NO170430B - Fremgangsmaate for fremstilling av et protein som har antikoagulerende og anti-metastatiske egenskaper - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av et protein som har antikoagulerende og anti-metastatiske egenskaper Download PDFInfo
- Publication number
- NO170430B NO170430B NO873859A NO873859A NO170430B NO 170430 B NO170430 B NO 170430B NO 873859 A NO873859 A NO 873859A NO 873859 A NO873859 A NO 873859A NO 170430 B NO170430 B NO 170430B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- fractions
- protein
- fraction
- adsorbed
- antistasin
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 title claims description 7
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 title claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 101710163968 Antistasin Proteins 0.000 claims description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 13
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 claims description 12
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 claims description 8
- 241000237664 Haementeria officinalis Species 0.000 claims description 7
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 5
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 2
- 238000002943 spectrophotometric absorbance Methods 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 8
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 4
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 4
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090001015 cancer procoagulant Proteins 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 238000007819 clotting time assay Methods 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/14—Angiotensins: Related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Forelliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et biokjemisk rent protein, som har anti-koagulerende og anti-metastatiske egenskaper.
Som beskrevet i US-PS 4 588 587 har spyttet fra blodsugende dyr, såsom igler, anti-koagulerende aktivitet. Som også omtalt i det ovenfor nevnte patentet viser et ekstrakt fra spyttkjertlene fra visse igler også anti-metastatiske virkninger. Det har vært antatt at disse virkningene kan oppstå ved en unik og kompleks kombinasjon av anti-koaguler-ingsmidler og/eller proteaseinhibitorer og/eller andre bestanddeler av ekstraktet som virker synergistisk.
Den teoretiske mekansimen hvorved metastasen finner sted antas å innbefatte flere trinn, såsom inntreden av tumorceller i organismens sirkulasjonssystem (intravasculering); transport av disse med blodstrømmen; vekselvirkning mellom sirkulerende ondartede celler med plater og plasma-koaguler-ingsfaktorer med aktivering av det hemostatiske systemet; vekselvirkning mellom de nevnte cellene og andre vertsceller enn plater; stopping av tumorceller, omgitt av plateaggrega-ter og hybrinklumper inne i kapillærrørene; proteolytisk angrep på blodkarveggen, spesielt dens nedre membran, ved tumorenzymer, unnslippelse fra sirkuleringssystemet (ekstra-vasculering); og dannelse- av sekundære tumorer eller koloni-er .
Viktig for denne mekanismen er evnen av den sirkulerende tumorcellen til å initiere dannelsen av en blodklump som tjener til å stenge cellen i et kapillarrør. Falanga, et al ( Biochemistrv 24:5558-5567, 1985) isolerte og karakteriserte et spesielt kreft-prokoaguleringsmiddel som ble vist å initiere koagulering ved aktivering av faktor X. I tillegg har andre forskere som er sitert i den nevnte referansen isolert kreft-prokoaguleringsmidler som direkte aktiverer faktor X. Endelig angir en av oppfinnerens tidligere publikasjoner (Cancer Metastasis Eeviews 3, 99-116 (1984)) en oppsummering av forskningen innenfor aktiveringen av koagu-leringssystemet ved tumorceller, hvor den eventuelle innbe-fatningen av faktor X også omtales.
Foreliggende oppfinnelse innbefatter en fremgangsmåte for fremstilling av et nyisolert, biokjemisk rent protein (eller proteiner) som har anti-metastatiske og anti-koagulerende egenskaper. Dette proteinet er avledet fra spyttkjertelen fra en igle, nærmere bestemt fra den meksikanske iglen Haementeria officinalis. Proteinet, betegnet antistasin, antas å inhibere koagulering av blod ved inhibering av koaguleringsfaktor Xa, men ikke trombin.
