KR100463584B1 - 오스테오프로테게린및그를코드하는핵산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 오스테오프로테게린이라 명명한 신규한 분비 폴리펩티드에 관한 것으로, 이것은 종양 괴사 인자 수용체 상과의 요소이며 골대사 조절에 관계한다. 또한 본 발명은 오스테오프로테게린을 코드하는 핵산, 폴리펩티드, 재조합 벡터와 발현 숙주 세포, OPG에 결합하는 항체 및 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 골다공증과 같은 흡수 증가를 특징으로 하는 골질환 치료에 이용된다.

Description

오스테오프로테게린 및 그를 코드하는 핵산
본 발명은 일반적으로 골대사(bone metabolism) 조절에 관련된 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히 본 발명은 종양 괴사 인자 수용체 상과(superfamily)의 하나인 오스테오프로테게린이라 명명한 신규한 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 폴리펩티드는 골다공증과 같은 골손실 증가를 특징으로 하는 골질환 치료에 사용된다.
폴리펩티드 성장 인자 및 시토킨은 표면 결합 수용체에 각각 특이하게 결합함으로써 세포 성장, 분화 및 대사의 광범위한 변화의 정보를 전달하는 분비 인자이다. 단백질의 한 부류로서, 수용체는 신호 전달(signal transduction)의 구조와 형태에 따라 다양하다. 수용체는 리간드 결합에 관련된 세포외 도메인과 적당한 세포내 신호를 전달하는 세포질 도메인을 갖는 것이 특징이다. 수용체 발현 양식은 궁극적으로 세포가 주어진 리간드에 반응할 것인지를 결정하는 반면, 주어진 수용체의 구조는 리간드 결합에 의해 유도되는 세포 반응을 지휘한다. 단백질 티로신 또는 단백질 세린/트레오닌 인산화를 활성화시키거나 [예를 들어, 혈소판 유도 성장 인자 수용체(PDGFR)] 성장 인자 - β 수용체 - I (TGFβR - I)을 형질감염시킴으로써, G - 단백질 활성화(예를 들어, β -아드레날린성 수용체)를 자극함으로써 및 세포질 신호 전달 단백질(예를 들어, TNFR - 1 및 Fas/APO)과의 결합을 조절함으로써 수용체는 세포질 도메인을 통해 세포내 신호를 전달하는 것으로 알려져 왔다 [Heldin, cell 80, 213 - 223 (1995) 참조].
종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 상과는 세포외 도메인에서 3 내지 6회 반복되는 보존적인 시스테인 - 풍부 모티프를 공유하는 트랜스막 단백질 유형 I 의 한 군이다 [Smith 등의 Cell 76, 953 - 962 (1994) 참조]. 공통적으로, 이러한 반복 단위는 이들 수용체의 리간드 결합 도메인으로부터 형성된다 [ Chen 등의 Chemistry 270, 2874 - 2878 (1995) 참조]. 이들 수용체에 대한 리간드는 TNFα 와 상동성인 단백질과 구조적으로 관련된 군이다 [Goeddel 등의 Cold Spring Harbor Symp. Quart. Biol. 51, 597 - 609 (1986) ; Nagata 등의 Science 267, 1449 - 1456 (1995) 참조]. TNFα는 다르지만 밀접하게 관련된 수용체인 TNFR - 1 및 TNFR - 2 와 결합한다. TNFα 는 증식, 분화 및 세포독성과 세포 사멸을 포함한 수용체 관련 세포의 다양한 생물학적 반응을 일으킨다 [Beutler 등의 Ann. Rev. Biochem, 57, 505 - 518 (1988) 참조].
TNFα 는 급성 및 만성 염증 반응을 조절하는 것으로 여겨진다 [Beutler 등의 Ann. Rev. Biochem. 57, 505 - 508 (1988) 참조]. TNFα 의 전신 운반은 독성 쇽 및 광범위한 종양 괴사를 유도한다. 이것 때문에, TNFα 는 패혈증을 포함한 다양한 감염 질환에 관련된 심각한 질병 및 사망에 책임이 있다. TNFR - 관련 수용체 Fas/APO 에 대한 리간드인 FasL 의 돌연변이[Suda 등의 Cell 75, 1169 - 1178 (1993) 참조]는 자가면역과 관련된 반면 [ Fisher 등의 Cell 81, 935 - 946 (1995) ], FasL 의 과다생산은 약물 - 유도 간염과 관계될 것이다. 그러므로, 다양한 TNFR - 관련 단백질에 대한 리간드는 종종 많은 질환 상태의 심각한 영향을 조절하는데, 이것은 이들 리간드의 활성도를 중화시키는 약물이 치료학적 가치를 가짐을 시사한다. 전신성 TNFα 를 중화시키는 능력에 대해 가용성 TNFR - 1 수용체 및 TNFα 에 결합하는 항체를 실험하였다 [Loetscher 등의 Cancer Cells 3(6), 221 - 226 (1991) 참조]. 자연발생적인 형태의 분비성 TNFR-1 mRNA 를 최근에 클로닝하였고, 시험관내 및 생체내 TNFα 활성도를 중화시키는 능력에 대해 그 생산물을 실험하였다[Kohno 등의 PNAS USA 87, 8331 - 8335 (1990) 참조]. TNFα 를 중화시키는 이 단백질의 능력은 TNF 에 결합하여 제거함으로써 TNFR - 관련 세포에 대한 세포독성 효과를 차단하는 가용성 TNF 수용체 기능을 의미한다.
본 발명의 목적은 TNFR 상과의 신규한 요소를 확인하는 것이다. 신규한 과의 요소는, 세포외 도메인은 포함하고 트랜스막 및 세포질 도메인은 결핍된 트랜스막 단백질 또는 그것의 가용성 형태일 것으로 예상된다. 우리는 TNFR - 2 에 밀접하게 관련된 분비성 단백질을 코드하는 TNFR 상과의 신규한 요소를 확인하였다. 가용성 TNFR - 1 과 비교하여, TNFR - 2 관련 단백질은 리간드의 활성도를 마이너스 조절할 것이므로 인간의 특정 질환 치료에 유용할 것이다.
발명의 요약
종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 상과의 신규한 요소는 랫의 태아 장 cDNA 라이브러리로부터 확인하였다. 전장의 cDNA 클론을 수득하여 서열을 결정하였다. 형질전환 마우스에서의 랫 cDNA 발현은 골 밀도, 특히 장골, 골반 및 척추에서 현저하게 증가하였다. cDNA 에 의해 코드되는 폴리펩티드를 오스테오프로테게린(OPG)이라 명명하고 이것은 골 축적을 촉진시키는 역할을 한다.
본 발명은 적어도 하나의 OPG 생물학적 활성도를 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 제공한다. 도 2B - 2C (서열번호 : 120), 도 9A - 9B (서열번호 : 122), 및 도 9C - 9D (서열번호 : 124) 에 나타나 있는 바와 같이 마우스, 랫 또는 인체 OPG 를 코드하는 핵산에 혼성화되는 핵산 또한 제공한다. OPG 는 포유동물의 OPG 가 바람직하며, 인체 OPG 가 더욱 바람직하다. 재조합 벡터 및 OPG 를 발현하는 숙주 세포 또한 재조합 OPG 를 생산하는 방법과 마찬가지로 본 발명에 포함된다. 폴리펩티드에 특이하게 결합하는 항체 또는 그것의 단편 또한 기술되어 있다.
또한 본 발명은 골질환 치료방법을 제공한다. 폴리펩티드는 골흡수를 막는 데 유용하며 골다공증, 칼슘과잉혈증 및 골의 파제트병과 같은 골 손실 및 류마티스성 관절염 또는 골수염 등에서 기인하는 골 손실을 초래하는 모든 증상을 치료하는 데에 이용될 것이다. 골질환은 또한 본 발명의 핵산을 이용한 안티 - 센스 또는 유전자 치료로 치료될 수 있다. 본 발명은 OPG 핵산 및 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물도 포함한다.
도 1A 는 신규한 EST LORF 의 FASTA 분석을 나타낸 것이다. 인체 TNFR - 2 서열에 대하여 일렬로 정렬시킨 FRl - 1 아미노산의 추정 서열이 나타나 있다. 도 1B 는 신규한 EST LORF 의 측면 분석이다. TNFR- 측면에 대해 일렬로 정렬시킨 FRl - 1 아미노산의 추정 서열이 나타나 있다. 도 1C 는 신규한 FRl - 1 에 상동인 TNFR 상과의 지정 영역의 구조도이다.
도 2 는 TNFR 상과의 신규한 요소인 전장의 랫 OPG 유전자의 구조 및 서열을 나타낸 것이다. 도 2A 는 pMOB - B1.1 삽입물의 지도이다. 상자는 cDNA 서열 (굵은 선) 내의 LORF 위치를 나타낸다. 블랙 박스는 신호 펩티드를 나타내며 회색의 타원은 시스테인이 풍부한 반복 서열의 위치를 나타낸다. 도 2B 및 2C 는 랫의 OPG cDNA 의 핵산 및 단백질 서열이다. 예상되는 신호 펩티드는 밑줄을 긋고 N - 결합 글리코실화 영역의 가능한 부위는 굵게 표시하여 철자 밑에 줄을 그었다. 도 2D 및 2E 는 TNFR 상과의 다른 요소인 fas (서열번호 : 128) ; tnfr1 (서열번호 : 129) ; sfu - t2 (서열번호 : 130) ; tnfr2 (서열번호 : 131) ; cd40 (서열번호 : 132) ; osteo (서열번호 : 133) ; ngfr (서열번호 : 134) ; ox40 (서열번호 : 135) ; 41bb (서열번호 : 136)과 OPG 의 파일업 서열 비교 (Pileup sequence comparison) (위스콘신 GCG 패키지, 버전 8.1) 를 나타낸 것이다.
도 3 은 예상되는 랫 OPG 단백질 서열의 펩플롯분석 (PepPlot analysis) (위스콘신 GCG 패키지, 버전 8.1)을 나타낸 것이다. 도 3A 는 소수성 (위) 및 친수성 (아래) 아미노산을 나타내는 랫 OPG 의 대략도이다. 또한 염기성 (위) 및 산성 (아래) 아미노산도 나타나 있다. 도 3B 는 Chou 및 Fasman 의 Adv. Enz. 47, 45 - 147 (1948) 에 정의된 바와 같이 베타 - 쉬트 형성 (위) 및 베타 - 쉬트 파괴 (아래) 아미노산 잔기를 나타낸 것이다. 도 3C 는 알파 - 헬릭스 및 베타 - 쉬트에 대한 측정 경향 (Chou 및 Fasman 의 동일문헌 참조) 을 나타낸 것이다. 1.00 이상의 곡선은 알파 - 헬릭스 또는 베타 - 쉬트 구조의 경향을 나타낸다. 구조는 곡선이 1.00 이하로 하락하는 지점의 단백질 잔기에서 끝날 것이다. 도 3D 는 알파 - 형성 (위) 또는 알파 - 파괴 (아래) 잔기를 나타낸 것이다. 도 3E 는 알파 및 베타 구조의 아미노 말단에서 특유하게 발견되는 서열 (Chou 및 Fasman 의 동일문헌 참조) 과 비교한 단백질 서열의 비를 나타낸 것이다. 도 3F 는 알파 및 베타 구조의 카르복실 말단에서 대표적으로 발견되는 서열 (Chou 및 Fasman의 동일문헌 참조) 과 비교한 단백질 서열의 비를 나타낸 것이다. 도 3G 는 턴 (turn) 에서 대표적으로 발견되는 단백질 서열 (Chou 및 Fasman 의 동일문헌 참조) 의 비를 나타낸 것이다. 도 3H 는 서열내 각 위치에서 헬릭스의 소수성 모멘트 [Eisenberg 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 140 - 144 (1984) 참조]를 나타낸 것이다. 도 31 는 Kyte 및 Doolittle [J. Mol Biol. 157, 105 - 132 (1982)] 및 Goldman 등의 [reviewed in Ann. Rev. Biophys. Chem. 15, 321 - 353 (1986)] 문헌에 기초한 평균 수치료법을 나타낸 것이다.
도 4 는 인체 조직에서 OPG cDNA 에 대한 mRNA 발현 형태를 나타낸 것이다. 32P - 표지 랫 cDNA 삽입물(도 2A, 왼쪽 두 패널) 또는 인체 cDNA 삽입물(도 2B 오른쪽 패널) 로 노던 블롯을 실시하였다.
도 5 는 간세포에서 OPG cDNA 를 발현하는 형질전환 마우스의 창조를 나타낸 것이다. 마우스의 간에서 HE - OPG 트랜스유전자의 노던 블롯 발현을 나타낸다.
도 6 은 OPG 형질전환 마우스의 골밀도 증가를 나타낸 것이다. 도 6A - 6F 는 대조 마우스이고, 도 6G - 6J 는 OPG 발현 마우스이다. 부검시에 모든 동물의 방사선 사진을 찍고 사진을 찍었다. 도 6A - 6F 에서, 대조 동물 및 형질전환 비 - 발현자(#28) 의 방사선 사진이 나타나 있다. 분명하게 윤곽이 뚜렷한 피질 및 맑은 중추 골수강을 갖는 골을 주목하라. 이와는 대조적으로, OPG (G - J) 동물은 불완전하게 한정된 피질 및 골수대의 밀도 증가를 보였다.
도 7 은 OPG 형질전환 마우스내 골소주 (trabecular bone) 의 증가를 나타낸 것이다. 도 7A - 7D 는 대조동물 골의 대표적인 현미경 사진이다. 도 7A 및 7B는 대퇴골의 저배율 (4×, 10×) 상을 나타낸 것이다(메이슨 트리크롬 염색). 주석산염 산저항성 포스파타제 (TRAP) 로 착색된 것은 연골 (도 7C) 및 골소주 (도 7D) 둘 다를 흡수하는 파골세포를 설명하는 것이다(화살표 참조). 골소주 상의 파골세포의 평평한 모양을 주목하라. 도 7E - 7H 는 OPG - 발현 동물 골의 대표적인 현미경 사진이다. 도 7E 및 7F 는 대퇴골의 저배율 (4×, 10×) 상을 나타낸 것이다. 투명한 부위가 성장판 연골이고 청색으로 염색된 부분이 골이며, 붉은 부분이 골수이다. 대조와는 달리 골소주가 일반적인 골수강의 부재를 초래하여 재흡수되지 않았음을 주목하라. 또한, 결과적인 소주는 청색과 투명한 부분으로 다양하게 나타난다. 투명한 부위는 절대로 수정되지 않는 성장판 연골의 단편이다. TRAP 염색에 근거하여, 이들 동물은 성장판에 파골세포를 갖는데(화살표 참조), 전체수는 감소할 수도 있다. 그러나, 성장판에서 떨어진 소주 표면은 실제로 파골세포가 전혀 없으며 (도 7H 참조), 대조 동물과는 달리 똑바로 서 있음을 발견하였다 (도 7D 참조).
도 8 은 단구 - 대식세포 발육에 있어서 HE - OPG 발현자가 결핍되지 않았음을 나타낸다. 마우스의 골화석증의 원인 중 하나는 M - CSF 유전자의 점돌연변이에서 기인하는 불완전한 M - CSF 생산이다. 이것은 순환성 및 조직 기저성 대식세포의 현저한 부족을 초래한다. OPG 발현자의 말초 혈액은 H1E 분석에 의해 평가된 바와 같이 단구세포를 함유하였다. 조직 대식세포의 존재를 확인하기 위해서, 마우스의 대식세포 상에서 세포 표면 항체를 인식하는 면역조직화학을 F480 항체를 이용하여 실시하였다. 도 8A 및 8C 는 정상 및 CR1 과발현자로부터의 비장에 대한 저배율 (4×) 현미경 사진이다. 두 동물 모두 수많은 F480 양성 세포를 가짐에 주목하라. 단구 - 대식세포 또한 정상 (도 8B) 및 HE - OPG 과발현자 (도 8D) (40×) 의 골수에 존재하였다.
도 9 는 마우스와 인체 OPG cDNA 클론의 구조 및 서열을 나타낸 것이다. 도 9A 및 9B 는 마우스의 cDNA 및 단백질 서열을 나타낸 것이다. 도 9C 및 9D 는 인체 cDNA 및 단백질 서열을 나타낸 것이다. 예상되는 신호 펩티드는 밑줄을 긋고, N - 결합 글리코실화의 가능한 부위는 굵게 표시한다. 도 9E 및 9F 는 랫, 마우스 및 인체 OPG 아미노산 서열을 정렬시켜 비교한 것이다.
도 10 은 TNFR - 1 및 인체 OPG 의 세포외 도메인에 존재하는 보존 서열을 비교한 것이다. TNFR1 및 OPG 정렬의 프리티플롯(PrettyPlot) (위스콘신 GCG 패키지, 버전 8.1) 은 실시예 6에 기술되어 있다. 맨 윗줄은 도메인 1 - 4 를 코드하는 인체 TNFR1 서열이다. 가운데 줄은 도메인 1 - 4 를 코드하는 인체 OPG 서열이다. 보존 잔기는 직사각형의 상자로 강조한다.
도 11 은 인체 OPG 의 입체도이다. 인체 TNFβ(가는 선) 와 함께 결정화한 인체 OPG 잔기 25 내지 163 (굵은 선)의 예상되는 3 차 구조의 몰스크립트 디스플레이 (Molescript display) 의 측면도이다. 방향에 대하여 언급한 바와 같이, OPG 폴리펩티드 골격을 따라 있는 굵은 화살표는 N - 말단에서 C - 말단 방향을 가리킨다. 각 시스테인 잔기의 곁사슬 위치는 각각의 시스테인이 풍부한 도메인을 표시하기 위해 폴리펩티드 골격을 따라 삽입된다. TNFβ 분자는 Banner 등의 (1993) 에 기술된 바와 같이 정렬시킨다.
도 12 는 OPG 시스테인 - 풍부 도메인의 구조이다. 예상되는 OPG 의 도메인 구조를 강조한 인체 (윗줄, 서열번호 : 136) 및 마우스 (아랫줄) 의 OPG 아미노산 서열을 정렬시킨 것이다. 폴리펩티드는 반으로 나누어진다 ; N -말단 (A) 및 C - 말단 (B). 절반의 N - 말단은 4 개의 시스테인 풍부 도메인을 함유할 것으로 예상된다(1 - 4로 표시). 예상되는 사슬간의 이황화물 결합은 굵은 선으로 나타내고 "SS1", "SS2" 또는 " SS3" 으로 표시한다. 티로신 28 및 히스티딘 75(밑줄) 는 이은 결합을 이루는 것으로 예상된다. OPG 리간드와 상호작용 할 것으로 예상되는 그들 아미노산은 적당한 잔기 위에 진한 점으로 표시하였다. OPG 의 C - 말단 절반에 위치하는 시스테인 잔기는 직사각형의 상자로 표시한다.
도 13 은 전장(full-length) 및 절단된 마우스 OPG - Fc 융합 단백질의 발현 및 분비를 나타낸 것이다. 도 13A 는 인체 lgG1 Fc 도메인에 대한 융합 지점을 나타내는 지도를 화살촉 모양으로 표시한 것이다. 도 13B 는 Fl. Fc(루이신 401 에서 전장의 OPG 에 융합된 Fc) 또는 CT. Fc (트레오닌 180 에서 카르복시 - 말단이 절단된 OPG 에 융합된 Fc) 융합 단백질 발현 벡터 중 하나를 발현하는 세포로부터 수득한 조정배지의 SDS - 폴리아크릴아미드 겔의 은 착색을 나타낸 것이다. 1 레인은 모 pCEP4 발현 벡터 세포주 ; 2 레인은 Fl. Fc 벡터 세포주 ; 3 레인은 CT.Fc 벡터 세포주이다. 도 13C 는 항 - 인체 lgG1 Fc 도메인 (피어스에서 구입)으로 탐침한 Fl. Fc 및 CT. Fc 융합 단백질 발현 벡터로부터 수득한 조정 배지의 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다. 1 레인은 모 pCEP4 발현 벡터 세포주 ; 2 레인은 Fl. Fc 벡터 세포주 ; 3 레인은 CT. Fc 벡터 세포주이다.
도 14 는 E. coli 에서의 인체 OPG 발현을 나타낸 것이다. 도 14A 는 박테리아 발현 벡터의 구성을 보여준다. 인체 OPG 유전자의 LORF 를 PCR 에 의해 증폭하고 올리고누클레오티드 링커 단편 (윗 가닥은 서열번호 : 137 이고, 아래 가닥은 서열번호 : 127 이다) 에 결합시킨 다음 pAMG21 벡터 DNA 내로 결합시켰다. 그 결과 생성된 벡터는 N - 말단 메티오닌 잔기에 결합되는 OPG 잔기 32 - 401 을 발현할 수 있다. 도 14B 는 비유도 및 유도 박테리아성 pAMG21 - 인체 OPG - 32 - 401 플라스미드의 SDS - PAGE 분석을 나타낸 것이다. 1 레인은 분자량 표준 ; 2 레인은 비유도 박테리아 ; 3 레인은 30 ℃ 에서 유도 ; 4 레인은 37 ℃ 에서 유도 ; 5 레인은 37 ℃ 에서 유도한 전체 세포 용균액 ; 6 레인은 전체 세포 용균액의 가용성 단편 ; 7 레인은 전체 세포 용균액의 불용성 단편 ; 8 레인은 전체 세포 용균액으로부터 수득한 정제된 봉입체를 나타낸다.
도 15 는 CHO 세포에서 생산된 재조합 마우스 OPG 의 SDS - PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의한 분석을 나타낸 것이다. 동량의 CHO 조정 배지를 각 레인에 가하였고, 환원 시료 완충액 (왼쪽 레인), 또는 비환원 시료 완충액 (오른쪽 레인) 중 하나로 처리함으로써 제조하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 나일론 막에 전이시킨 다음 항 - OPG 항체로 탐침하였다. OPG 의 55 kd 단량체 및 100 kd 의 이량체의 상대적인 위치는 화살촉 모양으로 표시한다.
도 16 은 CHO 세포에서 생산된 재조합 마우스 OPG 의 펄스 - 체이스 분석 (Pulse - chase analysis)을 나타낸 것이다. CHO 세포를 35S - 메티오닌/시스테인으로 펄스 - 표지한 다음 지정 시간 동안 추적하였다. 대사적으로 표지한 배양액을 조정 배지 및 세포로 분리하고, 각각으로부터 세정제 추출물을 제조하고 맑아지게 한 다음 항 - OPG 항체로 면역침강시켰다. 면역침강물을 SDS - PAGE에 의해 분리하고 필름에 노출시켰다. 상부의 왼쪽 및 오른쪽 패널은 비환원 조건하에서 분석한 시료이다. 하부의 왼쪽 및 오른쪽 패널은 환원 조건하에서 분석한 시료이다. 상부 및 하부의 왼쪽 패널은 세포 추출물이며, 상부 및 하부의 오른쪽 패널은 조정 배지 추출물이다. OPG 55 kd 단량체 및 100 kd 이량체의 상대적인 이동성은 화살촉 모양으로 표시한다.
도 17 은 CTLL - 2 세포주에서의 OPG 발현을 나타낸 것이다. CTLL - 2 세포 및 CHO - muOPG [1 - 401] 형질감염 세포로부터의 무혈청 조정 배지를 준비하여 농축시킨 다음 비환원 SDS - PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 왼쪽 레인은 CTLL - 2 조정배지이고, 오른쪽 레인은 CHO - muOPG 조정 배지이다. OPG 의 55 kd 단량체 및 100 kd 이량체의 상대적인 이동성은 화살촉 모양으로 표시한다.
도 18 은 대조 및 OPG 형질전환 마우스로부터 수득한 간 추출물 및 혈청 시료에서의 OPG 발현을 검출한 것이다. 형질전환 마우스는 실시예 4 에 기술한 바와 같이 구성하였다. SDS - PAGE 에 이어 항 - OPG 항체를 이용한 웨스턴 블로팅 후에 OPG 발현을 가시화하였다.
도 19 는 시험관내 파골세포 형성에 대한 huOPG [22 - 401] - Fc 융합 단백질의 효과를 나타낸 것이다. 파골세포 형성 검정은 실시예 11A 에 기술한 바와 같이 지정량의 huOPG [22 - 401] - Fc 융합의 부재(대조) 및 존재시에 실시하였다. 주석산염 산 포스파타제(TRAP) 에 대한 조직화학적 염색으로 파골세포 형성을 가시화하였다. 도 19A 는 OPG - 100 ng/ml, 도 19D 는 OPG 0.1 ng/ml, 도 19E 는 OPG 0.1 ng/ml, 도 19F 는 OPG 0.001 ng/ml 를 가한 것이고, 도 19G 는 OPG 를 가하지 않은 대조이다.
도 20 은 OPG 의 양이 증가함에 따라 파골세포 배양액의 TRAP 활성도 감소를 나타낸 것이다. 실시예 11A 에 기술한 바와 같이 측정한 파골세포 형성 검정 및 TRAP 활성도에 지정 농도의 huOPG [22 - 401] - Fc 융합 단백질을 가하였다.
도 21 은 파골세포 분화의 종결 단계에 대한 OPG 의 영향을 나타낸 것이다. 파골세포 형성 검정시 파골세포 성숙의 중간 단계 (5 - 6 일 ; OPG - CTL) 또는 파골세포 성숙의 총결 단계 (7 - 15 일 : CTL - OPG) 중에 huOPG [22 - 401] - Fc 융합체를 가하였다. TRAP 활성도를 측정하고, 전체에 걸쳐 OPG 의 존재시 (OPG - OPG) 에 OPG 의 부재시 (CTL - CTL) 에서 관찰되는 활성도와 비교하였다.
도 22 는 마우스에서 혈액의 칼슘 이온화에 대한 lL - 1β, lL - 1α 및 OPG 에 대한 효과를 나타낸 것이다. lL - 1β 단독, lL - 1α 단독, lL - 1β + muOPG [22 - 401] - Fc , lL - 1α + MuOPG [22 - 401]- Fc 및 muOPG [22 - 401] - Fc 단독 주입 후 혈액내 칼슘 이온화 수준을 모니터하였다. 대조 마우스에게는 인산완충식염수(PBS) 만을 주입하였다. lL - 1β 실험은 도 22A 에 나타나 있고 ; lL - 1α 실험은 도 22B 에 나타나 있다.
도 23 은 대조 마우스 및 lL1 - 처리 마우스의 두개관 파골세포에 대한 OPG 의 효과를 나타낸 것이다. 마우스의 두개관골 시료의 분석을 위한 조직학적 방법은 실시예 11B 에 기술되어 있다. 화살표는 2 일 - 처리 마우스에 존재하는 파골세포를 나타낸다. 마우스의 두개관 시료에 매일 4 회씩 PBS 를 주입한 마우스 (도 23A), 매일 lL - 1을 1회, PBS를 3 회씩 주입한 마우스 (도 23B), 매일 PBS 를 1 회, OPG 를 3 회씩 주입한 마우스 (도 23C), 매일 lL - 1 을 1 회, OPG 를 3 회씩 주입하였다.
도 24 는 정상적인 마우스의 골수강내 골축적에 대한 방사선 사진 분석을 나타낸 것이다. 14 일 동안 식염수 (도 24A) 또는 muOPG[22 - 401] - Fc 융합체 (5 mg/kg/d) (도 24B) 를 마우스에게 피하투여하고, 실시예 11C 에 기술한 바와 같이 골밀도를 측정하였다.
도 25 는 정상적인 마우스의 골수강내 골축적에 대한 조직형태학적 분석을 나타낸 것이다. 실시예 11C 에 기술한 바와 같이 투여 실험 및 골 조직학을 실시하였다.
도 26 은 정상적인 마우스의 골수강내 골축적에 대한 조직학적 분석을 나타낸 것이다. 실시예 11C 에 기술한 바와 같이 투여 실험 및 골 조직학을 실시하였다. 도 11A 는 식염수를 투여한 것이고, 도 11B 는 muOPG [22 - 401] - Fc 융합체를 투여한 것이다.
도 27 은 난소절개 랫에 투여한 OPG 의 활성도를 나타낸 것이다. 이러한 2 주 실험에서, 골밀도의 감소 경향은 OPG 또는 그외의 항 - 흡수 치료에 의해 막을 수 있을 것으로 보인다. DEXA 측정은 난소절개시 및 1 주, 2 주 치료 후에 하였다. 결과는 초기 골밀도의 변화율 (%) (평균 +/- SEM)로 표시하였다.
도 28 은 조직형태학적 방법에 의해 측정한 대퇴골의 골간단에서의 골밀도가, 난소절개 17 일 후 가짜로 수술한 동물 (SHAM) 보다 난소절개 랫 (OVX) 에서 더 낮게 나타나는 경향이 있다. 이러한 결과는 부형제 처리한 난소절개 랫 (OVX) 보다 상당히 높은 골밀도(평균 +/- SEM) 를 갖는 OPG - Fc 처리 난소절개 랫 (OVX + OPG) 처럼 OPG - Fc 에 의해 막을 수 있다.
종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 상과의 신규한 요소는 태아 랫의 장 cDNA 라이브러리로부터 분리한 발현 서열 표식(EST)으로 확인하였다. 전장의 랫 cDNA 클론 및 그에 해당하는 마우스와 인체 cDNA 클론의 구조를 실시예 1 및 6 에 기술한 바와 같이 측정하였다. 랫, 마우스 및 인체 유전자는 각각 도 2B - 2C (서열번호 : 120), 도 9A - 9B (서열번호 : 122) 및 도 9C - 9D (서열번호 : 124) 에 나타나 있다. 세 개의 모든 서열은 TNFR 군 요소의 세포외 도메인과 매우 유사한 것으로 나타났다. 분리된 전장의 cDNA 클론 중 어느 것도 막 - 결합 수용체로 예상되는 트랜스막 및 세포질 도메인을 코드하지는 않는데, 이것은 이들 cDNA 가 세포 표면 수용체 보다는 가용성의 분비 단백질을 코드함을 시사한다. 도 9D 에 나타난 1200 - 1353 누클레오티드에 걸친 인체 유전자의 일부를 1995년 11월 22일에 기탁 번호 제 17188769 호로 진뱅크 데이터베이스에 기탁하였다. 실시예 2 에 기술한 바와 같이, 랫 및 인체 mRNA 의 조직 분포를 측정하였다. 랫의 경우, mRNA는 신장, 간, 태반 및 심장에서 발현하는 것으로 검출되었으며, 신장에서 가장 높게 발현되었다. 골격근 및 이자에서의 발현도 검출되었다. 인체의 경우, 림프절, 흉선, 비장 및 충양돌기와 함께 동일한 조직에서 발현이 검출되었다.
간 - 특이 ApoE 프로모터 발현계를 이용하여 형질전환 마우스에서 랫 cDNA 를 발현시켰다(실시예 3). 발현 분석시 골밀도, 특히 장골(대퇴골), 척추 및 편평골 (골반)의 현저한 증가를 보였다. 골의 착색 부분의 조직학적 분석시, 골과 연골의 현저한 축적을 유도하는 골 형성과 흡수 사이에 현저한 불균형을 보이는 심각한 골화석증(실시예 4 참조)이 나타난다. OPG 발현 동물의 골내 소주파골세포 수의 감소는, TNFR - 관련 단백질 활성도의 상당 부분이 파골세포에 의해 조절되는 과정인 골흡수를 막는 것임을 시사한다. 형질전환 발현자의 활성도를 고려하여 본원에 기술된 TNFR - 관련 단백질을 OPG 라 명명한다.
