PT85746B

PT85746B - Processo para a preparacao de uma proteina com propriedades antimetasaticas

Info

Publication number: PT85746B
Application number: PT85746A
Authority: PT
Inventors: John A Friedman; John W Jacobs; Gregory P Gasic; Ellen Simpson
Original assignee: Pennsylvania Hospital
Priority date: 1986-09-18
Filing date: 1987-09-17
Publication date: 1990-07-31
Also published as: NO873859D0; FI874055A0; KR880003975A; NZ221835A; FI874055A; AU615635B2; NO170430C; PT85746A; DK489187D0; IL83912A0; EP0263608A2; NO873859L; AU7862687A; DK489187A; NO170430B; EP0263608A3; IL83912A

Description

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que possui propriedades antimetastáticas e anticoagulantes. Também compreende 0 processo para a preparação de composições farmaceuticamente que inibem ou reduzem a formação de metástases e/ou a coagulação do sangue.

Âmbito da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de utilização de uma proteína ou proteínas bioquimicamente puras, possuindo propriedades anticoagulantes e antimetastáticas, e à(s) proteína(s) propriamente dita(s).

Enquadramento geral da Invenção

Gomo divulgado pela Patente dos E.U.A. n^.4 588 587, a saliva de animais sugadores de sangue tais como sanguessugas, possui actividade anticoagulante. Gomo foi igualmente discutido na dita Patente, um extracto de certas glândulas salivsres da sanguessuga apresenta igualmente efeitos antimetastáticos. Foi defendido que estes efeitos podem resultar de ums combinação única e complexa de anticoagulantes, e/ou inibidores da protease, e/ou outros constituintes do extracto que actuam sinergisticamente.

Acredita-se que o mecanismo teórico pelo qual se realiza a metástase envolve várias fases, tais como a da entrada de células tumorígenas na circulação dos organismos (intravasculação); o seu transporte pela corrente sanguínea; interacções de células malignas circulantes com plaquetas e factores de coagulação do plasma com activação do sistema hemostático; interacção das mesmas células com células hospedeiras que não sendo as plaquetas; paragem das células tumorígenas, envolvidas por agregados de plaquetas e coágulos de fibrina dentro dos vasos capilares; ataque proteolítico da parede dos vasos sanguíneos, particularmente da sua membrana básica, por enzimas tumorígenos; saída do sistema circulatório (extravasculação); e formação de tumores secundários ou colónias.

É crucial para este mecanismo a capacidade da célu la tumorígena circulante iniciar a formação dum coágulo sanguíneo que serve para fechar a célula num vaso capilar. Fa langa, et al. (Biochemistry 24:5558-5567» 1985) isolou e caracterizou um procoagulante cancerígeno particular, o qual demonstrou iniciar a coagulação através da activação do factor x. Adicionalmente outros pesquisadores, citados nessa re ferência, tinham conseguido isolar prócoagulantes cancerígenos que activavam directamente o factor x. Finalmente, uma das primeiras publicações do presente inventor (câncer Metas tasis Reviews 3, 99-116)(1984) apresenta um resumo de pesqui sas sobre a activação do sistema de coagulação por células de tumor, que igualmente discute o possível envolvimento do factor x.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção compreende o processo para a preparação de uma proteína (ou proteínas) recentemente isola da bioquimicamente pura, possuindo propriedades anticoagulan tes e antimetastáticos. Esta proteína deriva de uma glândula salivar da sanguessuga, específicamente da sanguessuga mexicana HaSmenteria officinalis. Esta invenção compreende igual mente o método para isolar a proteína e um método para utilizar a proteína para evitar ou retardar a coagulação sanguí nea e metastáse. A proteína, denominada antistasina, é tida como inibidora da coagulação do sangue ao inibir o factor de coagulação Xa mas não a trombina.

A antistasina é isolada a partir dum extracto das glândulas salivares das sanguessugas, particularmente da san guessuga mexicana Haementeria officinalis, mediante cromatro grafia de afinidade com heparina seguida de cromatrografia de permuta de aniões. A antistasina isolada possui um peso molecular de aproximadamente 17*000 sob condições nas desnaturantes. A proteína possui um ponto isocléctrico de aproximadamente 9,5 e é extremamente activa como inibidora da coagulação em análises in vitro. Além, dissp, o extracto demons4

trou ser útil na inibição da metástase em testes in vivo com ratos.

