CN1197873C

CN1197873C - 人结缔组织生长因子及其制备方法

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Publication number: CN1197873C
Application number: CN 01107226
Authority: CN
Inventors: 李琦涵; 赵红玲; 王炯; 王丽春; 赵树栋; 孙明; 和绍清; 董承红; 胡方; 刘龙丁; 董少忠; 王晶晶; 马绍辉
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2001-02-27
Filing date: 2001-02-27
Publication date: 2005-04-20
Anticipated expiration: 2021-02-27
Also published as: CN1314415A

Abstract

本发明公开了一种人结缔组织生长因子(HCTGF)及其制备方法，包括以下步骤：从初产妇的胎盘脐静脉得到可维持培养的人脐静脉内皮细胞；再从经PDGF刺激的人脐静脉内皮细胞中提取的mRNA经过逆转录PCR扩增得到CTGFcDNA片段；经基因修饰、连接并扩增得到CTGF编码区基因片段；然后对所得的各CTGF亚克隆片段进行修饰、连接制得。

Description

人结缔组织生长因子及其制备方法

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种中国人种的结缔组织生长因子。

九十年代以来，在对细胞分子生物学全面了解的基础上，一类新的基因反应——“即刻早期基因反应”受到普遍关注。这是细胞受到外界信号刺激后立即产生的一种基因反应，它由多种刺激信号途径所激发，对各种信号刺激作出自身的以及相应组织或其它细胞的整体反应，以确保整个组织或机体的平衡。在研究各种生长因子对于组织再生和修复的作用中，发现了由内皮细胞和成纤维细胞产生的结缔组织生长因子，这种新的生长因子可能在人类组织的正常发育、生长和修复过程中发挥重要作用。

科学试验表明，在细胞即刻早期反应中，有一部分反应产物就是一些具有较强生物学功能的细胞因子，当其在特定刺激下产生后，它们能通过其它细胞或组织，发挥其特定的生物学效应，以保证机体的代偿平衡。

人结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor-缩写CTGF)就是这样的即刻早期基因产物。在正常情况下，血中和体液中无可检测到的CTGF，当在创伤刺激或某些细胞因子的信号刺激下，它以即刻早期基因产物形式被迅速合成分泌并作用于结缔组织中的细胞基质、成纤维细胞以及血管内皮细胞等。同时对其它炎性细胞表现一种趋化作用，通过这一系列的生物学效应，它能促进创伤的修复，调节创伤部位纤维组织、血管内皮细胞等的生长。CTGF作为一个具有促进创伤修复的生物活性因子，具有良好的开发应用前景。

但是，迄今为止，CTGF作为一种具有应用价值的细胞因子，仅在理论上得到认识。其纯化技术、活性检测系统均未完全建立，有待进一步深入研究。

本发明的目的是针对现有技术的不足之处，从克隆中国人种的CTGF基因入手，建立中国人种的CTGF基因克隆，并明确其系列结构，从而建立CTGF的表达体系，完善产物纯化方法及产物活性检测方法。

本发明公开的人结缔组织生长因子(HCTGF)具有以下特征：

1、序列特征

本发明hCTGF的cDNA位序列含有一个1050个核苷酸的开放阅读框，起始位点位于第120位，TGA终止位点位于第1179位，编码350个氮基酸。在3’端非编码区与国外已发表的序列有明显的差异性，这个差异的意义目前尚不能肯定，仅就一般原则而言，可能与CTGF表达调控的不同有一定关系(从这个角度亦证明本发明所分离的这个基因的独立性)。同时，对数个基因片段中的有关位置进行无义点突变修饰后，使该基因增加了一个KpnI位点，一个xhoI位点(酶切位点的引入并不影响CTGF的氨基酸编码系列)，该二位点亦可作为该基因的特征之一。本发明中包括5’和3’非翻译区的多核苷酸；含启动子的5’调控区。CTGF开放阅读框编码的多肽含39个半胱氨酸残基，表明这是一种具有许多分子内二硫键的蛋白质。该肽的氨基端含一段疏水信号序列，提示这是一种分泌蛋白，而且该肽在氨基酸系列的28位和225位天冬酰胺基上有两个N-连接的糖基化位点。CTGF多肽的特征是以单体形式存在，分子量为36～38KD。

2、来源：克隆：中国人原代脐静脉内皮细胞mRNA

3、序列描述：(见后页)