랫의 cDNA 서열을 이용하여, 마우스 및 인체 cDNA 클론을 분리하였다(실시예 5). 293 세포에서의 마우스 OPG 및 E. coli 에서의 인체 OPG 발현은 실시예 7 및 8 에 기술되어 있다. 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 정제된 Fc 융합체로서 마우스 OPG 를 생산하였다. 인체 lgG1 의 Fc 부위에 대한 융합 폴리펩티드 또는 비융합 폴리펩티드 중 하나로서 CHO 및 293 세포에서 발현되는 전장의 및 절단된 인체 및 마우스 OPG 폴리펩티드 또한 실시예 7 에 기술되어 있다. Fc 융합 폴리펩티드 또는 비융합 폴리펩티드 중 하나로 E. coli 에서 발현되는 전장의 및 절단된 인체 및 마우스 OPG 는 실시예 8 에 기술되어 있다. 재조합적으로 생산된 포유동물 및 박테리아성 OPG의 정제는 실시예 10 에 기술되어 있다. 시험관내 파골세포 성숙 검정, 칼슘과잉혈증을 유도하는 인터루킨 - 1 (lL - 1) 의 생채내 모델 및 정상적인 마우스내 골밀도의 주입 연구를 이용하여 OPG 의 생물학적 활성도를 결정하였다(실시예 11 참조). CHO 또는 293 세포에서 생산된 다음의 OPG 재조합 단백질을 E. coli 파골세포 성숙 검정으로 활성도를 측정하였다 : muOPG[22 - 185] - Fc , muOPG[22 - 194] - Fc, muOPG[22 - 401] - Fc, muOPG [22-401], huOPG [22-201] - Fc, huOPG [22-401] - Fc. CHO 세포에서 생산된 muOPG [22 - 180] - Fc 및 E. coli 에서 생산된 huOPG met [32 - 401]은 시험관내 검정에서 활성도를 확인하지 못했다. 몇몇 원료로부터의 OPG 는 이량체 및 어느 한도까지는 더 높은 다량체로서 생산되었다. 랫 OPG [22 - 401]는 형질전환 마우스에서 생산되었고, muOPG[22 - 401] 및 huOPG [22 - 401]은 CHO 세포에서 재조합 폴리펩티드로 생산되었으며, 세포독성 T 세포주로부터의 자연발생적인 산물로 발현된 OPG 는 비환원 SDS 겔 상에서 분석하였을 때 주로 이량체와 삼량체였다(실시예 9 참조). 아미노산 186 - 401 영역이 결실된 절단형 OPG 폴리펩티드(예를 들어, OPG [1 - 185] 및 OPG [1 - 194]는 주로 단량체인데, 이것은 186 - 401 영역이 OPG 폴리펩티드의 자가 - 결합과 관련됨을 시사한다. 그러나, E. coli 에서 생산된 huOPG met [32 - 401]은 대부분 단량체였다.
OPG는 골흡수 조절에 중요할 것이다. 단백질은 TNF 군의 가용성 수용체로서 작용하는 듯하며, 용골성 경로와 관련된 수용체 - 리간드 상호작용을 막을 것이다. 조절의 한 양상은 파골세포의 수의 감소로 나타난다.
핵산
본 발명은 OPG 의 생물학적 활성도 중 적어도 하나를 갖는 폴리펩티드를 코드하는 분리된 핵산을 제공한다. 본원에 기술한 바와 같이, OPG 의 생물학적 활성도는 골대사와 관련된 활성도, 특히 골밀도 증가를 포함하지만 이것으로 제한되지는 않는다. 본 발명의 핵산은 다음 중에서 선택한 것이다 :
(a) 도 2B - 2C (서열번호 : 120), 도 9A - 9B (서열번호 : 122) 및 도 9C - 9D (서열번호 : 124) 에 나타나 있는 핵산 서열 또는 그의 상보적 가닥 ;
(b) 도 2B - 2C (서열번호 : 120), 도 9A - 9B (서열번호 : 122) 및 도 9C - 9D (서열번호 : 124)의 폴리펩티드 - 코딩 영역과 엄격한 조건하에서 혼성화되는 핵산 ;
(c) 도 1A 에 나타나 있는 바와 같이 누클레오티드 148 내지 337 모두와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 핵산 ; 및
(d) (a) 및 (b) 서열과 동의성인 핵산 서열.
본 발명은 랫, 마우스 및 인체 OPG 를 코드하는 핵산 뿐만 아니라 OPG 의 생물학적 활성도 중 적어도 하나를 갖는 폴리펩티드를 코드하는, 거기에 혼성화되는 핵산 서열을 제공한다. 또한 본 발명은 도 1A 에 나타나 있는 누클레오티드 148 - 337 을 포함하는 랫의 OPG EST 에 혼성화되는 핵산을 제공한다. 혼성화 조건은 명세서의 실시예 1에 기술된 5 × SSC, 50 % 포름아미드 및 42 ℃ 와 같이 일반적으로 엄격하다. 이러한 조건의 엄격성은 염 및 유기 용매 농도와 온도를 조절함으로써 용이하게 얻을 수 있을 것이다. (b) 의 핵산은 TNF 수용체 상과의 다른 공지된 요소와의 혼성이 검출되지 않는 OPG - 관련 폴리펩티드를 코드하는 서열을 포함한다. 바람직한 실시형태로서의 핵산은 도 2B - 2C (서열번호 : 120), 도 9A - 9B (서열번호 : 122) 및 도 9C - 9D (서열번호 : 124 ) 에 나타나 있다.
혼성화는 도 2B - 2C (서열번호 : 120), 도 9A - 9B (서열번호 : 122) 및 도 9C - 9D (서열번호 : 124) 에 나타나 있는 폴리펩티드 - 코딩 영역의 일부 또는 전부에서 발생하며 근접한 비코딩 영역에서 일어날 수 있으므로, 본 발명의 혼성화되는 핵산 길이는 다양할 것이다. 따라서, 혼성화되는 핵산은 도 2B - 2C (서열번호 : 120), 도 9A - 9B (서열번호 : 122) 및 도 9C - 9D (서열번호 : 124) 에 나타난 서열의 절단형 또는 연장형일 것이다. 절단 또는 연장된 핵산은 그들이 OPG 의 생물학적 성질 중 하나 또는 그 이상을 보유한다면 본 발명에 포함된다. 혼성화되는 핵산 또한 OPG 코딩 영역의 5' 및/또는 3' 인 근접한 비코드화 영역을 포함할 것이다. 비코드화 영역은 프로모터, 인핸서, 번역 개시 부위, 전사 종결 부위 등과 같은 OPG 발현에 관련된 조절 부위를 포함한다.
핵산에 대한 혼성화 조건은 Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) 문헌에 기술되어 있다.
랫 OPG 를 코드하는 DNA 는 매릴랜드 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 ATCC 기탁번호 제 69970 호로 1995년 12월 27일에 기탁한 플라스미드 pMO - B1.1 에서 공급되었다. 마우스 OPG 를 코드하는 DNA 는 1995년 12월 27일에 기탁 번호 제 69971 호로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁한 플라스미드 pRcCMV - 마우스 OPG 에서 공급되었다. 인체 OPG 를 코드하는 DNA 는 1995년 12월 27 일에 기탁 번호 제 69969 호로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁한 플라스미드 pRcCMV - 인체 OPG 에서 공급되었다. 본 발명의 핵산은 ATCC 기탁 번호 제 69969 호, 제 69970 호 및 제 69971 호의 DNA 삽입물과 엄격한 조건하에서 혼성화될 것이며, OPG 의 생물학적 활성도 중 적어도 하나를 가질 것이다.
또한 본 발명은 도 2B, 9A 및 9B 에 나타나 있는 바와 같이 핵산 서열의 유도체를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 유도체는 하나 또는 그 이상의 잔기가 부가, 치환, 삽입 또는 결실된 핵산 서열을 포함하므로, 결과적으로 생성된 서열은 부가, 결실, 삽입 또는 치환된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드를 코드하며 그 결과 생성된 폴리펩티드는 OPG 활성도를 갖는다. 핵산 유도체는 스플라이스 변형 또는 다형태성에 의한 것처럼 자연발생적이거나 숙련자들이 이용할 수 있는 부위 특이 돌연변이유발 기술을 이용하여 구성될 것이다. OPG 의 자연발생적인 변이체의 한 예는 리더 서열내 잔기 3 의 lys 이 asn 으로 치환된 것을 코드하는 핵산이다(실시예 5 참조). 핵산 유도체는 생물학적 활성도를 가장 적게 파괴할 것 같은 분자의 영역에서 아미노산 치환체를 코드할 것으로 예상된다. 다른 유도체는 트랜스막 및 세포질 도메인과 함께 도 2B - 2C (서열번호 : 120), 도 9A - 9B (서열번호 : 122) 및 도 9C - 9D (서열번호 : 124)에 나타낸 세포외 도메인을 갖는 막 - 결합 형태의 OPG 를 코드하는 핵산을 포함한다.
한 실시형태에 있어서, OPG 유도체는 카르복시 말단으로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실된 OPG 절단형을 코드하는 핵산을 포함한다. OPG 를 코드하는 핵산은 카르복시 말단으로부터 1 내지 216 개의 아미노산이 결실된 것이다. 선택적으로, 항체의 Fc 부위는 새로운 카르복시 말단으로부터 연장시켜 생물학적으로 활성인 OPG - Fc 융합 폴리펩티드를 수득할 수 있다(실시예 11 참조). 바람직한 실시형태에 있어서, 핵산은 잔기 22 - 185, 22 - 189, 22 - 194 또는 22 - 201 (도 9E - 9F 의 번호를 사용함) 로부터의 아미노산 서열을 가지며 선택적으로 인체 lgG 의 Fc 부위를 코드하는 OPG 를 코드한다.
또한 본 발명은 아미노 말단으로부터 결실된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 OPG 의 절단형을 코드하는 핵산을 포함한다. 절단형은 리더 서열을 구성하는 21 개 아미노산이 일부 또는 전부 결핍된 것을 포함한다. 부가적으로, 본 발명은 성숙 아미노 말단(잔기 22) 으로부터 1 내지 10 개의 아미노산이 결실되고, 선택적으로 카르복시 말단 (잔기 401)으로부터 1 내지 216 개의 아미노산이 결실된 OPG 를 코드하는 핵산을 제공한다. 택일적으로, 핵산은 아미노 말단에서 메티오닌 잔기를 코드할 것이다. 이러한 OPG 절단 폴리펩티드의 예는 실시예 8 에 기술되어 있다.
본 발명의 핵산의 예는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 및 RNA 를 포함한다. cDNA 는 다양한 OPG 발현 조직에서 분리한 mRNA 로부터 제조한 라이브러리에서 수득하였다. 인체의 경우, OPG 에 대한 조직원은 신장, 간, 태반 및 심장을 포함한다. OPG 를 코드하는 게놈 DNA 는 여러 가지 종에서 통상적으로 입수할 수 있는 게놈 라이브러리로부터 수득한다. 합성 DNA 는 중복 올리고누클레오티드 단편을 화학 합성한 다음 단편을 조립함으로써 코딩 영역 및 플랭킹 서열의 일부 또는 전부를 재구성하여 수득한다(인터페론 유전자의 화학 합성에 관하여는 미국 특허 번호 제 4,695,623 호에 기술되어 있다). RNA 는 mRNA 를 직접 고수준으로 합성하는 원핵 발현 벡터, T7 프로모터를 이용하는 벡터 및 RNA 폴리메라제에 의해 가장 쉽게 수득한다.
본 발명의 핵산 서열은 어떤 세포와 조직이 OPG mRNA 를 발현하는가를 결정하기 위해 생물학적 시료내에서 OPG 서열을 검출하는데 이용한다. 또한 서열은 OPG 에 관련된 서열의 cDNA 및 게놈 라이브러리를 선별하는 데 이용될 것이다. 이러한 선별은 상동성의 서열을 검출하기에 적당한 혼성 조건을 이용하여 본 분야의 숙련자들의 능력내에서 잘 이루어진다. 또한 핵산은 안티 - 센스 치료 또는 유전자 치료에 의해 OPG 발현 수준을 조절하는 데에 유용하다. 핵산은 또한 폴리펩티드의 생산 및 생물학적 활성도의 연구에 사용되는 형질전환 동물의 개발에도 사용된다(실시예 3 참조).
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 OPG 를 코드하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포 및 OPG 의 생산 방법을 제공한다. 재조합 단백질 발현의 개요는 Methods of Enzymology V. 185, Goeddel, D. V. ed. Academic Press (1990) 문헌에서 발견된다.
OPG 생산을 위한 숙주 세포는 E. coli 와 같은 원핵 숙주 세포, 효모, 식물, 곤충 및 포유동물 숙주 세포를 포함한다. HB101 또는 JM101 과 같은 E. coli 균주가 발현에 적합하다. 바람직한 포유동물 숙주 세포는 COS, CHOd -, 293, CV - 1, 3T3, 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포 및 그외의 세포를 포함한다. 포유동물 숙주세포는 글리코실화 및 폴리펩티드 프로세싱과 같은 번역 후 변형이 OPG 활성도에 중요할 때 바람직하다. 포유동물 발현은 성장 배지에서 회수될 수 있는 분비 단백질의 생산을 가능하게 한다.
OPG 발현을 위한 벡터는 벡터 프로포게이션 (vector propogation) 및 클로닝된 삽입물의 발현을 위해 요구되는 최소한의 서열을 함유한다. 이들 서열은 복제 기원, 선별 마커, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 서열, RNA 스플라이스 부위 및 전사 종결 부위를 포함한다. 상기 언급한 숙주 세포에서 발현시키기에 적당한 벡터는 용이하게 입수할 수 있으며, 본 발명의 핵산은 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 벡터 내로 삽입된다. OPG의 조직 특이 발현을 위한 벡터도 포함된다. 이러한 벡터는 마우스내 생산을 위해 간, 신장 또는 그외의 기관에서 특이하게 작용하는 프로모터 및 표적 인체 세포에서의 OPG 발현을 위한 바이러스성 벡터를 포함한다.
적당한 숙주 - 벡터계를 이용하여, OPG 가 생성되는 조건하에서 OPG 를 코드하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포를 배양하고 발현 산물을 분리함으로써 OPG 를 재조합적으로 생산한다. OPG 는 형질감염된 포유동물 세포의 상청액 또는 형질전환된 박테리아 숙주 세포의 봉입체에서 생산된다. 그렇게 생산된 OPG 는 하기한 바와 같이 본 분야의 숙련자들에게 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다. 포유동물 및 박테리아 숙주계에서의 OPG 발현은 실시예 7 및 8 에 기술되어 있다. 포유동물 숙주에 대한 발현 벡터는 PCT 출원 번호 제 90/14363 호에 기술되어 있는 pDSRα 와 같은 플라스미드가 좋은 예이다. 박테리아 숙주 세포에 대한 발현 벡터는 실시예 8 에 기술된 플라스미드 pAMG21 및 pAMG22-His 가 좋은 예이다. 플라스미드 pAMG21 은 1996년 7월 24일에 기탁 번호 제 98113 호로 미국 매릴랜드 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁하였다. 플라스미드 pAMG22-His 는 1996 년 7 월 24 일에 기탁번호 제 98112 호로 미국 매릴랜드 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁하였다. 특이 플라스미드 및 숙주 세포는 예증 목적으로 기술한 것이며, 그외의 입수가능한 플라스미드와 숙주 세포 또한 폴리펩티드 발현에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
또한 본 발명은 숙주 염색체로부터 OPG 가 변이되도록 하기 위한 생체내 또는 생체외 재조합 결과로서 내인성 핵산으로부터 OPG를 발현시키는 것에 관한 것이다. 내인성 OPG 코딩 영역으로부터 OPG 를 직접 생산할 수 있는 외인성 조절 서열 (예를 들어 프로모터 또는 인핸서) 의 삽입에 의한 OPG 발현 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 OPG 를 직접 생산할 수 있는 내인성 조절 서열의 자극 (예를 들어, 전사 촉진 인자에 노출시킴으로써)을 제공한다.
폴리펩티드
본 발명은 골대사와 관련된 활성도, 특히 골흡수 저해 활성도를 가짐으로써 골밀도를 증가시키는, TNF 수용체 상과의 신규한 요소인 OPG 를 제공한다. OPG 는 OPG 생물학적 활성도 중 적어도 하나를 갖는 마우스, 랫 또는 인체 OPG 의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 유도체를 말한다. 랫, 마우스 및 인체 OPG 의 아미노산 서열은 각각 도 2B - 2C (서열번호 : 121), 도 9A - 9B (서열번호 : 123) 및 도 9C - 9D (서열번호 : 125) 에 나타나 있다. OPG 의 유도체는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 부가, 결실, 삽입 또는 치환되어 그결과 생성된 폴리펩티드가 OPG 의 생물학적 활성도 중 적어도 하나를 갖는 폴리펩티드를 말한다. OPG 의 생물학적 활성도는 골대사와 관련된 활성도를 포함하나, 이것으로 제한되지는 않는다. 바람직하게, 폴리펩티드는 21 개의 아미노산이 삭제된 아미노 말단 리더 서열을 가질 것이다.
본 발명의 OPG 폴리펩티드는 랫 [1 - 401], 랫 [22 - 180], 랫 [22 - 401], 랫 [22 - 401] - Fc 융합체, 랫 [1 - 180] - Fc 융합체, 마우스 [1 - 401], 마우스 [ 1- 180], 마우스 [ 22 - 401], 인체 [ 1 - 401], 마우스 [22 - 180], 인체 [22 - 401], 인체 [22 - 180], 인체 [1 - 180], 인체 [22 - 180] - Fc 융합체 및 인체 met - 32 - 401 을 포함한다. 아미노산 번호는 서열번호 : 121(랫), 서열번호 : 123 (마우스) 및 서열번호 : 125 (인체) 에 나타나 있다. 또한 본 발명은 OPG 의 아미노산 잔기 180 - 401 의 일부 또는 전부가 결실되거나 카르복시 - 말단이 절단되었으며 ; 잔기 180 - 401 에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환되었고 ; OPG 의 시스테인 - 풍부 도메인의 일부 또는 전부가 결실되었으며, 특히 말단 (카르복시 - 말단) 의 시스테인 - 풍부 도메인이 결실되었으며 ; 및 시스테인 - 풍부 도메인, 특히 말단 (카르복시 - 말단) 의 시스테인 - 풍부 도메인에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환된 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 한 실시형태에 있어서, OPG 는 카르복시 말단으로부터 1 내지 약 216 개의 아미노산이 결실되었다. 다른 실시형태에서, OPG 는 성숙한 아미노 말단으로부터 1 내지 약 10 개의 아미노산이 결실되었고 (여기에서 성숙한 아미노 말단은 잔기 22 에 있음), 선택적으로 카르복시 말단으로부터 1 내지 약 216 개의 아미노산이 결실되었다.
부가적으로 본 발명에 포함되는 OPG 폴리펩티드는 다음을 포함한다 : 인체 [ 22 - 180] - Fc 융합체, 인체 [ 22 - 201] - Fc 융합체, 인체 [ 22 - 401] - Fc 융합체, 마우스 [22 - 185] - Fc 융합체, 마우스 [22 - 194] - Fc 융합체. 이들 폴리펩티드는 CHO 또는 293 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 생산된다. 진핵 숙주 세포에서 발현되는, 부가적으로 본 발명에 포함되는 OPG 폴리펩티드는 다음을 포함한다 : 인체 met [ 22 - 401], Fc - 인체 met [ 22 - 401] 융합체 (Fc 부위는 실시예 8 에 기술된 바와 같이 전장의 OPG 코드화 서열의 아미노 말단에 융합된다), 인체 met[ 22 - 401] - Fc 융합체 (Fc 부위는 전장의 OPG 서열에 융합된다), Fc - 마우스 met [22 - 401] 융합체, 마우스 met [22 - 401] - Fc - 융합체, 인체 met [ 27 - 401], 인체 met [22 - 185], 인체 met [22 - 189], 인체 met [22 - 194], 인체 met [22 - 194] (P25A), 인체 met [22 - 194] (P26A), 인체 met [27 - 185], 인체 met [27 - 189], 인체 met [27 - 194], 인체 met - arg - gly - ser - (his)6[22 - 401], 인체 met - lys [22 - 401], 인체 met - (lys)3 - [22 - 401], 인체 met [22 - 401] - Fc (P25A), 인체 met [22 - 401] (P25A), 인체 met [22 - 401](P26D), 인체 met [22 - 401] (P26A), 마우스 met [22 - 401], 마우스 met [27 - 401], 마우스 met [32 - 401], 마우스 met [27 - 180], 마우스 met [22 - 189], 마우스 met [22 - 194], 마우스 met [27 - 189], 마우스 met [27 - 194], 마우스 met -lys [22 - 401], 마우스 HEK [22 - 401](A45T), 마우스 met - lys - (his)7 [22 - 401], 마우스 met - lys [22 - 401] - (his)7 및 마우스 met [27 - 401] (P33E, G36S,A45P). 진핵 숙주 세포에서 생산된 상기 OPG 폴리펩티드는 잔기가 표시되어 있지 않더라도 아미노 - 말단 메티오닌 잔기를 갖는 것으로 인지된다. 특정 예에 있어서, Ellison 등의[Nuc. Acids Res. 10, 4071 - 4079(1982) ] 문헌에 나타나 있는 서열을 갖는 인체 lgG1 - γ1의 227 개 아미노산 부위를 이용하여 OPG - Fc 융합체를 생산하였다. 그러나, 인체 lgG 의 Fc 부위의 변이체도 사용할 수 있다.
인체 lgG1 Fc 부위에 융합되는 카르복시 - 말단 OPG 절단형의 생물학적 활성도 분석은 OPG 부분 중 활성도에 필요한 약 164 개의 아미노산을 나타낸다. 이 부위는 아미노산 22 - 185, 바람직하게는 도 9C - 9D (서열번호 : 125)에 나타나 있는 것을 포함하며 TNFR 세포외 도메인 중 시스테인 - 풍부 도메인을 특징으로 하는 네 개의 시스테인 - 풍부 도메인을 포함한다.
OPG 및 TNF 수용체 군 요소의 세포외 리간드 결합 도메인간의 상동성을 이용하여, TNFR - I 의 세포외 도메인의 공지된 결정 구조를 근거로 OPG 의 입체 모델을 만들었다 (실시예 6 참조). 이 모델은 생물학적 활성도에 중요한 OPG 내의 잔기를 확인하는 데 사용하였다. 네 개의 시스테인 - 풍부 도메인 구조를 유지하는데 관련된 시스테인 잔기를 확인하였다. 모델에서 다음의 이황화물 결합을 확인하였다 : 도메인 1 : Cys41 내지 Cys54, Cys44 내지 Cys62, tyr23 및 his 66은 이 도메인의 구조를 안정시키기 위해 작용할 것이다 ; 도메인 2 : Cys65 내지 Cys80, Cys83 내지 Cys98, Cys87 내지 Cys105 ; 도메인 3 : Cys107 내지 Cys118, Cys124 내지 Cys142 ; 도메인 4 : Cys145 내지 Cys160, Cys166 내지 Cys185. 또한 잔기는 도 11 및 도 12A - 12B 에 나타나 있는 바와 같이 TNFβ 에 매우 근접한 것으로 확인되었다. 이 모델에서, OPG는 해당 리간드에 결합한다고 가정하자 ; TNFβ는 그것의 리간드와 OPG의 상호작용을 자극하는 모델 리간드로서 사용하였다. 이러한 모델링에 기초하여, OPG 내 다음 잔기는 리간드 결합에 중요할 것이다 : glu34, lys43, pro66 내지 gln91 (특히, pro66, his68, tyr69, tyr70, thr71, asp72, ser73, his76, ser77, asp78, glu79, leu81, tyr82, pro85, val86, lys88, glu90 및 glu91), glu153 및 ser155.
이들 아미노산 잔기 중 하나 또는 여러개를 치환하면 OPG 의 생물학적 활성도가 변할 것이다. 예를 들어, 특정 시스테인 잔기에서의 변화가 각각의 시스테인 - 풍부 도메인 구조를 변화시키는 반면, 리간드 결합에 중요한 잔기의 변화는 리간드와 OPG 의 물리적 상호작용에 영향을 끼칠 것이다. 구조적 모델은 증진된 생물학적 활성도, 더 높은 안정성 또는 보다 용이한 제형화와 같은 더욱 바람직한 특성을 갖는 유사체를 확인하는 데에 도움이 될 수 있다.
또한 본 발명은 OPG 단량체를 함유하는 OPG 다량체를 제공한다. OPG 는 다량체 (예를 들어, 더 큰 수의 단량체 중 이량체, 삼량체)일 때 활성일 것이다. 바람직하게, OPG 다량체는 이량체 또는 삼량체이다. OPG 다량체는 다량체 형성을 촉진시키기에 충분한 OPG 아미노산 서열을 갖는 단량체를 함유하거나 항체 Fc 영역과 같은 이형 서열을 갖는 단량체를 함유할 것이다. OPG의 카르복시 - 말단 결실 분석은, 영역 186 - 401 의 적어도 일부가 OPG 폴리펩티드 결합에 관련됨을 시사한다. OPG 아미노산 186 - 401 부위 중 일부 또는 전부를 자가 - 결합할 수 있는 아미노산 서열로 치환한 것 또한 본 발명에 포함된다. 택일적으로, OPG 폴리펩티드 또는 그의 유도체는 부위 특이 돌연변이유발에 의해 이량체 또는 다량체를 이루기 위해 변형되어, 자외선 광에 대한 노출과 같은 광화학 교차결합 또는 2작용 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 2작용 링커 분자에 의한 화학 교차결합에 의해 사슬간 이황화물 결합 로메이션(romation) 에 대한 짝짓지 않은 시스테인 잔기가 형성된다.
OPG 폴리펩티드의 변이는 본 발명에 포함되며, 번역후 변이(예를 들어, N - 결합 또는 O - 결합 탄수화물 사슬, N - 말단 또는 C - 말단의 프로세싱), 아미노산 골격에 대한 화학적 부분의 부착, N - 결합 또는 O - 결합 탄수화물 사슬의 화학적 변형 및 진핵 숙주 세포 발현의 결과로서 N - 말단 메티오닌 잔기의 부가를 포함한다. 또한 폴리펩티드는 단백질이 검출 및 분리되도록 효소, 형광, 동위원소 또는 친화 표식과 같은 검출가능한 표식으로 변형시킬 수 있다.
OPG 의 또다른 변형은 키메라 단백질을 포함하는데, 여기에서 OPG 는 이형 아미노산 서열에 융합된다. 이형 서열은 결과적으로 생성된 융합 단백질이 OPG 의 활성도를 보유하도록 하는 모든 서열일 수 있다. 이형 서열은 예를 들어 Fc 융합체와 같은 면역 글로불린 융합체를 포함하는데, 단백질의 정제에 도움이 될 수 있다. 이량체, 삼량체 및 그외의 더 높은 다량체 형태에 대한 OPG 단량체의 결합을 촉진시키는 이형 서열이 바람직하다.
본 발명의 폴리펩티드는 분비 단백질을 함유하는 세포 배양액 내 성분으로부터 정제되거나, OPG 를 발현하는 조직, 세포주 및 형질 전환된 숙주 세포에 존재하는 그외의 폴리펩티드로부터 분리되고 정제된다. 한 실시형태에 있어서, 폴리펩티드는 박테리아 숙주 세포의 발현산물과 같은 그외의 인체 단백질과 결합하지 않는다.
본 발명은 또한 안정성 및 폴리펩티드 순환 시간의 증가 또는 면역원성의 감소 (미국 특허 번호 제 4,179,337 호 참조) 와 같은 부가적인 이점을 갖는 OPG 의 화학 변형 유도체를 제공한다. 유도화를 위한 화학적 부분은 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올 등과 같은 수용성 중합체로부터 선택할 수 있다. 폴리펩티드는 분자내 무작위적인 위치에서 또는 분자내에서 미리 결정된 위치에서 변이될 것이며, 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 부착된 화학적 부분을 포함할 것이다.
중합체는 모든 분자량이 될 것이며 가지나거나 그렇지 않을 것이다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우, 바람직한 분자량은 조작 및 제작하기에 용이하도록 약 1 kDa ∼ 100 kDa 이다 (용어 "약" 은 폴리에틸렌 글리콜의 제조시에 일부 분자가 언급한 분자량보다 조금 더, 조금 덜 나갈 것임을 의미한다). 바람직한 치료학적 측면(예를 들어, 치료학적 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 생물학적 활성도, 조작의 용이성, 항원성의 정도 또는 결핍 및 그외의 공지된 효과가 있다 하더라도 바람직한 방출의 존속 기간)에 따라 다른 크기가 이용될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 그외의 화학적 부분)는 단백질의 기능성 또는 항원성 도메인에 대한 영향을 고려하여 단백질에 부착될 것이다. 본 분야의 숙련자들이 이용할 수 있는 다수의 부착 방법이 있다. 예를 들어 본원에서 참고문헌으로 인용한 제 EP 0 401 384 호 (G - CSF 에 대한 PEG 결합), Malik 등의 Exp. Hematol. 20 : 1028 - 1035 (1992) (염화 트레실을 이용한 GM - CSF 의 폴리에틸렌 글리콜화에 대하여 보고되어 있음) 를 참조하라. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 유리 아미노기 또는 카르복시기와 같은 반응기를 통해 아미노산 잔기내로 공유결합할 것이다. 반응기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합하는 곳이다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기는 리신 잔기 및 N - 말단 아미노산 잔기를 포함할 것이다 ; 유리 카르복시기를 갖는 것은 아스파르트산 잔기, 글루타민산 잔기 및 C - 말단 아미노산 잔기를 포함한다. 설프히드릴기는 또한 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시키기 위한 반응기로 사용될 것이다. 치료학적 목적을 위해 바람직한 것은 N - 말단 또는 리신기에 대한 부착처럼 아미노기에 부착시키는 것이다. N - 말단을 화학적으로 변형시킨 단백질이 특히 바람직할 것이다. 본 조성물의 예로서 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여, 폴리에틸렌 글리콜 분자의 다양성 (분자량, 가지등), 반응 혼합물내 단백질 (또는 펩티드) 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비, 실시된 폴리에틸렌 글리콜화 반응의 형태 및 선택된 N - 말단이 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질의 수득방법으로부터 선택될 수 있다. N - 말단이 폴리에틸렌 글리콜화된 제제의 수득방법 (즉, 필요에 따라 다른 모노폴리에틸렌 글리콜화된 부분에서 이 부분을 분리하는 방법) 은 폴리에틸렌 글리콜화된 분자 집단으로부터 N - 말단이 폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 정제함으로써 이루어질 수 있다. 선택적인 N - 말단의 화학적 변이는 특정 단백질 내에서의 유도화를 위해 이용 할 수 있는 일차 아미노기 (리신 대 N - 말단) 의 상이한 형태의 차등적 반응성을 이용하는 환원성 알킬화에 의해 이루어질 것이다. 적당한 반응 조건하에서, 중합체를 함유하는 카르보닐기에 의해 N - 말단에서 단백질의 선택적인 유도화가 충분히 이루어진다.
합성 OPG 이량체는 다양한 화학적 교차결합 방법에 의해 제조될 수 있다. OPG 단량체는 OPG 의 생물학적 활성도를 증진시키거나 보유하는 어떤 방식으로든 화학적으로 결합될 수 있다. 다양한 화학적 교차링커는 바람직한 단백질 이량체의 성질에 따라 사용될 것이다. 예를 들어, 교차링커는 짧고 상대적으로 굳거나 더 길고 보다 유연하며, 생물학적으로 가역적이고, 면역원성의 감소 또는 보다 긴 약동력학 반감기를 제공할 것이다.
한 실시예에서, OPG 분자는 2 단계 합성에 의해 아미노 말단을 통하여 결합된다 (실시예 12 참조). 1 단계에서, OPG 는 방어적인 티올을 도입하기 위해 아미노 말단에서 화학적으로 변형되는데, 정제 후 탈보호되어 두 번째 OPG 분자와 함께 다양한 교차링커를 통한 부위 - 특이 복합을 위한 부착지점으로 이용된다. 아미노 - 말단 교차결합은 이황화물 결합, 단 - 사슬을 이용한 티오에테르 결합, 2 작용기 지방족 화합물의 교차링커 및 가변 길이의 2 작용기 폴리에틸렌 글리콜 교차링커 (PEG "아령체" ) 에 대한 티오에테르 결합을 포함하지만 이것으로 제한되지는 않는다. 또한 OPG 이량체의 PEG 아령체 합성에 포함되는 것은 "모노벨(monobell)" 이라 명명된 그러한 합성 부산물이다. OPG 모노벨은 유리 중합체 말단과 함께 직쇄상의 2 작용기 PEG 에 결합되는 단량체로 구성된다. 선택적으로, OPG 는 다음과 같은 시약을 포함하는 각각의 아민 특이 동질이작용기 교차결합법 (amine specific homobifunctional crosslinking techniques) 을 통해 직접적으로 교차결합될 수 있다 : 디에틸렌트리아민펜타아세틱 디안하이드리드 (DTPA), p - 벤조퀴논 (pBQ) 또는 비스(술포숙시니미딜) 수버레이트 (BS3) 뿐만 아니라 본 분야에서 공지된 그외의 것. PEG 비스말레이미드와 같은 다양한 2 작용기의 티올 특이 교차링커의 존재하에 이미노티올란과 같은 시약으로 OPG 를 직접 티올화시키고, 1 단계 과정에서 이량체화 및/또는 아령체를 얻는 것 또한 가능하다.
