RU2605385C2 - Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови - Google Patents
Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2605385C2 RU2605385C2 RU2015150088/15A RU2015150088A RU2605385C2 RU 2605385 C2 RU2605385 C2 RU 2605385C2 RU 2015150088/15 A RU2015150088/15 A RU 2015150088/15A RU 2015150088 A RU2015150088 A RU 2015150088A RU 2605385 C2 RU2605385 C2 RU 2605385C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thymosin beta
- polysialic acid
- beta
- thymosin
- conjugate
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/2292—Thymosin; Related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности. Разработан способ региоселективного химического N-концевого сиалирования тимозина бета 4. Указанным способом получен моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, обладающий улучшенными фармакокинетическими свойствами. Подтверждена модификация N-концевой альфа-аминогруппы тимозина бета 4. Применение группы изобретений позволяет получить моносиалированный тимозин бета 4, обладающий пролонгированной стабильностью в токе крови, с высоким выходом. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области модификации белков, в частности касается аналогов тимозина бета 4 с пролонгированным временем циркуляции в крови. Оно может быть использовано для получения аналогов человеческого тимозина бета 4.
Уровень техники
Тимозин бета 4 - это пептид, вырабатываемый клетками тимусовой железы, который участвует в регуляции полимеризации актина, а также участвует в пролиферации, миграции и дифференциации клеток. Эти свойства тимозина бета 4 определяют его ценность в качестве медицинского препарата, особенно при лечении ишемической болезни сердца.
Тимозин бета 4 человека представляет собой 43-членный пептид ацетилированный по N-концевой α-аминогруппе.
Немодифицированный тимозин бета 4 получают биотехнологическим методом с помощью технологии рекомбинантной ДНК и далее модифицируют путем избирательного химического ацетилирования N-концевой альфа-аминогруппы. Такой способ описан в работах (К.А. Бейрахова, В.Н. Степаненко, А.И. Мирошников, Р.С. Есипов / Биотехнологический способ получения ацетилированного тимозина бета 4 // Биоорганическая химия, 2011, том 37, №2, с. 1-10), (Д.А. Макаров, Т.И. Муравьева, В.Н. Степаненко, В.И. Швец, Р.С. Есипов, 2014. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения рекомбинантного тимозина-бета 4 человека до пилотного производства. Биотехнология 4, 35-44)
Природный тимозин бета 4 - коротко живущий пептид, и период его полувыведения из крови напрямую зависит от вводимой дозы в организм [Mora С.А., Baumann С.А., Paino J.E., Goldstein A.L., Badamchian M. / Biodistribution of synthetic thymosin beta4 in the serum, urine, and major organs of mice // Int. J. Immunopharmacol.1997 Jan; 19(1):1-8], что создает трудности при его администрировании. Стандартный подход, применяемый для повышения стабильности терапевтического белка, заключается в присоединении к нему химическими или энзиматическими методами различных защитных групп, обеспечивающих защиту от протеалитических ферментов [Jevsevar S., Kunstelj М., Porekar V.G. PEGylation of the therapeutic proteins. Biotechnol J. 2010 Jan; 5(l):l 13-28; Schlapschy M., Binder U., C., Theobald I., Wachinger K., Kisling S., Haller D., Skerra A. PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins. ProteinEngDesSel. 2013 Aug; 26(8):489-501; Susanne M Mumby. Reversible palmitoylation of signaling proteins/ Current Opinionin Cell Biology Volume 9, Issue 2, April 1997, Pages 148-154]. Но принципиальная сложность такого подхода по отношению к тимозину бета 4 заключается в том, что химическая модификация тимозина бета 4 предпочтительна только по N-концевой альфа-аминогруппе. Присоединение функциональной группы к любому другому аминокислотному остатку внутри пептида изменит его нативную структуру, что, в свою очередь, приведет к потере его биологической активности. Известно, что биологическая активность тимозина бета 4 определяется активными