CN112048000A

CN112048000A - 一种水牛角特征肽段及其检测方法

Info

Publication number: CN112048000A
Application number: CN202010923295.5A
Authority: CN
Inventors: 刘睿; 陈盛君; 段金廒
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine; Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine; Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: CN112048000B

Abstract

本发明公开了一种水牛角特征肽段，本发明通过大量实验筛选，筛选出Gly‑Pro‑Ser‑Leu‑Ala‑Gly‑Ser‑Ala‑Ser‑Ser‑Val‑Arg等4条水牛角特征肽，这4条水牛角特征肽具有很高的专属性，可用于鉴定含有水牛角药材的药品。本发明提供的水牛角特征肽及其检测方法，通过大量实验筛选出最佳的色谱条件和质谱条件，整个方法操作简单，判断准确，能准确区分水牛角特征肽。本发明提供的水牛角特征肽及其检测方法，有利于水牛角药品的质量控制，对保证含有水牛角药品的质量具有重要的意义。

Description

一种水牛角特征肽段及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种动物药的检测鉴别方法，具体涉及水牛角特征肽段及其检测方法。

背景技术

水牛角Bubali Cornu为牛科动物水牛Bubalus bubalis Linnaeus的角，始载于《名医别录》：“疗时气寒热头痛”，性味苦咸、寒，具清热、解毒、凉血、定惊之功效，是中医临床及中药制药行业的重要品种。现代研究表明水牛角具有良好的解热、镇静等功效，目前中医临床及中药制药行业以水牛角替代犀角应用于方剂及中成药：清营汤、犀角汤、犀角地黄汤等均以水牛角替代犀角，这些方剂在清热解毒、定惊凉血等方面均取得了较好的疗效。临床资料分析表明，水牛角替代犀角治疗乙脑、小儿夏季热、急性扁桃体炎等高热病证的效果明显。水牛角物质基础研究表明，蛋白质类、肽类、氨基酸类、甾醇类、核苷类、无机元素类等为其主要成分。水牛角质量标准并不完善，水牛角药材、浓缩粉、含水牛角的成方制剂缺少专属性鉴别、含量测定的方法，药材市场存在以其它角类或蹄甲混售的现象。有研究表明基于COI序列的DNA条形码技术可用于鉴别水牛角药材混伪品，但是中药高温提取过程会影响DNA的完整性，进而影响DNA条形码鉴定的准确性，相较于DNA分子，蛋白质、肽类成分的一级序列信息在高温提取条件下保存较好，I型角蛋白(Keratin,type I)、II型角蛋白(Keratin,type II)、I型胶原(Type I Collagen)等蛋白质类成分为水牛角、羚羊角、山羊角等角类动物药重要物质基础。本发明通过检测4个水牛角特征肽来检测水牛角成分，该方法为水牛角质量研究提供了参考与依据，有利于水牛角及其制品质量标准进一步完善。

发明内容

本发明主要目的是针对上述存在的问题与不足，提供一种水牛角特征肽及检测角类动物药中水牛角特征肽的方法。本发明提供的水牛角特征肽专属性强。提供的方法操作简单，灵敏度高，能准确鉴定角类动物药中是否含有水牛角成分，为保证水牛角及其制品的质量提供科学方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种水牛角特征肽段，所述的特征肽序列如序列表1：

肽1：Gly-Pro-Ser-Leu-Ala-Gly-Ser-Ala-Ser-Ser-Val-Arg

肽2：Gly-Gly-Val-Thr-Cys-Gly-Gly-Leu-Thr-Tyr-Ser-Thr-Thr-Ala-Gly-Arg

肽3：Ile-Cys-Glu-Gly-Val-Gly-Pro-Val-Asp-Ile-Ala-Val-Ser-Ser-Ser-Arg

肽4：Leu-Val-Asn-Glu-Leu-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys。

一种水牛角特征肽的检测方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的4个水牛角特征肽配成混合对照品溶液；

