CN113234124B

CN113234124B - 一种活性肽在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用

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Publication number: CN113234124B
Application number: CN202110483486.9A
Authority: CN
Inventors: 李正; 刘睿; 韩立峰; 务勇胜; 朱金墙; 焦新怡
Original assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2041-04-30
Also published as: CN113234124A

Abstract

本发明提供了一种活性肽在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用，所述的缺血性脑中风为由脑血管狭窄或闭塞导致脑血流阻断使脑组织发生缺血缺氧、软化或坏死使脑血管功能障碍引起的症状；所述的缺血性脑中风、脑血栓、脑栓塞、腔隙性缺血性脑中风、多发性缺血性脑中风或小中风中的一种。本发明所述的活性肽从疏血通注射液中筛选出对缺血性脑中风损伤有保护作用的肽，为多组分中药的研究和多靶点药物的开发提供了新的方法。

Description

一种活性肽在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其是涉及一种活性肽在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。

背景技术

蛋白质和肽类药物作为最重要的生物药物之一，通常具有特定的三维结构和作用位点，能够在体内发挥特定的治疗作用，与传统药物相比具有更好的临床疗效和安全性。除抗体外，大多数蛋白质多肽药物的分子量不超过50kDa。近年来，多肽药物被开发用于多种疾病的诊断和治疗。缺血性脑中风是由于动脉血流阻塞和供氧中断而导致脑功能迅速丧失的疾病。目前，脑中风的临床治疗有限，术后康复效果差，具有较多副作用等。因此，研究具有高效的治疗活性和较少不良反应的药物十分必要。在我国，疏血通注射液广泛应用于急性脑中风的临床治疗，具有确切的药理活性。它是由传统动物药材水蛭和地龙组方而成的复方制剂。研究表明，水蛭素、蚓激酶作为主要成分具有显著的抗凝、抗炎、抗自由基作用，并能促进组织型纤溶酶原激活剂(TPA)的分泌。然而，目前对疏血通注射液中的活性成分的研究较少且定量方法尚不完善。此外，由于多肽成分含量低、结构复杂以及存在许多相似物的干扰，使得多肽药物的分析更加困难。近十年来，随着技术的发展，蛋白质组学和LC-MS/MS的应用迅速成为分离和鉴定蛋白复合物的重要组成部分。蛋白质组学为研究蛋白质/肽的特性、寻找药物设计的分子靶点提供了新的途径。但现有技术分析耗时长、成本高，仍然需要一种简单、灵敏、有效的方法来确定复合混合物中单体成分的活性。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种活性肽在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种活性肽，所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步，上述活性肽中，所述的活性肽由水蛭与地龙中提取出。

进一步，上述活性肽中，所述的活性肽通过分子对接技术筛选得到。分子对接旨在研究蛋白质与配体的相互作用，预测结合构象和结合亲和度，并找到最佳的配体结构。是一种高效、简便的方法来筛选含有数千种化合物的配体文库。

本发明还提供了一种活性肽的制备方法，所述的活性肽由水蛭与地龙中提取出，然后通过分子对接和分子动力学模拟技术筛选得到。

本发明还提供了一种活性肽组合物，所述的组合物包含所述的活性肽。

本发明还提供了一种重组载体，所述的载体包含编码所述的活性肽的核苷酸。

本发明还提供了一种重组细胞，所述的重组细胞包含编码所述的活性肽的核苷酸或所述的重组细胞包含所述的重组载体。

本发明还提供了一种治疗缺血性脑中风的药物，所述的药物包含权利要求1所述的活性肽。

本发明还提供了一种活性肽在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。

进一步，上述基于活性肽的应用中，所述的缺血性脑中风为由脑血管狭窄或闭塞导致脑血流阻断使脑组织发生缺血缺氧、软化或坏死使脑血管功能障碍引起的症状；所述的缺血性脑中风、脑血栓、脑栓塞、腔隙性缺血性脑中风、多发性缺血性脑中风或小中风中的一种。

本发明还提供了一种活性肽在增强细胞活性中的应用；所述的活性肽抑制LDH的释放。

本发明利用获得的蛋白质数据库匹配质谱数据检索，鉴定并定性定量分析出645种小肽。通过比较合成的标准肽，验证了多肽的鉴定结果。进一步筛选出三个与中风相关的蛋白：肾上腺素能受体2(ADRA2A)、蛋白酶激活受体4(PAR4)、多巴胺受体3(DRD3)和化合物进行分子对接，通过评分功能、相互作用等方法快速筛选出潜在的活性化合物。此外，还使用其他非计算机模拟方法重新筛选在实际环境中获得结合能力强的配体。体外细胞实验为上述研究结果提供了准确的验证。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明所述的活性肽从疏血通注射液中筛选出对缺血性脑中风损伤有保护作用的肽，为多组分中药的研究和多靶点药物的开发提供了新的方法。

本发明所述的活性肽的制备方法用于研究肽类成分的功能及其如何治疗中风提供了初步的理论基础。同时，利用计算机和生物工程技术对这些天然蛋白进行设计和分析，加快了多肽作为功能性药物的临床应用。

本发明挖掘疏血通中具有治疗缺血性脑中风的活性蛋白成分，阐明疏血通注射液中的药效物质基础，进一步为治疗神经性疾病的新药设计与研发提供新的思路。首先，将具有明确临床药理活性的中药复方疏血通注射液通过基因测序技术获得多肽类成分的蛋白质数据库，并采用nano HPLC-Q-EXATIVE-MS分析，鉴定小肽结构，进而建立疏血通注射液肽类成分LC-MS数据库，对疏血通注射液中的肽类成分进行定性定量分析；进而，通过分子对接技术进行快速高效的活性筛选，进一步筛选出活性肽，发现具有活性作用的新化合物YLKTT。本发明不仅为新化合物的发现提供了新的角度，而且为蛋白类靶向制剂的快速开发提供了新的范例。

附图说明

图1为本发明实施例1所述的活性肽的筛选技术路线图；

图2为本发明实施例1所述的原始数据过滤成分统计图；

图3为本发明实施例1所述的Clean reads为碱基含量分布图；

图4为本发明实施例1所述的Clean reads的碱基质量分布图。

图5为本发明实施例1所述的Unigene长度分布图；

图6为本发明实施例1所述的组装质量评估图；

图7为本发明实施例1所述的CDS长度分布图；

图8为本发明实施例2所述的疏血通注射液样品的BPC(基峰图)；

图9为本发明实施例2所述的TIC(总离子流图)；

图10为本发明实施例2所述的提取的9个标准肽的LC-MS鉴定图：A-I依次为标准肽TP-WW-1504、TP-WW-1505、TP-WW-1506、TP-WW-1507、TP-WW-1508、TP-WW-1509、TP-WW-1510、TP-WW-1511、TP-WW-1512和疏血通注射液样品对照EIC(离子流图)；

图11为本发明实施例3所述的化合物与ADRA2A对接结果图：11-A为肽与ADRA2A相互作用的三维结构，11-B为相互作用的二维结构；

图12为本发明实施例3所述的化合物与PAR4分子对接结果图：12-A为肽与PAR4相互作用的三维结构，12-B为相互作用的二维结构；

图13为本发明实施例3所述的化合物与DRD3分子对接结果图：13-A为肽与DRD3相互作用的三维结构，13-B为相互作用的二维结构；

图14为本发明实施例4所述的YLKTT活性肽的图：14-A为YLKTT结构式，14-B为YLKTT的细胞毒性，14-C为CCK-8测定YLKTT剂量范围；14-D为YLKTT对OGD/R损伤后C8-D1A细胞LDH漏出率。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明。

本发明使用BGISEQ-500平台检测13.75Gb数据。组装并去冗余后得61,082个Unigene，总长度、平均长度、N50以及GC含量分别为76,966,395bp、1,260bp、2,243bp和42.28％。然后将Unigene比对到七大功能数据库进行注释，最终分别有32,898(NR：53.86％)、11,022(NT：18.04％)、27,631(SwissProt：45.24％)、25,906(KOG：42.41％)、27,950(KEGG：45.76％)、18,282(GO：29.93％)以及27,987(Pfam：45.82％)个Unigene获得功能注释。使用Transdecoder检测出32,328个编码蛋白产物的序列CDS，进而通过开放阅读框翻译识别，构建地龙蛋白数据库，用于疏血通注射多肽成分LC-MS/MS匹配鉴定分析。

本发明采用LC-MS结合自建转录组数据库的方法快速鉴定疏血通注射液中的肽类成分，结果鉴定了645个小肽；通过合成部分标准品的方式，验证LC-MS鉴定结果的准确性，实验共合成了9个小肽，其中有5个出现在645个小肽列表中，均被检出，验证LC-MS鉴定结果的准确性。

通过分子对接的方法筛选与肾上腺素能受体2(ADRA2A)、蛋白酶激活受体4(PAR4)、多巴胺受体3(DRD3)(受体)结合的不同结构类型的多肽(配体)，以获得结合能力强的潜在活性成分。使用“CDOCKER”进行对接，实验证明，能量值越高，分子对接越稳定。根据对接结果，总结了前40个多肽的CDOCKER能量和能量。在此基础上，进一步从前40位中筛选出与这三种蛋白有共同交集的肽段，发现重复肽段序列分别为YLKTT、KRD、VELLQ、YRR、WKH、LLF、KRE、VEVL、VEMN、YSV、VRV、LEVL。

为了进一步验证筛选结果，利用CCK-8检测C8-D1A细胞存活率，评价药物对细胞活性的影响。当给予10、50、100、150、200、300μmol/L不同浓度的多肽时，只有YLKTT(分子量为624.74)能显著提高细胞活性。然而，当浓度达到300μg/mL时，YLKTT的细胞活性被抑制，实验表明YLKTT可以显著提高OGD/R组的细胞存活率，保护损伤细胞。

LDH是一种存在于细胞质中的酶。当细胞被破坏时，LDH被释放到培养基中。它能催化乳酸生成丙酮酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。水溶性四唑盐(WST，无色)可被NADH还原为甲瓒产物(橙色)。细胞损伤程度可以通过LDH的泄漏量来反映。OGD/R处理后，LDH释放明显增加，细胞活力下降。50-250μmol/L YLKTT完全抑制了LDH的释放，增强了细胞活力。这再次表明，YLKTT显著增强了细胞活性，保护C8-D1A细胞免受OGD/R的影响。

实例1活性肽成分蛋白数据库的建立

1.组织样品破碎裂解

取适量地龙、水蛭组织样品于对应编号研磨破碎管中，加入1.5mL TRIzol裂解液，放入TissueLyser II研磨机中，研磨30s，取出静置5min，使组织细胞充分裂解。

2.样品抽提纯化

将研磨破碎后的组织样品离心，4℃，12000g离心5min。将上清转入加有300μL氯仿/异戊醇(24:1)的EP管中，颠倒剧烈震荡混匀；4℃，12000g离心8min，若中间层较厚，水相较浑浊，可用等上清体积氯仿/异戊醇(24:1)再抽提一次。将上清转入加有600μL异丙醇的离心管中，切勿吸到中间层(微量组织或微量细胞样品，沉淀时加入2μL 5mg/mL糖原辅助沉淀)，颠倒混匀置于-20℃冰箱静置2h以上。4℃，17500g离心25min，弃上清，用0.9mL 75％乙醇洗涤，上下颠倒悬浮沉淀，4℃17500g离心3min(视沉淀情况可用75％乙醇再洗涤一次，4℃17500g离心3min)。弃上清，短暂离心后吸去残留液体，晾干3-5min。用30-200μL DEPC水溶解RNA沉淀，必要时可于55-60℃下孵育10min助溶。

3.DNaseI消化

取一定量TotalRNA样品，配制反应体系并适温反应一定时间，消化样品中存在的DNA污染。

4.mRNA分离合成

取消化的TotalRNA样品，适温变性打开其二级结构，使用oligo(dT)磁珠富集mRNA。在得到的mRNA中加入打断试剂，适温反应一定时间，将mRNA片段化。向打断后的mRNA中加入随机引物，充分混匀适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA，配制二链合成反应体系，适温反应一定时间，合成二链cDNA。

5.末端修复和接头连接

配制反应体系，适温反应一定时间，修复双链cDNA末端，并在3’末端加上A碱基，配制接头连接反应体系，适温反应一定时间，使接头与cDNA连接。

6.PCR反应及产物回收

配制PCR反应体系，并设置反应程序，对连接产物进行扩增。

7.PCR产物环化

将PCR产物变性为单链后，配制环化反应体系，充分混匀适温反应一定时间，得到单链环形产物，消化掉未被环化的线性DNA分子后，即得到最终的文库。

8.文库检测

使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent DNA 1000 Reagents)检测文库的片段大小及浓度。

9.上机测序

单链环状DNA分子通过滚环复制，形成一个包含200多个拷贝的DNA纳米球(DNB)。将得到的DNBs采用高密度DNA纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内。通过边合成边测序的方法，得到50bp/100bp的测序读长。

10.实验结果

本研究使用过滤软件SOAPnuke(华大基因，中国深圳)进行统计，使用trimmomatic进行过滤。在这一步中，通过去除原始数据中包含adapter的reads、包含N base的reads和低质量的reads，得到clean数据(如图2-4所示)，同时计算clean数据中的Q20、Q30和GC含量，具体见表1。

表1 Q20、Q30和GC的含量

用Bowtie2将Clean reads与内参基因序列进行比较，用RSEM计算基因和转录本的表达水平如表2所示。

表2基因和转录本的表达水平

本实施例使用BGISEQ-500平台共测试了13.75Gb的数据。然后Tgicl用于集群记录获得Unigene如表3与图5所示。

表3 Unigene结果

七个功能数据库注释如表4所示。

表4数据库注释

Values

Total

NR

NT

Swissprot

KEGG

KOG

Pfam

GO

Intersection

Overall

Number

61,082

32,898

11,022

27,631

27,950

25,906

27,987

18,282

4,557

37,472

Percentage

100％

53.86％

18.04％

45.24％

45.76％

42.41％

45.82％

29.93％

7.46％

61.35％

在某种程度上，转录组装配的完整性证明了使用车身装配的质量评估记录如图6所示。通过Transdecoder检测3228个序列CDS编码的蛋白产物如表5与图7所示。

表5蛋白产物

最后通过开放阅读框翻译和识别建立蛋白质数据库，进一步鉴定和分析SXT中的多肽成分。

实施例2活性肽成分的LC-MS分析

甲醇(色谱级)和乙腈(色谱级)购自德国Sigma有限公司。蒸馏水购自屈臣氏有限公司。甲酸购自美国TEDIA有限公司。疏血通注射液由牡丹江优博有限责任公司提供。上海淘普生物技术有限公司合成了9个多肽，纯度≥99％。

1.样品和标准溶液的制备

取疏血通注射液2mL加入C18脱盐柱进行脱盐，对上述馏分进行重组和离心，用20μL的溶剂混合(甲酸-甲醇-水，0.1:2:1％)分离脱盐和冻干后的馏分，离心，将上清液(10μL)转移到自动进样瓶中进行LC-MS分析。

将9种合成肽标准品TPWW-1504(0.95mg)、TPWW-1505(0.82mg)、TPWW-1506(0.98mg)、TPWW-1507(0.9mg)、TPWW-1508(0.82mg)、TPWW-1509(0.76mg)、TPWW-1510(0.84mg)、TPWW-1511(0.8mg)、TPWW-1512(0.84mg)，分别制备为最终浓度为1g/mL的标品备用。

2.Nano HPLC条件

分析在Thermo Scientific EASY-nLC 1000系统上进行的。用EASY-Spray柱(12cm×150μm,C18,1.9μm)进行色谱。洗脱液为水(甲酸0.1％，v/v)(A)和乙腈(甲酸0.1％，v/v)(B)，梯度为95-90％A,5-10％B(0-16min)；90-78％A,10-22％B(16-51min)；78-70％A,22-30％B(51-71min)；70-5％A,30-95％B(71-72min)；5-5％A,95-95％B(72-78min).

3.UHPLC方法

样品采用UHPLC(ultimate3000)联合Q-Exative MS(Thermo)检测。梯度方案为:0-15min,97-30％A,3-70％B；15-17min,30-0％A,70-100％B；17-17.1min,0-97％A,100-3％B；17.1-20min,97-97％A,3-3％B.

4.MS方法

4.1 SXT注射液中多肽的鉴定

SXT注入的质谱数据是在Q Exactive^TM混合四极轨道质谱仪(Thermo FisherScientific,San Jose,CA,USA)上获得的。HESI源参数设置为：喷雾电压-3.0kV/+3.5kV；护套气体压力为35arb；辅助气体压力：10arb；尾气压力，0arb；毛细管温度：350℃；辅助气体加热器温度，350℃。在正离子模式下采用全MS/dd-MS2(TopN)扫描方法。通用参数：运行时间：0-78min；极性：正离子；源内诱导电压：0ev；缺省电荷态：3。

一级质谱：微扫描：1；分辨率：70000，AGC target：3e5；Maximum IT：60ms；Numberof scan ranges：1；scan ranges：300-1400m/z；spectrum data type：profile。

二级质谱：微扫描：1；分辨率：17500，AGC target：5e4；Maximum IT：80ms；loopcount：20；MSX count：1；top N：20；isolation window：3.0m/z；isolation offset：0.0m/z；fixed first mass：100.0m/z；NCE/stepped NCE：27；spectrum data type：profile。

dd setting：underfill radio：1.0％；intensity threshold：6.3e3；apextrigger：-；charge exclusion：1，7，8，>8；peptide match：on；exclude isotopes：on；dynamic exclusion：18.0s。

合成肽标准品的HESI源参数设定为：正离子模式、FULL-MS/ddms2；Sheath gasflow rate：55；Aux gas flow rate：12；Sweep gas flow rate：2；Spray voltage(kv)：2.8；Capillary temp：320℃；S-lenRF level：50；Aux gas heater temp：250℃；Massrange：150-2250；

5.质谱数据分析

5.1数据库

数据库的选择是以所需物种、数据库注释完备性及序列可靠性为参考依据的。在选择数据库时，遵循如下原则，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库。

5.2原始质谱数据

质谱原始文件raw文件采用Maxquant进行查库鉴定及定量分析。

5.3搜库

Maxquat检索参数设置(无酶酶切)：

6.鉴定结果统计

采用上述方法，从疏血通注射液中共鉴定出645个小肽，如图8-9所示。并采取合成方式，验证鉴定结果准确性，随机选取9个小肽进行合成，采用LC-MS进行检测，验证“2”nanoLC-MS鉴定结果的准确性，进行选择离子监测(SIM)模式下的LC-MS分析，如图10所示。

实施例3分子对接

1.配体和受体的制备

采用LC-MS技术对SXT注射液中的645条肽段进行了初步分析。使用Discoverystudio(version 4.5.0)软件中的“Macromolecules”模块获得肽段的2D结构。复合物ADRA2A(PDB ID:6KUY)、PAR4(PDB ID:3QDZ)、DRD3(PDB ID:3PBL)的x射线晶体结构从RCSB蛋白数据库下载。

2.对接方法

通过比较构象与天然配体的最小均方根偏差(RMSD)值，判断对接方法及其参数的可行性和可靠性。RMSD值小于

表明该对接方法是可行有效的。但如果大于

则需要调整对接方式和设置参数。因此，所有肽都被连接到同一个活性位点，然后通过“CDOCKER”获得每个化合物的构象。除活性位点半径值和RMSD值外，所有计算均使用标准默认设置。与目标蛋白具有高于阈值的-CDOCKER ENERGY和-INTERACTION CDOCKER ENERGY的肽段被认为是活性化合物。

3.实验结果

分子对接是一种利用配体(药物)与受体(蛋白质)结合来筛选潜在活性成分的计算机程序。为此，通过分子对接的方法筛选与GPCRs结合的不同结构类型的多肽，以获得结合能力强的潜在活性成分。从对接结果来看，疏血通注射液645个活性化合物与目标蛋白对接，发现169个肽与PDB 6KUY成功对接，并产生了精准构象1646个，如图11所示。191个肽段与PDB 3QDZ成功对接，并产生了精准构象1893个，如图12所示。我们发现205个肽与PDB3PBL成功对接，并产生了精准构象1982个，如图13所示。实验证明，能量值越高，分子对接越稳定。根据对接结果，筛选了前40个多肽的-CDOCKER ENERGY和-INTERACTION CDOCKERENERGY值，得到12个肽。

实施例4体外细胞分析

1.缺糖缺氧再灌注(OGD/R)模型的建立

正常细胞培养：取生长对数期的小鼠星形胶质细胞C8-D1A细胞

以6×10³个/孔铺于96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂和95％O₂条件下培养。OGD/R：C8-D1A细胞如上操作铺板后，用无糖培养基在无氧培养箱(95％N₂,5％CO₂)中培养6h，弃去无糖培养基后正常培养(完全培养基)12h。空白对照组除不加细胞外，其余操作同正常组。

2.细胞活力测定

C8-D1A细胞经OGD刺激6h后，加入配制好含有不用浓度多肽的完全培养基，并在正常环境处理12h。利用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)。细胞存活率＝[(实验孔-空白孔)/(正常孔-空白孔)]×100％

3.肽的活性评价

3.1 CCK-8实验

检测方法是按照制造商的说明书进行(Dojindo，日本)。在本实验中，首先利用C8-D1A细胞对小肽的安全性进行了评价，结果显示，在OGD/R组与正常组相比，细胞活力下降几乎是正常组的1/2倍。给药组与OGD/R组相比，依次加入10、50、100、150、200、300μmol/L不同浓度的14个肽，只有YLKTT(分子量为624.74)能显著提高细胞活性。然而，当浓度为300μg/mL时，YLKTT的细胞活性被抑制如图14-C所示。

3.2 LDH释放试验

检测方法按照制造商的说明书进行操作(Dojindo，日本)。细胞损伤程度可以通过LDH的泄漏量来反映。OGD/R处理后，LDH释放明显增加，细胞活力下降。和CCK-8实验结果一致，当给药浓度为50-250μmol/L时，YLKTT完全抑制LDH的释放，使细胞活力增强如图14-D所示。这再次表明，YLKTT显著增强细胞活性，保护C8-D1A细胞免受OGD/R的损伤影响。

4.统计分析

使用GraphPad Prism 6.07统计学软件进行统计学分析，采用单因素方差分析进行组间比较，当P＜0.05是表示差异具有统计学意义，当P＜0.01时表示差异具有显著统计学意义。

七、权利要求的范围

鉴定并分析疏血通注射液中的645种肽类成分，成功鉴定并验证了其中YLKTT具有生物学活性，未曾见报道。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 天津中医药大学

<120> 一种活性肽在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用

<130> 2021.4.30

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Leu Lys Thr Thr

1 5

Claims

1.一种活性肽，其特征在于：所述活性肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种活性肽组合物，其特征在于：所述的组合物包含权利要求1所述的活性肽。

3.一种重组载体，其特征在于：所述的载体包含编码权利要求1所述的活性肽的核酸。

4.一种重组细胞，其特征在于：所述的重组细胞包含编码权利要求1所述的活性肽的核酸或所述的重组细胞包含权利要求3所述的重组载体。

5.一种治疗缺血性脑中风的药物，其特征在于：所述的药物包含权利要求1所述的活性肽。

6.权利要求1所述的活性肽在制备治疗缺血性脑中风药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的活性肽的应用，其特征在于：所述的缺血性脑中风为由脑血管狭窄或闭塞导致脑血流阻断使脑组织发生缺血缺氧、软化或坏死使脑血管功能障碍引起的症状；所述的缺血性脑中风为脑血栓、脑栓塞、腔隙性缺血性脑中风、多发性缺血性脑中风或小中风中的一种。

8.权利要求1所述的活性肽在增强C8-D1A细胞活性中的应用；所述的活性肽抑制LDH的释放。