CN105385776B - Ccdc57基因在椎间盘退行性疾病诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CCDC57基因在椎间盘退行性疾病诊断和治疗中的应用，CCDC57基因在椎间盘退行性疾病患者组织中呈低表达，增加CCDC57的表达可以抑制椎间盘退行性疾病髓核细胞的凋亡，本发明大大提高了椎间盘退行性疾病诊断的敏感性和特异性，同时为椎间盘退行性疾病的基因治疗提供了新的靶点。

Description

CCDC57基因在椎间盘退行性疾病诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及CCDC57基因在椎间盘退行性疾病诊断和治疗中的用途。

背景技术

正常的椎间盘位于上下终板之间，由中心胶冻样，富含蛋白聚糖及II性胶原的髓核和外层富含I型胶原的纤维环所构成。髓核是凝胶状的结构，由大量的蛋白聚糖或聚集蛋白聚糖构成，由稀疏排列的胶原纤维作为基质支撑。蛋白聚糖是基质的主要成分，是一种糖蛋白，包含蛋白质核心和至少1粘多糖链。高浓度粘多糖可增加髓核的渗透压，使其膨胀和抵制较大的压载力。研究认为粘多糖的数量下降将减少椎间盘高度，而当髓核变成纤维主导时便导致椎间盘退变的发生。正常的髓核细胞呈圆形的类软骨样细胞形态，细胞周围有包囊；而纤维环细胞则呈细长的成纤维细胞样形态，有极性地沿着纤维环的纤维走形规律排列。

椎间盘退行性疾病是椎间盘组织在多种原因综合作用下发生细胞介导的生物化学变化，引起老化加速、椎间盘力学特性改变，使临近骨关节、韧带发生相应变化，造成脊柱不稳，压迫脊髓、神经根、动脉，引起相应临床症状和体征的综合征。椎间盘退变性疾病归因于体内外因素的综合作用，环境和遗传，职业暴露如震动，以及椎机械的影响如举重和体重，生活方式等因素如缺乏锻炼被认为与椎间盘退变相关，而遗传因素占个人椎间盘退行性疾病因素的70％左右。髓核细胞数量的减少及细胞外基质的丢失是椎间盘退变的核心特性。最近研究表明，髓核细胞具有维持椎间盘内平衡不可或缺的特性，而其他各种体外和体内研究同样表明，椎间盘退行性疾病的发展的一个重要原因便是由细胞凋亡引起的细胞损失。

椎间盘退行性疾病常采用阶梯性治疗，早期治疗如绝对卧床休息、佩戴腰围、牵引、物理治疗运动疗法、药物治疗、中医传统治疗如推拿、脊柱整复手法治疗、神经阻滞注射治疗；中期治疗如成形手术射频髓核成形术、激光髓核成形术、椎间盘内电热疗法；晚期治疗如减压手术、融合手术。

针对椎间盘退行性病变的手术治疗存在较大风险，而早期的介入治疗可以达到更好的疗效，尽管目前已经对该病进行了大量的研究，但是其具体发病机制尚未明确阐述。因此，寻找椎间盘退行性病变早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对实现椎间盘退行性病变的早期诊断及个体化治疗具有深远意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于椎间盘退行性疾病诊疗的CCDC57基因。相比传统的椎间盘退行性疾病的诊断和治疗方法，使用基因标志物来诊断和治疗椎间盘退行性疾病具有及时性、特异性和无创性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了CCDC57基因及其表达产物在制备诊断椎间盘退行性疾病的产品中的应用。

进一步，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测CCDC57基因及其表达产物的表达水平以诊断椎间盘退行性疾病的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断椎间盘退行性疾病的产品至少包括一对特异扩增CCDC57基因的引物；所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性疾病的产品至少包括一对特异扩增CCDC57基因的引物；所述用免疫检测诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：与CCDC57蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：与CCDC57基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与CCDC57蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与CCDC57基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述基因芯片可用于检测包括CCDC57基因在内的多个基因(例如，与椎间盘退行性疾病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括CCDC57蛋白在内的多个蛋白质(例如与椎间盘退行性疾病相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与椎间盘退行性疾病的标志物同时检测，可大大提高椎间盘退行性疾病诊断的准确率。

本发明提供了一种诊断椎间盘退行性疾病的产品，所述产品能够通过检测椎间盘组织中CCDC57基因的表达水平来诊断椎间盘退行性疾病。

进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。

进一步，所述基因检测试剂盒可用于检测包括CCDC57基因在内的多个基因(例如，与椎间盘退行性疾病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括CCDC57蛋白在内的多个蛋白质(例如与椎间盘退行性疾病相关的多个蛋白质)的表达水平。将椎间盘退行性疾病的多个标志物同时进行检测，可大大提高椎间盘退行性疾病诊断的准确率。

本发明提供了CCDC57基因及其表达产物在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括增加CCDC57基因表达或增强CCDC57表达功能的试剂。