(2)将待检测角类动物药样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)水牛角特征肽混合对照品溶液注入液质联用仪，以水牛角特征肽为对照，采用多反应监测模式，选择的母离子包括：m/z 544.8(双电荷)、m/z 519.9(三电荷)、m/z 549.3(三电荷)及m/z582.3(双电荷)，进行检测；如果检测出上述离子对中任意2个及以上，且离子的保留时间与水牛角特征肽对照品一致，其子离子与对照品的子离子一致，则所述待检测样品中含有水牛角成分。

作为优选方案，以上所述的水牛角特征肽的检测方法，所述的酶切方法如下进行：取待检测角类动物药样品20mg，加入1ml蛋白裂解液，至于水浴过夜，离心，取上清液，加入5IAA溶液，避光放置，加入冷丙酮溶液，充分混匀后，冷藏，沉淀过夜；

取丙酮沉淀样品离心后，弃去上清，用冷丙酮洗涤沉淀两次，挥干沉淀，加入尿素溶液复溶，充分振摇，待沉淀完全溶解后加入Tris-HCl缓冲液，在各个角类样品中分别加入胰蛋白酶，恒温水浴孵育，即得。

作为优选方案，以上所述的水牛角特征肽的检测方法，所述的酶切方法如下进行：取待检测角类动物药样品20mg，加入1ml蛋白裂解液，蛋白裂解液包括4％SDS，20mM DTT，50mM Tris-HCl，pH＝8.8)；然后至于65℃水浴过夜，10000rpm离心20min，取上清液200μl，加入50μl 0.2M IAA溶液，避光放置30min，加入1ml 80％冷丙酮溶液，充分混匀后至于-20℃冷冻沉淀过夜；

取丙酮沉淀样品，经过10000rpm离心20min后，弃去上清，用80％冷丙酮洗涤沉淀两次，挥干沉淀，加入200μl 8M尿素溶液复溶，充分振摇，待沉淀完全溶解后加入1400μlTris-HCl缓冲液，使尿素浓度降至1M以下，在各个角类样品中分别加入0.1μg/μl的胰蛋白酶30μl，37℃恒温水浴孵育12h，即得。

作为优选方案，以上所述的水牛角特征肽的检测方法，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm×100mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸，0～8min，5～20％A线性梯度洗脱，8～12min，20～50％B线性梯度洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，MRM模式的离子对为：m/z 544.8(双电荷)/663.5、m/z 519.9(三电荷)/592.3、m/z 549.3(三电荷)/606.1及m/z 582.3(双电荷)/951.5。

作为优选方案，以上所述的水牛角特征肽的检测方法，其特征在于，角类动物药包括水牛角、山羊角、绵羊角、黄羊角、猪蹄甲、羊蹄甲等。

有益效果：本发明通过大量实验筛选，筛选出4条水牛角特征肽，这4条水牛角特征肽具有很高的专属性，可用于鉴定含有水牛角药材的药品。

本发明提供的水牛角特征肽及其检测方法，通过大量实验筛选出最佳的色谱条件和质谱条件。整个方法操作简单，判断准确，能准确区分水牛角特征肽。本发明提供的水牛角特征肽及其检测方法，有利于水牛角药品的质量控制，对保证含有水牛角药品的质量具有重要的意义。

附图说明

图1为水牛角4个特征肽的XIC图；

图2为4个特征肽的XIC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

一种水牛角特征肽段，所述的特征肽序列有4个，如序列表1：

肽1：Gly-Pro-Ser-Leu-Ala-Gly-Ser-Ala-Ser-Ser-Val-Arg

肽2：Gly-Gly-Val-Thr-Cys-Gly-Gly-Leu-Thr-Tyr-Ser-Thr-Thr-Ala-Gly-Arg

肽3：Ile-Cys-Glu-Gly-Val-Gly-Pro-Val-Asp-Ile-Ala-Val-Ser-Ser-Ser-Arg

肽4：Leu-Val-Asn-Glu-Leu-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys。

实施例2各种角质类动物药中特征多肽的检测

(1)取水牛角、山羊角、猪蹄甲、羊蹄甲样品各20mg，分别加入1ml蛋白裂解液[4％SDS，20mM DTT，50mM Tris-HCl(pH＝8.8)]，至于65℃水浴过夜，10000rpm离心20min，取上清液200μl，然后分别加入50μl 0.2M IAA溶液，避光放置30min，加入1ml 80％冷丙酮溶液，充分混匀后至于-20℃沉淀过夜。