천연원 및 형질감염된 숙주 세포로부의 OPG 정제방법 또한 본 발명에 포함된다. 정제방법은 정제된 단백질을 수득하기 위해 하나 또는 그 이상의 표준 단백질 정제 단계를 적당한 순서로 이용할 것이다. 크로마토그래피 단계는 이온 교환, 겔 여과, 소수성 상호작용, 역상, 크로마토포커싱, 항 - OPG 항체 또는 바이오틴 - 스트렙타비딘 친화 복합체 등을 이용하는 친화 크로마토그래피를 포함할 수 있다.
항체
본 발명은 OPG 에 특이하게 결합하는 항체를 포함한다. 항체 생성을 위한 항원은 전장의 폴리펩티드 또는 OPG 서열의 일부에 걸친 펩티드일 것이다. OPG 에 반응성인 다클론성 또는 단클론성 항체의 생성을 위한 면역학적 방법은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다[예를 들어, Harlow 및 Lane 의 Antibodies : A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N. Y.(1988) 참조]. 이렇게 생성된 항체는 표준 효소 - 결합 면역흡착 검정을 이용한 에피토프 인식 및 결합 특이성을 특징으로 한다. 또한 항체는 다른 종에서 유도한 가변 및 불변 도메인 부위를 갖는 키메라 항체를 포함한다. 한 실시형태에 있어서, 키메라 항체는 마우스 가변 도메인 및 인체의 불변 도베인을 갖는 인체화된 항체이다. 또한 본 발명은 인체 구조물에 삽입된 상보적 결정 부위 (소위 CDR - 삽입 항체) 도 포함한다. 키메라 항체 및 CDR - 삽입 항체는 본 분야의 숙련자들에게 공지된 재조합 방법에 의해 제조된다. 마우스에서 제조된 인체 항체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항 - OPG 항체는 생물학적 시료로부터 OPG 를 정제하기 위한 친화제로 사용될 것이다 (실시예 10 참조). 한 방법에 있어서, 항체는 CnBr - 활성 세파로스 상에 고정되고 항체 - 세파로스 복합체 컬럼은 액체 시료로부터 OPG 를 제거하는 데 이용된다. 항체는 또한 하기한 방법에 의해 생물학적 시료에서 OPG 를 검출하여 정량하기 위한 진단 시약으로 사용된다.
약학적 조성물
본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드와 함께 약학적으로 용인가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 용어 "치료학적 유효량"은 특정 조건 및 투여 경로에 대해 치료학적 효과를 제공하는 양을 의미한다. 조성물은 액체 또는 동결건조 형태일 것이며, 다양한 pH 값과 이온 강도를 갖는 희석제(트리스, 아세테이트 또는 인산 완충액), 트윈 또는 폴리소르베이트 같은 가용화제, 인체 혈청 알부민 또는 겔라틴 같은 담체, 티메로살 또는 벤질 알코올 같은 방부제 및 아스코르브산 또는 소디움 메탈비술피트 같은 항산화제를 포함할 것이다. 용해도와 안정성을 높이기 위해 수용성 중합체로 변이시킨 OPG 를 포함하는 조성물도 포함된다. 조성물은 또한 연장되는 기간에 걸친 제어 수송을 위해 리포솜, 마이크로에멀션, 미셀 또는 부형제 내로 OPG 의 삽입을 포함한다. 특히, OPG 조성물은 히드로겔, 실리콘, 폴리에틸렌, 에틸렌 - 비닐 아세테이트 공중합체 또는 생분해되는 중합체와 같은 중합체 매트릭스내로의 삽입을 포함한다. 히드로 겔의 예에는 폴리히드록시알킬메타크릴레이트 (p - HEMA), 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리비닐피롤리딘, 폴리비닐 알코올 및 다양한 폴리전해질 복합체가 포함된다. 생분해되는 중합체의 예에는 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), PLA와 PGA 의 공중합체, 폴리아미드 및 폴리아미드와 폴리에스테르의 공중합체가 포함된다. 그외의 제어 방출 제제형은 주사에 의해 투여될 수 있는 마이크로캡슐, 중심체, 마이크로분자 복합체 및 중합체 비드 (polymeric beads) 를 포함한다.
특정 조성물은 치료 조건, 투여 경로 및 바람직한 약동력학적 파라미터를 포함한 다수의 인자에 따라 선택될 것이다. 약학적 조성물에 적합한 성분에 대한 보다 광범위한 개요는 Remington's Pharmaceutical Sciences, l8th ed. A. R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA(1980) 문헌에 나타나 있다.
본 발명의 조성물은 피하, 정맥내 또는 근육내 주사에 의해 또는 경구, 비강, 폐나 직장 투여에 의해 투여될 수 있다. 최후에 선택된 투여 경로는 여러 인자에 의존할 것이며 본 분야의 숙련자들에 의해 확인될 것이다. 본 발명은 치료학적 유효량의 본 발명의 핵산과 함께 약학적으로 용인가능한 보조제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 핵산 조성물은 안티 - 센스 또는 유전자 치료 섭생법의 일부로서 세포 및 조직에 대한 OPG 코딩 영역의 일부 또는 전부의 운반에 적합할 것이다.
치료방법
골조직은 신체를 지탱하며, 미네랄 (대부분이 칼슘과 인), 콜라겐 및 비콜라겐 단백질의 매트릭스 및 세포로 구성되어 있다. 골, 골세포, 골아세포 및 파골세포에서 발견되는 세포의 세 형태는 끊임없이 형성되고 흡수되는 골에 의한 동적 과정과 관계가 있다. 골아세포는 골 조직의 형성을 촉진시키는 반면, 파골세포는 흡수에 관계한다. 골 매트릭스와 미네랄의 분해 또는 흡수는 골형성에 비해 신속하고 효율적인 과정이며, 골에서 미네랄을 대량 방출시킬 수 있다. 파골세포는 골격 조직의 정상적인 재편성 조절 및 호르몬에 의해 유도되는 흡수와 관련되어 있다. 예를 들어, 흡수는 세포외 체액내 칼슘 이온의 농도 감소에 반응하는 부갑상선 호르몬의 분비에 의해 자극된다. 그와는 대조적으로, 흡수 저해는 칼시토닌의 주요 기능이다. 또한 비타민 D 의 중간대사물질은 부갑상선 호르몬 및 칼시토닌에 대한 골의 반응을 변화시킨다.
골격 성숙 후에, 골격내 골의 양은 골형성 및 골흡수의 균형(또는 불균형)을 반영한다. 최고의 골질량은 40 세 전 골격 성숙 후에 나타난다. 40 세와 50 세 사이에, 균형이 깨지고 골흡수가 우세해진다. 나이가 들면서 남성보다 여성에서 더 빨리 골질량의 필연적인 감소가 시작되며 일부 여성(주로 코카서스계와 아시아계 혈통)은 폐경 후에 뚜렷하게 가속화된다.
골감소증은 일반적으로 정상 수준 이하로 골질량이 감소하는 것에 관련된 상태이다. 그러한 상태는 골합성율의 감소 또는 골용해율의 증가 또는 그 둘다에 의해 초래될 수 있다. 골감소증의 가장 공통된 형태는 일차성 골다공증이며, 폐경후 및 노인성 골다공증으로도 간주된다. 골다공증의 이러한 형태는 나이에 따른 일반적인 골손실의 결과이며, 일반적으로 정상적인 골형성율에도 불구하고 골흡수가 증가한 결과이다. 미국의 모든 백인 여성의 약 25 ∼ 30 % 가 골다공증 증세를 보인다. 45 세 이상의 여성에 있어서, 골다공증 및 둔부, 대퇴골, 목과 전자간 골절의 발생빈도사이에는 직접적인 관계가 존재한다. 상당한 연배인 남성이 50 세 ∼ 70 세 사이에 골다공증 증세를 보이지만, 이 질병은 주로 여성에게 영향을 미친다.
폐경후 및 노인성 골다공증의 원인은 알려져 있지 않다. 그 상태의 원인이 될 수 있는 몇가지 인자가 확인되었다. 그것은 노화에 따른 호르몬 수준의 변화 및 칼슘과 그외의 미네랄의 장 흡수 감소로 인한 부적절한 칼슘 소비를 포함한다. 치료는 일반적으로 진행을 막기 위한 식이 보충 및 호르몬 치료가 포함되었다. 그러나 오늘날까지 골손실에 대한 효과적인 치료는 존재하지 않는다.
본 발명은 치료학적 유효량의 OPG 를 이용한 골질환의 치료방법을 제공한다. 골질환은 절대 골손실 (골감소증 또는 골용해)을 특징으로 하는 모든 질환일 것이다. 일반적으로, OPG 치료는 골흡수율을 억제할 필요가 있을 때 기대할 수 있다. 따라서 치료는 정상 이상의 골흡수율을 감소시키거나 정상 이하의 골형성 수준을 보수하기 위해 골흡수의 정도를 정상 이하로 감소시키기 위해 실시될 것이다. OPG 로 치료할 수 있는 상태는 다음을 포함한다 :
골다공증, 예를 들어 일차성 골다공증, 내분비성 골다공증 (갑상선항진증, 부갑상선항진증, 쿠싱증후군 및 말단거대증), 골다공증의 유전적 및 선천적 형태 (불완전골형성증, 호모시스틴뇨증, 멘케스증후군 및 릴리 - 데이증후근) 및 단고정에 의한 골다공증.
성인 및 청소년 골의 파제트병 (변형성골염).
골수염 또는 골손실을 유도하는 골의 감염성 병변.
종양(유방, 폐 및 신장) 및 혈액학적 악성종양 (복합적인 골수종, 임파종 및 백혈병) 에서 생기는 칼슘과잉혈증, 내인성 칼슘과잉혈증 및 부갑상선기능항진증 및 신장 기능 질환과 관련된 칼슘과잉혈증.
소장, 대장 질환 및 만성 간, 신장 질환과 관련되고 스테로이드 투여에 의해 유도되는 수술후의 골감소증.
외상과 관련된 골괴사 또는 골세포 사멸, 또는 고세병, 겸상 빈혈증, 전신 홍반성 루푸스 및 그외의 상태와 관련된 비외상성 괴사.
류마티스성 관절염으로 인한 골손실.
치근막 골손실.
골용해성 전이.
OPG 는 골질환 치료를 위해 다른 인자와 함께 또는 단독으로 사용할 수 있을 것으로 인지된다. 한 실시형태에 있어서, 오스테오프로테게린은 골형성을 자극하는 치료학적 유효량의 인자와 함께 사용된다. 이러한 인자는 BMP - 1 내지 BMP - 12 로 명명한 골발생 인자, 형질전환 성장 인자 - β (TGF -β) 및 TGF - β 군 요소, 인터루킨 - 1 저해제, TFNα 저해제, 부갑상선 호르몬 및 그 유사체, 부갑상선 관련 단백질 및 그 유사체, E 시리즈 프로스타글란딘, 비스포스포네이트 (아렌드로네이트 및 그외의 것) 및 플루오르화물 및 칼슘과 같은 골 - 촉진 미네랄을 포함하지만 이것으로 제한되지는 않는다.
다음의 실시예는 본 발명을 보다 충분히 설명하기 위한 것으로, 그 범주로 제한하여 해석되지는 않는다.
실시예 1
랫 OPG cDNA 의 확인 및 분리
cDNA 클로닝 물질과 방법 및 분석은 Maniatis 등의 동일문헌에 기재되어 있다. PCR 반응 혼합물 (뵈링거 - 맨하임에서 구입) 및 제작자에 의해 특정된 프라이머 농도를 이용한 퍼킨 - 엘머 9600 열순환기를 이용하여 폴리메라제 연쇄 반응법 (PCR) 을 실시하였다. 일반적으로, 25 - 50 μl 의 반응물을 94 ℃ 에서 변성시킨 다음 94 ℃ 에서 5 초, 50 - 60 ℃ 에서 5 초 및 72 ℃ 에서 3 - 5 분씩 20 - 40 순환을 실시하였다. 반응물을 72 ℃ 에서 3 - 5 분간 처리하였다. 그런 다음 Maniatis 등의 동일문헌 에 기술되어 있는 바와 같이 겔 전기영동에 의해 반응물을 분석하였다.
EST 분석을 위해 배의 d20 장으로부터 분리한 mRNA 를 이용하여 cDNA 라이브러리를 구성하였다[Adams 등의 Science 252, 1651 - 1656 (1991) 참조]. 랫의 배를 절개하고 발육중인 소장 및 대장 전체를 들어내어 PBS 로 세척하였다. 산 구아니디늄 티오시아네이트페놀 - 클로로포름 추출에 의해 전체 세포를 정제하였다[Chomczynski 및 Sacchi Anal. Biochem. 162, 156 - 159, (1987) 참조]. 제작자가 지시한 방법을 이용하여 다이나비드 올리고 (dT) 25 [Dynabeads Oligo (dT) 25](다이날 코포레이션에서 구입) 에 흡착시켜 그것으로부터 용리한 전체 RNA 제제로부터 폴리 (A+) mRNA 분획을 수득하였다. 무작위 프라임 cDNA 라이브러리는 수퍼스크립트 플라스미드 시스템 (미국 매릴랜드 게터스버그에 소재하는 깁코 BRL 에서 구입) 을 이용하여 제조하였다. 내재성 Not I 제한 부위를 포함하는 무작위 cDNA 프라이머는 1차 가닥 합성을 시작하는 데 이용하였고, 다음 서열을 갖는다.
:
Figure pct00001
1 차 가닥 합성을 위해, 2.5 ㎍ 의 폴리 (A)RNA 및 120 ng, 360 ng 또는 1,080 ng 의 무작위 프라이머를 함유하는 각 세 반응물을 모았다. 2 차 가닥 합성 후, 반응 산물은 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 알코올 (비는 25 : 24 : 1) 혼합물로 각각 추출한 다음 에탄올 침전시켰다. 세 반응물의 이본쇄 (ds) cDNA 산물을 합하여 다음의 ds 올리고누클레오티드 어댑터에 결합시켰다 :
결합시킨 후, cDNA 를 Not I 으로 완전히 절단하고 페놀 : 클로로포름 : 이소아밀 (25 : 24 : 1) 알코올로 추출하여 에탄올 침전시켰다. 그런 다음 수퍼스크립트 플라스미드 시스템 (미국 매릴랜드 게터스버그에 소재하는 깁코 BRL 에서 구입) 과 함께 구입하여 제작자의 지시에 따라 미리 제조한 컬럼을 이용한 겔 여과에 의해 재현탁된 cDNA 를 크기별로 분획화하였다. 가장 거대한 cDNA 산물을 함유하는 두 분획을 풀링하고 에탄올 침전시킨 다음 Not I 및 Sal I 으로 절단한 pMOB 벡터 DNA 내로 방향성 있게 결합시켰다(Strathmann 등의 1991 문헌참조). 결합된 DNA 를 일렉트로포레이션에 의해 일렉트로 MAX DHIOB E. coli 감응 세포내로 도입시켰다. 자동적인 서열 분석을 위해, 약 10,000 개의 형질전환체를 암피실린 보충 LB 영양 배지를 함유하는 20 cm x 20 cm 한천 플레이트 상에 도말하였다. 생성된 콜로니를 가려내어 200 ml 의 L - 육즙, 7.5% 의 글리세롤 및 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 96 웰 미량역가 플레이트 상에 정렬시켰다. 배양액을 37 ℃ 에서 밤새 배양하고, 무균의 96 핀 복제 기구를 이용하여 두 세트의 미량역가 플레이트를 제조한 다음 또다른 분석을 위해 - 80 ℃ 에서 두 세트를 보관하였다. 전장의 cDNA 클로닝을 위하여, 약 10,000 개의 클론을 각각 함유하는 96 박테리아성 암피실린 플레이트 상에 대략 백만개의 형질전환체를 도말하였다. 퀴아겐 플라스미드 맥시 키트(독일의 퀴아겐 코포레이션에서 구입)를 이용하여 각 풀로부터 플라스미드 DNA를 각각 분리하고, PCR 분석을 위해 96 미량역가 플레이트에 정렬시켰다.
태아 랫의 장 cDNA 클론의 무작위 서열결정을 위해, 글리세롤 저장액을 녹여 소분취량을 증류수로 1 : 25 희석하였다. 다음의 올리고누클레오티드를 함유하는 PCR 반응 혼합물 (뵈링거 - 맨하임에서 구입) 에 약 3.0μl 의 희석된 박테리아 배양액을 가하였다 :
다음의 순환 조건을 갖는 열순환기 (퍼킨 - 엘머 9600) 에서 반응물을 항온하였다 : 94 ℃ 에서 2 분 ; 94 ℃ 에서 5 초, 50 ℃ 에서 5 초, 및 72 ℃ 에서 3 분씩 30 순환 ; 72 ℃ 에서 4 분. 열순환기에서 항온한 후, 2.0 mL 의 물로 반응물을 희석하였다. 증폭된 DNA 단편은 제작자가 추천한 방법으로 센트리콘 컬럼 (프린세톤 세퍼레이션스에서 구입) 을 이용하여 더 정제하였다. 제작자가 추천한 방법에 이어 T3 프라이머 (올리고누클레오티드 353 - 23 : 5' - CAATTAACCCTCACTAAAGG - 3') (서열번호 : 6) 표식 염료 - 종결 반응물(어플라이드 바이오시스템스에서 구입)을 이용하여, 어플라이드 바이오시스템스 373A DNA 시퀀서에서 자동적으로 PCR 반응 산물의 서열을 결정하였다.
무작위로 골라낸 cDNA 클론으로부터 수득한 5' 누클레오티드 서열을 번역한 다음, 변형된 FASTA 프로그램을 이용하여 현존 데이터베이스의 공지 단백질 서열과 비교하였다[Pearson 등의 Meth. Enzymol. 183, (1990) 참조]. Luethy 등의 [Protein Science 3, 139 - 146 (1994)] 문헌에서 변형시킨 바와 같이 Gribskov 등의 [Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 4355 - 4359 (1987)]문헌의 서열 측면 결정방법을 이용하여, 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 상과의 공지된 모든 요소에서 발견되는 특정 시스테인 - 풍부 단백질 모티프의 존재에 대해 번역된 서열을 분석하였다[Smith 등의 Cell 76, 959 - 962 (1994) 참조].
FASTA 및 프로필 연구 데이터를 이용하여 TNFR 상과의 잠재적인 새 요소로서 EST, FRl - 1 (태아 랫 장 - 1) 을 확인하였다. FRl - 1은 약 150 개 아미노산의 LORF 와 함께 대략 600 bp 의 삽입물을 함유하였다. 데이터베이스에서 가장 근접하게 비슷한 것은 인체 TNFR II 유형 (TNFR - 2) 였다. 비교 부위는 이 150 개 아미노산 LORF 에 걸쳐 TNFR - 2 와 FRl - 1 간에 ∼ 43 % 의 동질성을 보였다. TNFR 상과의 첫 번째와 두 번째 시스테인 - 풍부 반복체를 이용한 프로필 분석으로 ∼ 8 의 Z 스코어를 얻었는데, 이것은 FRl - 1 유전자가 새로운 군 요소를 코드함을 시사한다. FRl - 1 산물의 구조를 추정하기 위해, 태아 랫의 장 cDNA 라이브러리를 전장의 클론에 대해 선별하였다. 다음의 올리고누클레오티드를 원래의 FRl - 1 서열로부터 유도하였다 :
이들 프라이머를 PCR 반응에 이용하여 플라스미드 DNA 의 96 풀을 선별하는데, 각 풀은 10,000 개의 각각의 cDNA 클론으로부터의 플라스미드 DNA 를 함유하였다. 다음의 순환 조건을 갖는 퍼킨 - 엘머 96 웰 열 순환기를 이용하여 PCR 반응 혼합물 내에서 약 1 ug의 플라스미드 풀 DNA 를 증폭하였다 : 94 ℃ 에서 2 분, 1 순환 ; 94 ℃ 에서 15 초, 65 ℃ 에서 45 초, 30 순환 ; 65 ℃ 에서 7 분, 1 순환. PCR 반응 산물을 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 96 개의 플라스미드 DNA 풀 중 13 개에서 예상했던 상대적인 분자 질량을 갖는 DNA 산물의 증폭이 발생했다.
하나의 양성 풀로부터의 DNA 를 상기와 같이 일렉트로MAX DHIOB E. coli 감응 세포(미국 매릴랜드 게터스버그 소재 깁코 BRL 에서 구입)를 형질전환시키는 데 이용하였다. 약 40,000 개의 형질전환체를 멸균 니트로셀룰로스 필터 (BA - 85, 슐라이커 앤드 슈엘)상에 도말한 다음 위에서 수득한 PCR 산물의 32P - dCTP 표지 버전을 이용한 콜로니 혼성화로 선별하였다. 5 × SSC, 50 % 탈이온 포름아미드, 5 × 덴하르트액, 0.5 % SDS 및 100 ㎍/ml 의 변성된 연어 정자 DNA 에서 42 ℃ 로 2 - 4 시간동안 필터를 미리 혼성화시켰다. 그런 다음 5 × SSC, 50 % 탈이온 포름아미드, 2 × 덴하르트액, 0.1 % SDS, 100 ㎍/ml 의 변성된 연어 정자 DNA 및 ∼ 5 ng/ml 의 표지 프로브에서 42 ℃로 ∼ 18 시간동안 필터를 혼성화시켰다. 필터를 실온에서 2 × SSC 로 10 분간, 55 ℃ 에서 1 × SSC 로 10 분간 세척하고, 최종적으로 55 ℃ 에서 0.5 × SSC 로 10 - 15 분간 세척하였다. 방사선사진에 이어 혼성된 클론을 검출한 다음 2차 선별을 위해 니트로셀룰로스 필터에 재도말하였다. 2차 선별시, 플라스미드 클론(pB1.1)을 분리한 다음 100 ㎍/ml 암피실린를 함유하는 L - 육즙 배지에서 증폭시켜 플라스미드 DNA 를 수득하였다. 2.4 kb의 pB1.1 삽입물의 양 가닥의 서열을 결정하였다.
pB1. 1 삽입물 서열은 현존하는 모든 서열 중 비슷한 것을 검출하기 위한 공지된 데이터베이스의 FASTA 연구에 이용하였다. 인체 및 마우스 TNFR - 2 유전자에 대해 약 45 % 의 유사성이 있기는 하나, 공지된 어떤 유전자 또는 EST 에 동등한 것은 발견되지 않았다. 메티오닌 개시 코돈은 누클레오티드 서열의 bp 124 에서 발견되고 bp 1327 에서 종결되는 LORF 코드화 401 아미노산 잔기가 뒤이어 발견된다. 401 아미노산 잔기는 그 말단에 대략 31 잔기의 소수성 신호 펩티드를 가지며 4 개의 N - 결합 글리코실화 부위를 가질 것으로 예상된다. 펩플롯 프로그램 (위스콘신 GCG 패키지, 버전 8.1) 을 이용하여 소수성 트랜스막 스패닝 서열이 없음을 확인하였다. 그런 다음 추정된 401 아미노산 서열을 단백질 데이터베이스 연구에 이용하였다. TNFR 상과의 많은 요소, 가장 현저하게는 인체 및 마우스 TNFR - 2 와 상당히 유사한 것처럼 보였으나, 동등한 것은 역시 존재하지 않았다. 공지된 TNFR - 상과의 요소와 신규한 단백질 서열의 정렬은 파일업 프로그램을 이용하였으며, 프리티플롯 (위스콘신 GCG 패키지, 버전 8.1) 에 의해 변형하였다. 이러한 정렬은 전장의 FRI - 1 유전자 산물과 그외의 모든 TNFR 군 요소사이의 상당한 상동성을 보여준다. TNFR 군 요소들의 세포외 도메인에 대해 상동부위를 배치하고, 상동 부위는 이들 단백질의 리간드 결합 도메인에서 발견되는 세 개 또는 네 개의 시스테인 - 풍부 반복체에 해당한다. 이것은 FRl - 1 유전자가 신규한 TNFR 군 요소를 코드함을 의미한다. 트랜스막 스패닝 부위가 검출되지 않았으므로, 우리는 이것이 TNFR - 1 유도 가용성 수용체와 유사한 분비성 수용체일 것으로 예상하였다[Kohno 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8331 - 8335 (1990) 참조]. FRl - 1 유전자 (하기 참조) 의 겉보기 생물학적 활성도 때문에, 생성물을 오스테오프로테게린 (OPG)이라 명명하였다.
실시예 2
조직내에서 OPG mRNA 의 발현 양식
인체 전사물의 크기를 검출하고 발현 양식을 알아보기 위해 32p - dCTP 표지 FRl - 1 PCR 산물로 다양한 인체 조직 노던 블롯 (클론 테크) 을 탐침하였다. 5 × SSPE, 50 % 포름아미드, 5 × 덴하르트액, 0.5 % SDS 및 100 ㎍/ml 의 변성된 연어 정자 DNA 에서 2 - 4 시간동안 42 ℃ 로 노던 블롯을 미리 혼성화시켰다. 그린 다음 5 × SSPE, 50 % 포름아미드, 2 × 덴하르트액, 0.1 % SDS, 100 ㎍/ml 의 변성된 연어 정자 DNA 및 5 ng/ml 의 표지 프로브에서 18 ∼ 24 시간동안 42 ℃ 로 블롯을 혼성화시켰다. 실온에서 2 × SSC 로 10 분간, 50 ℃ 에서 1 × SSC 로 10 분간 블롯을 세척한 다음 0.5 × SSC 로 10 - 15 분간 세척하였다.
랫 유전자로부터 유도한 프로브를 이용하여, 약 2.4 kb의 상대적인 분자 질량을 갖는 우세한 mRNA 종이 신장, 간, 태반 및 심장을 포함한 일부 조직에서 검출된다. 신장에서 가장 높은 수준으로 검출된다. 분자량이 4.5 및 7.5 kb 로 큰 mRNA 종은 골격근 및 이자에서 검출되었다. 인체 태아 조직의 경우, 신장은 2.4 kb mRNA 를 상대적으로 높은 수준으로 발현하는 것으로 나타났다. 인체 프로브 (하기 참조)를 이용하여, 2.4 kb 의 전사물만이 이들 동일한 조직에서 검출된다. 부가적으로, 2.4 kb 전사물의 상대적으로 높은 수준은 림프절, 흉선, 비장 및 충양돌기에서 검출되었다. 인체 및 랫의 오스테오프로테게린 유전자 둘다에 의해 검출된 전사물의 크기는 랫의 pB1. 1 FRl - 1 삽입물의 길이와 거의 동일하므로, 그것이 전장의 cDNA 클론이었음을 의미한다.
실시예 3
형질전환 마우스내 OPG 의 전신 운반
ApoE - 간 특이 발현 벡터 [Simonet 등의 J. Clin. Invest. 94, 1310 - 1319 (1994), 및 PCT 출원번호 제 US94/11675 호 및 공동소유의 미국 출원 번호 제 08/221,767 호 참조] 내로 서브클로닝시키기 위해 코딩 영역을 PCR 증폭시키기 위한 주형으로 랫의 OPG 클론 pB1. 1 을 이용하였다. 다음의 5' 및 3' 올리고누클레오티드 프라이머를 각각 PCR 증폭에 이용하였다 :
PCR 반응 혼합물(뵈링거 - 맨하임에서 구입)을 다음과 같이 처리하였다 : 94 ℃ 에서 1 분, 1 순환 ; 94 ℃ 에서 20 초, 62 ℃ 에서 30 초 및 74 ℃ 에서 1 분, 25 순환. 증폭 후, 시료를 퀴아겐 PCR 컬럼을 통해 정제하고 SpeI 및 Not I 제한 효소로 밤새 절단하였다. 절단된 산물을 추출하여 침전시키고 ApoE 프로모터 발현 벡터내로 서브클로닝시켰다. 결과적으로 생성된 클론인 HE - OPG를 미량투여하기 전에, 그것이 성숙형인지를 확인하기 위해 서열을 결정하였다.
두 차례의 CsCl 밀도 기울기 원심분리를 통해 HE - OPG 플라스미드를 정제하였다. 정제된 플라스미드 DNA 를 Xho I 및 Ase I 으로 절단하고, 3.6 kb 의 트랜스유전자 삽입물을 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 5 mM 트리스, pH 7.4, 0.2 mM EDTA 내의 1㎍/ml 저장 주사 용액으로 정제된 단편을 희석하였다. BDF 1 × BDF 1으로 자란 마우스로부터의 단세포 배는 주사 바늘을 비스듬하게 자르고 사용하기 전에 실리콘 처리하는 것을 제외하고는 Brinster 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. UAS 82, 4338 (1985) 문헌에 기술된 바와 같이 기본적으로 주사하였다. 배를 CO2 항온기에서 밤새 배양하였고, 15 내지 20 개의 2 - 세포 배를 가임신중인 CD1 마우스 암컷의 난관으로 전이시켰다.
임신 기간 후에, 미량주사된 배의 이식으로부터 49 마리의 자손을 얻었다. 게놈 DNA 시료에 융합된 트랜스유전자의 PCR 증폭에 의해 자손을 선별하였다. 증폭의 표적 부위는 발현 벡터에 포함된 인체 Apo E 인트론의 369 bp 부위였다. PCR 증폭을 위해 사용된 올리고는 다음과 같다 :
Figure pct00011
PCR 조건은 다음과 같았다 : 94 ℃ 에서 2 분, 1 순환 ; 94 ℃ 에서 1 분, 63 ℃ 에서 20 초 및 72 ℃ 에서 30 초, 30 순환, 49 마리의 원래의 자손 중 9 마리가 PCR 양성 형질전환 원조인 것으로 확인되었다.
생후 8 - 10 주째에, 5 마리의 형질전환 원조 ( 2,11,16,17 및 28) 및 5 마리의 대조 (1,12,15,18 및 30) 를 해부와 병리학적 분석을 위해 희생시켰다. 부분적 간절제술에 의해 나머지 4 마리의 원조에서 간을 분리하였다. 부분적 간절제술을 위해 마우스를 마취시키고 간엽 제거 수술을 하였다. 모든 형질전환 원조 및 5 마리의 음성 대조 한배 자손 간으로부터 전체 세포성 RNA를 McDonald 등의 Meth. Enzymol. 152, 219 (1987) 문헌에 기술된 바와 같이 분리하였다. 트랜스유전자 발현 정도를 평가하기 위해 이들 시료에 대해 노던 블롯 분석을 실시하였다. 각 동물의 간으로부터 약 10 ㎍ 의 전체 RNA 를 전기영동 변성 겔에 의해 분해하고 [Ogden 등의 Meth. Enzymol 152, 61 (1987) 참조] HYBOND - N 나일론막 (애머샴에서 구입)에 전이시킨 다음 32P dCTP - 표지 pB1.1 삽입 DNA로 탐침하였다. 50 % 포름아미드, 5 × SSPE, 0.5 % SDS, 5 × 덴하르트액, 100 ㎍/ml 의 변성된 연어 정자 DNA 및 2 - 4 × 106 표지 프로브 cpm/혼성 완충액의 ml 에서 42 ℃ 로 밤새 혼성화를 실시하였다. 혼성된 후, 블롯을 2 × SSC , 0. 1 % SDS 로 실온에서 각 5 분간 2 회 세척한 다음 0.1 × SSC, 0.1 % SDS 로 55 ℃ 에서 각 5 - 10 분간 2 회 세척하였다. 원조 및 대조 한배자손 내에서의 트랜스유전자 발현은 방사선사진으로 측정하였다.
노던 블롯 데이타는 형질전환 원조 중 7 마리가 트랜스유전자 mRNA 를 검출가능한 수준으로 발현함을 보여준다 (동물 번호 2,11,16,17,22,33 및 45). 음성 대조 마우스와 원조 중 1 마리 (#28)는 트랜스유전자 - 관련 mRNA 를 발현하지 않았다. OPG가 분비 단백질인 것으로 언급하였으므로, 트랜스유전자 mRNA 는 유전자 산물의 전신 운반 정도를 대신할 것이다. PCR 및 노던 블롯 양성 마우스 중 동물 2, 17 및 22 는 가장 고수준의 트랜스유전자 mRNA 를 발현하였고, 숙주 세포와 조직에 대해 보다 광범위한 생물학적 효과를 보일 것이다.
