BR112014024398B1 - Polipeptídeo que se liga ao rankl humano, composições terapêuticas compreendendo o dito polipeptídeo, ácido nucleico isolado, vetor de expressão e uso terapêutico do dito polipeptídeo - Google Patents

Abstract

composição derivada de osteoprotegerina e uso desta uma composição terapêutica é descrita que pode ser usada para o tratamento ou prevenção de doenças em associação com reabsorção óssea, particularmente de um carcinoma metastático. em certos aspectos, a composição é fundamentada em um polipeptídeo que inclui os 215 aminoácidos principais da osteoprotegerina humana seguido pela porção fc da proteína igg1 humana. vetores de expressão e sistemas de expressão de dna para superproduzir o polipeptídeo em células mamíferas também são produzidos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]Em geral, a invenção refere-se ao campo de produtos farmacêuticos biológicos assim como seu uso em condições associadas com reabsorção óssea, por exemplo, em oncologia. Mais especificamente, a invenção refere-se a uma composição derivada de osteoprotegerina que se liga ao ativador do receptor de ligando NF-capaB (RANKL).

FUNDAMENTOS

[002]Os métodos descritos nesta seção podem ser adotados, e não são necessariamente métodos que foram previamente concebidos ou adotados. Portanto, a menos que de outro modo indicado, não deve ser considerado que qualquer um dos métodos descritos nesta seção qualifica-se como da técnica anterior, meramente em virtude de sua inclusão nesta seção.

[003]Osteoprotegerina humana (OPG; GenBank: U94332.1) é uma proteína de 401 aminoácidos que contém um peptídeo de sinal de 21 aminoácidos, que é clivado antes do ácido glutâmico 22 dando origem a uma proteína solúvel madura de 380 aminoácidos. OPG é um membro da família do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR), compreendendo quatro domínios semelhantes a TNFR ricos em cisteína em sua porção N-terminal. OPG mostrou ter um papel no desenvolvimento do osso, e camundongos carecendo do gene de OPG tiveram um fenótipo osteoporótico e anormalidades esqueléticas brutas.

[004]OPG, que é produzida por osteoblastos e células estromais da medula óssea, age como um receptor de proteção secretado sem nenhuma função de sinalização direta aparente. OPG age ligando-se ao seu ligando natural-ligando de osteoprotegerina (OPGL), que também é conhecido como RANKL (ativador do receptor de ligando NF-capaB). A ligação entre OPG e RANKL impede RANKL de ativar seu RANK de receptor cognato, que é um receptor de osteoclasto vital para a diferenciação, ativação e sobrevivência do osteoclasto.

[005]OPG recombinante existe em formas monoméricas e diméricas de pesos moleculares aparentes de cerca de 55 kDa e cerca de 110 kDa, respectivamente. O truncamento do domínio N-terminal à resíduo de cisteína 185 resulta na inativação de OPG, presumivelmente rompendo-se uma ligação de dissulfeto do domínio semelhante a TNFR, ao passo que o truncamento da porção C-terminal da proteína ao resíduo 194 não altera a atividade biológica.

[006]A superexpressão de OPG em camundongos transgênicos leva à osteopetrose profunda caracterizada por uma carência quase completa de osteoclastos nos camundongos. Reciprocamente, a ablação do gene de OPG causa osteoporose severa em camundongos, indicando um papel fisiológico importante de OPG em regular a reabsorção óssea. A secreção de OPG e RANKL dos osteoblastos e células estromais é regulada por numerosos hormônios e citocinas. Os níveis relativos de produção de OPG e RANKL são considerados controlar a extensão da reabsorção óssea: a expressão de RANKL aumenta a reabsorção óssea, ao passo que OPG em excesso tem o efeito oposto. OPG recombinante bloqueia os efeitos da grande maioria dos fatores que estimulam os osteoclastos, in vitro e in vivo. OPG também inibe a reabsorção óssea em uma variedade de modelos de doença em animais, incluindo ovariectomia, osteoporose induzida, hipercalcemia humoral de malignidade, e metástase óssea experimental. Portanto, OPG poderia representar uma opção terapêutica eficaz para doenças associadas com a atividade de osteoclasto excessiva (Kostenuik PJ, Shalhoub V., Curr Pharm Des. Meio de 2001;7(8):613 - 35).

[007]Denosumab é um anticorpo monoclonal completamente humano de afinidade alta que se liga a RANKL humano e inibe suas interações com RANK, tendo assim uma similaridade ao modo de ação de OPG. Denosumab sob o nome comercial Prolia foi aprovado por U.S. Food and Drug Administration (FDA) para a prevenção e tratamento de osteoporose em mulheres pós-menopáusicas. Denosumab sob o nome comercial Xgeva foi aprovado por U.S. Food and Drug Administration (FDA) para a prevenção de eventos esqueléticos relacionados em pacientes com metástases ósseas de tumores sólidos. Outras experiências clínicas de denosumab para outras condições relacionadas à remodelagem óssea estão correntemente em andamento, isto é para metástases ósseas de outras formas de câncer.

[008]Portanto, seria desejável ter uma composição terapêutica que é capaz de ligar-se a RANKL e é fundamentada na molécula de OPG que ocorre naturalmente, que, embora tendo um perfil farmacológico aceitável, tem um potencial terapêutico mais amplo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009]Este sumário é fornecido para introduzir uma seleção de conceitos em uma forma simplificada que são descritos ainda abaixo na Descrição Detalhada. Este sumário não é intencionado a identificar aspectos chaves ou aspectos essenciais do assunto reivindicado, nem deve ser intencionado a ser usado como um auxiliar em determinar o escopo do assunto reivindicado.

[010]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração um polipeptídeo que se liga a RANKL humano. O polipeptídeo compreende uma primeira sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 1 a 215 de osteoprotegerina humana (GenBank: U94332.1). O polipeptídeo compreende ainda uma segunda sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 103 a 329 de Fc de imunoglobulina humana gama-1 (GenBank: J00228.1). O polipeptídeo pode ser capaz de inibir a diferenciação de osteoclasto induzida por RANKL em um ensaio in vitro com base em célula com uma EC50 de cerca de 50 ng/ml ou a não mais do que 10 % em uma concentração de 100 ng/ml. O polipeptídeo pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 1.

[011]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração uma composição terapêutica. A composição compreende um polipeptídeo que se liga a RANKL humano. O polipeptídeo compreende uma porção biologicamente ativa de osteoprotegerina humana e uma porção Fc de imunoglobulina humana gama-1. O polipeptídeo é substancialmente purificado a uma forma homodimérica em solução. O polipeptídeo pode exibir uma meia-vida na circulação sistêmica em camundongos de pelo menos 80 horas depois de uma administração subcutânea em uma dose de 5 mg/kg. O polipeptídeo pode ser capaz de inibir substancialmente a lise óssea induzida por câncer de mama humano em um modelo lítico do osso de murino por pelo menos 6 semanas em um curso de administração subcutânea da dita composição em uma dose de não mais do que 1 mg/kg três vezes por semana.

[012]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração uma composição terapêutica. A composição compreende uma primeira sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 1 a 215 de osteoprotegerina humana. O polipeptídeo compreende ainda uma segunda sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 103 a 329 de Fc de imunoglobulina humana gama- 1. O polipeptídeo pode estar em uma forma substancialmente purificada a uma forma homodimérica em solução. O polipeptídeo pode exibir uma meia-vida na circulação sistêmica em camundongos de pelo menos 80 horas depois de uma administração subcutânea em uma dose de 5 mg/kg. O polipeptídeo pode ser capaz de inibir substancialmente a lise óssea induzida por câncer de mama humano em um modelo lítico do osso de murino por pelo menos 6 semanas em um curso de administração subcutânea da dita composição em uma dose de não mais do que 1 mg/kg três vezes por semana. O polipeptídeo pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 1.

[013]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo que se liga a RANKL humano. O polipeptídeo compreende uma primeira sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 1 a 215 de osteoprotegerina humana. O polipeptídeo compreende ainda uma segunda sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 103 a 329 de Fc de imunoglobulina humana gama-1. A primeira sequência de aminoácido no polipeptídeo pode preceder a segunda sequência de aminoácido. O polipeptídeo pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 1. O ácido nucleico pode ter seu uso de códon otimizado para a expressão alta do polipeptídeo em uma célula mamífera. O ácido nucleico pode compreender a sequência da SEQ ID NO. 2. O ácido nucleico pode compreender um vetor de expressão.

[014]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração um sistema de expressão heterólogo. O sistema de expressão abriga um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que se liga a RANKL humano. O polipeptídeo compreende uma primeira sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 1 a 215 de osteoprotegerina humana. O polipeptídeo compreende ainda uma segunda sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 103 a 329 de Fc de imunoglobulina humana gama-1. A primeira sequência de aminoácido no polipeptídeo pode preceder a segunda sequência de aminoácido. O polipeptídeo pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 1. O vetor de expressão do sistema de expressão pode ser abrigado em uma célula mamífera. A célula mamífera pode ser uma célula de ovário de hamster chinês (CHO). O nível de expressão do polipeptídeo no sistema de expressão pode ser pelo menos 125 mg por litro de cultura celular.

[015]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração um uso de uma substância para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença associada com reabsorção ou remodelagem óssea. A substância compreende um polipeptídeo que se liga a RANKL humano. O polipeptídeo compreende uma primeira sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 1 a 215 de osteoprotegerina humana. O polipeptídeo compreende ainda uma segunda sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 103 a 329 de Fc de imunoglobulina humana gama-1. A primeira sequência de aminoácido no polipeptídeo pode preceder a segunda sequência de aminoácido. O polipeptídeo pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 1. A doença associada com reabsorção ou remodelagem óssea pode ser um carcinoma, um câncer de mama, um câncer de próstata, mieloma múltiplo, um sarcoma ósseo, metástases ósseas devido a tumores sólidos, osteoporose, artrite reumatoide, ou artrite psoriática.