(2)分别取步骤(1)丙酮沉淀样品，10000rpm离心20min后，弃去上清，用80％冷丙酮洗涤沉淀两次，挥干沉淀，加入200μl 8M尿素溶液复溶，充分振摇，待沉淀完全溶解后加入1400μl Tris-HCl缓冲液，使尿素浓度降至1M以下，在各个角类样品中分别加入0.1μg/μl的胰蛋白酶30μl，37℃恒温水浴孵育12h，得到各角类酶解液。

(3)将实施例1所述的4个特征肽纯品配成200ng/ml浓度的混合对照品溶液1ml，加入5μl 0.2M IAA溶液，避光放置30min。

(4)将步骤(2)各角类酶解液与IAA处理过的4个特征肽混合对照品溶液，采用液质联用仪检测，液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱(2.1μm×100mm)，上样量为2μl，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～8min，5～20％A线性梯度洗脱，8～12min，20～50％B线性梯度洗脱。采用三重四极杆质谱，质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，MRM模式的离子对为：m/z 544.8(双电荷)/663.5、m/z 519.9(三电荷)/592.3、m/z549.3(三电荷)/606.1及m/z 582.3(双电荷)/951.5。

结果见图1(图中(A)为混合对照品；(B)为水牛角；(C)为山羊角；(D)为猪蹄甲；(E)为羊蹄甲)，水牛角样品中可检测出与4个特征肽混合对照品溶液一致的离子峰，其它样品中均没有检出，说明本发明能特异性的检测水牛角中的4个特征肽成分，从而与其它的角质类动物药进行区分。

实施例2水牛角配方颗粒特征多肽的检测

(1)取水牛角配方颗粒与山羊角提取物冻干粉样品各10mg，加入200μl 8M尿素溶液复溶，充分振摇，待沉淀完全溶解后加入1400μl Tris-HCl缓冲液，使尿素浓度降至1M以下，在二个样品中分别加入0.1μg/μl的胰蛋白酶30μl，37℃恒温水浴孵育12h。

(2)将实施例1所述的4个特征肽纯品配成200ng/ml浓度的混合对照品溶液1ml，加入5μl 0.2M IAA溶液，避光放置30min。

(3)将步骤(1)水牛角配方颗粒与山羊角提取物的酶解液与步骤(2)IAA处理过的混合对照品溶液采用液质联用仪检测，液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱(2.1μm×100mm)，上样量为2μl，流速0.3ml/min，流动相A(乙腈)，流动相B(0.1％甲酸)，0～8min，5～20％A线性梯度洗脱，8～12min，20～50％B线性梯度洗脱。采用三重四极杆质谱，质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，MRM模式的离子对为：m/z 544.8(双电荷)/663.5、m/z519.9(三电荷)/592.3、m/z 549.3(三电荷)/606.1及m/z 582.3(双电荷)/951.5。

结果见图2(图中(A)为混合对照品；(B)为水牛角配方颗粒；(C)为山羊角提取物)，水牛角配方颗粒样品中检测出m/z 519.9(三电荷)/592.3与m/z 582.3(双电荷)/951.5的离子对，与混合对照品溶液一致的离子峰，山羊角提取物样品中未检出，表明该方法也能用于检测与鉴别水牛角水提液或配方颗粒等提取物，与其他的角质类动物药的提取物进行区分。

以上所述的水牛角配方颗粒的制备工方法为：水牛角镑片，加20倍量水，煎煮提取2次，每次6小时，浓缩，加辅料制粒，干燥而得。

山羊角提取物制备方法为：山羊角镑片，加20倍量水，煎煮提取2次，每次6小时，浓缩，冷冻干燥。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江阴天江药业有限公司

