RU2604686C2 - Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения - Google Patents
Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2604686C2 RU2604686C2 RU2015150087/15A RU2015150087A RU2604686C2 RU 2604686 C2 RU2604686 C2 RU 2604686C2 RU 2015150087/15 A RU2015150087/15 A RU 2015150087/15A RU 2015150087 A RU2015150087 A RU 2015150087A RU 2604686 C2 RU2604686 C2 RU 2604686C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- thymosin beta
- beta
- thymosin
- blood
- hexanoic acid
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к области модификации белков, и описывает способ региоселективного химического N-концевого гексаилирования тимозина бета 4, а также моноконъюгат, полученный вышеописанным способом. Способ характеризуется тем, что растворяют ангидрид гексановой кислоты в многокомпонентном водно-органическом буфере с pH 3, обеспечивающим региоселективное гексаилирование и содержащем дезацетилтимозин бета 4, инкубируют его в течение 3 ч при 25°C, очищают методом ОФ ВЭЖХ и лиофилизуют. Моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4 обладает улучшенными фармакокинетическими свойствами. Изобретение позволяет получить моногексаилированный тимозин бета 4 с высоким выходом и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности.2 н.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области модификации белков, в частности касается аналогов тимозина бета 4 с пролонгированным временем циркуляции в крови. Оно может быть использовано для получения аналогов человеческого тимозина бета 4.
Уровень техники
Тимозин бета 4 - это пептид, вырабатываемый клетками тимусовой железы, который участвует в регуляции полимеризации актина, а также участвует в пролиферации, миграции и дифференциации клеток. Эти свойства тимозина бета 4 определяют его ценность в качестве медицинского препарата, особенно при лечении ишемической болезни сердца.
Тимозин бета 4 человека представляет собой 43-членный пептид, ацетилированный по N-концевой α-аминогруппе.
Немодифицированный тимозин бета 4 получают биотехнологическим методом с помощью технологии рекомбинантной ДНК и далее модифицируют путем избирательного химического ацетилирования N-концевой альфа-аминогруппы. Такой способ описан в работах (К.А. Бейрахова, В.Н. Степаненко, А.И. Мирошников, Р.С. Есипов / Биотехнологический способ получения ацетилированного тимозина бета 4 // Биоорганическая химия, 2011, том 37, №2, с. 1-10), (Д.А. Макаров, Т.И. Муравьева, В.Н. Степаненко, В.И. Швец, Р.С. Есипов, 2014. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения рекомбинантного тимозина бета 4 человека до пилотного производства. Биотехнология 4, 35-44).
Природный тимозин бета 4 коротко живущий пептид, и период его полувыведения из крови напрямую зависит от вводимой дозы в организм [Mora CA, Baumann CA, Paino JE, Goldstein AL, Badamchian M / Biodistribution of synthetic thymosin beta 4 in the serum, urine, and major organs of mice // Int. J. Immunopharmacol. 1997 Jan; 19(1):1-8], что создает трудности при его администрировании. Стандартный подход, применяемый для повышения стабильности терапевтического белка, заключается в присоединении к нему химическими или энзиматическими методами различных защитных групп, обеспечивающих защиту от протеалитических ферментов [Jevsevar S, Kunstelj М, Porekar VG. PEGylation of the therapeutic proteins. Biotechnol J. 2010 Jan; 5(1):113-28; Schlapschy M, Binder U, 
