CN106119220A

CN106119220A - 一种催化活性和对映归一性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体

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Publication number: CN106119220A
Application number: CN201610534520.XA
Authority: CN
Inventors: 邬敏辰; 叶慧华; 胡蝶; 石小玲; 吴芹; 李剑芳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2016-07-07
Filing date: 2016-07-07
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2036-07-07
Also published as: CN106119220B

Abstract

本发明公开了一种催化活性和对映归一性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。本发明在具有一定对映归一性催化特性的环氧化物水解酶基础上，通过定点突变生物技术改造环氧化物水解酶分子结构，得到一株催化活性和对映归一性均提高的环氧化物水解酶突变体PvEH1^{L105I/M160A/M175I}。突变体具有高对映归一择性、高催化活性的优点，有较大应用潜力，也为EH的研究奠定了理论基础。

Description

一种催化活性和对映归一性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体

技术领域

本发明涉及一种催化活性和对映归一性提高的菜豆环氧化物水解酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达领域。

背景技术

手性邻二醇是一类高附加值的多功能合成子，用于药物、精细化学品、农药和功能性材料等的合成。环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs)能催化外消旋环氧化物的对映归一性水解，将底物完全转化为相应的单一构型，具有绿色、经济等优点。外消旋环氧化物的对映归一性水解可以通过一种具有互补的对映选择性和区域选择性的环氧化物水解酶实现。

目前已报道的具有单一对映归一性催化特性的环氧化物水解酶有三种，分别来源于土豆、绿豆和新月柄杆菌。随着基因工程技术和高通量筛选技术的发展，对已知的环氧化物水解酶进行定向改造是丰富此类酶的重要途径。近年来，分子生物学技术，如定点突变、饱和突变、错易PCR和DNA shuffling等也用于改造EH的催化活性、稳定性、对映选择性等性质，并通过高通量筛选获得性质提高的突变酶。如Kotik等对来源于黑曲霉的环氧化物水解酶进行5轮迭代饱和突变后获得一种最优突变酶AnEH^H:12-A1，其催化环氧苯乙烷(SO)的对映归一性水机获得(R)-苯基乙二醇的ee值由野生型的3％提高到70％。然而这种方法随机性高，筛选工作量大，且ee值并不理想。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种催化活性和对映归一性提高的环氧化物水解酶(PvEH1)突变体。

所述突变体是(a)或(b)或(c)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质；

(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有环氧化物水解酶活性的蛋白质。

在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体的基因的核苷酸序列是SEQ IDNO.3所示的序列。

本发明还提供获得所述突变体的方法，是在如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列基础上，将第105位的亮氨酸突变成了异亮氨酸(L105I)，将第160位的蛋氨酸突变成了丙氨酸(M160A)，同时将第175位的蛋氨酸突变成了异亮氨酸(M175I)。

在本发明的一种实施方式中，以携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主；培养宿主使之产环氧化物水解酶突变体。

本发明还提供一种表达所述环氧化物水解酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：以携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为pET28a(+)-pveh1，表达宿主为E.coli BL21(DE3)。

本发明还提供一种应用所述环氧化物水解酶突变体生产(R)-苯基乙二醇的方法，是以所述突变体或表达所述突变体的基因工程菌为催化剂，在磷酸盐缓冲液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄,pH7.5)中催化外消旋环氧苯乙烷(底物浓度为10mM)生成(R)-苯基乙二醇。产物ee值为87.8％。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲体系可以是单水相或者水相与有机相构成的双相体系。

本发明在具有一定对映归一性催化特性的环氧化物水解酶基础上，通过定点突变生物技术改造环氧化物水解酶分子结构，得到一株催化活性和对映归一性均提高的环氧化物水解酶突变体PvEH1^{L105I/M160A/M175I}，其催化环氧苯乙烷、对硝基环氧苯乙烷、间硝基环氧苯乙烷、对氯环氧苯乙烷、间氯环氧苯乙烷的酶活力分别从野生型PvEH1的1.61、1.3、4.26、7.28和5.16U/g湿菌体提高至7.03、1.74、4.37、8.5和5.83U/g湿菌体，且催化上述底物的转化率均高达100％，获得相应邻二醇产物的ee_p分别从野生型PvEH1的33.6％、50.3％、14.7％、51.4％和1.0％提高至87.8％、64.7％、52.3％、70.9％和69.7％。突变体具有高对映归一性、高催化活性的优点，有较大应用潜力，也为EH的研究奠定了理论基础。

附图说明

图1：环氧化物水解酶催化示意图

具体实施方式

(R,S)-SO购自上海TCI公司；(S)-SO、(R)-SO、(S)-PED和(R)-PED购自上海安耐吉公司；其他试剂均为分析纯。手性气相色谱柱CYCLOSIL-B(30m×0.25mm×0.25μm)为美国Agilent科技公司产品；液相色谱柱OD-H(4.6mmΦ×250mm)为日本Daicel科技公司产品；液相色谱柱C18(4.6mmΦ×250mm)为美国Waters科技公司产品。

实施例1突变酶基因及其表达质粒的构建

将扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因pveh1，扩增产物与pUCm-T连接，转化E.coli JM109，经蓝白斑筛选、SacⅠ酶切鉴定和DNA测序。将测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-pveh1。用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pUCm-T-pveh1，回收pveh1，与经同样双酶切的pET-28a(+)连接，获重组质粒pET-28a(+)-pveh1。

以已知的土豆EH的晶体结构(PDB：2CJP)为模板，同源建模获得PvEH1的三维结构。用AutoDock4.2软件将模型底物分子(R)-SO与PvEH1进行分子对接，统计出催化(R)-SO分子内的氨基酸，同源性分析排除保守位点氨基酸；统计多种植物类EHs以及具有对映归一性特性的EHs的同位点氨基酸的种类和概率，综合以上因素选择将第105位的亮氨酸突变成了异亮氨酸，将第160位的蛋氨酸突变成了丙氨酸，同时将第175位的蛋氨酸突变成了异亮氨酸。基于上面设计的突变位点，设计并合成特异性定点突变引物如下：

L105-F：5-CCATGATTGGGGAGCGATTGTAGGATGGTAC-3'，含突变位点；

L105-R：5-GTACCATCCTACAATCGCTCCCCAATCATGG-3'，含突变位点；

L160-F：5-AGGAACCAGGCAAGGCGGAAACTCTGTATGAC-3'，含突变位点；

L160-R：5-GTCATACAGAGTTTCCGCCTTGCCTGGTTCCT-3'，含突变位点；

L175-F：5-GAAGCAATCAAGAACATTCTGACAAGTAGGAGACC-3'，含突变位点；

L175-R：5-GGTCTCCTACTTGTCAGAATGTTCTTGATTGCTTC-3'，含突变位点；

以L105-F、L105-R为上下游引物，以pET28a(+)-pveh1为模板，利用QuickChange^TM试剂盒进行PCR，转化Escherichia coli BL21(DE3)，利用质粒提取试剂盒获得重组质粒pET28a(+)-pveh1^L105I；(2)L160-F、L160-R为上下游引物，以pET28a(+)-pveh1^L105I为模板，利用QuickChange^TM试剂盒进行PCR，转化E.coli BL21(DE3)，利用质粒提取试剂盒获得重组质粒pET28a(+)-pveh1^L105I/M160A；(3)L175-F、L175-R为上下游引物，以pET28a(+)-pveh1^L105I ^/M160A为模板，利用QuickChange^TM试剂盒进行PCR，转化E.coli BL21(DE3)，利用质粒提取试剂盒获得重组质粒pET28a(+)-pveh1^{L105I/M160A/M170I}；(4)将上一步得到的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)，获得重组工程菌株E.coli BL21-pveh1^{L105I/M160A/M170I}。

将E.coli BL21-pveh1^{L105I/M160A/M170I}单菌落接种于2mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、220r/min培养过夜；取1mL培养液转接于50mL相同的培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，添加IPTG(终浓度0.5mmol/L)，20℃诱导10h。收集菌体，每g湿菌体用10mL磷酸钠缓冲液(Na₂HPO₄-NaH₂PO₄,100mmol/L,pH 7.5)悬浮得到菌悬液。

实施例2突变酶PvEH1^{L105I/M160A/M175I}催化活性的测定

在2mL EP管中加入450μL菌悬液，25℃保温5min，再加入50μL外消旋环氧苯乙烷(rac-SO，终浓度20mmol/L)立即记时反应10min后，取反应液200μL加入1mL甲醇终止反应。微孔过滤后，样品分析采用反相HPLC(Waters,Milford,MA)、C18柱和紫外检测仪。流动相为甲醇/水(70:30，v/v)，流速为0.8mL/min，检测波长为220nm。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟分解1μmol rac-SO所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶的活性单位(IU)。突变酶PvEH1^{L105I/M160A/M175I}催化活性为10.66U/g，相比于野生型酶(1.61U/g)提高了5.6倍。

实施例3对映体纯度和对映选择率的测定

在1.5mL EP管中加入450μL菌悬液和500μL磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，25℃保温5min，再加入50μL rac-SO(终浓度10mmol/L)进行反应。定时取样50μL至1mL乙酸乙酯(含1mmol/L正己醇作为内标)中萃取，样品分析采用气相色谱仪GC-2010(日本Shimadzu公司)、手性气相色谱柱和氢火焰离子化检测器。分析条件为：进样口和检测器温度250℃；初始柱温100℃，以5℃/min升温至195℃；载气为氮气，流速3.0mL/min，分流比1:50。正己醇、(R)-SO((R)-环氧乙烷)、(S)-SO((S)-环氧乙烷)、(S)-PED((S)-苯乙二醇)和(R)-PED((R)-苯乙二醇)的保留时间分别为3.477、5.959、6.065、16.752和16.866min。底物e.e._s＝[(R-S)/(R+S)]×100％；产物纯度e.e._p＝[(R_d-S_d)/(R_d+S_d)]×100％；E＝ln[(1-c)×(1-e.e._s)]/ln[(1-c)×(1+e.e._s)]。其中：R和S表示(R)-和(S)-SO浓度，R_d和S_d表示(R)-和(S)-PED浓度，c表示rac-SO转化率。突变酶PvEH1^{L105I/M160A/M175I}催化水解rac-SO的E为3.6，水解产物(R)-苯乙二醇的e.e._p值为87.8％。相比于野生型酶的催化效果，E提高了1.4倍，e.e._p值提高了1.6倍。

实施例4区域选择性系数的测定

在两支1.5mL EP管中各加入245μL菌悬液和250μL磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，25℃保温5min，再分别加入5μL(S)-和(R)-SO(终浓度5mmol/L)反应2h。α_S＝[R_d ^S/(R_d ^S+S_d ^S)]×100％；β_R＝[R_d ^R/(R_d ^R+S_d ^R)]×100％。其中：R_d ^S和S_d ^S表示由(S)-SO转化的(R)-和(S)-PED浓度，R_d ^R和S_d ^R表示由(R)-SO转化的(R)-和(S)-PED浓度。突变酶PvEH1^{L105I/M160A/M175I}的区域选择性系数α_S和β_R分别为99％和86.4％，比野生型酶(α_S＝91.1％，β_R＝53.3％)有明显提高。

表1突变体PvEH1^{L105I/M160A/M175I}的催化活性和对映归一性

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于，所述突变体是(a)或(b)或(c)：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质；

2.一种编码环氧化物水解酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列是SEQID NO.3所示的序列。

3.一种获得权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的方法，其特征在于，是在如SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列基础上，将第105位的亮氨酸突变成了异亮氨酸、将第160位的蛋氨酸突变成了丙氨酸，同时将第175位的蛋氨酸突变成了异亮氨酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主；培养宿主使之产环氧化物水解酶突变体。

5.一种表达权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：以携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述携带编码环氧化物水解酶的基因PvEH1的重组质粒为pET28a(+)-pveh1，表达宿主为E.coli BL21(DE3)。

7.一种应用权利要求1所述环氧化物水解酶突变体生产(R)-苯基乙二醇的方法，其特征在于，是以所述突变体或表达所述突变体的基因工程菌为催化剂，在磷酸盐缓冲液中催化外消旋环氧苯乙烷生成(R)-苯基乙二醇。

8.权利要求1所述环氧化物水解酶突变体在手性生物催化中的应用。

9.权利要求5或6所述的基因工程菌在手性生物催化中的应用。

10.携带权利要求2所述基因的载体或细胞。