실시예 4
OPG 의 생물학적 활성도
5 마리의 형질전환 마우스 (동물 2,11,16,17 및 28) 및 5 마리의 대조 한배 자손 (동물 1,12,15,18 및 30) 은 다음의 과정을 통해 해부 및 병리학적 분석을 위해 희생시켰다 : 안락사시키기 전에, 모든 동물은 그들의 지정 번호를 확인한 다음 무게를 달고 마취시켜 혈액을 뽑아내었다. 완전한 혈청 화학 및 혈액학적 패널을 위해 혈청 및 전핼액으로 보관하였다. 치명적인 CO2 흡입으로 마취시킨 직후 및 완전히 절개하기 전에 방사선사진법을 실시하였다. 이후에, 조직을 제거하여 조직학적 검사를 위해 10 % 완충 Zn - 포르말린에 고정시켰다. 수집된 조직은 간, 비장, 이자, 위, 십이지장, 회장, 결장, 신장, 재생성 기관, 피부 및 유선, 골, 뇌, 심장, 폐, 흉선, 호흡관, 식도, 갑상선, 공장, 맹장, 직장, 부신, 방광 및 골격근을 포함하였다. 고정 전에, 간, 위, 신장, 부신, 비장 및 흉선에 대해 전체 기관 중량을 결정하였다. 고정 후에는, 조직을 파라핀 블록 (paraffin block) 처리하여 3 ㎛ 의 단면은 얻었다. 포름산을 이용하여 골조직의 석회질을 제거하고 모든 단면을 헤마록실린과 에오신으로 염색하였다. 또한, 고모리 레티쿨린 (Gomori's reticulin) 및 메이슨 트리크롬 (Masson's Trichrome) 으로 특정 조직을 염색하였다. 단구 - 대식세포계의 다핵성 골흡수 세포인 파골세포에 의해 고도로 발현되는 효소인 주석산염 산 저항성 포스파타제 (TRAP)의 발현을 측정하기 위해 효소 조직화학을 실시하였다. 또한 복제 세포와 단구 - 대식세포계의 세포 각각을 검출하기 위해 BrdU 및 F480 단구 - 대식 세포 표면 항원에 대한 면역조직화학을 실시하였다. F480 표면 항원 발현을 검출하기 위해, 포르말린에 고정시키고 파라핀을 꽂은 4 ㎛ 단면의 파라핀을 제거하고 탈이온수로 수화시켰다. 단면을 3 % 과산화수소로
Figure pct00342
칭시키고 단백질 차단액 (미국 펜실베니아 피츠버그 소재 립쇼에서 구입) 으로 차단시켜 랫의 단클론성 항 - 마우스 F480(미국 인디애나 인디아나폴리스 소재 할란에서 구입)에서 항온하였다. 이 항체는 비오틴화된 토끼의 항 - 랫 면역글로불린, 크로마겐 (미국 캘리포니아 산타 바바라 소재 비오텍에서 구입) 과 같은 DNA 와 함께 과산화효소 복합 스트렙타비딘 (미국 캘리포니아 산라몬 소재 바이오제 넥스에서 구입) 으로 검출하였다. 단면을 헤마톡실린으로 대비 염색하였다.
내장 조직의 완전 - 해부 및 관찰시에, 트랜스유전자 발현자 또는 대조 한배 자손에서 이상한 것은 발견되지 않았다. 조직 중량 분석은, 비장 크기가 대조에 비해 형질전환 마우스에서 약 38 % 증가 하였음을 보여준다. 약간의 혈소판 팽창 및 트랜스유전자 발현자의 비염색 세포의 순환 증가가 있었다. 트랜스유전자 발현자내에서 최저한의 혈소판 수준이 감소되었다. 또한, 혈청 뇨산, 뇨질소 및 알칼린 포스파타제 수준은 모두 트랜스유전자 발현자내에서 감소 추세를 보였다. 발현자는 장골 (대퇴골), 척추 및 평골 (골반) 을 포함한 골격의 증가된 방사선밀도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 발현자의 대퇴골의 상대적인 크기는 대조 마우스와 다르지 않았다.
OPG 발현자로부터 염색된 골 단면의 조직학적 분석은, 대퇴골의 골간내 골소주에서 보이는 일차 해면질로부터의 연골 조각의 존재로 인해 심각한 골다공증을 보인다. 대퇴골의 단면에서 뚜렷하게 한정된 피질은 확인할 수 없었다. 정상적인 동물에서, 중추 골간은 골수로 채워져 있다. 척추 단면 또한 OPG - 유도 골격 변화가 전신성이었음을 의미하는 골화석증을 보인다. 잔여 골수는 주로 골수양성 성분으로 나타났다. 혈소판 생성세포가 존재하였다. 레티쿨린 염색은 레티쿨린 침전에 대한 징후가 없었다. 마우스내 단구 - 대식세포 유도 세포에 의해 발현되는 세포 표면 항원인 F480 에 대한 면역조직화학은 골수강내의 F480 양성세포가 존재함을 보여주었다. 평평해진 F480 양성 세포는 전적으로 소주골 표면 근처에서 볼 수 있었다.
골소주의 간엽세포 내막은 평평하고 불활성인 것으로 보였다. H & E 및 TRAP 염색에 근거하여, OPG 발현자내 골소주 표면에서 파골세포를 거의 발견할 수 없었다. 그와는 반대로, 파골세포 및/또는 연골흡수세포는 성장판 흡수 연골 부위에서 발견되었으나, 그 수는 대조에 비해 감소되었다. 또한, 파골세포는 보통 제작활동이 활발한 골간단의 피질 표면에 존재하였다. 발현자와 대조간의 현저한 차이는 소주의 파골세포, 척추와 대퇴골에서 매우 줄어들었다. 골축적 정도는 전체 간 RNA 의 노던 블로팅에 의해 검출된 OPG 트랜스유전자 mRNA 의 정도와 직접적으로 관계가 있었다.
OPG 발현자의 비장은 조혈 증가에 기인한 팽창으로 적비수의 양이 증가하였다. 모든 조혈 계통이 나타나 있다. F480 양성 세포는 대조 및 OPG 발현자의 적비수에 존재하였다. 두 발현자는 (2 및 17) 간 내부에 수질외 조절의 중심을 가지고 있었으며, 이것은 골화석증 골수에서 기인하는 것으로 보인다.
흉선, 림프절, 위장관, 췌장 - 간담즙관, 기도, 생식기계, 비뇨생식기계, 피부, 신경계, 심장과 대동맥, 유방, 골격근 및 지방에서 관찰할 수 있는 이상은 존재하지 않았다.
실시예 5
마우스 및 인체 OPG cDNA 의 분리
마우스 OPG mRNA 의 5' 말단에 해당하는 cDNA 클론을 PCR 증폭에 의해 마우스 신장 cDNA 라이브러리 (클론테크) 로부터 분리하였다. 올리고누클레오티드 랫의 OPG cDNA 서열로부터 유도하였고 하기에 나타나 있다 :
Figure pct00012
이 과정에서 수득한 부분 및 전장의 cDNA 산물의 서열을 결정하였다. 전장의 산물을 Not I 및 Xba I 으로 절단한 다음 플라스미드 벡터 pRcCMV (인비트로겐에서 구입) 내로 방향성있게 클로닝하였다. 그 결과 생성된 플라스미드를 pRcCMV - Mu - OPG 라 명명하였다. 클로닝된 산물의 누클레오티드 서열을 랫 OPG 의 cDNA 서열과 비교하였다. OPG LORF 에 걸친 1300 bp 부위에 대하여, 랫 및 마우스 DNA 서열이 대략 88 % 동일하다. 마우스 cDNA 서열은 401 아미노산의 LORF 를 함유하였는데, 랫 OPG 단백질 서열과 비교하여 갭 없이 ∼ 94 % 동일한 것으로 나타났다. 이것은 분리된 마우스 cDNA 서열이 마우스 OPG 단백질을 코드하고, 서열과 구조가 진화되는 동안에 매우 보존적이었음을 의미한다. 마우스 OPG 단백질 서열은 N - 말단에 동일한 추정 신호 펩티드를 함유하며 4개의 N - 결합 글리코실화 부위 모두 보존적이다.
다음의 랫 - 특이 올리고누클레오티드를 이용하여 인체 신장 cDNA 라이브러리로 부터 부분적인 인체 OPG cDNA 를 클로닝하였다 :
이 PCR 산물의 서열을 결정하고, 주형으로서 람다내 인체 OPG 게놈 클론을 이용한 인체 cDNA 의 3 ' 말단 증폭을 위한 프라이머를 만드는 데 사용하였다 :
증폭된 PCR 산물의 서열을 결정하고, 전체 인체 OPG cDNA 코드화 서열을 증폭시키는 데 유용한 5' 및 3' 인체 - 특이 프라이머를 만드는 데에 5 ' 말단 서열과 함께 사용하였다 :
전장의 인체 PCR 산물의 서열을 결정한 다음 Not I 및 Xba I 을 이용하여 플라스미드 벡터 pRcCMV (인비트로겐에서 구입) 내로 방향성 있게 클로닝하였다. 그결과 생성된 플라스미드를 pRcCMV - 인체 OPG 라 명명하였다. 산물의 누클레오티드 서열을 랫과 마우스의 OPG cDNA 서열과 비교하였다. OPG LORF 에 걸친 1300 bp 부위에 대하여, 랫 및 마우스의 DNA 서열은 인체 OPG cDNA 와 약 78 ∼ 88 % 동일하다. 인체 OPG cDNA 서열 또한 401 개 아미노산 LORF 를 함유하였으며, 그것은 랫 및 마우스 단백질 서열에 필적하였다. 언급한 인체 OPG 단백질은 랫 및 마우스 단백질과 각각 약 85 % 및 ∼ 90 % 동일하다. 랫, 마우스 및 인체 단백질의 서열을 정렬시키면 그것이 진화되는 동안에 매우 보존적이었음을 보여 준다. 인체 단백질은 N - 말단 신호 펩티드 및 5 개의 N - 결합 글리코실화 부위를 갖는 것으로 언급되며, 이 중 4 개가 랫과 마우스 OPG 단백질 간에 보존된다.
마우스 OPG 의 DNA 및 예상되는 아미노산 서열은 도 9A 및 9B(서열번호 : 122) 에 나타나 있다. 인체 OPG 의 DNA 및 예상되는 아미노산 서열은 도 9C 및 9D (서열번호 : 124) 에 나타나 있다. 랫, 마우스 및 인체 OPG 아미노산 서열 비교는 도 9E 및 9F 에 나타나 있다.
부가적인 인체 OPG cDNA 클론을 분리하여, 도 9C 에 나타나 있는 DNA 서열의 위치 103 에서 G 가 C 로 염기치환되었음을 밝혔다. 이러한 누클레오티드 변화는, 도 9C 에 나타나 있는 아미노산 서열의 위치 3 에서 리신의 아스파라긴 치환을 초래한다. 이러한 변화를 갖는 클론내 잔여 서열은 도 9C 및 9D의 서열과 동일하였다.
실시예 6
OPG 3 차원 구조 모델링
OPG 의 아미노-말단 부분은 공지되어 있는 모든 TNFR 상과 (superfami]y) 부류의 세포외 부분과 상동이다(도 1C). 이 부분의 TNFR - 관련 유전자에서 가장 주목할 만한 모티브는 ∼ 40 개 아미노산인데, 이것은 시스테인-풍부 반복 서열로서 독특한 구조로 접혀진다[Banner 등의 Cell 73, 431 - 445 (1993) 참조]. 이 모티브는 보통 4 개(3-6 범위)의 직렬 반복 모양 (도 1C 참조)을 나타내며 리간드 결합과 관련되는 것으로 알려져 있다[Beutler 및 van Huffel 의 Science 264, 667 - 663 (1994) 참조]. 각 반복 모양은 보통 6 개의 사이를 둔 시스테인 잔기를 함유하는데, 이 잔기는 SS1, SS2 및 SS3라고 부르는, 3 개의 도메인내 이황화물 결합을 형성하는 것과 관련된다(Banner 등의 동일문헌 참조). TNFR2, CD30 및 CD40 과 같은 어떤 수용체에 있어 반복 도메인의 일부는 단지 2개의 사슬내 이황화물 결합만(SS1 및 SS3)을 함유한다.
인체 OPG 단백질 서열을 Luethy 등의 동일문헌에 기술된 방법을 이용하여 TNFR1 세포외 도메인 단면에 정렬시켜 그 결과를 위스콘신 패키지의 프리티플롯(PrettyPlot) 프로그램, 버전 8.1 (미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 제넥틱스 컴퓨터 그룹)을 사용하여 그래프로 나타냈다(도 10). 이 정렬은 도메인 1-4 의 형성과 관련되는 시스테인 잔기가 분명히 전환되었음을 나타낸다. 그런다음 이 정렬을, 주형으로서 p55 TNFR1 (Banner 등의 동일문헌 참조)의 세포외 도메인의 공지되어 있는 3 차원 구조를 사용하여 인체 OPG N - 말단 도메인의 3 차원 (3-D) 모델을 구성하는데 사용하였다. 이를 위해 펩티드 골격의 원자 동조체 및 동일 잔기의 곁사슬을 TNFR1 의 결정 구조 동조체로부터 복제하였다. 그런다음, 삽입을 위한 잔류 동조체 및 다른 곁사슬을 룩(LOOK) 프로그램(미국 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 몰레큘라 어플리케이션 그룹)을 사용하여 생성시켰다. 룩을 사용하여 그것의 입체구조 에너지를 최소화함으로써 3 - D 모델을 정련시켰다.
다른 TNFR1 과 (family) 부류와 유사하게, 이 OPG 가 리간드에 결합한다고 생각된다. OPG 와 그 리간드의 상호작용을 모델로 나타내기 위해 TNF-β 의 결정구조를 "OPG 리간드"의 3 - D 구성을 모의 실험하는데 사용하였다. 이 데이터는 몰스크립트(Molscript) (Kraulis, J. 의 Appl. Cryst. 24, 946 - 950, 1991 참조)를 사용하여 그래프로 나타냈다(도 11 참조). 3 TNFβ 및 3 OPG 분자를 수반한 OPG/리간드 복합체에 대한 모델을 구성하였는데, 여기서 OPG 의 상대 위치는 결정구조의 TNFR1 과 동일하다. 그런다음 다음 접근법을 사용하여 리간드와 상호작용할 수 있는 OPG 의 잔기를 발견하는데 이 모델을 이용하였다 : 용매에 접근하기 쉬운 복합체내 모든 잔기 영역 및 하나의 단일 OPG 모델을 계산하였다. 단량체에서 보다도 복합체에서 다른 접근성을 갖는 잔기가 리간드와 상호작용하는 것 같다.
시스테인이 풍부한 도메인 1-4 각각을 포함하는 가장 주된 서열에 대한 이와 같은 정보를 이용하여 인체 및 마우스 OPG 아미노산 서열을 재정렬하였다(도 12A 및 12B). 각 도메인은 다음과 같이 예상되는 개개의 구조 특성을 지니고 있다 :
도메인 1
SS2 (C41 내지 C54)와 SS3 (C44 내지 C62) 이황화물 결합과 관련되는 4 개의 시스테인 함유. 비록 SS1 결합이 명백히 이황화물 결합을 기초로 하지 않으나, 위치 28 의 보존된 티로신은 TNFR1의 Y20 과 상동인데, 이 Y20 은 도메인 형성에 도움을 주는 H66 과 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이 두 잔기는 실제로 생물학적 활성도에 중요할 수도 있으며, Y28 까지 및 이 이상의 N - 말단 OPG 절두형이 변경된 활성도를 가질 수도 있다. 또한, 잔기 E34 및 K43 이 본 3-차원 모델을 기초로 한 결합 리간드와 상호작용한다고 예상된다.
도메인 2
6 개의 시스테인을 함유하고 SS1 (C65 내지 C80), SS2(C83 내지 C98) 및 SS3 (C87 내지 C105) 이황화물 결합을 함유한다고 예상된다. 이 OPG 부위 역시, TNFβ (상기 참조)와 밀접하게 접촉하는 TNFR1 도메인 2 의 부분에 대해 정렬한 P66-Q91 로부터 연장되어 있는 부위도 함유하며, OPG 리간드와 상호작용할 수 있다. 특정 잔기 P66, H68, Y69, Y70, T71, D72, S73, H75, T76, S77, D78, E79, L81, Y82, P85, V86, K88, E89, L90 및 Q91 이 본 구조 데이터를 기초로 한 결합 리간드와 상호작용 한다고 예상된다.
도메인 3
SS1(C107 내지 C118)와 SS3(C124 내지 C142) 이황화물 결합과 관련되는 4 개의 시스테인을 함유하나, SS2 결합은 함유하지 않는다. 본 구조 데이터를 기초로 하면 잔기 E115, L118 및 K119 가 OPG 리간드와 상호작용한다고 예상된다.
도메인 4
도메인 3 과 비슷하게, SS1 (C145 내지 C160)과 SS3 (C166 내지 C185) 이황화물 결합을 함유하고 있으나, SS2 결합은 함유하지 않는다. 본 구조 데이터를 기초로, E153 과 S155 가 OPG 리간드와 상호작용 한다고 예상된다.
따라서, OPG 에 대한 예상 구조 모델로서 그 생물학적 활성도를 위해 중요할 것 같은 고도로 보존된 잔기의 수를 확인할 수 있다.
실시예 7
포유동물 세포내 재조합 분비 OPG 단백질의 생성
OPG 가 실제로 분비 단백질인지 결정하기 위해 마우스 OPG cDNA를, 표식으로서 인체 lgG1 Fc 도메인에 융합시켜[Capon 등의 Nature 337, 525 - 531 (1989)], 인체 293 섬유아세포 내에서 발현시켰다. Fc 융합체는 벡터 pFc-A3 을 사용하여 생성시켰다. pFc-A3 은 접번(hinge) 도메인의 제 1 아미노산(Glu-99)에서 카르복실 말단까지 인체 면역글로불린 lgG-γ1 중쇄 (Ellison 등의 동일문헌 참조)의 Fc 부분을 코드화하는 부분을 함유하며 5'-NotI 융합부위와 3'- SalI 및 XbaI 부위에 의해 측면에 위치하게 된다. 이 플라스미드는 인체 비장 cDNA 라이브러리(클론테크에서 구입)를 PCR 증폭시켜 구성하였다. PCR 반응물의 최종 부피는 100 μl 였고 20 mM 트리스 - HCl(pH 8.8), 10 mM KCl, 10 μM (NH4)2 SO4, 2 mM MgSO4, 400μM 각 dNTP 를 수반한 0.1 % 트리톤 X-100 및 1μM 의 각 프라이머와 함께 증폭시킬 1 ng 의 cDNA 라이브러리내의 2 유닛의 벤트(Vent) DNA 중합효소 (뉴잉글랜드 바이오랩스에서 구입)를 사용하였다. 95 ℃ 에서 2 분간 변성시킴으로써 반응을 개시한 다음, 95 ℃ 에서 30 초간, 55 ℃ 에서 30 초간, 및 73 ℃ 에서 2 분간으로 30 회 순환시켰다.
5' 프라이머
는 lgG-γ1 접번 도메인의 첫 번째 잔기(Glu-99)의 5' 에 인접하는 NotI 부위를 포함한다. 3' 프라이머
는 SalI 과 XbaI 부위를 포함한다.
717-bp PCR 생성물을 NotI 및 SalI 으로 절단하고, 1 % 아가로스(에프엠시 코포레이션에서 구입)를 통해 전기이동시켜 분리하여 진클린(GeneClean) 과정 (비아이오 101, 인코포레이티드)으로써 정제한 다음 NotI, SalI - 절단 pBluescript II KS 벡터(스트라타진에서 구입)내로 클로닝시켰다. 결과적으로 생성된 플라스미드, pFc-A3 내의 삽입물을 서열결정하여 이 PCR 반응의 충실도(fidelity)를 확인하였다.
플라스미드 pRcCMV-MuOPG 내 클로닝된 마우스 cDNA 를 다음과 같은 두 세트의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다 :
쌍 1
Figure pct00022
쌍 2
Figure pct00023
Figure pct00024
제 1 쌍은 완전한 OPG LORF 를 증폭시키며 Fc 융합 벡터 pFcA3 의 프레임내 NotI 부위와 양립할 수 있는 NotI 제한 부위를 생성한다. 인체 lgG1 Fc cDNA 의 아스파르트산 잔기 216 에 대하여 NotI 제한부위 5' 을 유전공학 처리하여 pFcA3 를 제조하였다. 이 구성체에 OPG 단백질과 lgG Fc 부위 사이를 결합시키는 두 개의 부적절한 아미노산을 코드화하는 링커를 도입시킨다. Fc 부분에 결합시키면 이 생성물은 401 개 OPG 잔기 모두를 코드화한 다음 바로 이어 인체 lgG1 Fc 부분의 227 개 아미노산 잔기 모두를 코드화한다(Fl. Fc). 제 2 프라이머 쌍은 OPG 의 첫 번째 180 개 아미노산 잔기를 코드화하는 DNA 서열을 증폭시키는데, 이 아미노산 잔기는 그것의 추정상 리간드 결합 도메인을 포함하고 있다. 상기와 같이, 3' 프라이머는 lgG1 Fc 도메인에 바로 이어 트레오닌 180 위치에서 C-말단 절두된 OPG LORF 를 융합시키는 인위 NotI 제한부위를 생성한다(CT. fc).
OPG 잔기 401 과 인체 Fc 부분의 아스파르트산 잔기 221 을 결합시키는 아미노산 서열 접합부를 다음과 같이 변형시킬 수 있다 : 인체 Fc 부분의 잔기 216 - 220 을 코드화하는 DNA 를 하기와 같이 삭제할 수 있거나, 인체 Fc 부분의 C220 에 상응하는 시스테인 잔기를 세린이나 알라닌 중 하나로 돌연변이시킬 수 있다. 이 변형 벡터에 의해 코드화되는 OPG-Fc 융합 단백질을 인체 293 세포, 또는 CHO 세포내로 형질감염시켜, 재조합 OPG-Fc 융합 단백질을 하기와 같이 정제할 수 있다.
두 생성물을 플라스미드 벡터 pCEP4(인비트로겐에서 구입)내로 방향에 따라 클로닝시켰다. pCEP4 는 엡스테인 - 바르(Epstein - Barr) 바이러스 복제 기원을 함유하며, 293 - EBNA-1 세포내에서 에피솜 복제할 수 있다. 모 pCEP4, 및 pCEP4 - Fl. Fc 와 pCEP4-CT. Fc 벡터를 제조자가 권고하는 방법을 이용하여 293 - EBNA - 1 내로 지방감염(lipofect)시켰다. 형질감염된 세포를 벡터 발현을 선택하기 위해 100 ㎍/ml 히그로마이신에서 선택하고, 결과적으로 생성된 약물 - 내성 질량 배양주를 전면으로 성장시켰다. 그런 다음 이 세포를 무혈청 배지에서 72 시간동안 배양하여 조정배지를 제거하고 SDS - PAGE 로써 분석하였다. 약물 내성 293 배양주에 의해 생성된 주요 조정배지 단백질이 폴리아크릴아미드겔의 은 염색법으로 검출된다. pCEP4 - Fl. Fc 및 pCEP4-CT.Fc 조정배지 내에는 예상한 크기의 독특한 밴드가 풍부하게 숨어 있었다(도 13B 및 13C 참조). 고농도로 축적된 전장의 Fc 융합 단백질은 안정할 것이다. 웨스턴 블롯에서 항 - 인체 lgG1 Fc 항체(피어스에서 구입)에 의해 두개의 Fc 융합 단백질이 검출되었는데, 이것은 그것들이 재조합 OPG 생성물이라는 것을 나타내는 것이다.
제조자가 권고한 방법을 이용하여 단백질 -A 칼럼 크로마토그래피(피어스에서 구입)하여 전장의 OPG-Fc 융합 단백질을 정제하였다. 그런 다음, Matsudaira 등의 문헌[J. Biol. Chem, 262, 10 - 35 (1987) 참조] 에 필수적으로 기술되어 있는 자동화 에드만 붕괴법으로 이 단백질을 N - 말단 서열 분석하였다. 19 순환 후 다음 아미노산 서열을 판독시켰다 :
이 서열은 아미노산 잔기 22 에서 시작하는 예상된 마우스 OPG 아미노산 서열과 동일하였는데, 이것은 자연 포유동물 리더 절단부위가 본래 예상한바 대로 아미노산 잔기 Q21 - E22 사이이지, Y31 - D32 사이가 아님을 시사하는 것이다. pCEP4 - Fl. Fc 와 pCEP4 - CT. Fc 를 가지고 293 - EBNA 세포에서 수행한 발현 실험은 OPG 가 분비 단백질이며, 그것의 리간드에 결합하기 위해 체계적으로 작용할 수 있다는 것을 증명한다.
muOPG[22-180]-Fc 와 muOPG[22-401]-Fc 융합체를 구성시키고 발현시키는데 사용한 방법과 유사한 방법을 부가 마우스 및 인체 OPG-Fc 융합 단백질을 위해 사용하였다.
인체 lgG1 [muOPG Ct (185). Fc] 의 Fc 부분에 융합된 아미노산 1-185 를 코드화하는 마우스의 OPG cDNA 를 다음과 같이 구성하였다. 플라스미드 pRcCMV Mu 오스테오프로테게린(실시예 5 에 기술되어 있음)으로부터의 마우스 OPG cDAN 를 다음 프라이머쌍을 사용하여 상기한 바와 같은 중합효소 사슬반응으로써 증폭시켰다 :
1333-82 :
1333-80 :
Figure pct00027
이 프라이머쌍은 도 9A 에 나타난 바와 같이 OPG 리딩 프레임의 아미노산 잔기 63 - 185 (bp 278 - 645 에 상응)를 코드화하는 마우스 OPG cDNA 부분을 증폭시킨다. 3' 프라이머는 Fc 융합 벡터 pFcA3 의 프라임내 NotI 부위와 양립할 수 있는 NOtI 제한부위를 포함한다. 이 산물 역시 bp 436 에 위치한 독특한 EcoRI 제한부위를 갖는다. 증폭된 PCR 산물을 정제하고, NotI 및 EcoRI 으로 절단하여, 결과적으로 생성된 EcoRI-NotI 제한 단편을 정제하였다. 마우스 1-401 OPG - Fc 융합 삽입물을 갖는 벡터 pCEP4 를 EcoRI 및 NotI 으로 절단하고, 정제하여 상기 생성한 PCR 산물에 결합시켰다. 결과적으로 생성된 pCEP4 - 기저 발현벡터는 OPG 잔기 1-185 를 코드화하고 바로 이어 인체 lgG1 Fc 부분의 227개 아미노산 잔기 모두를 코드화한다. 이 마우스 OPG 1-185. Fc 융합 벡터를 293 세포내로 형질전환시켜 약물 선택하고, 상기와 같이 조정배지를 생성하였다. 제조자가 권고한 방법을 이용하여 단백질 - A 칼럼 크로마토그래피(피어스)함으로써 결과적으로 생성된 분비 마우스 OPG 1-185. Fc 융합 산물을 정제하였다.
인체 lgG1(muOPG Ct(194). Fc)의 Fc 부분에 융합된 아미노산 잔기 1-194 를 코드화하는 마우스 OPG DNA 를 다음과 같이 구성하였다. 플라스미드 pRcCMV Mu - 오스테오프로테게린으로부터의 마우스 OPG cDNA를 다음 프라이머쌍을 사용하여 증폭시켰다 :
1333-82
1333-81 :
Figure pct00029
이 프라이머쌍은 OPG 리딩 프레임의 아미노산 잔기 70-194(bp 298 - 672 에 상응)를 코드화하는 마우스 OPG cDNA 부분을 증폭시킨다. 3' 프라이머는 Fc 융합 벡터 pFcA3 의 프레임내 NotI 부위와 양립하는 NotI 제한부위를 포함한다. 이 산물 역시 bp 436 에 위치한 독특한 EcoRI 제한부위를 갖는다. 증폭된 PCR 산물을 상기한 바와 같은 마우스 OPG [1-401] Fc 융합벡터내에 클로닝시켰다. 결과적으로 생성된 pCEP4-기저 발현 벡터는 OPG 잔기 1-194 를 코드화하고 바로 이어서 인체 lgG1 Fc 부분의 227 아미노산 잔기 모두를 코드화한다. 이 마우스 OPG 1-194. Fc 융합 벡터를 293 세포내로 형질감염시키고 약을 선택하여, 조정배지를 생성하였다. 제조자가 권고한 방법을 사용하여 단백질 - A 칼럼 크로마토크래피(피어스)로써 결과적으로 생성된 분비 융합 산물을 정제하였다.
인체 lgG1 의 Fc 부위에 융합된 아미노산 1-401 를 코드화하는 인체 OPG DNA 를 다음과 같이 구성하였다. pRcCMV-hu 오스테오프로테게린(실시예 5 에 기술되어 있음)내 인체 OPG DNA 를 다음 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다 :
1254 - 90 :
(서열번호 : 36)
1254 - 95 :
(서열번호 : 37)
결과적으로 생성된 PCR 산물은 전장의 인체 OPG 단백질을 코드화하며 Fc 융합 벡터 FcA3 의 프레임내 Not I 부위와 양립할 수 있는 Not I 제한부위를 생성시킨다. 이 PCR 산물을 상기한 바와 같은 플라스미드 벡터 pCEP4 내로 방향에 따라 클로닝시켰다. 이 결과 생성된 발현 벡터는 인체 OPG 잔기 1-401 을 코드화하고 바로 이어서 인체 lgG1 Fc 부분의 227 개 아미노산 잔기를 코드화한다. 형질감염시키고 약물 선택한 세포로부터 조정배지를 생성하였고 제조자가 권고한 방법을 이용하여 단백질 - A 칼럼 크로마토그래피(피어스)로써 huOPG Fl. Fc 융합 산물을 정제하였다.
인체 lgG1 [ huOPG Ct(201), FC] 의 Fc 부분에 융합된 아미노산 잔기 1-201 을 코드화하는 인체 OPG DNA 를 다음과 같이 구성하였다. 플라스미드 pRcCMV - hu 오스테오프로테게린으로부터의 클로닝된 인체 OPG cDNA 를 다음 올리고누클레오티드 프라이머쌍을 사용하여 PCR 로써 증폭시켰다 :
1254 - 90 :
(서열번호 : 38)
1254 - 92 :
(서열번호 : 39)
이 프라이머쌍은 OPG 리딩 프레임의 아미노산 잔기 1-201 을 코드화하는 인체 OPG cDNA 부분을 증폭시키고 Fc 융합벡터 FcA3 의 프레임내 NotI 부위와 양립할 수 있는 3' 말단 Not I 제한부위를 생성한다. 이 산물을 Fc 단백질에 결합 시키면 OPG 잔기 1-201 을 코드화하고 바로 이어서 인체 lgG1 Fc 부분의 221 개 아미노산 잔기 모두를 코드화한다. 상기한 바와 같은 플라스미드 벡터 pCEP4 내로 이 PCR 산물을 방향에 따라 클로닝시켰다. 형질감염시키고, 약물 선택한 세포로부터 조정배지를 생성하였고, 제조자가 권고한 방법을 이용하여 단백질 - A 칼럼 크로마토그래피 (피어스)로써 hu OPG Ct(201). Fc 융합 단백질을 정제하였다.
비융합된 마우스 및 인체 OPG 를 구성하고 발현시키는데 다음 방법을 이용하였다.
pRcCMV Mu - 오스테오프로테게린으로부터의 마우스 OPG cDNA 삽입물을 PCR 증폭시킴으로써 전장의 마우스 OPG(잔기 1-401)의 포유동물 발현용 플라스미드를 생성하여 발현 벡터 pDSR α[DeClerck 등의 J. Biol. Chem. 266, 3893 (1991) 참조] 내로 서브클로닝하였다.
다음 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하였다 :
1295 - 26 :
(서열번호 : 40)
1295 - 27 :
Figure pct00035
(서열번호 : 41)
상기와 같이 PCR 하여 마우스 OPG 전장의 리딩 프레임을 증폭 시켰다. 이 PCR 산물을 정제하여 제조자가 권고한 조건하에서 제한 엔도누클레아제 Hind III 및 XbaI(미국 인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 뵈링거 만하임)로 절단시킨 다음, Hind III 및 XbaI으로 절단된 pDSRα 에 결합시켰다. 제한 엔도누클레아제 절단하여 재조합 클론을 검출한 후 서열결정하여 PCR 증폭 단계 동안에 어떠한 돌연변이도 생성되지 않았음을 확인하였다. 결과적으로 생성된 플라스미드, pDSRα-muOPG 를 칼슘 매개 형질감염[Wigler 등의 Cell 11, 233 (1977) 참조]에 의해 중국 햄스터 난소(CHO)세포내로 도입시켰다. 이 플라스미드 벡터내의 디히드로엽산 환원효소(DHFR) 유전자의 발현을 기초로 하여 개별 콜로니를 선택하고 몇몇 클론을 분리하였다. CHO 세포 조정배지를 웨스턴 블롯하여 마우스 OPG 재조합 단백질의 발현을 모니터링하였다. 고발현 세포를 선택하고, 문헌(DeClerck 등의 동일문헌 참조)에 기술된 바와 같이 메토트렉 세이트로 처리하여 OPG 발현을 더 증폭시켰다. 재조합 분비성 마우스 OPG 단백질을 더 정제하기 위해 CHO 세포주로부터 조정배지를 생산하였다.
pRcCMV-hu 오스테오프로테게린 내의 cDNA 삽입물을 직접 벡터 pDSR α (DeClerck 등의 동일문헌 참조) 내로 서브클로닝하여 전장의 인체 OPG(아미노산 1-401)의 포유동물 발현용 플라스미드를 생성하였다. 이 pRcCMV-OPG 플라스미드를 NotI 으로 완전히 절단하고, 클레노우로 말단을 블런트화 한 다음 XbaI 으로 완전히 절단하였다. 벡터 DNA 를 Hind III 로 절단하고 클레노우로 말단을 블런트화 한 다음 XbaI 으로 절단하여 OPG 삽입물에 결합시켰다. 그런 다음 재조합 플라스미드를 서열결정하여 인체 OPG cDNA 의 고유 배향(orientation)을 확인하였다.
