se přidávalo čerstvé médium se všemi dodatkovými přísadami. V různých intervalech se kultury použily pro ověření přítomnosti vinan rezistentní kyselinové fosfatázy (TRAP) buď za použití histochemického barviva (Sigma Kit # 387A, Sigma, St. Louis, MO) nebo pomocí testu TRAP roztoku. TRAP histochemická metoda umožňuje fenotypickou identifikaci osteoklastů, což jsou vícejademé (> 3 jádra) buňky, které jsou rovněž TRAP+. Podstatou testu roztoku je štěpení kultur, obsahujících osteoklasty, v citrátovém pufru (100 mM, pH 5,0), který obsahuje 0,1% Triton X-100. Aktivita vinanově rezistentní kyselinové fosfatázy se

-65CZ 292587 B6 následně stanovila na základě konverze p-nitrofenylfosfátu (20 mM) na p-nitrofenol v přítomnosti 80 mM vinanu sodného, který se objevil během tří- až pětiminutové inkubace, při pokojové teplotě. Reakce se ukončila přidáním NaOH do konečné koncentrace 0,5 M. Změřila se optická hustota při 405 nm a výsledky se vynesly do grafu.

Předcházející studie (Udagawa a kol., tamtéž) prováděné za použití testu tvorby osteoklastů ukázaly, že buňky exprimují receptory pro ^,25I-kalcitonin (autoradiografie) a vytváří důlky v povrchu kostí, a pokud se zkombinují s TRAP pozitivitou potvrzují, že vícejademé buňky mají osteoklastový fenotyp. Dalším důkazem podpory osteoklastového fenotypu vícejademých buněk, který se získal při in vitro testu tvorby osteoklastů je to, že buňky exprimují αν a β3 integriny imunocNtochemií a kalcitoninový receptor a TRAP mRNA hybridizací in šitu (ISH).

HuOPG [22—401]—Fc fuze se purifíkovala z CHO buněk kondiciovaného média a následně použila při testu tvorby osteoklastů. Při 100 ng/ml huOPG [22—401]-Fc byla tvorba osteoklastů inhibována v podstatě stoprocentně (obr. 19A). Hladiny TRAP, měřené v lyžovaných kulturách v jamkách mikrotitrační plotny, byly rovněž inhibovány v přítomnosti OPG s ID₅₀ přibližně 3 ng/ml (obr. 20). Zdálo se, že hladina TRAP aktivity v lyzátech koreluje s relativním počtem osteoklastů, zjištěných pomocí TRAP cytochemie (porovnání obr. 19A až 19G a 20). Purifikované humánní IgGl a TNFbp se rovněž analyzovaly na tomto modelu a zjistilo se, že nemají inhibiční ani stimulační účinky, z čehož vyplývá, že inhibiční účinky huOPG [22-401]Fc jsou účinky způsobené OPG částí fúzního proteinu. Stejným způsobem se analyzovaly i další formy humánních a myších molekul a získané kumulativní výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1.

Tabulka 1

Účinky různých OPG forem na in vitro tvorbu osteoklastů

OPG konstrukt Relativní bioaktivita in vitro

muOPG [22—401]-Fc	+++
muOPG [22—194]—Fc	+++
muOPG [22-195]-Fc	++
muOPG [22-180]-Fc	-
muOPG [22—401]	+++
muOPG [22-401] C195	+++
muOPG [22-401] C202	+
muOPG [22-401] C277	-
muOPG [22-401] C319	+
muOPG [22—401] C400	+
muOPG [22—185]	-
muOPG [22-194]	++
muOPG [22-200]	++
muOPG [22-212]	-
muOPG [22—293]	+++
muOPG [22-355]	-H-+
muOPG [22-401]-Fc	+++
muOPG [22-201]-Fc	+++
muOPG [22-401]-Fc P26A	+++
muOPG [22-401]-Fc Y28F	+++
muOPG [22—401 ]	+++
muOPG [27—401]—Fc	++
muOPG [29-401]-Fc	++
muOPG [32-401]-Fc	+/-

-66CZ 292587 B6 +++, EDjo ~ 0.4-2 ng/ml ++, ED₅₀ = 2-10 ng/ml +, ED₅₀ = 10-100 ng/ml -, ED₅₀ > 100 ng/ml

Z výše uvedených souhrnných dat vyplývá, že myší a humánní OPG aminokyselinové sekvence 22-401 jsou plně aktivní in vitro jak ve formě nekondenzované na Fc doménu, tak v nenakondenzované formě. Inhibují dávkově dependentním způsobem a při dávkách 2 až 10 ng/ml vykazují poloviční až maximální aktivitu. Úprava myšího C-konce na threoninovém zbytku 180 inaktivuje molekulu, zatímco úpravy na cysteinu 185 a dále zachovávají plnou aktivitu. Cysteinový zbytek v poloze 185 je předurčen pro tvorbu SS3 vazby v doménovém 4. úseku OPG. Odstranění tohoto zbytku v dalších TNFR-příbuzných proteinech již dříve ukázalo inhibici biologické aktivity (Yan a kol., J. Biol. Chem. 226, 12099-12104 (1994)). Naše zjištění, že muOPG[22-180]-Fc je inaktivní zatímco muOPG[22-185]-Fc je aktivní, odpovídá dřívějším zjištěním. Z toho vyplývá, že aminokyselinové zbytky 22-185 definují oblast OPG aktivity.

Výsledky testů tvorby osteoklastů rovněž ukazují, že stejně jako transgenicky exprimovaný OPG rovněž rekombinantní OPG protein potlačuje tvorbu osteoklastů. Experimenty analyzující objevení TRAP+ buněk, β3+ buněk, F480+ buněk v kulturách kontinuálně vystavených OPG ukázaly, že OPG blokuje objevení TRAP+ a β3+ buněk ale nikoliv F480+ buněk. Na druhou stranu, TRAP+ a β3+ buňky se začaly objevovat čtyři dny potom, co se kultura objevila v kontrolních kulturách. V kulturách ošetřených OPG lze nalézt pouze F480+ buňky a zdá se, že jsou přítomny v kvantitativně stejném počtu jako v kontrolních kulturách. Zdá se tedy, že mechanizmus OPG, působící in vitro, se podílí na blokaci diferenciace osteoklastů v kroku zahrnujícím vznik monocyto-makrofágů, ale před vznikem buněk exprimujících buď TRAP nebo β3 integriny. Tato zjištění souhrnně ukazují na to, že OPG nenarušuje obecný růst a diferenciaci monocyto-makrofágových prekurzorů kostní dřeně, ale spíše vede k závěru, že OPG specificky blokuje selektivní diferenciaci osteoklastů z monocytomakrofágových prekurzorů.

K přesnější časové specifikaci okamžiku, ve kterém se OPG v průběhu diferenciace osteoklastů projevuje jako inhibitor, se použila variace in vitro kultivační metody. Tato variace, kterou popsal Lacey a kol., viz níže, využívá jako osteoklastové prekurzory makrofágy kostní dřeně. Osteoklastové prekurzory se získají odebráním neadherentních buněk kostní dřeně po celonoční inkubaci v CSF-l/M-CSF, a kultivací těchto buněk po dobu dalších čtyř dní 1 000 až 2 000 U/ml CSF-1. Po čtyřech dnech kultivace, tj. růstové fáze, se odstranily neadherentní buňky. Adherentní buňky, kterými jsou makrofágy kostní dřeně, mohou být následně vystaveny maximálně na dva dny různým ošetřením v přítomnosti 1000 až 2000 U/ml CSF-1. Tato dvoudenní perioda se označuje jako střední diferenciační perioda. Potom se buněčné vrstvy opět nechají růst a na alespoň osm dní se následně přidají ST-2 buňky (1 χ 10⁵ buněk/ml), dexamethason (100 nM) a 1,25 (OH)2 D3 (10 nM). Tato časová perioda se označuje jako konečná diferenciační perioda. Analytická činidla se mohou podávat rovněž během této konečné diferenciační periody. Během konečné diferenciační periody se rovněž získají fenotypové markéry osteoklastové diferenciace (Lacey a kol., tamtéž).

Vliv huOPG [22-401]—Fc (100 ng/ml) na tvorbu osteoklastů se na tomto modelu analyzoval přidáním tohoto fúzního peptidu buď během střední nebo konečné diferenciační periody nebo alternativně v průběhu obou těchto period. Provedly se oba testy, jak TRAP cytochemický tak TRAP roztokový test. Výsledky TRAP roztokového testu jsou znázorněny na obr. 21. HuOPG [22-401]-Fc inhibuje vznik TRAP aktivity, pokud se přidají jak do střední tak do konečné diferenciační fáze nebo do obou těchto fází. Pokud se přidal do střední fáze a následně z kultur odstranil vypláchnutím, potom huOPG [22-401]—Fc vznik TRAP aktivity vlyzátech kultury neblokoval. Cytochemické výsledky byly paralelou údajů získaných roztokovým testem. Z výsledků všech těchto testů vyplývá, že pro uplatnění všech supresivních účinků

-67CZ 292587 B6 huOPG [22-401]-Fc na tvorbu osteoklastů je důležitá jeho přítomnost během konečné diferenciační periody.

B In vivo ILl-α a ILl-β imunologické experimenty

IL1 zvyšuje kostní resorpci, jak systemicky tak místně, pokud se injektuje subkutánně přes myší kalvu (Boyce a kol., Endocrinology 125, 1142-1150 (1989)). Systemické účinky lze odvodit ze stupně hyperkalcemie a lokální účinky lze stanovit histologicky, zjišťováním relativní hodnoty osteoklasty mediované odpovědi. Cílem těchto experimentů bylo určit zda může rekombinantní muOPG [22-401]-Fc modifikovat lokální a/nebo systemické účinky IL1, pokud se injektuje subkutánně, přes oblast kalvy, jako v případě IL1.

IL1—β experiment

Samečci myší (ICR Swiss white), staří čtyři týdny, se pro účely ošetření rozdělili do následujících skupin (pět myší na skupinu). Kontrolní skupina: IL1 ošetřená zvířata (myším se aplikovala jedna injekce 2,5 pg IL1—β denně); skupina zvířat ošetřených nízkou dávkou muOPG [22-401]-Fc (myším se aplikovaly tři injekce 1 pg muOPG [22-401]-Fc denně); skupina myší ošetřená nízkou dávkou muOPG [22-401]-Fc a ILl-β; skupina zvířat ošetřených vysokou dávkou muOPG [22-401 ]—Fc (myším se aplikovaly tři injekce 10 pg muOPG [22-401 ]—Fc denně); a skupina myší ošetřená vysokou dávkou muOPG [22-401]-Fc a ELl-β. Všechny myši přijaly stejný celkový počet injekcí buď aktivního faktoru nebo vehikula (0,1% albumin bovinního séra ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku). Zvířata ze všech skupin se následující den po poslední injekci utratila. Hmotnost a hladina ionizovaného vápníku v krvi se stanovila před aplikací první injekce, čtyři hodiny po aplikaci druhé injekce a 24 hodin po třetí IL1 injekci, a poslední měření se provedlo bezprostředně před utracením zvířat. Po utracení zvířat se zvířatům odebrala kalva, která se dále zpracovala pro účely parafinového dělení.

ILl-α experiment

Samečci myší (ICR Swiss white), staří čtyři týdny, se pro účely ošetření rozdělili do následujících skupin (pět myší na skupinu). Kontrolní skupina: ILl-alfa ošetřená zvířata (myším se aplikovala jedna injekce 5 pg ILl-α denně); skupina zvířat ošetřených nízkou dávkou muOPG [22-401]-Fc (myším se aplikovala jedna injekce 10 pg muOPG [22—401]—Fc denně); skupina myší ošetřená nízkou dávkou muOPG [22-401]-Fc a ILl-α (dávkování viz výše); skupina zvířat ošetřených vysokou dávkou muOPG [22-401]-Fc (myším se aplikovaly tři injekce 10 pg muOPG [22-401]—Fc denně); a skupina myší ošetřená vysokou dávkou muOPG [22-401]-Fc a ILl-α. Všechny myši přijaly stejný celkový počet injekcí buď aktivního faktoru nebo vehikula. Zvířata ze všech skupin se následující den po poslední injekci utratila. Hladina ionizovaného vápníku v krvi se stanovila před aplikací první injekce, čtyři hodiny po aplikaci druhé injekce a 24 hodin po třetí IL1 injekci a poslední měření se provedlo bezprostředně před utracením zvířat. Hmotnost zvířat se stanovila před aplikací první injekce, čtyři hodiny po aplikaci druhé injekce a 24 hodin po třetí IL1 injekci, a poslední měření se provedlo bezprostředně před utracením zvířat. Po utracení zvířat se zvířatům odebrala kalva, která se dále zpracovala pro účely parafinového dělení.

Histologické metody

Kalvariální kostní vzorky se fixovaly formalinem zinku, dekalcifikovaly v kyselině mravenčí, dehydratovaly ethanolem a tvářely v parafinu. Řezy (5 pm silné) se vedly kalvou vedle lambdového švu a zabarvily buď hematoxylinem a eosinem nebo se zreagovaly pro účely vinan rezistentní kyselinofosfatázové aktivity (Sigma Kit# 387A) a zabarvily protilátkou hematoxylinem. Kostní resorpce se hodnotila u ILl-α ošetřených myší histomorfometrickými metodami za použití osteohodnoty (Osteimetrics, Atlanta, GA) sledováním histologických znaků na desce

-68CZ 292587 B6 digitizátoru za použití mikroskopu, k jehož okulárové části je pomocí příslušného nástavce přimontována kamera. V hlavních dřeňových prostorech kalvariální kosti se určil počet osteoklastů, povrchy potažené osteoklasty a erodované povrchy. Injektované a neinjektované strany kalvy se měřily samostatně.

Výsledky

ILl-α a IL1—β produkoval při použitých dávkách hyperkalcemii, zejména druhý den, pravděpodobně v důsledku systemické indukce zvýšené kostní resorpce. Hyperkalcemická odezva byla u ILl-beta ošetřených myší blokována muOPG [22—401]—Fc a u ILl-alfa ošetřených myší byla značně zmírněna. Tento účinek se projevil nejzřetelněji druhý den (obrázek 22A až 22B).

Histologická analýza kalvy myší ošetřených ILl-α a ILl-β ukazuje, že ošetření samotným IL1 produkuje podstatné zvýšení indikace kostní resorpce zahrnující: počet osteoklastů, osteoklasty vystlaný povrch a erodovaný povrch (povrchy, které jsou vroubkované v důsledku působení osteoklastů (obr. 23B, tabulka 2). V odezvě na ILl-α nebo ILl-β bylo zvýšení kostní resorpce na injektované a neinjektované straně kalvy v podstatě stejné. Muopg [22-401]-Fc injekce redukují kostní resorpci jak u myší ošetřených ILl-α a ILl-β tak u myší přijímajících samotné vehikulum, nicméně tuto redukci bylo možné pozorovat pouze na stranách kalvy injektovaných muopg [22-401]-Fc.

Nejpravděpodobnějším vysvětlením pro tato pozorování je to, že muOPG [22—401]—Fc inhiboval kostní resorpci. Tento závěr se opírá o zjištěnou redukci celkového počtu osteoklastů a procento kostního povrchu, na němž může probíhat kostní resorpce v oblasti kalvy sousedící s muOPG [22—401]-Fc injekčními místy. Zdá se, že působení muOPG [22-401]-Fc je spíše lokální, jak ukázala histologie, ale ze skutečnosti, že muOPG [22-401]—Fc rovněž tlumí IL1-indukovanou hyperkalcemii, vyplývá, že muOPG [22-401]-Fc má mnohem mírnější vliv na systemické pojetí kostní resorpce.