[016]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração um método de tratar ou prevenir uma doença associada com reabsorção ou remodelagem óssea. O método compreende administrar a um paciente em necessidade de tratar ou prevenir uma doença associada com reabsorção ou remodelagem óssea uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo que se liga a RANKL humano. O polipeptídeo compreende uma primeira sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 1 a 215 de osteoprotegerina humana. O polipeptídeo compreende ainda uma segunda sequência de aminoácido compreendendo os aminoácidos 103 a 329 de Fc de imunoglobulina humana gama-1. A primeira sequência de aminoácido no polipeptídeo pode preceder a segunda sequência de aminoácido. O polipeptídeo pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 1. A doença associada com reabsorção ou remodelagem óssea pode ser um carcinoma, um câncer de mama, um câncer de próstata, mieloma múltiplo, um sarcoma ósseo, metástases ósseas devido a tumores sólidos, osteoporose, artrite reumatoide, ou artrite psoriática.

[017]Estes e outros aspectos e vantagens da invenção descrita aqui tornar- se-ão evidentes em consideração das Figuras e descrição detalhada abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[018]Os desenhos e descrições seguintes são fornecidos para auxiliar no entendimento da invenção:

[019]A Figura 1 mostra esquematicamente o mapa do plasmídeo pCDNA4-Fc e a sequência anotada usada na clonagem dos polipeptídeos da presente invenção;

[020]A Figura 2 mostra esquematicamente o mapa do plasmídeo pKN002 e a sequência anotada usada na clonagem dos polipeptídeos da presente invenção;

[021]A Figura 3 mostra curvas de crescimento de transfecção representativas obtidas no processo de gerar célula estável revestida para expressar os polipeptídeos da presente invenção;

[022]A Figura 4 mostrou um cromatograma analítico de HPLC de exclusão por tamanho da amostra contendo o polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 depois da etapa de purificação por cromatografia de troca aniônica;

[023]A Figura 5 mostrou uma análise de SDS-PAGE (sob condições de redução) da amostra contendo polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 depois da etapa de purificação por cromatografia de troca aniônica;

[024]A Figura 6 mostrou uma eluição por cromatografia de hidroxilapatita perfilada mostrando resolução superior da amostra contendo polipeptídeo da SEQ ID NO. 1;

[025]A Figura 7 mostrou um cromatograma analítico de HPLC de exclusão por tamanho da amostra do pico principal do eluato contendo o polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 da cromatografia de hidroxilapatita;

[026]A Figura 8 mostra imagens de raio X das tíbias de camundongos representativos do grupo 1 (administração s.c. de tampão de formulação) em oito semanas pós-inoculação usadas para avaliação da lise óssea (contagens designadas são indicadas abaixo de cada imagem);

[027]A Figura 9 mostra imagens de raio X das tíbias de camundongos representativos do grupo 2 (administração s.c. de polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 em 1 mg/kg) em oito semanas pós-inoculação usadas para avaliação da lise óssea (contagens designadas são indicadas abaixo de cada imagem);

[028]A Figura 10 mostra imagens de varredura microCT bidimensionais para um camundongo representativo em cada um dos grupos 1, 2 e 5; e

[029]A Figura 11 mostra imagens de varredura microCT tridimensionais para um camundongo representativo em cada um dos grupos 1, 2 e 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[030]Os ensinamentos divulgados aqui são fundamentados, em parte, na engenharia de uma molécula de proteína compreendendo uma porção N-terminal biologicamente ativa de OPG que é fundida à porção Fc de uma IgG humana. Para permitir a produção recombinante de tal molécula de proteína derivada de OPG, um vetor de expressão de DNA foi construído para superproduzir a molécula de proteína em um sistema de expressão de proteína heterólogo, e células mamíferas foram preparadas estavelmente expressando a molécula de proteína a um nível de expressão alto. Inesperadamente, a molécula de proteína da fonte recombinante formou homodímeros e homotetrâmeros em solução. Um procedimento de purificação de proteína foi desenvolvido permitindo-se obter uma preparação homodimérica substancialmente pura fisiologicamente relevante da molécula de proteína. A molécula de proteína assim purificada demonstra um grau alto de inibição da diferenciação de osteoclasto induzida por RANKL em um ensaio in vitro com base em célula relevante. Inesperadamente, a molécula de proteína exibe um perfil farmacocinético aceitável na administração subcutânea ao animal, enquanto não mostrando qualquer toxicidade ou imunogenicidade adversas. A molécula de proteína também demonstra um grau alto de eficácia em um modelo animal preditivo de metástase óssea induzida por câncer de mama humano.

[031]Os termos usados neste relatório descritivo geralmente têm seus significados habituais na técnica, dentro do contexto desta invenção e no contexto específico onde cada termo é usado. Certos termos são debatidos abaixo ou em qualquer lugar no relatório descritivo, para fornecer orientação adicional ao profissional em descrever as composições e métodos da invenção e como prepará- los e usá-los. O escopo ou significado de qualquer uso de um termo estará evidente a partir do contexto específico no qual o termo é usado. “Cerca de” e “aproximadamente” devem significar geralmente um grau de erro aceitável para a quantidade medida dada a natureza ou precisão das medições. Tipicamente, graus de erro exemplares estão dentro de 20 por cento (%), preferivelmente dentro de 10 %, e mais preferivelmente dentro de 5 % de um valor ou faixa de valores dados. Alternativamente, e particularmente em sistemas biológicos, os termos “cerca de” e “aproximadamente” podem significar valores que estão dentro de uma ordem de magnitude, preferivelmente dentro de 5 vezes e mais preferivelmente dentro de 2 vezes de um valor dado. Quantidades numéricas fornecidas aqui são aproximadas a menos que estabelecido de outro modo, significando que o termo “cerca de” ou “aproximadamente” pode ser inferido quando não expressamente estabelecido.

[032]Os métodos da invenção podem incluir etapas de comparar as sequências uma à outra, incluindo sequência do tipo selvagem a um ou mais mutantes (variantes de sequência). Tais comparações tipicamente compreendem alinhamentos de sequências poliméricas, por exemplo, usando programas de alinhamento de sequência e/ou algoritmos que são bem conhecidos na técnica (por exemplo, BLAST, FASTA e MEGALIGN, para citar alguns). O técnico habilitado pode avaliar facilmente que, em tais alinhamentos, onde uma mutação contém uma inserção ou supressão de resíduo, o alinhamento de sequência introduzirá um “intervalo” (tipicamente representado por um traço, ou “A”) na sequência de polímero não contendo o resíduo inserido ou suprimido.

[033]Os métodos da invenção podem incluir cálculos estatísticos, por exemplo, determinação de valores de IC50 ou EC50, etc.. O técnico habilitado pode avaliar facilmente que tais podem ser realizados usando uma variedade de programas comercialmente disponíveis, por exemplo, PRISMA (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA) ou similares.

[034]“Homólogo,” em todas suas formas gramaticais e variações ortográficas, refere-se à relação entre duas proteínas que possuem uma “origem evolutiva comum,” incluindo proteínas das superfamílias nas mesmas espécies de organismo, assim como proteínas homólogas de espécies diferentes de organismo. Tais proteínas (e seus ácidos nucleicos de codificação) têm homologia de sequência, como refletido por sua similaridade de sequência, se em termos de porcentagem de identidade ou pela presença de resíduos ou motivos específicos e posições conservadas. Entretanto, em uso comum e no presente pedido, o termo “homólogo,” quando modificado com um advérbio tal como “altamente,” pode referir-se à similaridade de sequência e pode referir-se ou não a uma origem evolutiva comum.

[035]O termo “similaridade de sequência,” em todas as suas formas gramaticais, refere-se ao grau de identidade ou correspondência entre sequências de ácido nucleico ou aminoácido que podem compartilhar ou não uma origem evolutiva comum.

[036]Os termos “proteína” e “polipeptídeo” são usados permutavelmente. Em general, proteínas derivadas de OPG dos presentes ensinamentos para o uso em mamíferos são expressas em células mamíferas que levam em consideração modificações pós-traducionais apropriadas, tais como linhagens de célula CHO ou HEK293, embora se espere que outras linhagens de célula de expressão de mamífero sejam igualmente úteis. Portanto, espera-se que as proteínas derivadas de OPG possam ser pós-traducionalmente modificadas sem substancialmente efetuar sua função biológica.

[037]Em certos aspectos, variantes funcionais de moléculas de proteína derivadas de OPG dos presentes ensinamentos incluem proteínas de fusão tendo pelo menos uma porção biologicamente ativa da OPG humana e um ou mais domínios de fusão. Exemplos bem conhecidos de tais domínios de fusão incluem, mas não são limitados a, poli-histidina, Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tioredoxina, proteína A, proteína G, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, uma Fc), proteína de ligação de maltose (MBP), ou albumina sérica humana. Um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, a porção de polipeptídeo de OPG pode ser fundida com um domínio que estabiliza o polipeptídeo de OPG in vivo (um domínio “estabilizador”), opcionalmente por intermédio de um ligador de peptídeo adequado. O termo “estabilização” significa qualquer coisa que aumenta a meia-vida de um polipeptídeo na circulação sistêmica, não obstante se isto for por causa da destruição diminuída, desobstrução diminuída, ou outro efeito farmacocinético. Fusões com a porção Fc de uma imunoglobulina são conhecidas conferir propriedades farmacocinéticas desejáveis em certas proteínas. Do mesmo modo, fusões à albumina sérica humana podem conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de domínios de fusão que podem ser selecionados incluem domínios de multimerização (por exemplo, dimerização, tetramerização) e domínios funcionais que conferem uma função biológica adicional, por exemplo, promovendo o acúmulo no sítio de ação alvejado in vivo.