상기한 바와 같이 결과적으로 생성된 플라스미드 pDSRα-hu OPG 를 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포내로 도입시켰다. 플라스미드 벡터내 디히드로엽산 환원효소(DHFR) 유전자의 발현을 기초로 하여 개별 콜로니를 선택하고 몇몇 클론을 분리하였다. CHO 세포 조정배지를 웨스턴 블롯하여 인체 OPG 재조합 단백질의 발현을 모니터링하였다. 고발현 클론을 선택하고, 메토트렉세이트로 처리하여 OPG 발현을 더 증폭시켰다. 인체 OPG 를 발현하는 CHO 세포주로부터 조정배지를 단백질 정제용으로 생산하였다.
잔기 1-185 를 코드화하는 마우스 OPG 에 대한 발현벡터를 다음과 같이 구성하였다. pRcCMV-Mu OPG 로부터의 마우스 OPG를 다음 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시켰다 :
1333 - 82 :
1356 - 12 :
(서열번호 : 43)
이 프라이머쌍은 OPG 리딩 프레임의 아미노산 63 - 185 (bp 278 - 645)를 코드화하는 마우스 OPG cDNA 부분을 증폭시키며 인위 SalI 제한 엔도누클레아제 부위가 뒤따르는 시스테인 코돈 (C185) 바로 뒤에 인위 정지코돈을 포함한다. 예상 산물은 선재 벡터내로 서브클로닝시키는데 유용한 내부 Eco RI 제한부위를 포함한다. PCR 증폭후 결과적으로 생성된 산물을 EcoRI 및 SalI 제한 엔도누클레아제로 절단하여 큰 단편을 겔 정제하였다. 그런 다음 정제 산물을, 상기한 EcoRI 및 Sal I 으로 절단된 pBluescript - muOPG Fl. Fc 의 큰 제한 단편내로 서브클로닝하였다. 결과적으로 생성된 플라스미드를 Hind III 및 Xho I 으로 절단하여 작은 단편을 겔 정제하였다. 잔기 1-185 를 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 이 단편을 Hind III 및 Xho I 으로 절단된 발현 벡터 pCEP4 내로 서브클로닝하였다. 결과적으로 생성된 플라스미드를 Hind III 및 XhoI 으로 절단하여 작은 단편을 겔 정제하였다. 잔기 1-185 를 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 이 단편을 Hind III 및 XhoI 으로 절단된 발현 벡터 pCEP4 내로 서브클로닝하였다. 결과적으로 생성된 벡터, pmuOPG[1-185]는 위치 185 에 위치한 시스테인 잔기에서 말단화된 절두 OPG 폴리펩티드를 코드화한다. 형질감염 시키고 약물 선택한 세포로부터 조정배지를 상기와 같이 생산하였다.
1333 - 82 :
1356 - 13 :
(서열번호 : 45)
이 프라이머쌍은 OPG 리딩 프레임의 아미노산 70 - 194 (bp 298 - 672)를 코드화하는 마우스 OPG cDNA 부위를 증폭시키며 인위 Sal I 제한 엔도누클레아제 부위가 뒤 따르는 리신 코돈 (k194) 바로 뒤에 인위 정지코돈을 포함한다. 예상 산물은 선재 벡터 내로 서브 클로닝시키는데 유용한 내부 EcoRI 제한부위를 포함한다. PCR 증폭후 결과적으로 생성된 산물을 EcoRI 및 SalI 제한 엔도누클레아제로 절단하여 큰 단편을 겔 정제하였다. 그런 다음 정제된 산물을, 상기한 EcoRI 및 Sal I 으로 절단된 pBluescript-muOPG Fl. Fc 의 큰 제한단편내로 서브클로닝하였다. 결과적으로 생성된 플라스미드를 Hind III 및 XhoI 으로 절단하여 작은 단편을 겔 정제하였다. 잔기 1-185 를 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 이 단편을 Hind III 및 XhoI 로 절단된 발현 벡터 pCEP4 내로 서브클로닝하였다. 결과적으로 생성된 벡터, pmuOPG [1-185]는 위치 194 의 리신에서 말단화된 절두 OPG 폴리펩티드를 코드화한다. 형질감염시키고, 약물 선택한 세포로부터 조정배지를 상기와 같이 생산하였다.
잔기 22 와 32 사이에 OPG 의 아미노산 치환이나 삭제중 하나를 도입시킨 huOPG[22-401]-Fc 유전자의 5' 말단에서 몇몇 돌연변이를 생성하였다. 제조자가 권고하는 조건을 이용하여 "QuickChangeTM부위 - 특이 돌연변이유발 키트"로 모든 돌연변이를 생성하였다. 간단히, huOPG [22-401]-Fc 플라스미드 DNA 주형과 돌연변이유발 프라이머를 함유하는 반응 혼합물을 디옥시누클레오티드의 존재하에서 Pfu 중합효소로 처리한 다음, 상기한 바와 같이 열순환기로 증폭시켰다. 열 쇼크(heatshock)에 의해 감응 E. Coli XL1-Blue 내로 반응물의 분취량을 형질감염시킨 후 평판화 하였다. 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA 를 서열결정하여 돌연변이를 확인하였다.
다음 프라이머쌍은, 인체 OPG 유전자의 잔기 22 - 26 을 삭제하여, 그 결과 huOPG [27 - 401] - Fc 융합 단백질을 생산하는데 사용하였다 :
1436 - 11 :
1436 - 12 :
다음 프라이머쌍은, 인체 OPG 유전자의 잔기 22 - 28 을 삭제하여, 그 결과 huOPG[29-401] - Fc 융합 단백질을 생산하는데 사용하였다 :
1436 - 17 :
1436 - 18 :
다음 프라이머쌍은, 인체 OPG 유전자의 잔기 22 - 31 을 삭제하여, 그 결과 huOPG[32- 401]-Fc 융합 단백질을 생산하는데 사용하였다 :
1436 - 27 :
1436 - 28 :
다음 프라이머쌍은, 티로신에 대한 코돈 잔기 28 을 인체 OPG 유전자의 페닐알라닌으로 변화시켜, 그 결과 huOPG[22- 401]-Fc Y28F 융합 단백질을 생산하는데 사용하였다 :
1436 - 29 :
1436 - 30 :
다음 프라이머쌍은, 프롤린 잔기 26 에 대한 코돈을 인체 OPG 유전자의 알라닌으로 변화시켜, 그 결과 huOPG[22- 401]-Fc P26A 융합 단백질을 생산하는데 사용하였다 :
1429 - 83 :
1429 - 84 :
고유 돌연변이를 포함하는 결과적으로 생성된 각 muOPG[22-401] -Fc 플라스미드를 인체 293 세포내로 형질감염시킨 다음, 상기와 같이 조정배지로부터 돌연변이 OPG- Fc 융합 단백질을 정제하였다. 실시예 11 에 기술한 시험관내 파골세포 형성 검정으로 각 단백질의 생물학적 활성도를 평가하였다.
실시예 8
E. coli 내 OPG 발현
A. 박테리아 발현 벡터
pAMG21
미국 특허 제 4,710,473 호에 기술되어 있는 암젠 발현 벡터계로부터 차례로 유도한 암젠 발현 벡터 pCFM1656 (입수처 : ATCC 제 69576 호)로부터 발현 벡터 플라스미드 pAMG21 을 유도할 수 있다. pCFM 1656 플라스미드는 다음에 의해 pCFM836 플라스미드(특허 번호 제 4,710,473 호)로부터 유도할 수 있다 : (a) T4 중합효소로 말단을 채워 2 개의 내인성 NdeI 제한부위를 파괴시킨 다음 블런트 말단 결합시키고 ; (b) 합성 PL 프로모터를 함유하고 있는 유일한 AatII 와 ClaI 제한부위 사이의 DNA 서열을 그 PL 프로모터를 함유하고 있는 pCFM636(특허 번호 제 4,710,473 호)로부터 수득한 유사 단편으로 대체시킨 다음
(c) 유일한 ClaI 과 KpnI 제한부위 사이의 작은 DNA 서열을 다음 올리고누클레오티드로 치환시킨다 :
발현 벡터 pAMG 21 은, PCR 중복 올리고 돌연변이유발 및 DNA 서열 치환으로 일련의 부위 특이 염기 변환시켜 pCFM1656 으로부터 유도할 수 있다. 플라스미드 복제 프로모터 PcopB의 5' 에 바로 인접한 BalII 부위(플라스미드 bp # 180)에서 시작하여 플라스미드 복제 유전자 쪽으로 진행시키며, 염기쌍 변화는 다음과 같다.
유일한 AatII(pCFM1656 위치 # 4364)와 SacII (pCFM1656 위치 # 4585) 제한부위 사이의 DNA 서열을 다음 DNA 서열로 치환시킨다 :
이 치환 DNA 서열의 점착 말단을 결합시키는 동안에 외부 AatII 및 SacII 부위는 파괴되다. 치환된 DNA 에는 유일한 AatII 및 SacII 부위가 존재한다.
pAMG22 - His
발현 플라스미드 pAMG22-His 는, pAMG22 의 유일한 NdeI(#4795)와 EcoRI(#4818) 제한 부위 사이의 작은 DNA 서열을 다음 올리고누클레오티드 이중체로 치환하여 암젠 발현 벡터 pAMG22 로부터 유도할 수 있다 :
pAMG22
발현 플라스미드 pAMG 22는, 1987년 12월 1일자로 특허 허여된 미국 특허 제 4,710,473 호에 기술되어 있는 암젠 발현 벡터계로부터 차례로 유도한 암젠 발현 벡터 pCFM1656 (ATCC 제 69576 호)로부터 유도할 수 있다. pCFM1656 플라스미드는 다음에 의해 pCFM836 플라스미드(특허 번호 제 4,710,473 호)로부터 유도할 수 있다 :
(a) T4 중합효소로 말단을 채워 2 개의 내인성 NdeI 제한부위를 파괴시킨 다음 블런트 말단 결합시키고 ; (b) 합성 PL 프로모터를 함유하고 있는 유일한 AatII와 ClaI 제한부위 사이의 DNA 서열을 그 PL 프로모터를 함유하고 있는 pCFM636(특허 번호 제 4,710,473 호)로부터 수득한 유사 단편으로 대체시킨 다음
(c) 유일한 ClaI 과 KpnI 제한부위 사이의 작은 DNA 서열을 다음 올리고누클레오티드로 치환시킨다 :
Figure pct00058
(서열번호 : 55)
Figure pct00059
(서열번호 : 56)
그런다음 발현 플라스미드 pAMG 22 는 PCR 중복 올리고 돌연변이유발 및 DNA 서열 치환으로 일련의 부위 특이 염기 변화시켜 pCFM 1656 으로부터 유도할 수 있다. 플라스미드 제한 프로모터 PcopB 의 5' 에 바로 인접한 BglII 부위에서 시작하여 플라스미드 복제 유전자 쪽으로 진행시키며, 염기쌍 변화는 다음과 같다 :
유일한 AatII(pCFM1656 위치 # 4364)와 SacII(pCFM 1656 위치 # 4585) 제한부위 사이의 DNA 서열을 다음 DNA 서열로 치환시킨다 :
Figure pct00062
이 치환 DNA 서열의 점착 말단을 결합시키는 동안에 외부 AatII 와 SacII 부위는 파괴된다. 치환된 DNA 에는 유일한 AatII 와 SacII 부위가 존재한다.
B. 인체 OPG Met[32 - 401]
이 실시예에 사용된 발현 벡터는, lux PR 프로모터의 하류에 유전자를 삽입시키기 위해 고유 제한부위를 함유시킨 pCFM1656 (lux 발현계에 관하여 기술되어 있는 미국 특허 제 5,169,318 호 참조)의 유도체인 pAMG21 이었다. 사용된 숙주세포는 GM120 (입수처 : ATCC 제 55764 호)이다. 이 숙주는 친주성 E. coli K12 숙주의 염색체의 제 2 부위내에 삽입시킨 lacIQ 프로모터와 lacI 유전자를 갖는다. 보통 사용되는 다른 E. coli 발현 벡터 및 숙주 세포도 본 발현에 적합하다.
인체 OPG 폴리펩티드의 아미노산 32-401 과 N - 말단 메티오닌을 코드화하는 DNA 서열을 다음과 같이 플라스미드 발현 벡터 pAMG21의 luxPR 프로모터의 조절하에 위치시켰다. 이를 완성하기 위해, 프라이머로서 올리고누클레오티드 # 1257 - 20 및 # 1257 - 19 를 사용하는 PCR 을, 주형으로서 인체 OPG cDNA 를 함유하는 플라스미드 pRcCMV-Hu OPG DNA 를 사용하고 각 순환, 즉 94 ℃ 에서 20 초간, 그 다음 37 ℃ 에서 30 초간, 그 다음 72 ℃ 에서 30 초간으로 30 순환동안 열순환시켜 수행하였다. 결과적으로 생성된 PCR 시료를 아가로스 겔에 용해하여 PCR 산물을 정제한 후 KpnI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 제한시키고 정제하였다. 합성 올리고누클레오티드 #1257-21 및 #1257-22 를 T4 폴리누클레오티드 키나아제와 ATP 를 사용하여 개별적으로 인산화반응시킨 다음 서로 혼합시켜 94 ℃에서 가열하고, NdeI 및 KpnI 점착 말단을 함유하는 올리고누클레오티드 링커 이중체를 형성시키기 위해 실온에서 서서히 냉각시켰다. NdeI 및 KpnI 점착 말단을 함유하는 올리고누클레오티드 # 1257 - 21과 #1257-22 사이에 형성된 인산화된 링커 이중체(도 14A 참조)와, 올리고 프라이머 #1257-20 과 #1257-19 를 사용하여 형성시킨 KpnI 과 BamHI 절단 및 정제된 PCR 산물 (상기 참조)을 플라스미드 벡터 pAMG21 의 두 부위, 즉 NdeI 및 BamHI 부위 사이에 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여 방향에 따라 삽입하였다(도 14A 및 하기 서열 참조). 합성 링커는 E. coli 코돈을 이용하였으며 N - 말단 메티오닌을 제공하였다.
2 개의 클론을 선택하여 플라스미드 DNA 를 분리하고, 이어서 인체 OPG 삽입물의 DNA 서열을 확인하였다. 메티오닌이 프레임에 바로 선행하는 인체 OPG 폴리펩티드의 아미노산 32-401 을 함유하는 결과적으로 생성된 pAMG21 플라스미드를 pAMG21-huOPG met[32-401] 또는 pAMG21-huOPG met[32-401]이라고 부른다.
올리고 # 1257-19
올리고 # 1257-20
Figure pct00064
올리고 # 1257-21
Figure pct00065
(서열번호 : 61)
올리고 # 1257-22
Figure pct00066
유도하기 전 30 ℃ 에서 20 ㎍/ml 카나마이신을 포함하는 2 XYT 배지내에서 pAMG21-huOPG met[32-401]-함유 E.coli GM120 배양주를 배양하였다. 배양배지에 합성 자기유도물질 N - (3 - 옥소헥사노일)- DL-호모세린 락톤을 가하고 30 ℃ 나 37 ℃ 에서 6 시간 더 배양하여 luxPR 프로모터로부터 huOPG met[32-401] 유전자 산물의 발현을 유도하였다. 6 시간후에, 봉입체가 존재하는지 이 박테리아 배양주를 현미경으로 조사한 다음 원심분리하여 펠릿화하였다. E. coli 에서 불용성으로 생산된 재조합 huOPG met[32-401] 유전자 산물의 일부를 나타내는 유도된 배양주에서 굴절성 봉입체를 관찰하였다. 일부 박테리아 펠릿을 10 mM 트리스- HCl/pH 8 1 mM EDTA 에 재현탁하고, 1 × 최종 농도가 되도록 2 × 래믈리 시료 완충액을 가하고, 5 % 최종 농도가 되도록 β -머캡토에탄올을 가함으로써 직접 용균시켜 SDS-PAGE 로 분석하였다. 30 ℃ 비유도 배양주의 총 세포 용균액인 레인 2 와 대비하여 30 ℃ 및 37 ℃ 유도 배양주의 총 세포 용균액을 함유하는 SDS-PAGE 겔 상에서 실질적으로 더 짙은 약 42 kDa의 쿠마시 염색 밴드가 관찰되었다(도 14B). 예상한 유전자 산물은 370 개 아미노산 길이일 것이고 약 42.2 kDa 의 예상 분자량을 가질 것이다. 37 ℃ 에서 6 시간 동안 유도한 다음, 부가 배양주를 펠릿화하고 봉입체를 분리시키기 위해 처리하거나(하기 참조) 미세유동화(microfluidizing)하여 처리하였다. 미세유동화하여 처리한 펠릿을 25 mM 트리스 - HCl/pH 8, 0.5 M NaCl 완충액에 재현탁하고 마이크로플루이다이저(Microfluidizer) 모델 1108 (마이크로플루이딕스 코포레이션)을 통해 20 회 통과시켜 수집하였다. 수집된 시료(미세유동화된 총 용균액)의 분취량을 제거하고, 잔류물을 20,000 x g 에서 20 분간 펠릿화하였다. 원심분리에 따른 상청액을 제거하고 (미세유동화된 가용성 분획) 그 펠릿을 25 mM 트리스- HCl/pH 8, 0.5 M NaCl, 6 M 요소 용액에 현탁하였다(미세유동화된 불용성 분획). 총 가용성 또는 불용성 분획의 분취량에 동부피의 2 × 래말리 시료 완충액과 β-머캡토에탄올을 가하여 5 % 최종 농도가 되게 하였다. 그런다음 SDS-PAGE 로써 시료를 분석하였다. 상당량의 재조합 huOPG met[32-401] 유전자 산물이 불용성 분획에서 발견되는 것으로 여겨진다. 재조합 단백질 봉합체를 정제하기 위해 다음과 같이 정제하였다 : 4 ℃ 에서 15 분간 4,900 x g 의 JS-4.2 로터를 갖춘 베크만(Beckman) J-6B 원심분리기로 밀도 구배 원심분리하여 배지로부터 박테리아 세포를 분리하였다. 이 박테리아 펠릿을 5 ml 의 물에 재현탁한 다음 물과 함께 10 ml 의 최종부피로 희석하였다. 이 현탁액을 얼음으로 차게 한 스테인레스 스틸 컵으로 옮기고 표준 팁을 갖춘 브랜손 소니파이어(Branson Sonifier)(동력고정 = 5, 사용률 = 95 %, 80 분기)를 사용하여 음파파괴시켰다. 195,000 x g 의 TLA 100.3 로터를 갖춘 베크만 옵티마 TLX 초원심분리기로 음파처리된 세포 현탁액을 23 ℃ 에서 5-10 분간 원심분리하였다. 상청액은 따라내고 펠릿을 분사병(squirt bottle)에서 유출되는 물로 세척하였다. 펠릿을 극소 주걱으로 긁어 모아 유리 균질기(15 ml 용량)에 옮겼다. 5 ml 의 퍼콜(Percoll) 용액(75 % 액체 퍼콜, 0.15 M 염화나트륨)을 균질기에 가하여 그 내용물이 균일하게 현탁될 때까지 균질화시켰다. 퍼콜 용액을 가하여 그 부피를 19.5 ml로 증가시켜 혼합하여 3 개의 베크만 퀵 - 시일(Beckman Quick - Seal) 시험관(13 × 32 mm)내에 분포시켰다. 제조자의 지시에 따라 시험관들을 밀봉하였다. 23 ℃, 20,000 rpm(21,600 x g)에서 30 분간 베크만 TLA 100.3 로터로 시험관을 회전시켰다. 이 시험관을 고유 밴드 유형에 대해 조사하였다. 굴절성 부분을 회수하기 위해 구배 분획을 회수하여 풀(pool)로 만든다음 물로 희석하였다. 원심분리하여 세포 봉입체를 펠릿화하고, 단백질 농도를 SDS-PAGE 에 따라 추정하였다.
하기한 바와 같이 분리한 세포 봉입체의 분취량을 5 % β-머캡토에탄올과 함께 1 x 라에믈리 시료 완충액내에 용해시켜 SDS-PAGE 겔상에서 분해시키면, 이 분리된 세포 봉입체가 고정제된 재조합 huOPG[32-401]유전자 산물을 제공한다. SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 세포 봉입체를 분해시킨 후에 관찰된 주요 ∼ 42 kDa 밴드를 분리 겔로부터 절단하고 N - 말단 아미노산 서열을 문헌[Matsudaira 등의 J. Biol. Chem. 262, 10-35(1987) 참조]에 기술된 바와 같이 본질적으로 결정하였다. 다음 서열은 19 순환 후 결정되었다 :
이 서열이 박테리아 발현 벡터에 의해 제공되는 메티오닌 잔기에 의해 생성된, pAMG21 Hu-OPG met[32-401] 발현 벡터에 의해 코드화되는 첫 번째 19 개 아미노산과 동일한 것임을 알았다.
C. 인체 OPG met[22-401]
N-말단 메티오닌과 인체 OPG 의 아미노산 22 내지 401 을 코드화하는 DNA 서열을 다음과 같이 원핵 플라스미드 발현 벡터 pAMG21의 luxPR 프로모터의 조절하에 위치시켰다. pAMG21-huOPG met[32-401]의 분리된 플라스미드 DNA[B 부문 참조]를 kpnI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 절단하여 그 결과 생성된 단편을 아가로스 겔 상에 분해시켰다. 표준 방법론을 이용하여 그 겔로부터 B 단편 (∼1064 bp 단편)을 분리하였다. 합성 올리고누클레오티드(올리고) #1267-06 및 # 1267-07 을 개별적으로 인산화반응시켜, NdeI 및 KpnI 점착 말단을 함유하는 올리고 링커 이중체를 B 부문에 기술된 방법을 사용하여 형성시켰다. 합성 링커 이중체는 E. coli 코돈을 이용하였으며 N - 말단 메티오닌을 제공한다. NdeI 와 KpnI 점착 말단을 함유하는 인산화된 올리고 링커 및 kpnI 과 BamHI 제한 엔노누클레아제로 절단된 pAMG21-huOP met[32-401]의 분리된 ∼1064 bp 단편을 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여 pAMG21 의 NdeI 와 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 결합 혼합물을 제조자의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이션으로 E. Coli 숙주 393 내로 형질전환 시켰다. 클론을 선택하여 플라스미드 DNA 를 분리하고, huOPG-met[22-401] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
올리고 # 1267 - 06
올리고 # 1267 - 07
Figure pct00069
E. coli 숙주 393 내 pAMG21-huOPG-met[22-401]의 배양주를 20 ㎍/ml 카나마이신을 함유하는 2 XYT 배지에 두어 유도하기 전 30 ℃ 에서 배양하였다. 배지에 합성 자가유도물질 N-(3-옥소헥사노일)-DL-호모세린 락톤을 가하여 최종 농도가 30 ng/ml 가 되게 하고 30 ℃ 나 아니면 37 ℃ 에서 6 시간 동안 더 배양함으로써 벡터 pAMG21 의 luxPR 프로모터로부터 재조합 유전자 산물의 발현을 유도하였다. 6 시간 후에 원심분리하여 (= 30 ℃ l+6 또는 37 ℃ l+6)박테리아 배양주를 펠릿화하였다. 또한 박테리아 배양주를 유도시키기 바로 전에 펄릿화하거나(= 30 ℃ Prel) 택일적으로 분리 배양주에 어떠한 자가유도물질도 가하지 않고 30 ℃ 에서 6 시간 더 배양하여 비유도(Ul)배양주(= 30 ℃ Ul)를 제공하도록 하였다. 30 ℃ Prel, 30 ℃ Ul, 30 ℃ l+6, 또는 37 ℃ l + 6 의 박테리아 펠릿을 재현탁하고, 용균시켜 B 부문에 기술되어 있는 바와 같이 SDS - 폴리아크릴아미드 겔 전기이동(PAGE)으로 분석하였다. 쿠마시 블루 및/또는 웨스턴으로 염색한 폴리아크릴아미드 겔을 니트로셀룰로스로 옮겨 실시예 10 에 기술되어 있는 바와 같이 토끼 항 - muOPG-Fc 다클론성 항체로 면역 프로빙하였다. 유도에 따른 유전자 산물의 수준은 비유도( 30 ℃ Ul)나 예비유도(30 ℃ Prel)시료와 비교하였다.
D. 마우스 OPG met[22-401]
N-말단 메티오닌과 마우스(mu) OPG(OPG)폴리펩티드의 아미노산 22 내지 401 을 코드화하는 DNA 서열을 다음과 같이 원핵 플라스미드 발현 벡터 pAMG21 내의 luxPR 프로모터의 조절하에 위치시켰다. 프라이머로서 올리고누클레오티드 # 1257-16 및 #1257-15, 주형으로서 플라스미드 pRcCMV-Mu OPG DNA 를 사용하고 B 부문에 기술된 바와 같은 열순화 조건을 사용하여 PCR 을 수행하였다. PCR 산물을 정제하여 B 부문에 기술되어 있는 kpnI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 절단하였다. 합성 올리고 # 1260-61 및 #1260-82 를 개별적으로 인산화반응시키고 B 부문에 기술되어 있는 방법을 이용하여 NdeI 및 KpnI 점착 말단을 갖는 올리고 링커 이중체를 형성하였다. 이 합성 링커 이중체는 E. coli 코돈을 사용하였으며 N - 말단 메티오닌을 제공하였다. NdeI 과 KpnI 점착 말단을 함유하는 올리고 # 1260-61 과 # 1260-82 사이에 형성된 인산화된 링커 이중체 및 올리고 프라이머 # 1257-16 과 #1257-15 를 사용하여 생성시킨, KpnI 및 BamHI 으로 절단되고 정제된 PCR 산물을 표준 방법론을 이용하여 pAMG21 의 NdeI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 제조자의 프로토콜을 이용하여 일렉트로포레이션하여 결합 혼합물을 E. coli 숙주 393 내로 형질전환 시켰다. 클론을 선택하여 플라스미드 DNA 를 분리하고, MuOPG met[22-401] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
C 부문에 기술된 방법을 이용하여, 유도에 따른 플라스미드 pAMG21-MuOPG met[22-401]를 함유하는 393 세포 배양주로부터 재조합 muOPG met[22-401] 폴리펩티드의 발현을 측정하였다.
올리고 #1257-15
(서열번호 : 65)
올리고 #1257-16
Figure pct00071
올리고 #1260-61
Figure pct00072
올리고 #1260-82
E. 마우스 OPG met[32-401]
N-말단 메티오닌과 마우스 OPG 의 아미노산 32 내지 401 을 코드화하는 DNA 서열을 다음과 같이 원핵 플라스미드 발현 벡터 pAMG21 내 luxPR 프로모터의 조절하에 위치시켰다. 이를 완성시키기 위해, 합성 올리고 # 1267-08 및 # 1267-09 를 개별적으로 인산화 반응시키고 B 부문에 기술된 방법을 이용하여 올리고 링커 이중체를 형성하도록 하였다. 합성 링커 이중체는 E. coli 코돈을 사용하였으며 N-말단 메티오닌을 제공하였다. NdeI 및 KpnI 점착 말단을 포함하는 올리고 # 1267-08 과 # 1267-09 사이에 형성된 인산화된 링커 이중체, 및 KpnI 및 BamHI 으로 절단하여 정제한 앞서 기술한 (D 부문 참조) PCR 산물을 표준 방법론을 이용하여 pAMG21 의 NdeI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 제조자의 프로토콜을 이용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 결합 혼합물을 형질전환시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리하고, muOPG-met[32-401] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
유도에 따른 pAMG21 재조합 플라스미드를 함유하는 393 세포 배양주로부터 재조합 muOPG-met[32-401] 폴리펩티드의 발현을 C 부문에 기술되어 있는 방법을 이용하여 결정하였다.
올리고 #1267-08
TAC-3 (서열번호 : 69)
올리고 #1267-09
Figure pct00075
CCA-3'(서열번호 : 70)
F. 마우스 OPG met-lys[22-401]
리신 잔기가 뒤따르는 N- 말단 메티오닌과 마우스 OPG 의 아미노산 22-401 을 코드화하는 DNA 서열을 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 내 lux PR 프로모터의 조절하에 위치시켰다. 합성 올리고 # 1282-95 와 #1282-96 을 개별적으로 인산화반응시켜 B 부문에 기술된 방법을 이용하여 올리고 링커 이중체를 형성하도록 하였다. 합성 링커 이중체는 E. coli 코돈을 사용했으며 N - 말단 메티오닌을 제공하였다. NdeI 및 KpnI 점착 말단을 포함하는 올리고 #1282-95 와 #1282-96 사이에 형성된 인산화된 링커 이중체 및 KpnI 및 BamHI 으로 절단되어 정제된 D 부문에 기술한 PCR 산물을 표준 방법론을 이용하여 pAMG21 내의 NdeI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 제조자의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이션하여 결합 혼합물을 E. coli 숙주 393 내로 형질전환시켰다. 클론을 선택하여 플라스미드 DNA 를 분리하고, MuOPG-Met-Lys[22-401] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
유도에 따른 재조합 pAMG21 플라스미드를 포함하는 형질전환된 393 세포로부터 재조합 MuOPG Met-Lys[22-401] 폴리펩티드의 발현을 C부문에 기술되어 있는 방법을 이용하여 측정하였다.
올리고 #1282-95
올리고 #1282-96
G. 마우스 OPG met-lys-(his) 7 [22-401]
마우스 OPG 의 아미노산 22 내지 401 이 뒤 따르는 N - 말단 잔기 Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His(=MKH)를 코드화하는 DNA 서열을 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 내 lux PR 프로모터의 조절하에 위치시켰다. 프라이머로서 올리고누클레오티드 #1300-50 및 #1257-15 와 주형으로서 플라스미드 pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA 를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 열순한 조건은 B 부문에 기술된 바와 같았다. 결과적으로 생성된 PCR 시료를 아가로스 겔 상에 분해시킨 다음 이 PCR 산물을 절제하여 정제하고, NdeI 및 BamHI 제한 엔도누 클레아제로 절단하여 정제하였다. 올리고 프라이머 #1300-50 및 #1257-15 를 사용하여 생성시킨, NdeI 및 BamHI 으로 절단하여 정제한 PCR 산물을 표준 DNA 방법론을 이용하여 pAMG21 의 NdeI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 제조자의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 결합 혼합물을 형질전환시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA를 분리하고, muOPG-MKH[22-401] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
유도 후에 재조합 pAMG21 플라스미드를 포함하는 형질전환된 393 배양주로부터 재조합 MuOPG-MKH[22-401] 폴리펩티드의 발현을 C 부문에 기술되어 있는 방법을 사용하여 결정하였다.
올리고 #1300-50
올리고 #1257-15
(D 부문 참조)
H. 마우스 OPG met-lys[22-401](his) 7
N-말단 met-lys, 아미노산 22-401 마우스 OPG 및 아미노산 401 다음에 오는 7 개의 히스티딘 잔기(=muOPG MK[22 - 401]-H7)를 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 내 lux PR 프로모터의 조절하에 위치시켰다. 프라이머로서 올리고누클레오티드 #1300-49 및 #1300-51과 주형으로서 pAMG21-muOPG met[22-401] DNA 를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 열순환 조건은 B 부문에 기술되어 있는 바와 같았다. 결과적으로 생성된 PCR 시료를 아가로스 겔 상에서 분해시키고, 이 PCR 산물을 절제하여, 정제한 다음 NdeI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 제한하고, 정제하였다. NdeI 및 BamHI 으로 절단하여 정제한 이 PCR 산물을 표준 방법론을 사용하여 pAMG21 내 NdeI 및 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 제조자의 프로토콜을 이용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 이 결합물을 형질전환시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음, muOPG MK[22-401]-H7 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
유도 후에 재조합 pAMG21 플라스미드를 포함하는 형질전환된 393 세포로부터 재조합 muOPG MK-[22-401]-H7 폴리펩티드의 발현을 C 부문에 기술되어 있는 방법을 이용하여 측정하였다.