-69CZ 292587 B6

Tabulka 2

Vliv OPG na proměnné kostní resorpce u IL-1 injektovaných myší

cn

10

σι

00

CM

4tí c (tí

CN

o

CO

ςο

03

co

xr

X

c-

X

H

m

Xí*

X

CN

10

cn

o

to.

•to

CN

o

ΓΊ

>

rH

m

Γ'

cn

o

+1

+J

+1

4->

ctí

+1

fj

cn

o

LQ

LD

Φ

cd

o

(Tt

XT

rH

cn

r-

co

tn

•3

UD

co

CN

X

o

X

4J

X

r—

X

CN

LD

W

β

-P

cn

o

m

XJ*

co

O

CN

ÍD

<o ·

H

co

CM

co

«—l

4fc

lO

rH

=tt=

rH (J X ·

|

σι

C-

n tn

ttí > O

σι

cn

xt

r-l

cn

Φ

o

t-

o

CN

σι

o

rH

X

4-> +1

(tí

X rH

X 00

X rH

X LP

X cn

co

X Xí*

04 xr

ω

4-í

a

rH

cn

CN

O Li

34

<tí

+1

><D

(1)

LI

+1

4J e Φ <3 >O Li

’ΓΊ 4-J cí co

rH LD

o co

<n r-

OJ xí*

CN r-

o LD X

co CN

o rH X

X

n

LD

O SX

Φ

CN

rH

CN

σι

rH

04

’Χ*

cu

z

G

cn

r-

cn

CO

m

rH

t-

rH

β

00

CN

cn

00

CN

00

cn

m

co

00

<•0

X

rH

X

rH

X

Γΰ

rH

o

LD

10

X

CN

X

co

3 x: o

>

x

rH

X

m

cn

ο

cn

+1

4J

(0

+1

+s

+1

y

r·

Xí*

ω

M

Φ

<tí Lt

m

σ>

cn

O

σι

cn

>

m

tí)

σι

o

CN

X

o 3

•n

r-

X

rH

m

•to

X

χφ

n ri 0

β

-P

X

c*

X

CN

o

rH

xt«

CN

•

H

co

σι

<n

xT

=#:

rH

xr

*

tífc

O H

o

A >

•

1

'Φ o β SX

<Z)

ttí >

co

cn

Xí*

LD

xr

+1

<0

o

CM

cn

LD

o

CN

íO

0

cn

X

cn

X

> o

4->

C

•to

xr

X

co

tn

in

^3*

σι

O A

34

<0

m

+1

Xí*

Ό Ή

>Φ

Φ

Ll

07 ±

73 ±

+1

Ή

+1

-H

+1

O C D 4-> Φ to

•r~i 4-> C co H

LP LP ·*

ΓΟΟ X

ΓΙΟ X

rH LQ

,55

V£> LP

o

SX

Φ

'(0

X

o

X

XJ*

CN

r-

rH

cn

<*> 34

z

β

ω

XT*

σι

xí*

rH

cn

rH

cn

3 A

LP

o

c—

Ό

Xí*

4* cn

O

10

rH

LD

iT)

σι

Γ-

m

X

M

xr

X

<0

X

cn

> o SX

!>

X

CM

X

CN

tri

CN

O

CM

rH

+1

4J

(0

+1

Λί

f*

+1

cn

Φ

nj L4

O

CN

m

co

CO

co

o

xr

X3*

Xí*

X

σι

xr

CN

X

x;

•m

m

X

o

cn

X

Γ-

'Φ +J > co

..

β

P

X

o

X

rH

cn

Xí*

rH

(—(

co

σι

rH

cn

«:

rH

CN

4fc

o o

o

4J 34

•

1 >

10 <ú 2

co

Xí*

o

rH

LD

CN

xr

O

+1

<0

XT

cn

t-

Xí*

CN

00

O

00

H Xí

o

X

34 O

JJ

β

cn

rH

cn

CN

XT*

xr

rH

00

O Li

34

(tí

Φ t> >φ

Φ

LI

+1

-H

H

+1

4-> O W Cb O

e •3 Lc

Ό -P £ co •H

C0 cn X

00 rH X

CN «Η X

rH LP X

10 tn

rH CO X

O •N·

00 m

«1

SX

Φ

'(0

CN

r-

o

co

rH

00

Xí*

σι

c*> β

z

β

rH

H

rH

CM

rH

CN

r4

>**X

Ό

4J

Ό

CM

Ό

x

tn

β Φ

T?

s

GX

P c

Nj

±L

s

a

β

x

l

Φ

β

m

Γ

•rl

rH

S

o

rH

A

o

rH

μ

p

Cd

xí*

•3

p

xr

A

Ll

****

A

LI

tí

H

Φ

4J

1

tn

i

w

4-J

T

+

Q<

β

rH

X

Ml

β

Λ

w

ri

CN

Cu o

Ěu O

a

A H

& o

# Rozdíl proti neinjektované straně p < 0,05 (t test dvojic)

-70CZ 292587 B6

C. Systemické účinky muOPG [22-401]-Fc u rostoucích myší

Tří- až čtyřtýdenní samečci myši BDF1 s hmotností 9,2 až 15,7 g se rozdělili do skupin po deseti myších. Potom se myši injektovaly subkutánně fyziologickým roztokem nebo muOPG [22—401 ΙΡο 2,5mg/kg bid po dobu čtrnácti dní (5 tng/kg/den). Myši se radiografovaly před ošetřením a sedmý a čtrnáctý den po ošetření. 24 hodin po poslední injekci se myši utratily. Odňala se jim pravá stehenní kost, fixovala ve formalinu zinku, dekalciovala v kyselině mravenčí a zapouzdřila v parafínu. Řezy se vedly střední oblastí distální femorální metafýzy a střední částí stehenní kosti. Hustota kosti se určila histomorfometricky v šesti sousedících oblastech, počínaje metafyzálním hraničním plátem růstové destičky přes primární a sekundární spongiózu až po femorální diafýzu (střední část kosti). Všechny oblasti měly rozměr 0,5 x 0,5 mm².

Radiografícké změny

Po sedmidenním ošetřování se ve spongióze spojené s růstovými destičkami myší ošetřených OPG objevila zóna se zvýšenou hustotou kosti, v porovnání s kostní hustotou, která byla pozorována v této oblasti u kontrolních myší. Účinky se projevily zejména v distální femorální aproximální tibiální metafázi (obr. 24A až 24B). Nicméně pásy zvýšené hustoty se rovněž objevily ve vertebrálních tělech, na iliakální hraně a distálním tibiu. Po čtrnácti dnech se oblasti neprůhlednosti rozšířily dále do střední části femorální a tibiální kosti, avšak pokud jde o intenzitu radio-neprůhlednosti, ta se snížila. Po ukončení experimentu nebyly navíc zjištěny žádné rozdíly v délce středních částí femorálních a tibiálních kostí nebo změny v délce těchto kostí, ke kterým by došlo v průběhu experimentu, z čehož vyplývá, že OPG neovlivňuje růst kostí.

Histologické změny

Distální femorální metafyza vykazuje zvýšenou hustotu kosti v oblastech 1,1 až 2,65 mm vzdálených od růstové destičky (obr. 25 a 26A až 26B). To je oblast v těle myší, ze které je kost rychle odstraňována osteoklastymediovanou kostní resorpcí. U těchto rychle rostoucích mladých myší zvýšení hustoty kosti v této oblasti, pozorované při OPG ošetření, odpovídá inhibici kostní resorpce.

D. Účinky osteoprotegerinu na ztrátu kostní hmoty indukovanou ovariektomií u krys

Dvanáctitýdenní samičky krysy Fisher se podrobily ovariektomií (OVX) nebo stejnému operačnímu zákroku bez vyjmutí vaječníků a provedla se u nich dvě měření absorpční fotometrie rentgenového záření (DEXA), jejichž úkolem bylo určit hustotu kostní hmoty v disální femorální metafýze. Po třídenní rekonvalescenci se zvířatům denně aplikovaly po dobu čtrnácti dní injekce podle následujících schémat: deset stínově operovaných zvířat dostalo vehikulum (fosfátem pufrovaný fyziologický roztok); deseti OVX zvířatům se podalo vehikulum (fosfátem pufrované vehikulum); šesti zvířatům se podal OPG-Fc 5 mg/kg SC; šesti OVX zvířatům se podal pamidronát (PAM) 5 mg/kg SC; šesti OVX zvířatům se podal estrogen (ESTR) 40 pg/kg SC. Po sedmi až čtrnáctidenním ošetřování zvířat se změřila pomocí DEXA hustota kostní hmoty. Dva dny po poslední injekci se zvířata usmrtila a odebrala se jim pravá tibiální a femurální kost pro účely histologického hodnocení.

DEXA měření hustoty kostní hmoty ukázala na tendenci řídnutí kostní hmoty v důsledku ovariektomie, které bylo blokováno OPG-Fc. Tyto vlivy jsou v podstatě shodné s vlivy známých antiresorpčních činidel, estrogenu a pamidronátu (obr. 27). Histomorfometrická analýza potvrdila pozorování, že při OPG-Fc léčení byla produkce kostní hmoty podstatně větší u OVX krys než produkce kostní hmoty, kterou bylo možné sledovat u neošetřených OVX krys (obr. 28). Tyto výsledky potvrzují aktivitu OPG při ztrátě kostní hmoty, která souvisí s nedostatkem endogenního estrogenu po ovariektomií.

-71 CZ 292587 B6

Souhrn in vivo

Účinky rekombinantního OPG in vivo jsou paralelou změn, sledovaných u OPG transgenických myší. Redukce počtu osteoklastů, pozorovaná u OPG transgenických myší, se reprodukuje 5 injektováním rekombinantního OPG lokálně přes kalvu jak normálních myší tak myší ošetřených

ILl-α nebo ILl-β. OPG transgenické myši vyvinuly osteopetrotický fenotyp s progresivním plněním dřeňové dutiny kostní hmotou a s nepřemodelovanou chrupavkou, vybíhající z růstových plotýnek od prvního dne po narození. U normálních třítýdenních (rostoucích) myší rovněž vedla OPG ošetření k retenci kosti a nepřemodelované chrupavky v oblastech tvorby endochondrální 10 kosti. Tento účinek se sledoval radiograficky a byl potvrzen histologicky. Rekombinantní OPG tedy u normálních zvířat vyvolává fenotypové změny podobné změnám, které lze pozorovat u transgenických zvířat a tyto změny odpovídají OPG-indukované inhibici kostní resorpce. Na základě výsledků in vitro testů, sledujících tvorbu osteoklastů, se zjistilo, že k podstatné části inhibice dochází v důsledku narušení tvorby osteoklastů. V souladu s touto hypotézou OPG 15 blokuje ovariektomií-indukovanou osteoporózou u krys. Je známo, že ztráta kostní hmoty u tohoto modelu je mediovaná aktivovanými osteoklasty, z čehož vyplývá role, kterou má OPG při ošetření primární osteoporózy.

Příklad 12

Pegylace derivátů OPG

Příprava N-koncových PEG-OPG konjugátů redukční alkylací

HuOPG met [22-194] P25A tvořil pufr, který se přemístil do 25 až 50 mM NaOAc, pH 4,5 až 4,8 a zahustil na 2 až 5 mg/ml. Tento roztok se použil pro provádění OPG redukční alkylace s monofunkčními PEG aldehydy při 5 až 7 °C. PEG monofunkční aldehydy, lineární nebo větvené, ΜΗ = 1 až 57 kDa (dostupný od společnosti Shearwater Polymers), se přidaly do OPG 30 roztoku jako pevné látky v množstvích 2 až 4 moly PEG aldehydu na mol OPG. Po rozpuštění polymeru v proteinovém roztoku se přidal kyanoborohydrid sodný v množství, které poskytlo konečnou koncentraci 15 až 20 mM v reakční směsi z 1 až 1,6 M čerstvě připraveného zásobního roztoku ve studené Dl vodě. Vývoj reakce a rozsah OPG pegylace se monitoroval velikostně vylučovací HPLC na G3000SW_XL koloně (Toso Haas) eluované 100 mM NaPO4, 0,5 M NaCl, 35 10% ethanolem, pH 6,9. Reakce se zpravidla nechala probíhat 16 až 18 hodin, načež se 6 až 8krát naředila a pH se snížila na 3,5 až 4. Reakční směs se frakcionalizovala iontoměničovou chromatografií (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia), při které se eluovala 20 mM NaOAc pH4 s lineárním gradientem do 0,75M NaCl během 25 objemů kolony a při rychlosti proudění 30 cm/hod. Frakce mono-, di- nebo poly-pegylátovaného OPG se sebraly a charakterizovaly 40 pomocí SEC HPLC a SDS-PAGE. N-koncovým sekvencováním se zjistilo, že monoPEG-OPG konjugátem, ve většině případů hlavním reakčním produktem, byl 98% N-koncově PEG-modifíkovaný OPG.

Tento postup se zpravidla použil pro přípravu následujících N-koncových PEG-OPG konjugátů 45 (ve kterých tvoří OPG HuOPG met [22-194] P25A: 5 kD monoPEG, 10 kD monovětvený PEG, kD monoPEG, 20 kD monoPEG, 20 kD monovětvený PEG, 25 kD monoPEG, 31 kD monoPEG, 57 kD monoPEG, 12 kD diPEG, 25 kD diPEG, 31 kD diPEYG, 57 kD diPEG, 25kDtriPEG.

Příprava PEG-OPG konjugátů acylací

HuOPG met [22-194] P25A tvořil pufr, který se přemístil do 50 mM pufru BICINE, pH 8 a zahustil se na 2 až 3 mg/ml. Tento roztok se použil pro provádění OPG redukční acylace s monofunkčními PEG N-hydroxysukcinimidylestery, prováděné při pokojové teplotě. PEG 55 N-hydroxysukcinimidylestery, lineární nebo větvené, ΜΗ = 1 až 57 kDa (dostupný od

-72CZ 292587 B6 společnosti Shearwater Polymers) se přidaly do OPG roztoku jako pevné látky v množstvím 4 až 8 molů PEG N-hydroxysukcinimidylesteru na mol OPG. Vývoj reakce a rozsah OPG pegylace se monitoroval velikostně vylučovací HPLC na G3000SWxl koloně (Toso Haas) eluované 100 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 10% ethanolem, pH 6,9. Reakce se zpravidla nechala probíhat 1 hodinu, načež se reakční směs 6 až 8krát naředila a pH se snížila na 3,5 až 4. Reakční směs se frakcionalizovala iontoměničovou chromatografií (HP SP HiLoad 16/10, Pharmacia). při které se eluovala 20 mM NaOAc pH 4 s lineárním gradientem do 0,75M NaCl během 25 objemů kolony při rychlosti proudění 30 cm/hod. Frakce mono-, di- nebo poly-pegylátovaného OPG se sebraly a charakterizovaly pomocí SEC HPLC a SDS-PAGE.

Tento postup se zpravidla použil pro přípravu následujících PEG-OPG konjugátů: 5 kD polyPEG, 20 kD poly-PEG, 40 kD póly větveného PEG, 50 kD polyPEG.

