CN109182488A

CN109182488A - Hmgcs2作为慢性肾脏疾病肾脏纤维化治疗的新靶点

Info

Publication number: CN109182488A
Application number: CN201810931650.6A
Authority: CN
Inventors: 周云枫; 管又飞
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2019-01-11

Abstract

本发明将HMGCS2作为慢性肾脏疾病肾脏纤维化治疗的新靶点，并提供了HMGCS2蛋白、HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒在制备慢性肾脏疾病治疗药物中的应用。本发明通过构建野生型、HMGCS2基因敲除小鼠模型、STZ诱导1型糖尿病肾病模型和2型糖尿病肾病模型以及血管紧张素II诱导慢性肾病模型进行实验，各数据表明HMGCS2可能参与了慢性肾脏疾病发生、发展的过程，抑制其功能能够有效地减轻慢性肾脏疾病肾脏纤维化程度。因此，HMGCS2有可能成为预防或治疗慢性肾脏疾病的潜在靶点。

Description

HMGCS2作为慢性肾脏疾病肾脏纤维化治疗的新靶点

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及HMGCS2作为慢性肾脏疾病(糖尿病肾病和高血压肾病)肾脏纤维化治疗的新靶点。

背景技术

慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)患病率在全世界范围内呈明显升高趋势，已成为全球性公共健康问题。根据中华医学会组织的慢性肾脏疾病流行病学调查结果显示，成年居民慢性肾病的患病率为9.3％，已经与美国和北欧(6.5％～10％)近似。按照这一患病率推算，目前全国至少有慢性肾病患者1.2亿。更加严重的是，慢性肾病的知晓率仅为8.7％，只及发达国家的1/5，慢性肾病就诊人数约为1100万左右。因此，CKD已成为我国重大的疾病之一，研究其发展机制、建立有效的防治手段是我国医疗卫生系统的重大任务。

各种原因引起的慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰的实质是肾脏纤维化和硬化,从而导致有效肾单位丧失和肾功能的进行性下降。肾脏纤维化是各种不同病因的慢性肾脏疾病(CKD)进展到终末期肾病的共同病理过程。其主要病理改变为正常肾单位的丢失，大量成纤维细胞的增生和细胞外基质的产生和堆积而导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化，最终导致肾脏功能丧失。

慢性肾脏疾病最主要的病因是慢性肾脏疾病肾病和高血压肾病。尽管全世界肾脏病研究者做了大量工作，但至今临床上仍然缺乏有效而可靠的治疗肾脏纤维化的方法，其主要原因是肾脏纤维化的发病机制极其复杂，对其尚缺乏全面认识。因此深入研究其发病机制和防治措施，已成为十分急迫的问题。

目前，对慢性肾脏疾病的防治尚无有效药物，在临床治疗中，仍以去除病因、积极治疗原发病为主，而药物仅起辅助作用。目前唯一用于临床治疗的慢性肾脏疾病的药物—肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)阻断剂，如血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素II受体阻断剂(ATRB)，但是它们都不是直接作用于肾脏纤维化的有效治疗手段。因此，开拓一种治疗慢性肾脏疾病的有效途径成为迫切需要解决的问题。

酮体，是哺乳动物体内乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮的总称。酮体主要在肝脏产生，其他器官如肾脏也有生成酮体的潜在能力。最近文章表明，在糖尿病状态下，肾脏产生酮体能力显著增强，糖尿病肾脏成为“生酮器官”。在酮体产生过程中，HMGCS2是其生成关键酶。肾脏作为一个生酮器官，其表达增加的HMGCS2与糖尿病肾病的关系目前报道较少，机制并没有阐明。最近研究表明STZ诱导的1型糖尿病小鼠心脏、肾脏和脾脏HMGCS2mRNA和蛋白表达显著上调，但机制并不清楚，提示HMGCS2可能在1型糖尿病小鼠心脏、肾脏和脾脏功能异常中发挥重要作用。而且，HMGCS2与高血压肾病的关系未见报道。为了明确HMGCS2在慢性肾脏疾病(糖尿病肾病和高血压肾病)发病机制中的作用，我们将使用基因敲除动物等研究手段探讨HMGCS2在其发生、发展中的作用及确切的分子机制。系统性研究HMGCS2在慢性肾病发生和发展中的作用，将为其防治提供新颖的思路和找到潜在的靶点，具有重要的科学意义及临床应用价值。