올리고 #1300-49
(서열번호 : 74)
올리고 #1300-51
I. 마우스 OPG met[27-401]
N- 말단 메티오닌과 마우스 OPG 의 아미노산 27 내지 401을 코드화하는 DNA 서열을, 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 의 luxPR 프로모터 조절하에 위치시켰다. 프라이머로서 올리고누클레오티드 #1309-74 및 #1257-15 를 사용하고 주형으로서 플라스미드 pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 열순환 조건은 B 부문에 기술되어 있는 바와 같았다. 결과적으로 생성된 PCR 시료를 아가로스 겔 상에서 분해시켜, 이 PCR 산물을 절제하고 정제한 다음, NdeI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 절단하여 정제하였다. NdeI 및 BamHI 으로 절단하여 정제한 이 PCR 산물을, 표준 방법론을 사용하여 pAMG21 의 NdeI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 이 결과 혼합물을 제조자의 프로토콜을 이용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 형질전환 시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음, muOPG-met[27-401] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
유도 후에, 재조합 pAMG21 플라스미드를 포함하는 형질감염된 393 배양주로부터 재조합 muOPG-met[27-401] 폴리펩티드가 발현 되었는지를 C 부문에 기술되어 있는 방법을 이용하여 측정하였다.
올리고 #1309-74
GTC AT-3'(서열번호 : 76)
올리고 #1257-15
(D 부문 참조)
J. 인체 OPG met[27-401]
N- 말단 메티오닌과 인체 OPG 의 아미노산 27 내지 401 을 코드화하는 DNA 서열을, 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 의 luxPR 프로모터 조절하에 위치시켰다. 프라이머로서 올리고누클레오티드 #1309-75 및 #1309-76 을 사용하고 주형으로서 플라스미드 pAMG21-huOPG-met[22-401] DNA 를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 열순환 조건은 B 부문에 기술되어 있는 바와 같았다. 결과적으로 생성된 PCR 시료를 아가로스 겔 상에서 분해시켜, 이 PCR 산물을 절제하고 정제한 다음, AseI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 절단하여 정제하였다. AseI 및 BanHI 으로 절단하여 정제한 상기 PCR 산물을, 표준 방법론을 사용하여 pAMG21 의 NdeI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 이 결과 혼합물을 제조자의 프로토콜을 이용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 형질전환 시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음, huOPG-met[27-401] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열 결정하였다.
유도 후에, 재조합 pAMG21 플라스미드를 포함하는 형질감염된 393 세포로부터 재조합 huOPG-met[27-401] 폴리펩티드가 발현되었는지를 C 부문에 기술되어 있는 방법을 이용하여 측정하였다.
올리고 #1309-75
T-3'(서열번호 : 77)
올리고 #1309-76
Figure pct00083
T-3'(서열번호 : 78)
K. 마우스 OPG met[22-180]
N- 말단 메티오닌과 마우스 OPG 의 아미노산 22 내지 180 을 코드화하는 DNA 서열을, 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 의 luxPR 프로모터 조절하에 위치시켰다. 프라이머로서 올리고누클레오티드 #1309-72 및 #1309-73 을 사용하고 주형으로서 플라스미드 pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA 를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 열순환 조건은 B 부문에 기술되어 있는 바와 같았다. 결과적으로 생성된 PCR 시료를 아가로스 겔 상에서 분해시켜, 이 PCR 산물을 절제하고 정제한 다음, NdeI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 절단하여 정제하였다. NdeI 및 BamHI 으로 절단하여 정제한 이 PCR 산물을, 표준 방법론을 사용하여 pAMG21 의 NdeI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 이 결과 혼합물을 제조자의 프로토콜을 이용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 형질전환 시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음, muOPG-met[22-180] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
유도 후에, 재조합 pAMG21 플라스미드를 포함하는 형질감염된 393 배양주로부터 재조합 muOPG-met[22-180] 폴리펩티드가 발현되었는지를 C 부문에 기술되어 있는 방법을 이용하여 측정하였다.
올리고 #1309-72
A-3'(서열번호 : 79)
올리고 #1309-73
Figure pct00085
A-3'(서열번호 : 80)
L. 마우스 OPG met[27-180]
N- 말단 메티오닌과 마우스 OPG 의 아미노산 27 내지 180 을 코드화하는 DNA 서열을, 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 의 luxPR 프로모터 조절하에 위치시켰다. 프라이머로서 올리고누클레오티드 #1309-74(l 부문 참조) 및 #1309-73(K 부문 참조)을 사용하고 주형으로서 플라스미드 pAMG21-muOPG-met[22-401] DNA를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 열순환 조건은 B 부문에 기술되어 있는 바와 같았다. 결과적으로 생성된 PCR 시료를 아가로스 겔 상에서 분해시켜, 이 PCR 산물을 절제하고 정제한 다음, NdeI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 절단하여 정제하였다. NdeI 및 BamHI 으로 절단하여 정제한 상기 PCR 산물을, 표준 방법론을 사용하여 pAMG21의 NdeI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 이 결과 혼합물을 제조자의 프로토콜을 이용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 형질전환 시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음, muOPG-met[27-180] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
유도 후에, 재조합 pAMG21 플라스미드를 포함하는 형질감염된 393 배양주로부터 재조합 muOPG-met[27-180] 폴리펩티드가 발현되었는지를 C 부문에 기술되어 있는 방법을 이용하여 측정하였다.
M. 마우스 OPG met[22-189] 및 met[22-194]
N-말단 메티오닌과 마우스 OPG 의 아미노산 22 내지 189, 또는 22 내지 194 중 하나를 코드화하는 DNA 서열을, 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 의 luxPR 프로모터 조절하에 위치시켰다.
합성 올리고누클레오티드 # 1337-92 및 #1337-93(= muOPG - 189 링커) 또는 #1333-57 및 #1333-58 (=muOPG-194 링커) 쌍을 개별적으로 인산화반응시키고 B 부문에 기술된 방법을 이용하여 올리고 링커 이중체쌍을 형성하였다. pAMG21-muOPG-met[22-401]의 정제된 플라스미드 DNA를 KpnI 및 BspEI 제한 엔도누클레아제로 절단하여 그 결과 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 상에서 분해시켰다. 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여 ∼413 bp B 단편을 분리하였다. BspEI 및 BamHI 점착 말단을 포함하는, 올리고 # 1337-92 와 #1337-93(muOPG-189 링커), 아니면 올리고 #1333-57 과 # 1333-58(muOPG-194링커) 사이에서 형성된 인산화 올리고 링커 이중체, 및 상기한 KpnI 과 BspEI 제한 엔도누클레아제로 절단시킨 플라스미드 pAMG21-muOPG-met[22-401]의 분리된 ∼413 bp B 단편을 표준방법론을 이용하여 pAMG21-muOPG-met[22-401]의 KpnI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 각 결합 혼합물을 제조자의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 형질전환시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음, muOPG-met[22-189] 이나, 아니면 muOPG-met[22-194] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
393 세포내로 형질전환시킨 재조합 pAMG21 플라스미드로부터 재조합 muOPG-met[22-189] 및 muOPG-met[22-194] 폴리펩티드가 발현되었는지를 C 부문에 기술된 방법을 이용하여 측정하였다.
올리고 #1337-92
올리고 #1337-93
Figure pct00087
올리고 #1333-57
Figure pct00088
올리고 #1333-58
Figure pct00089
N. 마우스 OPG met[27-189] 및 met[27-194]
N-말단 메티오닌과 마우스 OPG 의 아미노산 27 내지 189, 또는 27 내지 194 중 하나를 코드화하는 DNA 서열을, 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 의 luxPR 프로모터 조절하에 위치시켰다. BspEI 및 BamHI 점착 말단을 포함하는, 이산화된 올리고 링커 "muOPG-189 링커" 나, 아니면 "muOPG-194 링커" (M 부문 참조), 및 KpnI 과 BspEI 제한 엔도누클레아제로 절단시킨 플라스미드 pAMG21-muOPG-met[22-401]의 분리된 ∼413 bp B 단편을 표준방법론을 이용하여 플라스미드 pAMG21-muOPG-met[27-401]의 KpnI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 각 결합 혼합물을 제조자의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 형질전환시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음, muOPG-met[27-189] 이나, 아니면 muOPG-met[27-194] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
재조합 pAMG21 플라스미드 포함하는 393 세포로부터 유도 후 재조합 muOPG-met[27-189] 및 muOPG-met[27-194] 폴리펩티드가 발현되었는지를 C 부문에 기술된 방법을 이용하여 측정하였다.
Q. 인체 OPG met[22-185], met[22-189], met[2-194]
N-말단 메티오닌과 인체 OPG 폴리펩티드의 아미노산 22 내지 185, 22 내지 189, 또는 22 내지 194 중 하나를 코드화하는 DNA 서열을, 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 의 luxPR 프로모터 조절하에 위치시켰다. 합성 올리고누클레오티드 # 1331-87 및 #1331-88(= huOPG - 185 링커), #1331-89 및 #1331-90 (= huOPG-189 링커), 또는 #1331-91 및 1331-92(= huOPG-194 링커) 쌍을 개별적으로 인산화반응시키고 각각 B 부문에 기술된 방법을 이용하여 올리고 링커 이중체 쌍을 형성하였다. pAMG21-huOPG-met[27-401]의 정제된 플라스미드 DNA 를 KpnI 및 NdeI 제한 엔도누클레아제로 절단하여 그 결과 생성된 DNA 단편을 아가로스 겔 상에서 분해시켰다. 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여 ∼407 bp B 단편을 분리하였다. 올리고 # 1331-87 및 # 1331-88(huOPG-185 링커), 올리고 # 1331-89 및 # 1331-90(huOPG-189 링커), 아니면 올리고 # 1331-91 및 # 1331-92(huOPG-194 링커) [각 링커는 NdeI 및 BamHI 점착 말단을 포함함] 사이에서 형성된 인산화 올리고 링커 이중체, 및 상기한 KpnI 및 NdeI 제한 엔도누클레아제로 절단시킨 플라스미드 pAMG21-huOPG-met[27-401]의 분리된 ∼407 bp B 단편을 표준방법론을 이용하여 플라스미드 pAMG21-huOPG-met[22-401]의 KpnI 및 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 각 결합물을 제조자의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 형질전환시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음, huOPG-met[22-185], huOPG-met[22-189]이나, 아니면 huOPG-met[22-194] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
유도 후 재조합 pAMG21 플라스미드롤 포함하는 형질전환된 393 세포내로부터 재조합 huOPG-met[22-185], huOPG-met[22-189] 또는 huOPG- met[22-194] 폴리펩티드가 발현되었는지를 C 부문에 기술된 방법을 이용하여 측정하였다.
올리고 # 1331-87
Figure pct00090
올리고 # 1331-88
Figure pct00091
올리고 # 1331-89
Figure pct00092
올리고 # 1331-90
Figure pct00093
올리고 # 1331-91
Figure pct00094
올리고 # 1331-92
Figure pct00095
P. 인체 OPG-met[27-185], met[27-189] 및 met[27-185]
N-말단 메티오닌과 인체 OPG 폴리펩티드의 아미노산 27 내지 185, 27 내지 189, 또는 27 내지 194 중 하나를 코드화하는 DNA 서열을, 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 의 luxPR 프로모터 조절하에 위치시켰다. NdeI 및 BamHI 점착 말단을 포함하는, 각각의 인산화된 올리고 링커 "huOPG-185 링커", "huOPG-189 링커" 또는 "huOPG-194 링커" (0 부문 참조), 및 KpnI 및 NdeI 제한 엔도누클레아제로 절단시킨 플라스미드 pAMG21-huOPG-met[22-401]의 분리된 ∼407 bpB 단편(0 부문 참조)을 표준방법론을 이용하여 플라스미드 pAMG21-huOPGmet[27-401](J 부문 참조)의 KpnI 과 BamHI 부위 사이에 방향에 따라 삽입하였다. 각 결합물을 제조자의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 형질전환시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음, huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189]이나, 아니면 huOPG-met[27-194] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
393 세포내로 형질전환시킨 재조합 pAMG21 플라스미드로부터 재조합 huOPG-met[27-185], huOPG-met[27-189] 및 huOPG-met[27-194] 폴리펩티드가 발현되었는지를 C 부문에 기술된 방법을 이용하여 측정하였다.
Q. 마우스 OPG met[27-401] (P33E, G36S, A45P)
N-말단 메티오닌과 인체 OPG 의 아미노산 27 내지 48, 이 다음에 마우스 OPG 의 아미노산 잔기 49 내지 401 을 코드화하는 DNA 서열을 다음과 같이 원핵 발현 벡터 pAMG21 의 lux PR 프로모터 조절하에 위치시켰다. pAMG21-huOPG-met[27-401] 의 정제된 플라스미드 DNA (J 부문 참조)를 AatII 및 KpnI 제한 엔도누클레아제로 절단시키고 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여 아가로스 겔로부터 ∼1075 bp B 단편을 분리하였다. 또한, 플라스미드 pAMG21-muOPG [22-401] DNA(D 부문 참조)를 KpnI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 절단시키고 상기와 같이 ∼1064 bp B 단편을 분리하였다. AatII와 KpnI 점착 말단을 포함하는 분리된 ∼1075 bp pAMG21-huOPG-met [27-401] 제한 단편, KpnI 과 BamHI 점착 말단을 포함하는 ∼1064 bp pAMG21-muOPG-met[22-401] 제한 단편, 및 pAMG21 의 AatII 와 BamHI 사이의 핵산 서열에 상응하는 AatII 와 BamHI 점착 말단을 포함하는 ∼5043 bp 제한 단편을 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여 결합시켰다. 이 결합물을 제조자의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 393 내로 형질전환시켰다. 클론을 선택하고, 그 플라스미드 내에 재조합 삽입물이 존재하는지를 표준 DNA 방법론을 이용하여 확인하였다. muOPG-27-401(P33E, G36S, A45P) 유전자. muOPG 잔기 27 내지 48 을 huOPG 잔기 27 내지 48 로 대체시킨 결과 muOPG 에서 프롤린-33 이 글루타민산-33 으로, 글리신-36 이 세린 -36 으로, 알라닌 -45 가 프롤린 -45 로 아미노산 변화되었다.
재조합 pAMG21 플라스미드를 포함하는 형질전환된 393 세포로부터 재조합 muOPG-met[27-401](P33E, G36S, A45P)이 발현되었는지를 C 부문에 기술된 방법을 이용하여 측정하였다.
R. 마우스 OPG met-lys-(his)-ala-ser-(asp) 4 -lys[22-401](A45T)
N - 말단 His 표식과 엔테로키나제 인식서열(NH2 내지 COOH 말단), 즉 Met-Lys-His-His-His-His-His-His-His-Ala-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(=HEK), 이 다음에 마우스 OPG 폴리펩티드의 아미노산 22 내지 401 을 코드화하는 DNA 서열을 다음과 같이 lac 리프레서 조절 Ps4 프로모터의 조절하에 위치시켰다. pAMG22-His(A 부문 참조)를 NheI 및 BamHI 제한 엔도누클레아제로 절단하고, 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여 아가로스 겔로부터 큰 단편(A 단편)을 분리하였다. 올리고누클레오티드 #1282-91 및 #1282-92 를 개별적으로 인산화반응시키고 미리 기술한 방법(B 부문 참조)을 사용하여 올리고 링커 이중체를 형성하였다. NheI 및 KpnI 점착 말단을 포함하는 올리고 #1282-91 과 #1282-92 사이에 형성된 인산화된 링커 이중체, 및 KpnI 및 BamHI 으로 절단하여 정제한 PCR 산물(D 부문 참조), 및 NheI 과 BamHI 으로 절단된 벡터 pAMG22-His 의 A 단편을 표준 재조합 DNA 방법론을 이용하여 결합시켰다. 이 결합물을 제조자의 프로토콜을 사용하여 일렉트로포레이션하여 E. coli 숙주 GM120 내로 형질전환시켰다. 클론을 선택하여, 플라스미드 DNA 를 분리한 다음 muOPG-HEK[22-401] 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 서열결정하였다. DNA 서열결정으로, muOPG 폴리펩티드의 알라닌-45 가 트레오닌으로 단일 아미노산 변화된, 자연 muOPG 서열내의 허위돌연변이가 밝혀졌다.
재조합 pAMG21 플라스미드를 포함하는 GM120 세포로부터 재조합 muOPG-HEK[22-401](A45T)가 발현되었는지를 C 부문에 기술되어 있는 방법과 유사한 방법을 사용하여 결정하였으나, 합성 자가유도물질을 부가하는 대신 유도를 이루기 위해 0.4 mM 최종으로 IPTG 를 가하였다.
올리고 # 1282-91
올리고 # 1282-92
Figure pct00097
S. 인체 OPG met-arg-gly-ser-(his) 6 [22-401]
중복의, 2 중 가닥 DNA 로서 175 개 염기 단편을 생성하기 위해 8 개의 올리고누클레오티드(하기한 1338-09 내지 1338-16)를 고안하였다. 이 올리고를 어닐링하고, 결합시킨 다음, 5' 및 3' 올리고를 PCR 프라이머로서 사용하여 다량의 175 염기 단편을 생성하였다. 최종 PCR 유전자 산물을 제한 엔도누클레아제 ClaI 및 KpnI 으로 절단하여 인체 OPG 의 N-말단 28 개 코돈을 대신하는 단편을 생성하였다. 이 ClaI 및 KpnI 으로 절단시킨 PCR 산물을, 역시 ClaI 및 KpnI 으로 절단시킨 pAMG21-huOPG[27-401]내로 삽입하였다. 결합된 DNA 를 E. coli 균주 393 의 감응 숙주세포내로 형질전환시켰다. 재조합 단백질 산물을 생산하는 능력 및 정확한 누클레오티드 서열을 갖는 유전자 융합을 지니는 능력에 대해 클론을 선별하였다. 50 ml 진탕 플라스크 연구로부터 단백질 발현 수준을 측정하였다. 쿠마시 염색 PAGE 겔 및 마우스 항-OPG 항체를 수반한 웨스턴 분석으로 상기 구성체의 발현에 대해 전체 세포 용균액과 음파처리 펠릿을 분석하였다. huOPG Met-Arg-Gly-Ser-(His)6[22-401]의 발현 결과 큰 세포 봉입체가 형성되었는데, 이 단백질은 가용성(펠릿) 분획에 국한되어 있었다.
1338-09
Figure pct00098
1338-10
Figure pct00099
1338-11
Figure pct00100
1338-12
Figure pct00101
1338-13
Figure pct00102
1338-14
Figure pct00103
1338-15
Figure pct00104
1338-16
Figure pct00105
T. 인체 OPG met-lys[22-401] 및 met(lys) 3 [22-401]
인체 OPG[22-401] 의 met-lys 및 met-(lys)3 변형체를 구성하기 위해, 특정 수의 리신 잔기를 가하여 중복 올리고누클레오티드를 고안하였다. PCR 을 2 순환하여 최종 산물이 생성되도록, 각 구성체에 대한 2 개의 올리고를 중복시켜 고안하였다. 제 1 PCR 반응을 위한 주형은 인체 OPG 22-401 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA 시료였다. 제 1 PCR 에 의해 리신 잔기(들)이 부가되었다. 제 2 PCR 에 제 1 순환 산물을 사용하여 제 1 제한부위, ClaI 의 원래 서열을 부가시켰다.
최종 PCR 유전자 산물을 제한 엔도뉴클레아제 ClaI 및 KpnI 으로 절단한 다음 - 이것은 hu OPG 의 N - 말단 28 개 코돈을 대신함 -역시 상기 두 제한 엔도누클레아제로 절단시킨 플라스미드 pAMG21-huOPG[27-401] 내로 결합시켰다. 결합된 DNA 를 E. coli 균주 393 의 감응 숙주세포내로 형질전환시켰다. 재조합 단백질 산물을 생산하는 능력 및 정확한 누클레오티드 서열을 갖는 유전자 융합을 지니는 능력에 대해 클론을 선별하였다. 50 ml 진탕 플라스크 연구로부터 단백질 발현수준을 측정하였다. 쿠마시 염색 PAGE 겔 및 마우스 항- OPG 항체를 수반한 웨스턴 분석으로 상기 구성체의 발현에 대해 전체 서포 용균액과 음파처리 펠릿을 분석하였다. 어떠한 구성체도 검출가능한 수준의 단백질 발현을 나타내지 않았으며 세포 봉입체도 가시화되지 않았다. DNA 서열결정하여 DNA 서열을 확인하였다.
Met-Lys huOPG[22-401]을 제조하기 위한 올리고누클레오티드 프라이머 :
1338-17
1338-18
Figure pct00107
1338-20
Figure pct00108
Met-(Lys)3-huOPG[22-401]을 제조하기 위한 올리고누클레오티드 프라이머 :
1338-17
Figure pct00110
1338-19
Figure pct00111
1338-20
Figure pct00112
U. 인체 및 마우스 OPG[22-401]/Fc 융합체
4 개의 OPG-Fc 융합체를 구성하였는데, 여기서 인체 lgG1 의 Fc 부분을, 인체나 아니면 마우스 오스테오프로테게린 아미노산 22 내지 401 의 N- 말단에 (Fc/OPG[22-401]이라고 언급) 또는 그 C-말단에 (OPG[22-401]/Fc 라고 언급) 융합시켰다. 실시예 7 에 기술되어 있는 융합 벡터 pFc-A3 을 사용하여 Fc 융합체를 구성하였다.
표준 PCR 기술을 이용하여 모든 융합 유전자를 구성하였다. PCR 반응을 위한 주형은 표적 유전자를 포함하는 플라스미드 시료였다. 한 유전자의 C - 말단 부분과 다른 유전자의 N - 말단 부분을 결합시켜 중복 올리고를 고안하였다. 이러한 과정은, 적합한 PCR 반응을 수행한 후에 정확한 리딩 프레임에 상기 두 유전자가 융합되도록 한다. 처음에, 각 유전자에 대한 하나의 "융합" 올리고를 표적 유전자를 운반하는 벡터에 대한 보편 프라이머와 함께 PCR 반응에 도입하였다. 상보적 "융합" 올리고를 PCR 다른 유전자에 대한 보편 프라이머와 함께 사용하였다. 이러한 제 1 PCR 반응이 끝났을 때 2 개의 독립된 산물이 수득되었는데, 이 산물들은 PCR 의 제 2 순환을 유도하여 원하는 융합체를 생성시키도록 충분한 중복을 야기시키는 융합 부위를 갖는 각각의 개별 유전자를 가지고 있다. PCR 의 제 2 순환에 있어서, 2 개의 제 1 PCR 산물을 보편 프라이머와 함께 상기 중복 부위를 통하여 결합시켜, 전장의 융합 DNA 서열을 생산하였다.
최종 PCR 유전자 산물을 제한 엔도누클레아제 XbaI 및 BamHI으로 절단한 다음, 역시 상기 2 개의 제한 엔도누클레아제로 절단시킨 벡터 pAMG21 내로 결합시켰다. 결합된 DNA 를 E. coli 균주 393 감응 숙주세포내로 형질전환시켰다. 재조합 단백질 산물을 생산하는 능력 및 정확한 누클레오티드 서열을 갖는 유전자 융합을 지니는 능력에 대해 클론을 선별하였다. 50 ml 에 진탕 플라스크 연구로부터 단백질 발현 수준을 측정하였다. 쿠마시 염색 PAGE 겔 및 마우스 항 - OPG 항체를 수반한 웨스턴 분석으로 상기 융합체의 발현에 대해 전체 세포 용균액, 음파처리 펠릿 및 상청액을 분석하였다.
Fc/huOPG[22-401]
쿠마시 염색 PAGE 겔 및 웨스턴 블롯으로 Fc/huOPG[22-401]융합 펩티드의 발현을 검출하였다. 세포는 매우 큰 세포 봉입체를 가지고 있으며, 이 산물의 대부분은 불용성(펠릿) 분획내에 존재한다. 이러한 OPG-Fc 융합체를 구성시키기 위해 다음 프라이머를 사용하였다 :
1318-48
Figure pct00113
1318-49
Fc/muOPG[22-401]
쿠마시 염색 겔 및 웨스턴 블롯으로 이 융합 펩티드의 발현을 검출하였다. 세포는 매우 큰 세포 봉입체를 가지고 있으며, 이 산물의 대부분은 불용성(펠릿) 분획내에 존재한다. 이러한 OPG-Fc 융합체를 구성시키기 위해 다음 프라이머를 사용하였다 :
1318-50
(서열번호 : 109)
1318-51
Figure pct00116
muOPG[22-401]/Fc
쿠마시 염색 겔 및 웨스턴 블롯으로 이 융합 펩티드의 발현을 검출하였다. 재조합 산물의 양은 N - 말단 위치에서 Fc 부분을 갖는 OPG 융합 단백질 보다 적었다. 분명한 세포 봉입체가 검출되지 않았다. 산물의 대부분은 불용성(펠릿) 분획에 존재하는 것으로 여겨졌다. 이러한 OPG-Fc 융합체를 구성시키기 위해 다음 프라이머를 사용하였다 :
1318-54
1318-55
Figure pct00118
huOPG[22-401]/Fc
희미한 웨스턴 양성 신호가 존재했으나, 쿠마시 염색 겔로 이 융합 펩티드의 발현은 검출되지 않았다. 분명한 세포 봉입체가 검출되지 않았다. 이러한 OPG-Fc 융합체를 제조하기 위해 다음 프라이머를 사용하였다 :
1318-52
Figure pct00119
1318-53
인체 OPG met[22-401]-Fc 융합(P25A)
이 구성체는 위치 25 에서 프롤린을 알라닌으로 아미노산 변화시킨 것(P25A) 과 huOPG met[22-401]-Fc 융합체를 결합시킨 것이다. 플라스미드를 제한 엔도누클레아제 ClaI 및 KpnI 으로 절단하여 - 이 유전자의 N - 말단 28 개 코돈을 제거 - 결과적으로 생성된 작은 (200 염기쌍 보다 적음) 단편을 겔 정제시켰다. 그런 다음 프롤린이 알라닌으로 변화된 이 단편을 상기 두 제한 엔도누클레아제로 절단시킨 플라스미드 pAMG21-huOPG[22-401]-Fc 융합체 내로 결합시켰다. 결합된 DNA 를 E. coli 균주 393 감응 숙주세포내로 형질전환시켰다. 재조합 단백질 산물을 생성하는 능력 및 정확한 누클레오티드 서열을 갖는 유전자 융합체를 지니는 능력에 대해 클론을 선별하였다. 50 ml 진탕 플라스크 연구로부터 단백질 발현 수준을 측정하였다. 쿠마시 염색 PAGE 겔 및 마우스 항-OPG 항체를 수반한 웨스턴 분석으로 상기 구성체의 발현에 대해 전체 세포 용균액 및 음파처리 펠릿을 분석하였다. 쿠마시 염색 PAGE 겔 및 웨스턴 블롯으로 융합 펩티드의 발현 수준을 검출하였다. 단백질은 불용성(펠릿) 분획내에 존재하였다. 세포는 큰 세포 봉입체를 가졌다.
W. 인체 OPG met[22-401](P25A)
위치 25 에서 프롤린을 알라닌으로 치환시킨 것과 함께 N - 말단 메티오닌과 인체 OPG 의 아미노산 22 내지 401 을 코드화하는 DNA 서열을 원핵 발현 벡터 pAMG21 내의 lux PR 프로모터 조절하에서 다음과 같이 구성하였다 : 합성 올리고 # 1289-84 및 1289-85 를 어닐링하여 XbaI 과 KpnI 점착 말단을 갖는 올리고 링커 이중체를 형성하였다. 합성 링커 이중체는 최적 E. coli 코돈을 사용하였고 N - 말단 메티오닌을 코드화했다. 또한 이 링커는 본래 서열에 존재하지 않았던 SpeI 제한부위도 포함했다. 표준 방법을 사용하여 pAMG21-huOPG-22-401 내 XbaI 과 KpnI 부위 사이에 상기 링커 이중체를 방향에 따라 삽입하였다. 이 결합 혼합물을 E. coli 숙주 GM 221 내로 형질전환시켜 도입하였다. 처음에 재조합 단백질의 생성에 대해 클론을 선별하였다. 양성 클론으로부터 플라스미드 DNA 를 분리하고 HuOPG-Met[22-401](P25A) 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다. XbaI-KpnI 링커를 생성시키기 위해 다음 올리고누클레오티드를 사용하였다 :
올리고 # 1289-84
Figure pct00121
올리고 # 1289-85
Figure pct00122
X. 인체 OPG met[22-401](P26A) 및 (P26D)
위치 26 에서 프롤린을 알라닌으로 치환시킨 것과 함께 N - 말단 메티오닌과 인체 OPG 의 아미노산 22 내지 401 을 코드화하는 DNA 서열을 원핵 발현 벡터 pAMG21 내 lux PR 프로모터 조절하에서 다음과 같이 구성하였다 : 합성 올리고 # 1289-86 및 1289-87 을 어닐링하여 XbaI 과 SpeI 점착 말단을 갖는 올리고 링커 이중체를 형성하였다. 합성 링커 이중체는 최적 E. coli 코돈을 사용하였고 N - 말단 메티오닌을 코드화했다. 표준 방법을 이용하여 pAMG21-huOPG[22-401](P25A)내 XbaI 과 SpeI 부위 사이에 상기 링커 이중체를 방향에 따라 삽입하였다. 이 결합 혼합물을 E. coli 숙주 GM 221 내로 형질전환시켜 도입하였다. 처음에 재조합 단백질의 생성에 대해 클론을 선별하였다. 양성 클론으로부터 플라스미드 DNA 를 분리하고 huOPG-met[22-401](P26A) 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다. 서열결정한 클론 중 하나가 위치 26 에서 알라닌 보다 오히려 아스파르트산으로 치환되었음이 발견되었으며, 이 클론을 huOPG-met[22-401](P26D)라고 명명하였다. XbaI - SpeI 링커를 생성시키기 위해 다음 올리고누클레오티드를 사용하였다.
올리고 # 1289 - 86
올리고 # 1289-87
Y. 인체 OPG-met[22-194](P25A)
N - 말단 메티오닌과 위치 25 에서 프롤린이 알라닌으로 치환된 인체 OPG 의 아미노산 22 내지 194 를 원핵 발현 벡터 pAMG21 내 luxPR 프로모터 조절하에서 다음과 같이 구성하였다 : 플라스미드 pAMG21-huOPG[27-194] 및 pAMG21-huOPG[22-401](P25A)을 각각 KpnI 과 BamHI 엔도누클레아제로 절단하였다. 이 단편들을 서로 결합시켜 E. coli 숙주 GM221 내로 형질전환시켜 도입하였다. 처음에 재조합 단백질의 생성에 대해 클론을 선별하였다. 양성 클론으로부터 플라스미드 DNA 를 분리하고 huOPG-Met[22-194](P25A) 유전자의 DNA 서열을 확인하기 위해 DNA 서열결정하였다.
실시예 9
OPG 단량체의 회합(association)
토끼 다클론성 항 - OPG 항체를 사용하여 분비 재조합 OPG를 분석하기 위한 조정배지를 생성시키기 위해 muOPG[22-401]가 과발현되도록 유전공학 처리한 CHO 세포를 사용하였다. 조정배지의 분취량을 20 배 농축시킨 다음 환원 SDS-PAGE 및 비-환원 SDS - PAGE로 분석하였다(도 15). 환원 조건하에서 이 단백질은, 성숙한 산물이 그것의 칸센서스(consensus) N-결합 글리코실화 부위 중 하나 또는 그 이상에서 글리코실화되었을 것이라고 예상한 바와 같이 Mr 50-55 kd 폴리펩티드로 이동하였다. 놀랍게도, 같은 시료를 비-환원 SDS-PAGE 로 분석하였을 때, 대부분의 단백질은 환원 단백질 크기의 두배인 약 100 kd 폴리펩티드로 이동하였다. 게다가, 보다 적은량의 Mr 50-55 kd 폴리펩티드가 존재하였다. 이러한 SDS -PAGE 상의 이동 유형은, OPG 산물이 유리 설프히드릴기(들)의 산화를 통해 이량체를 형성한다는 견해와 일치하였다.