Příprava dimemího PEG-OPG

HuOPG met [22-194] P25A se připravil thiolací při 1 až 3 mg/ml ve fosfátovém pufru při téměř neutrálním pH. Do S-acetyl anhydridů kyseliny merkaptosukcinové (AMSA) se za stálého míchání přidal, při 4 °C, v průběhu dvou hodin do 3 až 7násobného molámího přebytku, zatímco pH hodnota se udržovala na 7,0. Monomethilátovaný OPG se separoval z nemodifikovaného a polythiolátovaného OPG iontoměničovou chromatografií a chráněný thiol se zbavil ochranné skupiny ošetřením hydroxylaminem. Po odstranění ochranné skupiny se hydroxylamin odstranil gelovou filtrací a výsledný monothiolátovaný OPG se podrobil celé řadě thiolové specifických síťovacích chemických reakcí. Za účelem vytvoření disulfídem vázaného dimeru se thiolátovaný OPG při >1 mg/ml nechal podlehnout vzduchové oxidaci dialýzou v mírně bazickém fosfátovém pufru. Kovalentní thioetherový OPG dimer se připravil uvedením bis-maleinimidového síťovacího činidla, N,N-bis(3-maleimidopropianyl)-2-hydroxy 1,3-propanu, s thiolátovaným OPG při >1 mg/ml při 0,6násobném molámím poměru síťovacího činidla proti OPG ve fosfátovém pufru při pH 6,5. Podobně se získávají PEG typu „dumbbells“, a to reakcí substechiometrických množství bis-maleimidových PEG síťovacích činidel s thiolátovaným OPG při 1 mg/ml ve fosfátovém pufru při 6,5. Libovolný z výše uvedených dimemích konjugátů mohl být dále čištěn bud’ pomocí iontoměničové nebo velikostně vylučovací chromatografíe.

Dimemí PEG-OPG konjugáty (ve kterých OPGY znamená HuOPG met [22-194] P25A), připravené za použití výše popsaných postupů, zahrnují disulfídově-vázaný OPG dimer, kovalentní thioetherový OPG dimer s alifatickým síťovacím činidlem aminového typu, 3,4 kD a 8 kD typu „dumbbells“ a „monobells“.

U PEG-OPG konjugátů se testovala aktivita in vitro za použití testu zrání osteoklastů, popsaných v příkladu 11A a aktivita in vivo měřením zvýšení kostní hustoty po injektování do těla myší, prováděné způsobem popsaným v příkladu 11C. In vivo aktivita je shrnuta v níže uvedené tabulce 3.

-73CZ 292587 B6

Tabulka 3 In vivo biologická účinnost pegylátovaného OPG OPG konstrukt	Zvýšení hustoty tibiální kosti
muOPG met [22-194]
muOPG met [22-194] 5k PEG	+
muOPG met [22-194] 20k PEG	+
muOPG met [22-194] P25A	—
muOPG met [22-194] P25A 5k PEG	+
muOPG met [22-194] P25A 20k PEG	+
muOPG met [22-194] P25A 3Ik PEG	+
muOPG met [22-194] P25A 57k PEG	+
muOPG met [22-194] P25A 12k PEG	+
muOPG met [22—194] P25A 20k větvený PEG	+
muOPG met [22-194] P25A 8k PEG dimer	+
muOPG met [22-194] P25A disulfidová	+
příčná vazba

V závěru je třeba upozornit, že výše uvedené příklady provedení vynálezu je třeba považovat za výhodná provedení, která mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Sekvenční protokol (1) údaje k SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

AAAGGAAGGA AAAAAGCGGC CGCTACANNN NNNNNT 36 (1) údaje k SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

-74CZ 292587 B6

TCGACCCACG CGTCCG (1) údaje k SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:3:

GGGTGCGCAG GC (1) údaje k SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:4:

TGTAAAACGA CGGCCAGT (1) údaje k SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:5:

CAGGAAACAG CTATGACC (1) údaje k SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

-75CZ 292587 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:6:

CAATTAACCC TCACTAAAGG 20 (1) údaje k SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:7:

GCATTATGAC CCAGAAACCG GAC 23 (1) údaje k SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:8:

AGGTAGCGCC CTTCCTCACA TTC 23 (1) údaje k SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:9:

GACTAGTCCC ACAATGAACA AGTGGCTGTG 30 (1) údaje k SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

-76CZ 292587 B6 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

ATTAGAATGC GGCCGCTAAA CTATGAAACA GCCCAGTGAC CATTC 45 (1) údaje k SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

GCCTCTAGAA AGAGCTGGGA C 21 (1) údaje k SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:12:

CGCCGTGTTC CATTTATGAG C 21 (1) údaje k SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:13:

ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG 24

-77CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

GTTGCACTCC TGTTTCACGG TCTG (1) údaje k SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

CAAGACACCT TGAAGGGCCT GATG (1) údaje k SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:16:

TAACTTTTAC AGAAGAGCAT CAGC (1) údaje k SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

AGCGCGGCCG CATGAACAAG TGGCTGTGCT GCG

(1)	údaje k SEQ ID NO: 18:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18: AGCTCTAGAG AAACAGCCCA GTGACCATTC C	31
(1)	údaje k SEQ ID NO: 19:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19: GTGAAGCTGT GCAAGAACCT GATG	24
(1)	údaje k SEQ ID NO:20:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:20: ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTG	24
(1)	údaje k SEQ IDNO:21:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:21: CAGATCCTGA AGCTGCTCAG TTTG	24

-79CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:22:

AGCGCGGCCG CGGGGACCAC AATGAACAAG TTG 33 (1) údaje k SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:23:

AGCTCTAGAA TTGTGAGGAA ACAGCTCAAT GGC 33 (1) údaje k SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

ATAGCGGCCG CTGAGCCCAA ATCTTGTGAC AAAACTCAC 39 (1) údaje k SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:25:

TCTAGAGTCG ACTTATCATT TACCCGGAGA CAGGGAGAGG CTCTT 45

-80CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:26:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:27:

CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTCA CGGATTGAAC CTG 43 (1) údaje k SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:28:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:29:

-81 CZ 292587 B6

TCCGTAAGAA ACAGCCCAGT GACC 24 (1) údaje k SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:30:

CCTCTGCGGC CGCTGTTGCA TTTCCTTTCT G 31 (1) údaje k SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:31:

Glu Thr Leu Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Pro Glu Thr Gly His

5 10 15

Gin Leu Leu (1) údaje k SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:32:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 (1) údaje k SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina

-82CZ 292587 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:33:

CCTCTGCGGC CGCACACACG TTGTCATGTG TTGC (1) údaje k SEQ ID NO:34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:34:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T (1) údaje k SEQ ID NO:35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:35:

CCTCTGCGGC CGCCTTTTGC GTGGCTTCTC TGTT (1) údaje k SEQ ID NO:36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:36:

CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG (1) údaje k SEQ ID NO:37:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-83CZ 292587 B6 (A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:37:

CCTCTGCGGC CGCTAAGCAG CTTATTTTTTA CTGAATGG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:38:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 37 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:38:

CCTCTGAGCT CAAGCTTGGT TTCCGGGGAC CACAATG 37 (1) údaje k SEQ ID NO:39:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:39:

CCTCTGCGGC CGCCAGGGTA ACATCTATTC CAC 33 (1) údaje k SEQ ID NO:40:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:40:

CCGAAGCTTC CACCATGAAC AAGTGGCTGT GCTGC 35

-84CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:41:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:41:

CCTCTGTCGA CTATTATAAG CAGCTTATTT TCACGGATTG 40 (1) údaje k SEQ ID NO:42:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:42:

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T 21 (1) údaje k SEQ ID NO:43:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:43:

CCTCTGTCGA CTTAACACAC GTTGTCATGT GTTGC (1) údaje k SEQ ID NO:44:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:44:

-85CZ 292587 B6

TCCCTTGCCC TGACCACTCT T (1) údaje k SEQ ID NO:45:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:45:

CCTCTGTCGA CTTACTTTTG CGTGGCTTCT CTGTT (1) údaje k SEQ ID NO:46:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1537 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:46:

-86CZ 292587 B6

GTGAAGAGCG	TGÁAGAGCGG	TTCCTCCTTT	CAGCAAAAAA	CCCCTCAAGA	CCCGTTTAGA	60
GGCCCCAAGG	GGTTATGCTA	GTTATTGCTC	AGCGGTGGCA	GCAGCCAACT	CAGCTTCCTT	120
TCGGGCTTTC	TTCTTCTTCT	TCTTCTTTCC	GCGGATCCTC	GAGTAAGCTT	CCATGGTACC	180
CTGCAGGTCG	ACACTAGTGA	GCTCGAATTC	CAACGCGTTA	ACCATATGTT	ATTCCTCCTT	240
TAATTAGTTA	AAACAAATCT	AGAATCAAAT	CGATTAATCG	ACTATAACAA	ACCATTTTCT	300
TGCGTAAACC	TGTACGATCC	TACAGGTACT	TATGTTAAAC	AATTGTATTT	CAAGCGATAT	360
AATAGTGTGA	CAAAAATCCA	ATTTATTAGA	ATCAAATGTC	AATCTATTAC	CGTTTTAATG	420
ATATATAACA	CGCAAAACTT	GCGACAAACA	ATAGGTAAGG	ATAAAGAGAT	GGGTATGAAA	480
GACATAAATG	CCGACGACAC	TTACAGAATA	ATTAATAAAA	TTAAAGCCTG	TAGAAGCAAT	540
AATGATATTA	ATCAATGCTT	ATCTGATATG	ACTAAAATGG	TACATTGTGA	ATATTATTTA	600
CTCGCGATCA	TTTATCCTCA	TTCTATGGTT	AAATCTGATA	TTTCAATTCT	GGATAATTAC	660
CCTAAAAAAT	GGAGGCAATA	TTATGATGAC	GCTAATTTAA	TAAAATATGA	TCCTATAGTA	720
GATTATTCTA	ACTCCAATCA	TTCACCGATT	AATTGGAATA	TATTTGAAAA	CAATGCTGTA	780
AATAAAAAAT	CTCCAAATGT	AATTAAAGAA	GCGAAATCAT	CAGGTCTTAT	CACTGGGTTT	840
AGTTTCCCTA	TTCATACTGC	TAATAATGGC	TTCGGAATGC	TTAGTTTTGC	ACATTCAGAG	900
AAAGACAACT	ATATAGATAG	TTTATTTTTA	CATGCGTGTA	TGAACATACC	ATTAATTGTT	960
CCTTCTCTAG	TTGATAATTA	TCGAAAAATA	AATATAGCAA	ATAATAAATC	AAACAACGAT	1020
TTAACCAAAA	GAGAAAAAGA	ATGTTTAGCG	TGGGCATGCG	AAGGAAAAAG	CTCTTGGGAT	1080
ATTTCAAAAA	TATTAGGCTG	TAGTAAGCGC	ACGGTCACTT	TCCATTTAAC	CAATGCGCAA	1140
A7GAAACTCA	ATACAACAAA	CCGCTGCCAA	AGTATTTCTA	AAGCAATTTT	AACAGGAGCA	1200
ATTGATTGCC	CATACTTTAA	AAGTTAAGTA	CGACGTCCAT	ATTTGAATGT	ATTTAGAAAA	1260
ATAAACAAAA	GAGTTTGTAG	aaacgcaaaa	AGGCCATCCG	TCAGGATGGC	CTTCTGCTTA	1320
ATTTGATGCC	TGGCAGTTTA	TGGCGGGCGT	CCTGCCCGCC	ACCCTCCGGG	CCGTTGCTTC	1380
GCAACGTTCA	AATCCGCTCC	CGGCGGATTT	GTCCTACTCA	GGAGAGCGTT	CACCGACAAA	1440
CAACAGATAA	aacgaaaggc	CCAGTCTTTC	GACTGAGCCT	TTCGTTTTAT	TTGATGCCTG	1500
GCAGTTCCCT	ACTCTCGCAT	GGGGAGACCA	TGCATAC			1537

(1) údaje k SEQ ID NO:47:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

-87CZ 292587 B6 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:47:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA 48 (1) údaje k SEQ ID NO:48:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 55 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:48:

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55 (1) údaje k SEQ ID NO:49:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:49:

CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49 (1) údaje k SEQ ID NO:50:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1546 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:50:

-88CZ 292587 B6

GCGTAACGTA TGCATGGTCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA 60

CGAAAGGCTC	AGTCGAAAGA	CTGGGCCTTT	CGTTTTATCT	GTTGTTTGTC	GGTGAACGCT	120
CTCCTGAGTA	GGACAAATCC	GCCGGGAGCG	GATTTGAACG	TTGCGAAGCA	ACGGCCCGGA	190
GGGTGGCGGG	CAGGACGCCC	GCCATAAACT	GCCAGGCATC	AAATTAAGCA	GAAGGCCATC	240
CTGACGGATG	GCCTTTTTGC	GTTTCTACAA	ACTCTTTTGT	TTATTTTTCT	AAATACATTC	300
AAATATGGAC	GTCGTACTTA	ACTTTTAAAG	TATGGGCAAT	CAAT7GCTCC	TGTTAAAATT	360
GCTTTAGAAA	TACTTTGGCA	GCGGTTTGTT	GTATTGAGTT	TCATTTGCGC	ATTGGTTAAA	420
TGGAAAGTGA	CCGTGCGCTT	ACTACAGCCT	AATATTTTTG	AAATATCCCA	AGAGCTTTTT	480
CCTTCGCATG	CCCACGCTAA	ACATTCTTTT	TCTCTTTTGG	TTAAATCGTT	GTTTGATTTA	540
T7ATTTGCTA	TATTTATTTT	TCGATAATTA	TCAACTAGAG	AAGGAACAAT	TAATGGTATG	600
TTCATACACG	CATGTAAAAA	TAAACTATCT	ATATAGTTGT	CTTTCTCTGA	ATGTGCAAAA	660
CTAAGCATTC	CGAAGCCATT	AÍTAGCAGTA	TGAATAGGGA	AACTAAACCC	AGTGATAAGA	720
CCTGATGATT	TCGCTTCTTT	AATTACATTT	GGAGATTT7T	TATTTACAGC	attgttttca	780
AATATATTCC	AATTAATCGG	TGAATGATTG	GAGTTAGAAT	AATCTACTAT	AGGATCATAT	840
T7TATTAAAT	TAGCGTCATC	ATAATATTGC	CTCCATTTTT	TAGGGTAATT	ATCCAGAATT	900
GAAATATCAG	ATTTAACCAT	AGAATGAGGA	TAAATGATCG	CGAGTAAATA	ATATTCACAA	960
TGTACCATTT	TAGTCATATC	AGATAAGCAT	TGATTAATAT	CATTATTGCT	TCTACAGGCT	1020
TTAATTTTAT	TAATTATTCT	GTAAGTGTCG	TCGGCATTTA	TGTCTTTCAT	ACCCATCTCT	1080
TTATCCTTAC	CTATTGTTTG	TCGCAAGTTT	TGCGTGTTAT	ATATCATTAA	AACGGTAATA	1140
GATTGACATT	TGATTCTAAT	AAATTGGATT	TTTGTCACAC	TATTATATCG	CTTGAAATAC	1200
AATTGTTTAA	CATAAGTACC	TGTAGGATCG	TACAGGTTTA	CGCAAGAAAA	TGGTTTGTTA	1260
TAGTCGATTA	ATCGATTTGA	TTCTAGATTT	GTTTTAACTA	ATTAAAGGAG	GAATAACATA	1320
TGGTTAACGC	GTTGGAATTC	GAGCTCACTA	GTGTCGACCT	GCAGGGTACC	ATGGAAGCTT	1380
ACTCGAGGAT	CCGCGGAAAG	AAGAAGAAGA	AGAAGAAAGC	CCGAAAGGAA	GCTGAGTTGG	1440
CTGCTGCCAC	CGCTGAGCAA	TAACTAGCAT	AACCCCTTGG	GGCCTCTAAA	CGGGTCTTGA	1500
GGGGTTTTTT	GCTGAAAGGA	GGAACCGCTC	TTCACGCTCT	TCACGC		1546

-89CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:51:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 47 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:51:

TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCATGC TAGCGTTAAC GCGTTGG (1) údaje k SEQ ID NO:52:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:52:

AATTCCAACG CGTTAACGCT AGCATGATGG TGATGGTGAT GATGTTTCA 49 (1) údaje k SEQ ID NO:53:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 141 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:53:

CTAATTCCGC TCTCACCTAC CAAACAATGC CCCCCTGCAA AAAATAAATT CATATAAAAA 60

ACATACAGAT AACCATCTGC GGTGATAAAT TATCTCTGGC GGTGTTGACA TAAATACCAC 120

TGGCGGTGAT ACTGAGCACA T ¹⁴¹ (1) údaje k SEQ ID NO:54:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 147 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

-90CZ 292587 B6 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:54:

CGATGTGCTC	AGTATCACCG	CCAGTGGTAT	TTATGTCAAC	ACCGCCAGAG	ATAATTTATC	60
ACCGCAGATG	GTTATCTGTA	TGTTTTTTAT	ATGAATTTAT	TTTTTGCAGG	GGGGCATiGT	120
TTGGTAGGTG	AGAGCGGAAT	TAGACGT				147

(1) údaje k SEQ ID NO:55:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 55 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:55:

CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55 (1) údaje k SEQ ID NO:56:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:56:

CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49 (1) údaje k SEQ ID NO:57:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 668 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:57:

-91 CZ 292587 B6

GTGAAGAGCG TGAAGAGCGG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA CCCGTTTAGA60

GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT CAGCTTCCTT120

TCGGGCTTTC TTČTTCTTCT TCTZCTTTCC GCGGATCCTC GAGTAAGCTT CCATGGTACC180

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTCGAATTC CAACGCGTTA ACCATATGTT ATTCCTCCTT240

TAATTAGTTA ACTCAAATCT AGAATCAAAT CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA300

TATTAATCAA GAATTTTAGC AT7TGTCAAA TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGTCCAT360

ATTTGAATGT ATTTAGAAAA ATAAACAAAA GAGTTTGTAG AAACGCAAAA AGGCCATCCG420

TCAGGATGGC CTTCTGCTTA ATTTGATGCC TGGCAGTTTA TGGCGGGCGT CCTGCCCGCC480

ACCCTCCGGG CCGTTGCTTC GCAACGTTCA AATCCGCTCC CGGCGGATTT GTCCTACTCA540

GGAGAGCGTT CACCGACAAA CAACAGATAA AACGAAAGGC CCAGTCTTTC GACTGAGCCT600

TTCGTTTTAT TTGATGCCTG GCAGTTCCCT ACTCTCGCAT GGGGAGACCA TGCATACGTT660

ACGCACGT668 (1) údaje k SEQ ID NO:58:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 726 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:58:

-92CZ 292587 B6

GCGTAACGTA	TGCATGGTCT	CCCCATGCGA	GAGTAGGGAA	CTGCCAGGCA	TCAAATAAAA	60
CGAAAGGCTC	AGTCGAAAGA	CiGGGCCTTT	CGTTTTATCT	GTTGTTTGTC	GGTGAACGCT	120
CTCCiGAGTA	GGACAAATCC	GCCGGGAGCG	GATTTGAACG	TTGCGAAGCA	ACGGCCCGGA	180
GGGTGGCGGG	CAGGACGCCC	GGCATAAACT	GCCAGGCATC	AAATTAAGCA	GAAGGGGCCT	240
CCCACCGCCC	GTCCTGCGGG	CGGTATTTGA	CGGTCCGTAG	TTTAATTCGT	CTTCGCCATC	300
CTGACGGATG	GCCTTTTTGC	G7TTCTACAA	ACTCTTTTGT	TTATTTTTCT	AAATACATTC	360
AAATATGGAC	GTCTCATAAT	TTTTAAAAAA	_TTcatttgac	AAATGCTAAA	ATTCTTGATT	420
AATATTCTCA	ATTGTGAGCG	CTCACAATTT	ATCGATTTGA	TTCTAGATTT	GTTTTAACTA	480
ATTAAAGGAG	GAÁTAACATA	TGGTTAACGC	GTTGGAATTC	GAGCTCACTA	GTGTCGACCT	540
GCAGGGTACC	ATGGAAGCTT	ACTCGAGGAT	CCGCGGAAAG	AAGAAGAAGA	AGAAGAAAGC	600
CCGAAAGGAA	GCTGAGTTGG	C7GCTGCCAC	CGCTGAGCAA	TAACTAGCAT	AACCCCTTGG	660
GGCCTCTAAA	CGGGTCTTGA	GGGGTTTTTT	GCTGAAAGGA	GGAACCGCTC	TTCACGCTCT	720

TCACGC 726 (1) údaje k SEQ ID NO:59:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:59:

TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT GGAC 44 (1) údaje k SEQ ID NO:60:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bazických párů (B) TYP: nukleová ky selina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:60:

GTCCTCCTGG TACCTACCTA AAACAAC 27

-93CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:61:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 102 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:61:

TATGGATGAA GAAACTTCTC MCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTACCCGGCG 60

GACATTTATC ACACAGCAGC TGATGAGAAG TTTCTTCATC CA 102 (1) údaje k SEQ ID NO:62:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:62:

Met Asp Glu Glu Thr Ser His Gin Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro 15 10 15

Gly Thr Tyr (1) údaje k SEQ ID NO:63:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 84 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:63:

TATGGAAACT TTCCTCCTCCAA AATATCTTCA TTATGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT 60

GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC 84 (1) údaje k SEQ ID NO:64:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina

-94CZ 292587 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:64:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCnTCftTAA TGftAGATATT 60

TTGGAGGAAA AGTTTCCA 78 (1) údaje k SEQ ID NO:65:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:65:

TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTCACGGATT GAAC 44 (1) údaje k SEQ ID NO:66:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:66:

GTGCTCCTGG TACCTACCTA AAACAGCACT GCACAGTG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:67:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 84 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:67:

TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA TTACGATCCG GAřACTGGTC ATCAGCTGCT 60

GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC 84

-95CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:68:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 78 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO.68:

CCGGAGCACA TTTftTCACAC AGCAGCTGAT GYCCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTAIT 60

TTGGAGGCAG AGTTTCCA 78 (1) údaje k SEQ ID NO:69:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:69:

TATGGACCCA GAAACTGGTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTGCTCCGG GTAC 54 (1) údaje k SEQ ID NO:70:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:70:

CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC TGGGTCCA 48 (1) údaje k SEQ ID NO:71:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 87 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:71:

-96CZ 292587 B6

TATGAAAGA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCATTACGAT CCGGAAACTG GTCATCAGCT 60

GCTGTGTGAT AAATGTGCTC CGGGTAC 87 (1) údaje k SEQ ID NO:72:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 81 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:72:

CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT 60

TTGGAGGCAG AGTTTCTTTC A 81 (1) údaje k SEQ ID NO:73:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 71 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:73:

GTTCTCCTCA TATGAAACAT CATCACCATC ACCATCATGA AACTCTGCCT CCAAAATACC 60

TGCATTACGA T 71 (1) údaje k SEQ ID NO:74:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:74:

GTTCTCCTCA TATGAAAGAA ACTCTGCCTC CAAAATACCT GCA 43 (1) údaje k SEQ ID NO:75:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 76 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý

-97CZ 292587 B6 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:75:

TACGCACTGG ATCCTTAATG ATGGTGATGGTGATGATGTA AGCAGCTTAT TTTCACGGAT 60

TGAACCTGAT TCCCTA 76 (1) údaje k SEQ ID NO:76:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 47 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:76:

GTTCTCCTCA TATGAAATAC CTGCATTACG ATCCGGAAAC TGGTCAT 47 (1) údaje k SEQ ID NO:77:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:77:

GTTCTCCTAT TAATGAAATA TCTTCATTAT GATGAAGAAA CTT 43 (1) údaje k SEQ ID NO:78:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:78:

TACGCACTGG ATCCTTATAA GCAGCTTATT TTTACTGATT 40

-98CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:79:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:79:

GTTCTCCTCA TATGGAAACT CTGCCTCCAA AATACCTGCA 40 (1) údaje k SEQ ID NO:80:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:80:

TACGCACTGG ATCCTTATGT TGCATTTCCT TTCTGAATTA GCA 43 (1) údaje k SEQ ID NO:81:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:81:

CCGGAAACAG ATAATGAG 18 (1) údaje k SEQ ID NO:82:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:82:

GATCCTCATT ATCTGTTT 18

-99CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:83:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:83:

CCGGAAACAG AGAAGCCACG CAAAAGTAAG (1) údaje k SEQ ID NO:84:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:84:

GATCCTTACT TTTGCGTGGC TTCTCTGTTT (1) údaje k SEQ ID NO:85:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:85:

TATGTTAATG AG (1) údaje k SEQ ID NO:86:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 14 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:86:

GATCCTCATT AACA

-100CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:87:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:87:

TATGTTCCGG AAACAGTTAA G 21 (1) údaje k SEQ ID NO:88:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:88:

GATCCTTAAC TGTTTCCGGA ACA 23 (1) údaje k SEQ ID NO:89:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:89:

TATGTTCCGG AAACAGTGAA TCAACTCAAA AATAAG 36 (1) údaje k SEQ ID NO:90:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:90:

GATCCTTATT TTTGAGTTGA TTCACTGTTT CCGGAACA 38

- 101 CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO:91:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 100 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:91:

CTAGCGACGA CGACGACAAA GAAACTCTGC CTCCAAAATA CCTGCATTAC GATCCGGAAA 60

CTGGTCATCA GCTGCTGTGT GATAAATGTG CTCCGGGTAC 100 (1) údaje k SEQ ID NO:92:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 92 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:92:

CCGGAGCACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACCAGTTTC CGGATCGTAA TGCAGGTATT 60

TTGGAGGCAG AGTTTCTTTG TCGTCGTCGT CG (1) údaje k SEQ ID NO:93:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:93:

ACAAACACAA TGCATTTGAT ACTAGA 26 (1) údaje k SEQ ID NO:94:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:94:

-102CZ 292587 B6

TTTGTTTTAA CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATATGAGAGG ATCGCATCAC (1) údaje k SEQ ID NO:95:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:95:

CATCACCATC ACGAAACCTT CCCGCCGAAA TACCTGCACT ACGACGAAGA 50 (1) údaje k SEQ ID NO:96:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:96:

AACCTCCCAC CAGCTGCTGT GCGACAAATG CCCGCCGGGT ACCCAAACA (1) údaje k SEQ ID NO:97:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:97:

TGTTTGGGTA CCCGGCGGGC ATTTGT (1) údaje k SEQ ID NO:98:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

-103CZ 292587 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:98:

CGCACAGCAG CTGGTGGGAG GTTTCTTCGT CGTAGTGCAG GTATTTCGGC 50 (1) údaje k SEQ ID NO:99:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 49 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:99:

GGGAAGGTTT CGTGATGGTG ATGGTGATGC GATCCTCTCA TATTTTATT 49 (1) údaje k SEQ ID NO: 100:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 100:

CCTCCTTTAA TTAGTTAAAA CAAATCTAGT ATCAAATCGA TTGTGTTTGT 50 (1) údaje k SEQ ID NO: 101:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 59 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 101:

ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAAATG 59 (1) údaje k SEQ ID NO: 102:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

- 104CZ 292587 B6 (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:102:

CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAGAAA CTTTTCCTCC AAAATATC 48 (1) údaje k SEQ ID NO:103:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:103:

TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C 31 (1) údaje k SEQ ID NO: 104:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 59 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 104:

ACAAACACAA TCGATTTGAT ACTAGATTTG TTTTAACTAA TTAAAGGAGG AATAAAATG 59 (1) údaje k SEQ ID NO: 105:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:105:

CTAATTAAAG GAGGAATAAA ATGAAAAAAA AAGAAACTTT TCCTCCAAAA TATC 54 (1) údaje k SEQ ID NO: 106:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina

-105CZ 292587 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 106:

TGTTTGGGTA CCCGGCGGAC ATTTATCACA C 31 (1) údaje k SEQ ID NO: 107:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 bazický ch párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 107:

CAGCCCGGGT AAAATGGAAA CGTTTCCTCC AAAATATCTT CATT 44 (1) údaje k SEQ ID NO: 108:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 108:

CGTTTCCATT TTACCCGGGC TGAGCGAGAG GCTCTTCTGC GTGT 44 (1) údaje k SEQ ID NO: 109:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 45 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 109:

CGCTCAGCCC GGGTAAAATG GAAACGTTGC CTCCAAAATA CCTGC 45 (1) údaje k SEQ ID NO: 110:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

-106CZ 292587 B6 (A) DÉLKA: 39 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 110:

CCATTTTACC CGGGCTGAGC GAGAGGCTCT TCTGCGTGT 39 (1) údaje k SEQ ID NO:111:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 111:

GAAAATAAGC TGCTTAGCTG GAGCTGAACC AAAATC 36 (1) údaje k SEQ ID NO: 112:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 112:

CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTCACGG ATTG 34 (1) údaje k SEQ ID NO: 113:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 36 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 113:

AAAAATAAGC TGCTTAGCTG CAGCTGAACC AAAATC 36

- 107CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 114:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 114:

CAGCTGCAGC TAAGCAGCTT ATTTTTACTG ATTGG 35 (1) údaje k SEQ ID NO: 115:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 102 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 115:

CTAGftAGGAG GAATAACATA TGGAAACTTT TGCTCCAAAA TATCTTCATT ATGATGAAGA 60

AACTAGTCAT CAGCTGCTGT GTGATAAATG TCCGCCGGGT AC 102 (1) údaje k SEQ ID NO: 116:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 94 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 116:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GACTAGTTTC TTCATCATAA TGAAGATATT 60 TTGGAGCAAA AGTTTCCATA TGTTATTCCT CCTT 94 (1) údaje k SEQ ID NO: 117:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 62 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

-108CZ 292587 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 117:

CTAGAAGGAG GAATAACMA TGGAAACTTT TCCTGCTAAA TATCTTCATT ATGATGAAGA 60

AA 62 (1) údaje k SEQ ID NO: 118:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 62 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 118:

CTAGTTTCTT CATCATAATG AAGATATTTA GCAGGAAAAG TTTCCATATG TTAT7CCTCC 60

TT 62 (1) údaje k SEQ ID NO: 119:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 51 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 119:

Tyr 1

His

Tyr

Tyr Asp Gin Asn Gly Arg Met Cys Glu Glu Cys His Met

5

10

15

Cy3

Gin

Pro

Gly

His

Phe

Leu

Val

Lys

His

Cya

Lys

Gin

Pro

Lys

Arg

20

25

30

Asp

Thr

Val

Cy3

His

Lys

Pro

Cys

Glu

Pro

Gly

Val

Thr

Tyr

Thr

Asp

35

40

45

Asp Trp His (1) údaje k SEQ ID NO: 120:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2432 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA

-109CZ 292587 B6 (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 124..1326 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 120:

ATCAAAGGCA GGGCATACTT CCTGTTGCCC AGACCTTATA TAAAACGTCA TGTTCGCCTG

GGCAGCAGAG AAGCACCTAG CACTGGCCCA GCGGCTGCCG CCTGAGGTTT CCAGAGGACC

120

168

216

ACA

ATG Met 1

AAC Asn

AAG TGG

CTG Leu 5

TGC TGT GCA CTC CTG GTG TTC TTG GAC ATC

Lys

Trp

Cys Cys

Ala Leu

Leu 10

Val

Phe

Leu

Asp

Ile 15

ATT

GAA

TGG

ACA

ACC

CAG

GAA

ACC

TTT

CCT

CCA

AAA

TAC

TTG

CAT

TAT

Ile

Glu

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

20

25

30

- 110CZ 292587 B6

GAC CCA

GAA Glu

ACC GGA Thr Gly 35

CGT CAG CTC TTG TGT GAC AAA TGT

GCT CCT GGC Ala Pro Gly 45

264

Asp

Pro

Arg Gin

Leu

Leu Cys 40

Asp Lys

Cys

ACC

TAC

CTA

AAA

CAG

CAC

TGC

ACA

GTC

AGG

AAG

ACA

CTG

TGT

GTC

312

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

50

55

60

CCT

TGC

CCT

GAC

TAC

TCT

TAT

ACA

GAC

AGC

TGG

CAC

ACG

AGT

GAT

GAA

360

Pro

Cys

Pro

Asp

Tyr

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

65

70

75

TGC

GTG

TAC

TGC

AGC

CCC

GTG

TGC

AAG

GAA

CTG

CAG

ACC

GTG

AAA

CAG

408

Cys

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Thr

Val

Lys

Gin

80

85

90

95

GAG

TGC

AAC

CGC

ACC

CAC

AAC

CGA

GTG

TGC

GAA

TGT

GAG

GAA

GGG

CGC

456

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

100

105

110

TAC

CTG

GAG

CTC

GAA

TTC

TGC

TTG

AAG

CAC

CGG

AGC

TGT

CCC

CCA

GGC

504

Tyr

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

115

120

125

TTG

GGT

GTG

CTG

CAG

GCT

GGG

ACC

CCA

GAG

CGA

AAC

ACG

GTT

TGC

AAA

552

Leu

Gly

Val

Leu

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

130

135

140

AGA

TGT

CCG

GAT

GGG

TTC

TCA

GGT

GAG

ACG

TCA

TCG

AAA

GCA

CCC

600

Arg

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

145

150

155

TGT

AGG

AAA

CAC

ACC

AAC

TGC

AGC

TCA

CTT

GGC

CTC

CTG

CTA

ATT

CAG

648

Cys

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Gly

Leu

Ile

Gin

160

165

170

175

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAT

GAC

AAT

GTA

TGT

TCC

GGA

AAC

AGA

GAA

GCA

696

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

180

185

190

ACT

CAA

AAT

TGT

GGA

ATA

GAT

GTC

ACC

CTG

TGC

GAA

GAG

GCA

TTC

744

Thr

Gin

Asn

Cys

Gly

ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

195

200

205

AGG

TTT

GCT

GTG

CCT

ACC

AAG

ATT

ATA

CCG

AAT

TGG

CTG

AGT

GTT

CTG

792

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

210

215

220

GTG

GAC

AGT

TTG

CCT

GGG

ACC

AAA

GTG

AAT

GCA

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

840

Val

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

225

230

235

-111 CZ 292587 B6

ATA AAA CGG AGA CAC AGC

TCG CAA GAG CAA ACT TTC CAG CTA CTT

AAG Lys 255

888

Ile 240

Lys

Arg Arg

His

Ser 245

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr 250

Phe

Gin

Leu

CTG

TGG

AAG

CAT

CAA

AAC

AGA

GAC

CAG

GAA

ATG

GTG

AAG

ATC

936

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

260

265

270

CAA

GAC

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AGC

AGT

GTG

CAA

CGG

CAT

ATC

GGC

CAC

984

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

275

280

285

GCG

AAC

CTC

ACC

ACA

GAG

CAG

CTC

CGC

ATC

TTG

ATG

GAG

AGC

TTG

CCT

1032

Ala

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

Arg

Ile

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

290

295

300

GGG

AAG

ATC

AGC

CCA

GAC

GAG

ATT

GAG

AGA

ACG

AGA

AAG

ACC

TGC

1080

Gly

Lys

Ile

Ser

Pro

Asp

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

305

310

315

AAA

CCC

AGC

GAG

CAG

CTC

CTG

AAG

CTA

CTG

AGC

TTG

TGG

AGG

ATC

AAA

1128

Lys

Pro

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

320

325

330

335

AAT

GGA

GAC

CAA

GAC

ACC

TTG

AAG

GGC

CTG

ATG

TAC

GCA

CTC

AAG

CAC

1176

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

340

345

350

TTG

AAA

GCA

TAC

CAC

TTT

CCC

AAA

ACC

GTC

ACC

CAC

AGT

CTG

AGG

AAG

1224

Leu

Lys

Ala

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

355

360

365

ACC

ATC

AGG

TTC

TTG

CAC

AGC

TTC

ACC

ATG

TAC

CGA

TTG

TAT

CAG

AAA

1272

Thr

ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

370

375

380

CTC

TTT

CTA

GAA

ATG

ATA

GGG

AAT

CAG

GTT

CAA

TCA

GTG

AAG

ATA

AGC

1320

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

385

390

395

TGC TTA TAGTTAGGAA TGGTCACTGG GCTGTTTCTT CAGGATGGGC CAACACTGAT1376

Cys Leu

400

GGAGCAGATG GCTGCTTCTC CGGCTCTTGA AATGGCAGTT GATTCCTTTC TCATCAGTTG1436

GTGGGAATGA AGATCCTCCA GCCCAACACA CACACTGGGG AGTCTGAGTC AGGAGAGTGA1496

GGCAGGCTAT TTGATAATTG TGCAAAGCTG CCAGGTGTAC ACCTAGAAAG TCAAGCACCC1556

-112CZ 292587 B6

TGAGAAAGAG	GATATTTTTA	TAACCTCAAA	CATAGGCCCT	TTCCTTCCTC	TCCTTATGGA	1616
TGAGTACTCA	GAAGGCTTCT	ACTATCTTCT	GTGTCATCCC	TAGATGAAGG	CCTCTTTTAT	1676
TTATTTTTTT	ATTCTTTTTT	TCGGAGCTGG	GGACCGAACC	CAGGGCCTTG	CGCTTGCGAG	1736
GCAAGTGCTC	TACCACTGAG	CTAAATCTCC	AACCCCTGAA	GGCCTCTTTC	TTTCTGCCTC	1796
TGATAGTCTA	TGACATTCTT	TTTTCTACAA	TTCGTATCAG	GTGCACGAGC	CTTATCCCAT	1856
TTGTAGGTTT	CTAGGCAAGT	TGACCGTTAG	CTATTTTTCC	CÍCTGAAGAT	TTGATTCGAG	1916
TTGCAGACTT	GGCTAGACAA	GCAGGGGTAG	GTTATGGTAG	TTTATTTAAC	AGACTGCCAC	1976
CAGGAGTCCA	GTGTTTCTTG	TTCCTCTGTA	GTTGTACCIA	AGCTGACTCC	AAGTACATTT	2036
AGTATGAAAA	ATAATCAACA	AATTTTATTC	CTTCTATCAA	CATTGGCTAG	CTTTGTTTCA	2096
GGGCACTAAA	AGAAACTACT	ATATGGAGAA	AGAATTGATA	TTGCCCCCAA	CGTTCAACAA	2156
CCCAATAGTT	TATCCAGCTG	TCATGCCTGG	TTCAGTGTCT	ACTGACTATG	CGCCCTCTTA	2216
TTACTGCATG	CAGTAATTCA	ACTGGAAATA	GTAATAATAA	TAATAGAAAT	AAAA2CTAGA	2276
CTCCATTGGA	TCTCTCTGAA	TATGGGAATA	TCTAACTTAA	GAAGCTTTGA	GATTTCAGTT	2336
GTGTTAAAGG	CTTTTATTAA	AAAGCTGATG	CTCTTCTGTA	AAAGTTACTA	ATATATCTGT	2396
AAGACTATTA	CAGTATTGCT	ATTTATATCC	ATCCAG			2432

(1) údaje k SEQ ID NO: 121:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 401 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 121:

Met Asn Lys Trp Leu Cys Cys Ala Leu Leu val Phe Leu Asp Ile Ile 15 10 15

Glu Trp Thr Thr Gin Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp 20 25 30

-113CZ 292587 B6

Pro

Glu Thr Gly Arg Gin Leu Leu Cys Asp Lys Cys Ala Pro Gly Thr

35

40

45

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

50

55

60

Cys

Pro

Asp

Tyr

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

70

75

80

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Thr

val

Lys

Gin

Glu

85

90

9S

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

100

105

110

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Leu

115

120

125

Gly

Val

Leu

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

165

170

175

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

180

185

190

Gin

Asn

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

195

200

205

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

210

215

220

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

val

Glu

Arg

Ile

225

230

235

240

Lys

Arg

His

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

245

250

255

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

260

265

270

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

Ala

275

280

285

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

Arg

Ile

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

290

295

300

- 114CZ 292587 B6

Lys Lys 305

Ile

Ser

Pro

Asp Glu Ile 310

Glu Arg Thr Arg Lys Thr Cys Lys

315

320

Pro

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp Arg

ile

Lys

Asn

325

330

335

Gly Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

340

345

350

Lys

Ala

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

355

360

365

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

370

375

380

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

385

390

395

400

Leu (1) údaje k SEQ ID NO: 122:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1324 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 90..1292 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 122:

CCTTATATAA ACGTCATGAT TGCCTGGGCT GCAGAGACGC ACCTAGCACT GACCCAGCGG

CTGCCTCCTG AGGTTTCCCG AGGACCACA ATG	AAC	AAG	TGG	CTG	TGC	TGC	GCA	113
Met 1	Asn	Lys	Trp	Leu 5	Cys	Cys	Ala

CTC

CTG

GTG

CTC

CTG

GAC

ATC

ATT

GAA

TGG

ACA

ACC

CAG

GAA

ACC

CTT

161

Leu

Val

Leu

Asp

Ile

Glu

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

Leu

10

15

20

-115CZ 292587 B6

CCT CCA AAG

TAC TTG CAT TAT

GAC CCA GAA ACT GGT CAT CAG

CTC Leu

CTG Leu 40

209

Pro 25

Pro

Lys

Tyr

Leu His 30

Tyr

Asp

Pro Glu

Thr 35

Gly

His

Gin

TGT

GAC

AAA

TGT

GCT

CCT

GGC

ACC

TAC

CTA

AAA

CAG

CAC

TGC

ACA

GTG

257

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

45

50

55

AGG

AAG

ACA

TTG

TGT

GTC

CCT

TGC

CCT

GAC

CAC

TCT

TAT

ACG

GAC

305

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Ser

Tyr

Thr

Asp

60

65

70

AGC

TGG

CAC

ACC

AGT

GAT

GAG

TGT

GTG

TAT

TGC

AGC

CCA

GTG

TGC

AAG

353

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

G1U

Cys

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

75

80

85

GAA

CTG

CAG

TCC

GTG

AAG

CAG

GAG

TGC

AAC

CGC

ACC

CAC

AAC

CGA

GTG

401

Glu

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

90

95

100

TGT

GAG

TGT

GAG

GAA

GGG

CGT

TAC

CTG

GAG

ATC

GAA

TTC

TGC

TTG

AAG

449

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

105

110

115

120

CAC

CGG

AGC

TGT

CCC

CCG

GGC

TCC

GGC

GTG

CAA

GCT

GGA

ACC

CCA

497

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

125

130

135

GAG

CGA

AAC

ACA

GTT

TGC

AAA

TGT

CCA

GAT

GGG

TTC

TCA

GGT

545

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

140

145

150

GAG

ACT

TCA

TCG

AAA

GCA

CCC

TGT

ATA

AAA

CAC

ACG

AAC

TGC

AGC

ACA

593

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

Ile

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Thr

155

160

165

TTT

GGC

CTC

CTG

CTA

ATT

CAG

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAT

GAC

AAC

GTG

641

Phe

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

170

175

180

TGT

TCC

GGA

AAC

AGA

GAA

GCC

ACG

CAA

AAG

TGT

GGA

ATA

GAT

GTC

ACC

689

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

185

190

195

200

CTG

TGT

GAA

GAG

GCC

TTC

AGG

TTT

GCT

GTT

CCT

ACC

AAG

ATT

ATA

737

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Ile

205

210

215

-116CZ 292587 B6

CCA AAT TGG CTG AGT

GTT Val

TTG GTG Leu Val

GAC AGT

TTG CCT Leu Pro

GGG ACC AAA GTG

785

Pro

Asn Trp

Leu 220

Ser

Asp 225

Ser

Gly

Thr Lys 230

Val

AAT

GCC

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

ATA

AAA

CGG

AGA

CAC

AGC

TCA

CAA

GAG

833

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

lle

Lys

Arg

His

Ser

C-ln

Glu

235

240

245

CAA

ACC

TTC

CAG

CTG

AAG

CTG

TGG

AAA

CAT

CAA

AAC

AGA

GAC

CAG

881

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

LyS

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

250

255

260

GAA

ATG

GTG

AAG

ATC

CAA

GAC

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AGC

929

Glu

Met

Val

Lys

Xle

lle

Gin

Asp

lle

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

265

270

275

280

GTG

CAG

CGG

CAT

CTC

GGC

CAC

TCG

AAC

CTC

ACC

ACA

GAG

CAG

CTT

977

Val

Gin

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

285

290

295

GCC

TTG

ATG

GAG

AGC

CTG

CCT

GC-G

AAG

ATC

AGC

CCA

GAA

GAG

ATT

1025

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

lle

Ser

Pro

Glu

lle

300

305

310

GAG

AGA

ACG

AGA

AAG

ACC

TGC

AAA

TCG

AGC

GAG

CAG

CTC

CTG

AAG

CTA

1073

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

315

320

325

CTC

AGT

TTA

TGG

AGG

ATC

AAA

AAT

GGT

GAC

CAA

GAC

ACC

TTG

AAG

GGC

1121

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

lle

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

330

335

340

CTG

ATG

TAT

GCC

CTC

AAG

CAC

TTG

AAA

ACA

TCC

CAC

TTT

CCC

AAA

ACT

1169

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Thr

Ser

His

Phe

Pro

Lys

Thr

345

350

355

360

GTC

ACC

CAC

AGT

CTG

AGG

AAG

ACC

ATG

AGG

TTC

CTG

CAC

AGC

TTC

ACA

1217

val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

Met

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

365

370

375

ATG

TAC

AGA

CTG

TAT

CAG

AAG

CTC

TTT

TTA

GAA

ATG

ATA

GGG

AAT

CAG

1265

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

lle

Gly

Asn

Gin

380

385

390

GTT

CAA

TCC

GTG

AAA

ATA

AGC

TGC

TTA

taactaggaa

TGGTCACTGG

1312

Val

Gin

Ser

Val

Lys

lle

Ser

Cys

Leu

395

400

GCTGTTTCTT CA

1324

-117CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 123:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 401 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 123:

Met 1

Aen

Lye

Trp

Leu 5

Cys

Cye Ala Leu Leu Val Leu Leu Asp Ile

Ile

10

15

Glu

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

Leu

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

20

25

30

Pro

Glu

Thr

Gly

His

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

35

40

45

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

50

55

60

Cys

Pro

Asp

His

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

70

75

80

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Gin

Glu

85

90

95

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

100

105

110

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Ser

115

120

125

Gly

Val

val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

Ile

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Thr

Phe

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

165

170

175

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

180

185

190

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

195 200 205

-118CZ 292587 B6

Phe

Ala Val Pro Thr 210

Lys

Ile 215

Ile Pro Asn

Trp

Leu 220

Ser

Val

Leu

Val

Asp

Ser

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

225

230

235

240

Lys

Arg

His

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

245

250

255

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

260

265

270

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

275

280

285

Asn

Leu

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

290

295

300

Lys

Ile

Ser

Pro

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys

305

310

315

320

Ser

Glu

Gin

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

325

330

335

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

340

345

350

Lys

Thr

Ser

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

355

360

365

Met

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

370

375

380

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

385 390 395 400

Leu (1) údaje k SEQ ID NO: 124:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: 5 (A) DÉLKA: 1355 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAK:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 94..1296

-119CZ 292587 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 124:

GTATATATAA CGTGATGAGC GTACGGGTGC GGAGACGCAC CGGAGCGCTC GCCCAGCCGC 60

CGCTCCAAGC CCCTGAGGTT TCCGGGGACC ACA ATG AAC AAG TTG CTG TGC TGC 114

Met 1

Asn Lys Leu Leu Cys Cys 5

GCG

CTC

GTG

TTT

CTG

GAC

ATC

TCC

ATT

AAG

TGG

ACC

CAG

GAA

ACG

162

Ala

Leu

Val

Phe

Leu

Asp

Ile

Ser

Ile

Lys

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

10

15

20

TTT

CCT

CCA

AAG

TAC

CTT

CAT

TAT

GAC

GAA

ACC

TCT

CAT

CAG

CTG

210

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Glu

Thr

Ser

His

Gin

Leu

25

30

35

TTG

TGT

GAC

AAA

TGT

CCT

GGT

ACC

TAC

CTA

AAA

CAA

CAC

TGT

ACA

258

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

40

45

50

55

GCA

AAG

TGG

AAG

ACC

GTG

TGC

GCC

CCT

TGC

CCT

GAC

CAC

TAC

ACA

306

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

Thr

60

65

70

GAC

AGC

TGG

CAC

ACC

AGT

GAC

GAG

TGT

CTA

TAC

TGC

AGC

CCC

GTG

TGC

354

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Leu

Tyr Cys

Ser

Pro

Val

Cys

75

80

85

AAG

GAG

CTG

CAG

TAC

GTC

AAG

CAG

GAG

TGC

AAT

CGC

ACC

CAC

AAC

CGC

402

Lys

Glu

Leu

Gin

Tyr

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

90

95

100

GTG

TGC

GAA

TGC

AAG

GAA

GGG

CGC

TAC

CTT

GAG

ATA

GAG

TTC

TGC

TTG

450

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

Cys

Leu

105

110

115

AAA

CAT

AGG

AGC

TGC

CCT

GGA

TTT

GGA

GTG

CAA

GCT

GGA

ACC

498

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

120

125

130

135

CCA

GAG

CGA

AAT

ACA

GTT

TGC

AAA

AGA

TGT

CCA

GAT

GGG

TTC

TCA

546

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

140 145 150

- 120CZ 292587 B6

AAT Asn

GAG ACG TCA TCT

AAA GCA CCC TGT AGA AAA CAC ACA AAT TGC AGT

594

Glu Thr Ser 155

Ser

Lys

Ala Pro Cys 160

Arg Lys

His

Thr

Asn Cys 165

Ser

GTC

TTT

GGT

CTC

CTG

CTA

ACT

CAG

AAA

GGA

AAT

GCA

ACA

CAC

GAC

AAC

642

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

170

175

180

ATA Ile

TGT TCC GGA

AAC AGT GAA

TCA ACT CAA Ser Thr Gin

AAA TGT

GGA ATA GAT

GTT Val

690

Cys 185

Ser Gly

Asn

Ser Glu 190

Lys

Cys 195

Gly

Ile

Asp

ACC

CTG

TGT

GAG

GCA

TTC

AGG

TTT

GCT

GTT

CCT

ACA

AAG

TTT

738

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Ly3

Phe

200

205

210

215

ACG

CCT

AAC

TGG

CTT

AGT

GTC

TTG

GTA

GAC

AAT

TTG

CCT

GGC

ACC

AAA

786

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

220

225

230

GTA

AAC

GCA

GAG

AGT

GTA

GAG

AGG

ATA

AAA

CGG

CAA

CAC

AGC

TCA

CAA

834

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

Gin

His

Ser

Gin

235

240

245

GAA

CAG

ACT

TTC

CAG

CTG

AAG

TTA

TGG

AAA

CAT

CAA

AAC

AAA

GCC

882

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Lys

Ala

250

255

260

CAA

GAT

ATA

GTC

AAG

ATC

CAA

GAT

ATT

GAC

CTC

TGT

GAA

AAC

930

Glri

Asp

ile

Val

Lys

Ile

Gin

Asp

ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Asn

265

270

275

AGC

GTG

CAG

CGG

CAC

ATT

GGA

CAT

GCT

AAC

CTC

ACC

TTC

GAG

CAG

CTT

978

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

Ala

Asn

Leu

Thr

Phe

Glu

Gin

Leu

280

285

290

295

CGT

AGC

TTG

ATG

GAA

AGC

TTA

CCG

GGA

AAG

AAA

GTG

GGA

GCA

GAA

GAC

1026

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Asp

300

305

310

ATT

GAA

AAA

ACA

ATA

AAG

GCA

TGC

AAA

CCC

AGT

GAC

CAG

ATC

CTG

AAG

1074

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Cys

Lys

Pro

Ser

Asp

Gin

Ile

Leu

Lys

315

320

325

CTG

CTC

AGT

TTG

TGG

CGA

ATA

AAA

AAT

GGC

GAC

CAA

GAC

ACC

TTG

AAG

1122

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

330

335

340

- 121 CZ 292587 B6

GGC Gly

CTA Leu 345

ATG CAC GCA CTA

AAG CAC TCA AAG

ACG TAC CAC

TTT Phe

CCC Pro

AAA Lys

1170

Met

His

Ala

Leu

Lys 350

His

Ser Lye

Thr

Tyr 355

His

ACT

GTC

ACT

CAG

AGT

CTA

AAG

ACC

ATC

AGG

TTC

CTT

CAC

AGC

TTC

1218

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

360

365

370

375

ACA

ATG

TAC

AAA

TTG

TAT

CAG

AAG

TTA

TTT

TTA

GAA

ATG

ATA

GGT

AAC

1266

Thr

Met

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

Gly

Asn

380

385

390

CAG

GTC

CAA

TCA

GTA

AAA

ATA

AGC

TGC

TTA

TAACTGGAAA

TGGCCATTGA

1316

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Leu

395

400

GCTGTTTCCT CACAATTGGC GAGATCCCAT GGATGATAA 1355 (1) údaje k SEQ ID NO: 125:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 401 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 125:

Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile

1

5

10

15

Lys

Trp

Thr

Gin

Glu

Thr

Phe

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

20

25

30

Glu

Thr

Ser

His

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

35

40

45

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cys

Ala

Pro

50

55

60

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

70

75

80

Leu

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Tyr

Val

Lys

Gin

Glu

85

90

95

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Lys

Glu

Gly

Arg

Tyr

100

105

110

- 122CZ 292587 B6

Leu

Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg

Ser Cys

Pro Pro Gly Phe 125

115

120

Gly

Val

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cye

Lys

Arg

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gin

Lys

165

170

175

Gly

Asn

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Ile

Cys

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Ser

Thr

180

185

190

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

195

200

205

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

Lys

Phe

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

210

215

220

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

val

Glu

Arg

Ile

225

230

235

240

Lys

Arg

Gin

His

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

245

250

255

Trp

Lys

His

Gin

Asn

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Val

Lys

Ile

Gin

260

265

270

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

Glu

Asn

Ser

Val

Gin

Arg

His

Ile

Gly

His

Ala

275

280

285

Asn

Leu

Thr

Phe

Glu

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

290

295

300

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Asp

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Cy3

Lys

305

310

315

320

Pro

Ser

Asp

Gin

Ile

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

325

330

335

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

His

Ala

Leu

Lys

His

Ser

340

345

350

Lys

Thr

Tyr

His

Phe

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

355

360

365

Ile

Arg

Phe

Leu

His

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

370

375

380

Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gin Val Gin Ser Val Lys Ile Ser Cys 385 390 395 400

Leu

- 123CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 126:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 139 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 126:

Cys Pro 1

Gin

Gly Lys Tyr Ile His Pro Gin

Asn

Asn Ser Ile

Cys 15

Cys

5

10

Thr

Lys

Cys

His

Lye

Gly

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gly

Pro

20

25

30

Gly

Gin

Asp

Thr

Asp

Cys

Arg

Glu

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

Phe

Thr

Ala

35

40

45

Ser

Glu

Asn

His

Leu

Arg

His

Cys

Leu

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

Lys

50

55

60

Glu

Met

Gly

Gin

Val

Glu

Ile

Ser

Cys

Thr

Val

Asp

Arg

Asp

Thr

65

70

75

80

Val

Cys

Gly

Cys

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Arg

His

Tyr

Trp

Ser

Glu

Asn

85

90

95

Leu

Phe

Gin

Cys

Phe

Asn

Cys

Ser

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

Val

HiS

100

105

110

Leu

Ser

Cys

Gin

Glu

Lys

Gin

Asn

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

115

120

125

Phe

Leu

Arg

Glu

Asn

Glu

Cys

Val

Ser

Cys

130

135

(1) údaje k SEQ ID NO: 127:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 48 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 127:

CCGGCGGACA TTTATCACAC AGCAGCTGAT GAGAAGTTTC TTCATCCA

-124CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 128:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 219 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 128:

Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val

Ala

1

5

10

15

Arg

Leu

Ser

Lys

Ser

Val

Asn

Ala

Gin

Val

Thr

Asp

Ile

Asn

Ser

20

25

30

Lys

Gly

Leu

Glu

Leu

Arg

Lys

Thr

Val

Thr

Val

Glu

Thr

Gin

Asn

35

40

45

Leu

Glu

Gly

Leu

His

Asp

Gly

Gin

Phe

Cys

His

Lys

Pro

Cys

Pro

50

55

60

Pro

Gly

Glu

Arg

Lys

Ala

Arg

Asp

Cys

Thr

Val

Asn

Gly

Asp

Glu

Pro

65

70

75

80

Asp

Cys

Val

Pro

Cys

Gin

Glu

Gly

Lys

Glu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Ala

His

⁸⁵

90

95

Phe

Ser

Lys

Cys

Arg

Cys

Arg

Leu

Cys

Asp

Glu

Gly

His

Gly

100

105

110

Leu

Glu

Val

Glu

Ile

Asn

Cys

Thr

Arg

Thr

Gin

Asn

Thr

Lys

Cys

Arg

115

120

125

Cys

Lys

Pro

Α3Π

Phe

Cys

Asn

Ser

Thr

Val

Cys

Glu

His

Cys

Asp

130

135

140

Pro

Cys

Thr

Lys

Cys

Glu

His

Gly

Ile

Lys

Glu

Cys

Thr

Leu

Thr

145

150

155

160

Ser

Asn

Thr

Lys

Cys

Lys

Glu

Gly

Ser

Arg

Ser

Α3Π

Leu

Gly

Trp

165

170

175

Leu

Cys

Leu

Pro

Ile

Pro

Leu

Ile

Val

Trp

Val

Lys

Arg

180

185

190

Lys

Glu

Val

Gin

Lys

Thr

Cys

Arg

Lys

HÍS

Arg

Lys

Glu

Asn

Gin

Gly

195

200

205

Ser

His

Glu

Ser

Pro

Thr

Leu

Α3Π

Pro

Glu

Thr

210

215

-125CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 129:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 280 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 129:

Met

Gly

Leu

Sec

Thr

Val

Pro

Asp

Leu

Pro

Leu

Val

Leu

1

5

10

15

Glu

Leu

Val

Gly

Ile

Tyr

Pro

Ser

Gly

Val

Ile

Gly

Leu

Val

Pro

20

25

30

His

Leu

Gly

Asp

Arg

Glu

Lys

Arg

Asp

Ser

Val

Cys

Pro

Gin

Gly

Lys

35

40

45

-126CZ 292587 B6

Tyr Ile His 50

Pro Gin

Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His

Lys

55

60

Gly

Thr

Tyr

Leu

Tyr

Asn

Asp

Cys

Pro

Gly

Pro

Gly

Gin

Asp

Thr

Asp

$5

70

75

80

Cys

Arg

Glu

Cys

Glu

Ser

Gly

Ser

Phe

Thr

Ala

Ser

Glu

Asn

His

Leu

85

90

95

Arg

His

Cys

Leu

Ser

Cys

Ser

Lys

Cys

Arg

Lys

Glu

Met

Gly

Gin

Val

100

105

110

Glu

Ile

Ser

Cys

Thr

Val

Asp

Arg

Asp

Thr

Val

Cys

Gly

Cys

Arg

115

120

125

Lys

Asn

Gin

Tyr

Arg

His

Tyr

Trp

Ser

Glu

Asn

Leu

Phe

Gin

Cys

Phe

130

135

140

Asn

Cys

Ser

Leu

Cys

Leu

Asn

Gly

Thr

Val

His

Leu

Ser

Cys

Gin

Glu

145

150

155

160

Lys

Gin

Asn

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

His

Ala

Gly

Phe

Leu

Arg

Glu

165

170

175

Asn

Glu

Cys

Val

Ser

Cys

Ser

Asn

Cys

Lys

Ser

Leu

Glu

Cys

Thr

180

185

190

Lys

Leu

Cys

Leu

Pro

Gin

ile

Glu

Asn

Val

Lys

Gly

Thr

Glu

Asp

Ser

195

200

205

Gly

Thr

Val

Leu

Pro

Leu

Val

Ile

Phe

Gly

Leu

Cys

Leu

210

215

220

Leu

Ser

Leu

Phe

ile

Gly

Leu

Met

Tyr

Arg

Tyr

Gin

Arg

Trp

Lys

225

230

235

240

Ser

Lys

Leu

Tyr

Ser

Ile

Val

Cys

Gly

Lys

Ser

Thr

Pro

Glu

Lys

Glu

245

250

255

Gly

Glu

Leu

Glu

Gly

Thr

Lys

Pro

Leu

Ala

Pro

Asn

Pro

Ser

260

265

270

Phe

Ser

Pro

Thr

Pro

Gly

Phe

Thr

275 280

-127CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 130:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 207 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 130:

Met Leu Arg Leu Ile

Ala

Leu

Leu Val Cys Val Val Tyr Val Tyr Gly

1

5

10

15

Asp

Val

Pro

Tyr

Ser

Asn

Gin

Gly

Lys

Cys

Gly

His

Asp

20

25

30

Tyr

Glu

Lys

Asp

Gly

Leu

Cys

Ala

Ser

Cys

His

Pro

Gly

Phe

Tyr

35

40

45

Ala

Ser

Arg

Leu

Cys

Gly

Pro

Gly

Ser

Asn

Thr

Val

Cys

Ser

Pro

Cys

50

55

60

Glu

Asp

Gly

Thr

Phe

Thr

Ala

Ser

Thr

Asn

His

Ala

Pro

Ala

Cys

Val

65

70

75

80

Ser

Cys

Arg

Gly

Pro

Cys

Thr

Gly

His

Leu

Ser

Glu

Ser

Gin

Pro

Cys

85

90

95

Asp Arg

Thr

His

Asp

Arg

Val

Cys

Asn

Cys

Ser

Thr

Gly

Asn

Tyr

Cys

100

105

110

Leu

Lys

Gly

Gin

Asn

Gly

Cys

Arg

Ile

Cys

Ala

Pro

Gin

Thr

Lys

115

120

125

Cys

Pro

Ala

Gly

Tyr

Gly

Val

Ser

Gly

His

Thr

Arg

Ala

Gly Asp

Thr

130

135

140

Leu

Cys

Glu

Lys

Cys

Pro

His

Thr

Tyr

Ser

Asp

Ser

Leu

Ser

Pro

145

150

155

160

Thr

Glu

Arg

Cys

Gly

Thr

Ser

Phe

Asn

Tyr

Ile

Ser

Val

Gly

Phe

Asn

165

170

175

Leu

Tyr

Pro

Val

Asn

Glu

Thr

Ser

Cys

Thr

Ala

Gly

His

Asn

180

185

190

Glu Val Ile Lys Thr Lys Glu Phe Thr Val Thr Leu Asn Tyr Thr 195 200 205 (1) údaje k SEQ ID NO: 131:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 227 aminokyselin (Β) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý

-128CZ 292587 B6 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 131:

Met

Ala

Pro

Val

Ala

Val

Trp

Ala

Leu

Ala

Val

Gly

Leu

Glu

Leu

1

5

10

15

Trp

Ala

His

Ala

Leu

Pro

Ala

Gin

Val

Ala

Phe

Thr

Pro

Tyr

20

25

30

Ala

Pro

Glu

Pro

Gly

Ser

Thr

Cye

Arg

Leu

Arg

Glu

Tyr

Asp

Gin

35

40

45

Thr

Ala

Gin

Met

Cys

Ser

Lys

Cys

Ser

Pro

Gly

Gin

His

Ala

Lys

50

55

60

Val

Phe

Cys

Thr

Lys

Thr

Ser

Asp

Thr

Val

Cys

Asp

Ser

Cys

Glu

Asp

65

70

75

80

Ser

Thr

Tyr

Thr

Gin

Leu

Trp

Asn

Trp

Val

Pro

Glu

Cys

Leu

Ser

Cys

85

90

95

Gly

Ser

Arg

Cys

Ser

Asp

Gin

Val

Glu

Thr

Gin

Ala

Cys

Thr

Arg

100

105

110

Glu

Gin

Asn

Arg

Ile

Cys

Thr

Cys

Arg

Pro

Gly

Trp

Tyr

Cys

Ala

Leu

115

120

125

Ser

Lys

Gin

Glu

Gly

Cys

Arg

Leu

Cys

Ala

Pro

Leu

Arg

Lys

Cys

Arg

130

135

140

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Ala

Arg

Pro

Gly

Thr

Glu

Thr

Ser

Asp

val

Val

145

150

155

160

Cys

Lys

Pro

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

Phe

Ser

Asn

Thr

Ser

Thr

165

170

175

Asp

Ile

Cys

Arg

Pro

His

Gin

Ile

Cys

Asn

Val

Ala

Ile

Pro

Gly

180

185

190

Asn

Ala

Ser

Arg

Asp

Ala

Val

Cys

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

Thr

Arg

Ser

195

200

205

Met

Ala

Pro

Gly

Ala

Val

His

Leu

Pro

Gin

Pro

Val

Ser

Thr

Arg

Ser

210

215

220

Gin His Thr

225

- 129CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 132:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 197 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 132:

Met Val Ser Leu Pro

Arg

Leu

Cys Ala Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr

1

5

10

15

Ala

Val

His

Leu

Gly

Gin

Cys

val

Thr

Cys

Ser

Asp

Lys

Gin

Tyr

Leu

20

25

30

His

Asp Gly

Gin

Cys

Asp

Leu

Cys

Gin

Pro

Gly

Ser

Arg

Leu

Thr

35

40

45

Ser

His

Cys

Thr

Ala

Leu

Glu

Lys

Thr

Gin

Cys

His

Pro

Cys

Asp

Ser

50

55

60

Gly

Glu

Phe

Ser

Ala

Gin

Trp

Asn

Arg

Glu

Ile

Arg Cys

His

Gin

His

65

70

75

80

Arg

His

Cys

Glu

Pro

Asn

Gin

Gly

Leu

Arg

Val

Lys

Glu

Gly

Thr

85

90

95

Ala

Glu

Ser

Asp

Thr

Val

Cys

Thr

Cys

Lys

Glu

Gly

Gin

His

Cys

Thr

100

105

110

Ser

Lys

Asp

Cys

Glu

Ala

Cys

Ala

Gin

His

Thr

Pro

Cys

Ile

Pro

Gly

115

120

125

Phe

Gly

Val

Met

Glu

Met

Ala

Thr

Glu

Thr

Asp

Thr

Val

Cys

His

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Val

Gly

Phe

Ser

Asn

Gin

Ser

Leu

Phe

Glu

Lys

145

150

155

160

Cys

Tyr

Pro

Trp

Thr

Ser

Cys

Glu

Asp

Lys

Asn

Leu

Glu

val

Leu

Gin

165

170

175

Lys

Gly

Thr

Ser

Gin

Thr

Asn

Val

Ile

Cys

Gly

Leu

Lys

Ser

Arg

Met

180

185

190

Arg Ala Leu Leu Val

195 (1) údaje k SEQ ID NO: 133:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 208 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

-130CZ 292587 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 133:

Met 1 Glu

Α3Π Trp

Lys Trp Leu Cys

Cys Ala

Leu Leu Val Phe Leu Asp Ile

Ile Asp

Thr Thr 20

5

10

15 Tyr

Gin

Glu

Thr

Phe

Pro 25

Pro

Lys

Tyr

Leu

His 30

Pro

Glu

Thr

Gly

Arg

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

35

40

45

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

50

55

60

Cys

Pro

Asp

Tyr

Ser

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

65

70

75

80

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Thr

Val

Lys

Gin

Glu

85

90

95

Cys

Asn

Arg

Thr

His

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

100

105

110

Leu

Glu

Leu

Glu

Phe

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Leu

115

120

125

Gly

Val

Leu

Gin

Ala

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

130

135

140

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

145

150

155

160

Arg

Lys

His

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

165

170

175

Gly

Α3Π

Ala

Thr

His

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

180

185

190

Gin

Asn

Cy3

Gly

Ile

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

195

200

205

(1) údaje k SEQ ID NO: 134:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 224 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein

-131 CZ 292587 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 134:

Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu

Leu

1

5

10

15

Leu

Gly

Val

Ser

Leu

Gly Gly

Ala

Lys

Glu

Ala

Cys

20

25

30

Pro

Thr

Gly

Leu

Tyr

Thr

His

Ser

Gly

Glu

Cys

Lys

Ala

Cys

Asn

35

40

45

Leu

Gly

Glu

Gly

Val

Ala

Gin

Pro

Cys

Gly

Ala

Asn

Gin

Thr

Val

Cys

50

55

60

Glu

Pro

Cys

Leu

Asp

Ser

Val

Thr

Phe

Ser

Asp

Val

Ser

Ala

Thr

65

70

75

80

Glu

Pro

Cys

Lys

Pro

Cys

Thr

Glu

Cys

Val

Gly

Leu

Gin

Ser

Met

Ser

85

90

95

Ala

Pro

Cye

Val

Glu

Ala

Asp

Ala

Val

Cys

Arg

Cys

Ala

Tyr

Gly

100

105

110

Tyr

Gin

Asp

Glu

Thr

Gly

Arg

Cys

Glu

Ala

Cys

Arg

Val

Cys

115

120

125

Glu

Ala

Gly

Ser

Gly

Leu

Val

Phe

Ser

Cys

Gin

Asp

Lys

Gin

Asn

Thr

130

135

140

Val

Cys

Glu

Cys

Pro

Asp

Gly

Thr

Tyr

Ser

Asp

Glu

Ala

Asn

His

145

150

155

160

Val

Asp

Pro

Cys

Leu

Pro

Cys

Thr

Val

Cys

Glu

Asp

Thr

Glu

Arg

Gin

165

170

175

Leu

Arg

Glu

Cys

Thr

Arg

Trp

Ala

Asp

Ala

Glu

Cys

Glu

Ile

Pro

180

185

190

Gly

Arg

Trp

Ile

Thr

Arg

Ser

Thr

Pro

Glu

Gly

Ser

Asp

Ser

Thr

195

200

205

Ala

Pro

Ser

Thr

Gin

Glu

Pro

Glu

Ala

Pro

Glu

Gin

Asp

Leu

Ile

210

215

220

(1) údaje k SEQ ID NO: 135:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 205 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina ío (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 135:

-132CZ 292587 B6

Met '

Tyr Val '

Trp

val

Gin

Pro

Thr

Ala

Phe

Leu

Gly

Leu

1

5

10

15

Ser

Leu Gly '

Val

Thr

Val

Lys

Leu

Asn

Cys

Val

Lys

Asp

Thr

Tyr

Pro

20

25

30

Ser

Gly

His

Lys

Cys

Arg

Glu

Cys

Gin

Pro

Gly

His

Gly

Met

Val

35

40

45

Ser

Arg

Cys

Asp

His

Thr

Arg

Asp

Thr

Val

Cys

His

Pro

Cys

Glu

Pro

50

55

60

Gly

Phe

Tyr

Asn

Glu

Ala

Val

Asn

Tyr

Asp

Thr

Cys

Lys

Gin

Cys

Thr

65

70

75

80

Gin

Cys

Asn

His

Arg

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Gin

Asn

Cys

Thr

Pro

85

90

95

Thr

Glu

Asp

Thr

Val

Cys

Gin

Cys

Arg

Pro

Gly

Thr

Gin

Pro

Arg

Gin

100

105

110

Asp

Ser

His

Lys

Leu

Gly

Val

Asp

Cys

Val

Pro

Cys

Pro

Gly

115

120

125

His

Phe

Ser

Pro

Gly

Ser

Asn

Gin

Ala

Cys

Lys

Pro

Trp

Thr

Asn

Cys

130

135

140

Thr

Leu

Ser

Gly

Lys

Gin

lle

Arg

His

Pro

Ala

Ser

Asn

Ser

Leu

Asp

145

150

155

160

Thr

Val

Cys

Glu

Asp

Arg

Ser

Leu

Ala

Thr

Leu

Trp

Glu

Thr

165

170

175

Gin

Arg

Thr

Phe

Arg

Pro

Thr

Val

Pro

Ser

Thr

Val

Trp

180

185

190

Pro

Arg

Thr

Ser

Gin

Leu

Pro

Ser

Thr

Pro

Thr

Leu

Val

195

200

205

(1) údaje k SEQ ID NO: 136:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 191 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:136:

-133CZ 292587 B6

Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val

10 15

Gly Cys

Glu Lys Val 20

Gly Ala Val Gin 25

Asn Ser

Cys

Asp

Asn 30

Cys

Gin

Pro

Gly

Thr

Phe

Cys

Arg

Lys

Tyr

Asn

Pro

Val

Cys

Lys

Ser

Cys

Pro

35

40

45

Pro

Ser

Thr

Phe

Ser

Ile

Gly

Gin

Pro

Asn

Cys

Asn

Ile

Cys

50

55

60

Arg

Val

Cys

Ala

Gly

Tyr

Phe

Arg

Phe

Lys

Phe

Cys

Ser

Thr

65

70

75

80

His

Asn

Ala

Glu

Cys

Glu

Cys

Ile

Glu

Gly

Phe

His

Cys

Leu

Gly

Pro

85

90

95

Gin

Cys

Thr

Arg

Cys

Glu

Lys

Asp

Cys

Arg

Pro

Gly

Gin

Glu

Leu

Thr

100

105

110

Lys

Gin

Gly

Cys

Lys

Thr

Cys

Ser

Leu

Gly

Thr

Phe

Asn

Asp

Gin

Asn

115

120

125

Gly

Thr

Gly

Val

Cye

Arg

Pro

Trp

Thr

Asn

Cys

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg

130

135

140

Ser

Val

Leu

Lys

Thr

Gly

Thr

Glu

Lys

Asp

Val

Cys

Gly

Pro

145

150

155

160

Pro

Val

Ser

Phe

Ser

Pro

Ser

Thr

Ile

Ser

Val

Thr

Pro

Glu

165

170

175

Gly

Pro

Gly Gly

His

Ser

Leu

Gin

Val

Leu

Thr

Leu

Phe

Leu

180

185

190

(1) údaje k SEQ ID NO: 137:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 137:

TATGGATGAA GAAACTTCTC ATCAGCTGCT GTGTGATAAA TGTCCGCCGG GTAC (1) údaje k SEQ ID NO: 138:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 380 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

- 134CZ 292587 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:138:

Glu

Thr

Leu

Pro

Lys

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Pro

Glu

Thr

Gly

His

1

5

1Ó

15

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Ala

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

20

25

30

Cys

Thr

Val

Arg

Lys

Thr

Leu

Cys

Val

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Ser

35

40

45

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Val

Tyr

Cys

Ser

Pro

50

55

60

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

65

70

75

80

Αβη

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

85

90

95

Cys

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Ser

Gly

Val

Gin

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Cys

Pro

Asp

Gly

Phe

115

120

125

Phe

Ser

Gly

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

Ile

Lys

His

Thr

Asn

130

135

140

Cys

Ser

Thr

Phe

Gly

Leu

Ile

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

145

150

155

160

Asp

Asn

Val

Cys

Ser

Gly

Asn

Arg

Glu

Ala

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly

ile

165

170

175

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

180

185

190

-135CZ 292587 B6

Lys

Ile

Ile Pro Asn Trp Leu Ser

Val Leu

Val Asp

Ser 205

Leu

Pro

Gly

195

200

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

His

Ser

210

215

220

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

225

230

235

240

Arg

Asp

Gin

Glu

Met

Val

Lys

Ile

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

245

250

255

Glu

Ser

Val

Gin

Arg

His

Leu

Gly

His

Ser

Asn

Leu

Thr

Glu

260

265

270

Gin

Leu

Ala

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Ile

Ser

Pro

275

280

285

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Arg

Lys

Thr

Cys

Lys

Ser

Glu

Gin

Leu

290

295

300

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lye

Asn

Gly

Asp

Gin

A3D

Thr

305

310

315

320

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

Tyr

Ala

Leu

Lys

His

Leu

Lys

Thr

Ser

His

Phe

325

330

335

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

His

Ser

Leu

Arg

Lys

Thr

Met

Arg

Phe

Leu

His

340

345

350

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Arg

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

355

360

365

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Leu

370

375

380

(1) údaje k SEQ ID NO: 139:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 380 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein

- 136CZ 292587 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 139:

Glu Thr Phe 1

Pro

Pro 5

Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His

10

15

Gin

Leu

Cys

Asp

Lys

Cys

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Lys

Gin

His

20

25

30

Cys

Thr

Ala

Lys

Trp

Lys

Thr

Val

Cye

Ala

Pro

Cys

Pro

Asp

His

Tyr

35

40

45

Tyr

Thr

Asp

Ser

Trp

His

Thr

Ser

Asp

Glu

Cys

Leu

Tyr

Cys

Ser

Pro

50

55

60

Val

Cys

Lys

Glu

Leu

Gin

Tyr

Val

Lys

Gin

Glu

Cys

Asn

Arg

Thr

His

65

70

75

80

Asn

Arg

Val

Cys

Glu

Cys

Lye

Glu

Gly

Arg

Tyr

Leu

Glu

Ile

Glu

Phe

85

90

95

Cye

Leu

Lys

His

Arg

Ser

Cys

Pro

Gly

Phe

Gly

Val

Gin

Ala

100

105

110

Gly

Thr

Pro

Glu

Arg

Asn

Thr

Val

Cys

Lys

Arg

Cys

Pro

Aep

Gly

Phe

115

120

125

Phe

Ser

Asn

Glu

Thr

Ser

Lys

Ala

Pro

Cys

Arg

Lys

His

Thr

Asn

130

135

140

Cys

Ser

Val

Phe

Gly

Leu

Thr

Gin

Lys

Gly

Asn

Ala

Thr

His

145

150

155

160

Asp

Asn

Ile

Cys

Ser

Gly

Asn

Ser

Glu

Ser

Thr

Gin

Lys

Cys

Gly

Ile

165

170

175

Asp

Val

Thr

Leu

Cys

Glu

Ala

Phe

Arg

Phe

Ala

Val

Pro

Thr

180

185

190

Lys

Phe

Thr

Pro

Asn

Trp

Leu

Ser

Val

Leu

Val

Asp

Asn

Leu

Pro

Gly

195

200

205

Thr

Lys

Val

Asn

Ala

Glu

Ser

Val

Glu

Arg

Ile

Lys

Arg

Gin

His

Ser

210

215

220

Ser

Gin

Glu

Gin

Thr

Phe

Gin

Leu

Lys

Leu

Trp

Lys

His

Gin

Asn

225

230

235

240

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Val

Lys

Ile

Gin

Asp

Ile

Asp

Leu

Cys

245 250 255

- 137CZ 292587 B6

Glu

Asn Ser Val 260

Gin Arg His

Ile Gly His 265

Ala Asn Leu

Thr 270

Phe

Glu

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

Met

Glu

Ser

Leu

Pro

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

275

280

285

Glu

Asp

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Cys

Lys

Pro

Ser

Asp

Gin

Ile

290

295

300

Leu

Lys

Leu

Ser

Leu

Trp

Arg

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Gin

Asp

Thr

305

310

315

320

Leu

Lys

Gly

Leu

Met

His

Ala

Leu

Lys

His

Ser

Lys

Thr

Tyr

His

Phe

325

330

335

Pro

Lys

Thr

Val

Thr

Gin

Ser

Leu

Lys

Thr

Ile

Arg

Phe

Leu

His

340

345

350

Ser

Phe

Thr

Met

Tyr

Lys

Leu

Tyr

Gin

Lys

Leu

Phe

Leu

Glu

Met

Ile

355

360

365

Gly

Asn

Gin

Val

Gin

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Leu

370

375

380

(1) údaje k SEQ ID NO: 140:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 140:

TGGACCACCC AGAAGTACCT TCATTATGAC (1) údaje k SEQ ID NO: 141:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 141:

GTCATAATGA AGGTACTTCT GGGTGGTCCA (1) údaje k SEQ ID NO: 142:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů

-138CZ 292587 B6 (B) TYP: nukleová kxselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 142:

GGACCACCCA GC7TCATTAT GACGAAGAAA C 31 (1) údaje k SEQ ID NO: 143:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 143:

GTTTCTTCGT CATAATGAAG CTGGGTGGTC C 31 (1) údaje k SEQ ID NO: 144:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 144:

GTGGACCACC CAGGACGAAG AAACCTCTC 29 (1) údaje k SEQ ID NO: 145:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:145:

GAGAGGTTTC TTCGTCCTGG GTGGTCCAC 29

-139CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 146:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:146:

CGTTTCCTCC AAAGTTCCTT CATTATGAC (1) údaje k SEQ ID NO: 147:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 147:

GTCATAATGA AGGAACTTTG GAGGAAACG (1) údaje k SEQ ID NO: 148:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:148:

GGAAACGTTT CCTGCAAAGT ACCTTCATTA TG (1) údaje k SEQ ID NO: 149:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 149:

CATAATGAAG GTACTTTGCA GGAAACGTTT CC

-140CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 150:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 150:

CACGCAAAAG TCGGGAATAG ATGTCAC (1) údaje k SEQ ID NO: 151:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 151:

GTGACATCTA TTCCCGACTT TTGCGTG (1) údaje k SEQ ID NO: 152:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 152:

CACCCTGTCG GAAGAGGCCT TCTTC (1) údaje k SEQ ID NO: 153:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 153:

GAAGAAGGCC TCTTCCGACA GGGTG

- 141 CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 154:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 154:

TGACCTCTCG GAAAGCAGCG TGCA (1) údaje k SEQ ID NO: 155:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 155:

TGCACGCTGC TTTCCGAGAG GTCA (1) údaje k SEQ ID NO: 156:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 156:

CCTCGAAATC GAGCGAGCAG CTCC (1) údaje k SEQ ID NO: 157:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:157:

CGATTTCGAG GTCTTTCTCG TTCTC

- 142CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 158:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 158:

CCGTGAAAAT AAGCTCGTTA TAACTAGGAA 33 (1) údaje k SEQ ID NO: 159:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 159:

CCATTCCTAG TTATAACGAG CTTATTTTCA CGG 33 (1) údaje k SEQ ID NO: 160:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 160:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO:161:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:161:

CCTCTCTCGAGTCAGGTGAC ATCTATTCCA CACTTTTGCG TGGC 44

- 143CZ 292587 B6 (1) údaje k SEQ ID NO: 162:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQIDNO:162:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO: 163:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 163:

CCTCTCTCGA GTCAAGGAAC AGCAAACCTG AAGAAGGC 38 (1) údaje k SEQ ID NO: 164:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:164:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO: 165:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 165:

-144CZ 292587 B6

CCTCTCTCGA GTCACTCTGT GGTGAGGTTC GAGTGGCC 38 (1) údaje k SEQ ID NO: 166:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 166:

CCTCTGAGCT CAAGCTTCCG AGGACCACAA TGAACAAG 38 (1) údaje k SEQ ID NO: 167:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 38 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 167:

CCTCTCTCGA GTCAGGATGT TTTCAAGTGC TTGAGGGC 38 (1) údaje k SEQ ID NO: 168:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 168:

Met Lys His His His His His His His Ala Ser Val Asn. Ala Leu Glu

5 10 15

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná nukleová kyselina, která kóduje polypeptid mající alespoň jednu z biologických aktivit osteoprotegerinu souvisejících s regulací kostního metabolizmu a která je zvolena ze skupiny tvořené:

a) nukleovými kyselinami znázorněnými na obrázcích 2B až 2C (SEQ ID NO: 120), 9A až 9B (SEQ ID NO: 122) a 9C až 9D (SEQ ID NO: 124) nebo jejich komplementárními řetězci;

b) nukleovými kyselinami, které za přísných hybridizačních podmínek hybridizují s polypeptid kódujícími oblastmi znázorněnými na obrázcích 2B až 2C (SEQ ID NO: 120), 9 A až 9B (SEQ ID NO: 122) a 9C až 9D (SEQ ID NO: 124);

c) nukleovými kyselinami, které za přísných hybridizačních podmínek hybridizují s nukleotidy 148 až 337, včetně, znázorněnými na obrázku 1 A; a

d) nukleovými kyselinami, které jsou degenerovanými formami nukleových kyselin (a), (b)a(c).
2. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kterou je cDNA, genomová DNA, syntetická DNA nebo RNA.
3. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, která má alespoň jeden kodon a maximálně všechny kodony preferenční pro expresi na Escherichia coli.
4. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, která má na sobě navázáno detekovatelné značení.
5. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, která zahrnuje polypeptid kódující sekvenci znázorněnou na obrázku 2B až 2C (SEQ IDNO:120), 9A až 9B (SEQ ID NO:122) nebo 9C až 9D (SEQ ID NO: 124).
6. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 5, která je tvořena sekvenčním úsekem sekvence znázorněné na obrázcích 9C až 9D (SEQ ID NO:124) od nukleotidu 158 k nukleotidu 1297.
7. Expresní vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 1.
8. Expresní vektor podle nároku 7, ve kterém nukleová kyselina obsahuje polypeptid kódující sekvenci znázorněnou na obrázcích 9C až 9D, (SEQ ID NO: 124).
9. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfektovaná expresním vektorem podle nároku 7.
10. Hostitelská buňka podle nároku 9, kterou je eukaryotická buňka.
11. Hostitelská buňka podle nároku 10, zvolená ze skupiny zahrnující buňky CHO, COS, 293, 3T3, CV-1 aBHK.
12. Hostitelská buňka podle nároku 9, kterou je prokaryotická buňka.
13. Hostitelská buňka podle nároku 12, kterou je Escherichia coli.
14. Transgenický savec obsahující expresní vektor podle nároku 7 s výjimkou člověka.

-146CZ 292587 B6
15. Transgenický savec podle nároku 14, kterým je hlodavec.
16. Transgenický savec podle nároku 15, kterým je myš.
17. Způsob výroby osteoprotegerinu, OPG, vyznačený tím, že zahrnuje růst hostitelských buněk transformovaných nebo transfektovaných nukleovou kyselinou podle nároku 1 za vhodných živných podmínek a izolaci polypeptidových produktů exprese nukleových kyselin.
18. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou podle nároku 1.
19. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 18, který má aminokyselinovou sekvenci myšího, krysího nebo humánního osteoprotegerinu nebo jejich derivátu a který má alespoň jednu z biologických aktivit osteoprotegerinu souvisejících s regulací kostního metabolizmu.
20. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 19, který má aminokyselinovou sekvenci savčího osteoprotegerinu.
21. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 20, který má aminokyselinovou sekvenci humánního osteoprotegerinu.
22. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 19, který je v podstatě prostý dalších humánních proteinů.
23. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 21, který má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 2B až 2C (SEQ IDNO:121), sekvenci znázorněnou na obrázku 9A až 9B (SEQ ID NO: 123) nebo sekvenci znázorněnou na obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO: 125) nebo jejich derivát}'.
24. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 23, který má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO: 125) tvořenou zbytky 22 až 401, včetně.
25. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 23, který má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO:125) tvořenou zbytky 32 až 401, včetně.
26. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 19, který je produktem exprese exogenní DNA sekvence.
27. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 26, který je produktem exprese exogenní DNA, kterou je cDNA, genomové DNA nebo syntetické DNA.
28. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 19, který je modifikován vodou rozpustným polymerem.
29. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 28, kde je vodou rozpustným polymerem polyethylenglykol.
30. Purifíkovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 19, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci alespoň 164 aminokyselin zahrnující čtyři cysteinově bohaté domény charakteristické pro cysteinově bohaté domény extracelulámích úseků receptorů nádor nekrotizujícího faktoru, přičemž sekvencí je celá sekvence znázorněná na obrázku 2B až 2C (SEQ ID NO: 121), na obrázku 9A až 9B (SEQ ID NO: 123) nebo na obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO: 125), nebo její derivát mající alespoň 85% identitu; a který má schopnost zvyšovat hustotu kosti.

-147CZ 292587 B6
31. Purifikovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 19 obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 2B až 2C (SEQ ID NO: 121), na obrázku 9A až 9B (SEQ ID NO: 123) nebo na obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO: 125), která má na zbytku 22 N-konec a která postrádá na C-konci kyseliny 1 až 216.
32. Purifikovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 31, který zahrnuje aminokyselinovou sekvenci tvořenou aminokyselinovými zbytky 22 až 185, 22 až 189, 22 až 194 nebo 22 až 201, včetně.
33. Purifikovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 32, který dále zahrnuje Fc oblast humánního IgGl navázanou na C-konci.
34. Purifikovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 19 obsahující aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 2B až 2C (SEQ ID NO: 121), obrázku 9A až 9B (SEQ ID NO: 123) nebo obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO: 125), která má na zbytku 22 N-konec a která na N-konci postrádá aminokyselinové zbytky 1 až 10 a případně na C-konci postrádá aminokyselinové zbytky 1 až 216.
35. Purifikovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 34, který zahrnuje aminokyselinovou sekvenci tvořenou aminokyselinovými zbytky 27 až 185, 27 až 189, 27 až 401 nebo 32 až 401, včetně.
36. Purifikovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 35, který dále obsahuje Fc oblast humánního IgGl navázanou na C-konci.
37. Purifikovaný a izolovaný polypeptid podle nároku 20 zvolený ze skupiny tvořené:

huOPG [22-201 ]-Fc huOPG [22-401]-Fc huOPG [22-180]-Fc huOPG met [22-401]-Fc huOPG Fc-met [22-401] huOPG met [22-185] huOPG met [22-189] huOPG met [22-194] huOPG met [27-185] huOPG met [27-189] huOPG met [27-194] huOPG met [32-401] huOPG met-lys [22-401] huOPG met [22^101] huOPG met [22-401 ]-Fc (P25A) huOPG met [22-401] (P25A) huOPG met [22^101] (P26A) huOPG met [22-401] (P26D) huOPG met [22-194] (P25A) huOPG met [22-194] (P26A) huOPG met met-(lys)3 [22-401] huOPG met met-arg-gly-ser-(his)6 [22-401], přičemž huOPG obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 9C až 9D (SEQ ID NO: 125).
38. Nukleová kyselina kódující polypeptid podle nároku 37.

-148CZ 292587 B6
39. Protilátka nebo její fragment, které se specificky váží na osteoprotegerin podle nároku 19.
40. Protilátka podle nároku 39, která je monoklonální protilátkou.
41. Způsob detekce přítomnosti osteoprotegerinu v biologickém vzorku, vyznačený tím, že zahrnuje:

inkubaci vzorku protilátku podle nároku 39 za podmínek, které umožňují navázání protilátky na osteoprotegerin; a detekci navázané protilátky.
42. Způsob hodnocení schopnosti kandidátské látky navázat se na osteoprotegerin, vyznačený tím, že zahrnuje:

inkubaci osteoprotegerinu podle některého z nároků 18 až 37 s kandidátskou látkou za podmínek, které umožňují její navázání; a měření navázané látky.
43. Použití izolované nukleové kyseliny podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro modifikaci živočicha vedoucí k regulaci hladiny osteoprotegerinu v těle živočicha.
44. Použití izolované nukleové kyseliny podle nároku 43, kde nukleová kyselina zvyšuje hladinu osteoprotegererinu ve tkáni.
45. Použití izolované nukleové kyseliny podle nároku 44, kde je živočichem člověk.
46. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství osteoprotegerinu podle nároku 19 ve farmaceuticky přijatelném nosiči, adjuvans, solubilizační činidlo, stabilizační činidlo a/nebo antioxidant.
47. Farmaceutická kompozice podle nároku 46, vyznačená tím, že osteoprotegerinem je humánní osteoprotegerin.
48. Farmaceutická kompozice podle nároku 47, vyznačená tím, že osteoprotegerin má aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 9B.
49. Použití izolovaného a purifikovaného polypeptidů podle nároku 19 pro výrobu léčiva pro léčbu nemocí kostí u živočichů.
50. Použití podle nároku 49, kde je polypeptidem humánní osteoprotegerin.
51. Použití nároku 49, kde je nemocí kostí excesivní ztráta kosti.
52. Použití podle nároku 49 kde je nemocí kostí osteoporóza, Pagetova kostní choroba, hyperkalcemie, hyperparatyreoidismus, steroidem indukovaná osteopenie, ztráta kostní hmoty v důsledku kloubního revmatismu, ztráta kostní hmoty v důsledku osteomyelitidy, osteolytické metastázy a periodontální ztráta kostní hmoty.
53. Použití podle nároku 49, kdy léčba dále zahrnuje podání terapeuticky účinného množství látek zvolených ze skupiny zahrnující kostní morfogenní proteiny BMP-1 až BMP-12, členy rodiny TGF-β, IL-l inhibitory, TNFa inhibitory, protein odvozený z hormonu paratyreoidu a jeho analogy, E řadu prostaglandinů, bisfosfonáty a kost obohacující minerály.

-149CZ 292587 B6
54. Osteoprotegerinový multimer tvořený osteoprotegerinovými monomery, které obsahují celou aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obr. 2B až 2C (SEQ ID NO: 121), obr. 9A až 9B (SEQ ID NO:123) nebo na obr. 9C až 9D (SEQ IDNO:125) nebo jejich část nebo derivát mající alespoň 85% identitu.
55. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, kterým je dimer.
56. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, který je vytvořen pomocí meziřetězcových disulfidových vazeb.
57. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, který je vytvořen spojením Fc úseků odvozených z humánního IgGl.
58. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, který je v podstatě prostý osteo15 protegerinových monomerů a inaktivních multimerů.
59. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, kde monomery obsahují aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO: 125) a tvořenou zbytky 22 až 401, nebo její derivát.
60. Osteoprotegerinový multimer podle nároku 54, kde monomery obsahují aminokyselinovou sekvenci znázorněnou na obrázku 9C až 9D (SEQ ID NO: 125) a tvořenou zbytky 22 až 194, nebo její derivát.