发明内容

本发明的目的是将HMGCS2作为慢性肾脏疾病治疗的新靶点。

本发明所指的HMGCS2，是指如下a或b中的一种：

a——由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b——将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗慢性肾脏疾病的功能的由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。

首先，本发明保护如上所述的HMGCS2蛋白在制备慢性肾脏疾病治疗药物中的应用，并且HMGCS2蛋白可单独使用，也可与其它活性组分或辅料配合制成药物。

其次，本发明还保护如上所述的HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒，所述HMGCS2蛋白的编码基因可为如下c或d或e或f的一种：

c——SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

d——序列表中序列2自5’末端第54至1580位核苷酸所示的DNA分子；

e——在严格条件下与c或d限定的DNA序列杂交且编码具有治疗慢性肾脏疾病的功能的蛋白的DNA分子；

f——与c或d限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有治疗慢性肾脏疾病的功能的蛋白的DNA分子。

进一步的，所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒可为将线性化的穿梭质粒和病毒骨架质粒共转化大肠杆菌或其它工具细胞，得到的重组病毒颗粒。所述线性化的穿梭质粒包括用限制性内切酶PmeⅠ酶切穿梭质粒pshuttl-CMV-HMGCS2得到的；所述穿梭质粒pshuttl-CMV-HMGCS2包括将所述HMGCS2蛋白的编码基因插入pshuttl-CMV质粒的多克隆位点(SalⅠ和EcoRⅤ酶切位点)得到的。

进一步的，所述含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒可为将所述含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒进行线性化，将线性化的质粒转染哺乳动物细胞，得到重组病毒。所述哺乳动物细胞具体可为293细胞。

其次，本发明还保护如上所述的HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒在制备慢性肾脏疾病治疗药物中的应用。

其次，本发明还包括一种慢性肾脏疾病治疗药物，包括如上所述的HMGCS2蛋白、HMGCS2蛋白的编码基因、含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒，HMGCS2蛋白、HMGCS2蛋白的编码基因、含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒可单独使用，也可与其它活性组分或辅料配合制成药物。

最后，本发明还保护调节如上所述的HMGCS2蛋白功能和活性的化学小分子和生物大分子在治疗慢性肾脏疾病中的应用。

进一步的，调节HMGCS2蛋白功能和活性的化学小分子和生物大分子为：抑制剂或者抗体。

本发明公开了HMGCS2作为慢性肾脏疾病(糖尿病肾病和高血压肾病)肾脏纤维化治疗的新靶点的用途。

经过实验发现：

(1)STZ诱导的1型糖尿病肾病模型，野生型与HMGCS2基因敲除小鼠血糖、尿量及尿白蛋白水平显著升高，但是HMGCS2基因敲除小鼠较野生型小鼠尿白蛋白水平显著降低；

(2)并且HMGCS2基因缺失可以显著减轻STZ诱导的肾脏纤维化。

(3)在STZ诱导的1型糖尿病肾病和db/db小鼠2型糖尿病肾病模型HMGCS2mRNA和蛋白表达水平显著增加。

(4)而且，在Ang II的诱导高血压肾病模型上小鼠肾脏HMGCS2mRNA和蛋白表达水平也明显增加。

由此可以看出，HMGCS2可能参与了慢性肾脏疾病(糖尿病肾病和高血压肾病)发生、发展的过程，抑制其功能能够有效地减轻慢性肾脏疾病肾脏纤维化程度。因此，HMGCS2有可能成为预防或治疗慢性肾脏疾病的潜在靶点。

附图说明

图1是HMGCS2腺病毒的Western blot鉴定；5，10，50，100，250指MOI；Ad-GFP：对照GFP腺病毒感染的293细胞；Ad-HMGCS2：Ad-HMGCS2感染的293细胞。

图2是HMGCS2基因敲除小鼠构建情况。

图3是链脲佐菌素(STZ)诱导慢性肾病(1型糖尿病肾病)模型，野生型与HMGCS2基因敲除小鼠体重和血糖的改变。

图4是STZ诱导1型糖尿病肾病，野生型与HMGCS2基因敲除小鼠尿量及尿蛋白的改变。

图5是STZ诱导1型糖尿病肾病，野生型与HMGCS2基因敲除小鼠肾脏肾脏纤维化的改变。

图6是STZ诱导1型糖尿病肾病模型和2型糖尿病肾病模型db/db小鼠肾脏HMGCS2表达情况。

图7是血管紧张素II(Ang II)诱导慢性肾病(高血压肾病)模型肾脏HMGCS2表达情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。

实施例1构建HMGCS2腺病毒

1、HMGCS2全长序列的克隆

全长HMGCS2蛋白序列见序列表的SEQ ID NO.1分析。HMGCS2基因cDNA序列如序列表的SEQ ID NO.2所示，在其编码区两侧附近区域设计引物。另外在引物两侧加上保护碱基，最终引物序列如下：

上游引物：5’-ATATGCAGCGGCTTTTGGCTCC-3’；

下游引物：5’-GCTTAGACGGGACACCGGGCAT-3’。

以小鼠肾脏cDNA为模板，用高保真pfu DNA聚合酶进行RT-PCR。PCR产物进行琼脂糖电泳，回收目标条带，长度为1527bp。

2、重组质粒的构建

①用限制性内切酶SalⅠ(购自NEB公司，R0138S)和EcoRⅤ(购自NEB公司，R0195S)双酶切步骤1的PCR产物，回收酶切产物。

②用限制性内切酶SalⅠ和EcoRⅤ双酶切pshuttl-CMV质粒(购自Stra-tagene公司，#240007)，回收载体骨架。

③用T4连接酶将步骤①的酶切产物和步骤②的载体骨架连接，得到连接产物。

④将连接产物进行测序，测序结果表明得到了重组质粒pshuttl-CMV-HMGCS2(又称穿梭质粒)。

3、重组腺病毒的制备和鉴定

(1)共转化

①用PmeⅠ内切酶(购自NEB公司，R0560S)线性化穿梭质粒，用琼脂糖电泳鉴定线性化的效率，并将其回收。

②将1-5μl(约1μg)线性化的穿梭质粒及1μl(约100ng/μl)病毒骨架质粒pAdEasy-1(购自Merck公司，T240005加入至含约40μl大肠杆菌BJ5183(购自Merck公司，ST200157电转感受态的EP管中混匀，冰上冷却。

③将混合物加入电转杯，电击(1250-1500V/mm,5ms)。

④电击结束取出样品，加入1ml SOC培养液，37℃低速振荡40min。取适当体积的电击转化细胞液涂于若干个卡那霉素抗性平板(25-50mg卡那霉素/ml培养基)，37℃培养16-20hr。

⑤次日挑取平板上长出的菌落(选择最小的菌落)，接种于3ml含卡那霉素的LB培养基(25-50mg卡那霉素/ml培养基)，37℃培养10-15hr。

⑥碱裂法提取质粒，0.8％琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为候选的阳性克隆。

⑦将候选的阳性克隆进行PacI(购自Merck公司，R0547S)单酶切，然后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，如显示出一条大片段(约30kb)及一条小片段(约3.0或4.5kb)，则基本确定为阳性克隆。

⑧取1-5μl阳性克隆转化至大肠杆菌DH5α(购自Merck公司，D0351，扩增重组菌并纯化质粒(重组病毒质粒)。

(2)重组病毒质粒感染293细胞

①293细胞培养：感染24小时前，接种2×106个293细胞(购自ATCC CRL-1573)于25cm²培养瓶，使生长密度约50-70％。

②用限制性内切酶PacI单酶切步骤(1)纯化的重组病毒质粒(约4μg DNA)，完全线性化后，乙醇沉淀，再用20μl ddH₂O溶解。

③将步骤②得到的线性化质粒和脂质体(Lipofectamine2000，购自Invitrogen公司，11668-027)分别稀释于500μl无血清培养基再混合,置于室温下15-30min，得到Lipofectamine-DNA混合物。

④以无血清培养基轻轻洗涤步骤①的培养瓶，另加2.5ml无血清培养基，37℃放置10min。

⑤将步骤③得到的Lipofectamine-DNA混合物加入步骤④的培养瓶，37℃孵箱放置4hr。

⑥弃Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培养基(含10％FCS)，37℃孵箱培养；培养过程中观察细胞生长情况，约2周后可观察到细胞病变出现。

(3)鉴定

①观察细胞病变(CPE)

感染细胞10-14d后收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃。取30-50％上清，感染50-70％饱和度的25cm2培养瓶中293细胞。2-3d后出现明显细胞病变。

②Western blot鉴定

感染细胞3-5d后，当1/3-1/2细胞漂浮时收集细胞提取蛋白，通过Western blot鉴定重组腺病毒产生。一抗为抗HMGCS2抗体(购自Abcam公司)，二抗为HRP标记的羊抗兔二抗(购自Santa Cruz公司)，见图1。

图1的Western blot结果显示近端肾小管上皮细胞感染Ad-HMGCS2 24小时后，HMGCS2蛋白表达显著增强，并呈现剂量依赖性。

4、重组腺病毒的扩增

①步骤3的(2)中，感染细胞14d后收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃。

②75cm²培养瓶中接种293细胞，至密度达到90％，加入适量病毒上清感染细胞；3-4d后，细胞几乎变圆，且有一半细胞漂浮，则收集所有细胞。约500g转速离心，弃上清。

③以灭菌PBS重悬沉淀，反复冻融4次；4℃下7000g离心5min，得到病毒裂解上清液；病毒纯化至少需要30瓶75cm²培养瓶细胞的上清液。

④CsCl连续梯度离心纯化：50ml离心管中称量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混匀，体积约为10ml；转移至12ml超速离心管(用于SW41转头)中，覆盖约2ml矿物油；平衡后，10℃下32000rpm离心18-24hr，用注射器抽吸离心出的密度在1.30-1.40g/ml之间的病毒带。

⑤病毒透析去盐：配置透析液(10mM Tris pH8.0，2mM MgCl₂，5％蔗糖)，灭菌处理；将抽吸出的病毒4℃透析，更换3次透析液，可基本去除CsCl，病毒液保存于-80℃。

5、病毒滴度测定(TCID50)

①细胞准备：96孔板中接种100μl 293细胞,每孔细胞数约104个。

②稀释病毒液准备：将步骤4得到的病毒液稀释成8个较高浓度(10-3-10-10)，每个浓度重复10个；每孔加入病毒稀释液100μl，另留两排不加病毒液作为阴性对照；37℃下，孵箱培养10天。

③10d后观察细胞，记数每排出现CPE的孔数，计算细胞病变率；如某一浓度各孔细胞全部病变，细胞病变率为1，如无细胞病变，细胞病变率为0。

计算T＝10×10^1+d(S-0.5)/ml

d＝Log 10稀释度(如为10倍稀释℃，d＝1)

S＝各浓度细胞病变比率之和

实施例2HMGCS2作为慢性肾病疾病(高血压肾病和糖尿病肾病)治疗的新靶点

(一)链脲佐菌素(STZ)诱导1型糖尿病肾病模型以及2型糖尿病肾病模型db/db小鼠均为肾脏病研究领域常用的模型动物。HMGCS2基因敲除小鼠由第一发明人授权委托上海斯丹赛生物技术有限公司构建并成功制备(图2)。

野生型与HMGCS2基因敲除小鼠，雄性，8-10周龄，22-28克，由第一发明人所在实验室繁殖。STZ从美国Sigma公司购置，按照50mg/kg/day剂量小鼠腹腔注射STZ(溶于柠檬酸缓冲液中)，连续注射5天，2周后检测空腹血糖>300mg/dl，认为糖尿病造模成功，对照组注射等量的柠檬酸缓冲液，连续观察4个月，成功复制1型糖尿病肾病模型。db/db小鼠为常用的2型糖尿病肾病模型动物；雄性，3-4月龄；购自美国Jackson Laboratory(USA)，由第一发明人所在实验室繁殖。

图2A中，HMGCS2基因编码区第2个外显子(exon2)随机删除14bp，成功构建HMGCS2-/-小鼠；图2B中，PCR可以明确区分HMGCS2+/+和HMGCS2-/-小鼠；图2C中，WesternBlot结果显示HMGCS2+/+肾脏表达HMGCS2蛋白，而HMGCS2-/-小鼠肾脏则不表达该蛋白。

1、STZ诱导野生型与HMGCS2基因敲除小鼠体重和血糖改变。

与对照组相比，STZ诱导野生型和HMGCS2基因敲除小鼠体重均明显降低，而野生型小鼠与HMGCS2基因敲除小鼠间体重无差异(图3A)。使用血糖仪(美国罗氏诊断公司)通过小鼠尾静脉采血，检测空腹6小时(早晨8点至下午2点)后血糖。结果表明，与对照组相比，STZ诱导野生型与HMGCS2基因敲除小鼠血糖显著升高，而野生型小鼠与HMGCS2基因敲除小鼠间血糖无显著差别(图3B)。

图3A的实验结果与对照组相比，STZ诱导野生型和HMGCS2基因敲除小鼠体重均明显降低，而野生型小鼠与HMGCS2基因敲除小鼠间体重无差异；图3B的实验结果与对照组相比，STZ诱导野生型与HMGCS2基因敲除小鼠血糖显著升高，而野生型小鼠与HMGCS2基因敲除小鼠间血糖无显著差别。*p<0.05,**p<0.01,与WT组比较，n＝4-5。

2、STZ诱导野生型与HMGCS2基因敲除小鼠尿量及尿蛋白改变。

采用小鼠尿液代谢笼收集24小时尿量，记录尿量，尿白蛋白浓度使用MouseAlbumin ELISA Kit(Abcam公司)测定，结果见图4。结果表明，野生型小鼠与HMGCS2基因敲除小鼠间基础尿量无显著差别；与对照组相比，STZ诱导野生型与HMGCS2基因敲除小鼠尿量显著增加(图4A)。另外，STZ诱导野生型与HMGCS2基因敲除小鼠尿白蛋白水平明显增加，但是HMGCS2基因敲除小鼠较野生型小鼠尿白蛋白水平显著降低(图4B)。

图4A中STZ诱导野生型和HMGCS2基因敲除小鼠24小时尿量显著增加；图4B中STZ诱导野生型和HMGCS2基因敲除小鼠24小时尿白蛋白水平明显升高，但HMGCS2基因敲除较野生型小鼠尿蛋白水平减少。*p<0.05,**p<0.01,与WT组比较；#p<0.05,与WT+STZ组比较，n＝4-5。

3、STZ诱导野生型小鼠肾脏出现明显纤维化，HMGCS2基因缺失可以减轻STZ诱导的肾脏纤维化。

通过肾脏PAS染色来检测野生型与HMGCS2基因敲除小鼠分别给予STZ处理后肾脏纤维化程度。结果见图5。结果表明，与对照组相比，经过STZ处理的野生型小鼠肾脏肾小球出现明显系膜增生和肾小球硬化，但HMGCS2基因缺失明显减轻肾小球病变(图5A)；根据PAS染色结果进行半定量统计分析，STZ诱导HMGCS2基因敲除小鼠较野生型小鼠肾脏肾小球系膜增生程度显著减轻(图5B)。

图5A的PAS染色代表图显示，STZ诱导野生型和HMGCS2基因敲除小鼠肾脏肾小球出现明显系膜增生和肾小球硬化，但HMGCS2基因缺失明显减轻肾小球病变；图5B的系膜增生半定量统计分析结果表明，STZ诱导HMGCS2-/-较HMGCS2+/+小鼠肾脏肾小球系膜增生程度显著减轻。*p<0.05,**p<0.01,与WT组比较；#p<0.05,与WT+STZ组比较，n＝4-5。

4、STZ诱导1型糖尿病肾病模型和2型糖尿病肾病模型db/db小鼠肾脏HMGCS2表达情况。

STZ诱导的1型糖尿病肾病小鼠肾脏HMGCS2的蛋白和mRNA水平较对照组明显升高(图6A&C)。2型糖尿病肾病db/db小鼠肾脏HMGCS2的蛋白和mRNA水平也较对照组显著增加(图6B&D)。上述结果表明，HMGCS2在糖尿病肾病小鼠肾脏表达上调，其与糖尿病肾病发生密切相关。

图6A的Western blot代表图及蛋白水平统计图显示STZ诱导的1型糖尿病肾病小鼠肾脏HMGCS2蛋白水平明显升高；图6B的Western blot代表图及蛋白水平统计图显示2型糖尿病肾病db/db小鼠肾脏HMGCS2蛋白水平明显升高；图6C的mRNA水平统计图表明STZ诱导的糖尿病肾病小鼠肾脏HMGCS2mRNA水平显著增加；图6D的mRNA水平统计图表明db/db小鼠肾脏HMGCS2mRNA水平显著增加。*p<0.05,**p<0.01,与Con或db/m比较,n＝4-5。

(二)血管紧张素II(Ang II)诱导高血压肾病模型为肾脏病研究领域常用的模型动物。HMGCS2基因敲除小鼠由第一发明人授权委托上海斯丹赛生物技术有限公司构建并成功制备(图2)。野生型与HMGCS2基因敲除小鼠，雄性，8-10周龄，22-28克，由第一发明人所在实验室繁殖。Ang II从美国Sigma公司购置，在小鼠皮下包埋含有Ang II的缓释泵(从美国ALZET公司购置)以每天2mg/kg/day剂量持续输注14天，成功复制高血压肾病模型。研究结果表明，Ang II诱导高血压肾病小鼠肾脏HMGCS2的蛋白和mRNA水平较对照组明显升高(图7)。上述结果表明，HMGCS2在高血压肾病小鼠肾脏表达上调，其与高血压肾病发生密切相关。

图7A的Western blot代表图及蛋白水平统计图显示AngII诱导的高血压肾病小鼠肾脏HMGCS2蛋白水平明显升高；图7B的mRNA水平统计图表明AngII诱导的高血压肾病小鼠肾脏HMGCS2mRNA水平显著增加。*p<0.05,**p<0.01,与Con比较，n＝4-5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳大学

<120> HMGCS2作为慢性肾脏疾病肾脏纤维化治疗的新靶点

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 508

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Gln Arg Leu Leu Ala Pro Ala Arg Arg Val Leu Gln Val Lys Arg

1 5 10 15

Ala Met Gln Glu Thr Ser Leu Thr Pro Ala His Leu Leu Ser Ala Ala

20 25 30

Gln Gln Arg Phe Ser Thr Ile Pro Pro Ala Pro Leu Ala Lys Thr Asp

35 40 45

Thr Trp Pro Lys Asp Val Gly Ile Leu Ala Leu Glu Val Tyr Phe Pro

50 55 60

Ala Gln Tyr Val Asp Gln Thr Asp Leu Glu Lys Phe Asn Asn Val Glu

65 70 75 80

Ala Gly Lys Tyr Thr Val Gly Leu Gly Gln Thr Arg Met Gly Phe Cys

85 90 95

Ser Val Gln Glu Asp Ile Asn Ser Leu Cys Leu Thr Val Val Gln Arg

100 105 110

Leu Met Glu Arg Thr Lys Leu Pro Trp Asp Ala Val Gly Arg Leu Glu

115 120 125

Val Gly Thr Glu Thr Ile Ile Asp Lys Ser Lys Ala Val Lys Thr Val

130 135 140

Leu Met Glu Leu Phe Gln Asp Ser Gly Asn Thr Asp Ile Glu Gly Ile

145 150 155 160

Asp Thr Thr Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Thr Ala Ser Leu Phe Asn Ala

165 170 175

Ala Asn Trp Met Glu Ser Ser Tyr Trp Asp Gly Arg Tyr Ala Leu Val

180 185 190

Val Cys Gly Asp Ile Ala Val Tyr Pro Ser Gly Asn Ala Arg Pro Thr

195 200 205

Gly Gly Ala Gly Ala Val Ala Met Leu Ile Gly Pro Lys Ala Pro Leu

210 215 220

Val Leu Glu Gln Gly Leu Arg Gly Thr His Met Glu Asn Ala Tyr Asp

225 230 235 240

Phe Tyr Lys Pro Asn Leu Ala Ser Glu Tyr Pro Leu Val Asp Gly Lys

245 250 255

Leu Ser Ile Gln Cys Tyr Leu Arg Ala Leu Asp Arg Cys Tyr Ala Ala

260 265 270

Tyr Arg Lys Lys Ile Gln Asn Gln Trp Lys Gln Ala Gly Asn Asn Gln

275 280 285

Pro Phe Thr Leu Asp Asp Val Gln Tyr Met Ile Phe His Thr Pro Phe

290 295 300

Cys Lys Met Val Gln Lys Ser Leu Ala Arg Leu Met Phe Asn Asp Phe

305 310 315 320

Leu Ser Ser Ser Ser Asp Lys Gln Asn Asn Leu Tyr Lys Gly Leu Glu

325 330 335

Ala Phe Arg Gly Leu Lys Leu Glu Glu Thr Tyr Thr Asn Lys Asp Val

340 345 350

Asp Lys Ala Leu Leu Lys Ala Ser Leu Asp Met Phe Asn Gln Lys Thr

355 360 365

Lys Ala Ser Leu Tyr Leu Ser Thr Asn Asn Gly Asn Met Tyr Thr Ser

370 375 380

Ser Leu Tyr Gly Cys Leu Ala Ser Leu Leu Ser His His Ser Ala Gln

385 390 395 400

Glu Leu Ala Gly Ser Arg Ile Gly Ala Phe Ser Tyr Gly Ser Gly Leu

405 410 415

Ala Ala Ser Phe Phe Ser Phe Arg Val Ser Lys Asp Ala Ser Pro Gly

420 425 430

Ser Pro Leu Glu Lys Leu Val Ser Ser Val Ser Asp Leu Pro Lys Arg

435 440 445

Leu Asp Ser Arg Arg Arg Met Ser Pro Glu Glu Phe Thr Glu Ile Met

450 455 460

Asn Gln Arg Glu Gln Phe Tyr His Lys Val Asn Phe Ser Pro Pro Gly

465 470 475 480

Asp Thr Ser Asn Leu Phe Pro Gly Thr Trp Tyr Leu Glu Arg Val Asp

485 490 495

Glu Met His Arg Arg Lys Tyr Ala Arg Cys Pro Val

500 505

<210> 2

<211> 3294

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

gggcatctct cccaagggct gtggactgct ggctttctgt tgatacctta gagatgcagc 60

ggcttttggc tccagcgagg cgggtcctgc aagtgaagag agcgatgcag gaaacttcgc 120

tcacacctgc tcacctgctc tcagcagccc agcagaggtt ttctacaatc cctcctgctc 180

ccctggccaa aacagataca tggccaaaag atgtgggcat ccttgccctg gaggtctatt 240

ttccagccca atatgtggac caaactgacc tggaaaagtt caacaatgtg gaagcaggga 300

agtatacagt gggcttgggc cagacccgta tgggcttctg ttcagtccag gaggacatca 360

actccctgtg cctgacagtg gtacagaggc tgatggaacg cacaaagctg ccgtgggatg 420

ctgtgggccg tctggaagtg ggcaccgaga ccatcattga caagtccaag gctgtcaaaa 480

cagtgctcat ggaactgttc caggattcag gcaacactga catcgagggc atagatacca 540

ccaacgcctg ttatggcggc acagcctccc tcttcaatgc tgccaactgg atggagtcca 600

gctactggga tggtcgctat gccctggtgg tctgtggtga cattgcagtc tacccgagtg 660

gtaacgcccg ccccacaggt ggtgctgggg ctgtggcaat gctgatcggg cccaaggccc 720

ctctggtcct cgagcaaggg ctgaggggaa ctcacatgga gaacgcgtac gacttctaca 780

aaccaaactt ggcctcagag tatccactgg tggatgggaa gctgtctatc cagtgctacc 840

tgcgggcctt ggatcgatgc tatgcagcct accgcaagaa gatccagaat cagtggaagc 900

aagctggaaa caaccagcct ttcaccctcg atgatgtgca gtatatgatc ttccacacac 960

ccttttgcaa gatggtccag aaatccctgg ctcggttgat gttcaatgac ttcctgtcat 1020

ccagcagtga caaacagaac aacttataca agggcctaga ggccttcagg ggtctaaagc 1080

tggaagaaac ctacaccaac aaggatgtag acaaggctct tttgaaggcc tccctggaca 1140

tgttcaacca gaagaccaag gcctcccttt acctctccac aaataatggg aacatgtaca 1200

cctcttccct ctatggctgc ctggcctcac ttctctctca ccactctgcc caagaattgg 1260

ctggctccag gattggagcc ttctcctacg gctcaggctt agcagcaagt ttcttttcat 1320

tccgagtgtc caaggatgct tccccaggtt cccccctgga gaaactggtg tctagtgtgt 1380

cagatctgcc caaacgtcta gactcccgga gacgcatgtc ccctgaggaa ttcacagaaa 1440

taatgaacca gagagagcaa ttttaccaca aggtgaactt ctctccacct ggagacacaa 1500

gcaatctctt cccaggtact tggtaccttg aacgagtgga tgagatgcat cgcaggaagt 1560

atgcccggtg tcccgtctaa tggagatcca tgcaacaatt ccccggggaa agaaggtgag 1620

ccgagctgct acccaaacag catctgctta aaatcccacc cacagcagta aatagggact 1680

agacacagca gcctcatagg atctgctctg tggtgaacgg cctccctctg tgaatcctgg 1740

gtgtctctcc ctgacacaat cagcgccaca ggctcatgct gctgtggacc agagctcccc 1800

tgtgaagagg gagatgaaag aaaggggagc cgctgacctg cagggatgca gatctttccc 1860

cacagcccgg cagagcagcc atttgttaca gcttattctc agactctggg ctattatagt 1920

ttatgcttgt ttcttaaagt ttctaaattt tgtatcttgt tctaaaataa tatgtggcaa 1980

ttaaaaagag agaagaaatt acttgtattt tctagaaggc aagacctact tactcagagg 2040

actgaacact tacgtcacca ccccattaat taattctcca caagtctggc cagttctgca 2100

aaggagtgtg gcagatacaa ggcaaataaa gacagtggca cagaacaccc actgcttact 2160

tctctgtcct acagacacca tatccagatg gagccagcag gtactcagta gataactccc 2220

cttgacatag gtggccagta ttagttaccg agactaaagg caaagcaaaa tccataaggt 2280

tggccaggca tgatcatgca gaactgaaat ctcagcactt gggaagccga ggcagggctg 2340

agttcaaggc tgatacatgt gaacttggtc tacagagcaa gttccaggac atccaaggct 2400

ataaagagaa acagtcttga aaagcaacaa caacaacaga aacaaactca aaaggatgac 2460

gcagaagtag aatcctctct tctttgggta aagagaacac agagtcctca taaaacagca 2520

atgttttagg aatgtgagca ttgggcacaa gcaaagggga gaaaagaggg caggggaggg 2580

ataggaagga caaggggttc tagtcttcca ttgtctttta gaaaaagctc tggacagagg 2640

ttctgttgaa ccttgaggga agccagctgg ccgaggagcc tcaaacacac acatgaaatg 2700

cggtgacggc catgtcccac caccagcagt aaagccgggc gaggcccagg ctgagcagct 2760

aatccagccc tagcccctcc tcagcccctc catgcacatg agaccctcga tctttccaga 2820

acttcttgca ggaccgtgct cccttcttag gtcactgcag ccatgtctgt ctacacgaaa 2880

gagaagccag tgtccccctg gttcaagaca gggacacaga acccacgaag agctctctgc 2940

agggtcttga cagccccccc tttctgtgtc ccattgttgg gccctggtat tcctctacca 3000

gaagtcacat ggattcaact aggggatgat ctcaaagtaa cactgtggaa ctgggaagat 3060

ggcccaggga gttaaggcac ctgctactaa ccttgacaac ctgagttcca tccctgggac 3120

ccccatggta aagagataac ccattcctga aagtgtcctc ttgttaccaa acttggggtc 3180

actgtttcta ctataagaaa tcaagttcag ccacctgtcc ccaagaagcc acctgtgcac 3240

tttggcatga atgtgttcta tccctcaata aaatgcattt caaaattgtg tcaa 3294

Claims

1.HMGCS2蛋白在制备慢性肾脏疾病治疗药物中的应用，其特征在于，所述HMGCS2蛋白是如下a或b中的一种：

a——由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b——将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗慢性肾脏疾病的功能的由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的蛋白质；HMGCS2蛋白可单独使用，也可与其它活性组分或辅料配合制成药物。

2.HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒，其特征在于，所述HMGCS2蛋白的编码基因可为如下c或d或e或f的一种：

c——SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

3.根据权利要求2所述的HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒，其特征在于，

所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒可为将线性化的穿梭质粒和病毒骨架质粒共转化大肠杆菌或其它工具细胞，得到的重组病毒颗粒。

4.根据权利要求3所述的HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒，其特征在于，

所述线性化的穿梭质粒包括用限制性内切酶PmeⅠ酶切穿梭质粒pshuttl-CMV-HMGCS2得到的；所述穿梭质粒pshuttl-CMV-HMGCS2包括将所述HMGCS2蛋白的编码基因插入pshuttl-CMV质粒的SalⅠ和EcoRⅤ酶切位点得到的。

5.根据权利要求2所述的HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒，其特征在于，

所述含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒可为将所述含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒进行线性化，将线性化的质粒转染哺乳动物细胞，得到重组病毒。

6.根据权利要求5所述的HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒，其特征在于，

所述哺乳动物细胞具体可为293细胞。

7.HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒在制备慢性肾脏疾病治疗药物中的应用，其特征在于，

所述HMGCS2蛋白的编码基因、含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有所述HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒如权利要求2-6任一项所述。

8.一种慢性肾脏疾病治疗药物，其特征在于，

包括如权利要求1-6任一项所述的HMGCS2蛋白、HMGCS2蛋白的编码基因、含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组质粒或含有HMGCS2蛋白的编码基因的重组病毒。

9.调节HMGCS2蛋白功能和活性的化学小分子和生物大分子在治疗慢性肾脏疾病中的应用，其特征在于，

所述HMGCS2蛋白是如下a或b中的一种：a——由序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b——将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有治疗慢性肾脏疾病的功能的由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。

10.根据权利要求9所述的调节HMGCS2蛋白功能和活性的化学小分子和生物大分子在治疗慢性肾脏疾病中的应用，其特征在于，

调节HMGCS2蛋白功能和活性的化学小分子和生物大分子为：抑制剂或者抗体。