Antistasin isoleres fra et ekstrakt av spyttkjertler fra igler, spesielt fra meksikansk igle Haementeria officinalis. ved heparin-affinitetskromatografi etterfulgt av anionveksl-ingskromatografi. Det isolerte antistasinet har en molekylvekt på ca. 17.000 under ikke-denaturerende betingelser. Proteinet har et isoelektrisk punkt på ca. 9,5 og meget aktivt som en inhibitor for koagulering ved in vitro analyse. Videre er det vist at ekstraktet er nyttig for inhibering av metastase i in vivo forsøk ved anvendelse av mus.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at det fremstilles et protein betegnet antistasin avledet fra spyttkjertelen- av iglen Haementeria officinalis. med anti-metastatiske og anti-koagulerende egenskaper, hvor det resulterende proteinet har en molekylvekt på ca. 17.000 og et isoelektrisk punkt på 9,5, som innbefatter trinnene: a) dissekering og fjernelse av spyttkjertelvev fra iglen; b) homogenisering og oppløseliggjørelse av nevnte spyttkjertelvev i en vandig oppløsning innbefattende et bufret
salt som har en fastsatt pH på 7,8 slik at det dannes et
homogenat; og
c) sentrifugering av homogenatet slik at det dannes super-natantproteinsuspensjonsfraksjoner, og analysering av
nevnte supernatantfraksjoner, og seleksjon av en produkt-
fraksjon som er kjennetegnet ved inhibering av koagu-ler ingsfaktor Xa, nevnte supernatantfraksjon separeres ved
en kraft på minst lOO.OOOg i et tidsrom på minst 1 time, som er kjennetegnet vved at supernatantfraksjonen behandles videre ved hjelp av trinnene d) plassering av nevnte supernatantfraksjon i kontakt med en kolonne av heparinagarose brakt til likevekt med tris-buffer, pH 8,7; e) separering av fraksjoner inneholdende proteiner som ikke er adsorbert på nevnte kolonne fra fraksjoner inneholdende
proteiner som er adsorbert på kolonnen; og
f) seleksjon fra nevnte adsorberte fraksjoner av et protein som har anti-koagulerende egenskaper; og g) eluering av en første del av nevnte adsorberte fraksjoner ved anvendelse av en bufret saltoppløsning inntil spektro-fotometrisk absorbans ved 280nm ikke lenger detekteres; h) eluering av en andre del av nevnte adsorberte fraksjoner ved anvendelse av en gradient elueringsvæske innbefattende
20mM tris-buffer og IM NaCl i tris-buffer; og undersøkelse av de eluerte fraksjonene for å identifisere en eluat-fraksjon som har anti-koagulerende aktivitet; og
i) konsentrering av nevnte eluatfraksjoner som har anti-koagulerende aktivitet ved sentrifugering gjennom ultra-filteret som har molekylvekt-utelukkelsesgrenser på ca.
12.000;
j) avsalting av den konsentrerte eluatfraksjonen;
k) adsorbsjon av den avsaltede, konsentrerte eluatfraksjonen.
på en mono-Q anionvekslingskolonne; og
1) eluering av den adsoberte fraksjonen med NaCl-trinn-gradient i området på 0,10-0,30M i tris-bufferoppløsning.
Figurene 1, 2 og 3 er kurver som viser absorbsjonsspekteret, ved 210 nm, for fraksjoner eluert fra en høytrykks væskekro-matografisk kolonne, som beskrevet i detalj i beskrivelsen. Tall angitt nær toppene i figuren indikerer retensjonstid uttrykt i 10~<2> minutter.
Antistasin er et biokjemisk rent protein, eller proteiner, som er separert fra et spyttkjertelekstrakt fra igle ved kromatografi og seleksjon av kromatografisk fraksjon som har anti-koagulerende aktivitet. Produktet antistasin er kjennetegnet ved en selektiv evne til å inaktivere faktor Xa, men ikke trombin.
Antistasin renses til to forskjellige trinn, trinn 1 som har delvis renhet, og trinn 2 med tilsynelatende homogenitet.
Innledende data vedrørende sekvensering av proteolytiske nedbrytninger av det tilsynelatende homogene preparat (Trinn 2) antyder muligheten av naturlige homologer av antistasin. Foreliggende oppfinnelse omfatter alle slike homologer, forutsatt at hver enkelt har inhiberingsaktivitet mot faktor Xa.