Breve Descrição das Figuras

As Figuras 1, 2 e 3 são cada uma delas curvas ilus trando o espectro de absorção, a 210 milimoles, de fracções eluídas de uma coluna cromatográfica líquida de elevada pres são, como se descreverá na sua descrição detalhada. Os números adjacentes aos picos nas Figuras indicam o tempo de retenção em 10~² minutos.

Descrição pormenorizada da Invenção

A antistasina é uma proteína, ou proteínas, bioqui micamente pura, cada uma das quais é separada de um extracto das glândulas salivares duma sanguessuga mediante cromatogra fia e selecção da fracção crornatográfica possuindo actividade anticoagulante. 0 produto antistasina(s) caracteriza-se por uma capacidade selectiva de desactivar o factor Xa, mas não a trombina.

A antistasina é purificada em duas fases diferentes tendo a Fase 1 uma pureza parcial e a Fase 2 uma homogeneidade aparente.

Os dadoe preliminares sobre as assimilações proteolíticas sequenciais da preparação aparentemente homogénea (Fase 2) sugerem a possibilidade de existirem homólogos naturais da antistasina. Esta invenção inclui todos esses tais homólogos, desde que cada um possua actividade inibidora con tra o factor Xa.

Será compreendido que outras variantes a qualquer uma das antistasinas da presente invenção são aqui incluídas, especialmente quaisquer variantes que sejam diferentes das antistasinas isoladas apenas por substituição de aminoácidos de conservação. Tais substituições de aminoácidos de conser vação são definidas como conjuntos no Quadro 1 da obra de Taylor, W.R., J. Mol. Biol. 188, 233 (1986). A antistasina ou seus fragmentos incluem nesta aplicação quaisquer tais va riações na sequência dos aminoácidos, quer pela substituição dos aminoácidos de conservação, delecção, ou outro processo, desde que a antistasina, após purificação, esteja imunoquimicamente reagente com anticorpos específicos para a antistasina isolada da sanguessuga mexicana Haementeria officinalis.

Seguidamente está um exemplo deste método de separação e selecção através da primeira fase da purificação.

Método de fabrico da Antistasina (Fase 1)

Prepara-se primeiramente um extracto da glândula salivar da sanguessuga mexicana, mediante a extracção das di seccionadas glândulas posterior e anterior à temperatura de 4°C por sonicação num tampão de 20 milimoles HEPBS (4-(2-hidróxietil)-l-piperazina etano ácido sulfónico), pH 7,8 contendo 10 milimoles de CaClg. 0 material sonicado é centrifugado a 8.500 gr durante 20 minutos, sendo os sobrenadantes agregados e centrifugados a 100.000 g durante uma hora. A suspensão de proteínas sobrenadantes resultante é congelada à temperatura de -70°C até ser necessário. A antistasina é purificada a partir do extracto de glândula salivar por um procedimento cromatográfico de duas fases, como um indicador da presença da actividade anticoagulante/antimetastática.

Coloca-se primeiramente o extracto da glândula salivar numa coluna de heparina-agarose equilibrada com milimo les TRIS-HC1, pH 8,7· 0 carregamento, lavagem e eluição da coluna de heparina-agarose são facilitados pelo uso de um dispositivo de obtenção de gradiantes e controlados da croma tografia líquido. Os picos da proteína eluindo-se da coluna são monitorizados por meio dum sistema compentorizado UV. As

proteínas que não aderem à coluna, e as que se eluiem na lavagem com tampão TRIS até que não se observe mais adsorvência a 280 nm, são registadas. A coluna lavada é então eluída por uma combinação de gradientes usando-se tampão TRIS e tampão TRIS contendo 1 M NaCl. Quando os picos de proteínas começam a eluir-se, o gradiente é mantido manualmente e as proteínas podem eluir-se da coluna sob condições isocráticas Após se ter eluído cada pico de proteínas, recomeça-se o grs diente.

As fracções da coluna possuindo actividade coagulante, como determinado pelo ensaio sobre a actividade coagulante, são então agregadas, concentradas por centrifugaçãc por meio de filtros ultrafiltrantes possuindo limites de exclusão do peso molecular de 12.000, des-salinizadas em peque· nas colunas de G-25 sephadex e aplicadas a uma coluna mono Q equilibrada em tampões TRIS. A coluna mono Q é então lavada e eluída de maneira similar à utilizada na coluna de heparina-agarose, produzindo-se antistasina (Fase 1).

A proteína parcialmente purificada obtida desta forma é concentrada para 1 mg/ml e armazenada congelada à temperatura de -70° em tampão TRIS. Uma maior purificação e análise para atingir o grau de pureza da Fase 2 estão descri tas no Exemplo, Figuras 1-5 e Quadro 5·

Características da Antistasina peso molecular da antistasina tem sido calculado por filtragem de gel numa cromatografia rápida de proteínas líquidas e por electroforese SDS-gel. Estas análises indicam um peso molecular de 17.000.

Mediu-se 0 ponto isocléctrico da antistasina por cromatofocagem numa coluna mono P utilizando-se a cromatogra fia rápida de proteínas líquidas. Este método produziu um pi de 9,5 para o material.

•V

A análise de aminoácidos da antistasina parcialmer te purificada (Fase 1) foi realizada num analisador de aminoácidos Glenco MM-7O. 0 material de antistasina foi hidrolizado com 6 NHC1 durante 24 horas. A composição de aminoácidos daí resultante está ilustrada no Quadro 1. Obtiveram-se resultados ligeiramente diferentes com uma pureza proteí ca aparentemente superior, vide Quadro 5· Outra análise feita ao produto purificado na Fase 1, indicou de certa forma um conteúdo de aminoácidos diferentes, como se mostra no Qus dro IA. Tal pode indicar a eventual presença de algumas formas de antistasina de certa forma diferentes no produto obti do na Fase 1, ou seus contaminantes ou derivados.

Mediçãodas propriedades antimetastáticas

Determinou-se a inibição da metástase experimenta] mente provocada injectando-se antistasina num tampão de controle duas horas de se injectar 10^T241 células tumorígenas seguido de inoculação de quantidades similares de antistasina, respectivamente duas e quatro horas após a injecção das células tumorígenas.

Passados 14-19 dias, os animais foram mortos contando-se então as colónias de tumor nos pulmões. Os resultados encontram-se no Quadro 2.

Efeitos anticoagulantes

Realizaram-se ensaios de coagulação de uma fase para medição do efeito da antistasina no tempo de protrombina, tempo da tromboplastina parcialmente activada, tempo de trombina e ensaio do factor x, à temperatura de 57° rum volume final de 0,3 ml com a ajuda dum fibrómetro. Para a determinação do efeito da antistasina no tempo da protrombina, adicionaram-se sequencialmente 100 ul de uma diluição salina de proteínas seguida de 100 ul de um reagente de trombo-

plastina contendo 0,025 M CaClg, a 100 ul de plasma humano normal determinando-se o tempo de coagulação.

Para se medir o tempo da tromboplastina parcialmen te activada, substituiu-se o reagente de tromboplastina por um reagente de caolina-cefalina contendo 0,025 M CaClg.

Para se medir o efeito da antistasina no tempo da trombina, a solução de substracto consistia quer em 100 ul de plasma humano normal quer em 100 ul de uma solução de 1 mg/ml de fibrinogeno em salina tamponizada HEPES sendo coagulada pela adição de 200 ul de uma solução salina tamponizada HEPES de 0,50 unidades/ml de trombina contendo várias quantidades de antistasina purificada. Para maximizar o efei to sobre a trombina, incubaram-se primeiramente 10 ul volumes de proteínas e trombina conjuntamente durante 5 minutos a 57 graus, antes da diluição e adição ao plasma humano normal ou fibrinogeno.

Para se determinar o efeito da antistasina sobre a actividade do factor Xa, trataram-se 100 ul de plasma deficiente de factor x com 100 ul de 0,025 M CoClg seguidos por 100 ul de factor Xa purificado ou 100 ul de factor Xa purificado contendo várias quantidades de antistasina.

Os resultados dos ensaios acima descritos estão apresentados nos Quadros 5 θ 4.

As análises realizadas indicam que a antistasina é uma proteína possuindo um peso molecular de aproximadamente 17*000 numa simples cadeia e com um ponto isocléctrico de 9,5· A antistasina é um potente anticoagulante do plasma humano e do plasma de ratos. Como se demonstrou pelos vários ensaios sobre o tempo de coagulação, a antistasina actua através da inibição do percurso do factor Xa, mais do que pela interferência com a trombina. Ê interessante ver que a actividade anticoagulante da antistasina surge mais pronunciada in vitro • Ζζ ⁹ ’ do que in vivo. Contudo, eventuais interferências ainda não foram totalmente examinadas.

Declaração sobre a Utilidade Industrial

A proteína ou proteínas da presente invenção são úteis para o tratamento de mamíferos para evitar ou reduzir a coagulação sanguínea ou metástase. Uma sua particular apli cação abrange o tratamento profilático de doenças relacionadas com a trombose.

EXEMPLO

A.- Purificação para a Fase 2

A antistasina foi parcialmente purificada de acordo com o método de Tuszynski, G.P. et al., J. Biol. Ciiem. 262, 9718-9725 (1987). 0 material parcialmente purificado foi mais purificado utilizando-se a fase de retorno HPLC num gradiente de acetonitrilo/água (vidê Figura 1). A actividade inibitória do factor Xa surge no pico II, exclusivamente. 0 Pico II continha um número de espécies proteicas e foi mai; purificado por uma fase de retorno HPLC utilizando um gradiente isopropanol/água como se mostra na Figura 2. 0 quinto pico (marcado com um asterisco ), continha a mais elevada actividade inibitória do Factor Xa. Este material foi purificado até atingir uma aparente homogeneidade como se mostra na Figura 5, mediante a utilização dum HPLC gradiente acetonitrilo/água, produzindo antistasina (Fase 2).

B.- Análise Estrutural

A composição aminoácida de antistasina (Fase 2) es tá no Quadro 5· A antistasina foi hidrolizada com 6 N HC1 du rante 24 horas e analizada num Analizador de Aminoacidos Bec kman.

Sujeitou-se a antistasina (Fase 2) a uma análise

sequencial de aminoácidos num sequênciador em fase gasosa dí. firma Applied Biosystems. Bloqueou-se a proteína intacta e o seu término amino tornou-a resistente à análise de sequência. Do mesmo modo, ela ficou reduzida a carbóximetilada para modificar os resíduos de cisteína sendo finalmente cliva da com enzima proteolítico, V8 protease, que cliva em resíduos ácidos glutâmicos. Produziram-se aproximadamente 10 fra gmentos péptidos de antistasina (Fase 2) por meio desta reac ção de clivagem e purificaram-se por uma fase de retorno HPLC utilizando um gradiente acetonitrilo/água. A sequência de aminoácidos de um destes fragmentos é:

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Neste fragmento particular encontrou-se uma pequena contaminação com outras sequências. Contudo, um resultado não confirmado foi a presença de sequências homólogas nou tros fragmentos, isto é, substituições de conservação noutro lugar na sequência da antistasina.

Quadro 1 * (< ι

Composição de aminoácidos da Antistasina, Pureza da Fase l^k ,

Aminoácidos	nmoles	Quociente	#de Resíduos
ASX	1.74	9.2	9
TER	0.80	4.2	4
SER	1.01	5.3	5
GLX	1.82	9.6	10
PRO	ND^b
GLI	1.87	9.8	10
ALA	0.53	2.8	3
CIS	1.51	8.0	8
VAL	0.46	2.4	2
MET	0.36	1.9	2

.,// “ 11

Quadro 1 (continuação)

Composição de ami no ácidos da Antistasina, Pureza da Fase l\^g

Aminoácidos	nmoles	Quociente	de Resíduo
ILE	0,61	5,2	5
LEU	0,35	4,5	5
TIR	0,34	1,8	2
FEN	0,48	2,5	5
HIS	0,19	1,0	1
LIS	1,44	7,6	8
ARG	1,40	7,4	7
(a)- Media sobre duas determinações, expressas como milimo-
les por	28 ug de proteínas
(b)- ND = não	determinado
	Quadro	,1A
Composição de	aminoácidos da Antistasina, Pureza	da Fase 1,

segunda análise (a)

Amino Ácidos % de Resíduos por I7.OOO ur

ASX	11.1
TER	8.9
SER	8.7
GLX	15-5
PRO	12.2
GLI	17.4
ALA	6.5
CIS	ND
VAL	4.3
MET	2.2
ILE	4.3
LEU	6.3
TIR	29.0

QUADRO IA (Continuação)

Composição de aminoácidos da Antistasina, Pureza	da Fase 1
segunda análise (a)
Amino Ácidos	% de Resíduos por	o o o • Οι—1
FEN	4.5
HIS	3.5
LIS	3-9
ARG	12.6

(a) - analizaram-se 464 ng de proteínas (b) - ND = não determinado

Quadro 2 % de Inibição das Colónias Tumorígenas do Pulmão pela Antistasina, Pureza da Fase 1

Amostra	Quantidade Injectada	Numero de Ratos	% de Inibicão^^a)
SGE^)		Experiência 1
1.000	5	100
Antistasina	15	4 Experiência 2	85
SGE	1.000	4	89
Antistasina	62	4 Experiência 3	100
SGE	1.000	7	97
Antistasina	73	7	93
(a)- Calcula	-se a % da	inibição da seguinte	maneira: o núme-

ro médio de tumores pulmonares de animais de controle menos o número médio de tumores pulmonares de animais

tratados, divididos pelo número médio de tumores pulmonares de animais de controle x 1CO. 0 número médio dos tumores pulmonares dos animais de controle estão entre 20-60 tumores por animal. 0 número médio dos animais tratados está entre 0-5 tumores por animal.

(b)- SGE = Extracto cru. da Glândula Salivar da Sanguessuga.

Quadro 3 efeito da Antistasina sobre a Protrombina e Tempos da Tronboplastina parcialmente activada

Adição

Tampão ('c') Antistasina^ '

Tempo de coagulação (Seg.)^^a^

95,6, 12,8

152,1, 82,8

Diferença^)

56,5, 70,0 (a) - Cada valor é a média das duas determinações. Obtiveram·

-se os tempos de coagulação com plasmas humano normal agregado. 0 primeiro tempo de coagulação e 0 segundo tempo da protrombina.

(b) - A diferença é a proteína menos 0 tampão de controle. 0 primeiro valor é 0 que foi calculado para 0 tempo de tromboplastina parcialmente activada e 0 segundo valor é 0 tempo da protrombina.

(c) - Adicionaram-se 2 ug de proteínas, pureza de Fase 1, ao plasma do teste.

Quadro 4 efeito da Antistasina, Fase 1 no tempo de coagulação da

Trombina e Factor Xa
Tempo de	Tempo de
Proteínas (ug) Coagulação	Proteínas	Coagulação
(Seg.)	(ug)	(Seg.)

efeito da Antistasina, Fase 1 no tempo de coagulação da

Trombina e Factor Xa

	Tempo de		Tempo de
Proteínas	(ug) Coagulação	Proteínas	Coagulação
	(Seg.)	(ug)	(Seg.)
	Trombina	Factor	Xa
0	22,9, 22,2^	0	25,9
2,42	31,4, 20,6^	1,21	275,9
		2,42	1369,5

(a)- O primeiro tempo de coagulação foi obtido usando-se 1 mg/ml de fibrogeno como substracto e o segundo tempo obteve-se usando-se como substracto o plasma humano nor mal. Os tempos de coagulação do Factor Xa obtiveram-se usando-se o plasma deficiente do factor x. Os tempos de coagulação são uma média das duas determinações. A trom bina e factor Xa presente nas misturas do ensaio foram 0,30 e 0,10 unidades, respectivamente.

Composição de aminoácidos da Antistasina, Pureza de Fase 2,

Mr - 17.000

Amino Ácidos

Resíduos por Mr = 17.000

ASP	11
TER	5
SER	8
GLU	14
PRO	10
GLI	15
ALA	4
VAL	2

Quadro 5 (Continuação)

Composição de aminoácidos da Antistasina, Pureza de Fase 2, Mr - 17.000

Amino Ácidos Resíduos por Mr = 17.000

ILE	5
LEU	7
TIR	2
FEN	—>
LIS	11
HIS	2
ARG	15
MET	5
CIS	20

Claims

REIVIKDICAÇOgSι lâ. - Frocesso para a preparação de uma proteína com propriedades anticoagulantes e antimetastáticas, bioqui· micamente pura, derivada da glândula salivar da sanguessuga Haementeria officinalis (antistasina), caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em

a) dissecar-se e remover-se o tecido da glândula salivar da referida sanguessuga;

b) homogeneizar-se e solubilizar-se o mencionado tecido de glândula salivar numa solução aquosa contendo um sal tamponizado tendo um valor fixo de pH a 7,8 de maneira a obter-se um homogeneizado; e

c) centrifugar-se o mencionado homogeneizado de modo a obtei·-se fracções sobrenadantes da suspensão de proteína e, mediante ensaio dos citados sobrenadantes, escolher-se as fracções do produto caracterizadas por inibirem o factor de coagulação Xa, sendo a referida fracção sobrenadan te com uma força de pelo menos 100 000 g durante pelo menos uma hora e sendo a mencionada fracção sobrenadante a 100 000 g ainda tratada posteriormente por meio das operações que consistem em

d) colocar-se a mencionada fracção sobrenadante em contacto com uma coluna com enchimento de heparina-agarose equilibrada com tampão de tris-(hidroximetil)-aminometano (tris de pH 8,7;

e) separar-se as fracções que contém proteínas que não são adsorvidas na citada coluna das fracções que são adsorvi das na referida coluna; e

f) escolher-se das mencionadas fracções adsorvidas as que contem uma proteína com propriedades anticoagulantes.
2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca racterizado pelo facto de compreender ainda as operações que consistem em

g) eluir-se uma primeira porção das citadas fracções adsorvidas usando uma solução de sal tamponizada até deixar de se detectar absorvância espectrofotométrica a 280 nm; e

h) eluir-se uma segunda porção das referidas fracções adsorvidas usando uma fase líquida de eluição em gradiente com preendendo tampão de tris 20 milimolar e NaCl molar em tampão de tris; e ensaiar-se as fracções eluídas para iden tificar uma fracção do eluido que possua actividade anticoa gulante.
3â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, ca racterizado pelo facto de incluir as operações que consistem

i) concentrar-se as mencionadas fracções do eluido que têm actividade anticoagulante por centrifugação através de ultrafiltros que tem limites de exclusão do peso molecular de cerca de 12 000;

des-salinizar-se a citada fracção do eluido concentrado;

k) adsorver-se a referida fracção de seluido concentrado des-salinizada numa coluna de permuta de aniões Mono-Q; e

l) eluir-se a mencionada fracção adsorvida com um gradiente em degraus de NaOl compreendido entre 0,10 e 0,30 molar em solução de tampão de tris, de maneira a obter-se antis tasina.
4a. - Processo de acordo com a reivindicação 3» ca racterizado pelo facto de, a partir das glândulas salivares de Haementeria officinalis, se obter uma proteína bioquímica mente pura (antistasina) que tem um peso molecular igual a cerca de 17 000 um ponto isocléctrico igual a 9,5 e a capa cidade de inibir ou demorar a coagulação do sangue por inibição selectiva de factor de coagulação Xa.
5*. - Processo de acordo com a reivindicação 4, cí. racterizado pelo facto de a citada proteína assim obtida pos suir propriedades antimetastáticas.
6&. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca racterizado pelo facto de a referida fracção contendo a proteína possuir a actividade inibitória em relação ao factor de coagulação Xa.
7^. - Processo para a preparação de polipeptidos de antistasina, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter um ou mais polipeptidos cada um dos quais inibe ou atrasa a coagulação do sangue por inibição do factor de coagulação Xa, tendo cada um um peso molecular de cer ca de 17 000, um ponto isofcléctrico igual a cerca de 9,5 θ uma sequência parcial de aminoácidos constituída por

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ou substituições que a conservam.
8â. - Processo para a preparação de polipeptidos de antistasina, caracterizado pelo facto de, como produto final, se obter um ou mais polipeptidos que inibem ou atrasam a coagulação do sangue por inibição selectiva do factor de coagulação Xa, possuem o peso molecular igual a 17 000, um ponto isoeléctrico igual a cerca de 9,5 e uma sequência parcial de aminoácidos constituída por

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9ã. - Processo para obtenção dum fragmento de qual- 19 - quer dos polipéptidos de antistasina, caracterizado pelo fac to de o referido fragmento consistir essencialmente em oligo péptidos ou curtos péptidos com sequências de 5 ou mais ami noácidos que são as sequências dos polipéptidos de acordo com as reivindicações 7 ou 8.
10^. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento ou a profilaxia de doenças relacionadas com a trombose, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de polipéptidos de antistasina de acordo com as reivindicações 7 ou 8 ou seus fragmentos de acordo com a reivindicação 9, com as substâncias veiculares ou auxiliares farmaceuticamente aceitáveis.

llã. - Método para o tratamento de mamíferos para evitar a formação de metástases, caracterizado pelo facto de se administrar diariamente a um mamífero que precisa esse tratamento uma quantidade de antistasina bioquimicamente pura de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9 de preferência, compreendida entre cerca de 0,5 θ 1 miligrama de substância activa por dia.
12â. - Método para o tratamento de mamíferos para prolongar o tempo de coagulação do sangue, caracterizado pelo facto de se administrar diariamente a um mamífero que pre cisa esse tratamento uma quantidade de antistasina bioquimicamente pura de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9> de preferência compreendida entre cerca de 0,5 θ 1 miligrama de substância activa por dia.