CN116240194A - 柠檬烯环氧水解酶突变体及其催化合成手性氧/氮-杂环化合物 - Google Patents

柠檬烯环氧水解酶突变体及其催化合成手性氧/氮-杂环化合物 Download PDF

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Abstract

本发明应用定向进化技术和方法对来源于红球菌属(Rhodococcuserythropolis DCL14)的柠檬烯环氧水解酶LEH进行酶改造，获得了对以4‑(环氧乙烷‑2‑基)‑1‑丁醇为代表的环氧醇类有酶活的一系列突变体，该突变体可高效不对称催化4‑(环氧乙烷‑2‑基)‑1‑丁醇生成(S)‑(四氢‑2H‑吡喃‑2‑基)甲醇，同时突变体也可以催化2‑(3‑苯基氧杂环丁烷‑3‑基)乙醇合成(S)‑(3‑苯基四氢呋喃‑3‑基)甲醇，该方法具有产率高、ee值高、辅酶使用量少、不需额外添加如葡萄糖脱氢酶等用以辅因子循环的酶、反应条件温和、操作简单等优点。

Description

柠檬烯环氧水解酶突变体及其催化合成手性氧/氮-杂环化 合物
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体柠檬烯环氧水解酶突变体，更具体涉及应用定向进化技术和方法对来源于红球菌属(Rhodococcuserythropolis DCL14)的柠檬烯环氧水解酶LEH进行酶改造获得的柠檬烯环氧水解酶突变体以及这些突变体作为生物催化剂在手性氧杂环化合物中的应用。
背景技术
手性氧/氮-杂环化合物是许多生物活性分子的结构单元，是重要的医药和精细化工中间体，如抗生素药物莫能菌素与克林霉素、抗癌活性药物艾瑞布林、外用抗感染药莫匹罗星以及抗抑郁药帕罗西汀等。
目前，合成手性氧/氮-杂环化合物有两种方法：化学法和生物合成法。化学合成方法有：使用钴复合物为催化剂进行氧杂环丁烷分子内的开环去对称化(Loy et al.,J.Am.Chem.Soc.,2009,131,2786-2787)，微波加热条件下手性氯代多醇的分子内脱氯环化(Kang et al.,Org.lett.2010,12,1716-1719)，以及利用负载在石墨上的双金属钯/镭作为催化剂不对称氢化还原环氧羧酸(Ullrich et al.,ACS.Catal.2018,8,785-789.)等方式，近些年来，有机小分子不对称催化的研究也取得了一定的进展(MacMillan et al.,D.W.J.Am.Chem.Soc.2012,134,11400.List et al.Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,12761)为含氮杂环化合物的不对称构建提供了全新的合成策略。然而传统化学方法利用贵重金属作为手性催化剂，需要添加有机溶剂且反应条件苛刻。
手性氧杂环化合物的生物合成方法有：灰黄霉素的生物合成途径细胞色素P450酶通过氧化环化合成了重要苯并呋喃酮骨架(Tang et al.,ACS.Chem.Biol.2013,8,2322-2330)；在天然产物的生物合成中,非血红素铁σ-酮戊二酸(σ-KG)依赖性加氧酶是另一种合成手性五元氧-杂环化化合物的酶(Tang et al.,Chem.Rev.2017,117,5226-5333.)；然而目前用生物合成手性氧/氮-杂环化合物方法并不常见，并且通过生物的方法，利用氧杂环丁烷分子做为合成子，去合成手性氧/氮-杂环化合物目前尚未报到。
柠檬烯环氧水解酶LEH(Limonene Epoxide Hydrolase,EC 3.3.2.8)可催化环氧化合物的水解反应并生成邻位手性二醇产物，其光学纯产物可作为医药中间体、精细化工品的手性砌块。该酶序列较短，仅包含150个左右氨基酸，不依赖任何辅因子；且其结构功能关系在过去几十年里有着广泛的研究基础，可作为模式酶开展新反应设计，因此通过定向进化技术和方法对柠檬烯环氧水解酶进行改造，获得绿色高效合成手性氧/氮-杂环化合物具有重要的应用价值。
发明内容
本发明应用定向进化技术和方法对来源于红球菌属(RhodococcuserythropolisDCL14)的柠檬烯环氧水解酶LEH进行酶改造，获得了对以4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇与3，3-二取代的氧杂环丁烷类底物具有高产率、高ee值的突变体，并将其应用于光学纯手性手性氧/氮-杂环化合物生物催化合成中。为合成手性氧/氮-杂环化合物环化合物的合成提供了新方法。
第一方面，本发明保护柠檬烯环氧水解酶LEH突变体。本发明的柠檬烯环氧水解酶LEH突变体是将位于柠檬烯环氧水解酶催化中心口袋的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。
所述柠檬烯环氧水解酶LEH催化中心口袋的氨基酸残基为柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第53位、第55位、第80位、第83位，第114位，第116位所示的氨基酸残基。
其中，所述第53位，第55位和所述第132位氨基酸残基均位于柠檬烯环氧水解酶LEH活性中心，是活化水分子的关键氨基酸；所述第80位、第83位，第114位和第116位是活性中心，控制手性重要位点。这些氨基酸残基均是影响柠檬烯环氧水解酶LEH对于底物对映体选择性和酶催化活性的关键位点，通过改造这些氨基酸残基可提高底物的转化率及选择性地获得不同手性氧杂环化合物。
进一步的，所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体是将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第53位和/或第55位和/或第80位和/或第83位和/或第114位和/或第116位所示的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。
更进一步的，所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体包括如下至少一种突变：将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第53位由酪氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸或者缬氨酸或苯丙氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第55位的天冬酰胺突变为脯氨酸或丙氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第80位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第114位的亮氨酸突变为缬氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸。
在本发明的具体实施例中，所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体为如下(1)-(9)中任一种：
(1)将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为亮氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(2)将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为异亮氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(3)将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为缬氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(4)将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为异亮氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(5)将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(6)将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(7)将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，且将第80位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且将第114位的亮氨酸突变为缬氨酸，且将第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸后。且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(8)将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，且将第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸后。且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(9)将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，且将第80位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且将第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸后。且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(10)在(1)-(9)中任一所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
上述蛋白质中，所述柠檬烯环氧水解酶LEH氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。所述标签可为下表1中所示的标签。
表1融合表达蛋白标签
Figure BDA0003399633670000031
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的核酸分子90％或者更高同一性的核苷酸，只要编柠檬烯环氧水解酶LEH突变体。且具有相同功能，均是衍生于本发明的核酸分子并且等同于本发明的序列，均属于本发明的保护范围。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
第二方面，本发明保护下述a1)-a4)中的任一种生物材料：
a1)含有编码上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的核酸分子的表达盒；
a2)含有编码上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的核酸分子的重组载体；
a3)含有编码上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的核酸分子的重组微生物；
a4)含有编码上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的核酸分子的转基因细胞系。
进一步的，a1)所述的含有编码上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的DNA，该DNA不但可包括启动柠檬烯环氧水解酶LEH突变体编码基因转录的启动子，还可包括终止柠檬烯环氧水解酶LEH突变体编码基因转录的终止子。更进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。
a2)所述的含有编码上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的核酸分子的重组载体可为携带有所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，具体如pET-22b等)、噬菌体、酵母质粒(如YEp系列载体等)或逆转录病毒包装质粒。
a3)所述的含有编码上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的核酸分子的重组微生物可为携带有所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体编码基因的酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌等。
a4)所述含有编码上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的核酸分子的转基因细胞系不包括繁殖材料。
第三方面，本发明保护上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体或上述核酸分子或上述生物材料的新用途。
本发明保护上述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体或上述核酸分子或上述生物材料在如下A1)-A8)中任一种应用：
A1)催化4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇生成(S)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇；
A2)合成或制备手性(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇；
A3)催化2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇合成(S)-(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇
A4)合成或制备手性(3-取代四氢呋喃-3-基)甲醇；
A5)催化N-苄基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺合成(S)-(1-苄基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇
A6)合成或制备(1-苄基-3-芳基四氢吡啶-3-基)甲醇；
A7)催化N-苄基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)丙胺合成(1-苄基-3-苯基哌啶-3-基)甲醇