[038]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração um polipeptídeo compreendendo os 215 aminoácidos principais da OPG humana (GenBank: U94332.1), seguido por 227 aminoácidos da porção Fc da Ig Gama-1 humana (GenBank: J00228.1). Em uma forma de realização exemplar, a molécula de proteína da presente invenção compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO. 1. Polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc (SEQ ID NO. 1) MNKLLCCALV FLDISIKWTT QETFPPKYLH YDEETSHQLL CDKCPPGTIL KQHCTAKWKT 60 VCAPCPDHYY TDSWHTSDEC LYCSPVCKEL QYVKQECNRT HNRVCECKEG RYLEIEFCLK 120 HRSCPPGFGV VQAGTPERNT VCKRCPDGFF SNETSSKAPC RKHTNCSVFG LLLTQKGNAT 180 HDNICSGNSE STQKCGIDVT LCEEAFFRFA VPTKFDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 240 KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV 300 LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL 360 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC 420 SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK 442

[039]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração uma molécula de DNA recombinante tendo uma estrutura de leitura aberta que codifica um polipeptídeo compreendendo os 215 aminoácidos principais da OPG humana seguido por 227 aminoácidos da porção Fc da Ig Gama-1 humana, opcionalmente conectada por intermédio de um ligador flexível. Em uma forma de realização exemplar, a molécula de DNA recombinante da presente invenção compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO. 2. DNA de hOPG-hIgG1-Fc (SEQ ID NO. 2) ATGAATAAGC TGCTGTGCTG TGCCCTCGTG TTTCTCGATA TAAGCATTAA GTGGACTACC 60 CAGGAGACAT TCCCTCCTAA GTATCTGCAC TATGACGAGG AGACAAGCCA TCAGCTGCTG 120 TGCGATAAGT GTCCTCCTGG GACCTATCTC AAACAACATT GTACAGCCAA ATGGAAGACA 180 GTCTGCGCTC CATGTCCTGA CCACTACTAC ACCGACTCTT GGCATACTAG CGACGAATGT 240 CTGTATTGTT CACCCGTGTG CAAGGAGCTG CAATACGTGA AACAGGAATG CAATAGGACA 300 CATAACCGCG TGTGTGAATG CAAAGAGGGC AGGTATCTGG AGATCGAATT TTGTCTGAAG 360 CACCGGAGCT GCCCACCCGG CTTTGGAGTG GTCCAGGCCG GGACTCCCGA GAGAAACACT 420 GTGTGCAAAA GATGCCCAGA CGGATTCTTT TCAAACGAGA CATCTTCTAA GGCACCATGT 480 CGGAAGCACA CTAACTGTTC CGTCTTTGGG CTGCTGCTCA CCCAGAAGGG CAATGCCACC 540 CACGATAATA TTTGCTCCGG AAACTCCGAA TCCACCCAAA AGTGCGGGAT AGATGTTACC 600 CTCTGCGAAG AGGCATTCTT CCGCTTCGCT GTTCCTACCA AGTTCGACAA AACTCACACA 660 TGCCCACCGT GCCCAGCTCC GGAACTCCTG GGCGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA 720 AAACCCAAGG ACACCCTCAT GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC 780 GTGAGCCACG AAGACCCTGA GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT 840 AATGCCAAGA CAAAGCCGCG GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC 900 CTCACCGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC 960 AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA 1020 CCACAGGTGT ACACCCTGCC CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG 1080 ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG 1140 CAGCCGGAGA ACAACTACAA GACCACGCCT CCCGTGTTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC 1200 CTCTACAGCA AGCTCACCGT GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC 1260 TCCGTGATGC ATGAGGCTCT GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG 1320 GGTAAA 1326

[040]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração um plasmídeo de expressão de mamífero recombinante para a expressão alta de um polipeptídeo compreendendo os 215 aminoácidos principais da OPG humana seguido por 227 aminoácidos da porção Fc da Ig Gama-1 humana, opcionalmente conectada por intermédio de um ligador flexível. Este plasmídeo compreende o promotor de citomegalovírus (CMV) para conduzir a transcrição do gene que codifica o dito polipeptídeo, seguido pela sequência de término de transcrição e poliadenilação de bGH. O plasmídeo também contém uma origem de replicação de pUC e gene de β- lactamase, que confere resistência à ampicilina, para suportar a propagação e seleção do plasmídeo em bactérias. O plasmídeo contém ainda um gene para Glutamina sintetase, um marcador selecionável amplamente usado para estabelecer linhagens de célula CHOK1 e NSO estáveis. O plasmídeo da presente invenção é ilustrativamente mostrado na Figura 2.

[041]Em uma forma de realização exemplar, o plasmídeo de expressão de mamífero da presente invenção compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO. 3. plasmídeo de expressão de hOPG-hIgG1-Fc (SEQ ID NO. 3) GAATTCATTG ATCATAATCA GCCATACCAC ATTTGTAGAG GTTTTACTTG CTTTAAAAAA 60 CCTCCCACAC CTCCCCCTGA ACCTGAAACA TAAAATGAAT GCAATTGTTG TTGTTAACTT 120 GTTTATTGCA GCTTATAATG GTTACAAATA AAGCAATAGC ATCACAAATT TCACAAATAA 180 AGCATTTTTT TCACTGCATT CTAGTTGTGG TTTGTCCAAA CTCATCAATG TATCTTATCA 240 TGTCTGGCGG CCGCGAGACG CCATCCACGC TGTTTTGACC TCCATAGAAG ACACCGGGAC 300 CGATCCAGCC TCCGCGGCCG GGAACGGTGC ATTGGAACGC GGATTCCCCG TGCCAAGAGT 360 GACGTAAGTA CCGCCTATAG AGTCTATAGG CCCACCCCCT TGGCTTCTTA TGCATGCTAT 420 ACTGTTTTTG GCTTGGGGTC TATACACCCC CGCTTCCTCA TGTTATAGGT GATGGTATAG 480 CTTAGCCTAT AGGTGTGGGT TATTGACCAT TATTGACCAC TCCCCTATTG GTGACGATAC 540 TTTCCATTAC TAATCCATAA CATGGCTCTT TGCCACAACT CTCTTTATTG GCTATATGCC 600 AATACACTGT CCTTCAGAGA CTGACACGGA CTCTGTATTT TTACAGGATG GGGTCTCATT 660 TATTATTTAC AAATTCACAT ATACAACACC ACCGTCCCCA GTGCCCGCAG TTTTTATTAA 720 ACATAACGTG CTCCACGCGA ATCTCGGGTA CGTGTTCCGG ACATGGGCTC TTCTCCGGTA 780 GCGGCGGAGC TTCTACATCC GAGCCCTGCT CCCATGCCTC CAGCGACTCA TGGTCGCTCG 840 GCAGCTAGTG GAGGCCAGAC TTAGGCACAG CACGATGCCC ACCACCACCA GTGTGCCGCA 900 CAAGGCCGTG GCGGTAGGGT ATGTGTCTGA AAATGAGCTC GGGGAGCGGG CTTGCACCAA 960 AAATTTTCGC GTCGACTATA CCGTCCACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA AGGCCAGGAA 1020 CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT CCATAGGCTC CGCCCCCCTG ACGAGCATCA 1080 CAAAAATCGA CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA GATACCAGGC 1140 GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC TCCTGTTCCG ACCCTGCCGC TTACCGGATA 1200 CCTGTCCGCC TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGCTCAC GCTGTAGGTA 1260 TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA 1320 GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA 1380 CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG 1440 TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA CTACGGCTAC ACTAGAAGAA CAGTATTTGG 1500 CTGCTGAAGC CAGTTACCTT CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG ACCGCTGGTA GCGGTTTTTT TGTTTGCAAG CAGCAGATTA CGCGCAGAAA CAAGAAGATC CTTTGATCTT TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGAACGA TAAGGGATTT TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT TTCGTTCATC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA CGGGAGGGCT TACCATCTGG GCAATGATAC CGCGAGACCC ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT GCCGGAAGGG CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG GCCATTGCTA CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG GTATGGCTTC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA TCCCCCATGT TGTGCAAAAA TCCTTCGGTC CTCCGATCGT TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ATGGCAGCAC TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TAAGATGCTT GGTGAGTACT CAACCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG CCGGCGTCAA TACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA CTTTAAAAGT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATGTAACCCA CTCGTGCACC CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC GGGTGAGCAA AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC TGTTGAATAC TCATACTCTT CCTTTTTCAA TATTATTGAA GCATTTATCA CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGAAAAATA AACAAATAGG ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACCTC GACGGATCGG GAGATCTCCC GGTGCACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGCCAGTAT CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG CGAGCAAAAT TTCTGTGGAA TTAGGGTGTG GAAAGTCCCC AGGCTCCCCA GCAGGCAGAA GTATGCAAAG AATTAGTCAG CAACCAGGTG TGGAAAGTCC CCAGGCTCCC CAGCAGGCAG AGCATGCATC TCAATTAGTC AGCAACCATA GTCCCGCCCC TAACTCCGCC CATCCCGCCC CTAACTCCGC CCAGTTCCGC CCATTCTCCG CCCCATGGCT GACTAATTTT TTTTATTTAT GCAGAGGCCG AGGCCGCCTC TGCCTCTGAG CTATTCCAGA AGTAGTGAGG AGGCTTTTTT GGAGGCCTAG GCTTTTGCAA AAAGCTAAGC TACAACAAGG CTCTGGCTAA CTAGAGAACC CACTGCTTAC TGGCTTATCG AAAGCTAGCT TAATACGACT CAATGAATCA GGGTGCAAAC AAGACGGTAT TAGACCGATA TTTACGGTTA GATATCCCGG ACCAGAAATG TCAAGCTATG TACATCTGGG TCGATGGAAC CGGCGAAAAC CTCCGCTCTA AGACCAGGAC ACTCAACTTT ACTCCTAAAT CTCCCAGTGA GCTGCCAATA TGGAATTTCG ATGGGTCATC AACGGGCCAG GCCGAACGGA GCAACAGTGA CGTGTACCTG TATCCAGTCG CTGTTTATCG AGATCCATTC AGGCTGGGTA ACAATAAGCT GGTCCTCTGT GAAACCTACA AATACAACAA GAAGCCTGCT GATACTAACC AGCGTTGGAA GTGTATGGAA GTAATGACAA GGGCAGCAGA CCAGCACCCA TGGTTCGGCA TGGAACAAGA ATATACTCTT TTGGACATTG ACAAACATCC CTTGGGTTGG CCCAAGAATG GCTATCCAGG CCCTCAGGGT CCCTATTACT GTGGTGTGGG TGCTAATAGG GTGTATGGGC GCGATGTGGT CGAGGCTCAC TACAGGGCGT GTCTTTGCGC TGGCATCAAC ATCTCTGGGG AGAACGCGAA AGTCATGCCG GCCCAATGGG AGTTCCAGGT TGGTCCGTGT GAAGGCATAA CCATGGGCGA CGACCTCTGG ATGGCTCGCT ACCTTCTTCA CAGGGTCGCT GAGGACTTTG ATGTTGTAGT AACACTCGAC CCCAAGCCAA TCCCTGGTGA CTGGAACGGC GCTGGAATGC ACACTAATTT CTCTACTGAA GCCATGCGTG GTCCCAATGG CATTCTGGAA ATTGAGAGTG CCATCGACAA ATTGTCGAAG GTTCATGAGA AACACATCAA GGCATACGAC CCACACGCAG GCAAGGATAA CGAAAGGCGC TTGACTGGTC ATTATGAAAC TTCCTCCATC CATGACTTTT CTGCAGGTGT GGCCAACCGT GGTGCCTCCA TCCGCATCCC CAGAGGAGTG GCTGAGGAGA AAACCGGCTA CCTGGAGGAC CGTCGCCCTT CCTCCAACGC TGACCCTTAT GTGGTGTCTG AGAGGCTTGT GCGTACCATC TGCCTGAACG AGCAGTGACT ATAGGGAGAC CCAAGCTGAC GCGCCCTGTA GCGGCGCATT AAGCGCGCCC GGGCTGGTGG TTACGCGCAG CGTGACCGCT ACACTTGCCA GCGCCCTAGC GCCCGCTCCT TTCGCTTTCT TCCCTTCCTT TCTCGCCACG TTCGCCGGCT TTCCCCGTCA AGCTCTAAAT CGGGGGCTCC CTTTAGGGTT CCGATTTAGT GCTTTACGGC ACCTCGACCC CAAAAAACTT GATTAGGGTG ATGGTTCACG TAGTGGGCCA TCGCCCTGAT AGACGGTTTT TCGCCCTTTG ACGTTGGAGT CCACGTTCTT TAATAGTGGA CTCTTGTTCC AAACTGGAAC AACACTCAAC CCTATCTCGG TCTATTCTTT TGATTTATAA GGGATTTTCT CTAGCTAGAG CTTGGCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC TGTGTGAAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC ACACAACATA CGAGCCGGAA GCATAAAGTG TAAAGCCTGG GGTGCCTAAT GAGTGAGCTA ACTCACATTA ATTGCGTTGC GCTCACTGCC CGCTTTCCAG TCGGGAAACC TGTCGTGCCA GCTGCATTAA TGAATCGGCC AACGCGCGGG GAGAGGCGGT TTGCGTATTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTGTCCACCT CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG CGGTATCAGC TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTAGAGAT TTCGATTCCA CCGCCGCCTT CTATGAAAGG TTGGGCTTCG GAATCGTTTT CCGGGACGCC GGCTGGATGA TCCTCCAGCG CGGGGATCTC ATGCTGGAGT TCTTCGCCCA CCCCAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG TTACAAATAA AGCAATAGCA TCACAAATTT CACAAATAAA GCATTTTTTT CACTGCATTC TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGTATAC CGTCGACCTC AAGGCTTGAC CGACAATTGC ATGAAGACGC GTAATCTGCT TAGGGTTAGT TTTACAGGAT GGGGTCTCAT TTATTATTTA CAAATTCACA TATACAACAC CACCAGATCG CCTGGAGACG CCATCCACGC TGTTTTGACC TCCATAGAAG ACACCGGGAC CGATCCAGCC TCCGCGGCCG GGAACGGTGC ATTGGAACGC GGATTCCCCG TGCCAAGAGT GACGTAAGTA CCGCCTATAG AGTCTATAGG CCCACCCCCT TGGCTTCTTA TGCATGCTAT ACTGTTTTTG GCTTGGGGTC TATACACCCC CGCTTCCTCA TGTTATAGGT GATGGTATAG CTTAGCCTAT AGGTGTGGGT TATTGACCAT TATTGACCAC TCCCCTATTG GTGACGATAC TTTCCATTAC TAATCCATAA CATGGCTCTT TGCCACAACT CTCTTTATTG GCTATATGCC AATACACTGT CCTTCAGAGA CTGACACGGA CGCGTTTTGC GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATAC GCGTTGACAT TGATTATTGA CTAGTTATTA ATAGTAATCA ATTACGGGGT CATTAGTTCA TAGCCCATAT ATGGAGTTCC GCGTTACATA ACTTACGGTA AATGGCCCGC CTGGCTGACC GCCCAACGAC CCCCGCCCAT TGACGTCAAT AATGACGTAT GTTCCCATAG TAACGCCAAT AGGGACTTTC CATTGACGTC AATGGGTGGA GTATTTACGG TAAACTGCCC ACTTGGCAGT ACATCAAGTG TATCATATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC GGGACTTTCC AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC GGTAGGCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA AGCAGAGCTC GTTTAGTGAA CCGTCAGATC GCCTGGAGAC GCCATCCACG CTGTTTTGAC CTCCATAGAA GACACCGGGA CCGATCCAGC CTCCGCGGCC GGGAACGGTG CATTGGAACG CGGATTCCCC GTGCCAAGAG TGACGTAAGT ACCGCCTATA GAGTCTATAG GCCCACCCCC TTGGCTTCTT ATGCATGCTA TACTGTTTTT GGCTTGGGGT CTATACACCC CCGCTTCCTC ATGTTATAGG TGATGGTATA GCTTAGCCTA TAGGTGTGGG TTATTGACCA TTATTGACCA CTCCCCTATT GGTGACGATA CTTTCCATTA CTAATCCATA ACATGGCTCT TTGCCACAAC TCTCTTTATT GGCTATATGC CAATACACTG TCCTTCAGAG ACTGACACGG ACTCTGTATT TTTACAGGAT GGGGTCTCAT TTATTATTTA CAAATTCACA TATACAACAC CACCGTCCCC AGTGCCCGCA GTTTTTATTA AACATAACGT GGGATCTCCA CGCGAATCTC GGGTACGTGT TCCGGACATG GGCTCTTCTC CGGTAGCGGC GGAGCTTCTA CATCCGAGCC CTGCTCCCAT GCCTCCAGCG ACTCATGGTC GCTCGGCAGC TCCTTGCTCC TAACAGTGGA GGCCAGACTT AGGCACAGCA CGATGCCCAC CACCACCAGT GTGCCGCACA AGGCCGTGGC GGTAGGGTAT GTGTCTGAAA ATGAGCTCGG GGAGCGGGCT TGCACCGCTG ACGCATTTGG AAGACTTAAG GCAGCGGCAG AAGAAGATGC AGGCAGCTGA GTTGTTGTGT TCTGATAAGA GTCAGAGGTA ACTCCCGTTG CGGTGCTGTT AACGGTGGAG GGCAGTGTAG TCTGAGCAGT ACTCGTTGCT GCCGCGCGCG CCACCAGACA TAATAGCTGA CAGACTAACA GACTGTTCCT TTCCATGGGT CTTTTCTGCA GTCACCGTCC TTGACACGAA GCTTGCCACC ATGAATAAGC TGCTGTGCTG TGCCCTCGTG TTTCTCGATA TAAGCATTAA GTGGACTACC CAGGAGACAT TCCCTCCTAA GTATCTGCAC TATGACGAGG AGACAAGCCA TCAGCTGCTG TGCGATAAGT GTCCTCCTGG GACCTATCTC AAACAACATT GTACAGCCAA ATGGAAGACA GTCTGCGCTC CATGTCCTGA CCACTACTAC ACCGACTCTT GGCATACTAG CGACGAATGT CTGTATTGTT CACCCGTGTG CAAGGAGCTG CAATACGTGA AACAGGAATG CAATAGGACA CATAACCGCG TGTGTGAATG CAAAGAGGGC AGGTATCTGG AGATCGAATT TTGTCTGAAG CACCGGAGCT GCCCACCCGG CTTTGGAGTG GTCCAGGCCG GGACTCCCGA GAGAAACACT GTGTGCAAAA GATGCCCAGA CGGATTCTTT TCAAACGAGA CATCTTCTAA GGCACCATGT CGGAAGCACA CTAACTGTTC 8040 CGTCTTTGGG CTGCTGCTCA CCCAGAAGGG CAATGCCACC CACGATAATA TTTGCTCCGG 8100 AAACTCCGAA TCCACCCAAA AGTGCGGGAT AGATGTTACC CTCTGCGAAG AGGCATTCTT 8160 CCGCTTCGCT GTTCCTACCA AGTTCGACAA AACTCACACA TGCCCACCGT GCCCAGCTCC 8220 GGAACTCCTG GGCGGACCGT CAGTCTTCCT CTTCCCCCCA AAACCCAAGG ACACCCTCAT 8280 GATCTCCCGG ACCCCTGAGG TCACATGCGT GGTGGTGGAC GTGAGCCACG AAGACCCTGA 8340 GGTCAAGTTC AACTGGTACG TGGACGGCGT GGAGGTGCAT AATGCCAAGA CAAAGCCGCG 8400 GGAGGAGCAG TACAACAGCA CGTACCGTGT GGTCAGCGTC CTCACCGTCC TGCACCAGGA 8460 CTGGCTGAAT GGCAAGGAGT ACAAGTGCAA GGTCTCCAAC AAAGCCCTCC CAGCCCCCAT 8520 CGAGAAAACC ATCTCCAAAG CCAAAGGGCA GCCCCGAGAA CCACAGGTGT ACACCCTGCC 8580 CCCATCCCGG GATGAGCTGA CCAAGAACCA GGTCAGCCTG ACCTGCCTGG TCAAAGGCTT 8640 CTATCCCAGC GACATCGCCG TGGAGTGGGA GAGCAATGGG CAGCCGGAGA ACAACTACAA 8700 GACCACGCCT CCCGTGTTGG ACTCCGACGG CTCCTTCTTC CTCTACAGCA AGCTCACCGT 8760 GGACAAGAGC AGGTGGCAGC AGGGGAACGT CTTCTCATGC TCCGTGATGC ATGAGGCTCT 8820 GCACAACCAC TACACGCAGA AGAGCCTCTC CCTGTCTCCG GGTAAATAAT A 8871