Det skal understrekes at andre varianter fremstilt ved foreliggende fremgangsmåte av antistasinene er innbefattet, spesielt eventuelle varianter som adskiller seg fra de isolerte antistasinene bare ved konservativ aminosyre konstitusjon. Alle slike konservative aminosyre substitusjoner er definert som "serier" i Tabell 1 av Taylor, R.W., J. Mol. Biol. 188. 233 (1986). Antistasin eller fragmenter derav i forbindelse med fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter alle slike variasjoner i aminosyre-sekvens, enten ved konservativ aminosyre substitusjon, utelatelse, eller annen prosess, forutsatt at antistasinet etter rensing er immunokjemisk reaktivt med antistoffer spesifikke for antistasin isolert av den meksikanske iglen, Haementeria officinalis.
Nedenfor følger et eksempel på denne separasjons og selek-sjonsfremgangsmåten fremgangsmåten ved det første rensetrinn.
Fremgangsmåte for fremstilling av antistasin (Trinn 1)
Et ekstrakt fra spyttkjertelen av den meksikanske iglen prepareres først ved ekstraksjon av de diserkerte fremre og bakre spyttkjertlene ved 4°C ved ultralydbehandling i en buffer av 20 mM HEPES (4-(2-hydroksyetyl)-l-piperazin etan sulfonsyre), pH 7,8 inneholdende 10 mM CaCl2- Det ultralyd-behandlede materialet sentrifugeres ved 8500 x g i 20 minutter og supernatantene samles og sentrifugeres ved 100 000 gil time. Den resulterende supernatantproteinsus-pensjonen nedfryses ved -70"C inntil den skal benyttes. Antistasinet renses fra ekstraktet av spyttkjertelen ved en totrinnskromatografisk fremgangsmåte ved anvendelse av forlengelsen av protrombintiden som en indikasjon for nærværet av antikoagulerende/antimetastatisk aktivitet.
Ekstraktet av spyttkjertelen plasseres først på en heparin-agarosekolonne brakt til likevekt med 20 mM tris-HCl, pE 8,7. Belegging, vasking og eluering av heparin-agarosekolonnen lettes ved anvendelse av en gradient markør og væskekromato-grafikontrollinnretning. Proteintopper som elueres fra kolonnen overvåkes ved hjelp av et UV-overvåkningssystem. Proteinene som ikke viser vedheng til kolonnen, og de som elueres ved vasking med tris-buffer inntil ingen ytterligere adsorbans- ved 280 nm er observerbar, kastes. Den vaskede kolonnen elueres deretter ved en kombinasjon av lineære og trinngradienter ved anvendelse av tris-buffer og tris-buffer inneholdende 1 M NaCl. Når proteintopper begynner å. elueres, holdes gradienten manuelt og proteiner får eluere fra kolonnen under isokratiske betingelser. Etter at hver proteintopp er eluert, startes gradienten på nytt.
Kolonnefraksjonene som inneholder anti-koagulerende aktivitet, bestemt ved hjelp av analyse for antikoagulerende aktivitet, samlet deretter, konsentreres ved sentrifugering gjennom ultrafiltreringsfiltere som har molekylvekt-utelukkelsesgrenser på 12 000, avsaltes på små kolonner av "G-25 Sephadex" og påføres på en mono-0-kolonne brakt til likevekt med tris-buffer. Mono-Q-kolonnen vaskes deretter og elueres ved en fremgangsmåte svarende til den for heparin-agarosekolonnen, slik at det oppnås antistasin (trinn 1).
Det delvis rensede proteinet avledet på denne måten konsentreres til 1 mg/ml og lagres nedfrosset ved -70°C i tris-buffer. Ytterligere rensing og analyse til renhet ifølge trinn 2 er beskrevet i eksemplet, figurene 1-3 og tabell 5.
Molekylvekten av antistasinet er estimert ved gelfiltrering på en hurtig proteinvæskekromatograf og ved- SDS-gelelektro-forese. Disse analysene indikerte en molekylvekt på 17 000.
Det isoelektriske punktet for antistasin ble målt ved kromatofokusering på en mono-P-kolonne ved anvendelse av hurtig proteinvæskekromatografi. Denne fremgangsmåten ga en pl på 9,5 for materialet.