예상된 성숙한 OPG 폴리펩티드는 23 개 시스테인 잔기를 포함하고 있는데, 이 중 18 개가 4 개의 시스테인- 풍부 도메인을 구성하는 사슬내 이황화물 결합을 형성하는 것과 관련된다고 추측된다(도 12A). 나머지 5 개의 C-말단 시스테인 잔기는 다른 TNFR 과 부류와의 상동성을 기초로 예상할 수 있는 이차 구조와 관련되지 않는다. 전부 순홀수의 시스테인 잔기가 존재하는데, 형식적으로는 최소한 하나의 잔기가 두개의 OPG 단량체 사이에서 분자간 이황화물 결합을 형성할 수 있다는 것이 가능하다.
OPG 동성(kinesis)과 단량체 회합을 밝히기 위해 파동-추적 표식 연구를 수행하였다. muOPG[22-401]을 발현하는 CHO 세포를, 35S 메티오닌과 시스테인을 함유하는 무혈청 배지로 30 분간 상기와 같이 대사적으로 표식하였다. 이 기간 후에 배지를 제거하고, 원래 방사성 아미노산 농도에 대해 약 2,000 배 과량 수준으로 비표식 메티오닌과 시스테인을 함유하는 완전 배지로 대체하였다. 부가 후 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간 및 12 시간에서, 상기 조정배지를 제거함으로써 배지를 수확하고, 그 조정 배지의 용균액과 점착성 단층을 제조하였다. 배지와 세포 용균액을 상기와 같이 청징화한 다음 상기와 같은 항-OPG 항체를 사용하여 면역침강시켰다. 면역침강물을 세척한 후 비환원 SDS-PAGE 완충액에서 끓여 방출시킨 다음 동등하게 1/2 로 하여 둘로 나누었다. 하나의 1/2 에 환원제 β - 머캅토에탄올을 가하여 5 % 최종농도가 되게 한 반면 나머지 1/2 은 비환원 조건으로 유지시켰다. 두 세트의 면역침강물을 상기와 같이 SDS-PAGE 하여 분석한 다음 오토레이디오그래피를 위해 처리하고 필름에 노출시켰다. 그 결과는 도 16 에 나타나 있다. 환원 SDS-PAGE 로 분석한 시료가 두 패널 하단에 도시되어 있다. OPG 폴리펩티드는 합성된 후에 신속히 약간 더 큰 폴리펩티드로 프로세싱되는데, 아마도 이것은 N-결합 글리코실화에 의한 변형을 의미하는 것 같다. 약 1-2 시간 후 세포내 OPG 수준은 극적으로 감소하되 동시에 배양 상청액에서 일어난다. 이것은 규정 시간을 초과하여 OPG 벡터가 상기 세포로부터 배지내로 이동한 결과로 여겨지는데, 이는 OPG 가 자연 발생적인 분비성 단백질이라는 견해와 일치한다. 비환원 조건하에서 동일한 면역침강물을 분석한 결과 OPG 이량체 형성과 조정배지내 분비사이의 관계가 밝혀졌다(도 16, 상단 패널). 처음 30-60 분에서, OPG 단량체가 분명한 글리코실화에 의해 세포내에서 처리된 다음에 이량체로 형성된다. 규정시간이 초과되면 대부분의 OPG 단량체는 이량체로 나뉘고 이어서 세포로부터 사라진다. 합성후 처음 약 60 분에서 OPG 이량체가 조정배지에 나타나고 이 실험을 지속시키는 사이에 축적된다. 이 기간 후에 OPG 가 형성된 다음 조정배지내로 분비된다. OPG 단량체는 규정시간을 초과하여 상기 세포 내부에 낮은 수준으로 지속되며, 적은량도 배지에 나타난다. 이것은 공유결합 OPG 이량체의 붕괴로 인한 것이 아니라, 세포내에 단량체의 아화학량이 생성되고 이어서 분비되는 결과로 여겨진다.
형질감염된 CHO 세포로부터 재조합적으로 생성되는 OPG 는 주로 이량체라고 여겨진다. 이량체화가 OPG 합성시 자연 과정인지를 결정하기 위해, 자연적으로 OPG 를 발현하는 것으로 밝혀진 세포주의 조정배지를 분석하였다. 조직 및 세포주 RNA 를 선별하여 CTLL-2 세포주, 즉 마우스 세포독성 T 림프구 세포주(입수처 : ATCC 제 TIB -214 호)가 OPG mRNA 를 발현한다는 것을 발견하였다. 이 OPG 전사물이 신장으로부터 확인된, 클로닝시켜 서열결정한 2.5 - 3.0 kb RNA 와 동일하고, 분비성 분자를 코드화한다는 것을 발견하였다. CTLL-2 세포로부터 수득한 조정배지를 웨스턴 블롯 분석한 결과는 비록 전부는 아닐지라도 분비된 대부분의 OPG 단백질이 이량체임을 보여준다(도 17). 이것은 OPG 이량체화 및 분비가 세포주내 과발현 인공산물이 아니라, 세포를 발현시켜 생성된 산물의 주요 형태일 것 같음을 시사한다.
OPG 형질전환 마우스에서 발현된 OPG 분자의 성질을 결정하기 위해 정상 및 형질전환된 마우스의 조직과 혈청을 분석하였다. 랫 OPG cDNA 가 간세포 조절 요소의 조절하에서 발현되었으므로, 비환원 조건하에서 대조 및 형질전환 마우스의 실질(parenchyma)로부터 제조한 추출물을 분석하였다(도 18). 형질전환된 마우스의 추출물에서는 OPG 이량체가 아화학량의 단량체와 함께 쉽게 검출되나, 대조 마우스에서는 쉽게 검출되지 않는다. 이 OPG 이량체와 단량체는 유전공학 처리한 CHO 세포에서 발현시킨 재조합 마우스 단백질과 동일하다. 이것은 OPG 이량체가 실제로 자연형의 유전자 산물이며, 활성 성분의 요소일 것 같다는 것을 강하게 시사한다. 대조 및 형질전환 마우스로부터 수득한 혈청 시료를 유사하게 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다. 대조 마우스에서 대부분의 OPG 단백질이 이량체로서 이동하는 반면, 소량의 단량체도 검출된다. 게다가, 상당량의 더 큰 OPG 관련 단백질이 검출되었는데, 이것은 공유 결합된 삼량체의 예상 크기와 일치하는 상대 분자량을 지닌 이동체이다. 따라서, 재조합 OPG 는 OPG 형질전환 마우스에서 주로 이량체 단백질로서 발현되는데, 이 이량체형이 OPG 마우스내 골화석증 표현형에 대한 근거일 수 있다. OPG 재조합 단백질 역시 더 높은 분자량의 "삼량체" 형으로 존재할 수도 있다.
OPG 의 5 개의 C-말단 시스테인 잔기가 호모이량체화에 작용하는지를 결정하기 위해, 시스테인 잔기 195(C195)에 대한 마우스 OPG코돈, C202, C277, C319 및 C400 을 상기와 같이 QuickChangeTM 부위 - 특이 돌연변이유발 키트(미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 스트라타진에서 구입)를 사용하여 세린으로 변화시켰다. muOPG 유전자를 pcDNA 3.1(+) 벡터(미국 캘리포니아 샌디에고에 소재하는 스트라타진에서 구입)의 NotI 과 XbaI 부위 사이에 서브클로닝시켰다. 결과적으로 생성된 플라스미드, pcDNA 3.1 - muOPG 및 돌연변이유발 프라이머를 디데옥시누클레오티드의 존재하에서 Pfu 중합효소로 처리한 다음, 상기와 같이 열순환기로 증폭시켰다. 반응물의 분취량을 열쇼크로 감응 E. coli XL1-Blue 내로 옮긴 후 평판화하였다. 돌연변이를 확인 하기 위해 형질전환체로부터의 플라스미드 DNA 를 서열결정하였다. 마우스 OPG 유전자의 시스테인 잔기 195 에 대한 코돈을 세린으로 변화시키기 위해 다음 프라이머쌍을 사용하였으며, 그 결과 muOPG[22-401]C195S 단백질이 생성되었다 :
1389-19 :
Figure pct00125
1406-38 :
Figure pct00126
마우스 OPG 유전자의 시스테인 잔기 202 에 대한 코돈을 세린으로 변화시키기 위해 다음 프라이머쌍을 사용하였으며, 그 결과 muOPG[22-401]C2O2S 단백질이 생성되었다 :
1389-21 :
Figure pct00127
1389-22 :
Figure pct00128
마우스 OPG 유전자의 시스테인 잔기 277 에 대한 코돈을 세린으로 변화시키기 위해 다음 프라이머쌍을 사용하였으며, 그 결과 muOPG[22-401]C277S 단백질이 생성되었다 :
1389-23 :
Figure pct00129
1389-24 :
마우스 OPG 유전자의 시스테인 잔기 319 에 대한 코돈을 세린으로 변화시키기 위해 다음 프라이머쌍을 사용하였으며, 그 결과 muOPG[22-401]C319S 단백질이 생성되었다 :
1389-17 :
Figure pct00131
1389-18 :
Figure pct00132
마우스 OPG 유전자의 시스테인 잔기 400 에 대한 코돈을 세린으로 변화시키기 위해 다음 프라이머쌍을 사용하였으며, 그 결과 muOPG[22-401]C400S 단백질이 생성되었다 :
1406-72 :
1406-75 :
Figure pct00134
고유 돌연변이를 포함하는 결과적으로 생성된 각 muOPG[22-401] 플라스미드를 인체 293 세포내로 형질감염시키고, 돌연변이체 OPG-Fc 융합 단백질을 상기와 같이 조정배지로부터 정제하였다. 실시예 11 에 기술한 시험관내 파골세포 형성 검정으로 각 단백질의 생물학적 활성도를 측정하였다. 각 형질감염체로부터의 조정 배지를 비환원 SDS-PAGE 및 항 -OPG 항체를 수반한 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 5 개의 C-말단 시스테인 잔기 중 어느 잔기를 돌연변이시켜도 주로(79%) 단량체 55 kd OPG 분자가 생성되었다. 이것은 C-말단 시스테인 잔기가 OPG 호모이량체화에 함께 작용한다는 것을 강하게 시사하는 것이다.
OPG 호모이량체화에 중요한 OPG C - 말단 도메인의 부분(들)을 지도화하기 위해 OPG C-말단 삭제 돌연변이체를 구성하였다. 마우스 OPG 의 C-말단 부분에 예비성숙한 종결 변역 신호를 도입시키는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켜 이들 OPG 돌연변이체를 구성시켰다. 5' 올리고는 MuOPG 출발코돈(HindIII 제한부위 포함)으로 고안하였고 3' 올리고누클레오티드(종결코돈 및 XhoI 부위 포함)는 트레오닌 잔기 200(CT200), 프롤린 212(CT212), 글루타민산 293(CT-293)이나, 아니면 세린 355 (CT-355)에서 끝나도록 muOPG 의 C-말단 부분을 절두시켜 고안하였다.
muOPG[22-200]를 구성하기 위해 다음 프라이머를 사용하였다 :
1091-39 :
Figure pct00135
1391-91 :
Figure pct00136
muOPG[22-212]를 구성하기 위해 다음 프라이머를 사용하였다 :
1091-39 :
Figure pct00137
1391-90 :
Figure pct00138
muOPG[22-293]을 구성하기 위해 다음 프라이머를 사용하였다 :
1091-39 :
Figure pct00139
1391-89 :
(서열번호 : 165)
muOPG[22-355]를 구성하기 위해 다음 프라이머를 사용하였다 :
1091-39 :
1391-88 :
Figure pct00142
고유 절두체를 포함하는 결과적으로 생성된 각 muOPG-CT 플라스미드를 인체 293 세포(입수처 : ATCC 제 CRL 1573 호)내로 형질감염시킨 다음, 상기와 같은 조정배지로부터 돌연변이체 OPG-Fc 융합 단백질을 정제하였다. 실시에 11 에 기술되어 있는 시험관내 파골세포형성 검정으로 각 단백질의 생물학적 활성도를 평가하였다. 또한 상기 조정배지도 비환원 SDS-PAGE 로 분석하고 항-OPG 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅하였다.
OPG 의 C-말단 부분을 절두시킨 결과 호모이량체를 형성하는 OPG 의 능력이 초래된다. CT355 는 다소의 이량체가 형성될지라도, 주로 단량체이다. CT 293 은 동등한 몰량의 단량체 및 이량체, 및 고분자량의 집합체도 형성하는 것으로 여겨진다. 그러나, CT 212 와 CT200 은 단량체이다.
실시예 10
OPG 정제
A. 포유동물 OPG-Fc 융합 단백질 정제
OPG-Fc 융합 단백질을 발현하는 293 세포로부터 5 L 의 조정 배지를 다음과 같이 제조하였다. 냉동한 세포 시료를 10 ml 의 293S 배지(DMEM-고글루코스, 1 X L-글루타민, 10 % 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS) 및 100 ㎍/ml 히그로마이신)내에 해동시키고 1 일 후 신선한 배지를 공급하였다. 3 일 후, 시료를 1 : 10 및 1 : 20 으로 희석하여 2 개의 T175 플라스크에 분배하였다. 1 : 10 분배물을 비율에 따라 200 까지 늘려 2 개의 부가 T175 플라스크를 만들었다. 이 시점에서의 세포는 해동 후 5 일째 였다. 혈청 - 함유 배지를 흡인시켰을 때에 세포는 전면(약 3 일)에 가깝게 성장하였으며, 이 세포를 플라스크당 25 ml PBS 로 1 회 세척하고 각 플라스크에 25 ml의 SF 배지(DMEM - 고글루코스, 1 × L-글루타민)를 가하였다. 세포를 3 일간 5 % CO2 에 유지시켜, 이 시점에서 배지를 수확하고, 원심분리하여, 0.45 m 셀룰로스 질산염 필터(코닝에서 구입)를 통하여 여과시켰다.
PBS 로 평형화시킨 프로테인 G 세파로스 칼럼(파마시아에서 구입)을 사용하여 OPG-Fc 융합 단백질을 정제하였다. 컬럼의 크기는 출발 배지의 부피에 따라 변하였다. 상기와 같이 제조한 조정배지를 컬럼상에 부하시키고, 그 컬럼 PBS 로 세척한 후, 100 mM 글리신 pH 2.7 을 사용하여 순단백질을 용리시켰다. 가능한한 빨리 중화시키기 위해 1 M 트리스 pH 9.2 를 함유하는 시험관에 분획들을 모았다. 단백질을 함유하는 분획들을 풀로 만들어, 아미콘 센트리콘(Amicon Centricon) 10 이나, 아니면 센트리프렙(Centriprep) 10 으로 농축시킨 후 PBS 내에 투석여과시켰다. - 80 ℃ 에서 순단백질을 저장한다.
이러한 방법으로 마우스[22-401]-Fc, 마우스[22-180]-Fc, 마우스[22-194]-Fc, 인체[22-401]-Fc 및 인체[22-201]-Fc 를 정제하였다. 마우스[22-185]-Fc 도 이러한 방법으로 정제한다.
B. 항 - OPG 항체 정제
3 마리의 뉴질랜드 화이트 토끼(5-8 lbs 초기 중량)를 muOPG[22-401]-Fc 융합 단백질로 피하주사하였다. 동부피의 프로인트 완전 보조액으로 에멀션화 한 50 ㎍ 의 항원으로 1 일째에 각 토끼를 면역화하였다. 프로인트 불완전 보조액으로 대신하여 동일한 방법으로 더 추가 자극시켰다(14 일 및 28 일째). EIA로 항체 역가를 모니터링하였다. 제 2 추가자극 후, 이 항혈청은 고항체 역가를 나타냈으며 각 상기 동물로부터 25 ml 의 생성 방혈을 수득하였다. 먼저 마우스 OPG-Fc 를 고정시킨 친화성 칼럼에 상기 혈청을 통과시켰다. 1 % 얼음 아세트산을 함유하는 피어스 젠틀 일루션 버퍼(Pierce Gentle Elution Buffer)로 항-OPG 항체를 용리시켰다. 그런 다음 용리된 단백질을 PBS 내에 투석시키고 Fc 칼럼상에 통과시켜, OPG 융합 단백질의 Fc 부분에 특이적인 어떠한 항체도 제거하였다. 항-OPG 특이 항체를 함유하는 분획들을 PBS 내에 투석시켰다.
C. 마우스 OPG[22-401] 정제
항체 친화성 크로마토그래피
친화성 정제된 항 - OPG 항체를 결합(coupling) 완충액(0.1 M 탄산나트륨 pH 8.3, 0.5 M NaCl)내에 투석여과시키고, CNBr - 활성화 세파로스 비드(파마시아에서 구입)와 함께 실온에서 2 시간 동안 혼합시켰다. 그런 다음 수지를, 1 M 에탄올아민(pH 8.0)을 사용하여 비점유 위치를 차단시키기 전에 실온에서 2시간 동안 결합 완충액으로 광범위하게 세척하였다. 그런 다음 저 pH(0.1 M 아세트산나트륨 pH 4.0, 0.5 M NaCl)로 수지를 세척한 후 고 pH(0.1 M 트리스 - HCl pH 8.0, 0.5 M NaCl)로 세척하였다. 최종 세척을 3 회 반복하였다. 최종적으로 수지를 칼럼내에 채워 넣기 전에 PBS 로 평형화시켰다. 채워 넣자 마자 수지를 PBS 로 세척하였다. 0.1 M 글리신 - HCl, pH 2.5 로 블랭크 용리를 행한 다음 PBS 로 재평형화시켰다.
muOPG[22-410]을 발현하는 CHO 세포로부터의 농축된 조정배지를 저유속으로 상기 칼럼에 가하였다. 280 nm 에서 측정한 UV 흡광도가 기본선으로 되돌아 갈 때까지 컬럼을 PBS 로 세척하였다. 먼저 0.1 M 글리신 - HCl(pH. 25)을 사용하여 칼럼으로부터 단백질을 용리시키고, PBS 로 재평형화시킨 다음, 제 2 완충액 (0.1 M CAPS, pH 10.5), 1 M NaCl 로 용리시켰다. 2 개의 용리 풀을 개별적으로 PBS 내에 투석여과시키고 - 20 ℃ 에 냉동시키기 전에 무균여과하였다.
종래 크로마토그래피
CHO 세포 조정배지를 나선으로 감겨진 아미콘(Amicon) 카트리지(S10y10)로 23 × 농축시켜 20 mM 트리스 pH 8.0 내에 투석여과시켰다. 투석여과된 배지를, 20 mM 트리스 pH 8.0 으로 평형화시킨 Q-세파로스 HP(파마시아에서 구입) 컬럼에 가하였다. 280 nm 에서의 흡광도가 기본선이 될 때까지 칼럼을 세척하였다. 트리스 pH 8.0 내 0-300 mM NaCl 구배 20 칼럼 부피로 단백질을 용리시켰다. 칼럼 분획들을 웨스턴 블롯 분석하여 OPG 단백질을 검출하였다.
OPG 를 함유하는 분획들을 풀로 만들고 300 mM NaCl , 0.2 mM DTT 의 최종농도가 되게 하였다. NiNTA 수퍼로스(퀴아겐에서 구입) 컬럼에 상기 풀로 만든 분획들을 가한 후에 20 mM 트리스, pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.2 mM DTT 로 평형화시켰다. 기본선 흡광도에 이를 때까지 칼럼을 평형화 완충액으로 세척하였다. 평형화 완충액내 0 - 30 mM 이미다졸 구배로 칼럼으로부터 단백질을 용리시켰다. 잔류 단백질은 1 M 이미다졸로 칼럼을 세척하여 제거하였다. OPG - 함유 분획을 검출하기 위해 다시 웨스턴 블롯을 이용하였다.
풀로 만든, NiNTA 칼럼으로부터의 분획을 10 mM 인산 칼륨 pH 7.0, 0.2 mM DTT 내에 투석시켰다. 투석된 풀을, 10 mM 인산염 완충액으로 평형화시킨 세라믹 수산화인회석 칼럼(바이오 - 래드에서 구입)에 가하였다. 칼럼을 세척한 후, 10 - 100 mM 인산 칼륨 구배의 20 칼럼 부피 이상으로 단백질을 용리시켰다. 그런 다음 100 - 400 mM 인산염 구배의 20 칼럼 부피로 용리시켰다.
SDS - 폴리아크릴아미드 겔을 쿠마시 블루 염색하고 웨스턴 블로팅하여 OPG 를 검출하였다. 분획들을 풀로 만들어 PBS 내에 투석여과 시키고 - 80 ℃ 에서 냉동시켰다. 정제된 단백질은 단량체로서 나타났는데 PBS 내에 투석여과시킨 후에도 여전히 그와 같을 것이다. 이 단량체는 냉동저장하거나 pH 5 4 ℃ 에서 저장할 때 안정하다. 그러나 PBS 내 4 ℃ 에서 저장하면, 이량체로 되고 1 주 후에는 삼량체 및 사량체가 형성될 것이라 여겨진다.
D. E. coli 로부터 인체 OPG met[22-401] 정제
5 ℃ 에서 저전단(low shear)균질기를 사용하여, 15 % (W/V)의 농도가 되도록 박테리아 세포 페이스트를 10 mM EDTA 내에 현탁시켰다. 그런 다음 각 5 ℃ 에서 15,000 psi 로 2 회 균질화시켜 이 세포를 파괴하였다. 결과적으로 생성된 균질물을 5 ℃ 에서 1 시간 동안 5,000 x g 으로 원심분리하였다. 원심분리 펠릿을 본래 균질화 부피의 물 내에 저전단 균질화시켜 세척한 다음 상기와 같이 원심분리하였다. 세척된 펠릿을 6 M 구아니딘 HCl, 10 mM 디티오트레이톨, 10 mM 트리스 HCl, pH 8.5 의 15 % (W/V) 용액(최종 농도)에 주위 온도에서 30 분간 가용화시켰다. 50 mM CAPS, pH 10.5, 1 mM 환원 글루타티온을 함유하는 2 M 요소내에 이 용액을 30 배 희석시킨 다음 5 ℃ 에서 72 시간 동안 교반하였다. 먼저 아세트산으로 pH 4.5 로 조정한 다음 25 mM 아세트산 나트륨, pH 4.5 로 평형화 시킨 SP-HP 세파로스 수지 칼럼에 대하여 크로마토그래피를 실시하여 25 ℃ 에서 이 용액으로부터 OPG 를 정제하였다. 0.1 칼럼 부피/분 유속에서 20 칼럼 부피를 사용하여 동일 완충액내 50 mM - 550 mM 의 선형 영화 나트륨 구배로 칼럼 용리를 수행하였다. 단지 원하는 OPG 형태만을 포함하는 피크 분획을 풀로 만들어 5 ℃에 저장하거나, 인산염 완충 식염수로 완충액 교환하고, 초여과하여 농축시킨 다음 5 ℃ 에 저장하였다. 이 물질을 역상 HPLC, SDS-PAGE, 내독소 존재에 대한 리물루스 아메바양세포 용균액 검정, 및 N - 말단 서열결정하여 분석하였다. 또한, 질량 분광법, pH/온도 안정성, 형광, 원편광 이색성, 시차 스캐닝 열량 측정법, 및 단백질 분해효소 단면 검정과 같은 기술을 상기 단백질의 접혀지는 성질을 조사하기 위해 사용할 수도 있다.
실시예 11
재조합 OPG 의 생물학적 활성도
조직학 및 조직형태학을 기초로, 형질전환 마우스내에서 OPG가 과발현되면 파골세포의 수를 현저하게 감소시켜 골 조직을 두드러지게 증가시킨다고 여겨진다(실시예 4). 이러한 생체내 효과의 기초를 이루는 잠재 기작(들)을 더 통찰하기 위해, 여러가지 형태의 재조합 OPG 를 시험관내 파골세포 형성 배양 모델로 시험하였다(파골세포 형성 검정). 이와 같은 배양계는 본래 Udagawa 가 고안하였는데[Udagawa 등의 Endocrinology 125, 1805-1813 (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 7260-7264(1990) 참조], 이것은 골수세포와, 골수 기질 세포주로부터의 세포를 조합시켜 이용한 것이다. 이와 같은 연구를 위해 사용한 이 배양계의 변형에 관한 설명은 이미 공지되어 있다[Lacey 등의 Endocrinology 136, 2367-2376 (1995)참조]. 이 방법에 있어, 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 흘러나온 골수세포를, 단핵구/대식세포과 계통 세포에 대해 특이적인 조절성장인자인, 500 U/ml CSF-1(군체 자극 인자 1, 또는 M-CSF 라고도 함)을 보충한 배양배지(10 % 열 비활성화 소 태아 혈청을 함유한 알파 MEM)에서 밤새 배양하였다. 이와 같이 배양한 후 비점착 세포를 수집하여 구배 정제한 다음 골수세포주 ST2 로부터의 세포와 공통 배양하였다(1 × 106 비점착 세포 : 1 × 105 ST2 세포/ml 배지). 이 배지에 덱사메타손(100 nM)과, 1,25 디히드록시비타민 D3(1,25 (OH)2 D3, 10 nM)라고 알려져 있는 비타민 D3 의 생물학적 - 활성 대사물질을 보충한다. 파골세포 출현(appearance)을 증진시키기 위해 프로스타글란딘 E2(250 nM)를 일부 배양 배지에 가한다. 공동배양 기간은 보통 8 - 10 일의 범위이고, 이 배지를 매 3 - 4 일 마다 신선하게 부가한 모든 보충물로 바꾼다. 조직화학 염료(시그마 키트 # 3874, 미국 미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마에서 구입)나 TRAP 용액 검정을 이용하여, 산성주석산염 포스파타제(TRAP)의 존재에 대해 여러 시간 간격으로 상기 배양물을 평가한다. TRAP 조직화학 방법으로 다핵(≥ 3핵) 세포이고 또한 TRAP+ 인 파골세포를 표현형으로 확인할 수 있다. 상기 용액 검정은, 0.1 % 트리톤 X - 100 을 함유하는 시트르산 완충액 (100 mM, pH 5.0)내에 파골세포 - 함유 배양물을 용균시키는 것을 포함한다. 그런 다음, 실온에서 3 - 5 분 배양 시키는 동안에, 80 mM 주석산염 나트륨의 존재하에서 P- 니트로페닐인산염(20 nM)이 P-니트로페놀로 전환되는 것을 기초로 하여 산성주석산염 내성 포스파타제 활성도를 측정한다. 0.5 M 의 최종농도가 되도록 NaOH 를 가함으로써 반응을 종결시킨다. 405 nm 에서 광학 밀도를 측정하고 그 결과를 좌표에 따라 점을 정한다.
파골세포 형성 검정을 이용한 예전의 연구(Udagawa 등의 동일 문헌 참조)는 이들 세포가 125I - 칼시토닌에 대한 수용체를 발현하고 (오토레이디오그래피) 골 표상에 소와(小窩)를 형성할 수 있다는 것을 설명하며, 이것을 TRAP 양성도(positivity)와 결합시켰을 때 다핵 세포가 파골세포 표현형을 가지고 있음을 확인해 준다. 시험관내 파골세포 형성 검정에서 일어난, 다핵 세포의 파골세포 표현형을 지지하는 부가 증거는, 이 세포가 면역세포화학에 의해, αv 및 β3 인테그린을 발현하고 원 위치 혼성화(lSH)에 의해, 칼시토신 수용체와 TRAP mRNA 를 발현한다는 것이다.
huOPG[22-401]-Fc 융합체를 CHO 세포 조정배지로부터 정제하고 이어서 파골세포 형성 검정에 이용하였다. 100 ng/ml 의 huOPG[22-401]-Fc 에서 파골세포 형성은 사실상 100 % 저해되었다(도 19A). 미량역가 평판 웰내의 용균 배양물로 측정한 TRAP 의 수준 역시 약 3 ng/ml 의 lD50 을 갖는 OPG 의 존재하에서 저해되었다(도 20). 용균액의 TRAP 활성도 수준은, TRAP 세포화학으로 알 수 있는 파골세포의 상대수와 서로 관계가 있는 것으로 여겨진다(도 19A - 19C 및 20 비교). 정제된 인체 lgG1 및 TNFbp도 이러한 모델로써 시험한 결과 저해효과나 자극효과가 없음을 발견하였는데, 이것은 huOPG[22-401]-Fc 의 저해효과가 융합 단백질의 OPG 부분에 기인하였음을 시사하는 것이다. 인체 및 마우스 분자의 부가 형태도 시험하였으며 그 누적 데이터는 표 1 에 요약되어 있다.
상기 누적 데이터는 마우스 및 인체 OPG 아미노산 서열 22 - 401 이, Fc 도메인과 융합되었을 때나 아니면 비융합 되었을 때, 시험관내 에서 완전히 활성임을 시사한다. 그것들은 투여량 - 의존 방식으로 저해하며 2-10 ng/ml 범위에서 ½- 최대 활성도를 갖는다. 트레오닌 잔기 180 에서 마우스 C - 말단이 절두되면 분자를 비활성화시키는 반면, 시스테인 185 및 이를 지나서 절두되면 완전한 활성도를 갖는다. 위치 185 에 위치한 시스테인 잔기가 OPG 의 도메인 4 부분에 SS3 결합을 형성시킨다고 예상된다. 다른 TNFR-관련 단백질에서 이 잔기의 제거로 생물학적 활성도가 소멸된다는 사실은 이미 알려져 있었다[Yan 등의 J. Biol. Chem 266, 12099-12104(1994) 참조]. 이러한 발견과 일치하여 본 출원인도 muOPG[22-180]-Fc 가 비활성인 반면 muOPG[22-185]-Fc 는 활성이라는 것을 발견하였다. 이것은 아미노산 잔기 22 - 185 가 OPG 활성도에 대한 부분을 규정한다는 것을 시사한다.
이러한 발견은, 유사 돌연변이 - 발현 OPG, 재조합 OPG 단백질 역시 파골세포 형성 검정으로 시험한 바와 같이 파골세포의 형성을 억제한다는 것을 암시한다. OPG 에 연속적으로 노출시킨 배양물내에서 TRAP+ 세포, β3+ 세포, F480+ 세포 출현을 조사하는 시간 경과 실험으로, OPG 가 TRAP+ 및 β3+ 세포의 출현을 차단하지만 F480+ 세포의 출현은 차단하지 않는다는 것이 설명되었다. 대조적으로, TRAP+ 및 β3+ 세포는 대조 배양물을 확립(establishment) 배양한 후 4 일과 같이 일찍 나타나기 시작한다. F480+ 세포만이 OPG - 처리 배양에서 발견될 수 있으며, 질적으로 대조 배양물과 동일한 수로 존재한다고 여겨진다. 따라서, 시험관내 OPG 효과의 기작은, 단핵구 - 대식세포가 출현되는 단계를 지나, 그러나 TRAP 나 β3 인테그린을 발현시키는 세포가 출현되기 전 단계에서 파골세포 분화를 차단시키는 듯하다. 총괄하여, 이 발견은, OPG 가 골수로부터 단핵구 - 대식세포 전구체의 일반 성장 및 분화를 방해하지 않는다는 것을 나타내지만, 오히려 OPG 가 단핵구 - 대식세포 전구체로부터 파골세포의 선택적 분화를 특이하게 차단시킨다는 것을 시사해 주고 있다.
OPG 가 파골세포 분화 경로를 보다 특이하게 저해했을 때를 결정하기 위해, 변형된 시험관내 배양법을 이용하였다. 문헌(Lacey 등의 상기문헌 참조)에 기술되어 있는 이 변형법에서는 파골세포 전구체로서 골수 대식세포를 사용한다. CSF-1/M-CSF 와 함께 밤새 배양한 후 비점착 골수 세포를 취하고, 이 세포를 1,000 - 2,000 U/ml CSF-1 과 함께 4 일간 더 배양하여, 파골세포 전구체를 유도시킨다. 배양 4 일 후, 성장상 (growth phase)이라고 부르는 비점착 세포를 제거한다. 그런 다음 골수 대식세포인, 점착세포를 1,000 - 2,000 U/ml CSF-1 이 존재하는 다양한 처리에 2 일 동안 까지만 노출시킬 수 있다. 이 2 일의 기간을 중간 분화기라고 부른다. 그후, 이 세포층을 다시 세척하고 ST-2 세포(1 × 105 세포/ml), 덱사메타손(100 mM) 및 1,25 (OH)2 D3(10 nM)를 최종 8일간 가하는데, 이 기간을 종결 분화기라고 부른다. 이 종결 기간 중에 시험용 제제를 가할 수도 있다. 파골세포 분화의 표현형 표식자는 이 종결기간 중에 획득된다(Lacey 등의 동일문헌 참조). 중간 분화기, 종결 분화기 또는 택일적으로 이 두 분화기 중에 huOPG[22-401]-Fc(100 ng/ml)를 가하여 상기 모델로 파골세포 형성에 대한 효과를 시험하였다. TRAP 세포화학과 용액 검정을 수행하였다. 용액 검정 결과는 도 21 에 나타나 있다. huOPG[22-401]-Fc 는, 중간기와 종결기 둘 다에 가했을 때나 단지 종결 분화기에 가했을 때 TRAP 활성도의 출현을 저해하였다. 중간기에 가한 뒤 세척하여 배양물에서 제거시켰을 때, huOPG[22-401]-Fc는 배양 용균액 내 TRAP 활성도의 출현을 차단시키지 않았다. 세포화학 결과는 용액 검정 데이터와 유사하다. 총괄하여, 이 관찰은, huOPG[22-401]-Fc 가 파골세포 형성에 대한 억제효과 모두를 발휘하기 위해서는 단지 종결 분화기 중에 존재해야 할 필요가 있음을 나타낸다.