[042]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração um sistema de expressão de mamífero para a produção de um polipeptídeo compreendendo os 215 aminoácidos principais da OPG humana seguido por 227 aminoácidos da porção Fc da Ig Gama-1 humana, opcionalmente conectada por intermédio de um ligador flexível. O sistema de expressão da presente invenção compreende uma célula mamífera que abriga um plasmídeo de expressão de mamífero recombinante para a expressão alta de um polipeptídeo compreendendo os 215 aminoácidos principais da OPG humana seguido por 227 aminoácidos da porção Fc da Ig Gama-1 humana, opcionalmente conectada por intermédio de um ligador flexível.

[043]Em uma forma de realização exemplar, o sistema de expressão de mamífero da presente invenção compreende células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) que abrigam um plasmídeo compreendendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO. 3.

[044]Em certos aspectos, a presente invenção leva em consideração um método de tratamento de um mamífero afetado por um transtorno associado com reabsorção ou remodelagem óssea.

EXEMPLOS

[045]Os exemplos seguintes ilustram os aspectos precedentes e outros aspectos da presente invenção. Estes Exemplos não limitantes são divulgados de modo a prover aqueles de habilidade comum na técnica com formas de realização ilustrativas sobre a forma como os compostos, composições, artigos, dispositivos, e/ou métodos reivindicados aqui são preparados e avaliados. Os Exemplos são intencionados a serem puramente exemplares da invenção e não são intencionados a limitar o escopo do que o inventor considera como sua invenção. Esforços foram feitos para garantir precisão com respeito a números (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios devem ser considerados.

Exemplo 1: Construção de plasmídeos para a expressão de polipeptídeos da presente invenção.

[046]Inicialmente, um primeiro fragmento de DNA foi quimicamente sintetizado compreendendo DNA que codifica os resíduos de aminoácido de hOPG 1 a 215, imediatamente seguido pelo DNA que codifica um fragmento principal de aminoácidos de hIgG1-Fc. Na extremidade 5’ do primeiro fragmento de DNA a sequência de codificação de hOPG foi precedida pelo sítio de restrição Hind III, uma sequência Kozak (GCCACC) junto com sua sequência de sinal. O DNA de codificação do fragmento hIgG1-Fc do primeiro fragmento de DNA na 3’ continha um sítio de restrição Sac II.

[047]Subsequentemente, o gene sintético foi subclonado, utilizando os sítios de restrição Hind III e Sac II previamente engendrados, em um vetor de pCDNA4-Fc compreendendo o DNA que codifica os aminoácidos de hIgG1-Fc remanescentes. O vetor de pCDNA4-Fc utiliza o promotor de citomegalovírus (CMV) para conduzir a transcrição do gene de interesse, e foi provado gerar expressão de nível alto em uma ampla variedade de linhagens de célula mamífera. O vetor compreende as sequências de término de transcrição e poliadenilação de bGH. O vetor também contém uma origem de replicação de pUC e um gene de β-lactamase, que confere resistência à ampicilina, para suportar o crescimento e seleção em bactérias. A Figura 1 mostra o mapa de plasmídeo pCDNA4-Fc e a sequência anotada.

[048]Finalmente, o segundo fragmento de DNA compreendendo o DNA que codifica os resíduos de hOPG 1 a 215 e os resíduos 103 a 329 de hIgG1-Fc foi subclonado, utilizando o plasmídeo pCDNA4-Fc esquematicamente mostrado na Figura 1, em vetor de expressão de mamífero pKN002 para a expressão alta de polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc da SEQ ID NO. 1. O vetor pKH002 utiliza o promotor de citomegalovírus (CMV) para conduzir a transcrição do gene de interesse, seguido pela sequência de término de transcrição e poliadenilação de bGH. O vetor também contém uma origem de replicação de pUC e gene de β-lactamase, que confere resistência à ampicilina, para suportar o crescimento e seleção em bactérias. Finalmente, o vetor pKH002 contém um gene para Glutamina sintetase - um marcador selecionável amplamente usado para estabelecer linhagens de célula CHOK1 e NSO estáveis. A Figura 2 ilustrativamente mostra o mapa e sequência anotada do plasmídeo de pKH002-hOPG-hIgG1-Fc de expressão alta resultante da SEQ ID NO. 3.

Exemplo 2: Geração de linhagens de célula estáveis para expressar polipeptídeos da presente invenção.

[049]Um clone estável de células CHO-K1 que super-expressam o polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc da SEQ. ID 1 foi gerado através de protocolos padrão. O plasmídeo de expressão pKH002-h0PG-hIgG1-Fc descrito no Exemplo 1 foi usado para gerar linhagens de célula estáveis para expressão alta do dito polipeptídeo. Níveis de expressão do dito polipeptídeo em uma pluralidade de clones estavam acima de 125 mg/L em uma cultura em lote de 7 dias. Uma linhagem de célula clonal mostrou níveis de expressão de cerca de ou acima de 125 mg/L em cultura em lote em frasco de agitação.

Materiais

[050]Células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) foram obtidas como estoques congelados de ATCC (CCL-61®). As células foram adaptadas internamente em um meio de CD CHO. Meio e reagente foram obtidos de fonte comercial. Na adaptação completa, as células foram cultivadas à densidade alta para algumas passagens. As células resultantes foram subclonadas. Um dos clones resultantes com um tempo de duplicação abaixo de 20 h e boa morfologia foi selecionado como linhagem de célula parental.

Métodos

[051]Um frasco de células CHO-K1 (7,5 x 106 células viáveis em um volume de 1,5 ml) foi descongelado em 20 ml de meio CD CHO suplementado com 4 mM de L-glutamina para fornecer uma densidade de célula de 3,75 x 105 células/ml em um frasco Erlenmeyer a 37 °C/CO2 a 10 % em uma plataforma de agitador orbital em 80 a 100 rpm. As células foram subcultivadas a cada três a quatro dias.

[052]Um banco de células de pesquisa de 19 frascos criogênicos, cada um contendo 7,5 x 106 células (passagem 1) em 1,5 ml de meio de crescimento fresco a 50 %/meio condicionado a 50 % contendo 7,5 % de DMSO, foi armazenado em nitrogênio líquido. Depois da expansão adicional, 50 frascos criogênicos cada um contendo 7,5 x 106 células (passagem 3) em 1,5 ml foram congelados em nitrogênio líquido (como descrito acima) e foram usados como um banco de células de trabalho.

[053]A transfecção de células CHO-K1 com o plasmídeo pKH002-hOPG- hIgG1-Fc descrito no Exemplo 1 foi realizada por eletroporação utilizando o instrumento Gene Pulse Xcell (BIO-RAD) usando protocolos padrão. Um a dois dias antes da eletroporação, células CHO-K1 diluídas foram transferidas em meio de crescimento fresco (meio CD CHO) de modo que elas atingissem a fase mid-log (geralmente cerca de 2 a 3 x 106 células/ml) no dia do experimento. A seguir da transfecção, utilizando protocolos padrão, linhagens de célula foram adaptadas à cultura em suspensão seguido por medição de 50 ml de curvas de crescimento de cultura. A contagem e viabilidade celulares foram medidas diariamente para cada linhagem de célula testada. Níveis de produção do polipeptídeo desejado foram medidos por dois métodos: ELISA; e purificações de teste por coluna de proteína A.

[054]Várias transfecções foram realizadas em células CHO-K1 no processo da geração de linhagem de célula de expressão de hOPG-hIgG1-Fc potencial; uma curva de crescimento de transfecção representativa é mostrada na Figura 3 e os dados são mostrados na Tabela 1. DNA superenrolado foi transfectado em células CHO-K1 sob eletroporação e selecionados com MSX. As células foram selecionadas em placas de 96 reservatórios como minirreservatórios e a produtividade foi avaliada usando SDS-PAGE e ELISA. Com base nestas análises, duas transfecções foram identificadas como produzindo os níveis mais altos de hOPG-hIgG1-Fc, e estas transfecções serão caracterizadas em mais detalhe.

[055]Depois da seleção inicial em placas de 96 reservatórios, 24 linhagens de célula foram dimensionadas em placas de até 24 reservatórios e depois frascos T25. Os meios foram coletados das placas de 24 reservatórios ou frascos T25, SDS-PAGE e ELISA foram realizados. Quatro linhagens que demonstraram boa expressão de hOPG-hIgG1-Fc foram transferidas para a cultura em suspensão. Os níveis de expressão de duas das quatro linhagens de célula acima estavam acima de 125 mg/L em uma cultura em lote de 7 dias, as ditas duas linhagens foram selecionadas como linhagens de célula parental de expressão alta.