Aminosyreanalyse av det delvis rensede antistasinet (trinn 1) ble gjennomført på en "Glenco MM-70" aminosyreanalysator. Antistasinmaterialet ble hydrolysert med 6 N HC1 i 24 timer. Den resulterendeaminosyresammensetningen er angitt som tabell 1. Noe annerledes resultater oppnås med større tilsynelatende proteinrenhet, se tabell 5. En annen analyse av det trinn 1 rensede produktet indikerte et noe annet aminosyreinnhold, som vist i tabell IA. Dette kan indikere mulig nærvær av noe andre former av antistasin i produktet fra trinn 1 eller forurensninger eller derivater derav.
Inhibering av eksperimentelt indusert metastase ble bestemt ved å injisere antistasin eller en bufferkontroll to timer før injeksjon av 10^ T241 tumorceller etterfulgt av innoku-lering av tilsvarende mengder antistasin, henholdsvis 2 og 4 timer etter injeksjonen av tumorcellene.
Etter 14-19 dager ble dyrene avlivet og lungetumorkolonier ble telt. Resultatene er angitt i tabell 2.
Ett-trinns koaguleringsanalyser for måling av virkningen av antistasin på protrombintiden, aktivert partiell tromboplastintid, trombintid, og faktor X-analyse ble utført ved 37°C i et endelig volum på 0,3 ml ved hjelp av et fibrometer. For bestemmelsen av virkningen av antistasin på protrombintiden, ble 100 pl av en saltvannsfortynning av protein etterfulgt av 100 pl tromboplastinreagens inneholdende 0,025 M CaCl2 trinnvis tilsatt til 100 pl av normalt humant plasma og koaguleringstiden ble bestemt.
For måling av aktivert partiell tromboplastintid, ble-kao.lin-cefalinreagens inneholdende 0,025 M CaCl£ anvendt i stedet for tromboplastinreagensen.
For måling av virkningen av antistasin på trombintiden var substratoppløsningen enten 100 pl av normalt humant plasma eller en 100 pl oppløsning av en 1 mg/ml fibrinogen i HEPES-bufret saltvann og ble koagulert ved tilsats av 200 pl av en 0,30 enhet/ml HEPES-bufret saltvannsoppløsning av trombin inneholdende forskjellige mengder renset antistasin. For å maksimalisere virkningen på trombin, ble volumer på 10 pl av protein og trombin først inkubert sammen i 5 minutter ved 37°C før fortynning og tilsats til det normale humane plasmaet eller fibrinogenet.
For bestemmelse av virkningen av antistasin på faktor Xa-aktivitet, ble 100 pl av plasma med faktor X underskudd behandlet med 100 pl av 0,025 M CaCl2 etterfulgt av 100 pl renset faktor Xa eller 100 pl av renset faktor Xa inneholdende forskjellige mengder antistasin.
Resultatene fra de ovenfor omtalte analysene er gjengitt i
tabellene 3 og 4.
De gjennomførte analysene indikerer at antistasin er et protein som har en molekylvekt på ca. 17 000 i en enkeltkjede med et isoelektrisk punkt på 9,5. Antistasin er et potent antikoaguleringsmiddel for både human og museplasma. Som demonstrert i de forskjellige koaguleringstidanalysene, virker antistasin ved inhibering av faktor Xa reaksjonsveien, fremfor ved interferens ved trombin. Det er interessant at antikoaguleringsaktiviteten for antistasin synes mer uttalt in vitro enn in vivo. Imidlertid er mulig interferens ikke fullt ut undersøkt på det nåværende tidspunkt.
Eksempel
A. Rensing til trinn 2
Antistasin ble delvis renset ved fremgangsmåten ifølge Tuszynski, et al., J. Biol. Chem. 262. 9718-9723 (1987). Det delvis rensede materialet ble ytterligere renset ved anvendelse av revers fase EPLC på en acetonitril/vanngradient (se fig. 1). Faktor Xa-inhiberingsaktivitet kommer tilsyne utelukkende i topp II. Topp II inneholdt et antall protein-spesies og ble ytterligere renset ved revers-fase HPLC ved anvendelse av en isopropanol/vanngradient som vist i fig. 2. Den femte toppen (angitt med en stjerne) inneholdt den høyeste faktor Xa-inhiberingsaktiviteten. Dette materialet ble renset til tilsynelatende homogenitet som vist i fig. 3, ved hjelp av HPLC ved anvendelse av en acetonitril/vann-gradient, hvilket gir antistasin (trinn 2).
B. Strukturanalyse
Aminosyresammensetningen for antistasin (trinn 2) er vist i tabell 5. Antistasinmaterialet ble hydrolysert med 6 N HC1 i 24 timer og analysert på en "Beckman Amino Acid Analyzer".
Antistasin (trinn 2) ble underkastet aminosyresekvensanalyse i en "Applied Biosystems Gas Phase Sequencer". Det intakte proteinet ble blokkert ved dets aminoterminal hvilket gjør det resistent mot sekvensanalyse. Følgelig ble det redusert og karboksymetylert for å modifisere cysteinrester og endelig spaltet med det proteolytiske enzymet, V8-protease, som spalter ved glutaminsyrerester. Ca. 10 peptidfragmenter av antistasin (trinn 2) ble produsert ved denne spaltningsreak-sjonen og renset ved revers fase HPLC ved anvendelse av en acetonitril/vanngradlent. Aminosyresekvensen for ett av disse fragmentene er: PHE-CYS-LYS-CYS-ÅRG-LETJ-GLU-PRO-MET-LYS-ALÅ-THR-CYS-ASP-ILE-SER-GLU-CYS-PRO-GLTJ.
Liten forurensning med andre sekvenser ble funnet for dette spesielle fragmentet. Imidlertid var et ubekreftet resultat tilstedeværelsen, av homologe sekvenser i andre fragmenter, dvs. konservative substitusjoner annet steds i antistasin-sekvensen.
Claims (1)
- Fremgangsmåte for fremstilling av et protein betegnet antistasin avledet fra spyttkjertelen av iglen Haementeria officinalis. med anti-metastatiske og anti-koagulerende egenskaper, hvor det resulterende proteinet har en molekylvekt på ca. 17.000 og et isoelektrisk punkt på 9,5, som innbefatter trinnene: a) dissekering og fjernelse av spyttkjertelvev fra iglen; b) homogenisering og oppløseliggjørelse av nevnte spyttkjertelvev i en vandig oppløsning innbefattende et bufret salt som har en fastsatt pH på 7,8 slik at det dannes et homogenat; og c) sentrifugering av homogenatet slik at det dannes super-natantproteinsuspensjonsfraksjoner, og analysering av nevnte supernatantfraksjoner, og seleksjon av en produkt-fraksjon som er kjennetegnet ved inhibering av koaguleringsfaktor Xa, nevnte supernatantfraksjon separeres ved en kraft på minst lOO.OOOg i et tidsrom på minst 1 time, karakterisert ved at supernatantfraksjonen behandles videre ved hjelp av trinnene d) plassering av nevnte supernatantfraksjon i kontakt med en-kolonne av heparinagarose brakt til likevekt med tris-buffer , pE 8,7; e) separering av fraksjoner inneholdende proteiner som ikke er adsorbert på nevnte kolonne fra fraksjoner inneholdende proteiner som er adsorbert på kolonnen; og f) seleksjon fra nevnte adsorberte fraksjoner av et protein som har anti-koagulerende egenskaper; og g) eluering av en første del av nevnte adsorberte fraksjoner ved anvendelse av en bufret saltoppløsning inntil spektro-fotometrisk absorbans ved 280nm ikke lenger detekteres; h) eluering av en andre del av nevnte adsorberte fraksjoner ved anvendelse av en gradient elueringsvæske innbefattende 20mM tris-buffer og IM NaCl i tris-buffer; og undersøkelse av de eluerte fraksjonene for å identifisere en eluat-fraksjon som har anti-koagulerende aktivitet; og i) konsentrering av nevnte eluatfraksjoner som har anti-koagulerende aktivitet ved sentrifugering gjennom ultra-filteret som har molekylvekt-utelukkelsesgrenser på ca. 12.000; j) avsalting av den konsentrerte eluatfraksjonen; k) adsorbsjon av den avsaltede, konsentrerte eluatfraksjonen på en mono-Q anionvekslingskolonne; og 1) eluering av den adsoberte fraksjonen med NaCl-trinn-gradient i området på 0,10-0,30M i tris-bufferoppløsning.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US90858186A | 1986-09-18 | 1986-09-18 | |
US8843287A | 1987-08-26 | 1987-08-26 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO873859D0 NO873859D0 (no) | 1987-09-15 |
NO873859L NO873859L (no) | 1988-03-21 |
NO170430B true NO170430B (no) | 1992-07-06 |
NO170430C NO170430C (no) | 1992-10-14 |
Family
ID=26778655
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO873859A NO170430C (no) | 1986-09-18 | 1987-09-15 | Fremgangsmaate for fremstilling av et protein som har antikoagulerende og anti-metastatiske egenskaper |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0263608A3 (no) |
KR (1) | KR880003975A (no) |
AU (1) | AU615635B2 (no) |
DK (1) | DK489187A (no) |
FI (1) | FI874055A (no) |
IL (1) | IL83912A (no) |
NO (1) | NO170430C (no) |
NZ (1) | NZ221835A (no) |
PT (1) | PT85746B (no) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3819078A1 (de) * | 1988-06-04 | 1989-12-07 | Hoechst Ag | Amblyommin, ein neuer wirkstoff fuer die antikoagulationstherapie |
DE58907266T2 (de) * | 1988-06-11 | 1994-09-29 | Ciba Geigy Ag | Polypeptide mit einer die Koagulierung hemmenden Wirkung. |
US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
US4832849A (en) * | 1988-06-16 | 1989-05-23 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii |
KR0185973B1 (ko) * | 1989-06-20 | 1999-05-01 | 게리 디. 스트리트 | 남미의 거머리인 헤멘테리아 길리아니로부터의 항전이 물질 길란텐 |
US5648461A (en) * | 1990-02-22 | 1997-07-15 | W.R. Grace & Co.-Conn | Synthetic analogs of thrombospondin and therapeutic use thereof |
US5190918A (en) * | 1990-02-22 | 1993-03-02 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Peptide fragments and analogs of thrombospondin and methods of use |
US5200397A (en) * | 1990-02-22 | 1993-04-06 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Use of peptide analogs of thrombospondin for the inhibition of angiogenic activity |
US6239110B1 (en) | 1990-02-22 | 2001-05-29 | W.R. Grace & Co. -Conn. | Synthetic analogs of thrombospondin and therapeutic use thereof |
CA2047527A1 (en) * | 1990-07-24 | 1992-01-25 | Christopher Dunwiddie | Method for administering a therapeutic anticoagulant |
CA2052486A1 (en) * | 1990-10-09 | 1992-04-10 | Thomas M. Connolly | Protein for inhibiting collagen-stimulated platelet aggregation |
US5801017A (en) * | 1993-04-09 | 1998-09-01 | Bio-Technology General Corp. | Production of recombinant factor Xa inhibitor of leech Hirudo medicinalis |
US5824641A (en) | 1993-04-09 | 1998-10-20 | Bio-Technology General Corp | Method of treating of preventing influenza |
US6339062B1 (en) | 1998-11-23 | 2002-01-15 | Inkine Pharmaceutical Company, Inc. | Retroinverso polypeptides that mimic or inhibit thrombospondin activity |
GB9930659D0 (en) * | 1999-12-24 | 2000-02-16 | Bio Discovery Ltd | Inhibitors of complement activation |
US7691839B2 (en) | 2005-09-28 | 2010-04-06 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for blocking platelet and cell adhesion, cell migration and inflammation |
CN109620847B (zh) * | 2018-12-11 | 2022-07-26 | 山东沃华医药科技股份有限公司 | 一种脑血疏口服液中的水蛭抗凝成分的制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4588587A (en) * | 1983-03-01 | 1986-05-13 | Pennsylvania Hospital | Method of treatment to inhibit metastasis |
-
1987
- 1987-09-15 NO NO873859A patent/NO170430C/no unknown
- 1987-09-15 IL IL83912A patent/IL83912A/xx unknown
- 1987-09-16 NZ NZ221835A patent/NZ221835A/xx unknown
- 1987-09-17 PT PT85746A patent/PT85746B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-09-17 DK DK489187A patent/DK489187A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-09-17 AU AU78626/87A patent/AU615635B2/en not_active Ceased
- 1987-09-17 EP EP87308243A patent/EP0263608A3/en not_active Withdrawn