, Theobald I, Wachinger K, Kisling S, Haller D, Skerra A. PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins. ProteinEngDesSel. 2013 Aug; 26(8):489-501; Susanne M Mumby. Reversible palmitoylation of signaling proteins / Current Opinionin Cell Biology Volume 9, Issue 2, April 1997, Pages 148-154]. Но принципиальная сложность такого подхода по отношению к тимозину бета 4 заключается в том, что химическая модификация тимозина бета 4 предпочтительна только по N-концевой альфа-аминогруппе. Присоединение функциональной группы к любому другому аминокислотному остатку внутри пептида изменит его нативную структуру, что в свою очередь приведет к потере его биологической активности. Известно, что биологическая активность тимозина бета 4 определяется активными сайтами в коротких пептидных последовательностях, так например, его основной актинсвязывающий сайт расположен в аминокислотных остатках 17-22, основной сайт, проявляющий антиапоптозную активность и осуществляющий защиту от токсичности, располагается в аминокислотных остатках 1-15, а сайт, представляет собой первые четыре аминокислотных остатка Ac-SPDK, первый из которых ацетилирован по N-концевой альфа-аминогруппе, обладает широким спектром биологической активности. Связано это с тем, что природная пострансляционная модификация пептида - присоединение ацетильной группы происходит именно по N-концевой альфа-аминогруппе тимозина бета 4. Поскольку концентрация тимозина бета 4 в крови уже через 2 часа падает до базального уровня после его администрирования [Mora CA, Baumann CA, Paino JE, Goldstein AL, Badamchian M. Biodistribution of synthetic thymosin beta 4 in the serum, urine, and major organs of mice. Int J Immunopharmacol. 1997 Jan; 19(1):1-8], существует потребность в аналогах тимозина бета 4 с пролонгированным временем циркуляции в крови.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к созданию стабильного в токе крови аналога тимозина бета 4 посредством региоселективного химического гексаилирования тимозина бета 4. Конкретнее, настоящее изобретение раскрывает способ получения модифицированного тимозина бета 4 с пролонгированной стабильностью в токе крови с высоким выходом за счет региоспецифического ацилирования тимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты по свободной N-концевой альфа-аминогруппе тимозина бета 4.
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.
Фиг 1. Формула ангидрида гексановой кислоты.
Фиг 2:
A - Профиль полупрепаративной хроматографической очистки продуктов реакции гексаилирования дезацетилтимозина бета 4. Колонка Диасорб 130 С16Т, 8 мкм, 15X250 мм. Разделение проводили в градиенте 80% ацетонитрила с 0,1% ТФУ 15-30%. 1 - дезацетилтимозин бета 4, 2 - моногексаноилтимозин бета 4, 3-5 - побочные продукты реакции.
B - профиль аналитической ОФ ВЭЖХ фракции 2.
C - Масс-спектр аналитической ОФ ВЭЖХ фракции 2.
Фиг 3. Хроматографический профиль продуктов протеолитического расщепления конъюгата капроновой кислоты с тимозином бета 4.
Фиг 4. Однобуквенная последовательность дезацетилтимозина бета 4. Результаты протеолитического расщепления конъюгата капроновой кислоты с тимозином бета 4.
Подробное описание изобретения
Химическая модификация молекулы белка жирными кислотами придает молекуле белка липофильные свойства, что приводит к изменениям в белок/белковых взаимодействиях, связывании с мембраной и таргетных взаимодействиях. Сайтспецифическое ацилирование ангидридом гексановой кислоты возможно только при pH ниже 4. Характерным аспектом изобретения является региоспецифический способ гексаилирования, включающий моноселективное ацилирование тимозина бета 4 ангидридом гексановой (капроновой) кислоты (фиг. 1) по свободной N-концевой альфа-аминогруппе пептида в буферном растворе для гексаилирования. Техническим результатом региоселективной химической модификации является образование моногексаноилтимозина β4, выход которого составляет не ниже 30%.
Под буферным раствором для гексаилирования подразумевается многокомпонентный водно-органический буферный раствор, содержащий 30% ацетонитрила и 15% любого другого органического растворителя, например бутанола или изопропанола, список не ограничивается перечисленным, который обеспечивает постоянное значение pH 3,0. Такой буфер с концентрацией от 5 мМ до 100 мМ может содержать соли уксусной, фосфорной, лимонной кислот, список не ограничивается перечисленным.
Техническим результатом изобретения является получение моногексаилированного тимозина бета 4, обладающего в 4 раз большим временем полувыведения из плазмы крови по сравнению с тимозином бета 4.
Осуществление изобретения
Пример 1
Получение моногексаноилтимозина бета 4.
К растворенному в буфере (50 мМ ацетат натрия, 30% ацетонитрила, 15% бутанола, pH 3) дезацетилтимозину бета 4 добавляют 22,5 мкл ангидрида гексановой кислоты, тщательно перемешивают и инкубируют в течение 3 ч при 25°C. Идентификацию образующегося моногексаноилтимозина бета 4 проводят методом хромато-масс-спектрометрии Реакционную смесь разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и наносят на колонну Диасорб 130 С16Т, 8 мкм, 15X250 мм. Разделение проводят в градиенте 80% ацетонитрила с 0,1% ТФУ (15-30% за 60 мин). Фракции содержащие моногексаноилтимозин бета 4 более 98% объединяют и лиофилизуют. На фигуре 4 под буковой A изображен профиль полупрепаративной хроматографической очистки монокесаноилтимозина бета 4, где 2 - пик, соответствует моногексаноилтимозину бета 4; 3, 4 и 5 - пики - побочные продукты реакции. Под буквой B изображен профиль аналитической ОФ ВЭЖХ фракции, содержащей моногексаноилтимозин бета 4, под буквой C изображен масс-спектр моногексаноилтимозина бета 4.
Пример 2
Подтверждение структуры моногексаилированного тимозина бета 4.
Лиофилизованный аналог тимозина бета 4 и химически синтезированный тимозин бета 4 в количестве 200 мкг (считают по пептиду) растворяют в 50 мкл буфера (50 мМ Трис/HCl, pH 8,0), затем добавляют 5 мкл 0,067 мг/мл раствора Asp-N протеиназы (0,335 мкг) и инкубируют в течение 3 ч при 37°C. Протеолитическую смесь анализируют методом хромато-масс-спектрометрии. Хроматографические профили продуктов протеолитического расщепления соответствуют профилям на фиг 3. Молекулярные массы фрагментов пептидов соответствуют значениям на фиг 4.
Пример 3
Тестирование стабильности аналога тимозина бета 4 и химически синтезированного тимозина бета 4 на сыворотке крови.
Стабильность определяют как время, за которое в сыворотке крови остается 50% пептида от исходного количества (T1/2). Сыворотку крови выделяют из крови кролика по стандартным протоколам. Расфасовывают по 50 мкл и замораживают на -70°C. Расфасованную сыворотку крови используют однократно. Тестируемые образцы растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в концентрации 10 мг/мл в 50 мкл сыворотки крови и инкубируют в течение 1-24 ч при 37°C. Смесь анализируют методом хромато-масс-спектрометрии. Стабильность измеряют по изменению площади поглощения исследуемого образца со временем. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов определяют параметрическим методом. Для тимозина бета 4 T1/2 соответствует 2 ч., для моногексаилированного тимозина бета 4 T1/2 соответствует 8 ч.
Claims (2)
1. Способ получения моноконъюгата капроновой кислоты с тимозином бета 4, включающий растворение ангидрида гексановой кислоты в многокомпонентном водно-органическом буфере с pH 3, обеспечивающим региоселективное гексаилирование и содержащем дезацетилтимозин бета 4, инкубирование в течение 3 ч при 25°C, очистку методом ОФ ВЭЖХ и лиофилизацию.
2. Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, полученный способом по п.1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015150087/15A RU2604686C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015150087/15A RU2604686C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015150087A RU2015150087A (ru) | 2016-05-10 |
| RU2604686C2 true RU2604686C2 (ru) | 2016-12-10 |
Family
ID=55959686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015150087/15A RU2604686C2 (ru) | 2015-11-23 | 2015-11-23 | Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2604686C2 (ru) |
-
2015
- 2015-11-23 RU RU2015150087/15A patent/RU2604686C2/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| К.А. Бейрахова, В.Н. Степаненко, А.И. Мирошников, Р.С. Есипов / Биотехнологический способ получения ацетилированного тимозина бета 4 // Биоорганическая химия, 2011, том 37, N2, с. 1-10. Ruff D., Crockford D., Girardi G., Zhang Y. A randomized, placebo-controlled, single and multiple dose study of intravenous thymosin beta4 in healthy volunteers. Ann N Y Acad Sci. 2010 Apr;1194:223-9. Bubb M.R. "Thymosin beta 4 interactions". Vitamins and Hormones. 2003, 66: 297-;316. Ti Dongdong et.al. Controlled Release of Thymosin Beta 4 Using a Collagen-;Chitosan Sponge Scaffold Augments Cutaneous Wound Healing and Increases Angiogenesis in Diabetic Rats with Hindlimb Ischemia. Tissue Engineering Part A. February 2015, 21(3-4): 541-549. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015150087A (ru) | 2016-05-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Matthew et al. | Lyngbyastatin 4, a dolastatin 13 analogue with elastase and chymotrypsin inhibitory activity from the marine cyanobacterium Lyngbya confervoides | |
| AU2016218977C1 (en) | Nucleic acid products and methods of administration thereof | |
| Du et al. | Mixed macromolecular crowding accelerates the refolding of rabbit muscle creatine kinase: implications for protein folding in physiological environments | |
| Okamoto et al. | Total chemical synthesis and biological activities of glycosylated and non‐glycosylated forms of the chemokines CCL1 and Ser‐CCL1 | |
| BR112012029577A2 (pt) | polipeptídeos helicoidais randômicos prolina/alanina biossintéticos e seus usos. | |
| Wingfield et al. | Folding and purification of insoluble (inclusion body) proteins from Escherichia coli | |
| TW202003586A (zh) | 生長分化因子15融合蛋白 | |
| Platt et al. | Stapling mimics noncovalent interactions of γ-carboxyglutamates in conantokins, peptidic antagonists of N-methyl-D-aspartic acid receptors | |
| Williams et al. | Rolloamides A and B, cytotoxic cyclic heptapeptides isolated from the Caribbean marine sponge Eurypon laughlini | |
| van Lierop et al. | Methods for enhancing ring closing metathesis yield in peptides: synthesis of a dicarba human growth hormone fragment | |
| Pan et al. | Isolation and characterization of myrmexins, six isoforms of venom proteins with anti-inflammatory activity from the tropical ant, Pseudomyrmex triplarinus | |
| RU2604686C2 (ru) | Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения | |
| Kowalczyk et al. | Synthesis of truncated analogues of preptin-(1–16), and investigation of their ability to stimulate osteoblast proliferation | |
| Huang et al. | Preparation and use of cysteine orthoesters for solid-supported synthesis of peptides | |
| RU2605385C2 (ru) | Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови | |
| CN107001416B (zh) | 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl04、其制备方法及应用 | |
| RU2607527C2 (ru) | Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения | |
| BRPI0706628A2 (pt) | variante de glicosilação de fsh d3n | |
| Xue et al. | Efficient synthesis of complex glycopeptides based on unprotected oligosaccharides | |
| CN107001433B (zh) | 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl03、其制备方法及应用 | |
| CN107001421B (zh) | 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl02、其制备方法及应用 | |
| CN107108695B (zh) | 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl01、其制备方法及应用 | |
| CN107108696B (zh) | 芋螺毒素肽κ-CPTx-btl05、其制备方法及应用 | |
| CN107531756B (zh) | 两种芋螺毒素肽、其制备方法及应用 | |
| Manissorn et al. | Effects of Chemical Additives in Refolding Buffer on Recombinant Human BMP-2 Dimerization and the Bioactivity on SaOS-2 Osteoblasts |