KR0185973B1 - 남미의 거머리인 헤멘테리아 길리아니로부터의 항전이 물질 길란텐 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

남미의 거머리인 헤멘테리아 길리아니로부터의 항전이 물질 길란텐

제1도는 헤멘테리아 길리아니의 조 타액선 추출물에 의한 FXa의 억제를 도시한 것이다.

제2도는 DEAE 음이온 교환 칼럼상의 조 타액선 추출물(가용성 단백질 25㎎)의 분획화를 도시한 것이다.

제3도는 헤파린 아가로스 크로마토그래피에 의한 부분 정제된 FXa 억제제의 분획화를 도시한 것이다.

제4도의 소위 FXa-Affi-Gel-15 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의한 FXa억제제의 분획화를 도시한 것이다.

제5도는 역상 HPLC에 의한 헤멘테리아 길리아니 항-FXa 물질(길란텐)의 정제를 나타낸 것이다.

제6도는 P₅의 마이크로보어 역상 HPLC를 나타낸 것이다.

제7도는 헤멘테리아 길리아니 항응고 단백질 P₁내지 P₅에 의한 FXa의 화학양론적 억제를 나타낸 것이다.

제8도는 C57/BL 마우스의 B16-F10 흑색종 세포의 폐로의 전이에 대한 재조합체-히루딘 및 헤멘테리아 길리아니 팩터 Xa 억제제 단백질(길란텐)의 효과를 나타낸 것이다.

제9도는 C57/BL 마우스의 B16 F10 흑색종 세포의 폐로의 전이에 대한 고용량의 길란테의 효과를 나타낸 것이다.

본 발명은 헤멘테리아 길리아니(Haementeria ghilianii) 거머리의 타액 또는 타액선으로부터 분리된 팩터(Factor) Xa 억제활성을 지닌 단백질성 물질이 항전이(antimetastatic)활성을 갖고 있다는 발견에 관한 것이다.

암 세포가 제1종양 부위에서 떨어진 기관으로 퍼지는 것을 전이(metastasis)라고 한다. 전이는 암의 발병학에서 가장 흥미를 끄는 양태 중의 하나로 생각되어 왔다. 환자가 다발 종양 성장에 굴복하여 죽게 되기 때문에 질환을 치료하는 경우 암종양의 전이로 인해 대개 치료가 실패한다는 것은 확실한 사실이다. 전이가 발생하는 정도는 종양 개개의 형태에 따라 다르다. 흑색종, 유방암 폐암 및 전립선암이 주로 전이되기 쉽다.

전이가 발생하는 경우, 제2종양이 체내 각종 부위에서 생성될 수 있으며 더욱 통상적인 전위 부위중 하나는 폐이다.

즉, 종양의 전이를 어느 정도 억제하는 것이 유익하며, 이것은 억제에 관련된 약제가 제1종양에 대해 특정한 효과를 갖는지 여부와는 관계가 없다. 물론, 약제가 제1종양을 억제한다면, 이것은 약제를 위해 추가의 장점이 될 것이다.

거머리는 고대이후 의학적으로 사용되어 왔다. 19세기 초 거머리의 의학적 사용으로 인해 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)종이 거의 멸종되었으며 러시아에서는 이의 수출량을 할당하게 되었다. 최근에, 거머리의 분비물은 더욱 과학적으로 연구되었으며, 항응고제, 항전이제, 마취제, 항생제 및 혈관확장제와 같은 광범위한 생화학적 및 약리학적 활성을 지닌 다양한 생물학적 생성물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 예를들면, 히루도 메디시날리스 거머리의 타액선으로부터 분리된 히루딘(Hirudin)은 가장 특이적이고 강력한 공지의 트롬빈 억제제이고, 또한, 헤멘테리아 길리아니 거머리의 타액선으로부터 분리된 헤멘텐(Hementin)은 고분자량인 것으로 알려진 피브린(피브리노겐) 분해효소이다. 보고에 의하면, 이 효소가 거머리의 항응고 물질이다. 이 효소는 숙주의 피브린 분해계를 활성화시키거나 응고계를 억제하기 보다는 피브리노겐 및 피브린을 분해시킨다.

본 발명자들은 헤멘테리아 길리아니 거머리의 타액 또는 타액선으로부터 분리된 항응고 활성을 지닌 단백질성물질이 가치있고 유용한 항전이 활성을 갖고 있다는 것을 발견하였다.

헤멘테리아 길리아니 거머리의 타액선으로부터 분리된 팩터 Xa 억제 활성을 지닌 단백질성물질은 유용한 항전이제이며, 따라서, 길란텐(ghilanten)으로 언급한다. 길란텐이란 이름은 이 단백질성 물질이 헤멘테리아 길리아니(ghil-) 및 항 팩터 Xa(-anten)활성에서 유래되었다는 의미이다. 이 항전이 팩터는, 헤멘테리아 길리아니 거머리의 타액 또는 타액선 추출물을 음이온 교환 수지를 사용하고 염 농도가 증가되는 구배로 용출시키는 크로마토그래피를 통해 분리한다. 이어서 높은 팩터 Xa 억제활성과 항응고활성을 지닌 분획을 역상 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)시켜 팩터 Xa 억제활성 및 항전이 활성을 지닌 물질을 더욱 정제시킨다.

더욱, 특히, 본 발명은 헤멘테리아 길리아니의 타액으로부터 분리된 단백질성 물질인 항전이 팩터 길란텐의 종양 전이 형성을 억제하는데 안전하고 충분한 양을 흑색종, 유방암, 폐암 또는 전립선암 환자에게 투여함을 특징으로 하여, 종양 전이의 형성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

[도면의 설명]

제1도는 헤멘테리아 길리아니의 조 타액선 추출물에 의한 FXa의 억제를 도시한 것이다. 타액선 추출물(가용성 단백질) 약 11㎍을 정제된 FXa 16ng에 가한다. 샘플을 실온에서 10분 동안 배양시키고 ,메톡시카보닐-D-사이클로헥실글리실-글리실-아르기닌-p-니트로아닐리드 아세테이트를 가한 후 아미드 분해활성을 측정한 다음, p-니트로아닐린 형성을 405㎚에서 분광계도를 사용하여 1분 간격으로 기록하면서 모니터한다. 윗 곡선: 소의 Fxa 색소원의 기질; 아랫 곡선: 소의 FXa, 타액선 추출물 및 색소원의 기질. 삽입도면: (윗 곡선) 사람의 FXa 및 색소원의 기질:(아랫 곡선) 사람의 FXa, 타액선 추출물 및 색소원의 기질. 헤멘테리아 길리아니의 타액선 추출물은 소 및 사람의 트롬빈에 의한 H-D-헥사하이드로티로실-L-알라닐-L-아르기닌-p-니트로아닐리드 아세테이트의 가수분해를 억제하지 않는다(도시하지 않음).

제2도는 0.46x7.5㎝의 DEAE 음이온 교환 칼럼상의 조 타액선 추출물(가용성 단백질 25㎎)의 분획화를 도시한 것이다. 단백질을 20mM HEPES(pH 7.8)중의 NaCl의 선형 구배로 용출한다(이에 대한 상세한 방법을 참조하기 바람). 유속은 분당 1㎖로서 분획 1㎖가 수집된다. 판넬 A: 항응고 활성(열린 원)을 프로트롬빈 시간연장으로서 1단계 응고 분석으로 측정한다. FXa의 억제는 색소원의 기질 메톡시카보닐-D-사이클로헥실글리실-글리실-아르기닌-p-니트로아닐린 아세테이트를 사용하여 p-니트로아닐린 형성의 억제(열린 사각형)에 대해 405㎚에서 측정한다. 판넬 B: 이 판넬은 280㎚에서의 흡광으로 모니터한 헤멘테리아 길리아니 단백질 용출 프로파일을 나타낸다. 피브리노겐 분해 활성(헤멘틴)은 빗금친 부분으로 나타낸다. 이 헤멘틴 활성은 항-FXa 또는 주 항응고 활성과 함께 동시에 용출되지 않는다.

제3도는 헤파린 아가로스 크로마토그래피에 의한 부분정제된 FXa 억제제의 분획화를 도시한 것이다. 공용출되는 항응고 및 항-FXa 활성을 갖는 DEAE 분획을 모은 후, 0.5x5㎝의 헤파린 아가로스의 칼럼에 부하한다. 단백질을 20mM HEPES(pH 7.8)중의 NaCl을 1M까지 선형 구배로 용출한다. 유속은 분당 1㎖로서 분획 1㎖를 수집한다. 항응고 활성(열린 원)은 프로트롬빈 시간 연장으로서 1단계 응고 분석으로 측정한다. FXa의 억제는 색소원의 기질 메톡시카보닐-D-사이클로헥실글리실-글리실-아르기닌-p-니트로아닐린 아세테이트를 사용하여 p-니트로아닐린 형성의 억제(열린 사각형)에 대해 405㎚에서 측정한다.

제4도는 소의 FXa-Affi-Gel-15상에서의 친화성 크로마토그래피에 의한 FXa 억제제의 분획화를 도시한 것이다. 단백질을 0.1M 벤즈아미딘을 사용하여 칼럼으로부터 용출한다. 유속은 시간당 4㎖로서 분획 1.2㎖를 수집한다; 크로마토그래피 분획의 1/500 희석액으로 기술한 바와 같이 항응고(열린 원) 및 항-FXa(닫힌 원)활성에 대해 분석한다.

제5도는 역상 HPLC에 의한 헤멘테리아 길리아니 항-FXa 물질(길란텐)의 정제를나타낸 것이다. 상기 기술한 공용출 항응고 및 항-FXa 활성을 갖는 피이크 분획을 2.1x30㎜ Aquapore RP-300 칼럼상의 마이크로보어(microbore) 역상 HPLC로 분획화한다. 그늘진 부분은 피이크 분획에 분포된 항응고 활성을 나타낸다. 삽입도면은 동일한 칼럼상에서의 초기의 역상분리의 재크로마토그래피를 나타낸다. 분리된 재크로마토그래피로 비중첩 피이크를 얻는다. 주 FXa 억제활성은 길란텐 P₄및 P₅(짙게 그늘진 부분)에서 발견되며, 활성은 또한 길란텐 P₁, P₂및 P₃(옅게 그늘진 부분)에서도 발견된다.

제6도는 P₅의 마이크로보어의 역상 HPLC를 나타낸 것이다. 헤멘테리아 길리아니 단백질 P₅에 대한 흡수를 214㎚에서 모니터한다. 삽입 도면은 마이크로보어역상 HPLC로 분리한 P₅의 SDS PAGE(12% 아크릴아미드)를 나타낸다. 레인 a(굵은 선)은 분자량 표준 단백질을, 레인 b는 정제된 P₅를 나타낸다. 단백질은 문헌[참조: Oakley, et al., Anal. Biochem 105:361-363, (1980)]의 방법에 따르는 은 염색으로 검출하였다.

제7도는 헤멘테리아 길리아니 항응고 단백질 P₁내지 P₅에 의한 FXa의 화학양론적 억제를 도시한 것이다. 소의 팩터 Xa(35nM)를 지정된 농도의 각 억제제와 함께 배양한 후 시간에 따른 메톡시카보닐-D-사이클로헥실글리실-글리실-아르기닌-p-니트로아닐린 아세테이트로부터의 p-니트로아닐린 형성률을 405㎚에서 모니터한다. 억제제 및 억제된 효소 농도는 다음과 같다: [P₁]=24nM. [FX_a]i=20㎚; [P₂]=16nM. [FX_a]i=11㎚; [P₃]=14nM. [FX_a]i=10㎚; [P₄]=60nM. [FX_a]i=35㎚; [P₅]=40nM. [FX_a]i=35㎚. 삽입도면: P₅에 의한 소 팩터 Xa의 용량 의존성 억제를 나타낸 것이다.

제8도는 C57/BL 마우스의 B16-F10 흑색종 세포의 폐로의 전이에 대한 재조합체-히루딘 및 헤멘테리아 길리아니 펙터 Xa 억제제 단백질(길란텐)의 효과를 나타낸 것이다.

제9도는 C57/BL 마우스의 B16 F10 흑색종 세포의 폐로의 전이에 대한 고용량의 길란텐 효과를 나타낸 것이다. 대조(C)는 종양 세포만을 받고; 비히클(V)(표1에 정의)은 종양 세포만을 받고; 대조(왼쪽) 및 비히클(오른족)과 같이 길란텐은 종양 세포 접종에 대해 -2, +2 및 +4시간째에 길란텐 5㎍을 받은 것이다,

여기서 사용된 용어 타액이란 타액(또는 분비물)은 물론 거머리 전체 및 거머리의 특정부분, 특히 타액선으로부터 균질화시킨 조직을 포함한다. 또한, 용어 타액은 분리물 또는 조직 균질물이 팩터 Xa 억제활성을 지닌 본 발명의 항전이 팩터를 함유한다면 타액의 분리물도 포함한다.

팩터 Xa 억제 및 항전이 활성을 지닌 본 발명의 항전이 팩터는 팩터 Xa 억제 및 항전이 활성에 주로 관여된 수개의 서열의 단백질로 이루어진다. 본 발명을 위해, 헤멘테리아 길리아니 거머리의 타액으로부터 분리된 필수적인 팩터 Xa 억제 및 항전이 활성을 지닌, 즉 팩터 Xa 에 대해 1000nM 이상의 IC₅₀을 지닌 모든 단백질/펩타이드가 단독 및 혼합 형태로 사용된다. 특히, 본 발명자들은, 본 발명의 항전이 팩터가 순차적인 차단 합성에 따르거나 합성 유전자 작제를 포함하는 유전자 클로닝 및 발현에 따라 유도된 물질을 포함한다고 생각한다.

항전이 팩터의 완전한 아미노산 서열은 아직 완전히 알려지지 않았지만, 단백질중 하나의 실질적으로 완전한 서열은 하기와 같다

또한, 본 발명의 항전이 팩터를 포함하는 펩타이드는 분자량이 약 18kdal이고 고도로 글리코실화되어있지 않다. 일부 당 그룹들이 존재할 수 있지만 본 발명자는 겉보기 분자량이 SDS PAGE 측정에서의 폴리아크릴아미드 겔 농도에 따라 크게 변화지 않는다는 것을 의미하는 것이다. 또한, 본 발명자들은, 아미노산 분석을 수행한 결과 각각의 펩타이드는 약 3개의 알라닌 잔기, 3개의 메티오닌 잔기, 7 내지 9개의 라이신 잔기, 9 내지 10개의 아르기닌 잔기 및 8 내지 9개의 프롤린 잔기와 소량의 방향족 잔기(예: 3개의 페닐알라딘 및 3개의 티로실 잔기)를 갖고 있다는 것을 발견하였다. 시스테인/시스틴 및 트립토판 잔기의 수와 같은 보다 정확한 조성내용은 보다 많은 양의 펩타이드의 입수성 및 서열분석을 통해 가능하다.

본 명세서에서는 하기와 같은 아미노산의 약자를 사용한다:

Ala(또는 A)-알라닌

Arg(또는 R)-아르기닌

Asx-아스파라긴(N)(Asn)및/또는 아스파르트산(D)(Asp)

Cys(또는 C)-시스테인

Gly(또는 G)-글리신

Glx-글루탐산(E)(Glu)및/또는 글루타민(Q)(Gln)

His(또는 H)-히스티딘

Ile(또는 I)-이소루이신

Ley(또는 L)-루이신

Lys(또는 K)-라이신

Met(또는 M)-메티오닌

Phe(또는 F)-페닐알라닌

Pro(또는 P)-프롤린

Ser(또는 S)-세린

Thr(또는 T)-트레오닌

Tyr(또는 Y)-티로신

Val(또는 V)-발린

본 발명의 항전이 팩터는 많은 단백질/펩타이드와 같이 무독성의 유기 또는 무기산과 함께 약제학적으로 허용되는 염을형성할 수 있다. 적절한 염을 형성하는 무기산의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산. 및 산 금숙염(예:나트륨 모노하이드로겐 오르토포스페이트 및 황산수소칼륨)이다. 적절한 염을 형성하는 유기산의 예로는 모노 디 및 트리카복실산이 있다. 이러한 산의 예는 아세트산, 클리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리신산, 2-페녹시벤조산 및 설폰산(예:메탄솔폰산 및 2-하이드록시에탄 설폰산)이다. 카복시 말단 아미노산 부위의 염에는 적절한 무기 또는 유기 염기와 함께 형성된 무독성의 카복실산 염이 포함된다. 예를들면, 이러한 염은 알칼리 금속(예:나트륨 및 칼륨); 알칼리 토금속(예:칼슘 및 마그네슘); 알루미늄을 포함하는 그룹 IIIA족의 경금속; 및 1급, 2급 및 3급의 유기아민(예: 트리에틸아민을 포함한 트리알킬아민, 프로카인, 디벤질아민, 1-에텐아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디하이드록아비에틸아민, N-(저급)알킬피페리딘 및 기타 적절한 아민)의 염이다.

하기 실험은 헤멘테리아 길리아니 거머리로부터 분리한 단백질성 물질 또는 이의 조성물의 종양 세포의 전이, 특히 종양 세포의 폐로의 전이를 억제하는 능력을 입증하는 것이다, 폐는 동물체에서 전이 연구를 위해 편리한 기관이다. 또한, 특정 종양 세포에 대한 본 발명의 항전이 팩터의 효과가 하기에서 입증되었다.

본 발명의 단백질성 물질의 항전이 활성을 확인하기 위해 생존력 있는 B16 흑색종 F10 세포주 1×10⁵를 C57/BL 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 주사한다. 이후, t=0시간째의 종양 접종에 대해 -2,+2,+4 및 +6시간째에 항전이 팩터를 투여한다. 15일째에 동물을 죽인 후 폐의 전이 병소의 수를 정량한다. 나타난 결과는 하기 표1에 요약되었고 시험에서 사용된 동물의 수는 n으로 나타내었다.

B16 흑색종 F10 세포(1×10 세포/동물)을 0일째에 C57/BL 마우스의 꼬리 정맥에 정맥내 주사한다. 비히클:10㎎/㎖의 BSA를 함유하는 10mM Hepes, 0.15M NaCl, pH 7.4; 종양 세포 접종후, 재조합체-히루딘(25의 항트롬빈 단위) 및 FXa 억제제(1-2㎍)를 -2,+2,+4, +6시간째에 마우스에 정맥내 주사한다. 종양 세포 접종후 14일째에 동물을 죽인다. 폐를 절개하고 고정시킨 후, 해부 현미경을 통해 폐 전이 병소의 수를 측정한다.

이러한 실험에서, 길란텐(5㎍)을 종양 세포 접종에 대해, -2, +2 및 +4시간 째에 마우스에게 정맥내 주사한다. 실험 조건은 표 1에 기술한 바와 동일하다.

상기 표의 결과에 의하면, 항전이 팩터는 0시간째의 종양 세포 접종에 대해 -2,+2,+4 및 +6시간째에 투여한 경우, 1일당 단독 처리후 동물중의 전이를 상당히 억제한다는 것이 명확하다. 더욱이, 이 항전이 팩터는 작용에 있어서 강력한 트롬빈 억제제인 히루딘만큼 고특이적이어서 전이 병소의 증가를 완화시킨다.

본 명세서에 기술되고 청구된, 전이 억제에 의한 치료 방법을 전이되기 쉬운 암, 특히 흑색종, 유방암, 폐암 및 전립선암에 걸린 동물 또는 환자를 위해 단독으로 사용하거나 치료법의 일부로서 혼합 사용할 수 있다. 전이 병소의 형성을 억제하는 치료법은 암의 검출 후 가능한 빨리 투여하는 것이 최상이다. 초기 단계에서 환자에 이 치료법을 이용하여, 치료의사는 유의한 전이가 일어나지 않을 확률을 최대화한다. 이는 성공적인 치료를 위한 기회를 최대화하려는 것이다. 이러한 치료법에서 항전이 팩터 또는 이의 염은 일반적으로 제1종양 자체를 억제하는 또다른 형태의 치료법과 함께 투여할 수 있다. 이 혼합 치료시 다른 요법은, 이에 한정하는 것은 아니나, 방사선 조사 치료 또는 혼화성의 항종양제 또는 항신생물성제의 투여 방법이다. 이 항신생물성제의 예는 멜팔란(melphalan), 로무스틴 캡슐(loumstine capsule), 사이클로포스파미드, 플루오로우라실 및 오르니틴 탈카복실라제 억제제(예: 디플루오로메틸오르니틴(DFMO), 6-헵틴-2,5-디아민 및 (E)-2,5-디아미노-2-(플루오로메틸)-3-펜텐산 메틸 에스테르 디하이드로클로라이드)이다. 또한, 본 특허원에 기술된 치료법은 외과적 방법과 함께 사용하여(전 또는 후에)신체로부터 제1종양 물질을 제거할 수 있다. 신체로부터 종양 물질을 제거하는 외과적 방법은 종양 세포의 전이가 사용된 신체적 조작의 결과로서 일어날 수 있다는 두려움 때문에 보통은 피한다. 그러나, 본 발명의 항전이 팩터 또는 이의 염을 외과적 방법 전에 환자에 투여하는 경우, 외과술로부터 야기될 수 있는 전이의 위험은 감소하여 외과술은 더욱 바람직한 치료 방법이 될 것이다.

건전한 의학적 판단 범위내에서, 본 발명에서 사용된 항전이 팩터 또는 이의 염의 용량 및 투여 방법은 치료될 특정 상태의 중증도 및 특성, 치료 기간, 사용된 보조 치료법, 환자의 연령 및 신체적 상태 등과 같은 용인에 따라 관여한 의사의 특정 지식 및 전문성 범위내에서 변경할 수 있다. 그러나. 단일 용량은 전형적으로 0.01 내지 2000㎎/1㎏ 바람직하게는 1 내지 200mg/kg(달리 언급하지 않는한 여기서 사용된 단위 ㎎/㎏은 체중 ㎏당 ㎎을 의미한다)의 범위로 할 수 있다. 보통하루에 4회 이하 용량을 사용할 수있으나, 이는 건전한 유익/위험비를 고려하여 환자의필요에 따라 변경할 수있다. 각종의 환자 반응이 예상될 수있으나, 지정한 범위내에서의 고용량은 보통 경구 투여의 경우 필요하며, 정맥내 투여의 경우는 저용량을 사용할 수있다.

경구 투여를 위해, 항전이 팩터 또는 이의 염을 캡슐제, 정제 또는 입제의 형태로 제형화시킬 수있으며, 정맥내 투여의 경우, 활성물질을 적절한 액체로 제형화시킬 수 있다. 경우에 따라, 활성 화합물을 적합한 약제학적 담체와 혼합한다.

본 발명의 항전이 팩터는 경구투여 후, 장을 통해 통과될 수 있지만, 본 발명자들은 비경구투여(예: 피하, 정맥내, 근육내 또는 복막내); 데포우(depot) 주사 투여; 또는 이식 제제에 의한 투여를 선호한다.

비경구투여를 위해 본 발명의 항전이 물질은 계면활성제 및 기타의 약제학적으로 허용되는 보조제를 첨가 또는 첨가하지 않고 살균액(예: 물 및 오일)일 수 있는 약제학적인 담체와 함께 생리학적으로 허용되는 희석제중 물질의 액제 또는 현탁제의 주사가능한 용량으로서 투여할 수있다. 이러한 제제에서 사용할 수 있는 오일의 예로는 석유 오일, 동물성오일, 식물성 오일 또는 합성 오일(예: 땅콩오일, 콩기름 및 광유)이 있다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련당용액, 에탄올 및 글리콜(예: 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜)이 특히 주사액을 위한 바람직한 액체 담체이다.

본 발명의 항전이 팩터는 활성성분을 서방출시킬 수 있는 방법으로 제형화가능한 데포우 주사 또는 이식제제의 형태로 투여할 수있다. 활성성분을 펠릿 또는 작은 실린더로 압축시킬 수 있으며 데포우 주사 또는 이식 제제로서 피하 또는 근육내로 이식시킬 수 있다. 이식제제는 생물학적으로 분해가능한 중합체 또는 합성 실리콘과 같은 불활성 물질(예: 실라스틱, 실리콘 고무 또는 다른 중합체 (Dow-Corning Corporation제조))을 사용할 수 있다.

본 발명의 항전이 팩터는 거머리 타액으로부터 제조한다. 본 발명의 항전이 팩터를 수득 및 정제하는데 사용하기 위한 헤멘테리아 길리아니의 전방 또는 후방, 또는 전후방의 타액선으로부터의 타액선 추출액은 몇가지 방법으로 수득할 수 있는데, 예를 들면, 타액선을 외과적으로 제거하고 균질화시킨 후, 조직 균질물을, 예를 들면, 황산암모늄용액 또는 기타 염(예:염화나트륨) 또는 완충액, 또는 아세톤으로 추출하고 농축 또는 탈수시키거나, 조직 균질물을 초원심분리하여 수득한다. 생성된 조 타액선 추출물을 통상적으로 크로마토그래피시켜 항 FXa 및 항응고활성을 지닌 부분을 분리한다. 본 발명자들은 DAEA-셀룰로즈, 음이온 교환수지 및 헤파린-아가로스 수지상에서 염화나트륨의 염농도를 증가시키는 선형 구배에 따라 용출시키면서 크로마토그래피시키는 것을 사용한다. 또한 다른 수지를 사용할 수있으며, 각종 구배로 다른 염, 또는 유기 용매 또는 이의 혼합물로 용출시킬 수 있고, 통상적인 방법에 따라 칼럼 유속을 변형시켜 팩터 Xa 억제 및 항응고 활성을 지닌 부분을 분리할 수 있다.

생성된 정제 타액선 추출물을 크로마토그래피 수지(예;전형적으로 친화성 크로마토그래피에서 사용되는 팩터 Xa와 결합할 수 있는 화학적 그룹을 지닌 수지)에 결합된 팩터 Xa(예:소 팩터 Xa)를 사용하여 친화성 크로마토그래피시킨다. 본 발명자들은 N-석시미딜 에스테르 함유 수지 Affi-Gel-15(Bio-Rad Corporation으로부터 입수)를 사용하였다. 이 수지를 팩터 Xa와 4-모르폴리노프판설폰산 및 이어서 에탄올아민과 배양함으로서 이 수지와 팩터 Xa를 결합시킬 수있다. 정제된 타액선 추출물은 이 수지를 사용하여 활성부위에 가역적인 세린 프로테아제 억제제인 벤즈아미딘을 함유하는 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)으로 용출시키면서 크로마토그래피시킨 다음, 항응고 및 아미드 분해 활성을 지닌 부분을 수집한다. 벤즈아미딘을 투석 또는 후속의 크로마토그래피 단계에 의해 용이하게 제거된다. 친화성 크로마토그래피 기술상의 각종 통상적인 변경은 당해 전문가에게는 쉽게 이해될 것이다.

팩터 Xa 억제활성을 지닌 생성된 조 단백질성 물질을 추가로 정제한다. 이 정제는 정지상(stationary phase)이 비극성이고 용출상(eluting phase)이 극성인 크로마토그래피의 한 형태인 역상 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 정지상은 전형적으로 불활성 표면(예:유리)에 화학적으로 결합된 탄화수소 쇄이며, 용출상은 수성 메탄올, 아세토니트릴 또는 프로판올이다. 소수성 상호작용 크로마토그래피의 경우, 정지상은 비극성이고 용출상은 극성(예:물 또는 수성 완충액)이다. 본 발명자들은 C-18 타입 수지, 즉 고체 수지에 결합된 탄화수소가 실질적으로 탄소수 18의 탄화수소인 수지(예:Aquapore RP-300)를 사용하였으며, 이 C-18 수지는 트리플루오로아세트산을 함유하는 수성 아세토니트릴을 증가시키는 선형 구배로 용출시킨다. 그러나, 다른 적절한 칼럼으로는 C, C, C, C등을 사용할 수 있다.

[실시예]

하기 실시예는 본 발명을 설명하는 것이며 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

[헤멘테리아 길리아니 타액선 추출물로부터 FXa 억제 물질인 길란텐의 제조 및 특성화 응고 색소원 및 피브린(피브리노겐)분해 분석]

제조사에 의해 권장된 표준 프로그램과 시약을 사용하여 1-단계 응고분석으로서 Electra 800 자동 응고 타이머(Medical Laboratory Automation Inc)로 프로트롬빈 시간을 측정한다. 간단히 설명하면, (i) 20mM HEPES 0.15M NaCl, 2.5mM CaCl(pH 7.4)중 헤멘테리아 길리아니의 타액선 조직의 조추출물, (ii) 칼럼 용출 완충액중 헤멘테리아 길리아니의 타액선 추출물의 크로마토그래피 분획물 또는 (iii) 20mM HEPES 0.15M NaCl, 2.5mM CaCl(pH 7.4)중 헤멘테리아 길리아니의 타액선으로부터 정제된 FXa 억제제(길란텐)의 각종 양을 시트레이트된 정상 사람의 혈장 100㎕에 가한다. 11.6mM CaCl를 함유하는 트롬보플라스틴 시약(DADE

) 200㎕를 첨가한후 응고 시간을 측정한다, FXa 및 트롬빈 아미드 분해활성의 색소원 분석은 각각 메톡시카보닐-D-사이클로헥실글리실-글리실-아르기닌-p-니트로아닐린 아세테이트 및 H-D-헥사하이드로티로실-L-알라닐-L-아르기닌-p-니트로아닐리드 아세테이트를 사용하여 96웰 미세역가 플레이트(Accrate chemical and Scientific Corp., WEstbury, NY)중에서 수행한다. 이 분석에서 20mM HEPES 0.15M NaCl(분석 완충액, pH 7.2)25㎕중 효소 0.15 내지 350ng을 분석 완충액 25㎕에 가한 후 적절한 억제제 샘플 50㎕을 첨가한다. 용액을 실온에서 10분간 배양한 후, 최종농도가 2.5x10⁴M이 되도록 색소원 기질 100㎕를 첨가하여 분석을 시작한다. EL309 마이크로플레이트 자동판독기(Microplate Autoreader)(BIO-TEK Instruments)를 사용하여 p-니트롤아닐린 흡수에 대하여 405㎚에서 분광도광계도를 1분 간격을 기록함으로써 억제제의 존재 및 부재하에서의 아미드 분해 활성을 모니터한다.

¹²⁵I-표지된(사람)피브리노겐은 문헌[참조: Knight, et al., Thromb. Haemostas(Stuttgart) 46, 593-596(1981)]에 기술된 방법에 따라 제조한다. 50mM 트리스-HCl, 0.1M NaCl, 0.025M 나트륨 시트레이트(pH 7.9) 5㎖중의 피브리노겐(5㎎)을 플라스틱 배양 튜브중 0.045% NaI 캐리어 5㎕와 함께 Na¹²⁵I(New England Nuclear, Boston, MA)500μCi와 혼합한 후 빙냉시킨다. 반응을 개시하기 위해, 혼합물을 요오도겐 100㎍으로 피복시킨 냉각튜브에 옮긴 후, 빙욕상에서 1시간 동안 부드럽게 교반한다. 방사선 요오드와 반응을 종결시키기 위해, 단백질 용액을 플라스틱 배양 튜브에 경사여과시켜서 반응물로부터 요오도겐을 분리한다. BSA(5㎎)을 샘플에 가한 gnm 용액을 0.05M 트리스-HCl, 0.1M NaCl(pH 7.9)로 평형시킨 0.5x12㎖의 BioGel P2 칼럼상에서 분획화시켜¹²⁵I-표지된 피브리노겐으로부터 잔존하는 유리¹²⁵I를 분리시킨다. 특이 방사능은 1.9x10⁸dpm/㎎이다.

피브리노겐 분해 분석은¹²⁵I-표지된 피브리노겐을 트리클로로아세트산 가용성¹²⁵I-표지된 펩타이드로 분해시킨 크로마토그래피 분획중의 헤멘틴(참조: S.M. Malinconico, et al., J. Lab. Clin. Med 103 44-58(1984)의 능력을 기초로 한다. 이 분석에서 DEAE-5PW 크로마토그래피 분획 100㎕을 50mM 트리스-HCl, 0.1M NaCl(pH 7.9)227㎕중의¹²⁵I-표지된 피브리노겐 50㎍과 함께 배양한 후, 샘플을 CaCl₂중에서 10mM로 조절하고 37℃에서 밤새 배양한다. 여기에 배양 완충액중 BSA 100㎕(3㎎/㎖)를 가한후, 빙냉시킨 20% 트리클로로아세트산(TCA) 427㎕를 첨가한다. 샘플을 2시간 동안 얼음에 놓고 원심분리한후 펠릿 및 상등액의 방사능을 감마 카운팅을 통해 측정한다. 피브리노겐 분해활성은 TCA 불용성 카운트(count)에 대한 TCA 가용성 카운트의 비(TCA sol/TCA ppt)로서 표시한다.

[타액선 추출물의 제조]

헤멘틴 활성 50유니트/㎎단백질(참조: S.M.Malinconico et al., J. Lab. Clin. Med 103 44-58(1994))에 상응하는 헤멘테리아 길리아니 타액선을 20mM HEPES(pH 7.8, 추출 완충액 2㎖)를 함유하는 3㎖ 유리 Reacti-바이알(Pierce Chemical Co.)중에서 유리 로드로 부드럽게 한다. 바이알을 얼음상에 놓고 내용물을 30% 듀티 사이클(duty Cycle)과 파워 레벨 3을 사용하여 30초간 4회 파워폭발을 통해 마이크로프로브 팁(microprode tip) 초음파(Branson Sonic Power Supply) 처리한다. 바이알을 3750rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 수집한 후, 에펜도르프 테이블탑(tabletop) 원심분리기에서 8500rpm으로 다시 원심분리한다. 첫 번째 원심분리 단계로부터의 펠릿을 추출 완충액 2㎖에 재현탁시킨후 상기의 방법을 반복한다, 두 개의 초음파 처리 추출로부터 생성된 상등액을 합한 후, 즉시 정제를 위해 사용한다.

소 FXa-Affi-Gel-15 친화성 매트릭스의 제조

수지 2.5㎖와 함께 4-모르폴리노-프로판설폰산(MOPS)(pH 7.5, 커플링 완충액)2㎖중의 정제 효소 2㎎을 4℃에서 밤새 배양하여 소 FXa를 Affi-Gel-15와 커플링시킨다. 비드를 철저히 세척한후 커플링 완충액 3㎖에 재현탁시킨다. 이어서, 비드를 1M 에탄올아민(pH 8.0) 0.3㎖와 4℃에서 밤새 반응시킨 후 0.05M HEPES 0.1M NaCl(pH 7.5 0.1% 트윈-20 함유)로 철저히 세탁한다.

[FXa 항응고제의 정제]

추출 완충액 4㎖중의 가용성 단백질 25㎎을 함유하는 타액선추출물을 20mM HEPES(pH 7.8 완충액 A)로 평형시킨 DEAE-5PW(Waters Associates) 음이온 교환 칼럼(0.46x7.5㎝)에 적용시킨다. 단백질을 100% 완충액 A(초기조건) 내지 100% 완충액 B(완충제 A 함유 0.5M NaCl)의 범위로 NaCl로 60분간 선형구배시켜 용출시킨다. 유속은 1㎖/분이다. 0.1 내지 0.20M의 NaCl에서 용출된 항응고 및 항-FXa 활성모두를 함유하는 분획을 모은 후(참조:제2도), 전도도가 10mS/㎝이 될 때까지 완충액 A로 희석하고 0.5x5㎝ 헤파린-아가로스 칼럼(Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc)에적용시킨다. 항응고 활성을 지닌 DEAE 분획의 헤파린-아가로스 상에서의 추가적인 정제는 제3도에 나타나 있다. 칼럼을 완충액 A로 완전히 세척한 후, 100% 완충액 A 내지 100% 완충액 B(완충액 A+1M NaCl)범위의 선형 염 구배를 통해 75분간 용출시킨다. 유속은 분당 1㎖이다. 일부 적용시에, 단백질을 소 FXa-Affi-Gel-15의 칼럼상에서 분획화시켜 항-FXa 활성을 회수한다(제4도). 항응고 활성을 지닌 조 추출물 또는 크로마토그래피 분획을 0.1% 트윈-20으로 조정한 후 소 FXa-Affi-Gel-15의 2㎖의 베드(bed)용적을 지닌 칼럼상에서 친화성 크로마토그래피시켜 분획화한다. 칼럼을 0.1% 트윈-20을 함유하는 0.05M HEPES 0.1M NaCl(pH 7.5)로 완전히 세척한 후 0.1M 벤즈아미딘을 함유하는 0.05M HEPES 0.1% 트윈-20(pH 7.5)으로 단백질을 용출시킨다. 응고 및 아미드 분해분석은 수집한 분획의 1/500 희석액에 대해 수행한다. 컬럼은 4㎖/시간의 유속으로 용출시킨다. 항응고 및 아미드 분해활성의 최종 분획화는 Applied Biosystems Model 130 단백질/펩타이드 분리 시스템으로 2.1x30㎜ Aquapore RP-300 C-18 역상 컬럼상에서 수행한다. 단백질을 100% 완충액 A(H₂O중 0.1% 트리플루오로아세트산)내지 100% 완충액 B(0.7% 트리플루오로아세트산/70% 아세토니트릴/29.93% H₂O)범위의 아세토니트릴 선형구배로 40분에 걸쳐 용출시킨다. 단백질 함유 분획(참조: 제5도)을 사번트 스피드 백(Savant Speed Vac) 시스템상에서 밤새 건조시킨다. 샘플을 0.1% 트리플루오로아세트산/H₂O에 재용해시킨 후, 각종 분취량을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 기체상 마이크로서열분석(microsequencing), 아미노산 분석 및 항응고 및 아미드 분해활성에 대해 분석한다.

[폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석]

3% 스택킹(Stacking) 겔을 함유하는 아크릴 아미드중의 폴리아크릴아미드 겔(8x8㎝ 및 두께 1㎜) 20% 및 12%를 Mighty Small 전기영동 유니트(Hoefer Scientific Co.)에 넣은 후 10㎃/겔의 정전류를 통과시킨다. 겔은 0.25M 트리스-HCl(pH 9.0) 및 0.1% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 함유한다. 전기영동은 25mM 트리스-HCl, 0.2M 글리신, 0.1% SDS(pH 8.4)중에서 수행한다. 건조된 샘플을 10mM 트리스-HCl(pH 6.8), 1% SDS 20% 슈크로오즈, 1mM EDTA 6M 우레아, 1% 2-머캅토에탄올 및 0.03% 브로모페놀블루 35㎕에 용해시킨다음, 전기영동시키기 전에 샘플을 60℃에서 15분간 가열한다. 겔을 고정시킨 후 문헌[참조: Oakley, et al., Anal Biochem 105 361-363(1980)]의 은 염색방법에 따라 단백질을 검출한다. 표준 단백질의 전기영동에 의한 이동에 대한 분자량의 대수의 표준 플롯(plot)으로부터의 외삽을 통해 단백질의 겉보기 분자량을 측정한다. 표준 단백질은 포스포릴라제 B(98,000), 소혈청 알부민 (67,000), 오브 알부민(43,000) 탄산 달수 효소(30,000) 콩 트립신 억제제(20,000) 및 α-락토알부민이다.

[서열분석]

자동 에드만 분해는 모델 470A 단백질-펩타이드 서열분석기(Applied Biosystemps, Inc)를 사용하여 제조사에 의해 제공된 시약, 지시사항 및 표준 프로그램에 따라 수행한다. 페닐티오하이단토인-유도체화된 아미노산은 470A 기체상 서열분석기와 온라인으로 직접 연결된 모델 120 PTH-분석기(Applied Biosystemps, Inc)를 사용하여 각 사이클에서 분석한다.

[아미노산 분석]

가수분해 튜브로 사용된 자동 샘플기(Autosmapler) 마이크로바이알(Hewlett Packard)을 메탄올중에서 초음파 처리한 후, 500℃의 화로중에서 4시간 동안 가열한다. 펩타이드는 액화 페놀(MCB)의 얼마간의 ㎕를 함유하는 일정하게 비등하는 HCl(Pierce Chemical Co.) 200㎕와 함께 105℃의 피코택 윅스테이션(Picotag Workstation, Waters Associates)에서 기체상 가수분해를 통해 20시간 동안 가수분해시킨다. 가수분해된 샘플을 스피드 백 농축기(Savant)중에서 건조시키고 소용적의 0.1N HCl(전형적으로 15 내지 30㎕)에 용해시킨 후, 모델 1090 HPLC의 자동 샘플기(Hewlett Packard)에 넣는다. 아미노산 분석은 고감도 배치(형광검출)를 통해 Aminoquant 분석기(Hewlett Packard)를 사용하여 수행한다. 아미노산은 우선 주요 아미노산을 위해 O-프탈알데히드(OPA)에 이어서 부차적인 아미노산을 위해서는 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(FMOC)로 예비칼럼 유도체화시킨후 측정한다[참조: Biankenship et al., Anal Biochem 178 227-232(1989)]. 유도체화된 아미노산은 제조사에 의해 제공된 칼럼, 시약 및 지시 사항에 따라 역상 HPLC를 통해 분리한다. 이 시스템은 아미노아실 매쓰를 1 내지 500pmol까지 정확히 정량한다.

제1도는 헤멘테리아 길리아니의 조 타액선 추출물에서의 항-FXa 활성을 나타낸 것이다. 활성물질은 사람(삽입 도면 참조)과 소의 FXa를 억제하나 사람과 소의 트롬빈(데이터는 도시하지 않았음)은 억제하지 못한다.

제2는 DAEA상의 음이온 교환을 통한 가용성 단백질 추출물 25㎎의 크로마토그래피를 나타낸 것이다. 항응고 및 FXa 억제활성은 0.1 내지 0.16M NaCl(판넬 A)의 분획 30 내지 35에서 동시에 용출된다. 항-FXa 활성이 없는 피브리노겐 분해활성은 2.0M NaCl(판넬 B) 이상의 분획 37 내지 44(빗금친 영역)에서 용출된다. 이 물질은 응고(피브린)용해를 촉진하며,¹²⁵I-표지된 피브리노겐(제2도 판넬 B)을 분해시키고 SDS-PAGE에 의해 정제된 피브리노겐의 α,β 및 γ 쇄를 분해시키는 것으로 나타났다. 이러한 분획의 피브린(피브리노겐) 분해작용은 헤멘틴에 기안한 것이다. 더욱이 항-FXa 활성을 지닌 분획은 피비린(피브리노겐) 분해 활성을 나타내지 않았다. 제1도 및 제2도의 결과를 토대로 하면, 0.1 내지 0.16M NaCl에서 용출되는 억제제는 히루도 메디시날리스의 히루딘[참조: J.Dodt et al., Boil Chem Hoppe-Seyler 366 379-385(1985)] 또는 헤멘티아 길리아니의 피브린(피브리노겐)분해성분인 헤멘틴 [참조: S.M.Malinonico et al., J.Lab Clin Med 103 44-58(1984)]에 기인한 것이 아니다. 제2도에 나타난 바와 같이, 피이크 활성을 지닌 분획 25㎕는 프로트롬빈 시간을 16초까지 연장시키며 아미드 분해 분석에서 FXa 17ng을 완전히 억제하였다. DEAE 분획화한 추출물의 분석을 토대로 하면, FXa 억제활성은 주요한 항응고 활성을 나타내는 것이다.

DEAE 칼럼으로부터 항-FXa 활성을 지닌 항응고 분획을 모은 후, 헤파린 아가로스 크로마토그래피를 통해 분획화시킨다(제3도), 항응고 및 항-FXa 아미드 분해활성은 0.45 내지 0.55M NaCl에서 동시에 용출된다. 더욱이 피이크 항응고 활성을 나타내는 분획 25㎕는 프로트롬빈 시간을 약 17초까지 연장시키며 정제된 FXa 16ng에 의한 색소원 기질의 가수분해를 완전히 억제한다.

FXa-Affi-Gel-15 상의 친화성 크로마토그래피에 의한 항응고/항-FXa 활성의 분획화가 제4도에 나타나 있다, 항응고 및 항-FXa 활성은 가역적 활성부위 세린프로테아제 억제제인 0.1M 벤즈아미딘으로 칼럼으로부터 모두 용출된다.

제5도는 마이크로보어 역상 HPLC에 의한 억제제의 추가의 분획화를 나타낸 것이다. 나타난 바와 같이, 4개의 부(minor) 및 2개의 주(major) 피이크는 다중의 피이크를 따라 분포된 항응고 활성으로 분해된다.

재분획화에 의해 6개의 P₀-P₅로 지정한 분리 피이크가 생성되었다(삽입 도면). 이들 중 P₁내지 P₃이 활성을 나타내는 보다 낮은 반면에 R₄및 R₅는 주요 항응고 및 항-FXa 활성을 나타내었다. P₀에서는 검출되지 않았다.

분획 P₁내지 P₅의 SDS PAGE(20% 아크릴아미드)에 의해, 이 단백질이 겉보기 분자량이 약 18,000(도시하지 않음)인 것과 유사한 이동을 나타낸다는 것이 입증되었다. 제6도는 마이크로보어 역상 HPLC에 의한 P₅의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸 것이다. 삽입도면은 P₅의 12% SDS-PAGE(12% 아크릴 아미드)를 나타내는 것이다. 이순수한 성분의 겉보기 분자량은 18,000이며 즉 정제된 FXa 억제제의 겉보기 분자량은 12% 내지 20%의 폴리아크릴아미드 겔 농도에 따라 상당히 변하지 않는데, 이는 고도로 글리코실화되지 않았다는 것을 나타내는 것이다.

제7도는 각 펩타이드가 화학양론적 억제제 농도에서 팩터 Xa를 70% 초과 억제하였으며, 이는 P₁내지 P₅의 특이 활성에 있어서 차이가 거의 없다는 것을 나타내는 것이다. P5에 의한 FXa의 용량-의존성 억제가 나타나 있으며 최대의 1/2를 억제하는 P5의 농도는 20nanimolar이다.

표 3은 분획 P₀내지 P₅의 아미노산 조성을 나타낸 것이다. P₁내지 P₅의 아미노산의 함량은 P₄및 P₅가 약간 높은 Asx, Glx, Lys 및 Pro 함량을 갖고 있는 것을 제외하고는, 대부분의 잔기에서는 매우 유사하다. P₀는 Asx, Glx, Thr, Arg, Val, Met, Ile, Lys 및 Pro의 함량에 있어서 P₁내지 P₅와 상당히 상이하다. 조성에 있어서의 유사성은 P₁내지 P₅가 동일한 단백질의 서열 연관 변이체임을 나타내는 것이다.

[실시예 2]

아미노산 서열 결정

피리딜에틸화 및 시아노겐 브로마이드 분해

정제된 억제제는 소량의 단백질을 사용하는 문헌[참조:Hawke and Yuam Applied Biosystems Incorporated User Bulletin No. 28(1987)]의 방법이 변형된 문헌[참조:Freidman et al. J.Biol.Chem. 245 3868-3871(1970)]의 방법에 따라 피리딜에틸화시킨다. 요약하면 건조 단백질(약 1nanomol)을 6M 구아니딘-HCl, 0.25M 트리스-HCl(pH 8.5) 44㎕에 용해시킨 후, 10% β-머캅토에탄올 3㎕ 및 4-비닐피리딘 3㎕와 함께 실온에서 2시간 동안 반응시킨다. 피리딜에틸화된 단백질을 모델 130 단백질-펩타이드 분리 시스템(Applied Biosystem Inc) 상의 Aquqpore RP-300 칼럼(2.1x30㎜)을 사용하는 마이크로보어 역상 HPLC를 통해 탈염시킨다. 100㎕/분의 유속으로 150분간에 걸쳐 100% 완충액 A(HO중 0.1% TFA) 내지 100% 완충액 B(HO중 0.085% TFA 및 70% 아세토니트릴)의 범위에서 선형 구배시킨다. 단편을 얻기 위해 피리딜에틸화된 단백질 (약 1nanomol)을 90% 포름산 330㎕에 용해시키고 CNBr 수개 결정을 가한다. 샘플을 질소로 플러싱하고 밀봉한 다음 실온에서 24시간 동안 암소에 둔다. 샘플을 스피드백 원심분리기(Savant) 상에서 건조시킨 후 HO층 0.1% TFA 50㎕에 재용해시키고 상기와 같은 구배를 사용하여 마이크로보어 역상 HPLC를 통해 재정제한다.

[효소 분해]

본래의 단백질 서열을 결정하기 위한 초기 시도는 아미노(N-)말단을 차단시키는 것이다. 서열 결정화의 실패를 통해 차단된 N-말단 시아노겐 브로마이드 단편을 확인한다; 아미노산 분서에 의해 충분한 펩타이드가 존재하는 것으로 확인되었다. CNBR 단편을 펩타이드(3.6㎍)을 인산나트륨 완충액(pH 8.0) 40㎕중의 피로글루타메이트 아미노 펩티다제(Sigma)와 함께 1:10(w/w)의 효소/기질 비로 24시간 동안 배양하여 탈차단시킨다. 역상(RP)마이크로보어 HPLC를 통해 반응 혼합물을 탈염시키고 20사이클동안 탈차단된 CNBR의 단편의 서열을 결정한다[CNBR-1(PYR)].

피리딜에틸화 이전에 본래의 단백질에 대해 제한 트립신 분해를 수행한다. 항응고 단백질(20㎍)을 1% NHCO(pH 9.00) 200㎕에 용해시킨 후 실온에서 1:20(w/w)의 효소/기질비로 24시간 동안 트립신(Sigma-TPcK 처리)과 반응시킨다. RP-마이크로보어 HPLC를 통해 반응 혼합물을 탈염시켜 단일 피이크를 얻는다, 후속 환원, 피리딜에틸화 및 재크로마토그래피시켜 4개이 피이크를 얻으며, 이중 하나는 서열 CNBR-2와 중첩된 36개 잔기 서열 TY-1이다.

[아미노산 서열 분석]

제조사에 의해 제공된 시약, 지시 사항 및 표준 프로그램을 사용하여 모델 470A 단백질-펩타이드 서열분석기(Applied Biosystems Inc)상에서 자동에드만 분해시킨다, 페닐티오하이단토인-유도체화 아미노산은 470A 기체상 서열분석기와 온라인으로 직접 연결된 모델 120 PTH-분석기(Applied Biosystems Inc)를 통해 각 사이클에서 분석한다.

Claims (1)

1. 헤멘테리아 길리아니(Haementera ghilianii)거머리의 타액으로부터 분리되고, 겉보기 분자량이 18KDa이고,

   

   의 아미노산 서열을 갖는 실질적으로 순수한 펩타이드를 포함하는 항전이 팩터(antimetastatic factor) 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 활성 성분으로서 포함하는 폐로의 흑색종 종양 전이를 억제하기 위한 약제학적 조성물.

Images