[056]As duas linhagens de célula parental de expressão alta foram plaqueadas para clonagem única, semeando as células em 5 x placas de 96 reservatórios. Para ambas as linhagens de célula parental uma pluralidade de clones foi selecionada das placas de 96 reservatórios e transferida para placas de 24 reservatórios. Os meios foram coletados de reservatórios confluentes e avaliados como antes pelos testes SDS-PAGE e ELISA. Os clones que não produziram resultados desejados foram descartados. Um subconjunto da pluralidade de clones cultivados em reservatório em cultura em suspensão isenta de soro e curvas de crescimento de 50 mL foram avaliados. Todos os clones foram adicionalmente reanalisados por SDS-PAGE e ELISA. A partir do subconjunto de clones, o único com a produtividade mais alta foi escolhido para ser avaliado em um conjunto adicional de curvas de crescimento de 1 L, confirmando que o clone teve a produtividade mais alta e mostrou uma melhora significante comparada com sua linhagem de célula parental.

[057]A linhagem de célula de produção mais alta escolhida foi selecionada e descongelada em CD-CHO. Curvas de crescimento na linhagem de célula foram avaliadas, e as amostras foram coletadas diariamente para contagem celular, viabilidade celular e produtividade de hOPG-hIgG1-Fc. Com base nestes estudos, foi determinado que a linhagem de célula de produtividade mais alta selecionada estava expressando o polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc em quantidades necessárias para suportar a produção comercial. O rendimento do polipeptídeo depois da purificação foi de pelo menos 125 mg/L (sem qualquer otimização da produção).Tabela 1: Uma Curva de crescimento de Linhagem de Célula Clonal Representativa

Exemplo 3: Purificação de polipeptídeos da presente invenção.

[058]O polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc da SEQ ID,1 foi expressado em CHO- K1 essencialmente como descrito no Exemplo 2 precedente. As células foram colhidas e lisadas utilizando protocolos bem estabelecidos. Depois da clarificação do lisato celular, o sobrenadante contendo o polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc expressado foi primeiro aplicado a uma coluna de afinidade de proteína A. A etapa de purificação por afinidade foi realizada de acordo com o procedimento esboçado na Tabela 2. O eluato de Proteína A contendo hOPG-hIgG1-Fc foi ajustado no pH ao pH de cerca de 7,5 usando 1 M de Tris-HCl, pH 9,0. A condutividade foi ajustada com água deionizada (dH2O) conforme necessário.

[059]De modo a reduzir os teores de DNA, HCP, endotoxina e contaminantes virais potenciais, o eluato da coluna de proteína A ajustado no pH foi purificado ainda por cromatografia de troca aniônica (AIEX) utilizando a resina Q Sefarose. A etapa de AIEX é operada em um modo de fluxo de acordo com o procedimento esboçado na Tabela 3.

[060]O fluxo de AIEX foi analisado por HPLC de exclusão por tamanho (SEC- HPLC) e SDS-PAGE (redução). Os resultados da análise são apresentados na Figura 4 e Figura 5, respectivamente.

[061]O procedimento operacional de SEC-HPLC é esboçado na Tabela 4. A forma biologicamente relevante de polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc é um homodímero ligado por intermédio de um dissulfeto C-terminal. Com base em rodadas de teste com marcadores de tamanho de proteína, o peso molecular do pico pré-sustentação (tempo de retenção RT = 13,5 min) foi cerca de 378 KDa, indicando que é provável representar um tetrâmero de hOPG-hIgG1-Fc.Tabela 2: O procedimento operacional da Cromatografia de Afinidade de Proteína A

Tabela 3: O procedimento operacional de AIEX

Tabela 4: O Procedimento operacional de SEC-HPLC

[062]Para inquirir se as condições de eluição de pH baixo usadas na etapa de purificação por afinidade de proteína A pode causar formação de oligômero superior, um estudo foi realizado para possivelmente correlacionar a concentração de eluato e o teor de oligômero. Uma coluna de proteína A analítica (2 mL) com resina MabSelect Sure foi empacotada e usada seguindo o procedimento operacional esboçado na Tabela 1. Quatro experimentos foram realizados variando os volumes de carga de coluna dos, isto é 20, 50, 100 e 150 mL, respectivamente. Os eluatos coletados foram analisados por SEC-HPLC para estimar o teor de oligômero. Os resultados indicaram que o oligômero foi formado durante a eluição de pH, enquanto o teor de oligômero não teve nenhuma correlação com a concentração da mistura.

[063]Portanto, para reduzir a oligomerização indesejada, os métodos de purificação adicionais seguintes foram investigados: cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia de troca catiônica (CIEX), e cromatografia de hidroxilapatita (HA).

[064]Para HIC, duas resinas, Fenil- e Butil- , e três sais de fase móvel, NaCl, Na2SO4 e (NH4)2SO4, foram testados. Utilizando uma resina com base em fenila e fase móvel com base em NaCl demonstrou melhor resultado permitindo obter uma pureza de > 97 % e um rendimento de cerca de 50 %. Duas resinas CIEX foram triadas sem mostrar resultados superiores àqueles obtidos de HIC.

[065]Outros testes utilizando cromatografia de hidroxilapatita (HAC) produziram resultados superiores. Uma coluna de HA foi empacotada com Macro-Prep Ceramic HA Tipo II 40 μm (Bio-Rad) a um volume de coluna (CV) de 10,4 mL (altura do leito de 11 cm). Experimentos de triagem foram realizados para identificar as melhores condições de eluição (ver a Tabela 6). O material de partida usado foi fluxo de AIEX depois do processo de cromatografia de etapa dupla inicial. Inicialmente, dois lotes de proteína foram preparados. Os níveis de expressão de proteína total para o primeiro e o segundo lotes foram cerca de 588 mg/L e 50 mg/mL, respectivamente. As purezas e concentrações em fluxos de AIEX dos dois lotes foram comparáveis: cerca de 92 % e 2,5 mg/mL, respectivamente. O fluxo de AIEX foi dialisado contra o tampão de carga de HAC antes de carregar sobre a coluna de HA. Todos os experimentos foram realizados em uma taxa de fluxo de 2 mL/min. Tabela 5: Experimentos de triagem em HAC

[066]Entre os experimentos resumidos na Tabela 5, o experimento No 6 produziu resultados superiores. O cromatograma de HAC do experimento No 6 é mostrado na Figura 6. A mistura das frações de pico principais do experimento No 6 teve pureza acima de 99 % (um exemplo de cromatograma analítico de SEC-HPLC da fração de pico principal de HAC é mostrado na Figura 7) e o rendimento estimado da proteína foi de 63 %. Notavelmente, o experimento No 5 também produziu separação relativamente boa, entretanto um rendimento de proteína mais baixo de cerca de 55 %.

[067]Em um ensaio in vitro com base em célula, o polipeptídeo da SEQ ID NO. 1, que foi expressado e purificado essencialmente como descrito neste exemplo, em uma concentração de cerca de 100 ng/ml bloqueou completamente 50 ng/ml de diferenciação de osteoclasto induzida por RANKL (células RAW264.7, EC50 de cerca de 50 ng/ml).

Exemplo 4: Estudo de toxicidade de polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc da SEQ ID NO. 1 para administração subcutânea em camundongos.

[068]O polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 foi expressado e purificado essencialmente como descrito nos exemplos precedentes. Para a administração em animais, o polipeptídeo foi formulado no tampão seguinte: 1 % p/v de Sacarose, 100 mM de Cloreto de sódio, 25 mM de Cloridreto de L-Arginina, 25 mM de Bicarbonato de sódio, pH 6,3. A concentração de estoque de dosagem usada foi 0,5 mg/mL do polipeptídeo.

[069]Os camundongos SPF usados no estudo foram aleatoriamente divididos em 3 grupos: grupo de controle de tampão de formulação, grupo de dose baixa e grupo de dose alta, cada grupo tinha 5 camundongos. Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico, a dose anestésica foi de 30 mg/kg. O dorso dos camundongos foi raspado para monitorar o sítio de injeção. 20 μL de tampão de formulação foram administrados ao grupo de controle por injeção subcutânea. 16 mg/kg do polipeptídeo foram administrados ao grupo de dose baixa, e 32 mg/kg do polipeptídeo foram administrados ao grupo de dose alta, respostas nos sítios de injeção foram observadas e imagens tomadas em 15 min, 6 h, 24 h, 72 h e no dia 7.

[070]No estudo conduzido, nenhuma reação aguda foi observada em camundongos depois da administração subcutânea do tampão de formulação sozinho, ou do polipeptídeo da SEQ ID. 1 nas doses de 16 e 32 mg/kg. Nenhuma reação na pele ou outras anormalidades foram observadas por até 7 dias de observação.

Exemplo 5: Farmacocinética (PK) do polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc da SEQ ID NO. 1 depois da administração subcutânea em camundongos.

[071]O polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 foi expressado e purificado essencialmente como descrito nos exemplos precedentes. Para administração em animais, o polipeptídeo foi formulado no tampão seguinte: 1 % p/v de Sacarose, 100 mM de Cloreto de sódio, 20 mM de Cloridreto de L-Arginina, 25 mM de Bicarbonato de sódio, pH 6,3. A concentração do estoque de dosagem usada foi 0,5 mg/mL do polipeptídeo.

[072]Quatorze camundongos nu/nu Balb/c fêmeas foram randomizados com base no peso corporal em sete grupos de dois animais no Dia 0 do estudo. Um único tratamento do polipeptídeo (5 mg/kg) foi administrado subcutaneamente (dorsal) no Dia 0 a todos os grupos exceto os camundongos no Grupo 1, que foram sangrados por intermédio de punctura cardíaca para a preparação do plasma no Dia 0 do estudo. Amostras de sangue foram coletadas de camundongos por intermédio do seio orbital nos grupos remanescentes em vários momentos por todo o estudo para a preparação do plasma.

[073]Pesos corporais foram registrados para todos os animais no dia do tratamento (Dia 0) e depois três vezes por semana, incluindo o dia do término de cada grupo.

[074]Grupos de camundongos foram separados em pontos no tempo específicos para a preparação do plasma. Mudanças de peso corporal não foram medidas em grupos separados para a coleta da amostra em 0 hora e dentro de 36 horas da administração da dose. A maioria dos grupos ganhou peso durante o período de estudo. Apenas o Grupo 5 que terminou em 7 dias pós-tratamento falhou a obter um ganho global no peso corporal. Nenhum camundongo perdeu peso corporal excessivo e nenhum sinal clínico adverso foi relatado durante o período de estudo.

[075]A seguir da fase de vida do estudo, amostras de plasma foram analisadas por ELISA para proteínas Hu-Fc. A quantificação de Hu-Fc em amostras de plasma de camundongo por ELISA foi usada como uma leitura para níveis circulantes do polipeptídeo. O ensaio foi realizado em amostras de todos os camundongos no estudo.

[076]O polipeptídeo foi detectado no plasma de animais em 1 hora pós- administração. Uma equação de Modelo de Queda de Fase usando Prisma 5.0c (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA) depois foi usada para determinar a farmacocinética do polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 como detectado por Hu-Fc ELISA. Níveis circulantes de pico de Hu-Fc (Cmax) foram determinados como sendo de 26,49 ng/mL, e o tempo para níveis circulantes de pico (Tmax) foi de 10 horas pós- tratamento. Os níveis de polipeptídeo diminuíram até níveis quase indetectáveis por três semanas pós-administração, o ponto de avaliação final. A meia-vida (T1/2) foi de 83,52 horas e K0,0083 h-1. Hu-Fc não foi detectado no plasma dos animais do Grupo 1 não tratados. Os resultados do estudo são resumidos na Tabela 6.Tabela 6: Concentração de Proteína Humana-Fc Média ± SEM (μg/mL) em cada Tempo Pós-Administração

SEM incapaz de ser calculado visto que o nível de Hu-Fc estava abaixo do limite detectável de ELISA para uma das amostras no Grupo. A Concentração de Proteína Humana-Fc foi determinada pelo Software Prisma com base em ASangria por intermédio do seio orbital #Sangria por intermédio de punctura cardíaca terminal

Exemplo 6: Determinação da eficácia do polipeptídeo hOPG-hIgG1-Fc da SEQ ID NO. 1 contra câncer de mama humano como um modelo lítico do osso de murino.

[077]O modelo lítico do osso de murino usado no presente exemplo é bem conhecido na técnica (por exemplo, ver Arrington, S.A., et al., Bone. Março de 2006;38(3):359 - 67). O polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 foi expressado e purificado essencialmente como descrito nos exemplos precedentes. Para administração em animais, o polipeptídeo foi formulado no tampão seguinte: 1 % p/v de Sacarose, 100 mM de Cloreto de sódio, 20 mM de Cloridreto de L-Arginina, 25 mM de Bicarbonato de sódio, pH 6,3. A concentração do estoque de dosagem usada foi 0,5 mg/mL do polipeptídeo.

[078]Sessenta camundongos Nude-Foxn1nu Atímicos fêmeas foram todos inoculados com 5 x 105 células de câncer de mama humano MDA-MB-468 (em 5 μL) na tíbia direita. Quatorze dias pós-inoculação, os camundongos foram randomizados por peso corporal em cinco grupos de 12 (Dia 0).

[079]Os camundongos em cada grupo receberam tratamento subcutâneo com Veículo (Tampão de formulação) ou polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 (1, 5 ou 10 mg/kg), ou tratamento intravenoso com Zometa (Ácido zoledrônico) (0,1 mg/kg). Os tratamentos foram administrados três vezes por semana, começando no Dia 0, e foram continuados por seis semanas.

[080]O peso corporal foi registrado para todos os animais no primeiro dia de tratamento (Dia 0) e depois três vezes por semana, incluindo o dia do término do estudo (48 horas pós-tratamento final, 42 dias pós-tratamento inicial). Houve ganho de peso corporal médio significante (p < 0,05) em todos os grupos durante o curso do estudo. Nenhum sinal clínico adverso, incluindo perda de peso corporal em excesso, foi observado em camundongos que recebem tratamento com polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 ou Zometa.

[081]O tratamento com polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 em todas as doses e Zometa resultou em inibição significante (p < 0,05) da lise óssea avaliada em imagens de raio X de tíbias tomadas tanto em seis quanto em oito semanas pós-inoculação, comparado com Veículo. Embora houvesse pouca ou nenhuma evidência de lise óssea, o músculo da pata inoculado pareceu alargado na imagem de raio X tomada em seis semanas pós-inoculação de um camundongo que recebe o polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 em 10 mg/kg e dois camundongos que recebem Zometa. Em oito semanas pós-inoculação, a incidência de músculo da pata alargado aumentou em todos os grupos. Todos os camundongos com músculo da pata alargado que recebem polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 ou Zometa tiveram evidência suave ou nenhuma evidência de lise óssea em oito semanas pós-inoculação. Imagens de raio X de todos os camundongos são apresentadas.

[082]O tratamento com polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 em 1 mg/kg e Zometa resultou em inibição significante (p < 0,05) da lise óssea comparado com Veículo, indicada por parâmetros de densidade óssea avaliados por varredura microCT de tíbias inoculadas excisadas no término do estudo. Imagens de varredura microCT bidimensionais e tridimensionais representativas de um camundongo em cada um dos grupos analisados para microCT são apresentadas.

Materiais e Métodos

[083]Todos os materiais para o estudo foram obtidos de fontes comerciais. Células de tumor de mama humano MDA-MB-468 foram originadas da American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). Células de tumor de mama humano MDA-MB-468 (Passagem 5 do estoque de trabalho) foram cultivadas em meio de cultura celular RPMI 1640, suplementado com 10 % de FBS, 1 % de Glutamax e 1 % de penicilina-estreptomicina. As células foram colhidas por tripsinização, lavadas duas vezes em HBSS e contadas. As células depois foram recolocadas em suspensão em HBSS a uma concentração final de 1 x 108 células/mL.

[084]Antes da inoculação do tumor, o sítio de injeção foi abundantemente limpo com álcool. Uma agulha de 27G foi introduzida através da pele para perfurar um túnel, 5 a 7 mm em comprimento (suficiente para acomodar 5 μL de suspensão celular) do platô da tíbia traseira direita no canal da medula óssea. Usando uma seringa do tipo Hamilton de 50 μL com uma agulha de 27G, 5 μL de suspensão de célula MDA- MB-468 (5 x 105 células) foram descarregados no túnel pré-formado. O tratamento dos camundongos começou 14 dias depois da inoculação de célula MDA-MB-468.

[085]Em total, 65 camundongos fêmeas (Mus musculus) foram inoculados para o estudo, dos quais 60 foram realmente usados no estudo (em grupos de 5, 12 grupos em total). O peso corporal do animal variou no início do tratamento de cerca de 20,3 a cerca de 27,8 g (média de 24,1 g) na inoculação. Os animais foram alojados em grupos de quatro em gaiolas individualmente ventiladas (Alternative Design Max, USA), três gaiolas por grupo. Os animais foram mantidos em um ambiente controlado (faixas alvejadas: temperatura 21 ± 3 °C, umidade 30 a 70 %, 15 mudanças de ar por hora), com um ciclo de luz/escuridão de 12 horas, e sob condições de barreira (quarentena). Temperatura e umidade relativa foram monitoradas continuamente. Todos os animais foram submetidos às mesmas condições ambientais.

[086]Uma dieta para roedor comercial certificada padrão (Dieta para Roedor com Teor de Proteína Global de 18 % Teklad, Harlan Laboratories, Inc, IN, USA) e água de torneira foi fornecida aos animais à vontade. Verificações de mortalidade foram realizadas uma vez ao dia na manhã durante o estudo. Sinais clínicos (tais como má saúde e mudanças comportamentais) também foram registrados para todos os animais uma vez ao dia. Os pesos corporais foram registrados para todos os animais no primeiro dia de tratamento (Dia 0) e depois três vezes por semana, incluindo o dia do término do estudo.

[087]A seguinte formulação de veículo foi usada no estudo: 1 % de sacarose, 100 mM de cloreto de sódio, 20 mM de cloridreto de l-arginina, 25 mM de fosfato de sódio, pH 6,3. A solução foi armazenada a 4 °C. O Zometa (Ácido zoledrônico) do artigo de referência foi usado na formulação clínica (0,8 mg/mL) e foi armazenado na temperatura ambiente. O Artigo de Teste (polipeptídeo da SEQ ID NO. 1) (45 mg/mL) foi diluído em tampão de formulação (1 % de sacarose, 100 mM de cloreto de sódio, 20 mM de cloridreto de l-arginina, 25 mM de fosfato de sódio, pH 6,3) para obter a concentração necessária para a dosagem. A formulação clínica de Zometa® (0,8 mg/mL) foi diluída em solução salina estéril para obter a concentração necessária para a dosagem. As soluções de dosagem foram preparadas frescas em cada dia de dosagem.

[088]O regime de dosagem usado neste estudo é resumido na Tabela 7. Sessenta camundongos foram randomizados por peso corporal no Dia 0 do estudo, 14 dias pós-inoculação, em cinco grupos de 12 camundongos.Tabela 7: Regime de Dosagem do Animal

[089]O Controle de Veículo (Tampão de formulação; Grupo 1) e polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 (1, 5 e 10 mg/kg; Grupos 2, 3 e 4, respectivamente) foramadministrados por injeção subcutânea (s.c.) (Tabela 7). Zometa (0,1 mg/kg; Grupo 5) foi administrado por injeção intravenosa (i.v.) (Tabela 6). Os tratamentos foram administrados três vezes por semana, começando no Dia 0 e continuaram por seis semanas.

