CN110627855B - 龙纳霉素及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了龙纳霉素及其制备方法和应用，所述的龙纳霉素源于南海永兴岛附近10米海底沉积物中分离出的海洋放线菌Nocardiopsis sp.的固体发酵产物。实验研究结果表明，本发明所述龙纳霉素对乳腺癌细胞系SUM1315和M468具有较强的细胞毒活性，可进一步用于制备抗癌药物。

Description

龙纳霉素及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一类龙纳霉素及其制备方法和应用。
背景技术
我国丰富的海洋生物资源在国民经济和人民生活中占有重要的地位，是潜在新药发现的资源宝库。在所有能够生产药物的天然资源中，海洋生物资源已成为最后、也是最大的一个极具开发潜力的领域。在过去的近半个世纪的海洋生物药物先导化合物发现研究中，国内多个研究机构和研究小组已对我国近海部分海洋生物进行了相当系统的天然产物化学及生物活性研究，发现了一大批新颖骨架化合物和具有新药开发潜力的高活性先导化合物和候选药物，部分成分正在进入临床前研究过程中。
海洋生物资源由于样品采集困难等因素，近年来虽有少量化学和生物学的研究报道，但基本尚处于待研究开发状态，在海洋生物物种多样性与分布、海洋生物化学多样性与生物学功能等多个方面的研究还比较落后，这种现状已成为我国深远海海洋生物资源开发利用的瓶颈。对特殊生境海洋生物新资源进行深度挖掘和系统研究，已成为研究开发具有我国自主知识产权的新药的主要途径之一。
发明内容
本发明首次从南海永兴岛附近10米海底沉积物中分离出海洋放线菌Nocardiopsis sp.，从其发酵产物中发现了一个新的活性物质龙纳霉素(loongmycin)，体外活性实验表明，该化合对乳腺癌细胞系SUM1315和M468具有较强的细胞毒活性。
本发明具体技术方案如下：
化合物龙纳霉素，具有如下结构式：
Figure BDA0002200399540000011
本发明所述的龙纳霉是利用拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.菌种通过固体发酵提取得到，优选的，拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.菌种选自保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏日期2019年8月22日，保藏编号为CGMCC No.18412的菌株。
本发明另一目的在于提供所述的龙纳霉素的制备方法，包括以下步骤：
(1)将拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.菌种发酵培养(优选26～30℃培养7天)；优选的，将Nocardiopsis sp.菌种(优选生物保藏编号为CGMCC No.18412的拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.菌种)在添加了NaCl 4g/L和NH4Br 4g/L平板ISP2培养基上于26～30℃培养7天；
(2)将步骤(1)所得培养基烘干、甲醇萃取，浓缩得到浸膏F1；
(3)对浸膏F1进行凝胶柱层析，优选凝胶柱为Sephadex LH-20，用纯甲醇进行洗脱，得到3个组分
(4)将第二出峰组分经HPLC分离纯化制得式(I)所示化合物。
步骤(4)中HPLC色谱条件为：使用反相色谱柱，流动相A：乙腈，流动相B：水，梯度洗脱程序为：
Figure BDA0002200399540000021
优选的，步骤(4)中，HPLC分离纯化过程如下：semi-HPLC半制备反相高效液相色谱：ODS-2Hypersil colum，5μm，250mm×10mm，流动相为：乙腈-水体积比＝1：4～4：1，以2mL/min流速梯度洗脱20min。泵的型号可以为Hitachi pump L-7100，紫外灯的型号可以为UV detector L-7400。
本发明的另一目的为提供一种拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.菌种，本发明上述制备方法中使用的Nocardiopsis sp.系从南海永兴岛附近10米海底沉积物中分离、纯化得到，特征为：在ISP2平板上，培养初期基内菌丝为白色，易产生单个菌落，一周后开始产生白色孢子，划线不连续气生菌丝白色。该菌种已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18412，保藏日期2019年8月22日，分类命名：拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
有益效果：
本发明首次从南海永兴岛附近10米海底沉积物中分离出的海洋放线菌Nocardiopsis sp.CGMCC 184122，并从其发酵产物中首次发现了龙纳霉素(loongmycin)，体外活性实验表明，该化合物对乳腺癌细胞系SUM1315和M468具有较强的细胞毒活性，可进一步用于制备抗癌药物。
附图说明
图1为本发明龙纳霉素HPLC色谱图。
图2为本发明龙纳霉素对乳腺癌细胞系SUM1315和M468具有较强的细胞毒活性的实验结果图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：Nocardiopsis sp.CGMCC 184122的分离、纯化与鉴定
将来自南海永兴岛附近10米海底沉积物中风干后，用无菌水研磨，并梯度稀释成3个梯度10-1，10-2，10-3，分别取各梯度稀释液200μl涂布于高氏一号培养基(可溶性淀粉20g、KNO3 1g、NaCl 0.5g、K2HPO4·3H2O 0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂15-25g、蒸馏水1L，PH7.4～7.6)中，置于28℃恒温箱中培养，待菌落长出(约十天后)，用竹签挑取单菌落用四区划线法接到高氏平板中进行纯化培养，得到蜜蜂内生放线菌。在ISP2平板上，培养初期基内菌丝为白色，易产生单个菌落，一周后开始产生白色孢子。经过形态及16SrRNA鉴定该菌为拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.。将该菌命名为Nocardiopsissp.NA01583，并于2019年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.18412。
实施例2：Nocardiopsis sp.CGMCC 18412的固体发酵
将菌株Nocardiopsis sp.CGMCC 18412转接至分别添加了NaCl 4g/L和NH4Br 4g/L平板ISP2培养基上，在28℃进行发酵7天。
实施例3：龙纳霉素的提取与分离
实施例2中所得得培养基烘干、甲醇萃取，浓缩得到浸膏F1。对浸膏F1进行凝胶柱层析，以MeOH作为流动相进行洗脱获得3个出峰组分。将第二出峰组分经过semi-HPLC(色谱柱：Allsphere ODS-2.5mm column)，乙腈-水体系，以2mL/min流速，乙腈-水体积比＝1:4～4:1(20％到80％)梯度洗脱20min，制得本发明所述loongmycin(100mg)。泵的型号可以为Hitachi pump L-7100，紫外灯的型号可以为UV detector L-7400。
实施例4：龙纳霉素的结构鉴定
本发明所述龙纳霉素的结构是基于它们的质谱、核磁共振谱确定的。
龙纳霉素的1H和13C NMR数据见以下列表：
表1.1H and 13C NMR data for loongmycin
Figure BDA0002200399540000041
Loongmycin结构如下：
Figure BDA0002200399540000042
实施例5：活性试验
实验材料：乳腺癌细胞系SUM1315和M468，MTT试剂盒，PBS buffer，TritonX 100(0.5％)，PI，RnaseA。
实验方法：
1)、MTT初筛化合物方法
乳腺癌细胞系SUM1315和M468在对数生长期时消化计数，以3×103个/well的密度接种于96孔培养板中，体系100μl。待细胞贴壁后，加入化合物每孔终浓度1μm，体系200μl，37℃培养48h后，每孔加入20μl配置好的MTT(5mg/ml)，继续培养4h，弃上清，每孔加入200μlDMSO，350rpm振荡混匀10min，使用酶标仪在波长570nm处测定吸光度OD值，计算抑制率。
抑制率的计算：
生长抑制率＝(1－存活率)×100％＝[1-(OD实验－OD空白)/(OD对照－OD空白)]×100％(OD空白表示空白组的平均光密度，OD对照表示对照组的平均光密度，OD实验表示测试药物组的平均光密度)。
半数抑制浓度(IC50)定义为当50％的肿瘤细胞存活时的样品浓度。根据测定光密度(OD)值，制作细胞生长抑制率的标准曲线，在标准曲线上求得其对应的样品浓度。
2)、流式检测细胞周期
在乳腺癌细胞系SUM1315和M468细胞种板加药，到特定时间后300g离心10min，加入1mL PBS清洗一次，300g离心10min，然后加入75％乙醇固定过夜，将固定后的细胞1200g离心10min，用PBS洗一遍，每个样品加入100μl TritonX 100(0.5％)，100μl PI，2μlRnaseA避光孵育20min上机检测。
实验结果如图2所示。
对SUM1315的IC50约2μM，M468的IC50约0.2μM。
体外活性实验表明，该化合物对乳腺癌细胞系SUM1315和M468具有较强的细胞毒活性，可进一步用于制备抗癌药物。

Claims (10)

1.化合物龙纳霉素，具有如下结构式：
Figure FDA0002200399530000011
。
2.根据权利要求1所述的龙纳霉素的制备方法，其特征在于拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.菌种通过固体发酵提取得到。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述菌种为生物保藏编号CGMCCNo.18412的拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.菌种。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.菌种用ISP2平板培养；
(2)将步骤(1)所得培养基烘干、甲醇萃取，浓缩得到浸膏F1；
(3)对浸膏F1进行凝胶柱层析，用纯甲醇进行洗脱，得到3个组分；
(4)将第二出峰组分经HPLC分离纯化制得权利要求1所述化合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(1)28℃培养7天。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述凝胶柱为Sephadex LH-20。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中HPLC色谱条件为：使用反相色谱柱，流动相A：乙腈，流动相B：水，梯度洗脱程序为：
Figure FDA0002200399530000012
8.一种拟诺卡氏菌属Nocardiopsis sp.菌种，其特征在于生物保藏编号CGMCCNo.18412。
9.根据权利要求1项所述的龙纳霉素在制备预防或治疗癌症药物中的应用。
10.根据权利要求9项所述的应用，其特征在于所述癌症为乳腺癌。
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