A8)合成或制备(1-苄基-3-取代基哌啶-3-基)甲醇；
所述(四氢-2H-吡喃-2-基)醇可为如下任一种：(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇、1-(四氢-2H-吡喃-2-基)乙-1-醇、2-(四氢-2H-吡喃-2-基)丙-2-醇。
所述(3-芳基四氢呋喃-3-基)甲醇可为如下任一种：(3-(4-甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(3-甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(3、5-二甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-乙基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-甲氧基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-甲硫基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-萘基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-氟苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-氯苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-溴苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-三氟甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-苄基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-乙基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-甲基)四氢呋喃-3-基)甲醇，(3-苯基四氢-2H-吡喃-3-基)甲醇。
所述(1-苄基-3-芳基四氢吡啶-3-基)甲醇可为如下任一种：(1-苄基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-烯丙基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-炔丙基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-正丁基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苯基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苯基-3-对甲苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苯基-3-对氯苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-3-(对甲苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-3-(间甲苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-(3,5-二甲苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-(4-乙苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-(4-甲氧苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-(4-甲硫苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-(4-萘基)四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-(对氟苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇。
所述(1-苄基-3-取代基哌啶-3-基)甲醇可为如下任一种：(1-苄基-3-苯基哌啶-3-基)甲醇,(1-苄基-3-苄基哌啶-3-基)甲醇。
在所述方法中，所述宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞。进一步的，所述原核细胞具体可为细菌；所述低等真核细胞具体可为酵母细胞。更进一步的，所述宿主细胞具体为大肠杆菌。
在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。相应的，所述诱导培养为向培养体系中加IPTG至终浓度0.05-1.0mmol/L(如0.1mmol/L)，20-30℃(如20℃)诱导培养10-20小时(如12小时)。
进一步的，以所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体作为生物酶催化所述底物生成(S)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇或者(S)-(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇的反应组成如下：柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的全细胞，溶菌酶，DNase I(脱氧核糖核酸酶)，助溶剂乙腈，底物，磷酸盐缓冲液等。具体反应体系为：柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的全细胞100g/L，溶菌酶1g/L，DNase I(脱氧核糖核酸酶)为6U/mL，5％-10％的乙腈作为助溶剂，余量为50mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)。
所述底物在所述反应体系中浓度为1-50mmol/L(如5mmol/L)；所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶粉在所述反应体系中浓度为1-10g/L(如10g/L)；所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体全细胞上述应用中浓度为50-500g/L(如100g/L)；所述柠檬烯环氧水解酶在所述反应体系中的浓度为0.1-2g/L(如0.5g/L),所述乙腈在所述反应体系中的体积百分含量为5-20％(如10％)；
反应体系由如下组成：底物4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇或2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇5mmol/L、表达柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的全细胞100g/L，溶菌酶1g/L，DNase I(脱氧核糖核酸酶)为6U/mL，5％的乙腈作为助溶剂，余量为磷酸钾缓冲液。
本发明应用定向进化技术和方法对来源于红球菌属(RhodococcuserythropolisDCL14)的柠檬烯环氧水解酶LEH进行酶改造，获得了对以4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇为代表的环氧醇类有酶活的一系列突变体，该突变体可高效不对称还原催化4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇生成(S)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇，同时突变体2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇合成(S)-(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇，该方法具有产率高(收率高达99％)、ee值高、辅酶使用量少、不需额外添加如葡萄糖脱氢酶等用以辅因子循环的酶、反应条件温和、操作简单等优点。因此，本发明在生物催化制备手性胺醇化合物具有较好的工业应用前景。
附图说明
图1为柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体催化4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇生成(S)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇。
图2为催化2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇合成(S)-(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇。
图3为柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体催化N-苄基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺合成(S)-(1-苄基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇。
图4柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体催化4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇生成(S)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇GC检测结果图谱。
图5为柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体催化2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇合成(S)-(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇HPLC检测结果图谱。其中，WT：LEH；M1：突变体Y53F/N55A/I80F/L114V/I116V；M2：突变体Y53F/N55A/I116V；M3：突变体Y53F/N55A/I80F/I116V。
图6为柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体催化N-苄基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺合成(S)-(1-苄基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇HPLC检测结果图谱。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、柠檬烯环氧水解酶LEH及其突变体序列
本发明应用定向进化技术和方法对来源于红球菌属(RhodococcuserythropolisDCL14)的柠檬烯环氧水解酶LEH进行酶改造。选择4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇为模式底物，通过破坏柠檬烯环氧水解酶LEH活化水分子网络FY53/N55位点，使其突变为疏水性氨基酸，通过简并密码子建库筛选，获得以下突变体。
本实施例中的柠檬烯环氧水解酶LEH核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(GenBank:Y18005.1)，柠檬烯环氧水解酶LEH氨基酸序列如SEQ ID NO.2。本实施例中柠檬烯环氧水解酶LEH具体为如下(1)-(10)中任一种：
(1)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53L/N55P:将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸(Y)突变为亮氨酸(L)，且将第55位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为脯氨酸(P)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(2)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53I/N55P:将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸(Y)突变为异亮氨酸(I)，且将第55位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为脯氨酸(P)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(3)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53V/N55P:将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸(Y)突变为缬氨酸(V)，且将第55位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为脯氨酸(P)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(4)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53I/N55A:将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸(Y)突变为异亮氨酸(I)，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变(N)为丙氨酸(A)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(5)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53F/N55P:将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)，且将第55位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为脯氨酸(P)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(6)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53F/N55A:将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变(Y)为苯丙氨酸(F)，且将第55位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(7)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53F/N55A/I80F/L114V/I116V:将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸(Y)为苯丙氨酸(F)，且将第55位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)，且将第80位的异亮氨酸(I)突变为苯丙氨酸(F)，且将第114位的亮氨酸(L)突变为缬氨酸(V)，且将第116位的异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)后。且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(8)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53F/N55A/I116V:柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53F/N55A/I80F/I116V:将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸(Y)为苯丙氨酸(F)，且将第55位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)，且将第116位的异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)后。且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
(9)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体Y53F/N55A/I80F/I116V:将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸(Y)为苯丙氨酸(F)，且将第55位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为丙氨酸(A)，且将第80位的异亮氨酸(I)突变为苯丙氨酸(F)，且将第116位的异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)后。且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质。
实施例2、柠檬烯环氧水解酶LEH基因或其突变体的工程菌的制备
一、柠檬烯环氧水解酶LEH基因工程菌株的制备
将来源于红球菌属(Rhodococcuserythropolis DCL14)的柠檬烯环氧水解酶LEH以大肠杆菌为宿主细胞进行表达，其核苷酸序列为SEQ ID No.1(GenBank:Y18005.1)。
将目的基因通过NdeI和XhoI酶切位点连入pET22b质粒，得到重组载体。将重组载体pET22b-ReLEH化转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(A+)的LB固体平板中倒置培养12-16h，挑选阳性转化子进行菌落PCR及DNA测序验证，验证正确的转化子即为柠檬烯环氧水解酶LEH基因工程菌株。
二、柠檬烯环氧水解酶LEH基因突变体工程菌株的制备
分别构建实施例1中各个柠檬烯环氧水解酶LEH突变体的柠檬烯环氧水解酶LEH基因突变体工程菌株。柠檬烯环氧水解酶LEH的突变体是通过设计兼并引物构建突变库筛选获得，或者通过设计突变引物获得。设计的兼并引物和突变引物序列如表2和表3所示。
表1突变库构建所用引物序列
Figure BDA0003399633670000071
Figure BDA0003399633670000081
表2突变体及所用引物序列
Figure BDA0003399633670000082
具体构建方法如下：
1、构建Y53/N55突变库
构建Y53/N55突变库以重组载体pET22b-ReLEH为模板分别采用各突变体对应的引物进行两轮PCR反应。突变库构建所用引物具体序列如表2中所示：
PCR反应体系及程序如下：
第一轮PCR体系为50μL，包括如下组分：模板(150ng/μL)1μL；2×High-fidelityMaster Mix25μL；ddH2O 22μL；前引物F1(10μmol/L)1μL；后引物R1(10μmol/L)1μL。所用引物具体序列如表1中所示。
第一轮PCR程序：预变性98℃，2分钟；变性98℃，10秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，30秒；终延伸72℃，5分钟。循坏次数30次。
第二轮PCR体系为50μL，包括如下组分：模板(150ng/μL)1μL；2×High-fidelityMaster Mix 25μL；ddH2O 22μL；第一轮PCR产物2μL。
第二轮PCR程序：预变性98℃，2分钟；变性98℃，10秒；退火60℃，15秒；延伸72℃，30秒；终延伸72℃，5分钟。循坏次数30次。
2、I80/V83/L114/I116突变库
构建I80/V83/L114/I116以重组载体pET22b-ReLEH-Y53F/N55A为模板，突变库构建所用引物具体序列如表3中所示：
PCR反应体系及程序如下：
第一轮PCR反应扩增获得F2R2产物。PCR体系为50μL，包括如下组分：模板(150ng/μL)1μL；2×High-fidelity Master Mix 25μL；ddH2O 22μL；前引物(10μmol/L)1μL；后引物(10μmol/L)1μL。所用引物具体序列如表2中所示。
第一轮PCR程序：预变性98℃，2分钟；变性98℃，10秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，30秒；终延伸72℃，5分钟。循坏次数30次。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，待核酸条带分离后进行切胶回收，具体步骤参照琼脂糖胶回收试剂盒说明书。
第二轮PCR反应扩增获得目的PCR产物。PCR体系为50μL，包括如下组分：模板(150ng/μL)1μL；2×High-fidelity Master Mix 25μL；ddH2O 22μL；第一轮PCR产物2μL。
第二轮PCR程序：预变性98℃，2分钟；变性98℃，10秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，3分钟；终延伸72℃，5分钟。循坏次数30次。
PCR结束后，向各反应体系中加入DpnI酶2μL，37℃消化2小时，并取1μL电转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，放入37℃培养箱倒置培养12-16小时，待转化子长出，挑取转化子进行测序验证，测序验证正确的转化子即为柠檬烯环氧水解酶LEH基因突变体工程菌株。
实施例3、柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的表达及全细胞、粗酶液与纯酶液的制备
将实施例2中制备的柠檬烯环氧水解酶LEH基因或其突变体工程菌株进行诱导表达。挑取含柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的重组质粒的重组菌E.coli BL21(DE3)转化子至含有100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡过夜12h，再按照体积百分含量1％接种量分别接种到含有5100μg/mL氨苄青霉素的TB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.7时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，20℃、220rpm诱导表达12h后，4℃、4，000rpm离心10min，收集沉淀菌体，并将收集的菌体用磷酸钾缓冲液(50mmol/L，pH 7.4)重悬得到柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的全细胞，然后在冰浴条件下超声破碎菌体细胞，得到超声破碎后的样品或使用溶菌酶破碎细胞壁后的样品(即为粗酶液)。将粗酶液12,000rpm,4℃离心60min收集上清，用0.45μm水系滤膜过滤后用ATKA蛋白纯化仪进行纯化，所用层析柱为HisTrap HP 5mL预装柱(GE)，货号17524802。上样及平衡缓冲液A(50mmol/L磷酸钾缓冲液，0.5mol/L NaCl,20mmol/L咪唑，pH 8.0)；洗脱缓冲液B(50mmol/L磷酸钾缓冲液，0.5mol/L NaCl,500mmol/L咪唑pH 8.0)，洗脱流速2mL/min；收集洗脱液(即为纯酶液)。
实施例4、柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体粗酶液催化4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇生成(S)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇
用实施例3制备的柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体粗酶液催化4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇生成(S)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇的示意图如图1所示。
上述粗酶液催化反应采用如下不对称还原反应体系进行：
不对称还原反应体系由如下组成：底物4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇(0.05mol/L)、体积分数5％的乙腈为助溶剂，表达柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的全细胞100g/L，溶菌酶1g/L，DNase I(脱氧核糖核酸酶)为6U/mL，余量为磷酸钾缓冲液。
上述不对称还原反应的条件为30℃反应12小时。
反应结束后，计算转化率并进行立体选择性分析，具体方法如下：
将上述反应液加入等体积的异丁醇(x3)混悬，12,000rpm离心2分钟，吸取上清，合并有机相，无水硫酸钠干燥，用滤膜过滤后上样，然后用GC或者HPLC检测反应。
GC检测方法如下：
仪器：岛津气相GC-2030；色谱柱：HYDRODEXβ-TBDAc 25m*0.25mm ID；流速：1ml/min载气：N2；分流：30:1进样量：1ul；SPL1:220℃；FID1:230℃；升温程序:110℃,10℃/min,135℃,2min,10℃/min,200℃,4min。HPLC检测条件：色谱柱：Chiralpark AD-H(250×4.6mm,5μm)；检测波长220nm，柱温：30℃，流速：1mL/min，上样量：2μL；流动相B：正己烷，流动相C：异丙醇。洗脱程序：98％B/2％C，运行40分钟。检测结果如表3所示。
表3柠檬烯环氧水解酶LEH或突变体粗酶液催化4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇检测结果
Figure BDA0003399633670000101
注：表中e.r＝AS:AR:AS：液相色谱分析获得的(S)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇的峰面积值；AR：液相色谱分析获得的(R)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇的峰面积值。
实施例5、柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体粗酶液2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇合成(S)-(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇
用实施例3制备的柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体粗酶液催化2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇合成(S)-(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇的示意图如图3所示。
不对称还原反应体系由如下组成：底物2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇(0.05mol/L)、体积分数5％的乙腈为助溶剂，表达柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的全细胞100g/L、，溶菌酶1g/L，DNase I(脱氧核糖核酸酶)为6U/mL，余量为磷酸钾缓冲液。
反应条件实施例4，检测结果如表5所示。
表5柠檬烯环氧水解酶LEH或突变体催化2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇检测结果
柠檬烯环氧水解酶LEH及其突变体 转化率(％) ee(％)
WT - -
Y53L/N55P 33 76:24(S)
Y53I/N55P 5 53:47(S)
Y53V/N55P 9 56:44(S)
Y53I/N55A 47 56:44(S)
Y53F/N55P 80 64:36(S)
Y53F/N55A 83 66:34(S)
Y53F/N55A/I80F/L114V/I116V 8 86:14(S)
Y53F/N55A/I116V 96 72:28(S)
Y53F/N55A/I80F/I116V 68 87:13(S)
注：表中e.r＝AS:AR:AS：液相色谱分析获得的(S)-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇的峰面积值；AR：液相色谱分析获得的(R)-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇的峰面积值。
实施例6、柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体粗酶液催化环氧乙烷醇底物
用实施例3制备的柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体粗酶液催化环氧乙烷醇底物，分别为4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇(1a)，4-(3-甲基环氧乙烷-2-基)-1-丁醇(1b)，4-(3，3-二甲基环氧乙烷-2-基)-1-丁醇(1c)对应生成的产物分别为(S)-(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇(2a)、(S)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)乙-1-醇(2b)、(S)-2-(四氢-2H-吡喃-2-基)丙-2-醇(2c)。
上述粗酶液催化反应采用如下不对称还原反应体系进行：
不对称还原反应体系由如下组成：底物5mmol/L、柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的全细胞100g/L、体积分数5％的乙腈为助溶剂，表达柠檬烯环氧水解酶LEH或其突变体的全细胞100g/L，溶菌酶1g/L，DNase I(脱氧核糖核酸酶)为6U/mL，余量为磷酸钾缓冲液(pH 7.4)。
表6为GC检测方法
Figure BDA0003399633670000121
注：a色谱柱：HYDRODEXβ-TBDAc 25m*0.25mm ID流速：1ml/min载气：N2分流:30:1进样量：1μL分流；SPL1:220℃；FID1:230℃；升温程序:110℃,10℃/min,135℃,2min,10℃/min,200℃,4min。检测结果如表7和图5所示，可以看出，柠檬烯环氧水解酶LEH突变体对底物4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇有很好的催化活性及对映体选择性之外，对其它环氧乙烷醇类底物同样具有良好的催化活性。
表7柠檬烯环氧水解酶LEH及其突变体催化环氧乙烷醇类底物检测结果
Figure BDA0003399633670000122
实施例8、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000123
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)M2(Y53F/N55A/I116V):转化率＝99％；e.r＝72:28；M3(Y53F/N55A/I80F/I116V):转化率＝99％；e.r＝72:28；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝97:3,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝22.8min(minor)and tR＝24.0min(major)]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.38(t,J＝7.5Hz,2H),7.29(t,J＝7.3Hz,1H),7.22(d,J＝7.3Hz,2H),4.25(d,J＝8.6Hz,1H),4.05(dd,J＝15.9,7.9Hz,1H),4.04–3.89(m,1H),3.85(d,J＝8.6Hz,1H),3.74–3.52(m,2H),2.45–2.29(m,1H),2.28–2.12(m,1H),1.92(s,1H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ143.11,128.66,127.28,126.92,74.26,69.34,67.59,53.47,33.90。
HRMS(ESI):calcd for[M+H]+Chemical Formula:C11H14O2 178.0994；found178.0996。
实施例9、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000131
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-甲基苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M2(Y53F/N55A/I116V):转化率＝99％；e.r＝78:22；M3(Y53F/N55A/I80F/I116V):转化率＝79％；e.r＝87:13；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cmID)[正己烷/异丙醇＝97:3,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝30.9min(minor)and tR＝32.5min(major)]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(d,J＝7.9Hz,2H),7.11(d,J＝8.1Hz,2H),4.18(d,J＝8.5Hz,1H),4.01(q,J＝7.8Hz,1H),3.91(dd,J＝13.0,8.2Hz,1H),3.80(d,J＝8.5Hz,1H),3.62(s,2H),2.44(s,1H),2.37(s,3H),2.34–2.24(m,1H),2.17(dd,J＝20.2,8.2Hz,1H)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ134.0,136.6,129.4,127.2,74.4,69.4,67.6,53.1,34.0,21.0。
HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C12H16O2 192.1150；found 192.1155。
实施例10、柠檬烯环氧水解酶突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000132
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(3-甲基苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M2(Y53F/N55A/I116V)：转化率＝99％；e.r＝64:36；M3(53F/N55A/I80F/I116V)：转化率＝91％；e.r＝83:17；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cmID)[正己烷/异丙醇＝95:5,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝13.4min(minor)and tR＝15.2min(major)]]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.26(t,J＝7.5Hz,1H),7.10(d,J＝7.5Hz,1H),7.02(d,J＝9.3Hz,2H),4.20(d,J＝8.5Hz,1H),4.01(t,J＝7.6Hz,1H),3.93(dd,J＝9.0,4.9Hz,1H),3.82(d,J＝8.5Hz,1H),2.40(s,3H),2.36–2.27(m,1H),2.24–2.13(m,1H)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ138.1,128.4,128.1,127.5,124.4,74.2,69.0,67.5,53.3,33.9,21.6。
HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C12H16O2 192.1150；found 192.1155。
实施例11、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(3,5-二甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000133
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(3,5-二甲基苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M2(Y53F/N55A/I116V):转化率＝99％；e.r＝64:36；M3(Y53F/N55A/I80F/I116V):转化率＝91％；e.r＝81:19；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝95:5,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝13.4min(minor)and tR＝15.2min(major)]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.95(s,1H),6.84(s,2H),4.24(d,J＝8.5Hz,1H),4.06(q,J＝7.9Hz,1H),3.95(td,J＝8.9,5.0Hz,1H),3.84(d,J＝8.5Hz,1H),3.67(s,2H),2.37(s,6H),2.36–2.28(m,1H),2.27–2.10(m,1H),1.80(s,1H)。
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ143.0,143.0,138.1,128.6,125.1,74.3,69.3,67.5,53.3,33.9,21.5。
HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C13H18O2206.1307；found 206.1308。
实施例12、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-乙基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000141
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(4-乙基苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M2(Y53F/N55A/I116V)：转化率＝99％；e.r＝76:24；M3(Y53F/N55A/I80F/I116V)：转化率＝78％；e.r＝90:19；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cmID)[正己烷/乙醇＝97:3,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝12.2min(minor)and tR＝14.4min(major)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.22(d,J＝8.2Hz,2H),7.15(d,J＝8.2Hz,2H),4.26(d,J＝8.5Hz,1H),4.07(dd,J＝15.9,7.9Hz,1H),3.95(td,J＝8.9,5.1Hz,1H),3.85(d,J＝8.6Hz,1H),3.69(s,2H),2.67(q,J＝7.6Hz,2H),2.35(ddd,J＝12.8,7.8,5.1Hz,1H),2.21(ddd,J＝12.4,9.2,7.3Hz,1H),1.58(s,1H),1.27(t,J＝7.6Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ142.8,140.3,128.1,127.2,74.4,69.3,67.6,53.1,34.0,28.4,15.6.；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C13H18O2206.1307；found 206.1308.
实施例13、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-甲氧苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000142
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-甲氧苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V)：转化率＝99％；e.r＝79:21；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V)：转化率＝90％；e.r＝88:12；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cmID)[正己烷/异丙醇＝98:2,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝47.0min(minor)and tR＝48.0min(major)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.15(d,J＝8.7Hz,2H),6.92(d,J＝8.7Hz,2H),4.22(d,J＝8.5Hz,1H),4.10–4.00(m,1H),3.94(td,J＝8.9,5.0Hz,1H),3.83(s,3H),3.82(d,J＝7.7Hz,1H),3.69–3.61(m,2H),2.32(ddd,J＝12.6,7.8,5.1Hz,1H),2.24–2.11(m,1H),1.82(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ158.4,135.2,128.3,114.0,74.4,69.1,67.6,55.3,52.7,34.1；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C12H16O3208.1099；found 208.1102.
实施例14、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-甲硫苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000151
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-甲硫苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V)：转化率＝97％；e.r＝78:22；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V)：转化率＝64％；e.r＝89:11；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cmID)[正己烷/乙醇＝97：3,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝22.0min(minor)and tR＝23.1min(major)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.27(d,J＝8.3Hz,1H),7.15(d,J＝8.4Hz,1H),4.22(d,J＝8.6Hz,1H),4.05(q,J＝7.9Hz,1H),3.94(td,J＝8.9,5.1Hz,1H),3.83(d,J＝8.6Hz,1H),3.67(s,1H),2.51(s,1H),2.33(ddd,J＝12.7,7.8,5.1Hz,1H),2.24–2.06(m,1H),1.67(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ140.0,140.0,137.0,137.0,127.8,126.9,74.3,69.1,67.6,53.1,34.0,15.9；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C12H16O2S224.0871；found 224.0871。
实施例15、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-萘基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000152
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-萘基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V)：转化率＝87％；e.r＝82:18；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V)：转化率＝78％；e.r＝90:10；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cmID)[正己烷/乙醇＝97：3,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝34min(minor)and tR＝36min(major)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(dd,J＝8.2,2.8Hz,3H),7.67(s,1H),7.58–7.47(m,2H),7.36(d,J＝8.5Hz,1H),4.33(d,J＝8.6Hz,1H),4.10(dd,J＝15.9,7.9Hz,1H),4.03–3.94(m,2H),3.77(s,2H),2.50–2.39(m,1H),2.36–2.26(m,1H),1.82(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ140.4,133.2,132.3,128.5,128.5,127.9,127.6,126.4,126.0,125.9,125.5,74.3,69.1,69.1,67.7,53.6,34.1.；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C15H17O2229.1223；found 229.1224。
实施例16、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-氟苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000153
/>
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-氟苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V)：转化率＝99％；e.r＝71:29；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V)：转化率＝79％；e.r＝84:15；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL IC column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝93:7,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝16.5min(minor)and tR＝17.9min(major)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.25–7.16(m,2H),7.08(t,J＝8.6Hz,2H),4.25(d,J＝8.6Hz,1H),4.07(q,J＝7.9Hz,1H),3.98(dd,J＝8.9,5.0Hz,1H),3.83(d,J＝8.5Hz,1H),3.74–3.64(m,2H),2.46–2.28(m,1H),2.26–2.13(m,1H),1.74(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ161.6(d,J＝245.6Hz),139.0(d,J＝3.3Hz),128.8(d,J＝7.9Hz),115.4(d,J＝21.1Hz),74.3,68.9(d,J＝0.6Hz),67.6,52.9,34.2；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C11H14FO2197.0972；found 197.0975。
实施例17、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-氯苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000161
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-氯苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V):转化率＝99％；e.r＝73:27；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V):转化率＝98％；e.r＝89:11；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL IC column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝93:7,,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝15.4min(major)and tR＝17.0min(minor)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32(d,J＝7.3Hz,2H),7.13(d,J＝7.3Hz,2H),4.19–4.08(m,1H),4.01–3.93(m,1H),3.92–3.84(m,1H),3.79–3.70(m,1H),3.58(s,2H),2.53(s,1H),2.30–2.18(m,1H),2.17–2.03(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ142.0,132.6,128.7,128.6,74.0,68.5,67.5,53.0,34.0:HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C11H14ClO2 212.0604；found212.0604。
实施例18、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-溴苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000162
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-氯苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V):转化率＝99％；e.r＝77:23；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V):转化率＝59％；e.r＝89:11；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL IC column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝93:7,,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝16.2min(major)and tR＝18.1min(minor)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51(d,J＝8.3Hz,2H),7.12(d,J＝8.4Hz,2H),4.22(d,J＝8.6Hz,1H),4.05(q,J＝7.9Hz,1H),4.00–3.91(m,1H),3.81(d,J＝8.6Hz,1H),3.68(s,2H),2.48–2.24(m,1H),2.22–2.10(m,1H),1.83(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ142.5,131.7,129.2,120.9,74.1,68.8,67.6,53.2,34.1.；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C11H14BrO2256.0099；found 256.0098；
实施例19、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-三氟甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000171
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-氯苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V):转化率＝99％；e.r＝77:23；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V):转化率＝59％；e.r＝89:11；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL IC column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝93:7,,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝17.1min(major)and tR＝19.4min(minor)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(d,J＝8.1Hz,2H),7.32(d,J＝8.0Hz,2H),4.18(d,J＝8.6Hz,1H),3.98(d,J＝7.7Hz,1H),3.89(d,J＝4.9Hz,1H),3.78(d,J＝8.6Hz,1H),3.62(s,2H),2.71(s,1H),2.34–2.24(m,1H),2.20–2.07(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ147.7(d,J＝1.3Hz),129.0(q,J＝32.5Hz),125.3(q,J＝3.8Hz),124.2(q,J＝271.9Hz),73.8,68.3,67.4,53.4,34.0.；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C12H13F3O2246.0868；found246.0868。
实施例20、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-苄基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000172
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-氯苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V):转化率＝99％；e.r＝95:5；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V):转化率＝59％；e.r＝96:4；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL IC column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝97:3,,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝11.7min(major)and tR＝13.3min(minor)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(t,J＝7.1Hz,2H),7.27(t,J＝8.5Hz,3H),4.02–3.81(m,2H),3.73(d,J＝8.8Hz,1H),3.64(d,J＝8.8Hz,1H),3.50(s,2H),2.86(dd,J＝35.4,13.4Hz,2H),1.97(s,1H),1.92–1.81(m,1H),1.80–1.70(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ138.4,130.1,128.3,126.4,75.0,67.7,65.7,49.1,39.9,33.8.；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C13H18O2206.1307；found 206.1308。
实施例21、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-(4-乙基)四氢呋喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000173
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-乙基)氧杂环丁烷-3-基)乙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V):转化率＝79％；e.r＝85:15；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V):转化率＝59％；e.r＝96:4；通色谱柱：HYDRODEXβ-TBDAc 25m*0.25mm ID流速：1ml/min载气：N2分流:30:1进样量：1μL分流；SPL1:220℃；FID1:230℃；升温程序:110℃,10℃/min,135℃,2min,10℃/min,200℃,4min；tS＝8.8min(major)and tR＝9.2min(minor)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δδ3.99–3.78(m,2H),3.73(d,J＝8.8Hz,1H),3.61–3.49(m,2H),3.44(d,J＝8.8Hz,1H),2.45(s,1H),1.84–1.64(m,2H),1.66–1.40(m,2H),0.93(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ140.3,140.3,140.3,136.4,136.3,129.2,127.2,74.3,69.0,67.6,53.0,34.0,21.0；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C7H14O2130.0994；found130.0999.
实施例22、柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶液催化合成(S)-(3-苯基四氢-2H-吡喃-3-基)甲醇
Figure BDA0003399633670000181
与实施例6的方法类似：选用的底物是2-(3-(4-氯苯基)氧杂环丁烷-3-基)丙醇(5mM)；M1(Y53F/N55A/I116V):转化率＝67％；e.r＝83:17；M2(Y53F/N55A/I80F/I116V):转化率＝54％；e.r＝90:10；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL IC column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝93:7,,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝12.3min(major)and tR＝13.5min(minor)]；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46–7.37(m,4H),7.28(ddd,J＝8.4,5.7,2.5Hz,1H),4.04(d,J＝11.7Hz,1H),3.93(d,J＝11.7Hz,1H),3.86–3.72(m,3H),3.64(ddd,J＝11.1,7.4,3.6Hz,1H),2.12–1.89(m,2H),1.73(dtd,J＝15.8,8.0,4.1Hz,1H),1.63–1.49(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ142.7,128.7,126.9,126.7,72.8,68.6,68.4,42.9,30.5,22.4；HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C12H16O2192.1150；found 192.1153；
实施例23、(1-苄基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000182
与实施例6的方法类似：选用的底物是N--2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体为M4(Y53F/N55A)转化率＝68％。通过HPLC检测，DaicelCHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇(0.1％二乙胺)＝98:2,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝17.237min(major)and tR＝18.5min(minor)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44–7.33(m,7H),7.27(t,J＝7.3Hz,1H),7.22(d,J＝7.2Hz,2H),3.79–3.62(m,3H),3.56(s,1H),3.46(d,J＝8.7Hz,1H),3.33–3.21(m,1H),2.73(dd,J＝8.8,1.7Hz,1H),2.63–2.52(m,1H),2.46–2.25(m,2H),1.31(s,1H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δδ145.0,138.2,128.7,128.6,128.4,127.4,126.7,126.5,75.6,63.6,60.1,53.8,50.8,33.5.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+ChemicalFormula:C11H14O2 178.0994；found 178.0996.
实施例24、(1-烯丙基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000183
与实施例6的方法类似：选用的底物是N-烯丙基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝94％；e.r＝90:10；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝98:2,,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝10.7min(major)and tR＝11.9min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δδ7.35(t,J＝7.5Hz,2H),7.30–7.25(m,1H),7.22(d,J＝7.2Hz,2H),5.96(tt,J＝12.8,6.5Hz,1H),5.38–5.12(m,2H),4.39(s,1H),3.75(d,J＝10.1Hz,1H),3.65–3.48(m,2H),3.31(td,J＝8.9,3.4Hz,1H),3.20(d,J＝6.4Hz,2H),2.70(d,J＝9.2Hz,1H),2.58–2.47(m,1H),2.44–2.35(m,1H),2.34–2.24(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ144.8,134.5,128.5,128.4,126.7,126.6,118.1,75.0,63.2,58.4,53.5,50.9,33.5.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+Chemical Formula:C14H19NO217.1467；found217.1469。
实施例25、(1-炔丙基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000191
与实施例1的方法类似：选用的底物是N-炔丙基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝94％；e.r＝90:10；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝98:2,,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝10.7min(major)and tR＝11.9min(minor)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δδ7.37(t,J＝7.5Hz,2H),7.30–7.22(m,3H),4.03(s,1H),3.74(d,J＝10.1Hz,1H),3.59(d,J＝10.2Hz,1H),3.56–3.45(m,2H),3.38(d,J＝8.8Hz,1H),3.16(td,J＝8.8,3.8Hz,1H),2.97(d,J＝8.8Hz,1H),2.67(dd,J＝16.8,9.5Hz,1H),2.49(dt,J＝15.8,8.1Hz,1H),2.39–2.22(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ145.0,128.4,126.8,126.6,78.3,74.5,73.5,61.4,51.6,51.2,42.4,33.7.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C14H17NO 215.1310；found 215.1310。
实施例26、(1-正丁基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000192
与实施例1的方法类似：选用的底物是N-正丁基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝98％；e.r＝96:4；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝98:2,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝13.5min(major)and tR＝14.7min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δδ7.36(t,J＝7.5Hz,2H),7.27(d,J＝7.1Hz,1H),7.23(d,J＝7.4Hz,2H),4.83(s,1H),3.76(d,J＝10.0Hz,1H),3.56(d,J＝9.4Hz,2H),3.43–3.31(m,1H),2.72(dd,J＝8.9,1.8Hz,1H),2.62(dt,J＝11.8,7.5Hz,1H),2.58–2.48(m,2H),2.41–2.25(m,2H),1.67–1.55(m,2H),1.48–1.36(m,2H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)δ144.7,128.4,126.6,126.6,75.2,63.7,55.4,53.7,50.7,33.4,30.3,20.6,14.0.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C15H23NO233.1780；found 233.1780。
实施例27、(1-苯基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000201
与实施例1的方法类似：选用的底物是N-苯基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝98％；e.r＝99:1；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝98:2,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝8.3min(major)and tR＝11.0min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45(t,J＝7.5Hz,2H),7.34(dd,J＝15.9,7.8Hz,5H),6.78(t,J＝7.2Hz,1H),6.70(d,J＝8.0Hz,2H),3.84(d,J＝9.3Hz,1H),3.59(t,J＝7.6Hz,2H),3.46(t,J＝8.1Hz,1H),2.72–2.51(m,1H),2.41–2.19(m,1H),1.60(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ147.7,143.8,129.3,128.7,127.0,126.9,116.0,111.8,69.3,54.8,51.8,46.6,32.3.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C17H19NO253.1467；found253.1467。
实施例28、(1-对甲苯基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000202
与实施例1的方法类似：选用的底物是N-对甲苯基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝99％；e.r＝99:1；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝90：10,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝11.2min(major)and tR＝14.5min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45(t,J＝7.5Hz,2H),7.34(dd,J＝15.9,7.8Hz,5H),6.78(t,J＝7.2Hz,1H),6.70(d,J＝8.0Hz,2H),3.84(d,J＝9.3Hz,1H),3.59(t,J＝7.6Hz,2H),3.46(t,J＝8.1Hz,1H),2.72–2.51(m,1H),2.41–2.19(m,1H),1.60(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ147.7,143.8,129.3,128.7,127.0,126.9,116.0,111.8,69.3,54.8,51.8,46.6,32.3.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C18H21NO 267.1623；found 267.1623。
实施例29、(1-对氯苯基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000203
与实施例1的方法类似：选用的底物是N-对氯苯基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝98％；e.r＝99:1；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝98:2,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝12.0min(major)and tR＝14.5min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45(t,J＝7.5Hz,2H),7.34(dd,J＝15.9,7.8Hz,5H),6.78(t,J＝7.2Hz,1H),6.70(d,J＝8.0Hz,2H),3.84(d,J＝9.3Hz,1H),3.59(t,J＝7.6Hz,2H),3.46(t,J＝8.1Hz,1H),2.72–2.51(m,1H),2.41–2.19(m,1H),1.60(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ147.7,143.8,129.3,128.7,127.0,126.9,116.0,111.8,69.3,54.8,51.8,46.6,32.3.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C17H18ClNO 287.1077；found 287.1077。
实施例30、(1-苄基-3-(4-甲苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000211
与实施例1的方法类似：选用的底物是N-苄基-2-(3-(4-甲苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝53％；e.r＝94:6；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝90:10,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝6.6min(major)and tR＝7.4min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.32(m,5H),7.19(d,J＝8.0Hz,2H),7.13(d,J＝8.2Hz,2H),3.79–3.69(m,3H),3.58(dd,J＝9.9,1.8Hz,1H),3.51(s,1H),3.46(d,J＝8.8Hz,1H),3.27(td,J＝8.7,2.7Hz,1H),2.72(dd,J＝8.8,1.7Hz,1H),2.55(dt,J＝12.1,8.1Hz,1H),2.46–2.37(m,4H),2.36–2.27(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ141.9,138.2,136.1,129.1,128.7,128.6,127.4,126.6,75.5,63.7,60.1,53.8,50.5,33.6,21.0.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C19H23NO 281.1780；found 281.1780。
实施例31、(1-苄基-3-(3-甲苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000212
与实施例1的方法类似：选用的底物是N-苄基-2-(3-(3-甲苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝89％；e.r＝97:3；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝90:10,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝6.1min(major)and tR＝7.7min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.29(m,5H),7.24(t,J＝7.9Hz,1H),7.08(d,J＝7.5Hz,1H),7.02(d,J＝6.4Hz,2H),4.43(s,1H),3.80–3.67(m,3H),3.56(d,J＝9.9Hz,1H),3.45(d,J＝8.8Hz,1H),3.26(dd,J＝12.3,5.3Hz,1H),2.72(d,J＝8.8Hz,1H),2.59–2.48(m,1H),2.43–2.26(m,5H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ144.9,138.3,137.9,128.7,128.6,128.2,127.4,124.6,75.6,63.6,60.1,53.8,50.7,33.5,21.5.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C19H23NO 281.1780；found 281.1780。
实施例32、(1-苄基-3-(3,5-二甲苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000221
与实施例1的方法类似：选用的底物是N-苄基-2-(3-(3,5-二甲苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝69％；e.r＝93:7；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝90:10,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝5.1min(major)and tR＝5.9min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46–7.38(m,4H),7.37–7.32(m,1H),6.93(s,1H),6.84(s,2H),3.78–3.69(m,3H),3.57(dd,J＝9.9,1.9Hz,1H),3.44(d,J＝8.8Hz,1H),3.29–3.22(m,1H),2.71(dd,J＝8.8,1.9Hz,1H),2.59–2.48(m,1H),2.43–2.37(m,1H),2.36(s,6H),2.34–2.26(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ144.9,138.3,137.9,128.7,128.6,128.2,127.4,124.6,75.6,63.6,60.1,53.8,50.7,33.5,21.5.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C20H25NO295.1936；found 295.1939。
实施例33、(1-烯丙基-3-(4-乙苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000222
实施例1的方法类似：选用的底物是N-烯丙基-2-(3-(4-乙苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝73％；e.r＝85:15；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝90:10,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝10.0min(major)and tR＝11.9min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.17(dd,J＝20.3,8.2Hz,4H),6.13–5.83(m,1H),5.35–5.12(m,2H),4.52(s,1H),3.75(d,J＝10.0Hz,1H),3.64–3.46(m,2H),3.37–3.25(m,1H),3.19(d,J＝6.4Hz,2H),2.74–2.63(m,3H),2.56–2.48(m,1H),2.44–2.21(m,2H),1.27(t,J＝7.6Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ142.5,142.1,134.8,127.9,126.6,117.8,75.2,63.4,58.4,53.6,50.5,33.5,28.4,15.6.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C16H23NO245.1780；found 245.1780
实施例34、(1-苄基-3-(4-甲氧苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000231
实施例1的方法类似：选用的底物是N-苄基-2-(3-(4-甲氧苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝83％；e.r＝98:2；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝90:10,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝9.6min(major)and tR＝10.5min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δδ7.48–7.31(m,2H),7.19–7.10(m,1H),6.94–6.86(m,1H),3.83(s,1H),3.75–3.66(m,1H),3.54(dd,J＝9.9,1.9Hz,1H),3.49(s,1H),3.42(d,J＝8.8Hz,1H),3.24(td,J＝8.7,3.0Hz,1H),2.69(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H),2.58–2.47(m,1H),2.44–2.36(m,1H),2.32–2.24(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ158.1,138.2,137.1,128.7,128.6,127.7,127.4,113.8,75.4,63.8,60.1,55.3,53.8,50.1,33.7.HRMS(ESI):calcdfor[M+H]+C19H23NO2 297.1729；found 297.1729。
实施例35、(1-烯丙基-3-(4-乙苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000232
实施例1的方法类似：选用的底物是N-苄基-2-(3-(3,5-二甲苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝73％；e.r＝89:11；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-H column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝90:10,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝20.6min(major)and tR＝20.8min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)1H NMR(400MHz,CDCl3)δδ7.48–7.31(m,2H),7.19–7.10(m,1H),6.94–6.86(m,1H),3.83(s,1H),3.75–3.66(m,1H),3.54(dd,J＝9.9,1.9Hz,1H),3.49(s,1H),3.42(d,J＝8.8Hz,1H),3.24(td,J＝8.7,3.0Hz,1H),2.69(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H),2.58–2.47(m,1H),2.44–2.36(m,1H),2.32–2.24(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ141.8,136.5,134.9,127.2,126.8,117.6,75.0,63.3,58.4,53.5,50.4,33.5,16.0.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C15H21NOS263.1344；found 263.1348。
实施例36、(1-苄基-3-(对氟苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000233
实施例1的方法类似：选用的底物是N-苄基-2-(3-(对氟苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝61％；e.r＝94:6；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL IC column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝97:3,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝14.9min(major)and tR＝16.5min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44–7.32(m,5H),7.21–7.14(m,2H),7.03(t,J＝8.7Hz,2H),3.75–3.65(m,3H),3.56–3.49(m,1H),3.41(d,J＝8.8Hz,1H),3.25(td,J＝8.9,3.0Hz,1H),2.69(dd,J＝8.8,1.8Hz,1H),2.53(dt,J＝12.2,8.1Hz,1H),2.41(dd,J＝17.0,9.3Hz,1H),2.31–2.22(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ161.4(d,J＝245.2Hz),140.7(d,J＝3.2Hz),138.0,128.7,128.6,128.2(d,J＝7.9Hz),127.4,115.1(d,J＝21.1Hz),75.4,63.6,60.0,53.7,50.3,33.6.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C18H20FNO 285.1529；found285.15332。
实施例37、(1-苄基-3-(对氯苯基)四氢吡啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000241
实施例1的方法类似：选用的底物是N-苄基-2-(4-(对氯苯基)氧杂环丁烷-3-基)乙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝57％；e.r＝91:9；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL IC column(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝97:3,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝15.5min(major)and tR＝18.7min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δδ7.43–7.29(m,7H),7.14(d,J＝8.4Hz,2H),3.76–3.64(m,3H),3.53(dd,J＝10.2,1.7Hz,1H),3.40(d,J＝8.8Hz,1H),3.25(td,J＝8.8,3.0Hz,1H),2.67(dd,J＝8.8,1.5Hz,1H),2.52(dt,J＝12.2,8.1Hz,1H),2.41(dd,J＝17.0,9.2Hz,1H),2.29–2.20(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ143.5,138.1,132.4,128.7,128.6,128.5,128.1,127.4,75.2,63.4,60.0,53.7,50.5,33.5.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C18H20ClNO301.1233；found 301.1233。
实施例38、(1-苄基-3-苯基哌啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000242
实施例1的方法类似：选用的底物是N-苄基-2-(4-苯基氧杂环丁烷-3-基)丙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝98％；e.r＝99:1；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-Hcolumn(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝98:2,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝27.8min(major)and tR＝28.9min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43–7.29(m,7H),7.14(d,J＝8.4Hz,2H),3.76–3.64(m,3H),3.53(dd,J＝10.2,1.7Hz,1H),3.40(d,J＝8.8Hz,1H),3.25(td,J＝8.8,3.0Hz,1H),2.67(dd,J＝8.8,1.5Hz,1H),2.52(dt,J＝12.2,8.1Hz,1H),2.41(dd,J＝17.0,9.2Hz,1H),2.29–2.20(m,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ143.5,138.1,132.4,128.7,128.6,128.5,128.1,127.4,65.3,64.6,60.3,57.335.1,32.7,21.1.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C18H20ClNO 281.1780；found 281.1782。
实施例39、(1-苄基-3-苄基哌啶-3-基)甲醇的制备：
Figure BDA0003399633670000251
实施例1的方法类似：选用的底物是N-苄基-2-(苄基氧杂环丁烷-3-基)丙胺(5mM)柠檬烯环氧水解酶LEH突变体M4(Y53F/N55A)：转化率＝67％；e.r＝71:29；通过HPLC检测Daicel CHIRALCEL AD-Hcolumn(25cm×0.46cm ID)[正己烷/异丙醇＝98:2,λ＝254nm,流速：1.0mL/min；tS＝24.6min(major)and tR＝26.8min(minor)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44–7.18(m,10H),4.21(d,1H,J＝13.7Hz),3.94(d,1H,J＝10.8Hz),3.28(d,1H,J＝13.7Hz),3.23(d,1H,J＝13.2Hz),3.17(d,1H,J＝10.1Hz),2.85(m,1H),2.75(d,1H,J＝13.5Hz),2.54(ddd,1H,J＝12.1,3.0,3.0Hz),1.78–1.39(m,6H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ139.3,137.7,130.1,129.5,129.1,128.5,126.5(d),126.3,65.2,60.6,53.0,46.3,37.1,29.7,25.8,20.6.HRMS(ESI):calcd for[M+H]+C20H25NO295.1936；found 295.1938。
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<160> 2
<210> 1
<211> 450
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<213> Rhodococcus erythropoli
<400> 1
ATGACATCAAAGATCGAACAACCTCGCTGGGCGTCCAAGGACAGTGCCGCCGGCGCTGCCTCGACTCCGGACGAAAAGATCGTTCTGGAGTTCATGGACGCACTGACCAGTAATGATGCTGCAAAACTCATTGAGTACTTTGCAGAAGACACGATGTACCAGAACATGCCACTCCCCCCTGCATACGGCCGCGACGCCGTCGAGCAAACTCTGGCTGGCCTGTTCACCGTCATGAGCATCGATGCGGTGGAGACGTTCCATATCGGCTCGAGTAACGGACTTGTGTACACCGAACGTGTCGATGTCCTACGCGCACTACCCACCGGCAAGAGCTACAACCTGTCAATCCTCGGAGTCTTCCAGCTCACCGAGGGCAAGATTACGGGTTGGCGTGACTACTTCGATCTGCGCGAATTCGAAGAAGCTGTCGACCTTCCCCTCCGCGGCTAA450
<210> 2
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
MTSKIEQPRWASKDSAAGAASTPDEKIVLEFMDALTSNDAAKLIEYFAEDTMYQNMPLPPAYGRDAVEQTLAGLFTVMSIDAVETFHIGSSNGLVYTERVDVLRALPTGKSYNLSILGVFQLTEGKITGWRDYFDLREFEEAVDLPLRG149

Claims (10)

1.柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，其特征在于，将位于柠檬烯环氧水解酶催化中心口袋的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质，优选地是柠檬烯环氧水解酶LEH活性中心和控制手性重要位点的至少一个氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质。
2.如权利要求1所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，其特征在于，所述至少一个氨基酸残基为柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第53位、第55位、第80位、第 83位，第114位，第116位所示的氨基酸残基；
优选地，所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体是将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第53位和/或第55位和/或第80位和/或第83位和/或第114位和/或第116位所示的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质；
更优选的，所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体包括如下至少一种突变：将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第53位由酪氨酸突变为亮氨酸或异亮氨酸或者缬氨酸或苯丙氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第55位的天冬酰胺突变为脯氨酸或丙氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第80位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第114位的亮氨酸突变为缬氨酸，将柠檬烯环氧水解酶LEH的氨基酸序列的第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸；
进一步优选，所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体为如下（1）-（9）中任一种：
（1）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为亮氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（2）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为异亮氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（3）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为缬氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（4）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为异亮氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（5）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为脯氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（6）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（7）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，且将第80位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且将第114位的亮氨酸突变为缬氨酸，且将第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（8）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，且将第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
（9）将柠檬烯环氧水解酶LEH序列的第53位氨基酸由酪氨酸突变为苯丙氨酸，且将第55位氨基酸由天冬酰胺突变为丙氨酸，且将第80位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且将第116位的异亮氨酸突变为缬氨酸后，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质；
上述蛋白质中所述柠檬烯环氧水解酶LEH的野生型是氨基酸序列如 SEQ ID No.1所示的柠檬烯环氧水解酶LEH或其来源于同一物种的同源基因编码的柠檬烯环氧水解酶LEH。
3.如权利要求1或2所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体的融合蛋白，优选地，在其 N端或/和 C 端连接标签得到的融合蛋白质，更优选地所述标签是Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II或c-myc，更具体地是RRRRR、HHHHHH、DYKDDDDK、WSHPQFEK或EQKLISEEDL。
4.编码如权利要求1至2任一项所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，或如权利要求3所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体的融合蛋白的编码核酸分子，优选地，所述核酸分子是 DNA，如 cDNA、基因组 DNA 或重组 DNA，或者 RNA，如 mRNA 或hnRNA。
5.含有如权利要求1至2任一项所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，或如权利要求3所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体的融合蛋白的表达盒、重组载体、重组微生物、重组细胞系；
所述表达盒包括启动柠檬烯环氧水解酶LEH 突变体编码基因转录的启动子，终止柠檬烯环氧水解酶LEH 突变体编码基因转录的终止子，任选地还包括增强子序列；
所述重组载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质；
所述重组微生物为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌；
所述的重组细胞系是植物细胞，动物细胞且不包括繁殖材料。
6.含有如权利要求1至2任一项所述的柠檬烯环氧水解酶 LEH突变体，或其编码基因在下述方面中的应用：
A1）催化4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇生成 (S) - (四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇；
A2）制备手性(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇；
A3）催化2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇合成(S) -(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇；
A4）合成或制备手性(3-取代四氢呋喃-3-基)甲醇；
A5）催化N-苄基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙胺合成(S) -(1-苄基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇
A6）合成或制备 (1-苄基-3-芳基四氢吡啶-3-基)甲醇；
A7）催化N-苄基-2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)丙胺合成 (1-苄基-3-苯基哌啶-3-基)甲醇
A8）合成或制备(1-苄基-3-取代基哌啶-3-基)甲醇。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述（四氢-2H-吡喃-2-基）醇可为如下任一种：(四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇、1-(四氢-2H-吡喃-2-基)乙-1-醇、 2-(四氢-2H-吡喃-2-基)丙-2-醇；
所述(3-芳基四氢呋喃-3-基)甲醇可为如下任一种：(3-(4-甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(3-甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(3、5-二甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-乙基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-甲氧基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-甲硫基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-萘基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-氟苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-氯苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-溴苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-三氟甲基苯基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-苄基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-乙基)四氢呋喃-3-基)甲醇、(3-(4-甲基)四氢呋喃-3-基)甲醇，(3-苯基四氢-2H-吡喃-3-基)甲醇；
所述(1-苄基-3-芳基四氢吡啶-3-基)甲醇可为如下任一种：(1-苄基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-烯丙基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-炔丙基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-正丁基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苯基-3-苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苯基-3-对甲苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苯基-3-对氯苯基四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-3-（对甲苯基）四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-3-（间甲苯基）四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-（3,5-二甲苯基）四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-（4-乙苯基）四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-（4-甲氧苯基）四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-（4-甲硫苯基）四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-（4-萘基）四氢吡啶-3-基)甲醇、(1-苄基-（对氟苯基）四氢吡啶-3-基)甲醇；
所述(1-苄基-3-取代基哌啶-3-基)甲醇可为如下任一种： (1-苄基-3-苯基哌啶-3-基)甲醇,(1-苄基-3-苄基哌啶-3-基)甲醇。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述应用通过重组宿主细胞的全细胞催化来实现，其中宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞；进一步的，所述原核细胞具体为细菌；所述低等真核细胞具体为酵母细胞更优选地，所述宿主细胞具体为大肠杆菌，更具体为E.coli BL21（DE3）。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述E.coli BL21（DE3）的诱导培养为向培养体系中加IPTG至终浓度0.05-1.0 mmol/L，20-30 ℃（如20 ℃）诱导培养10-20小时；进一步的，以所述柠檬烯环氧水解酶LEH 突变体作为生物酶催化所述底物生成(S) - (四氢-2H-吡喃-2-基)甲醇或者(S) -(3-苯基四氢呋喃-3-基)甲醇的反应是在浓度为 0.001-0.1mol/L，pH 6-8的磷酸盐缓冲液中进行的；
所述底物在所述反应体系中浓度为 1-50 mmol/L（如 5 mmol/L）；所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体粗酶粉在所述反应体系中浓度为 1-10 g/L（如 10 g/L），或者所述柠檬烯环氧水解酶LEH突变体全细胞上述应用中浓度为50-500 g/L；所述柠檬烯环氧水解酶裂解液在所述反应体系中的浓度为50-500 g/L,所述乙腈在所述反应体系中的体积百分含量为5-20 %。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，催化反应采用不对称还原反应体系，其组成如下：底物4-(环氧乙烷-2-基)-1-丁醇或2-(3-苯基氧杂环丁烷-3-基)乙醇5 mmol/L、体积分数3-15%的乙腈为助溶剂、表达柠檬烯环氧水解酶突变体的全细胞，溶菌酶，DNase
Figure 251396DEST_PATH_IMAGE001
，余量为磷酸钾缓冲液。/>
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