сайтами в коротких пептидных последовательностях, так, например, его основной актинсвязывающий сайт расположен в аминокислотных остатках 17-22, основной сайт, проявляющий антиапоптозную активность и осуществляющий защиту от токсичности, располагается в аминокислотных остатках 1-15, а сайт, представляющий собой первые четыре аминокислотных остатка Ac-SPDK, первый из которых ацетилирован по N-концевой альфа-аминогруппе, обладает широким спектром биологической активности. Связано это с тем, что природная посттрансляционная модификация пептида - присоединение ацетильной группы происходит именно по N-концевой альфа-аминогруппе тимозина бета 4. Поскольку концентрация тимозина бета 4 в крови уже через 2 часа падает до базального уровня после его администрирования [Mora С.А., Baumann С.А., Paino J.E., Goldstein A.L., Badamchian M. Biodistribution of synthetic thymosin beta 4 in the serum, urine, and major organs of mice. Int JImmunopharmacol. 1997 Jan; 19(1):1-8], существует потребность в аналогах тимозина бета 4 с пролонгированным временем циркуляции в крови.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к созданию стабильного в токе крови аналога тимозина бета 4 посредством региоселективного химического сиалирования тимозина бета 4. Конкретнее, настоящее изобретение раскрывает способ получения модифицированного тимозина бета 4 с пролонгированной стабильностью в токе крови с высоким выходом, за счет региоспецифической моноконъюгации тимозина бета 4 с бутиральдегидным производным полисиаловой кислоты по свободной N-концевой альфа-аминогруппе тимозина бета 4.
Изобретение иллюстрируется следующими рисунками.
Фиг 1. Формула бутиральдегидного производного полисиаловой кислоты.
Фиг 2. А - Профиль полупрепаративной хроматографической очистки продуктов реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4. Колонка Диасорб 130 С16Т, 8 мкм, 15Х250 мм. Разделение проводили в градиенте 80% ацетонитрила с 5% NH4OAc 8-23%. В - Электрофоретический анализ фракций полупрепаративной ОФ ВЭЖХ:М - стандарт универсальных масс, 1-23 кДа, 2-22 кДа, 3-21 кДа, 4-20 кДа, 5-18 кДа, 6-17 кДа, 7-16 кДа, 8-15,5 кДа, 9-15 кДа продукты реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4.
Фиг 3. Хроматографический профиль продуктов протеолитического расщепления конъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4.
Фиг 4. Однобуквенная последовательность дезацетилтимозина бета 4. Результаты протеолитического расщепления моносиалированного тимозина бета 4.
Подробное описание изобретения
Химическая модификация молекулы белка полисиаловой кислотой направлена на улучшение переносимости препарата, снижение иммуногенности и повышение периода его полужизни. Полисиаловая кислота неиммунногенна и биодеградируема, кроме того уменьшает иммуногенность самого модифицируемого белка. Свойства, демонстрируемые ПСК, позволяют молекулам белка избежать фагоцитоза и увеличить свое время циркуляции в крови. Реакцию сайтспецифического сиалирования тимозина бета 4 проводили только при рН не ниже 4,5 поскольку при более низких значениях рН происходит деградация полисиаловой кислоты. Характерным аспектом изобретения является региоспецифический способ сиалирования, включающий моноселективную конъюгацию альдегида полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 по свободной N-концевой альфа-аминогруппе пептида в буферном растворе для сиалирования при мольном соотношении белок/ПСК 1:5. Техническим результатом региоселективной химической модификации является образование моносиалированного тимозина бета 4, выход которого составляет не ниже 60%.
Под буферным раствором для сиалирования подразумевается многокомпонентный водно-органический буферный раствор, содержащий 30% ацетонитрила, который обеспечивает постоянное значение рН 4,5. Такой буфер с концентрацией от 5 мМ до 100 мМ может содержать соли уксусной, лимонной, глутаминовой, фосфорной, сорбиновой, янтарной кислот или 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), список не ограничивается перечисленным.
