CN105296623B - 一种诊治骨关节炎的分子标志物 - Google Patents

一种诊治骨关节炎的分子标志物 Download PDF

Info

Publication number
CN105296623B
CN105296623B CN201510725004.0A CN201510725004A CN105296623B CN 105296623 B CN105296623 B CN 105296623B CN 201510725004 A CN201510725004 A CN 201510725004A CN 105296623 B CN105296623 B CN 105296623B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hmgcs2
osteoarthritis
gene
product
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510725004.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105296623A (zh
Inventor
董东
孙耀兰
杨承刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd filed Critical Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority to CN201510725004.0A priority Critical patent/CN105296623B/zh
Publication of CN105296623A publication Critical patent/CN105296623A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105296623B publication Critical patent/CN105296623B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/105—Osteoarthritis, e.g. cartilage alteration, hypertrophy of bone

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于骨关节炎早期诊断的分子标志物‑HMGCS2基因及其表达产物。本发明利用基因芯片和Western blot方法证明HMGCS2基因在骨关节炎患者和正常人的滑膜组织中存在差异表达，可以作为早期诊断骨关节炎的指标。另外，本发明还公开了HMGCS2基因及其表达产物可以作为骨关节炎治疗的靶标，用于指导新药的研发。

Description

一种诊治骨关节炎的分子标志物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及HMGCS2基因在骨关节炎的诊断、治疗中的用途。
背景技术
骨关节炎为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。
人口统计学趋势表明，到2020年，受关节疾病影响的人群将增加到50％，全世界将有5.7亿人受到骨关节炎的困扰。我国社会逐渐进入老龄化社会，因此我们将面临骨关节炎发病的普遍流行时期。对该病的研究十分重要和迫切。
骨关节炎的原发异常可以发生在关节软骨、滑膜、软骨下骨、韧带或关节周围的神经肌肉组织。关节软骨的损害是骨关节炎最明显的变化。关节软骨丧失是骨关节炎的关键病变。随着蛋白聚糖含量的下降，关节软骨逐渐缓慢降解。由于骨关节炎患者的蛋白聚糖、胶原和透明质酸合成速率均增加，使得组织的分解代谢活性特别高。通常认为，蛋白溶解酶和中性金属蛋白酶在骨关节炎关节软骨丢失中是最重要的原因。关节软骨组织内没有血管和神经，对创伤、炎症的反应是由关节软骨、滑膜组织或关节液中的蛋白质如细胞因子等介导的。滑膜对于维持关节的正常功能，并且在骨关节炎疾病的发生发展过程中起着重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于骨关节炎(Osterarthritis，OA)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨关节炎的诊断方法，使用基因标志物来诊断骨关节炎的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测HMGCS2基因表达的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。
进一步，所述检测HMGCS2基因表达的产品包括检测HMGCS2基因mRNA水平的产品、和/或检测HMGCS2蛋白水平的产品。
进一步，所述检测HMGCS2基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测HMGCS2基因及其表达产物的表达水平以诊断骨关节炎的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增HMGCS2基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增HMGCS2基因的引物；所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与HMGCS2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨关节炎的产品包括：与HMGCS2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨关节炎的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与HMGCS2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与HMGCS2基因的核酸序列杂交的探针。
所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括的一对特异扩增HMGCS2基因的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
所述检测HMGCS2基因表达的产品可以是检测HMGCS2基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
所述诊断骨关节炎的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨关节炎的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知HMGCS2基因的异常与骨关节炎相关也属于HMGCS2基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断骨关节炎的工具，所述工具包括检测HMGCS2基因表达的试剂；所述试剂包括检测HMGCS2基因mRNA的引物和/或探针、检测HMGCS2蛋白的抗体。
所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测HMGCS2基因转录水平的针对HMGCS2基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的HMGCS2蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括HMGCS2基因在内的多个基因(例如，与骨关节炎相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括HMGCS2蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨关节炎相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨关节炎的标志物同时检测，可大大提高骨关节炎诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测HMGCS2基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括HMGCS2蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测HMGCS2基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对HMGCS2基因的引物和/或探针。根据HMGCS2基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测HMGCS2基因表达水平的引物和探针。
所述试纸包括检测HMGCS2基因表达的试剂。
所述高通量测序平台包括检测HMGCS2基因表达的试剂。
与HMGCS2基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述HMGCS2蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述HMGCS2蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与HMGCS2蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述检测HMGCS2基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对。
本发明还提供了HMGCS2基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
所述促进剂包括促进HMGCS2基因表达的试剂和促进HMGCS2基因表达产物的试剂；所述促进HMGCS2基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进HMGCS2蛋白含量的试剂；所述促进HMGCS2基因表达产物的试剂包括促进HMGCS2基因表达产物稳定性的试剂、促进HMGCS2基因表达产物活性的试剂、促进HMGCS2基因表达产物功能的试剂。