- 1987-09-17 FI FI874055A patent/FI874055A/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-09-18 KR KR870010372A patent/KR880003975A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU615635B2 (en) | 1991-10-10 |
IL83912A (en) | 1993-05-13 |
EP0263608A3 (en) | 1989-06-14 |
NO873859D0 (no) | 1987-09-15 |
NO873859L (no) | 1988-03-21 |
DK489187A (da) | 1988-03-19 |
FI874055A0 (fi) | 1987-09-17 |
PT85746B (pt) | 1990-07-31 |
AU7862687A (en) | 1988-03-24 |
PT85746A (en) | 1987-10-01 |
KR880003975A (ko) | 1988-05-31 |
DK489187D0 (da) | 1987-09-17 |
FI874055A (fi) | 1988-03-19 |
NO170430C (no) | 1992-10-14 |
IL83912A0 (en) | 1988-02-29 |
EP0263608A2 (en) | 1988-04-13 |
NZ221835A (en) | 1992-03-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO170430B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et protein som har antikoagulerende og anti-metastatiske egenskaper | |
Koide et al. | Antithrombin III Toyama: replacement of arginine-47 by cysteine in hereditary abnormal antithrombin III that lacks heparin-binding ability. | |
IE891941L (en) | Extraction and purification of an anticoagulant principle¹from the south american leech, haementeria ghilanii | |
DK165506B (da) | Proteinpraeparat med koagulationsaktivitet samt fremgangsmaade til fremstilling deraf | |
JP2008289498A (ja) | 精製されたマルチメラ−ゼ | |
KR0159275B1 (ko) | 안넥신의 정제 방법 | |
Jackson et al. | Purification and partial amino acid sequence of human urine protein 1: evidence for homology with rabbit uteroglobin | |
Reber et al. | Three abnormal fibrinogen variants with the same amino acid substitution (γ 275 Arg→ His): Fibrinogens Bergamo II, Essen and Perugia | |
RU2050160C1 (ru) | Полипептид, полученный из ткани или секрета пиявок hirudinaria manillensis, специфически ингибирующий тромбин | |
US4137127A (en) | Process for the preparation of thrombin-like enzymes from snake venoms | |
RU2138275C1 (ru) | Ингибиторы тромбина, способы их получения и фармацевтическая композиция на их основе | |
Iwasaki et al. | Purification and Characterization of a Coagulant Enzyme, Okinaxobin I, from the Venom of Trimeresums okinavensis (Himehabu Snake) Which Releases Fibrinopeptide B | |
Lee et al. | Cloning and characterization of a blood coagulation factor IX-binding protein from the venom of Trimeresurus stejnegeri | |
US5194589A (en) | Leech protein having anticoagulant and antimetastatic properties | |
EP0445304A1 (en) | Isolated, physiologically active human thrombomodulin polypeptide | |
US5219993A (en) | Method of recovering purified epi protein from a solution especially a fermentation solution | |
EP1482969A2 (en) | Purifying process of soluble proteins of the l. obliqua bristles through prothrombin activation; process for a partial determination of the amino acids sequence of the prothrombin activator; process for determining the prothrombin activation of fraction ii, n-terminal and internal fragments sequence | |
Mills et al. | The action of plasmin on fibrinogen and fibrin I. Changes in the N-Terminal residues | |
Ashton et al. | Preparation and characterization of anhydrothrombin | |
JPS63146900A (ja) | 抗凝血性及び抗転移性特性を有するタンパク質 | |
Shitanishi et al. | Separation of human factor X from factor Xa by reversed-phase high-performance liquid chromatography | |
KR20010049671A (ko) | 뱀의 독소로부터 분리된 혈액 항응고단백질인 핼릭신 | |
JPH0365187A (ja) | 起炎性ホスホリパーゼa↓2阻害蛋白、その製造方法およびその遺伝子 | |
MXPA04007344A (es) | Proceso para purificar proteinas solubles de cerdas de l.obliqua a traves de la activacion de protrombina; proceso para la determinacion parcial de la secuencia de aminoacidos del activador de protrombina; proceso para determinar la activacion de pro |