Техническим результатом изобретения является получение моносиалированного тимозина бета 4, обладающего в 3 раз большим временем полувыведения из плазмы крови по сравнению с тимозином бета 4.
Осуществление изобретения
Пример 1
Получение моносиалированного тимозина бета 4.
К растворенному в буфере (50 мМ ацетат натрия, 30% ацетонитрила, рН 4.5) дезацетилтимозину бета 4 добавляют 80 мг цианборгидрида натрия и 140 мг бутиральдегидного производного полисиаловой кислоты, тщательно перемешивают и инкубируют в течение 3 ч при 25°C. Идентификацию образующегося моносиалированного тимозина бета 4 проводят методом электрофореза в денатурирующих условиях. Реакционную смесь разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и наносят на колонну Диасорб 130 С16Т, 8 мкм, 15Х250 мм. Разделение проводят в градиенте 80% ацетонитрила с 1% NH4OAc (8-23% за 60 мин). Фракции, содержащие моносиалированный тимозин бета 4 более 98%, объединяют и лиофилизуют. На фигуре 2 под буквой А изображен профиль полупрепаративной хроматографической очистки сиалированного тимозина бета 4, фракции 1-9 соответствуют моносиалированному тимозину бета 4 с разной молекулярной массой. Под буквой В изображен электрофоретический анализ фракций с 1 по 9.
Пример 2
Подтверждение структуры моносиалированного тимозина бета 4.
Лиофилизованный аналог тимозина бета 4 и химически синтезированный тимозин бета 4 в количестве 200 мкг (считают по пептиду) растворяют в 50 мкл буфера (50 мМ Трис/HCl, рН 8,0), затем добавляют 5 мкл 0,067 мг/мл раствора Asp-N протеиназы (0,335 мкг) и инкубируют в течение 3 ч при 37°C. Протеолитическую смесь анализируют методом хромато-масс-спектрометрии. Хроматографические профили продуктов протеолитического расщепления соответствуют профилям на фиг 3. Молекулярные массы фрагментов пептидов соответствуют значениям на фиг 4.
Пример 3
Тестирование стабильности аналога тимозина бета 4 и химически синтезированного тимозина бета 4 на сыворотке крови.
Стабильность определяют как время, за которое в сыворотке крови остается 50% пептида от исходного количества (Т1/2). Сыворотку крови выделяют из крови кролика по стандартным протоколам. Расфасовывают по 50 мкл и замораживают на -70°C. Расфасованную сыворотку крови используют однократно. Тестируемые образцы растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в концентрации 10 мг/мл в 50 мкл сыворотки крови и инкубируют в течение 1-24 ч при 37°C. Смесь анализируют методом хромато-масс-спектрометрии. Стабильность измеряют по изменению площади поглощения исследуемого образца со временем. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов определяют параметрическим методом. Для тимозина бета 4 Т1/2 соответствует 2 ч, для сиалированного тимозина бета 4 Т1/2 соответствует 6 ч.
Claims (2)
1. Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, включающий растворение дезацетилтимозина бета 4 в многокомпонентном водно-органическом буфере с рН 4.5, обеспечивающем региоселективное сиалирование и содержащем цианборгидрид натрия и бутиральдегидное производное полисиаловой кислоты, тщательное перемешивание и инкубирование в течение 3 ч при 25°C, очистку методом ОФ ВЭЖХ и лиофилизацию.