南京中医药大学

<120> 一种水牛角特征肽段及其检测方法

<141> 2020-09-04

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Pro Ser Leu Ala Gly Ser Ala Ser Ser Val Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Gly Val Thr Cys Gly Gly Leu Thr Tyr Ser Thr Thr Ala Gly Arg

1 5 10 15

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Cys Glu Gly Val Gly Pro Val Asp Ile Ala Val Ser Ser Ser Arg

1 5 10 15

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys

1 5 10

Claims

1.一种水牛角特征肽段，其特征在于，所述的特征肽为：

肽1：Gly-Pro-Ser-Leu-Ala-Gly-Ser-Ala-Ser-Ser-Val-Arg

肽2：Gly-Gly-Val-Thr-Cys-Gly-Gly-Leu-Thr-Tyr-Ser-Thr-Thr-Ala-Gly-Arg

肽3：Ile-Cys-Glu-Gly-Val-Gly-Pro-Val-Asp-Ile-Ala-Val-Ser-Ser-Ser-Arg

肽4：Leu-Val-Asn-Glu-Leu-Thr-Glu-Phe-Ala-Lys。

2.一种水牛角特征肽的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将待检测角类动物药样品，用胰蛋白酶进行酶切后，将酶解液和步骤(1)水牛角特征肽混合对照品溶液注入液质联用仪，以水牛角特征肽为对照，采用多反应监测模式，选择的母离子包括：m/z 544.8(双电荷)、m/z 519.9(三电荷)、m/z 549.3(三电荷)及m/z 582.3(双电荷)，进行检测；如果检测出上述离子对中任意2个及以上，且离子的保留时间与水牛角特征肽对照品一致，其子离子与对照品的子离子一致，则所述待检测样品中含有水牛角成分。

3.根据权利要求2所述的水牛角特征肽的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法如下进行：取待检测角类动物药样品20mg，加入1ml蛋白裂解液，至于水浴过夜，离心，取上清液，加入5IAA溶液，避光放置，加入冷丙酮溶液，充分混匀后，冷藏，沉淀过夜；

4.根据权利要求3所述的水牛角特征肽的检测方法，其特征在于，所述的酶切方法如下进行：取待检测角类动物药样品20mg，加入1ml蛋白裂解液，蛋白裂解液包括4％SDS，20mMDTT，50mM Tris-HCl，pH＝8.8)；然后至于65℃水浴过夜，10000rpm离心20min，取上清液200μl，加入50μl 0.2M IAA溶液，避光放置30min，加入1ml 80％冷丙酮溶液，充分混匀后至于-20℃冷冻沉淀过夜；

取丙酮沉淀样品，经过10000rpm离心20min后，弃去上清，用80％冷丙酮洗涤沉淀两次，挥干沉淀，加入200μl 8M尿素溶液复溶，充分振摇，待沉淀完全溶解后加入1400μl Tris-HCl缓冲液，使尿素浓度降至1M以下，在各个角类样品中分别加入0.1μg/μl的胰蛋白酶30μl，37℃恒温水浴孵育12h，即得。

5.根据权利要求3所述的水牛角特征肽的检测方法，其特征在于，液质联用仪检测的液相条件为：色谱柱为1.7μm Waters C18柱，规格为2.1μm×100mm，上样量为2μl，流速0.3ml/min，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸，0～8min，5～20％A线性梯度洗脱，8～12min，20～50％B线性梯度洗脱；采用三重四极杆质谱，质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)，MRM模式的离子对为：m/z 544.8(双电荷)/663.5、m/z 519.9(三电荷)/592.3、m/z 549.3(三电荷)/606.1及m/z 582.3(双电荷)/951.5。

6.根据权利要求2所述的水牛角特征肽的检测方法，其特征在于，角类动物药包括水牛角、山羊角、绵羊角、黄羊角、猪蹄甲、羊蹄甲。