CN108991336A - 环（脯氨酸-缬氨酸）在制备食品防腐保鲜剂中的应用 - Google Patents

环（脯氨酸-缬氨酸）在制备食品防腐保鲜剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物次生代谢产物应用技术领域，具体为环（脯氨酸‑缬氨酸）在制备食品防腐保鲜剂中的应用，也就是将环(脯氨酸‑缬氨酸)作为食品中腐败菌或致病菌的抑制剂，其中腐败菌或致病菌为大肠杆菌。环(脯氨酸‑缬氨酸)作为凝结芽孢杆菌次生代谢产物，属于环二肽类化合物，对多种适配腐败菌和致病菌均具有抑制作用；而且环(脯氨酸‑缬氨酸)在凝结芽孢利用自身独特的生物合成途径中能大量被产生，易于制备；同时环(脯氨酸‑缬氨酸)对大肠杆菌的最低抑菌浓度为5μg/mL，其抑制作用显著强于目前已商业化的一线防腐保鲜剂乳酸链球菌素Nisin。该化合物具有潜在开发成为食品防腐保鲜剂的价值，并能产生巨大的社会和经济效益。

Description

环(脯氨酸-缬氨酸)在制备食品防腐保鲜剂中的应用
技术领域
本发明涉及微生物次生代谢产物应用技术领域，具体为环(脯氨酸-缬氨酸)在制备食品防腐保鲜剂中的应用。
背景技术
大肠杆菌也称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，分类于肠杆菌科，属于埃希氏菌属，革兰氏阴性无芽孢杆菌，作为人、动物肠道中的正常菌群附着在肠道中，并随着人和动物肠道的排泄物排出体外，从而分散到自然环境中，该菌在自然界中的生命力强，在土壤、水中可存活数月之久。一旦食品被检测出含有大肠杆菌就意味着食品可能直接或间接受到了粪便的污染。卫生学上，将大肠杆菌作为饮用水、食品等粪源性污染指示菌，因而在食品中抑制大肠杆菌的生长，对食品实际的生产和安全有着重大的意义。
近年来，由于大肠杆菌引发的食品安全事件层出不穷，每年由大肠杆菌引发的病例多达6.4亿。在我国，大肠杆菌是引起我国居民腹泻的首要病源，因此采用科学有效的方法，快速抑制大肠杆菌，减少食品腐败变质是提升食品安全的有效途径，同时也是确保我国居民生命安全的必要措施。
环(脯氨酸-缬氨酸)(Cyclo-(Pro-Val)，E-8)为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属)的次生代谢产物，分子式为C10H16N2O2；分子量：196.25；CAS登录号：5654-87-5，结构式为：
Faouzi F等学者在文献“DD-diketopiperazines:antibiotics active againstVibrio anguillarum isolated from marine bacteria associated with cultures ofpecten maximus”中报道了环二肽Cyclo(Pro-Tyr)、Cyclo(Phe-Pro)、Cyclo(Pro-Val)和Cyclo(Leu-Pro)具有抗鳗弧菌的作用，MIC分别为0.07、0.03、0.05、0.05μg/mL。但现有技术中缺少环(脯氨酸-缬氨酸)对食品中食源性病原菌的抑制效果的报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术的不足，提供一种环(脯氨酸-缬氨酸)在制备食品防腐保鲜剂中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
环(脯氨酸-缬氨酸)在制备食品防腐保鲜剂中的应用。
优选的，环(脯氨酸-缬氨酸)作为食品中腐败菌或致病菌的抑制剂。
优选的，腐败菌或致病菌为大肠杆菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、环(脯氨酸-缬氨酸)作为凝结芽孢杆菌次生代谢产物，属于环二肽类化合物，对多种适配腐败菌和致病菌均具有抑制作用；而且环(脯氨酸-缬氨酸)在凝结芽孢利用自身独特的生物合成途径中能够大量被产生，易于制备；
2、环(脯氨酸-缬氨酸)对大肠杆菌的最低抑菌浓度为5μg/mL，对大肠杆菌具有明显的抑制作用，其抑制作用显著强于乳酸链球菌素Nisin。乳酸链球菌素Nisin作为唯一已商业化的一线防腐保鲜剂，其对革兰氏阴性菌的抑制作用极差，大大限制了其在防腐保鲜领域的应用范围，本发明所涉及的化合物环(脯氨酸-缬氨酸)有效地填补了其在该方面应用的空白。该化合物具有潜在开发成为食品防腐保鲜剂的价值，并能产生巨大的社会和经济效益。
附图说明
图1为环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8)对大肠杆菌的最低抑菌浓度数据图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式例对本发明进行详细描述。本发明的范围并不受限于该具体实施方式。
实施例1
环(脯氨酸-缬氨酸)对大肠杆菌的抑菌实验
1实验用品
1.1实验药品
抑菌剂(环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8))。
1.2实验使用的菌种
大肠杆菌E.coli(肠杆菌科，埃希氏菌属细菌)。
1.3实验使用的试剂
甲醇，LB培养基。
1.4实验使用的仪器及设备
超净工作台、普通冰箱、Milli-Q超纯水器、涡旋混合器、电热恒温水浴锅、TGL-16G型离心机、手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器、培养皿、点样瓶、96孔板、Multiskan MK3酶标仪(Thermo Electron)、LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)、DELTA 320型pH计(Mettler-Toledo)、电子天平(Mettler-Toledo)。
2实验方法
2.1主要试剂的配置
LB培养基的配置：1L水中加入酵母提取物5克、蛋白胨10克、氯化钠10克
环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8)母液的配置：用1mL溶解1mg E-8
2.2抑菌圈实验
2.2.1指示菌(大肠杆菌)的培养
①分离单菌落，将灭菌后的LB培养基倒平板，每个培养皿约15mL，将保藏的大肠杆菌划线于配制好的LB平板，倒置，并于37℃恒温培养箱中培养24h；
②挑单菌落于试管中置于37℃，200r/min摇床中培养12h。
2.2.2抑菌圈试验
①取100mL LB半固体培养基55℃水浴加热30min，将培养皿分四块区域，做好标记1，2，3，4；(1为空白对照)；
②将培养好的大肠杆菌配制为1％(体积比)的菌液，摇匀并倒平板，每个平板15mL菌液，冷却15min，其中大肠杆菌作为标示抑菌效果的指示菌；
③用100％甲醇溶解待测抑菌剂，稀释成不同浓度(具体浓度数值0、1、3、5、10μg/mL)，在标记处用点样器点样10μL；待抑菌剂样品自动会发干后，正放置于37℃恒温培养箱中过夜培养；
④第二天观察抑菌效果。
2.3最低抑菌浓度(MIC)测定试验
2.3.1指示菌(大肠杆菌)的培养
①分离单菌落同2.2.1；
②挑取指示菌单菌落至10mL LB液体培养基中，放置于37℃，200r/min的摇床中过夜培养。
2.3.2测最低抑菌浓度(MIC)
①将抑菌剂(环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8))母液取出于4℃融化，母液浓度1μg/μL；
②将母液用甲醇稀释为0.1μg/μL的工作液(800μL工作液＝80μL母液+720μL甲醇)；
③取五根试管，标号1，2，3，4，5，每根管中加入2mL的LB液体培养基；
④取培养后的菌液，用酶标仪测出OD值，计算LB液体培养基要加入的菌液量为360μL；
⑤向各个试管中加入不同浓度(0、1、3、5、10μg/mL)的抑菌物质，使抗菌物质在各试管中的终浓度成梯度递增趋势；
⑥将试管置于37℃，200r/min的摇床中培养5h；
⑦在超净台中，每根试管中取100μL点样于96孔板，每只试管平行取样两次；用酶标仪测OD值。
3试验结果
表1为不同浓度的环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8)对大肠杆菌的抑菌效果数据表，图1为环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8)对大肠杆菌的最低抑菌浓度数据图。从表1可以看出，环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8)对大肠杆菌具有一定的抑制作用，且不同浓度的环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8)对大肠杆菌的抑菌效果不同，随着环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8)浓度的增加，其抗菌效果呈现先逐渐升高，再逐渐降低的趋势。从图1中可以看出环(脯氨酸-缬氨酸)(E-8)对大肠杆菌的最低抑菌浓度MIC为5μg/mL。
表1不同浓度的环(脯氨酸-缬氨酸)对大肠杆菌的抑菌效果数据表
实施例2
环(脯氨酸-缬氨酸)应用于苹果汁的防腐实例
取新鲜苹果，洗净、去皮、榨汁，分装于两个灭菌的三角瓶中，每瓶100mL向其中一个三角瓶中加入0.05g环(脯氨酸-缬氨酸)，混匀后，分装于5支无菌试管中，另一个三角瓶中不添加任何物质，也分装于5支无菌试管中。将10支无菌试管放置于37℃的条件下培养，每周观察苹果汁的感官品质和测定菌落总数变化。连续观测五个月，发现不添加任何物质的苹果汁原液在实验开始6天后均长满菌，呈腐败状态，而添加了环(脯氨酸-缬氨酸)的苹果汁感官品质没有任何变化。说明环(脯氨酸-缬氨酸)能有效抑制环(脯氨酸-缬氨酸)中微生物的生长，使食品饮料的保鲜期延长。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.环(脯氨酸-缬氨酸)在制备食品防腐保鲜剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的环(脯氨酸-缬氨酸)在制备食品防腐保鲜剂中的应用，其特征在于，所述环(脯氨酸-缬氨酸)作为食品中腐败菌或致病菌的抑制剂。
3.根据权利要求2所述的环(脯氨酸-缬氨酸)在制备食品防腐保鲜剂中的应用，其特征在于，所述腐败菌或致病菌为大肠杆菌。
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