B. 생체내 lL1 - α 및 lL1 - β 항원투여 실험
마우스의 두개관 위에 lL1 을 피하주사하면 전신적으로 및 국소적으로 골 흡수를 증가시킨다[Boyce 등의 Endocrinology 125, 1142 - 1150 (1989) 참조]. 전신효과는 칼슘 과잉혈의 정도로 평가할 수 있고, 국소효과는 파골세포 - 매개 반응의 상대 크기로 조직학적으로 평가 할 수 있다. 이 실험의 목적은, lL1 과 동일한 두개관 부위 위에 재조합 muOPG[22-401]-Fc 를 피하주사했을 때 이 재조합 muOPG[22-401]-Fc 가 lL1 의 국소 및/또는 전신 작용을 변형시킬 수 있는 지를 결정하는 것이었다.
lL-1 β 실험
4 주 된 수컷 마우스들(lCR 스위스 화이트)을 다음 처리 군으로 나누었다(군당 5 마리 마우스) : 대조군 : lL1 처리 동물(2.5 ㎍의 lL1 - β 를 1 주사/일로 주입한 마우스) : 저투여량 muOPG [22-401]-Fc 처리 동물( 1 ㎍ 의 muOPG[22-401]-Fc 을 3 주사/일로 주입한 마우스) ; 저투여량 muOPG[22-401]-Fc 및 lL1 - β ; 고투여량 muOPG[22-401]-Fc 처리 동물(10 ㎍ muOPG[22-401]-Fc 을 3 주사/일로 주입한 마우스) ; 고투여량 muOPG[22-401]-Fc 및 lL1 - β. 활성인자나 아니면 부형제(인산염 완충 식염수내 0.1 % 소 혈청 알부민)를 상기와 동일한 총 수로 모든 마우스에 주입하였다. 최종 주입 후 그 날에 모든 군의 마우스들을 희생시켰다. 이 동물들을 희생시키기 바로 전에 lL1 제 1 주사전, 제 2 주사 후 4 시간, 제 3 주사 후 24 시간에서 체중 및 혈액 이온화 칼슘 수준을 측정한다. 희생된 후 두개관을 제거하여 파라핀 절편화시켰다.
lL1 - α 실험
4 주 된 수컷 마우스(ICR 스위스 화이트)을 다음 처리 군으로 나누었다(군당 5 마리 마우스) : 대조군 ; lL1 알파 처리 동물(5 ㎍ 의 lL1- 알파를 1 주사/일로 주입한 마우스) ; 저투여량 muOPG[22-401] -Fc 처리 동물(10 ㎍ 의 muOPG[22-401]-Fc 를 1 주사/일로 주입한 마우스) ; 저투여량 muOPG[22-401]-Fc 및 lL1 - 알파(상기와 같은 투여량) ; 고투여량 muOPG[22-401]-Fc 처리 동물(10 ㎍ muOPG[22-401]-Fc 를 3 주사/일로 주입한 마우스) ; 고투여량 muOPG[22-401]-Fc 및 lL1 - α. 활성인자나 부형제를 상기와 동일수의 주사/일로 모든 마우스들에 주입하였다. 최종 주입 후 그 날에 모든 군의 동물들을 희생시켰다. 동물들을 희생시키기 바로 전에, lL1 제 1 주사 전, 제 2 주사 후 4 시간 및 제 3 주사 후 24 시간에서 혈액 이온화 칼슘 수준을 측정하였다. 동물을 희생시키기 바로 전에, lL1 제 1 주사 전, 제 2 주사 후 4 시간 및 제 3 주사 후 24 시간에서 동물의 체중을 측정하였다. 희생된 후 두개관을 제거하여 파라핀 절편화시켰다.
조직학적 방법
두개관골 시료를 아연 포르말린으로 고정시키고, 포름산으로 탈회시키고, 에탄올을 통해 탈수시킨 다음 파라핀으로 슬라이드 제작하였다. 람다상 봉합에 인접한 두개관을 통해 절편(5 ㎛ 두께)을 절단하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색하거나, 아니면 산성주석산염 내성 포스파타제 활성도를 반작용시켜(시그마 키트 # 387A) 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 현미경 - 슬라이드 제작 카메라 루시다 부착물을 사용하는 디지티저 가압판(digitizor platen)으로 조직학적 특징을 추적함으로써 오스테오메저(미국 조지아 애틀랜타에 소재하는 오스테오메트릭스에서 구입)를 이용하는 조직형태학적 방법으로 lL1-α 처리 마우스에서의 골 흡수를 평가하였다. 두개관골의 골수강내 파골세포수, 파골 세포계 표면, 및 손상된 표면을 측정하였다. 두개관의 주입된 측과 비주입된 측을 따라 측정하였다.
결과
lL1-α 및 lL1-β 는 사용한 투여량에서, 특히 제 2 일째에 칼슘과잉혈을 초래하였는데, 이것은 아마도 전신적으로 골 흡수 증가가 유도되었기 때문일 것이다. 칼슘과잉혈 반응은 lL1-베타 처리 마우스내의 muOPG[22-401]-Fc 에 의해 차단되었고, lL1-알파로 처리한 마우스에서는 2 일째 가장 두드러진 효과가 상당히 감소되었다(도 22A - 22 B).
lL1-알파 및 베타로 처리한 마우스 두개관의 조직학적 분석은, 단지 lL1 처리만이 다음을 포함하는 골 흡수 지표를 두드러지게 증가시켰음을 나타낸다 : 파골세포수, 파골세포계 표면 및 손상된 표면(파골세포 작용으로 인해 깊은 가리비 모양을 나타내는 표면) (도 23 B, 표 2). lL1-α 나 lL1-β 에 반응하는 골 흡수 증가는 두개관의 주입된 측과 비주입된 측에 대해 유사하였다. muOPG [22-401]-Fc를 주입한 경우에 lL1-알파 및 베타 처리 마우스 둘 다에서 골 흡수는 감소되었으나 부형제만을 주입한 마우스에서는 이와 같은 감소가 단지 muOPG[22-401]-Fc 만이 주입된 두개관측에서만 보여졌다.
아마 이들 관찰에 대한 대부분의 설명은, muOPG[22-401]-Fc가 골 흡수를 저해한다는 것인데, 이와 같은 결론은 muOPG[22-401]-Fc 주사 부위에 근접한 두개관 부위에서 총 파골세포수와 골 흡수되는 유효 골 표면 백분율이 감소됨으로써 지지된다. 조직학에 의해, muOPG[22-401]-Fc 의 작용은 주로 국소적으로 정해진다고 여겨지나, muOPG[22-401]-Fc 역시 lL1 - 유도 칼슘과잉혈을 감소시키는데 이것은 muOPG[22-401]-Fc 가 전신적 골 흡수에 보다 더 미세한 효과를 나타낸다는 것을 시사하는 것이다.
C. 마우스 성장시 muOPG[22-401]-Fc 의 전신 효과
9.2 - 15.7 g 체중의 3-4 주 된 수컷 BDF1 마우스들을 군당 10 마리 마우스로 된 군들로 나누었다. 식염수 또는 muOPG [22-401]-Fc 2.5 mg/kg 을 1 일 2 회 14 일간 이들 마우스들에 피하주사하였다(5 mg/kg/일). 처리하기 전 7 일 및 14 일에 마우스들을 X 선 사진 촬영하였다. 최종 주사후 24 시간에서 마우스들을 희생시켰다. 우대퇴골을 제거하고, 아연 포르말린으로 고정시키고, 포름산으로 탈회시킨 다음 파라핀으로 포매(embed)시켰다. 말단 대퇴골간단과 대퇴골간의 중앙부를 통해 절편을 절단시켰다. 일차 및 이차 해면상을 통하여 대퇴골간내로, 성장판의 골간단 한계로부터 연장 되어 있는 6 개의 근접한 부위에서 조직형태학으로 골 밀도를 결정하였다. 각 부위는 0.5 × 0.5 ㎟ 였다.
X 선 사진 촬영 변화
처리 7 일 후, 대조에서 나타난 것과 비교하여 OPG 처리 마우스에서는 성장판과 결합되어 있는 해면상에 증가된 골 밀도 구역에 대한 증거가 존재하였다. 이 효과는 특히 말단 대퇴골 및 근위경골 중기에서 나타난다(도 24A - 24B). 그러나 증가된 밀도 띠 역시 척추체, 장골릉 및 단부경골에 나타났다. 14 일째에 비투과성 부위가 대퇴골 및 경골간내로 더 연장되었으나 방사선-비투과성의 세기는 감소하였다. 부가적으로, 이 실험이 완료되었을 때 대퇴골 길이의 차이나 실험 중에 길이의 변화는 없었는데, 이는 OPG 가 골 성장을 변화시키지 않는다는 것을 의미한다.
조직학적 변화
단부 대퇴골간단은 성장판으로부터 1.1 내지 2.65 mm 거리의 부위에서 증가된 골 밀도를 나타냈다(도 25 및 26A - 26B ). 이곳은 마우스에서 파골세포 - 매개 골 흡수에 의해 신속하게 제거된 골 부위이다. 빠르게 성장하는 이들 어린 마우스에서 OPG 처리로 관찰된 이 부위에서의 골 증가는 골 흡수의 저해와 일치한다.
D. 랫의 난소절제로 유도된 골 손실에 대한 오스테오프로테게린 효과
12 주 된 암컷 휘셔(Fisher) 랫을 난소절제하거나(OVX) 모의 수술하여 이중 X 선 흡수측정법(DEXA) 측정치는 단부 대퇴골간단의 골밀도로 나타냈다. 회복 3 일 후, 상기 동물들에 다음과 같이 14 일간 매일 주사하였다 : 10 마리의 모의 수술시킨 동물에 부형제(인산염 완충 식염수)를 주입하고 : 10 마리의 OVX 동물에게 부형제(인산염 완충 식염수)를 주입하고 : 6 마리의 OVX 동물에 OPG-Fc 5 mg/kg 을 주입하고 ; 6 마리의 OVX 동물에 파미드로네이트(PAM) 5 mg/kg 을 주입하고, 6 마리의 OVX 동물에 에스트로겐(ESTR) 40 ug/kg 를 주입하였다. 처리 7 일 및 14 일 후 상기 동물들은 DEXA 에 의해 측정된 골 밀도를 가졌다. 최종 주사 후 2 일째에 동물들을 희생시켜 우경골과 대퇴골을 조직학적 평가를 위해 제거하였다.
골 밀도의 DEXA 측정치는 OPG-Fc 에 의해 차단되는, 난소절제에 따른 골 밀도 감소 경향을 나타냈다. 그것의 효과는 공지되어 있는 항흡수제인 에스트로겐 및 파미드로네이트와 유사하였다(도 27). 조직형태학 분석으로, 골 밀도를 초래하는 OPG-Fc 처리를 수반하는 이 관찰이 비처리 OVX 랫에서 보여지는 골 밀도 보다 OVX 랫에서 상당히 더 높았음이 확인되었다(도 28). 이 결과는 골 손실시 OPG 의 활성도가 난소절제후 내인성 에스트로겐이 중지되는 것과 관련된다는 것을 입증한다.
생체내 요약
재조합 OPG 의 생체내 작용은 OPG 형질전환 마우스에서 보여지는 변화와 유사하다. OPG 형질전환 동물에서 보여졌던 파골세포수의 감소는, 정상 마우스 및 lL1-α 나 lL1-β 로 처리한 마우스 둘 다에 있어 두개관 위로 재조합 OPG 를 국소적으로 주사함으로써 재생된다. OPG 형질전환 마우스는 태어난 지 1 일 후에 성장판으로부터 연장되는 골 및 재편성되지 않은 연골을 갖는 골수강의 진행성 충진을 수반하는 골화석증 표현형을 발생시킨다. 3주 된 정상(성장하는)마우스에 OPG 를 처리하면 역시 연골내 골 형성 부위에 골 및 재편성되지 않은 연골이 생성되는데, 그 효과를 방사선 사진 촬영법으로 관찰하고 조직학적으로 확인하였다. 따라서, 재조합 OPG 는 상기 형질전환 동물에서 보여진 변화와 유사하게 정상 동물에서 표현형 변화를 야기하는데 이 변화는 OPG - 유도의 골 흡수 저해와 일치한다. 파골세포 형성의 시험관내 검정을 기초로 하면, 이와 같은 저해의 상당 부분은 손상된 파골세포 형성에 기인한다. 이러한 가설과 일치하여, OPG 는 랫에서 난소절제 - 유도성 골다공증을 차단시킨다. 이 모델에서의 골 손실은 활성화된 파골세포에 의해 매개된다고 알려져 있는데, 이는 OPG 에 대한 역할이 일차 골다공증을 치료하는 것임을 시사한다.
실시예 12
OPG 의 폴리에틸렌 글리콜화 유도체
환원성 알킬화에 의한 N - 말단 PEG-OPG 결합체 제조
huOPG met[22-194]P25A 를 25 - 50 mM NaOAc, pH 4.5 - 4.8 로 완충액 교환시키고 2 - 5 mg/ml 로 농축하였다. 이 용액을 5 - 7 ℃ 에서 단기능 PEG 알데히드와 함께 OPG 환원성 알킬화를 구성시키는데 사용하였다. 선형 또는 분지된 형태이고, MW = 1 - 57 kDa 인 PEG 단기능 알데히드(시어워터 폴리머즈에서 구입)를 고체 상태로, OPG 의 몰당 2 - 4 몰의 PEG 알데히드를 구성시키는 양으로 상기 OPG 용액에 가하였다. 이 단백질 용액내에 중합체를 용해시킨 후, 차가운 탈염수 내 1 - 1.6 M 의 신선하게 제조된 저장용액으로 된 반응 혼합물내에서 15 - 20 mM 의 최종농도가 되도록 소디움 시아노보로하이드리드를 가하였다. 반응을 진행시킨 다음 G3000 SWXL 칼럼 (토소 해스에서 구입)상의 크기 배제 HPLC 를 사용하여 100 mM NaPO4, 0.5 M NaCl, 10 % 에탄올, pH 6.9 로 용리시켜 OPG 폴리에틸렌 글리콜화 정도를 모니터링하였다. 전형적으로 16 - 18 시간 동안 반응이 진행되도록 한 후, 그 반응 혼합물을 6 - 8 배 희석시키고 pH 를 3.5 - 4 로 낮추었다. 이온 교환 크로마토그래피(HP SP 하이로드 16/10, 파마시아에서 구입)를 이용하여, 30 cm/h 의 유속, 25 칼럼 부피 이상, 0.75 M NaCl 까지의 선형구배의 20 mM NaOAc pH 4 로 용리시켜 반응 혼합물을 분획화하였다. 모노-, 디- 또는 폴리- 폴리에틸렌 글리콜화된 OPG 분획들을 풀로 만들어 SEC HPLC 및 SDS -PAGE 로 특정화하였다. 대부분의 경우에 주요 반응 산물인, 모노PEG-OPG 결합체가 98 % N - 말단 PEG - 변형 OPG임을 N - 말단 서열결정하여 결정하였다.
이 방법은 다음 N - 말단 PEG-OPG 결합체(여기서 OPG 는 HuOPG met[22-194]P25A 임)를 제조하는데 일반적으로 사용하였다 : 5 kD 모노PEG, 10 kD 모노 분지 PEG, 12 kD 모노 PEG, 20 kD 모노 PEG, 20 kD 모노 분지 PEG, 25 kD 모노 PEG, 31 kD 모노 PEG, 57 kD 모노 PEG, 12 kD 디 PEG, 25 kD 디 PEG, 31 kD 디 PEG, 57 kD 디 PEG, 25 kD 트리 PEG.
아실화에 의한 PEG-OPG 결합체 제조
huOPG met[22-194]P25A 를 50 mM BICINE 완충액, pH 8 로 완충액 교환시키고 2 - 3 mg/ml 로 농축하였다. 이 용액을, 실온에서 단기능 PEG N - 히드록시숙시니디딜 에스테르와 함께 OPG 아실화를 구성시키는데 사용하였다. 선형이나 분지된 형태이고, MW = 1 - 57 kDa인 PEG N - 히드록시숙시니미딜 에스테르(시어워터 폴리머즈에서 구입)를 고체 상태의, OPG 몰당 4 - 8 몰의 PEG N - 히드록시숙시니미딜 에스테르를 구성시키는 양으로 상기 OPG 용액에 가하였다. 반응을 진행시킨 다음, G3000SWXL 칼럼(토소 해스에서 구입)상의 크기 배제 HPLC 를 사용하여 100 mM NaPO4, 0.5 M NaCl, 10 % 에탄올, pH 6.9 로 용리시켜 OPG 폴리에틸렌 글리콜화 정도를 모니터링하였다. 전형적으로 1 시간 동안 반응이 진행되도록 한 후 이 반응 혼합물을 6 - 8 배 희석시키고 pH 를 3.5 - 4 로 낮추었다. 이온 교환 크로마토그래피( HP SP 하이로드 16/10, 파마시아에서 구입)를 사용하여, 30 cm/h 의 유속, 25 칼럼 부피 이상, 0.75 M NaCl 까지의 선형구배로서 20 mM NaOAc, pH 4 로 용리시켜 반응 혼합물을 분획화하였다. 모노-, 디- 또는 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 OPG 분획들을 풀로 만들어 SEC HPLC 및 SDS - PAGE 로 특정화하였다.
이 방법은 다음 PEG - OPG 결합체를 제조하는데 일반적으로 사용하였다 : 5 kD 폴리PEG , 20 kD 폴리PEG, 40 kD 폴리 분지 PEG, 50 kD 폴리PEG.
이량체 PEG - OPG 제조
티올화(thiolation)용으로 huOPG met[22-194]P25A 를, 거의 중성인 pH 의 인산염 완충액내 1-3 mg/ml 로 준비한다. pH 를 7.0 으로 유지시키는 동안 S - 아세틸 머캅토숙신산 무수물(AMSA) 를 3-7 배 몰 과량으로 가하고 4 ℃ 에서 2 시간 동안 반응물을 교반시켰다. 모노티올화된 OPG 를 비변형되고 폴리티올화된 OPG 로부터 이온 교환 크로마토그래피하여 분리하고, 보호된 티올은 히드록실아민으로 처리하여 탈보호시킨다. 탈보호시킨 후, 히드록실아민을 겔 여과하여 제거하고 결과적으로 생성된 모노티올화된 OPG 를 다양한 티올 특이 교차결합 화학에 실시시킨다. 이황화물 결합된 이량체를 생성시키기 위해, 티올화된 OPG > 1 mg/ml 를 약간의 염기성인 인산염 완충액으로 투석하여 공기중 산화되도록 한다. 비스 - 말레이미드 교차결합제인, N, N - 비스(3 - 말레이미도 프로피아닐)-2-히드록시 1, 3 프로판과 > 1 mg/ml 의 상기 티올화된 OPG 를 0.6 × 몰 비율의 교차결합제 : OPG 로 pH 6.5의 인산염 완충액내에 반응시킴으로써 공유결합 티오에테르 OPG 이량체를 제조하였다. 유사하게, 비스 - 말레이미드 PEG 교차결합체와 > 1 mg/ml 티올화된 OPG 의 아화학량론적 양을 pH 6.5 의 인산염 완충액내에 반응시킴으로써 PEG 아령체(dumbbell)를 생성시킨다. 상기 이량체 결합체 중 어느 결합체도 이온 교환 크로마토그래피나, 아니면 크기 배제 크로마토그래피로 더 정제할 수 있다.
상기 방법을 사용하여 제조한 이량체 PEG-OPG 결합체(여기서 OPG 는 huOPG met[22-194]P25A 이다)에는 이황화물 결합된 OPG 이량체, 지방족 아민형 교차결합체를 수반한 공유결합 티오에테르 OPG 이량체, 3.4 kD 및 8 kD PEG 아령체 및 모노벨(monobell)이 포함된다.
PEG-OPG 결합체를, 실시예 11A 에 기술되어 있는 파골세포 성숙 검정을 이용하여 시험관내 활성도에 대해 시험하며, 실시예 11C에 기술되어 있는 바와 같이 마우스내 주사 후 증가된 골 밀도를 측정함으로써 생체내 활성도에 대해 시험하였다. 생체내 활성도는 하기 표 3 에 나타나 있다.
본 발명은 바람직한 실시구체형태로 기술되어 있으나, 이 기술된 실시구체형태로 제한하려는 것이 아니라, 첨부된 특허청구의 범위의 진의 및 범위 내에 포함되는 다양한 변형을 및 등가물을 포함하고자 하는 것으로, 여기서 범위란 상기 모든 변형물 및 등가물을 포함시키기 위 한 가장 광범위한 해석이다.
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Claims (58)

  1. OPG 의 생물학적 활성도 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩티드를 코드하는, 다음 중 하나 또는 그 이상에서 선택한 분리한 핵산
    (a) 도 2B - 2C(서열번호 : 120), 도 9A - 9B(서열번호 : 122) 또는 도 9C - 9D(서열번호 : 124)에 나타나 있는 핵산 또는 이의 상보적 가닥 ;
    (b) 도 2B - 2C(서열번호 : 120), 도 9A - 9B(서열번호 : 122) 또는 도 9C - 9D(서열번호 : 124)에 나타나 있는 잔기 1 - 401 또는 22 - 401 을 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 ; 또는
    (c) 도 2B - 2C(서열번호 : 120), 도 9A - 9B(서열번호 : 122) 또는 도 9C - 9D(서열번호 : 124)에 나타나 있는 적어도 잔기 22 - 185 를 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산.
  2. 제 1 항에 있어서, 핵산은 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 임을 특징으로 하는 핵산.
  3. 제 1 항의 핵산에 의해 코드되는 폴리펩티드.
  4. 제 1 항에 있어서, 핵산은 E.coli 발현을 위한 코돈을 하나 또는 그 이상 함유함을 특징으로 하는 핵산.
  5. 제 1 항에 있어서, 핵산에 부착되는 검출가능한 표식을 가짐을 특징으로 하는 핵산.
  6. 제 1 항에 있어서, 핵산은 도 2B - 2C(서열번호 : 120), 도 9A - 9B(서열번호 : 122) 또는 도 9C - 9D(서열번호 : 124)의 폴리펩티드 - 코딩 영역을 포함함을 특징으로 하는 핵산.
  7. 제 6 항에 있어서, 핵산은 도 9C - 9D(서열번호 : 124)의 누클레오티드 158 - 1297 에 나타나 있는 서열을 가짐을 특징으로 하는 핵산.
  8. 제 1 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 핵산은 도 9C - 9D(서열번호 : 124)에 나타나 있는 폴리펩티드 - 코딩 영역을 포함함을 특징으로 하는 발현 벡터.
  10. 제 8 항의 발현 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킨, 인체세포를 제외한 숙주 세포.
  11. 제 10 항에 있어서, 숙주 세포는 진핵 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  12. 제 11 항에 있어서, 숙주 세포는 CHO, COS, 293, 3T3, CV - 1 및 BHK 세포 중에서 선택함을 특징으로 하는 숙주 세포.
  13. 제 10 항에 있어서, 숙주 세포는 원핵 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  14. 제 13 항에 있어서, 숙주 세포는 E. coli 임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  15. 제 8 항의 발현 벡터를 포함하는 인체를 제외한 형질전환 포유동물.
  16. 제 15 항에 있어서, 포유동물은 설치류임을 특징으로 하는 형질전환 포유동물.
  17. 제 16 항에 있어서, 포유동물은 마우스임을 특징으로 하는 형질전환 포유동물.
  18. 제 1 항의 핵산으로 형질전환시키거나 형질감염시킨 숙주 세포를 영양 조건하에서 성장시키고, 이 핵산의 폴리펩티드 발현 산물을 분리함을 포함하는 OPG 의 생산방법.
  19. 다음 중 하나 또는 그 이상에서 선택한 아미노산 서열을 포함하며 골 밀도를 증가시키거나 골 흡수를 저해하는 분리정제한 OPG 폴리펩티드
    (a) 도 2B - 2C(서열번호 : 121), 도 9A - 9B(서열번호 : 123) 또는 도 9C - 9D(서열번호 : 125)의 잔기 1 - 401 또는 잔기 22 - 401 에 나타나 있는 아미노산 서열 ; 및
    (b) 적어도 잔기 22 - 185 를 포함하는 도 2B - 2C(서열번호 : 121), 도 9A - 9B(서열번호 : 123) 또는 도 9C - 9D(서열번호 : 125)에 나타나 있는 아미노산 서열.
  20. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드는 포유동물의 OPG 임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  21. 제 20 항에 있어서, 폴리펩티드는 인체 OPG 임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  22. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드는 다른 인체 단백질을 포함하지 않음을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  23. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드는 도 9C - 9D(서열번호 : 125)의 잔기 22 - 401 에 나타나 있는 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  24. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드는 도 9C - 9D(서열번호 : 125)의 잔기 32 - 401 에 나타나 있는 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  25. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드는 외인성 DNA 서열의 발현 산물임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  26. 제 25 항에 있어서, DNA 는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA 임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  27. 제 19 항에 있어서, 폴리펩티드는 수용성 중합체로 변형시킴을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  28. 제 27 항에 있어서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  29. 종양 괴사 인자 수용체 세포와 영역의 시스테인 풍부 도메인을 특징으로 하는 네 개의 시스테인 풍부 도메인을 포함하는 적어도 164 개의 아미노산으로 이루어진, 도 2B - 2C(서열번호 : 121), 도 9A - 9B(서열번호 : 123) 또는 도 9C - 9D(서열번호 : 125)에 나타나 있는 아미노산 서열의 부분 또는 전체인 아미노산 서열, 및
    골밀도 증가 활성도
    를 포함하는 폴리펩티드.
  30. 잔기 22 에 아미노 말단을 갖는 도 2B - 2C(서열번호 : 121), 도 9A - 9B(서열번호 : 123) 또는 도 9C - 9D(서열번호 : 125)에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하되, 카르복시 말단으로부터 1 내지 216개의 아미노산이 결실된 폴리펩티드.
  31. 제 30 항에 있어서, 폴리펩티드는 잔기 22 - 185, 22 - 189, 22 - 194 또는 22 - 201 모두의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  32. 제 31 항에 있어서, 폴리펩티드는 카르복시 말단으로부터 연장된 인체 lgG1 의 Fc 영역을 더 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  33. 잔기 22 에 아미노 말단을 갖는 도 2B - 2C(서열번호 : 121), 도 9A - 9B(서열번호 : 123) 또는 도 9C - 9D(서열번호 : 125)에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함하되, 아미노 말단으로부터 1 내지 10 개의 아미노산이 결실되고, 카르복시 말단으로부터 1 내지 216 개의 아미노산이 결실된 폴리펩티드.
  34. 제 33 항에 있어서, 폴리펩티드는 잔기 27 - 185, 27 - 189, 27 - 194, 27 - 401 또는 32 - 401 모두의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  35. 제 34 항에 있어서, 폴리펩티드는 카르복시 말단으로부터 연장된 인체 lgG1 의 Fc 영역을 더 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  36. 다음 중에서 선택한 폴리펩티드
    huOPG [22 - 201] - Fc
    huOPG [22 - 401] - Fc
    huOPG [22 - 180] - Fc
    huOPG met [22 - 401] - Fc
    huOPG Fc - met [22 - 401]
    huOPG met [22 - 185]
    huOPG met [22 - 189]
    huOPG met [22 - 194]
    huOPG met [27 - 185]
    huOPG met [27 - 189]
    huOPG met [27 - 194]
    huOPG met [32 - 401]
    huOPG met - lys [22 - 401]
    huOPG met [22 - 401]
    huOPG met [22 - 401] - Fc (P25A)
    huOPG met [22 - 401](P25A)
    huOPG met [22 - 401](P26A)
    huOPG met [22 - 401](P26D)
    huOPG met [22 - 194](P25A)
    huOPG met [22 - 194](P26A)
    huOPG met met - (lys)3 [22 - 401] 및
    huOPG met met - arg - gly - ser - (his)6 [22 - 401].
  37. 제 36 항의 폴리펩티드를 코드하는 핵산.
  38. 제 19 항의 OPG 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 이의 단편.
  39. 제 38 항에 있어서, 항체는 단클론성 항체임을 특징으로 하는 항체.
  40. OPG 에 항체가 결합하는 조건하에서 제 38 항의 항체와 함께 시료를 항온하고 결합된 항체를 검출함을 포함하는, 생물학적 시료내 OPG 의 존재 검출방법.
  41. 결합 조건하에서 후보 물질과 함께 제 19 항의 OPG 폴리펩티드를 항온하고, 결합된 물질을 측정함을 포함하는, 상기 OPG 에 결합하는 후보 물질의 활성도 평가방법.
  42. 제 1 항의 핵산으로 동물을 변이시킴를 포함하는, 인체를 제외한 동물에서의 제 3 항의 OPG 폴리펩티드 수준 조절방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 핵산은 조직내 OPG 수준의 증가를 촉진시킴을 특징으로 하는 조절방법.
  44. 약학적으로 용인가능한 담체, 보조제, 가용화제, 안정화제 및 항산화제 중 하나 또는 그 이상내에 치료학적 유효량의 제 19 항의 OPG 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, OPG 는 인체 OPG 임을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제 44 항에 있어서, OPG 는 도 9B 에 나타나 있는 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제 19 항의 OPG 폴리펩티드를 포함하는 오스테오프로테게린 단량체로 이루어진, 골 밀도를 증가시키거나 골 흡수를 저해하는 오스테오프로테게린 다량체.
  48. 제 47 항에 있어서, 다량체는 이량체임을 특징으로 하는 다량체.
  49. 제 47 항에 있어서, 다량체는 사슬간 이황화물 결합에 의해 형성됨을 특징으로 하는 다량체.
  50. 제 47 항에 있어서, 다량체는 인체 lgG1 으로부터 유도된 Fc 영역의 결합에 의해 형성됨을 특징으로 하는 다량체.
  51. 제 47 항에 있어서, 다량체는 오스테오프로테게린 단량체 및 불활성 다량체를 포함하지 않음을 특징으로 하는 다량체.
  52. 제 47 항에 있어서, 단량체는 도 9C - 9D(서열번호 : 125)의 잔기 22 - 401 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 다량체.
  53. 제 47 항에 있어서, 단량체는 도 9C - 9D(서열번호 : 125)의 잔기 22 - 194 에 나타나 있는 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 다량체.
  54. 치료학적 유효량의 제 19 항의 OPG 폴리펩티드를 포함하는 골질환 치료용 약학적 조성물.
  55. 제 54 항에 있어서, 폴리펩티드는 인체 OPG 임을 특징으로 하는 조성물.
  56. 제 54 항에 있어서, 골질환은 과도한 골손실임을 특징으로 하는 조성물.
  57. 제 56 항에 있어서, 골질환은 골다공증, 골의 파제트병, 칼슘과잉혈증, 부갑상선기능항진증, 스테로이드 - 유도 골감소증, 류마티스성 관절염에서 기인하는 골손실, 골수염에서 기인하는 골손실, 골용해성 전이 및 치근막 골손실 중에서 선택함을 특징으로 하는 조성물.
  58. 제 54 항에 있어서, 조성물은 골발생 단백질인 BMP - 1 내지 BMP - 12, TGF - β 군 요소, lL - 1 저해제, TNFα 저해제, 부갑상선 호르몬 및 그 유사체, 부갑상선 호르몬 관련 단백질 및 그 유사체, E 시리즈 프로스타글란딘, 비스포스포네이트 및 골 - 촉진 미네랄 중에서 선택한 물질의 치료학적 유효량을 더 포함함을 특징으로 하는 조성물.
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