CN1876818A - 一类能在真核细胞中高效表达人肝细胞生长因子的重组质粒 - Google Patents
一类能在真核细胞中高效表达人肝细胞生长因子的重组质粒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1876818A CN1876818A CN 200510074858 CN200510074858A CN1876818A CN 1876818 A CN1876818 A CN 1876818A CN 200510074858 CN200510074858 CN 200510074858 CN 200510074858 A CN200510074858 A CN 200510074858A CN 1876818 A CN1876818 A CN 1876818A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hgf
- sequence
- recombinant plasmid
- pgk
- people
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医学领域中的裸DNA基因治疗范畴。本发明在构建人肝细胞生长因子(HGF)重组质粒时,将HGF基因组DNA序列中的部分内含子序列引入进来。使得该重组质粒在真核细胞中的表达量与只是cDNA序列的重组质粒相比,大大提高(约100倍)。从而克服了当前裸DNA基因治疗转染率低而导致治疗效果差的问题。
Description
一.技术领域
本发明属于生物医学领域中裸DNA基因治疗范畴,是构建含有人HGF cDNA以及少量人HGF内含子的重组质粒,使人HGF在真核细胞内大量表达。
二.背景技术
动脉闭塞症是一类严重威胁人类健康的血管疾病,主要包括下肢动脉闭塞症和冠状动脉闭塞症,其临床上的共同特点是都有动脉供血不足的症状,具有疼痛难忍,病程长,治疗难度大等特点,并严重影响患者的生活与工作。目前尚无较好的药物治疗方法,主要是借助外科手术治疗,但经过外科手术治疗后的病人,并发症多,预后差,最终可能发展为截肢或全身衰竭。因此,人们迫切需要研究治疗动脉闭塞症的新方法及新药物。
近年来,随着现代分子生物学技术的发展,使得基因治疗在许多领域的应用成为现实,使用基因治疗来医治缺血性疾病已逐步从实验室走向临床。通过合适的载体介导转移促血管生长的基因促进血管生成,可以在缺血局部开成侧枝循环,建立“分子搭桥”机制,增加血供量,从而达到治疗目的。
目前已知的能调节血管再生的因子有,血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子与肝细胞生长因子(HGF)。肝细胞生长因子由间质细胞合成分泌,最初认为它的靶细胞为肝细胞,能刺激肝细胞进行有丝分裂,近年来已发现它也具有很强的促进新血管生成作用,作用比VEGF和成纤维细胞生长因子还强。
现已在临床上试验用于治疗血管闭塞症的基因药物有VEGF与HGF,使用的载体主要有腺病毒载体(AV)、腺相关病毒载体(AAV)和重组质粒载体,在这三种载体中,AV与AAV使用较多,主要是由于它们的病毒特性,使得转染率很高,易于携带基因进入人体细胞,然而正是由于它们的病毒特性,使得基因治疗的安全性成为倍受关注的问题。与AV与AAV相比,重组质粒由于其无生命形式,除非进入细胞,否则很快消失,使得基因治疗的安全性大大提高,但是重组质粒载体也有一个很大的缺点,就是在没有外力的作用下,它进入细胞的几率很低,使得在临床上要大量的给药或者是用基因枪注射,才能起到治疗效果。
三.发明内容:
本发明通过将人HGF的部分基因组内含子序列引进大量提高重组质粒进入细胞后的目的蛋白表达量,从而克服重组质粒转化率低、导致治疗效果差这一技术问题。
Nakamura等利用Northern Blot证实HGF mRNA的大小为6kb,并在1989年克隆出大鼠和人的HGF cDNA,人的HGF核苷酸序列中由一个2184核苷酸长的开放阅读框架和3580核苷酸长的3个富含A-U序列的非编码区组成。HGF的α和β亚基编码在同一mRNA中,728个氨基酸的多肽由人的cDNA编码,从甲硫氨酸开始的前31个氨基酸残基是疏水的,这是一种典型的信号序列,β亚基的N端直接连在α亚基的C端,蛋白水解位点在α、β亚基之间的Arg-Val(第495和496残基)。因此,成熟的HGF二聚体是经蛋白酶从一个含728个氨基酸的原前体蛋白(Pre-Pro-Precursor)切割而来,α、β亚基分别有643个和234个氨基酸。HGF与纤溶酶原有38%的同源性,HGF的α链有4个Kringle结构,与纤溶酶原A链的5个Kringle结构相似,每个Kringle结构由两个外显子编码,并且外显子一内含子的排列也与纤溶酶原相似,这说明HGF基因和纤溶酶原基因可能由同一原祖基因复制的。另一方面,HGF的β链与各种丝氨酸蛋白酶和纤溶酶原的β链同源,但在丝氨酸水解酶活化位点的Ser和His在HGF的β链中被Glu和Tyr替换,所以HGF不显示水解活性。最近,Seki等克隆并分析了人HGF基因,人HGF基因长大约70kb,含有18个外显子,分别被17个内含子隔开;第一个外显子编码5′端非翻译区和信号肽,接下去的10个外显子编码具有4个Kringle结构的α链,每个Kringle结构由两个被称为Kringle内含蛋白的外显子编码,α、β链之间的水解位点由第12个外显子编码,剩下6个外显子编码β链;最后第18个外显子编码β链C末端和一个3′端非编码区。根据S1核酸酶图谱和引物扩增分析判断,人HGF基因的主要转录起始点位于转录起始密码上游76bp处,按新的基因定位法,确定了人HGF基因位于染色体7q 21.1上。