具体地，所述促进HMGCS2基因表达的试剂包括：含有HMGCS2基因的试剂、携带HMGCS2基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有HMGCS2蛋白质的试剂。
本发明的促进剂一方面可以用于补充内源性的HMGCS2蛋白的缺失或不足，通过提高HMGCS2蛋白的表达，从而治疗因HMGCS2蛋白缺乏导致的骨关节炎。另一方面可以用于促进HMGCS2蛋白的活性或者功能，从而治疗骨关节炎。
本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
本发明还提供了一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的HMGCS2基因和/或其表达产物的促进剂。
进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有HMGCS2基因的药物或者含有HMGCS2蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有HMGCS2基因的药物或者含有HMGCS2蛋白质的药物注入体内组织中。
本发明的药物还可与其他治疗骨关节炎的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
在本发明的上下文中，“HMGCS2基因”包括HMGCS2基因以及HMGCS2基因的任何功能等同物的多核苷酸。HMGCS2基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中HMGCS2基因(NC_000001.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，HMGCS2基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述HMGCS2基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，HMGCS2基因表达产物包括HMGCS2蛋白以及HMGCS2蛋白的部分肽。所述HMGCS2蛋白的部分肽含有与骨关节炎相关的功能域。
“HMGCS2蛋白”包括HMGCS2蛋白以及HMGCS2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括HMGCS2蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与HMGCS2的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，HMGCS2蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述HMGCS2蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是HMGCS2蛋白的融合蛋白。对于与HMGCS2蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留HMGCS2蛋白的生物学活性即可。
本发明的HMGCS2蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留HMGCS2蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断骨关节炎”既包括判断受试者是否已经患有骨关节炎、也包括判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险。
在本发明的上下文中，“治疗骨关节炎”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了HMGCS2基因表达与骨关节炎相关，通过检测受试者滑膜组织中HMGCS2的表达，可以判断受试者是否患有骨关节炎、或者判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-HMGCS2基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨关节炎的早期诊断，从而降低骨关节炎的死亡率。
附图说明
图1显示利用基因芯片检测HMGCS2基因在滑膜组织中的表达情况；
图2显示利用Western blot检测HMGCS2蛋白在滑膜细胞中的表达情况；
图3显示利用QPCR在转录水平上检测HMGCS2基因的过表达情况；
图4显示利用Western blo检测HMGCS2蛋白的过表达情况；
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 OA滑膜组织和正常滑膜组织中HMGCS2基因的表达差异
60例OA患者的滑膜组织来自于北京协和医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的OA病人。所用病例符合Altam提出的关于OA的诊断标准。40例正常滑膜组织来自于北京协和医院骨科，为外伤手术病人关节滑膜组织。OA患者滑膜液(SF)高速离心后取上清，-80℃储存待用。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。
1、组织RNA的提取
1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体滑膜组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状；
2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离心管中；
3)加入300uL Lysis solution，置于匀浆器内，充分研磨1-5min；
4)12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5mL的离心管中；
5)加入600ul RNase-Free Water，用漩涡器混匀；
6)加入20ul蛋白酶K，在55℃温浴15min，不断涡旋混匀；
7)14000g，室温，离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶1.5mL的离心管中；
8)加入450ul的95％乙醇，涡旋混匀；
RNA吸附：
9)取650ul含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min；
10)弃下层，重置收集管于柱上；
11)依照裂解液的容量，重复9)～10)步；
12)加入400ulWash solution，14000g离心2min；
13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；
DNase处理：
14)加入100ulEnzyme Incubation Buffer和15ulDNase I，14000g离心1min；
15)将收集管中的溶液重新移入柱中；
16)室温放置15min；
RNA洗涤：
17)加入400ulWash solution，14000g离心1min，弃下层，重置收集管于柱上；
18)加入400ulWash solution，14000g离心2min，弃收集管；
RNA洗脱：
19)把柱子放入1.7mL Elution管中；
20)加入30ul Elution Buffer；
21)200g离心2min，使溶液充分与柱结合，然后14000g离心1min。
2、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品：OD260/OD280为1.8-2.2。
3、基因芯片杂交及扫描
总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNAFragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
4、芯片数据处理与分析
杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
5、统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。
6、结果
结果显示(如图1所示)，与正常人相比，骨关节炎患者滑膜组织中HMGCS2基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 OA滑膜组织和正常滑膜组织中HMGCS2蛋白的表达差异
1、步骤
1.1 滑膜组织细胞体外培养
将无菌获取的滑膜组织用PBS清洗后，用无菌手术剪刀反复剪切成约1mm x1mm x1mm的组织块，加入胶原酶II(0.5mg/ml)37℃、消化2h后，经200目纱网过滤，离心去上清后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。当细胞长成梭形并成片后，进行传代培养。当细胞传至第3代后，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD19和PE标记的小鼠抗人CD11b进行标记，流式细胞仪检测鉴定。上述4种标记均为阴性的细胞为成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like Synoviocytes，FLS)用于本研究。
1.2 细胞总蛋白的提取
取对数期生长良好的纤维样滑膜细胞进行细胞总蛋白的提取，按照EpiQuik全细胞提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
1.3 Western blot检测
将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。
2、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将HMGCS2蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如图2所示，与正常人相比，骨关节炎滑膜组织中HMGCS2蛋白的表达水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3 HMGCS2基因表达质粒构建