[090]O Controle de Veículo e Artigos de Teste foram administrados em um volume de dosagem de 10 mL/kg. Cada peso corporal do animal foi medido imediatamente antes da dosagem. O volume da solução de dosagem administrada a cada animal foi calculado e ajustado com base no peso corporal individual.

[091]Raios X de ambas as tíbias foram realizados em todos os camundongos em seis e oito semanas pós-inoculação (quatro e seis semanas pós-tratamento inicial). A avaliação visual da lise óssea das tíbias direitas inoculadas foi feita a partir de cada imagem de raio X e uma contagem foi fornecida para indicar a severidade da lise e a presença de um músculo da pata alargado. O grau de lise foi concedido em uma escala de 0 (nenhuma lise) a 4 (lise óssea muito severa). A presença de um músculo da pata alargado, como indicado por uma protuberância do tecido muscular é concedida uma contagem adicional de 0,5.

[092]A tíbia inoculada direita foi excisada de todos os camundongos em todos os grupos no término. Tíbias excisadas foram conservadas em formalina tamponada neutra a 10 % para a análise microCT (Adelaide Microscopy, Adelaide, SA, Austrália), compreendendo Volume de Osso Total (TBV), Volume de Osso Trabecular (Tb.BV), Fator Padrão Trabecular (Tb.Pf) e Índice de Modelo Estrutural (SMI).

[093]O Volume de Osso Total (TBV) (mm3) é uma medida do volume de osso trabecular (Tb.BV) e cortical total (mm3) dentro do volume de interesse (VOI), onde o VOI inclui a região em seção transversal consistindo nos ossos corticais e trabeculares. O Fator Padrão Trabecular (Tb.Pf) (mm-1) é um índice de fragmentação inverso, que indica a conectividade estrutural com a aplicação específica ao osso trabecular. Um valor de Tb.Pf mais baixo significa treliças trabeculares mais bem conectadas enquanto um valor de Tb.Pf mais alto indica uma estrutura trabecular mais desconectada (isto é mais fragmentação/lise óssea). O Índice de Modelo Estrutural (SMI) é um indicador da prevalência relativa de bastões e placas em uma estrutura 3D tal como o osso trabecular. Este parâmetro é importante na osteólise do osso, que é caracterizada por uma transição de estruturas semelhantes à placa (normais) para estruturas semelhantes a bastão (degradação). Uma placa, cilindro e esfera ideais têm valores de SMI de 0, 3 e 4 respectivamente. Quanto mais alto o valor, mais dano existe. Todos os cálculos estatísticos foram realizados usando Prisma 5.0c (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA).

[094]Um teste t pareado foi usado para determinar se o peso corporal mudou significantemente dentro de um grupo de tratamento entre o Dia 0 e o término do estudo. Onde os dados não passaram no Teste de Normalidade, o Teste de Pares Combinados de Wilcoxon foi realizado.

[095]A comparação da contagem de lise óssea avaliada em imagens de raio X em seis e oito semanas pós-inoculação foi feita entre todos os grupos. Como ambos os conjuntos de dados falharam no Teste de Normalidade, a Análise de Uma Via de Variância de Kruskal-Wallis (ANOVA) em Ranks foi realizada. Comparação Múltipla vs Procedimento de Controle (Método de Dunn) foi realizado para comparar cada tratamento com o Veículo.

[096]A comparação de parâmetros de lise óssea avaliados por varredura microCT de tíbias excisadas inoculadas foi feita entre os camundongos nos Grupos 1, 2 e 5. Para dados normalmente distribuídos, um ANOVA de Uma Via foi realizado, e a comparação entre todos os grupos feita usando o Teste de Comparação Múltipla de Tukey. Onde os dados falharam no Teste de Normalidade, a Análise de Uma Via de Variância (ANOVA) de Kruskal-Wallis em Ranks foi realizada. Neste caso, a comparação entre todos os grupos foi feita usando Todo Procedimento de Comparação Múltipla aos Pares (Método de Dunn). Um valor de p de menos do que 0,05 foi considerado significante.

Resultados e Observações

[097]Nenhum sinal clínico adverso foi observado em camundongos que recebem tratamento com polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 ou Zometa (Grupos 2 a 5). Nenhum camundongo que recebe tratamento com polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 ou Zometa (Grupos 2 a 5) perdeu peso corporal em excesso de 15 % do peso inicial durante o período de estudo. Houve ganho de peso corporal médio significante (p < 0,05) em todos os grupos (Tabela 8).

[098]Imagens de raio X de ambas as tíbias foram tomadas de todos os camundongos no Dia 28 e 42 (seis e oito semanas pós-inoculação). A avaliação visual da lise óssea das tíbias direitas inoculadas foi feita a partir de cada imagem de raio X e uma contagem foi fornecida para indicar a severidade de lise e a presença de um músculo alargado na pata inoculada (Tabela 9, e Figura 8 e Figura 9). O tratamento com polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 em todas as doses (1, 5 e 10 mg/kg; Grupos 2, 3 e 4, respectivamente) e Zometa (Grupo 5) resultou em inibição significante (p < 0,05) da lise óssea avaliada em imagens de raio X tomadas em tanto nas seis quanto nas oito semanas pós-inoculação comparado com o Controle de Veículo (Grupo 1).Tabela 8: Mudanças de Peso Corporal e Número de Sobrevivência para Cada Grupo no Final do Estudo

Tabela 9: Contagem de raio X Média de Lise Óssea em Tíbias Inoculadas ± SEM em Seis Semanas e Oito Semanas Pós-inoculação para Cada Grupo

a: significantemente diferente para o Veículo (Grupo 1) (p < 0,05, ANOVA de Uma Via de Kruskal-Wallis em Ranks) Legenda da Contagem: 0 Nenhuma lise óssea 1 Lise óssea de início/suave 2 Lise óssea moderada 3 Lise óssea severa 4 Lise óssea muito severa Músculo alargado - contagem + 0,5 Tabela 10: Parâmetros de Lise Óssea Médios no Término ± SEM para CadaParâmetro para os Grupos 1,2 e 5, Medidos por Varredura microCT

a: significativamente diferente para o Veículo (Grupo 1) (p < 0,05, ANOVA de Uma Via ou ANOVA de Uma Via de Kruskal-Wallis em Ranks) Legenda:

[099]Parâmetros de varredura microCT para a avaliação da lise óssea incluíram uma análise morfométrica tridimensional compreendendo Volume de Osso Total (TBV), Volume de Osso Trabecular (Tb.BV), Fator Padrão Trabecular (Tb.Pf) e Índice de Modelo Estrutural (SMI). Os dados são apresentados na Tabela 10. Imagens representativas de varreduras microCT de um animal em cada um dos grupos analisados são apresentadas na Figura 10 e Figura 11. O tratamento tanto com polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 em 1 mg/kg (Grupo 2) quanto com Zometa (Grupo 5) resultou em inibição significante (p < 0,05) da lise óssea comparado com o Controle de Veículo (Grupo 1), indicado por todos os parâmetros de varredura microCT (TBV e Tb.BV significantemente mais altos, e Tb.Pf e SMI significantemente mais baixos).

[0100]Portanto, segue-se que o polipeptídeo da SEQ ID NO. 1 (1, 5 e 10 mg/kg, s.c. 3 x por semana por 6 semanas) foi eficaz em prevenir a lise óssea induzida por células de câncer de mama humano MDA-MB-468, inoculadas nas tíbias de camundongos Nude-Foxn1nu Atímicos fêmeas. Esta eficácia, medida por imagiologia de raio X em seis e oito semanas pós-inoculação e varredura microCT das tíbias excisadas no término (oito semanas pós-inoculação) não pareceu ser dependente de dose. Do mesmo modo o composto de referência para estes estudos, Zometa (0,1 mg/kg, i.v. 3 x por semana por 6 semanas) também demonstrou eficácia.

[0101]“Zometa” é uma marca registrada da Novartis AG Corporation, Suíça. “Prolia” e “Xgeva” são marcas registradas da Amgen Inc., a Delaware Corporation.

[0102]Todas as publicações e patentes mencionadas aqui são por meio desta incorporadas por referência em sua totalidade como se cada publicação ou patente individual fosse específica e individualmente indicada como sendo incorporada por referência.

[0103]Embora formas de realização específicas do assunto fossem debatidas, o relatório descritivo acima é ilustrativo e não restritivo. Muitas variações tornar-se-ão evidentes àqueles habilitados na técnica na revisão deste relatório descritivo e das reivindicações abaixo. O escopo total da invenção deve ser determinado por referência às reivindicações, junto com seu escopo total de equivalentes, e ao relatório descritivo, junto com tais variações.

Claims (7)

1. Polipeptídeo que se liga ao RANKL humano, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo é capaz de inibir a diferenciação de osteoclastos induzida por RANKL em um ensaio in vitro com base em células com uma EC50 de cerca de 50 ng/ml ou a mais de 10% a uma concentração de 100 ng/ml, compreendendo: uma primeira sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 1 a 215 de osteoprotegerina humana; e uma segunda sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 103 a 329 de Fc de imunoglobulina humana gama-1; em que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.

2. Composição terapêutica de injeção para o tratamento ou prevenção de doenças associadas à remodelagem óssea CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um polipeptídeo que se liga ao RANKL humano, em que o polipeptídeo compreende uma primeira sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 1 a 215 de osteoprotegerina humana; e uma segunda sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 103 a 329 de Fc de imunoglobulina humana gama-1; em que o dito polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1.

3. Ácido nucleico isolado CARACTERIZADO pelo fato de que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, em que a sequência do ácido nucleico compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO. 2.

4. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o uso de códon é otimizado para expressão alta do dito polipeptídeo em uma célula mamífera.

5. Vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 3 ou 4.

6. Uso de um polipeptídeo, conforme definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença associada com remodelagem óssea.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita doença é um câncer de mama.

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