在常用的以HGF作为治疗基因的基因药物中,无论是使用AV、AAV或者重组质粒,人们总是使用HGF的cDNA,没有人使用基因组的DNA序列(包括内含子序列)。这主要是因为基因组序列太大,没办法构建到载体上,且使得药物更加不易转染到细胞内。然而,众所周知,真核表达系统中蛋白表达一般是从基因组序列转录、加工、翻译而来。我们用重组载体把目的基因送入细胞后,要利用真核细胞的表达系统产生目的蛋白,那么,该蛋白在基因组序列中的内含子序列肯定有一部分在表达过程中起到重要作用。基于上述的观点,我们在大量的筛选试验中发现HGF基因组基因中的外显子4、5间,8、9间和15、16间的部分内含子序列对重组质粒的表达起着很重要的作用。于是,我们用基因工程方法构建了重组质粒pGK0、pGK1、pGK2、pGK3、pGK4、pGK5、pGK6(如图1),并将它们做了体外表达量比较试验,发现含有内含子的质粒pGK1、pGK2、pGK3、pGK4、pGK5、pGK6比只含有HGF cDNA的pGK0质粒表达量高60-100倍,在体外试验中,pGK1、pGK2、pGK3局部注射兔后肢缺血模型中表现出很好的疗效,远高于pGK0。
四.附图说明:
图1为pGKn的质粒结构示意图,标明了该重组质粒的完整结构。包括HGF表达启动序列CMV,HGF表达基因序列HGF0~6,BGH polyA表达终止序列,重组质粒复制序列ori,重组质粒筛选标记序列kan R。
图2用于构建pGK0~6的HGF基因序列示意图分别标明内含子插入的位置。
图3琼脂糖电泳表明pGK1重组质粒的纯化前后。
图4pGK0~6分别注射到小鼠肌肉后,用Elisa KIT检测到的HGF蛋白表达量的比较立柱图,用于说明不同序列的HGF基因在真核细胞内的表达量。
图5pGK0、pGK1、pGK2、pGK3注射到兔后肢缺血模型后,新生血管数的比较。
五.具体实施方式
(一)、重组质粒pGK的构建
首先,利用PCR方法,以pUC19为模板扩增出0.7kb的ColE1序列。以Invitragen公司的pcDNA3.1为模板扩增出1kb的DNA片段,该片段包含有细胞病毒启动子,多克隆位点和牛生长激素终止子;以Navagen公司的pET-9a为模板扩增出0.9kb的磷酸转移酶基因(抗卡那霉素),然后用T4连接酶将三个片段顺序连接形成新的重组真核表达质粒pK。
然后,以PubMed中报道的HGF cDNA为模板,扩增出HGF蛋白的cDNA全序列。用限制性内切酶处理HGF片段与质粒pK,再用T4连接酶将HGF片段顺式插入到pK质粒中形成重组质粒pGK0。详细结构如图1,再以Genebank中报道的HGF基因组基因为模板扩增出外显子4和5、8和9、15和16之间的内含子片段且经过加工。
外显子4和5间的内含子片段留下距外显子4的3’端下游1-300bp,距外显子5的5’端上游1-1.2kb的两段片段按原顺序组合成内含子X1;外显子8和9间的内含子片段留下距外显子8的3’端下游1-300bp,距外显子9的5’端上游1-1.2kb的两段片段按原顺序组合成内含子X2;外显子15和16间的内含子距外显子15的3’端下游1-300bp,距外显子16的5’端上游1-1.2kp的两段片段按原顺序组合成为内含子X3,三个片段长度从1.2kb到1.5kb。
将X1插入到pGK0中的HGF cDNA外显子4、5间得到pGK1。
将X2插入到pGK0中的HGF cDNA外显子8、9间得到pGK2。
将X3插入到pGK0中的HGF cDNA外显子15、16间得到pGK3。
将X1插入到pGK0中的HGF cDNA外显子4、5间且将X2插入到pGK0中的HGF cDNA外显子8、9间得到pGK4
将X1插入到pGK0中的HGF cDNA外显子4、5间且将X3插入到pGK0中的HGF cDNA外显子15、16间得到pGK5
将X2插入到pGK0中的HGF cDNA外显子8、9间且将X3插入到pGK0中的HGF cDNA外显子15、16间得到pGK6。如图2所示。
二).重组质粒的生产与检定
重组质粒pGK的生产包括:工程菌的构建、工程菌的发酵以及发酵产物的纯化。首先,是将pGKx转化到宿主菌DH5α中,筛选出质粒产量最高的作为工程菌保存。将工程菌进行发酵得到的菌液离心后收取菌泥并根据分子克隆的碱裂解方法来破碎细菌,然后5000rpm,20min离心后,上清经过0.22um的滤膜过滤后,用分子量为30kD的中空纤维膜进行超滤浓缩。然后进行层析,首先是Sepharose 6Fast Flow凝胶过滤层析,平衡液是100mM Tris-HCl,pH7,10mM EDTA,2M硫酸铵,收集目标峰。第二步是Plasmidselect亲和层析,平衡液还是100mM Tris-HCl,pH7,10mM EDTA,2M硫酸铵,上一步的得到的样品直接上样,平衡后用洗脱液100mM Tris-HCl,pH7,10mM EDTA,2M硫酸铵,1.4M NaCl将目标质粒洗下。最后用分子量为30kD的中空纤维膜进行超滤浓缩并换液为生理盐水。电泳检测得到的HGF质粒的纯度大于95%,超螺旋的含量大于90%,(如图3)OD260与OD280的比值大于1.8,残留的RNA和蛋白都检测不到,说明质粒的质量达到了要求。
(三).pGK0~6HGF在小鼠体内表达HGF蛋白量的测定与比较。如图4。
1.动物标本的制定
取4周龄雄性小鼠,饲养一周,淘汰一般状况不好的小鼠。用乙醚麻醉小鼠,用胰岛素注射器分别缓慢肌注pGK(0-6)(5-10/秒)药物0.1ml(100ug/只),针头深度为3-5mm,注射完等5秒钟再拨针,拨针后压5秒。根据试验要求几天后取肌肉组织(在两侧肌腱处切断,取完整的一块肌肉)和脏器。
2.HGF蛋白量的测定
取肌肉组织和脏器,称体重,并记下重量,装在1.5ml试管(conical tube)内,-80℃保存(液氮冰冻)。常温下解冻,装肌肉的试管内放入500μl细胞缓冲液,用匀浆器制成匀浆(手动),4℃放置16小时,4℃ 5000rpm离心30分钟,取上清液,测上清液的总蛋白。按HGF测定盒说明测定上清液有HGF蛋白量(ELISA方法),将测定出来的HGF蛋白量换算成每100mg肌肉内的HGF蛋白量,换算方法如下:
100mg肌肉的HGF蛋白=ELISA方法测得的蛋白量÷(100/肌肉体重mg×总蛋白量)
ELISA方法测得的蛋白单位为pg/ml,应换算成ng/ml,1000pg=1ng
细胞缓冲液的组成:
-1M Tris-HCl(pH7.4)1.25ml(final 25mM)
-1M NaCl 2.5ml(final 50mM)
-Na Deoxycholate 0.25g(final 0.5%)脱氧胆酸盐钠
-IGEPAL CA-6301ml(final 2%)
-10% SDS 1ml(final 0.2%)
in 50ml 3次蒸溜水
-100mM PMSF 0.5ml(final 1mM):PMSF是用之前当场加入。
总蛋白的测定:DC蛋白测定方法(Bio-Rad)
所需物品:分光光度计(750nm)、与分光光度计对应的试管、13×100mm试管、试管架、吸管、搅拌器、DC蛋白测定盒。
HGF蛋白的测定:
原理:
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人HGF单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的HGF与单抗结合,加入生物素化的抗人HGF,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入酶底物OPD,出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492nm处测OD值,HGF浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中HGF浓度。
试剂盒组成:
1.96孔微孔板:一块,已包被抗人HGF单抗。
2.样品稀释液:一瓶
3.第一抗体工作液:一瓶
4.酶标抗体工作液:一瓶
5.底物稀释液:二瓶
6.终止液:一瓶
7.洗涤液(20x):一瓶
8.标准品(冻干粉,16000PG/ml):二管
9.OPD片:三片
10.坐标纸:一张
准备试剂与收集血样:
1.洗涤液:用重蒸水1∶20稀释。
2.底物工作液配制:使用前将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加液5ML。
3.标准品液配制:使用前每管中加入蒸馏水200ul溶解后即可。
检测程序:
1.建立标准曲线:设标准孔8孔,每孔中各加入样品稀释液100ul,第一孔加标准品100ul,混匀后用加样器吸出100ul,移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第七孔,最后,从第七孔中吸出100ul弃去,使之体积均为100ul。第八孔为空白对照。
2.加样:待测品孔每孔各加入待测样品100ul。
3.将反应板充分混匀后置37℃ 120分钟。
4.洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。
5.每孔中加入第一抗体工作液50ul。
6.将反应板置37℃ 60分钟。