1、HMGCS2基因表达载体的构建
根据HMGCS2基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：正向引物为5’-TGACTCCAGTGAAGCGCATT-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物为5’-GCATACTTTCGGCGATGCT-3’(SEQ ID NO.4)。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的HMGCS2基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-HMGCS2用于后续实验。
2、转染
将OA成纤维样滑膜细胞分为两组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和HMGCS2过表达组(转染pcDNA3.1-HMGCS2)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-HMGCS2的工作浓度均为0.5μg/ml。
3、QPCR检测
3.1 提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
3.2 逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
3.3 QPCR
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增HMGCS2基因的正向引物序列为5’-TATGGAGAATGTGTATGAC-3’(SEQ ID NO.5)，反向引物序列为5’-TACGGTATGATGTGTAAC-3’(SEQ ID NO.6)；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.7)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.8)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃10s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
3.4 统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、Western检测
具体步骤同实施例2。
2、结果
如图3所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-HMGCS2的细胞中HMGCS2的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；如图4所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-HMGCS2的细胞中HMGCS2的蛋白水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 刺激条件下OA成纤维样滑膜细胞增殖实验
1、刺激条件下OA成纤维样滑膜细胞增殖实验
1.1 步骤
将OA成纤维样滑膜细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔2x103 cells/孔/200μl，37℃、5％CO2培养箱孵育24小时后，加入滑膜液中(1：5稀释)，继续孵育24小时，之后分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μl CK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。
1.2 统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
1.3 结果
结果如表1所示，与不加滑膜液刺激的对照组相比，加滑膜液刺激的FLS增殖明显加快，差异具有统计学意义(P<0.05)。
表1 FLS细胞OD值
实验组 OD值(光密度)
不加滑膜液 0.1697±0.004
加滑膜液 0.2514±0.003
实施例5 HMGCS2基因过表达对刺激条件下OA成纤维样滑膜细胞增殖的影响
1、步骤
以2×105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，按照实施例3的方法进行细胞转染，每个实验组设计三复孔，每孔100μl，放置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，转染24h后，加入滑膜液中(1：5稀释)，继续孵育24小时，之后分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μl CK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，HMGCS2基因过表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如表2所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-HMGCS2抑制了滑膜液刺激下的细胞增殖，差异具有统计学意义(P<0.05)。
表2 FLS细胞OD值
实验组 OD值(光密度)
pcDNA3.1 0.2611±0.003
pcDNA3.1-HMGCS2 0.1935±0.002
实施例6 HMGCS2基因过表达对OA成纤维样滑膜细胞增殖的影响
1、步骤
以2×105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后，按照实施例3的方法进行细胞转染，每个实验组设计三复孔，每孔100μl，放置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，转染48h之后分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μl CK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，HMGCS2基因过表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如表3所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-HMGCS2细胞增殖明显减慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。
表3 FLS细胞OD值
实验组 OD值(光密度)
pcDNA3.1 0.1628±0.002
pcDNA3.1-HMGCS2 0.0987±0.005
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.检测HMGCS2基因表达的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测HMGCS2基因表达以诊断骨关节炎的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增HMGCS2基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增HMGCS2基因的引物；所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与HMGCS2蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨关节炎的产品包括：与HMGCS2基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨关节炎的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与HMGCS2蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与HMGCS2基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括的一对特异扩增HMGCS2基因的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括检测HMGCS2基因表达的试剂；所述试剂包括检测HMGCS2基因mRNA的引物和/或探针、检测HMGCS2蛋白的抗体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测HMGCS2基因mRNA的引物包括SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对。
7.促进HMGCS2基因表达的试剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，促进HMGCS2基因表达的试剂包括含有HMGCS2基因的试剂、携带HMGCS2基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有HMGCS2蛋白质的试剂。
CN201510725004.0A 2015-10-29 2015-10-29 一种诊治骨关节炎的分子标志物 Active CN105296623B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510725004.0A CN105296623B (zh) 2015-10-29 2015-10-29 一种诊治骨关节炎的分子标志物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510725004.0A CN105296623B (zh) 2015-10-29 2015-10-29 一种诊治骨关节炎的分子标志物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105296623A CN105296623A (zh) 2016-02-03
CN105296623B true CN105296623B (zh) 2019-03-01