2. Ковалентный моноконъюгат линейной полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, полученный способом по п. 1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015150088/15A RU2605385C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015150088/15A RU2605385C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015150088A RU2015150088A (ru) | 2016-03-20 |
RU2605385C2 true RU2605385C2 (ru) | 2016-12-20 |
Family
ID=55530811
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015150088/15A RU2605385C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2605385C2 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9173951B2 (en) * | 2008-09-19 | 2015-11-03 | Nektar Therapeutics | Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof |
-
2015
- 2015-11-23 RU RU2015150088/15A patent/RU2605385C2/ru active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9173951B2 (en) * | 2008-09-19 | 2015-11-03 | Nektar Therapeutics | Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
D. RUFF et al. A randomized, placebo-controlled, single and * |
D. RUFF et al. A randomized, placebo-controlled, single and multiple dose study of intravenous thymosin β4 in healthy volunteers. Vol. 1194, Thymosins in Health and Disease: 2nd International Symposium. PP. 223-;229. LIVANIOU E. et al. A thymosin beta 4 ELISA using an antibody against the N terminal fragment thymosin beta 4 [1-14]. J. Immunol. Methods. 1992 Apr 8, 148, (1-2), PP. 9-14. JOSHUA K. AU. et al. Widely Distributed Residues in Thymosin Beta-4 Affect the Kinetics and Stability of Actin Binding. Vol. 1112, Thymosins in Health and Disease First International Symposium. PP. 38-44. * |
МАКАРОВ Д.А., ЕСИПОВ.Р.С. Получение конъюгатов полисиаловой кислоты и пэг с рекомбинантным тимозином бета-4. VI РОССИЙСКИЙ СИМПОЗИУМ ";БЕЛКИ И ПЕПТИДЫ";, Уфа, 11-15 июня 2013 г. C.215. Найдено в Интернет 08.08.2016 на http://propep.ru/docs/sbornik_tezisov.pdf. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2015150088A (ru) | 2016-03-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Laico et al. | Isolation of the fundamental polypeptide subunits of biological membranes | |
CN103068839B (zh) | 改进的重组人促卵泡激素 | |
MX2011000847A (es) | Proteinas conjugadas con eficacia prolongada in vivo. | |
CN108064173A (zh) | 胰岛素受体部分激动剂 | |
TWI532495B (zh) | 藥學製劑 | |
BR122020010980B1 (pt) | Preparação farmacêutica compreendendo os polipeptídeos de amilóide p de soro humano, métodos de preparação dos referidos polipeptídeos, e usos terapêuticos | |
CN106459171A (zh) | A22K,desB27,B29R,desB30,在赖氨酸22的ε位置处被酰化的人胰岛素类似物 | |
JP2011525800A (ja) | 長時間にわたる循環半減期を有するn−グリコシル化ヒト成長ホルモン | |
WO2020142275A1 (en) | Methods of producing ustekinumab | |
BRPI0822530A2 (pt) | hormônio do crescimento modificado por polietileno glicol de fita dupla, método de preparação e sua aplicação | |
RU2605385C2 (ru) | Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови | |
RU2604686C2 (ru) | Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения | |
RU2607527C2 (ru) | Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения | |
TWI633115B (zh) | 加成糖鏈之多胜肽及含有該多胜肽之醫藥組成物 | |
Xue et al. | Efficient synthesis of complex glycopeptides based on unprotected oligosaccharides | |
EP4026555A1 (en) | Human recombinant hyposialylated erythropoietin, methods of purification and therapeutic uses thereof | |
Fasoli et al. | Extensive heterogeneity of human urokinase, as detected by two-dimensional mapping | |
JP3522798B2 (ja) | 糖修飾蛋白質の製造法 | |
RU2391354C1 (ru) | Комплекс биологически активного рекомбинантного белка с полисиаловой кислотой | |
RU2661088C1 (ru) | Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза | |
US20050148507A1 (en) | Method for the production of an N-terminally modified chemotactic factor | |
ZA200507702B (en) | Method for the production of an N-terminally modified chemotactic factor | |
Liang et al. | Purification and Activity Evaluation of a Novel Thrombopoietin Mimetic Peptide | |
JPH01102099A (ja) | 生理活性を有する糖タンパク質 | |
EP3738978A1 (en) | In-vivo release sustained recombinant coagulation factor viii and preparation method therefor |