7.洗板:同前。
8.每孔加酶标抗体工作液100ul。
9.将反应板置37℃ 60分钟。
10.洗板:同前。
11.每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗处反应5-10分钟。
12.每孔加入1滴终止液混匀。
13.在492nm处测吸光值。
结果计算与判断:
1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.以标准品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0PG/ml之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。
3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应HGF含量。结论:注射pGK1、pGK2、pGK3、pGK4、pGK5、pGK6的动物肌肉内检测到的HGF量远大于注射pGK0的动物,如图4。
3.pGK0、pGK1、pGK2、pGK3在兔后肢缺血模型中生血管效果的比较,如图5、6
(1)兔后肢缺血模型的建立:第一天用戊巴比妥钠30mg/kg iv麻醉(或甲苯噻嗪5mg/kg,氯胺酮50mg/kg im)试验用兔,切除左侧股动脉(结扎股动脉各分支,切除到腘动脉、大隐动脉分叉处),然后肌注庆大霉素3mg/kg/日,3日;吗啡0.3mg/日,10日。第十天时,分别注射pGK0、pGK1、pGK2、pGK3,注射点为内收肌2点,半膜肌1点,股内肌1点。第四十天时评价药效。
(2)兔下肢缺血模型的治疗效果
疗效观察方法-1:选择性髂内动脉造影术(Pu方法):
1.从右侧颈动脉插管到左侧髂内动脉(3F Terumo,Japan)
2.注入造影剂5ml,1ml/秒
3.照相
血管的计数:
取注入造影剂后第4秒照的图片,在大腿中间划一条与大腿垂直的线,数经过这条线的所有血管,重复数两次,取平均值。
疗效观察方法-2:组织学图片检查:
取兔子半膜肌、内收肌和腓肠肌,用液化淡冰冻,做组织切片,再用H.E.染色后在显微镜下观察,数1000个肌细胞内的毛细血管数。
总结:注射pGK1、pGK2、pGK3的动物在肌肉内产生的新血管数量大于注射pGK0的动物,如图5。
Claims (8)
1.一类能在真核细胞中高效表达肝细胞生长因子的重组质粒,其特征为:用于构建的人HGFcDNA中含有部分人HGF基因组序列中的内含子序列。
2.权利要求1中所述的质粒中HGF序列中所含的内含子为人HGF基因组序列中外显子4、5间的部分序列。
3.权利要求1中所述的质粒中人HGF序列中所含的内含子为人HGF基因组序列中外显子8、9间的部分序列。
4.权利要求1中所述的质粒中人HGF序列中所含的内含子为人HGF基因组序列中外显子15、16间的部分序列。
5.权利要求1中所述的重组质粒中,可以同时保留权利要求2、3、4中所述的部分内含子序列的两个。
6.权利要求2、3、4、5中所述的质粒中人HGF序列中所含的内含子序列,其长度在300-15000bp间,且其核酸序列能与HGF基因组核酸序列中相应的内含子序列,在强烈的反应条件下能杂交。
7.权利要求1所述的重组质粒,主要用于临床上肢体缺血性疾病以及缺血性心脏病。
8.权利要求1所述的重组质粒,在临床上使用时,仅需要裸DNA局部肌肉直接注射就能达到治疗效果。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200510074858 CN1876818A (zh) | 2005-06-07 | 2005-06-07 | 一类能在真核细胞中高效表达人肝细胞生长因子的重组质粒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200510074858 CN1876818A (zh) | 2005-06-07 | 2005-06-07 | 一类能在真核细胞中高效表达人肝细胞生长因子的重组质粒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1876818A true CN1876818A (zh) | 2006-12-13 |
Family
ID=37509373
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200510074858 Pending CN1876818A (zh) | 2005-06-07 | 2005-06-07 | 一类能在真核细胞中高效表达人肝细胞生长因子的重组质粒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1876818A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108611367A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-10-02 | 北京诺思兰德生物技术股份有限公司 | 一类通过质粒载体介导的基因治疗重组载体 |
CN111542613A (zh) * | 2017-12-29 | 2020-08-14 | 赫利世弥斯株式会社 | 导入有杂交的肝细胞生长因子的腺相关病毒载体 |
-
2005
- 2005-06-07 CN CN 200510074858 patent/CN1876818A/zh active Pending
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111542613A (zh) * | 2017-12-29 | 2020-08-14 | 赫利世弥斯株式会社 | 导入有杂交的肝细胞生长因子的腺相关病毒载体 |
US11634728B2 (en) | 2017-12-29 | 2023-04-25 | Helixmith Co., Ltd | Adeno-associated virus (AAV) vector having hybrid HGF gene introduced thereto |
CN111542613B (zh) * | 2017-12-29 | 2023-11-21 | 赫利世弥斯株式会社 | 导入有杂交的肝细胞生长因子的腺相关病毒载体 |
CN108611367A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-10-02 | 北京诺思兰德生物技术股份有限公司 | 一类通过质粒载体介导的基因治疗重组载体 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107949638A (zh) | 新型人血清白蛋白突变体 | |
CN106755372A (zh) | 一种分子标志物在口腔鳞状细胞癌诊断和治疗中的应用 | |
CN102443064A (zh) | 一种基于凝血酶活性的双靶向作用的嵌合多肽及其应用 | |
CN116286996A (zh) | 一种靶向cxcl16+巨噬细胞的药物载体及其制备方法和应用 | |
US10640772B2 (en) | DNA aptamers binding to molecular targeted agents and detection method of molecular targeted medicine using the same | |
CN1876818A (zh) | 一类能在真核细胞中高效表达人肝细胞生长因子的重组质粒 | |
CN105803069A (zh) | Smr3b基因在垂体瘤诊治中的应用 | |
US9943575B2 (en) | Pharmaceutical compositions of tenecteplase | |
CN101698681B (zh) | 一种双靶向作用的嵌合多肽及其应用 | |
CN107227362A (zh) | 一种与肝癌相关的基因及其应用 | |
CN1654478A (zh) | 聚乙二醇修饰α-干扰素1b的制备方法 | |
CN104926946A (zh) | 具有延长体内半衰期的adamts13-mdtcs融合蛋白及其应用 | |
CN1786175A (zh) | 一种表达重组人tPA的质粒及构建方法 | |
CN100351381C (zh) | 一种新的类凝血酶基因及其应用 | |
RU2607527C2 (ru) | Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения | |
CN1232532C (zh) | 成纤维细胞生长因子-2结构类似物,其生产方法及应用 | |
CN1197873C (zh) | 人结缔组织生长因子及其制备方法 | |
CN113956989B (zh) | 一种分泌尿酸氧化酶的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
CN1468862A (zh) | 生产重组人组织型纤溶酶原激活剂tnk突变体的工艺方法 | |
CN105624313A (zh) | 一种用于肺腺癌诊疗的分子标记物 | |
CN106868197A (zh) | 基因标志物在多发性骨髓瘤中的应用 | |
CN102772782B (zh) | 一种新的肝癌分子标志物视黄酸受体应答蛋白2 | |
CN102258483B (zh) | 一种抗血栓的重组巴曲酶冻干制剂 | |
RU2604686C2 (ru) | Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения | |
RU2605385C2 (ru) | Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |