CN101759775B - 一种水蛭活性小肽及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水蛭活性小肽及其制备方法和用途，属于中药领域。其技术方案是水蛭加水匀浆后，在适当的条件下，酶解成小肽，以常规方法精制，再以超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，未透过液浓缩，干燥，即得到相对分子量范围为0.2KD～3KD水蛭活性小肽，将其与药剂学上可接受的辅料配合使用，制备成胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂、粉针剂或注射剂等常规制剂。本发明在治疗心脑血管疾病方面具有良好效果，在治疗缺血性脑中风疾病方面效果尤佳。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药水蛭活性小肽及其制备方法和用途。属中药领域。
背景技术
水蛭作为传统中药，始载于《神农本草经》，临床应用很广泛，药效确实。水蛭通常以药材原粉、水提、醇提或水提醇沉的方式入药，方法比较传统，药材利用率较低；单味或配伍复方口服给药，治疗心脑血管疾病疗效显著。水蛭中疗效确切的水蛭素类成分口服易失活，而且只存于日本医蛭等吸血水蛭中，而蚂蟥、柳叶蚂蟥等非吸血水蛭又在临床中口服疗效确切，说明水蛭中还有另一类活性成分或部位。经现代研究，水蛭小肽确切的疗效成为水蛭的另一个活性部位，小肽在动物体内以蛋白的形式存在，服用后蛋白经胃肠道内的胃蛋白酶及胰酶酶解成小肽，再吸收入血发挥疗效；但蛋白在体内酶解成小肽的效率极低，绝大多数直接排除体外，造成药材的大量浪费，疗效大大降低，而且人体酶解转化蛋白还受到药材粉碎细度、胃肠道pH变化及口服其他食物的干扰。
水蛭的临床确切疗效及较低的生物利用度，迫切需要一种新的提取方法，提高其生物利用度。应用酶解法水解动物蛋白，获得具有一定生理活性的生物活性肽是目前国内外研究的热点，水蛭酶解法制备活性小肽，能充分合理的利用水蛭药材资源，并排除人体对吸入异蛋白引起的免疫原排异反应，服用更安全，具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种更有效的，安全的水蛭活性小肽有效部位；本发明的第二目的是提供该制剂的制备方法及其在制备用于治疗心脑血管疾病药物中的应用。
发明人提供一种水蛭活性小肽有效部位，其相对分子量为0.2KD～3KD，总小肽含量不低于50％。
本发明的水蛭活性小肽可采用胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解或仿生酶解的方法制备，再经精制纯化，并以分子截留值3KD的超滤膜超滤除去大分子的未水解的蛋白、多肽及角蛋白，其透过液再以分子截留值0.2KD的纳滤膜纳滤，以除去小分子的氨基酸等杂质，未透过液经浓缩、干燥，即得到本发明的水蛭活性小肽有效部位，其相对分子量为0.2KD～3KD，经测定其总小肽含量不低于50％。经对相对分子量3KD以上、0.2KD～3KD、0.2KD以下的各部位进行药效筛选，结果药效成分主要集中在相对分子量0.2KD～3KD范围内，而相对分子量3KD以上、0.2KD以下部位基本无活性。相对分子量为0.2KD～3KD的水蛭酶解小肽为水蛭的主要活性部位。
动物药的小肽获取方法有酶解法、酸解法、碱解法，酸解法、碱解法破坏肽的结构，专属性不强，不易控制，水解过渡成为氨基酸；酶解法专属性强，不同的蛋白酶酶解的肽键部位不同，如胃蛋白酶主要酶解的部位为苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键，胰蛋白酶主要酶解的部位为精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸组成的肽键，有针对性的选择蛋白酶能够得到理想的小肽，故以酶解法制备水蛭小肽具有较大优势。
以胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解的方法酶解水蛭，对蛋白中相应的肽键进行酶解，可得到水蛭活性小肽，其药效远高于水蛭原粉；而仿生酶解法酶解水蛭为发明人所独创，即模拟人体口服水蛭等动物药的过程，创造性的在体外采用人体仿生酶解的方法，将水蛭先后以胃蛋白酶、胰蛋白酶在最佳酶解条件下酶解，与直接口服原粉相比，所得的有效物质群相同，但仿生酶解是最优的酶解条件下酶解的，酶解的更充分，效率高，且经适当方式去除未酶解的无活性蛋白，不仅增强了疗效，而且消除了服用水蛭粉异蛋白引起的免疫原反应，减小了不良反应发生率，安全性高，而且其酶解效果比胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解好。
胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解或仿生酶解的方法分别为：
1、胃蛋白酶酶解：取水蛭，加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH1.0～3.0，加入水蛭量1％～3％且酶活力不低于1200U/g的胃蛋白酶，于30～50℃保温酶解2～8小时，80～85℃保温30分钟，即得；
2、胰蛋白酶酶解：取水蛭，加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH7.5～9.0，加入水蛭量1％～3％且酶活力不低于2500U/mg的胰蛋白酶，于30～50℃保温酶解2～8小时，80～85℃保温30分钟，即得；
3、木瓜蛋白酶酶解：取水蛭，加水匀浆，80～85℃保温30分钟，加入水蛭量1％～3％且酶活力不低于500U/mg的木瓜蛋白酶，于30～50℃保温酶解2～8小时，80～85℃保温
分钟，即得；
4、仿生酶解：取水蛭加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH1.0～3.0，加入水蛭量0.5％～2％且酶活力不低于1200U/g的胃蛋白酶，于30～50℃保温酶解0.5～2小时，再调节pH7.5～9.0，加入水蛭量0.5％～2％且酶活力不低于2500U/mg的胰蛋白酶或酪蛋白转化力不低于25.0的胰酶，于30～50℃保温酶解2～6小时，80～85℃保温30分钟，即得。
酶解方法具体为：
1、胃蛋白酶酶解：取水蛭，加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH2.0，加入水
量2％且酶活力不低于1200U/g的胃蛋白酶，于30～50℃保温酶解6小时，80～85℃保温
分钟，即得；
2、胰蛋白酶酶解：取水蛭，加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH8.0，加入水蛭量2％且酶活力不低于2500U/mg的胰蛋白酶，于30～50℃保温酶解6小时，80～85℃保温30分钟，即得；
3、木瓜蛋白酶酶解：取水蛭，加水匀浆，80～85℃保温30分钟，加入水蛭量2％且酶活力不低于500U/mg的木瓜蛋白酶，于30～50℃保温酶解6小时，80～85℃保温30分钟，即得；
4、仿生酶解：取水蛭加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH2.0，加入水蛭量1％且酶活力不低于1200U/g的胃蛋白酶，于30～50℃保温酶解1小时，再调节pH8.0，加入水蛭量1％且酶活力不低于2500U/mg的胰蛋白酶或酪蛋白转化力不低于25.0的胰酶，于30～50℃保温酶解3小时，80～85℃保温30分钟，即得。
按上述所得的水蛭酶解液，可采用常规精制方法精制，如以不同分子截留值超滤膜截留、醇沉或硫酸铵盐析等。以不同分子截留值超滤膜截留时可先以10KD超滤膜超滤，透过液再以5KD超滤膜超滤，透过液为相对分子量小于5KD的成分(小肽和氨基酸等)，将大分子的成分去除；醇沉的方法为将水蛭酶解液浓缩至相对密度为1.10～1.15(60℃)的清膏，加入乙醇使含醇量达40％～80％，静置冷藏12～24小时，保留上清液，除去了未酶解的大分子蛋白及角蛋白等杂质；硫酸铵盐析为在水蛭酶解浓缩液中加入硫酸铵，使小肽物质析出，以达到精制的目的。
经过精制后的水蛭酶解液先以分子截留值3KD的超滤膜超滤，透过液再以分子截留值0.2KD的纳滤膜纳滤，未透过液经浓缩、干燥，即为水蛭活性小肽，其相对分子量为0.2KD～3KD，其总小肽含量不低于50％，为水蛭发挥药效的有效部位。
发明人所用的水蛭可以是水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudonipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman及其他水蛭变种的新鲜或干燥全体。鲜体可直接加水匀浆，干体可先粉碎成80～100目粉或超微粉，再加水匀浆。按本发明的方法操作，水蛭的抗凝血、溶血栓、抗菌等活性大大增强，优于以往常用的水蛭原粉、水提液、醇提液及水提醇沉液。
本领域技术人员可以方便地将本发明酶解产物配合适当的辅料，制备成各种常规制剂，如：胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸剂、粉针剂或注射剂等。
本发明提供的水蛭酶解产物可以单独使用，也可以与其他药物成分联合使用，即：在药物活性成分中，可以只有该产物，还可以是其与其他药物的混合物，达到配合治疗、辅助治疗的目的。
本发明水蛭酶解产物可以在活血化瘀药物中广泛应用，可用于治疗心脑血管疾病，包括缺血性脑中风、冠心病、心绞痛、脑血栓等。
有益效果
为进一步验证本发明产物的治疗作用，发明人进行了动物药效学实验。
一、体外抗凝血活性试验
1、材料
1.1动物 Wister大鼠，购自北京大学实验动物科学部。
1.2药品 未酶解组：水蛭100g加水匀浆，80℃保温30分钟，离心，上清液调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.15的清膏，加乙醇使含醇量达60％，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，即得；
胃蛋白酶酶解组：水蛭100g加水匀浆，80℃保温30分钟，放冷，调pH2.0，加入1％胃蛋白酶，40℃保温酶解1小时，杀酶，离心，上清液调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.12的清膏，加乙醇使含醇量达60％，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以相对分子量0.2KD的纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽有效部位(小肽含量75％)；
胰蛋白酶酶解组：水蛭100g加水匀浆，80℃保温30分钟，放冷，调节pH8.0，加入1％胰蛋白酶，40℃保温酶解3小时，杀酶，离心，上清液调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.10的清膏，加乙醇使含醇量达60％，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以相对分子量0.2KD的纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽有效部位(小肽含量81％)；
木瓜蛋白酶酶解组：水蛭100g加水匀浆，80℃保温30分钟，放冷，加入1％木瓜蛋白酶，40℃保温酶解3小时，杀酶，离心，上清液减压浓缩至60℃相对密度为1.12的清膏，加乙醇使含醇量达60％，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以相对分子量0.2KD的纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽有效部位(小肽含量79％)；
仿生酶解小肽组：水蛭100g加水匀浆，80℃保温30分钟，放冷，调pH2.0，加入1％胃蛋白酶，保温酶解1小时，调节pH8.0，加入1％胰蛋白酶，保温酶解3小时，杀酶，离心，上清液调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.13的清膏，加乙醇使含醇量达60％，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以相对分子量0.2KD的纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽有效部位(小肽含量86％)；
空白对照组：即生理盐水组。
1.3试剂 胃蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号：F20070914；胰蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号：F20071228；木瓜蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号：F20071205；牛纤维蛋白原，供凝血酶效价测定用，购自中检所，批号：140626-200608；凝血酶，购自珠海经济开发区生物化学制药厂，批号：20071101。
2、方法与结果
2.1试验方法 大鼠腹腔静脉取血，3.8％枸橼酸钠(1：9)抗凝，混合后，以3000r/ml离心15分钟，取上清液，得到贫血小板血浆(PPP)。取血浆0.1ml，加入水蛭不同酶解液0.1ml，混匀，37℃保温3min，再加入已预温的凝血酶(10U/ml)0.2ml，混匀，记录出现絮状沉淀所需时间，即为凝血酶原时间(PT)。
2.2试验结果 水蛭不同酶解工艺对应的凝血酶原时间测定结果见下表。
表 凝血酶原时间(PT)测定结果(n＝5)
| 组别 | 凝血酶原时间(s) |
| 空白对照组 | 19±2.85 |
| 未酶解组 | 23±2.34 |
| 胃蛋白酶酶解组 | 71±4.53*+ |
| 胰蛋白酶酶解组 | 83±2.18*+ |
| 木瓜蛋白酶酶解组 | 86±3.06*+ |
| 仿生酶解小肽组 | 225±2.84**++ |
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与未酶解组比较，+P<0.05，++P<0.01。
上述试验结果表明，各酶解组均大大增加了水蛭的抗凝血活性，与未酶解组比较差异显著；而仿生酶解组较其他酶解组效果更强。
二、体外溶栓活性试验
1、材料
1.1药品 各供试品溶液的制备方法同上。
1.2试剂 琼脂糖，购自北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20080204；考马斯亮蓝R-250，购自上海展云化工有限公司，批号：0708019；胃蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号：F20070914；胰蛋白酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号：F20071228；胰酶，购自国药基团化学试剂有限公司，批号：F20071130；牛纤维蛋白原，供凝血酶效价测定用，购自中检所，批号：140626-200608；凝血酶，购自珠海经济开发区生物化学制药厂，批号：20071101。
2、方法与结果
2.1试验方法 取0.08g琼脂糖，加入磷酸盐缓冲液(PH7.6)10ml，加热使溶解，冷却至55℃，加入纤维蛋白原溶液(7mg/ml)0.8ml及凝血酶溶液(5U/ml)0.5ml，混匀，立即倒入已预热的培养皿中，待基本冷却后转移至7℃冰箱中放置20min，用直径0.5厘米打孔器打孔即得。每个孔中均加入20μl对应样品液，以生理盐水做对照。于37℃培养箱中培养22h。取出，用考马斯亮蓝R-250染色20～30min，脱色液脱色，观察纤维蛋白溶圈，记录溶圈直径。
2.2试验结果 水蛭不同酶解工艺对应的纤溶活性测定结果见下表。
表 纤维蛋白溶圈测定结果(n＝5)
| 编号 | 溶圈直径(mm) | 溶圈面积(mm2) |
| 空白对照组 | 6.4±2.42 | 13.58±8.55 |
| 未酶解组 | 12±2.16 | 108.45±16.40** |
| 胃蛋白酶酶解组 | 21±1.98 | 351.35±21.42*** |
| 胰蛋白酶酶解组 | 23±2.04 | 424.26±18.36*** |
| 木瓜蛋白酶酶解组 | 23±2.11 | 414.63±14.54*** |
| 仿生酶解小肽组 | 29±3.18* | 595.56±15.32*** |
注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
上述试验结果表明，仿生酶解工艺大大增加了水蛭的纤溶活性，均比其余酶解工艺理想，较未酶解样品具有显著性差异。
三、对大鼠凝血时间及静脉血栓形成的影响
1、材料
1.1动物 Wister大鼠50只，雌雄各半，体重200±20g。购自北京大学实验动物科学部。
1.2药品 各供试品溶液的制备方法同上。
2、方法与结果
2.1试验方法 取Wistar大鼠50只，雌雄各半，体重200±20g，随机分为5组，每组10只：未酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解样品组、仿生酶解样品组、空白对照组，灌胃给药每天1次，给药剂量分别为10ml/kg，空白对照组灌胃给予同体积生理盐水，连续7天。末次给药后1h，各组动物腹腔注射3.5％戊巴比妥钠麻醉，剖腹分离下腔静脉，于左肾静脉下穿一丝线结扎下腔静脉管，造成淤血，关闭腹腔。6h后，用内径为1mm的玻璃毛细管插入鼠内眦静脉丛取血，至毛细管血柱达5mm，每隔30s折断毛细管一段，检查有无出现凝血丝，计算毛细管采血到出现血凝丝时间，即为凝血时间。再次打开腹腔，于结扎下方2cm处夹闭血管，纵行剖开，取出血栓，记录血栓有无并称重。
2.2试验结果 结果见下表。
表 对大鼠凝血时间及静脉血栓形成的影响(X±S)
| 组别 | 动物数(只) | 剂量(ml/kg) | 凝血时间(s) | 血栓湿重(mg) |
| 空白对照组 | 10 | — | 66.00±21.07 | 24.94±2.14 |
| 未酶解组 | 10 | 10 | 90.00±17.28* | 20.68±3.06 |
| 胃蛋白酶酶解组 | 10 | 10 | 138.00±22.23** | 14.85±2.23** |
| 胰蛋白酶酶解组 | 10 | 10 | 156.00±20.45** | 14.12±2.57** |
| 木瓜蛋白酶酶解组 | 10 | 10 | 162.00±19.11** | 13.56±3.21** |
| 仿生酶解小肽组 | 10 | 10 | 249.00±15.15*** | 10.24±2.37*** |
与空白对照组比较(t检验)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
以上试验结果表明，仿生酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解组、木瓜蛋白酶酶解组均可明显延长凝血时间，且仿生酶解样品组优于其余三组，与空白对照组比较具有显著性差异，与未酶解组差异显著；仿生酶解样品组、胃蛋白酶酶解样品组、胰蛋白酶酶解组、木瓜蛋白酶酶解组均可明显减小血栓湿重，且仿生酶解样品组优于其余三组，与空白对照组比较具有显著性差异，与未酶解组差异显著。
以下实施例所得酶解产物均可获得上述实验效果。
具体实施方式
下面列举实施例，进一步说明本发明，各实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明：
实施例1
取水蛭500g粉碎成细粉，加10倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，调节pH2.0，加入2％胃蛋白酶，40℃保温酶解6小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.10的清膏，加硫酸铵盐析，析出物加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例2
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，调节pH2.0，加入1％胃蛋白酶，40℃保温酶解1小时，调节pH8.0，加入1％胰蛋白酶，50℃保温酶解3小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.15的清膏，加乙醇使含醇量达60％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽，加入适量的淀粉，制粒，干燥，整粒，填装胶囊。
实施例3
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至50℃，调节pH8.0，加入2％胰蛋白酶，50℃保温酶解6小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，以相对分子量10KD超滤膜超滤，透过液再以相对分子量5KD超滤膜超滤，透过液再以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例4
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，加入2％木瓜蛋白酶，40℃保温酶解6小时，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，减压浓缩至60℃相对密度为1.10的清膏，加乙醇使含醇量达40％，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例5
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，调节pH1.0，加入1％胃蛋白酶，40℃保温酶解2小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.10的清膏，加乙醇使含醇量达80％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例6
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，调节pH3.0，加入3％胃蛋白酶，40℃保温酶解8小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.10的清膏，加乙醇使含醇量达60％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例7
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至50℃，调节pH7.5，加入1％胰蛋白酶，50℃保温酶解2小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.10的清膏，加乙醇使含醇量达50％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例8
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至50℃，调节pH9.0，加入3％胰蛋白酶，50℃保温酶解8小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.12的清膏，加乙醇使含醇量达60％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例9
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，加入1％木瓜蛋白酶，40℃保温酶解2小时，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，减压浓缩至60℃相对密度为1.15的清膏，加乙醇使含醇量达40％，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例10
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，加入3％木瓜蛋白酶，40℃保温酶解6小时，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，减压浓缩至60℃相对密度为1.14的清膏，加乙醇使含醇量达70％，静置12小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例11
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，调节pH1.0，加入0.5％胃蛋白酶，40℃保温酶解0.5小时，调节pH7.5，加入0.5％胰蛋白酶，50℃保温酶解2小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.10的清膏，加乙醇使含醇量达50％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例12
取水蛭500g粉碎成细粉，加20倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，调节pH3.0，加入2％胃蛋白酶，40℃保温酶解2小时，调节pH9.0，加入2％胰蛋白酶，50℃保温酶解6小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.13的清膏，加乙醇使含醇量达40％，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽。
实施例13
取水蛭500g粉碎成细粉，加10倍量水，匀浆30分钟，80℃保温30分钟，放冷至40℃，调节pH3.0，加入0.5％胃蛋白酶，40℃保温酶解0.5小时，调节pH7.5，加入0.5％胰蛋白酶，50℃保温酶解2小时，80℃保温30分钟，离心，上清液备用，残渣再以适量水洗涤，离心，合并上清液，调节pH近中性，减压浓缩至60℃相对密度为1.13的清膏，加乙醇使含醇量达40％，静置16小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至适量，以相对分子量3KD的超滤膜超滤，透过液再以纳滤膜纳滤，滤液浓缩，干燥，即得相对分子量0.2KD～3KD的水蛭活性小肽，加入适量
微晶纤维素，混匀，以水为黏合剂，制成颗粒，干燥，即得。
实施例14
水蛭小肽(仿生酶解)100g
取水蛭小肽，加入适量的淀粉，混匀，制成颗粒，干燥，即得。
实施例15
取实施例2所制得胶囊剂治疗缺血性脑中风患者60例，男35例，女25例，年龄最小的40岁，最大的70岁，平均55岁；病程最短6小时，最长5天，全部病例均经头颅CT或
颅核磁共振(MRI)证实为颅内动脉或椎基底动脉系统的血栓形成。治疗方案：口服，每次1粒，每日2次。用药30天后复查，基本痊愈和显著进步患者例数48例，占80％，症状明显改善患者例数7例，占11.7％。
Claims (4)
1.一种水蛭活性小肽，其特征在于该水蛭活性小肽是由如下方法制备的：
水蛭加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH1.0～3.0，加入水蛭量0.5％～2％且酶活力不低于1200U/g的胃蛋白酶，于30～50℃保温酶解0.5～12小时，再调节pH7.5～9.0，加入水蛭量0.5％～2％且酶活力不低于2500U/mg的胰蛋白酶或酪蛋白转化力不低于25.0的胰酶，于30～50℃保温酶解2～6小时，80～85℃保温30分钟，以不同分子截留值超滤膜截留或醇沉或硫酸铵盐析中任一种方法精制，再以分子截留值3KD的超滤膜超滤、0.2KD的纳滤膜纳滤方法纯化，即得；
所制得的水蛭活性小肽的相对分子量范围为0.2KD～3KD，总小肽含量不低于50％。
2.根据权利要求1所述的水蛭活性小肽，其特征在于是由如下方法制备的：
水蛭加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH2.0，加入水蛭量1％且酶活力不低于1200U/g的胃蛋白酶，于30～50℃保温酶解1小时，再调节pH8.0，加入水蛭量1％且酶活力不低于2500U/mg的胰蛋白酶或酪蛋白转化力不低于25.0的胰酶，于30～50℃保温酶解3小时，80～85℃保温30分钟，以不同分子截留值超滤膜截留或醇沉或硫酸铵盐析中任一种方法精制，再以分子截留值3KD的超滤膜超滤、0.2KD的纳滤膜纳滤方法纯化，即得。
3.权利要求1至2中任一所述的水蛭活性小肽在制备用于治疗心脑血管疾病的药物中的应用。
4.权利要求1至2中任一所述的水蛭活性小肽在制备用于治疗缺血性脑中风疾病的药物中的应用。
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| Mao.Interaction of Hirudin with Thrombin: Identification of a Minimal Binding.《Biochemistry》.1988, * |
Cited By (1)
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