CN114262727B - 一种地龙中纤溶活性多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地龙中纤溶活性多肽及其制备方法，该方法包括如下步骤：步骤一，取地龙鲜品冻干粉，加入NH4HCO3溶液超声辅助提取，3K滤膜超滤，收集分子量大于3K的组分得到地龙蛋白；步骤二，地龙蛋白中加入碱性蛋白酶，酶解产物通过10K滤膜超滤，收集小于10K的组分得到酶解多肽；步骤三，将酶解多肽溶解于Tris‑HCl中，然后加载到HiPrep16/10DEAE FF预装柱，梯度洗脱，收集每个馏分，冷冻干燥后测定抗凝活性；步骤四，取抗凝活性最高的馏分加载到凝胶Sephadex G‑10色谱柱，超纯水洗脱，取第一组馏分即得所述纤溶活性多肽。本发明制备得到的HEPLPEP、EYPLPEP，为首次从地龙蛋白中酶解纯化分离得到，富含脯氨酸，不含赖氨酸、精氨酸，不易在肠胃道被胰蛋白酶等水解酶水解，具有良好的溶栓活性。
Description
技术领域
本发明涉及纤溶活性多肽制备技术领域，尤其涉及一种地龙中纤溶活性多肽及其制备方法。
背景技术
地龙是我国的一味传统中药，具有清热定惊、平喘利尿、活血通络的功效。2020版《中国药典》收载地龙来源为钜蚓科参环毛蚓Pheretima aspergillum、通俗环毛蚓P.vulgaris、威廉环毛蚓P.aguillelmi或栉盲环毛蚓P.pectinifera的干燥体。地龙化学成分主要有氨基酸、蛋白质、多肽、核苷、有机酸、脂质等，尤其是地龙蛋白占地龙干体的55％～68％，现代研究发现地龙蛋白具有抗凝血、抗菌、神经保护等多方面的药理作用，常用于治疗中风等心脑血管疾病。
目前报道，地龙中纤溶活性成分为蚓激酶，现在常见的用于治疗血栓的蚓激酶类中成药有蚓激酶肠溶片，蚓激酶肠溶胶囊。虽然有文献报道蚓激酶可以通过肠道细胞的胞吞作用吸收，但蛋白主要还是肠胃道消化酶作用水解为小分子肽段和氨基酸，然后经过小肠吸收进入血液循环。因此对地龙蛋白水解得到活性肽的研究具有实际意义。
生物活性肽对身体产生有益影响，对人类健康产生作用，越来越收到人们的关注。由于蛋白质的在体内的很多药理作用是由蛋白质释放出的的多肽实现的。这些生物活性肽具有抗高血压、抗菌、抗血栓形成、免疫调节、阿片类药物、抗氧化等作用。随着酶工程技术的飞速发展，对蛋白质进行酶解改性以改善其功能性质，获得高活性物质，制备生物活性肽也成为了近年来的研究热点。
目前，生物活性肽主要通过蛋白水解酶酶解或微生物发酵制备，但由于自然界中发现的这些肽的含量非常少，具有活性的肽也可以化学合成。由于酶解法具有安全性高、条件温和、过程易控等优势而成为获得生物活性肽的首选方法。酶解法是将蛋白质在特定的pH值和温度下进行酶促处理。常用来制备生物活性肽的蛋白水解酶有碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。所用蛋白酶和酶水解时间的选择对于释放出的生物活性肽的类型有一定影响，例如，与枯草杆菌蛋白酶水解的蛋白质相比，用杆菌溶素比枯草杆菌蛋白酶水解的大米蛋白质显示出更强的抗炎和抗酪氨酸酶活性。
因此，研究适合酶解地龙蛋白的蛋白酶、酶解条件、分离纯化得到纤溶活性多肽的方法，最终得到抗凝血活性优异的地龙中纤溶活性多肽是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种地龙中纤溶活性多肽及其制备方法，以抗凝血活性作为该纤溶活性多肽的评价指标。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明第一方面是提供一种地龙中纤溶活性多肽的制备方法，以抗凝血活性作为所述纤溶活性多肽的评价指标，包括如下步骤：
步骤一，取地龙鲜品冻干粉，加入NH4HCO3溶液超声辅助提取30-60min，离心，于沉淀中加NH4HCO3溶液超声辅助提取30-60min，合并上清液，3K滤膜超滤，收集分子量大于3K的组分得到地龙蛋白；
步骤二，取步骤一所得的地龙蛋白用NaCl溶液溶解，加入碱性蛋白酶，在pH 9-10、温度55-60℃条件下，超声辅助酶解8-10小时，酶解产物通过10K滤膜超滤，收集小于10K的组分得到酶解多肽；
步骤三，将步骤二得到的酶解多肽溶解于10mM Tris-HCl中，然后加载到HiPrep16/10DEAE FF预装柱，流动相A为20mM的Tris-HCl溶液，其pH＝8.0，流动相B为20mM的Tris-HCl溶液，并含有1M NaCl，pH＝8.0，梯度洗脱，收集每个馏分，冷冻干燥后测定抗凝活性；
步骤四，取抗凝活性最高的步骤三所得馏分加载到凝胶Sephadex G-10色谱柱，超纯水洗脱，取第一组馏分即得所述纤溶活性多肽。
进一步地，所述NaCl溶液的质量浓度为0.9％。
进一步地，步骤二中，在pH＝9、温度55℃条件下酶解。
进一步地，步骤二中，超声辅助酶解8小时。
进一步地，步骤二中，所述碱性蛋白酶与地龙蛋白的质量比为1：50。
进一步地，步骤三中，所述梯度洗脱具体为：
进一步地，步骤三中，洗脱流速3ml/min，波长214nm。
本发明第二方面是提供一种上述制备方法制备得到的纤溶活性多肽。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明采用碱性蛋白酶进行纤溶活性多肽的提取，显著提高了地龙蛋白的水解度与酶解活性效率。
纤溶活性多肽是小分子化合物，容易进入血液循环系统发挥溶栓活性，且安全性高。纤溶活性多肽主要氨基酸组成为脯氨酸、谷氨酸。本发明制备得到的HEPLPEP、EYPLPEP，为首次从地龙蛋白中酶解纯化分离得到，富含脯氨酸，不含赖氨酸、精氨酸等，不易在肠胃道被胰蛋白酶等水解酶水解，体外研究实验表明具有良好的溶栓活性。
附图说明
图1为纤溶活性多肽UPLC-HRMS图；
图2为多肽HEPLPEP的MS2图；
图3为多肽EYPLPEP的MS2图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供一种地龙中纤溶活性多肽的制备方法，以抗凝血活性作为上述纤溶活性多肽的评价指标，包括如下步骤：
步骤一，取地龙鲜品冻干粉，加入NH4HCO3溶液超声辅助提取30min，离心，于沉淀中加NH4HCO3溶液超声辅助提取30min，合并上清液，3K滤膜超滤，收集分子量大于3K的组分得到地龙蛋白；
步骤二，取步骤一所得的地龙蛋白用NaCl溶液(质量浓度0.9％)溶解，加入碱性蛋白酶，在pH 9、温度55℃条件下，超声辅助酶解8小时，酶解产物通过10K滤膜超滤，收集小于10K的组分得到酶解多肽；其中，碱性蛋白酶与地龙蛋白的质量比为1：50(w/w)；
步骤三，将步骤二得到的酶解多肽溶解于10mM Tris-HCl中，然后加载到HiPrep16/10DEAE FF预装柱，流动相A为20mM的Tris-HCl溶液，其pH＝8.0，流动相B为20mM的Tris-HCl溶液，并含有1M NaCl，pH＝8.0，梯度洗脱，波长214nm，流速3ml/min，收集每个馏分，冷冻干燥后测定抗凝活性；
梯度洗脱具体为：
步骤四，取抗凝活性最高的步骤三所得馏分加载到凝胶Sephadex G-10色谱柱，超纯水洗脱，取第一组馏分即得纤溶活性多肽。
本实施例中，采用纤溶酶抑制剂试剂盒(荧光法)测定酶解多肽纤溶活性：取50μl地龙多肽样品，加入40μl纤溶酶底物，孵育20min，37℃(Ex/Em＝360/405nm)测定荧光强度。
本实施例中，采用纤维蛋白原-凝血时间法(FIB-TT)测定纤溶活性多肽的抗凝血活性：取10μl样品与1mg/ml的纤维蛋白原混合孵育2min，加入4BP/ml的凝血酶溶液，采用半自动凝血仪测定凝固时间。以生理盐水为阴性对照，蚓激酶为阳性对照。
实施例2
本实施例提供了采用UPLC-HRMS法识别纤溶多肽：
将上述实施例1制备的纤溶活性多肽组分溶解在0.1％甲酸(v/v)中，液相方法：C18柱(5μm，100μm，100μm×1cm)(Thermo Fisher Science)，流动相(A)1％甲酸，流动相(B)80％ACN(1％甲酸)，RP柱Accept PepMap RSLC 75μm×150mm，C18，2μm，100μ(ThermoFisher Science)，流速为300nL/min，4％B到35％B的90min的线性梯度。质谱方法：2kV的喷雾电压和200℃的毛细管温度，DDA数据采集方式，正模式分析多肽，在m/z 200-2000的扫描范围内选择+1到+5的电荷，30％HCD碰撞能量，其基峰离子色谱图如图1所示。数据处理：用PEAK软件处理数据。峰面积在E+07以上，Denovo Score>80分的肽鉴定到39个(表1)，峰面积E+08以上，Denovo Score>80肽鉴定到4个。
表1
对酶解出的纤溶活性肽Blast检索进一步验证多肽专属性，其中峰强度前三的多肽检索到的蛋白描述为：LLAPP没有检索到蛋白，HEPLPEP，EYPLPEP等检索到蛋白多为假设蛋白或未表征蛋白，HEPLPEP，EYPLPEP二级质谱峰归属如图2-3所示。
HEPLPEP溶栓活性(抗凝血活性)测定：
将质谱鉴定的峰强度最高的肽HEPLPEP人工合成(吉尔生物)，配制成0.2mg/ml多肽溶液，采用纤维蛋白原-凝血时间法(FIB-TT)测定HEPLPEP溶栓活性。取10μl样品与1mg/ml的纤维蛋白原混合孵育2min，加入4BP/ml的凝血酶溶液，采用半自动凝血仪测定凝固时间。以生理盐水为阴性对照，蚓激酶为阳性对照。生理盐水凝固时间为7.57±0.25秒，蚓激酶(0.5mg/ml)凝固时间29.97±0.83，HEPLPEP凝固时间48.7±6.06。
上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容及图示所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种地龙中纤溶活性多肽的制备方法，以抗凝血活性作为所述纤溶活性多肽的评价指标，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，取地龙鲜品冻干粉，加入NH4HCO3溶液超声辅助提取30-60min，离心，于沉淀中加NH4HCO3溶液超声辅助提取30-60min，合并上清液，3K滤膜超滤，收集分子量大于3K的组分得到地龙蛋白；
步骤二，取步骤一所得的地龙蛋白用NaCl溶液溶解，加入碱性蛋白酶，在pH 9、温度55℃条件下，超声辅助酶解8-10小时，酶解产物通过10K滤膜超滤，收集小于10K的组分得到酶解多肽；所述碱性蛋白酶与地龙蛋白的质量比为1：50；
步骤三，将步骤二得到的酶解多肽溶解于10mM Tris-HCl中，然后加载到HiPrep16/10DEAE FF预装柱，流动相A为20mM的Tris-HCl溶液，其pH＝8.0，流动相B为20mM的Tris-HCl溶液，并含有1M NaCl，pH＝8.0，梯度洗脱，收集每个馏分，冷冻干燥后测定抗凝活性；
所述梯度洗脱具体为：
步骤四，取抗凝活性最高的步骤三所得馏分加载到凝胶Sephadex G-10色谱柱，超纯水洗脱，取第一组馏分即得所述纤溶活性多肽；所述纤溶活性多肽的序列为HEPLPEP或EYPLPEP。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，超声辅助酶解8小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，洗脱流速3ml/min，波长214nm。
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Non-Patent Citations (2)
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| Marker peptide screening and species-specific authentication of Pheretima using proteomics;Yufan Gu等;Analytical and Bioanalytical Chemistry;第413卷;3167-3176 * |
| 基于纳升高效液相色谱-四极杆-线性离子阱-静电场 轨道阱高分辨质谱技术研究广地龙中的蛋白质;董洪霜;中国中药杂志;第44卷(第2期);324-331 * |
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