进一步，所述试剂包括：含有能编码功能性CCDC57蛋白的核酸的试剂、CCDC57蛋白的激活剂、含有CCDC57蛋白质的试剂。

其中，所述含有能编码功能性CCDC57蛋白的核酸的试剂可以是在有利条件下翻译成活性形式的CCDC57蛋白的单链核酸(如mRNA)或双链核酸(如DNA)，所述的核酸可以连接在表达载体上或重组到宿主细胞里，只要能编码成活性CCDC57蛋白，任何一种CCDC57基因的携带方式均可。所述的CCDC57蛋白激活剂是指刺激CCDC57蛋白活性、增加CCDC57蛋白活性、促进CCDC57蛋白活性、增强CCDC57蛋白激活、使CCDC57蛋白活性敏感化或上调CCDC57蛋白活性的试剂，如去甲基化试剂、CCDC57启动子和/或增强子特异性的转录激活剂、CCDC57蛋白的激动剂(如激活抗体)等。

进一步，上述药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

所述的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。

表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。

添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

本发明还提供了一种治疗椎间盘退行性疾病的药物组合物，所述药物组合物包括增加CCDC57基因表达或增强CCDC57表达功能的试剂。

本发明的药物可以用于补充内源性的CCDC57蛋白的缺失或不足，通过提高CCDC57蛋白的表达，从而治疗因CCDC57蛋白减少导致的椎间盘退行性疾病。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

进一步，本发明中CCDC57蛋白或编码CCDC57蛋白的核酸可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。

本发明的药物组合物可以被配制成任何的给药类型，例如，利用注射器或其它装置的皮内注射、皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射、胸膜内注射、膀胱内注射、冠状动脉内或肿瘤内注射、口服给药、直肠给药。

本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有CCDC57基因的药物或者含有CCDC57蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有CCDC57基因的药物或者含有CCDC57蛋白质的药物注入体内组织中。

本发明的药物还可与其他治疗椎间盘退行性疾病的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，CCDC57蛋白或编码所述蛋白的核酸)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如CCDC57蛋白或编码所述蛋白的核酸)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。

可以在治疗过程中，根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

本发明中与CCDC57基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述CCDC57蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述CCDC57蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与CCDC57蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

在本发明的上下文中，“CCDC57基因”包括人CCDC57基因以及人CCDC57基因的任何功能等同物的多核苷酸。CCDC57基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中CCDC57基因(NC_000017.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，CCDC57基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述CCDC57基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，CCDC57基因表达产物包括人CCDC57蛋白以及人CCDC57蛋白的部分肽。所述CCDC57蛋白的部分肽含有与椎间盘退行性疾病相关的功能域。

“CCDC57蛋白”包括CCDC57蛋白以及CCDC57蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括CCDC57蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人CCDC57的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，CCDC57蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述CCDC57蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是CCDC57蛋白的融合蛋白。对于与CCDC57蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留CCDC57蛋白的生物学活性即可。

本发明的CCDC57蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留CCDC57蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“治疗椎间盘退行性疾病”包括能消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟病症的任何症状的发生和复发，即包括对疾病的治疗性干预和预防性干预。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了CCDC57基因表达水平与椎间盘退行性疾病相关，通过检测受试者椎间盘髓核组织中CCDC57的表达，可以判断受试者是否患有椎间盘退行性疾病，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种椎间盘退行性疾病的新的分子标记物-CCDC57基因，利用分子标记物来实现疾病的诊断和治疗，相比传统手段，更具有及时性、特异性、无创性。

附图说明

图1显示利用QPCR检测CCDC57基因在椎间盘退行性疾病髓核组织中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测CCDC57基因在椎间盘退行性疾病髓核细胞中的表达情况；

图3显示利用MTT检测CCDC57基因表达对椎间盘退行性疾病细胞增殖能力的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 筛选与椎间盘退行性疾病相关的基因标志物

1、样品收集

各收集8例正常椎间盘髓核组织和椎间盘退行性疾病组织样本。上述样本为椎间盘退行性疾病患者的手术切除标本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备(利用kit进行操作)

上述获得的髓核组织剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：

1)RNA的分离：

A.组织匀浆或细胞中加入II 1ml；

B.室温放置3min，加入0.2ml氯仿后剧烈摇动15s；

C.置于冰上防止10min；

D.12000g，4℃离心15min；

E.转移80％的水相进入新的2ml EP管中，加入1/2量的无水乙醇，振摇；

F.将小于700μl的上述液体转移至Mini column，振摇后10000g室温离心60s。

2)RNA纯化：

A.向Mini column加入500μl RWC Wash Buffer，10000g李欣30s；

B.加入500μl RWB Wash Buffer，10000g离心30s，重复两次后采取最大离心完全干燥Mini column；

C.向柱子加入15μl预热至70℃的DEPC水，室温放置2min后全速离心。

3、高通量转录组测序

1)RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

3)差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

RNA-seq结果显示，CCDC57基因在椎间盘退行性疾病组织中的表达量显著低于正常椎间盘髓核组织中的表达量。

实施例2 QPCR测序验证CCDC57基因的差异表达

1、对CCDC57基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择椎间盘退行性疾病髓核组织和正常椎间盘髓核组织各80例。

2、QPCR具体操作步骤如下所示：

(1)RNA提取

RNA提取步骤如实施例1所述。

(2)逆转录

A.在Microtube中配置混合液：Oligo dT(50μM)1μl，dNTP混合液(10mM)1μl，RNA模板5μg，加ddH₂O至10μl，混合均匀；

B.在PCR仪上按照下列反应条件进行变性、退火反应：65℃5min后，立即放置冰上；

C.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：

上述变性、退火后反应液10μl，5×Buffer 4μl，RNase抑制剂(40U/μl)0.5μl，RTase(200U/μl)1μl，ddH₂O(RNase-free)4.5μl，混合均匀；

D.在PCR仪上按照下列反应条件进行反转录反应：

(30℃10min)×3、(42℃45min)×4、(95℃5min)×5，处理后，置于冰上；

E.按下列配方在冰上配制PCR反应液：

Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)(2×)12.5μl、正向引物(10μM)1μl、反向引物(10μM)1μl、DNA模板(<100ng)2.0μl、ddH₂O 8.5μl；

F.PCR的循环条件如下：

95℃10min，(95℃15s，60℃45s)×40，选取β-actin作为内参。PCR的引物序列如下：

CCDC57的引物序列：

正向引物：5’-ATGCTCAAATTGCTCAACTAT-3’(SEQ ID NO.3)，

反向引物：5’-GCTTCACCTCTTCTTCCT-3’(SEQ ID NO.4)

β-actin的引物序列：

正向引物：5’-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-TCCTTCTGCATCCTGTCG-3’(SEQ ID NO.6)

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图1所示，与正常椎间盘髓核组织相比，CCDC57基因在椎间盘退行性疾病组织中下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3 CCDC57基因的过表达

1、细胞培养

1)将获取的髓核组织在无菌条件下用D-HANKS液冲洗3次。

2)用剪刀将髓核组织剪碎(约1mm³大小)，置于无菌离心管中。

3)使用0.25％胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min摇动一次。

4)800rpm离心5min，弃去上清液。

5)0.2％Ⅱ型胶原酶37℃消化4h，用200目筛网过滤。

6)滤液以800rpm离心5min，弃去上清液。

7)DMEM/F12培养基冲洗，800rpm离心5min，重复3次。

8)细胞计数后接种于培养瓶，含15％胎牛血清及1％P/S的DMEM/F12培养基作为培养液，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。

2、CCDC57基因的过表达

2.1 CCDC57基因表达载体的构建

根据CCDC57基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGGGATCCGCCACCATGCTGCCACTGGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-CGGCTCGAGGCGGGCACCCACCTCTC-3’(SEQ ID NO.8)

从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的CCDC57基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-CCDC57用于后续实验。

2.2转染

将椎间盘髓核分为两组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和CCDC57过表达组(转染pcDNA3.1-CCDC57)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-CCDC57的工作浓度均为0.5μg/ml。

2.3 RT-PCR检测

具体步骤同实施例2。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

如图2所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-CCDC57的细胞中CCDC57的含量显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4 CCDC57基因对椎间盘退行性疾病细胞增殖的影响

采用MTT实验检测CCDC57基因对椎间盘退行性疾病髓核细胞增殖能力影响。

1、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测：每孔加入5g/L的MTT液20μl，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO 150μl，细心吹打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(A值)。然后每12h检测1次，连续测72h，共7次。本实验重复3次。

2、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3、结果

图3所示的结果显示：转染pcDNA3.1-CCDC57组的细胞生长速度明显高于转染pcDNA3.1空载体组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明CCDC57表达能够促进椎间盘髓核细胞的生长。

实施例5 CCDC57基因对椎间盘退行性疾病细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测CCDC57基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养 步骤同实施例3。

2、细胞转染 步骤同实施例3。

3、步骤

细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×10⁶个/ml，取200μl上述细胞悬液放置到Eppendorf管中，加入10μl Annexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果：

转染pcDNA3.1-CCDC57组的细胞凋亡率为(8.77±0.24)％，转染pcDNA3.1空载体组的细胞凋亡率为(25.78±0.47)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，CCDC57基因的过表达抑制椎间盘髓核细胞的凋亡。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.CCDC57基因及其表达产物在制备诊断椎间盘退行性疾病的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测CCDC57基因及其表达产物的表达水平以诊断椎间盘退行性疾病的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断椎间盘退行性疾病的产品至少包括一对特异扩增CCDC57基因的引物；所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性疾病的产品至少包括一对特异扩增CCDC57基因的引物；所述用免疫检测诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：与CCDC57蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：与CCDC57基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断椎间盘退行性疾病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与CCDC57蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与CCDC57基因的核酸序列杂交的探针。

4.CCDC57基因及其表达产物在制备治疗椎间盘退行性疾病的药物组合物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括增加CCDC57基因表达或增强CCDC57表达功能的试剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：含有能编码功能性CCDC57蛋白的核酸的试剂、CCDC57蛋白的激活剂、含有CCDC57蛋白质的试剂。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

8.一种治疗椎间盘退行性疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括增加CCDC57基因表达或增强CCDC57表达功能的试剂。