120 Encoding region

-------→

5′·····/ATGACCGCCGCCAGTATGGGCCCCGTCCGCGTCGCCTTCGTGGTCCTCCTCGCCCTCTGCAG

CCGGCGGGCCGTCGGCCACAACTGCAGCGGGCCGTGCCGGTGCCCGGACGAGCCGGCGCCGCGCTGCCCGG

CGGGCGTGAGCGTCGTGCTGGACGGCTGCGGCTGCTGCCGCGTCTGCGCCAAGCAGCTGGGCGAGCTGTGC

ACCGAGCGCGACCCCTGCGACCCGCACAAGGGCCTCTGTGACTTCGGCTCCCCGGCCAACCGCAAGATCGG

GGTGTGCACCGCCAAAGATGGTGCTCCCTGCATCTTCGGTGGTACGGTGTACCGCAGCGGAGACTGGTTCC

AGAGCAGCTGCAAGTACCAGTGCTCGTGCCTGGACGGGGCGGTGGGCTGCATGCCCCTGTGCAGCATGGAC

GTTCGTCTGCCCAGCCCTGAGTGCCCCTTCCCGAGGAGGGTCAACCTGCCCGGGAAATGCTGCGAGGAGTG

GGTGTGTGACGAGCCCAAGGACCAAACCGTGGTTGGGCCTGCCCTCGCGGCTTACCGACTGGAAGACACGT

TTGGCCCAGACCCAACTATGATTAGAGCCAACTGCCTGGTCCAGACCACAGAGAAGCAGAGCCGCCTGTGC

ATGGTCAGGCCTTGCGAAGCTGACCTGGAAGAGAACATTAAGAAGGGCAAAAAGTGCATCCGTACTCCCAA

AATCTCCAAGCCTATCAATTTGAGCTTTCTGGCTGCACGAGCATGAAGACATACCGAGCTAAATTCTGTGG

AGTATGTACCGACGGCCGATGCTGCACCCCCCACAGAACCACCACCCTGCCGGTGGAGTTCAAGTGCCCTG

ACGGCGAGGTCAAGAAGAAGAACATGATGTTCATCAAGACCTGTGCCTGCCATTACAACTGTCCCGGAGAC

AATGACATCTTTGAATCGCTGTACTACAGGAAGATGTACGGAGACAT

1179 Noncoding region

←-- ------ ---→

GGCATGA/AGCCAGAGAGTGAGAGACATTAACTCATTAGACTGGAACTTGAACTGATTCACATCTCATTTT

TCCGTAAAAATGATTTCAGTGGCACAAGTTATTTAAATCTTTTTTTCTAACTGGGGGAAAAGGTCCCACCC

AATTCAAACATTGTGCCATGTCAAACAAATAGTCTATCTTCCCAGCACTGGTTTGAAGAATGTAATACTTG

ACAGTGGAACTACATTAGTACACAGCACCAGAATGTATATTAAGGTGTGGCTTTAGGAGCACTGGGAGGGT

ACCGGCCCGGTTAGTATCGTCAGATCGACTCTTATAAGAGTAATATGCCTGCTATTTGAAGTGTAATGGAG

AAGGAAAATTTTAGCGTGCTCACTGACCTGCCTGTAGCCCCAGTGACAGCTAGGATGTGCATTCTCCAGCC

ATCAAGAGACTGAGTCAAGTTGTTCCTTAAGTCAGAACAGCAGACTCAGCTCTGACATTCTGATTCGAATG

ACACTGTT GTATGCAGCTATTCTAGTAGAATGTGTAGCCCCACTTAATGAAAAAATCCTTATAAAAACTGA

AAAACTCTATATAGGTGATCAGNNNTTTCACCNGGAAGCATTTGGTTCTACTTTATATGACTNNNTCGGAC

AGTTTATTGTTGAGAGTGTGAAAAAAAGTTACATGTTTGCACCTTCTAGTTAAAATAAAGTTCATGTTCGC

CCTTTCTAGTTGAAGAAAGTGTATATTTTTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3’

本发明提供了人结缔组织生长因子的制备方法，该法包括：从初产妇的胎盘脐静脉得到可维持培养的人脐静脉内皮细胞；再从经PDGF刺激的人脐静脉内皮细胞中提取的mRNA经过逆转录PCR扩增得到CTGFcDNA片段；经基因修饰、连接并扩增得到CTGF编码区基因片段；然后对所得的各CTGF亚克隆片段进行修饰、连接制得。

本发明还提供了表达载体的构建及产物的纯化方法：在CTGF的表达方面，构建了以融合蛋白形式表达载体-pGEX-CTGF，并实现较高水平的表达。重组产品的纯化工作，目前仍是基因工程中的一个重点和难点技术，CTGF原核表达中的纯化问题，由于其没有相关的资料，故是一个较为复杂的过程，pGEX表达载体产物-即与GST融合的蛋白，由于CTGF的独特特性，是一种具有许多分子内二硫键的蛋白质，所形成的融合蛋白以不溶形式存在。表达蛋白沉淀以7M盐酸胍溶解，PBS透析复性后，使用排阻层析和Sepharose4B Glutathion亲和层析纯化后，以凝血酶酶解，已能获得约90％纯度的重组体蛋白。

本发明同时提供其活性检测方法：经过重组技术所生产的CTGF，选用人胚胎成纤维细胞KMB-17作为基质细胞进行检测，当其以纯化的CTGF作为细胞生长刺激剂时，此细胞对CTGF的刺激表现出相对明显的增殖效应，从而说明所得CTGF的确具有刺激成纤维细胞生长繁殖的活性，此外，CTGF对腺体细胞SGC和Vero细胞也表现一定的刺激作用，这进一步肯定了其生物学活性。MTT法检测结果说明在0.3～100ng/ml的浓度范围内，CTGF可有效刺激成纤维细胞增殖，以3ng/ml时效果最佳。

本发明对CTGF活性机理的研究：

-CTGF作用后KMB-17细胞原癌基因表达分析研究表明，受CTGF刺激后伴随KMB-17细胞增殖过程所出现的src原癌基因表达与正常细胞相比有明显差异，src基因产物是一类具有SH功能域的信号传递分子，因此其表达的增加意味着细胞在信号传递方面功能的增强。

-CTGF作用于KMB-17细胞后蛋白磷酸化分析研究表明，细胞内有17KD的蛋白分子出现磷酸化现象，且在特定的时间(2hrs)较为明显，提示CTGF对细胞的信号刺激是通过特定的磷酸化传导的。利用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体所做的免疫沉淀实验结果证实CTGF作用细胞后产生的磷酸化蛋白分子为酪氨酸磷酸化蛋白。本发明对药效学观察：

在促进创伤的修复，调节创伤部委纤维组织、血管内皮细胞生长试验中，已取得满意的效果。

-CTGF对烫伤小鼠皮肤的愈合研究结果表明，CTGF在10～60ng/ml浓度范围内对小鼠皮肤浅I度烫伤的愈合有一定的促进作用。

-CTGF基因治疗家兔外周缺血性模型的研究中发现，该基因产物的导入可刺激新生血管的形成，并可明显增加血流量。

-正处于治疗外周及冠状动脉缺血性疾病的试验研究阶段，并积极进行着新药开发工作。

本发明具有以下突出优点：

1、本发明从培养得到的人脐静脉脉内皮细胞中，克隆到了CTGF的编码基因，并明确了其序列结构，在3′端非编码区与国外已发表的序列有明显差异，从该角度也证明了中国人种CTGF具有独立性。同时该全基因经无义突变引起了KpnI和XhoI两个酶切位点，是其主要特征。构建了原核表达载体PGEX-CTGF，靶蛋白表达量可达20％以上。

2、CTGF多肽的主要生物学活性是其丝裂原性，或刺激靶细胞增殖的能力。这种丝裂原活性在体内的最终结果是靶组织的生长，CTGF也具有趋化活性，即指细胞与特殊的分子相互作用，结果引起细胞的化学诱导性运动。此前尚未发现对结缔组织细胞具有丝裂原活性和趋化活性的生长因子，因此CTGF蛋白的发现及编码这种分子的cDNA的克隆具有重要意义。

3、药效学观察表明，本发明所述的人结缔组织生长因子(HCTGF)，在某些临床情况，如烧伤、烫伤等创伤的愈合及心血管疾病中可作为一种治疗制剂。

4、本发明的实验进展显示，当HCTGF与相应受体结合后，所产生的信号传递过程中，在小分子蛋白的酪氨酸位置上会发生磷酸化，这个蛋白的酪氨磷酸合过程与细胞的增殖及原癌基因Src表达的增加有关联。六种原癌基因探针对其在细胞受CTGF刺激后表达情况的分析表明，受CTGF刺激后伴随KMB-17增殖过程所出现的原癌基因表达与正常细胞相比有明显差异的是src基因的表达，而其余的fos，myc，intmos，ras均与正常细胞相同。原癌基因在正常细胞中是以一些执行正常细胞调控功能的特殊因子形式出现的，src基因产物事实上是一类具有SH功能域的信号传递分子，因此，其表达的增加意味着细胞在信号传递方面功能的增强。本发明的基础研成果对将细胞因子类的基因工程产品实际应用于临床，对多种疾病的治疗和预防具有广泛的应用前景和重要意义。

附图说明：

图1为形成单层的人脐静脉内皮细胞(200x)；

图2为经逆转录-PCR扩增得到的CTGFcDNA片段；

图3为经基因修饰，连接并扩增得到的CTGF编码区基因片段，a.CTGF编码基因，b.DNA标准分子量，c.pGEX载体；

图4为CTGF各个亚克隆基因片段的连接方案；

图5为CTGF刺激KMB-17细胞后六种原癌基因的表达趋向：a、b、c、d、e、f分别为CTGF刺激KMB-17细胞及细胞对照的c-fos、myc、int、src、mos、ras原癌基因的表达情况。

图6为备浓度CTGF对人成纤维细胞的增殖作用。

通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明的限定。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

制备实施例

包括以下的工艺步骤和条件

1、人原代脐静脉内皮细胞的培养：脐带组织取自云南省第一人民医院妇产科健康初产妇，采用MEM培养液(SIGMA公司产品)保存脐带，10分钟后，将经MEM培养液洗净的脐静脉分离，并剪下其内皮层，初步剪碎后加入0.1％胰酶-0.2％胶原酶I(SIGMA公司产品)，常温下搅拌消化10分钟，用MEM培养液洗两次，细胞溶液悬于DMEM-8％胎牛血清(GIBLCO公司产品)，1％双抗，pH7.4培养液，37℃静止培养，2～3天后形成单层备用。

2、原代人脐静脉内皮细胞mRNA的提取：单层细胞先经无血清的DEME洗三遍，加入含有PDGF(0.5ng/ml)的无血清DEME，37℃培养1小时，冷PBS洗二次，使用Quickprop mRNA纯化试剂盒(Pharmacia公司产品)提取细胞总mRNA。经冷乙醇沉淀后，离心，干燥，以含有RNA酶抑制剂焦磷酸二乙酯处理过的去离子水溶解，定量为0.4ug/ml，-20℃冻存备用。

3、CTGFmRNA的逆转录RT-PCR扩增：根据CTGF基因中全基因长度及其序列情况，分别合成三对引物

①a.GAGAATTCATGACCGCCGCCAG；

b.AGAGAATTCTGCCAGCTGCTCTGGAA；

②a.GAATTCAGCAGCTGCAAGTAC；

b.GAGAATTCCGTGTCTTCCAGTC；

③a.GAGAATTCCTTACGACCTGGAA；

b.GAGAATTCTCATGCCATGTCTCC；

a均为5′端引物，b均为3′端引物。三对引物都设计以EcoRI位点置于5′端和3′端。首先以cDNA第一链逆转录试剂盒(pharmacia)公司产品，使用3′端引物，从上述脐静脉内皮细胞mRNA中取出三份，每份5ul，均含mRNA 0.5ug，mRNA在75℃变性5分钟，冰浴，加入引物，冰浴10分钟，继续加入试剂盒内的相关成分，37℃，90分钟，再以该逆转录产物作为引物，PCR扩增所得的CTGF cDNA条件为：94℃ 3分钟变性，94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环，72℃延伸反应6分钟。完成的样品上样电泳，剩余样品经酚：氯仿抽提，乙醇沉淀纯化，溶于ddH₂O，-20℃保存备用。

4、DNA连接反应及细菌转化：所需连接的各种核酸-CTGF分段基因和全基因，与各种载体，包括克隆载体和表达载体，经全部酶切，检测，酚：氯仿抽提、乙醇纯化过程，沉淀，溶于ddH₂O按含量比例混合，加入新鲜配制的ATP，连接缓冲液，连接酶(T4 ligase，Bio-Red公司产品)。16℃，18小时。取出总体积的1/10，1/5各一份，加入预先制备好的钙转化细菌(DH5a BL21 JM-109等)50ul，0℃ 45分钟，42℃ 90秒，0℃ 2分钟，加入等量LB，37℃ 1小时，涂布于有选择性抗菌素(包括氨卞抗性和卡那抗性等)的LB-琼脂平板上，37℃ 15～18小时。观察重组菌体生长情况。

5、重组DNA质粒的鉴定：重组连接DNA质粒经转化细菌，菌落从带有相应抗菌素培养基上小量扩增后，按常规方法提取质粒DNA，先经酶的鉴定，再经测序确定其读码框架正确与否。

6、DNA测序反应：各类重组质粒DNA的测序均使用T7测序试剂盒(pharma-cia公司产品)。测序引物包括通用引物和设计的各种引物，其中用于CTGF序列测定的引物分别为：

a.5′AACTGCCTGGTCCAG3′；

b.5′AAAGATGGTGCTCC3′；

C.3′GGCTCTAATCATCGT5′；

d.5′AACTGCCTGGTCCAG3′；

e.5′CATGTTCTTCTTCATG3′；

用于CTGF表达载体的测序引物为a.5′AACTGCCTGGTCCAG3′用于pGEX-CTGF测序；b.5′AAAGATGGTGCTCC3′用于pBV-CTGF测序；C.3′GGCTCTAATCATCGT5′用于pSVK3-CTGF测序。

7、CTGF基因修饰及全码区连接：逆转录后克隆所得到的CTGF基因共三个片段，为将其完整地连接为全编码区CTGF基因，使用了点突变方法，在三个片段的5′及3′末端，均引入了新的酶切位点。但此点突变位点均为无义突变，具体突变为：片段1、CTGF-1：5′-GGTACG(C)GTG3′(含KPnI切点)；片段2、CTGF-2：5′-GGTGGTACG(c)-CTG(C)GAA(G)GAC3′(含KpnI和XI切点)，片断3、CTGF-3：5′TACCGACTG(C)GAA(G)-3′(含XhoI切点)，突变方法为寡核苷酸点突变，该突变引物以PCR方法获得三个带突变碱基的片段，纯化后，分别经kpnI和XhoI酶切，再提纯，再按小片段连接方法连接三个片段，加入PEG8000可缩小连接体积，再以带有EcoRI位点的两个引物：

A)5′GAGAATTCATGACCGCCGCCAG3′

B)5′GAGAATTCTCATGCCATGTCTCC3′

它们含CTGF基因全编码区基因范围，将上述三个片段的连接产物作为模板进行PCR扩增，最后得到CTGF编码区全基因，即人结缔组织生长因子(HCTGF)。

试验1对烫伤小鼠皮肤的愈合试验

将过滤无菌置4℃保存的制备实施例所述的CTGF分别稀释成10ng/ml，60ng/ml，360ng/ml的溶液，用含0.2％的人白蛋白的RPMI1640培养基作为溶剂，每次给药前临时配制。各组小鼠在烫伤4小时后，开始涂擦相应浓度的CTGF溶液，每只小鼠0.2ml，每日2次，早晚各一次，共擦7天。对照组以同样的方法涂擦含0.2％的人白蛋白的RPMI1640培养基。每日观察动物伤口愈合情况。于第15夭纪录各组小鼠烫伤伤口的愈合情况，结果如表1。

表1

组别 CTGF浓度烫伤动物数存活动物数未愈合面积(cm²)

(ng/ml) (只) (只) X±SD

对照组 0 14 11 0.15±0.08

低剂量组 10 14 13 0.08±0.05*

中剂量组 60 14 10 0.05±0.07*

高剂量组 360 14 12 0.15±0.05

*：与对照组相比，P＜0.05

试验2各浓度CTGF对人成纤维细胞的增殖作用

如附图7所示，在所测定的浓度范围内(0.3ng/ml～100ng/ml)，从0.3ng/ml～3ng/ml，随着CTGF浓度的增加，所测得的人成纤维细胞的OD值亦增加，呈典型的量效关系，3ng/ml时达到峰值。当CTGF浓度超过3ng/ml后，OD值稍有减少，但其OD值仍高于不加CTGF时的OD值。试验结果说明，在所测试的浓度范围内，CTGF能有效刺激人成纤维细胞的增殖，以3ng/ml时刺激效果最佳。

Claims

1.一种人结缔组织生长因子，其序列特征为：①人结缔组织生长因子的cDNA序列含有一个1050个核苷酸的开放阅读框，起始位点位于第120位，TGA终止位点位于第1179位，编码人结缔组织生长因子；而且②序列描述：

120 编码区

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5｀...../ATGACCGCCGCCAGTATGGGCCCCGTCCGCGTCGCCTTCGTGGTCCTCCTCGCCCTCTGCAG