Family

ID=55194442

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510725004.0A Active CN105296623B (zh) 2015-10-29 2015-10-29 一种诊治骨关节炎的分子标志物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105296623B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755549B (zh) * 2017-03-16 2019-06-25 天津市天津医院 分子标志物在骨关节炎中的应用
CN108103186B (zh) * 2018-02-28 2021-07-02 固安博健生物技术有限公司 诊断类风湿性关节炎和骨关节炎的分子标志物
CN108823300B (zh) * 2018-06-20 2021-03-05 中国医学科学院北京协和医院 circRNA在制备诊断骨关节炎的产品上的应用
CN109182488A (zh) * 2018-08-14 2019-01-11 深圳大学 Hmgcs2作为慢性肾脏疾病肾脏纤维化治疗的新靶点

Also Published As

Publication number Publication date
CN105296623A (zh) 2016-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105296623B (zh) 一种诊治骨关节炎的分子标志物
CN105132574B (zh) 骨关节炎诊治标志物及其应用
CN105132550B (zh) 检测muc21基因表达的试剂在制备骨关节炎诊治产品中的应用
CN105400885B (zh) Tff2基因作为颅内动脉瘤诊治标志物的用途
CN106947809B (zh) C6orf58基因在制备舌鳞癌诊治产品中的应用
CN105603085B (zh) 椎间盘退行性病变的诊治靶标
CN105112550B (zh) 作为骨质疏松症诊治靶标的mtus1基因
CN105200137B (zh) Cers2基因及其表达产物作为骨质疏松症的诊治靶标
CN105154540B (zh) Paep基因及其表达产物作为骨关节炎的诊治靶标
CN108103186B (zh) 诊断类风湿性关节炎和骨关节炎的分子标志物
CN105039577B (zh) Cyp2f1基因在骨关节炎诊治中的应用
CN105695621B (zh) Reps1基因在制备诊治骨关节炎产品中的应用
CN105400894A (zh) 椎间盘退行性病变诊治标志物
CN105400888A (zh) 一种诊治颅内动脉瘤的分子标志物
CN105087821B (zh) 一种诊治骨质疏松症的分子标志物
CN108642167A (zh) Baiap2作为类风湿性关节炎和/或骨关节炎的诊治靶标
CN105296657B (zh) 颅内动脉瘤诊治标志物
CN105256040B (zh) Khdc1l基因作为疾病诊断标志物的用途
CN105506170B (zh) Sav1基因作为子宫肌瘤诊治标志物的用途
CN105316417B (zh) Znrd1基因及其表达产物作为颅内动脉瘤的诊治靶标
CN105400895B (zh) Shisa4基因作为椎间盘退行性病变诊治标志物的用途
CN105603116B (zh) 一种诊治子宫肌瘤的分子标志物
CN105861740B (zh) Ablim3基因作为食管癌诊治标志物的用途
CN108359726A (zh) Coro2b作为分子诊治标志物的用途
CN105950752B (zh) 以pex13作为诊断胆管癌的基因标志物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant