CN107604019A

CN107604019A - 生物催化制备(r)‑1‑n‑苯甲氧羰基‑3‑氨基哌啶的方法

Info

Publication number: CN107604019A
Application number: CN201710885619.9A
Authority: CN
Inventors: 姜梦颖; 孟枭; 孙丰来
Original assignee: Changzhou Hequan Pharmaceutical Co Ltd; Changzhou Whole New Drug Research And Development Co Ltd; Shanghai Sta Pharmaceutical R & D Co Ltd; Shanghai SynTheAll Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明涉及一种对映体纯的(R)‑1‑N‑苯甲氧羰基‑3‑氨基哌啶（以下简称(R)‑N‑Cbz‑3‑氨基哌啶）的制备方法。主要解决现有制备方法均以叔丁氧羰基作为保护基团在弱酸性条件下稳定性较差的技术问题。本发明的技术方案：一种(R)‑N‑Cbz‑3‑氨基哌啶的制备方法，在以异丙胺作为氮源的条件下，通过酶催化转化1‑N‑苯甲氧羰基‑3‑哌啶酮（以下简称N‑Cbz‑3‑哌啶酮）直接制备式II的(R)‑N‑Cbz‑3‑氨基哌啶；反应式如下：。

Description

生物催化制备(R)-1-N-苯甲氧羰基-3-氨基哌啶的方法

技术领域

本发明涉及一种对映体纯的(R)-1-N-苯甲氧羰基-3-氨基哌啶（简称(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶）生物催化制备方法。

背景技术

(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶（如式II所示）

是一种重要的手性医药中间体。R型3-氨基哌啶是生产降血糖药阿格列汀，林格列汀等的重要中间体，同时氮保护的氨基哌啶也可用于合成苯甲酸阿格列汀。

目前，众多制备(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶的方法（包括传统化学法和生物酶催化法）中，生物酶催化法因为具有反应效率高、立体选择性好、反应条件温和、低能耗、环境友好等优点，受到越来越广泛的关注和越来越深入的研究。

专利CN104178536B中公开了一种生物制备(R)-3-氨基哌啶的方法，以N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮为底物，在以异丙胺或D-丙氨酸作为氨基供体，来源于镉胁迫对节杆菌(Arthrobacter. sp.)的D-转氨酶的存在下，将3-哌啶酮转化为(R)-3-氨基哌啶。该发明转化率高，具有重要的工业应用价值。

专利CN103865964A中公开了一种以转氨酶为催化剂，在氨基供体和转氨酶的存在下，将N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮转化为氮保护的(R)-3-氨基哌啶。之后可以脱去保护基团得到(R)-3-氨基哌啶或其盐。

具体合成路线如下所示：

其中PG为保护基，可选用C_1-4烷氧羰基、苄氧羰基或苄基。该发明中选取的氨基供体为异丙胺，选取的转氨酶来源于镉胁迫对节杆菌(Arthrobacter. sp.)，经过基因重组得到表达ω-转氨酶的重组大肠杆菌。最终得到产物的ee值一般在99%左右。但是该发明所采用的酶不易得到，不适用于大规模商业化生产。

相关文献（Org. Process Res. Dev. 2016, 20(3), 602-608）报道，ω-转氨酶可以有效催化非手性的酮得到对映体纯的转氨产物，具体路线如下所示：

文献中以1-叔丁氧羰基-3-哌啶酮为原料，选取异丙胺作为氨基供体，在转氨酶(来源于镉胁迫对节杆菌KNK168突变体的氨基转移酶Tar0和Tar1)的作用下，得到了对映体纯的（R）-1-叔丁氧羰基-3-氨基哌啶。

苯甲氧羰基和叔丁氧羰基都是常用的氨基保护基团，而目前文献所报道的利用酶催化的方法制备单一构型的羟基哌啶主要以叔丁氧羰基作为保护基团。研究表明（Chin.J. Org. Chem. 2011, 31, 908 – 911），相比于叔丁氧羰基，苯甲氧羰基在弱酸性条件下更稳定。因此，以苯甲氧羰基作为氨基保护基团，通过一种新型酶催化技术生产(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶具有重要意义。

此外，目前关于(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶的生物制备方法中所采用的酶都需要通过基因改造进行大量的分子生物学操作，不适用于大规模工业化生产。因此开发一种使用可大量获得的商业化酶作为原料的方法实现高效大规模商业化生产(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产率并且高效的(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶的制备方法，主要解决现有制备方法均以叔丁氧羰基作为保护基团在弱酸性条件下稳定性较差的技术问题。同时采用可大量购买的商品化酶为原料，适用于大规模商业化生产。旨在通过一种新型酶催化技术，实现N-Cbz-3-哌啶酮的氨化，从而实现大规模制备对映体纯的(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶的目的。

本发明的技术方案：一种(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶的制备方法，在以异丙胺作为氮源的条件下，通过酶催化转化N-Cbz-3-哌啶酮直接制备式II的(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶；反应式如下：

在本发明的制备方法中，所述酶是氨基转移酶（亦称为转氨酶，ATA）。转氨酶为采购自美国药企Codexis, Inc.公司的ATA-412、ATA-426、ATA-P2-A07或ATA-P2-B01中的一种，优选ATA-412。反应需加入辅酶磷酸吡哆醛。

在本发明的制备方法中，还包括以常规方法分离出产物式（II）所述的对映体。常规分离方法包括有机溶剂进行萃取、离子交换或层析等。其中，优选使用溶剂萃取法分离未反应的所述式（II）的对映体。

在本发明的制备方法中，所述反应在有机溶剂和水的混合物，或纯水中进行。在使用有机溶剂和水的混合物的情况下，所述有机溶剂是与水可混溶的。其作用在于进一步增加底物的溶解性同时。优选的与水可混溶的有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺。

在本发明的制备方法中，所述反应在 pH 范围为7~9的条件下进行。优选的反应pH 在7~8之间，其中选取的最优 pH 为7.5。通过向反应溶剂中加入缓冲液进行pH 控制。常用的缓冲液包括但不限于 KH₂PO₄-K₂HPO₄或 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液。

在本发明的制备方法中，所述反应在温度为 15~60℃的条件下进行。当温度低于15℃时，反应速度较慢。但温度高于 60℃时，酶会不可逆失活。出于保证反应稳定、高效进行的目的，优选的反应温度为 25℃。

在本发明的制备方法中，还包括分离出氨基产物(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶的步骤。

以本发明的方法制备的 (R)-N-Cbz-3-氨基哌啶（II），对映体过量值不低于 99%，纯度不低于 99%。

本发明的有益效果是，以苯甲氧羰基作为氨基保护基团，通过一种新型酶催化技术实现高效生产(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶具有重要意义。该方法简单易行、产率高、选择性好。

附图说明

图 1 是N-Cbz-3-氨基哌啶的外消旋物的高效液相色谱法图谱。左侧的峰为S构型，右侧的峰为R构型。

图 2 是按照本发明实施例3的方法转化后的N-Cbz-3-氨基哌啶的手性高效液相色谱法图谱。图中唯一的峰为目标化合物(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶。

图 3 是按照本发明实施例3的方法转化后的N-Cbz-3-氨基哌啶的手性高效液相色谱质谱联用法图谱。图中质荷比m/z为235.2的峰为目标化合物(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶的分子离子峰。

图 4 是按照本发明实施例3的方法转化后的(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶的氢谱核磁图谱。¹H NMR (400MHz, CDCl₃) δ ppm 1.17 - 1.31 (m, 1 H), 1.42-1.52 (m, 1 H),1.69 (s, 1 H), 1.85 – 1.99 (m, 1 H), 2.67 (s, 1 H), 2.80 (s, 1 H), 2.91 (ddd,J = 13.36, 10.60, 3.14 Hz, 1H), 3.76-4.13 (m, 2 H), 5.05-5.18 (m, 2 H), 7.27– 7.42 (m, 5 H)。

具体实施方式

本发明所述的反应方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 利用转氨酶，催化氨化N-Cbz-3-哌啶酮。其中转氨酶的添加量为0.002~10g转氨酶/g 底物。

反应温度为 15~60 ℃，优选为 25 ℃。

所用反应介质为加入浓度在 0.5~2 mol/L异丙胺和浓度为 1~5 mmol/L磷酸吡哆醛的纯水和含有磷酸盐浓度在 50~150 mmol/L（优选为90 mmol/L）、pH 范围为 7~9（优选为 pH = 7.5）的 KH₂PO₄-K₂HPO₄或 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液，也可以是纯水或上述缓冲液与水混溶的有机溶剂（如N,N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜等）组成的两相体系。

(2) 反应结束后，反应液通入氮气或负压除去杂质后，使用二氯甲烷或甲基叔丁基醚萃取，萃取结束后，萃取混合物经离心机或过滤器处理，分层后，取所需有机层，即为粗产品的溶液。

(3) 将粗产品的溶液，可以直接在不高于 45℃的条件下减压浓缩干，最终得到浅黄色粘稠状液体，即为对映体过量值不低于 98%的产品 (R)-N-Cbz-3-氨基哌啶。

本发明所使用试剂和原料均市售可得。

以下根据实施例，并且结合附图，详细描述本发明。从下文的详细描述中，本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。下列实施例仅试图阐明本发明，而对本发明保护范围不起任何限定作用。

实施例1

在 50 mL 玻璃夹套反应瓶中，加入 20mL 纯水，0.106 g KH₂PO₄和 0.212 g K₂HPO₄，搅拌直至固体溶清；加入 1.7 mL 的异丙胺并用磷酸调节pH值到7.5；向反应液中加入0.05 g 转氨酶冻干粉（采购自美国药企Codexis, Inc.公司的ATA-412）和 0.02 g 磷酸吡哆醛，搅拌后加入 1 g N-Cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度 25℃，连续搅拌 24 小时；

用 20 mL 二氯甲烷萃取反应液，得到下层有机相，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，在 30℃减压蒸馏浓缩。所得黄色粘稠液体称重得0.67 g，粗收率为 66.73 %。所得液体即产品 (R)-N-Cbz-3-氨基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值 83.21 %。分析条件：岛津 LC-20A 液相色谱仪和紫外检测器，ChiSapak AS-H（250 × 4.6 mm，5 μm）手性色谱柱，流动相：含0.1%乙二胺的己烷-含0.1%乙二胺的乙醇（体积比 90 : 10）。30℃1 mL/min下平衡，检测波长 254 nm。

实施例2

在 50 mL 玻璃夹套反应瓶中，加入 20mL 纯水，0.106 g KH₂PO₄和 0.212 g K₂HPO₄，搅拌直至固体溶清；加入 1.7 mL 的异丙胺并用磷酸调节pH值到7.5；向反应液中加入0.05 g 转氨酶冻干粉（采购自美国药企Codexis, Inc.公司的ATA-412）和 0.01 g 磷酸吡哆醛，搅拌后加入 1 g N-Cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度 37℃，连续搅拌 24 小时；

后处理条件同实施例 1 。所得黄色粘稠液体称重得0.78 g，粗收率为 77.69%。所得液体即产品 (R)-N-Cbz-3-氨基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值 85.21 %。分析条件同实施例 1 。

实施例3

在 50 mL 玻璃夹套反应瓶中，加入 20mL 纯水，0.106 g KH₂PO₄和 0.212 g K₂HPO₄，搅拌直至固体溶清；加入 1.7 mL 的异丙胺并用磷酸调节pH值到7.5；向反应液中加入0.05 g 转氨酶冻干粉（采购自美国药企Codexis, Inc.公司的ATA-412）和 0.01 g 磷酸吡哆醛，搅拌后加入溶于1 mL N,N-二甲基甲酰胺的 1 g N-Cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度 25℃，连续搅拌 24 小时；

反应结束后，反应液通入氮气或负压除去杂质后，用 20 mL 二氯甲烷萃取反应液，得到下层有机相，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，在 30 ℃减压蒸馏浓缩。所得黄色粘稠液体称重得 0.91 g ，最终收率为 90.24 %。所得液体即产品 (R)-N-Cbz-3-氨基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值可达 99.57%。分析条件同实施例 1 。产品液相色谱法图谱见图2，产品液相色谱质谱联用法图谱见图3，产品的核磁图谱见图4。

实施例4

在 50 mL 玻璃夹套反应瓶中，加入 20mL 纯水，0.106 g KH₂PO₄和 0.212 g K₂HPO₄，搅拌直至固体溶清；加入 1.7 mL 的异丙胺并用磷酸调节pH值到7.5；向反应液中加入0.05 g 转氨酶冻干粉（采购自美国药企Codexis, Inc.公司的ATA-412）和 0.01 g 磷酸吡哆醛，搅拌后加入1 g N-Cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度 25℃，连续搅拌 24 小时；

反应结束后，反应液通入氮气或负压除去杂质后，用 20 mL 二氯甲烷萃取反应液，得到下层有机相，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，在 30 ℃减压蒸馏浓缩。所得黄色粘稠液体称重得 0.89 g ，最终收率为 88.12%。所得液体即产品 (R)-N-Cbz-3-氨基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值可达 98.62%。分析条件同实施例 1 。

实施例5

在 5 mL 玻璃反应瓶中，加入 2 mL 纯水，0.011 g KH₂PO₄和 0.021 g K₂HPO₄，搅拌直至固体溶清；加入 1.7 mL 的异丙胺并用磷酸调节pH值到7.5；向反应液中加入 0.005 g转氨酶冻干粉（采购自美国药企Codexis, Inc.公司的ATA-426）和 0.001 g 磷酸吡哆醛，搅拌后加入溶于 0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺的 0.1 g N-Cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度 25℃，连续搅拌 24 小时；

反应结束后，反应液通入氮气或负压除去杂质后，用 2 mL 二氯甲烷萃取反应液，得到下层有机相，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，用氮气吹干后所得黄色粘稠液体即产品(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶。经高效液相色谱法分析，对映体过量值可达 99.26%。分析条件同实施例 1 。

实施例6

在 5 mL 玻璃反应瓶中，加入 2 mL 纯水，0.011 g KH₂PO₄和 0.021 g K₂HPO₄，搅拌直至固体溶清；加入 1.7 mL 的异丙胺并用磷酸调节pH值到7.5；向反应液中加入 0.005 g转氨酶冻干粉（分别采购自美国药企Codexis, Inc.公司的ATA-P2-A07和ATA-P2-B01）和0.001 g 磷酸吡哆醛，搅拌后加入溶于 0.1 mL N,N-二甲基甲酰胺的 0.1 g N-Cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度 25℃，连续搅拌 24 小时；

反应结束后，反应液通入氮气或负压除去杂质后，用 2 mL 二氯甲烷萃取反应液，得到下层有机相，加入少量无水硫酸钠除水后过滤，用氮气吹干后所得黄色粘稠液体即产品(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶。经高效液相色谱法分析，对映体过量值分别可达 98.54% 和98.89%。分析条件同实施例 1 。

实施例7

在 1 L 玻璃夹套反应瓶中，加入400 mL 纯水，5.3 g KH₂PO₄和 10.6 K₂HPO₄，搅拌直至固体溶清；加入 8.5 mL 的异丙胺并用磷酸调节pH值到7.5；向反应液中加入 2.5 g 转氨酶冻干粉（采购自美国药企Codexis, Inc.公司的ATA-412）和 0.5 g 磷酸吡哆醛，搅拌后加入 50 g N-Cbz-3-哌啶酮；调整并控制反应液温度 25℃，连续搅拌 24 小时；

反应结束后，反应液负压除去杂质后，用等体积二氯甲烷萃取三次，得到下层有机相加入少量无水硫酸钠除水后过滤，在 30℃减压蒸馏浓缩。所得液体在 30℃、氮气流保护下减压烘干 12 小时，称重得 47.8 g 黄色粘稠液体，粗收率为 95.41 %。所得液体即产品(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶，经高效液相色谱法分析，对映体过量值 97.29%。分析条件同实施例 1 。

本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。

Claims

1.一种生物催化制备(R)-1-N-苯甲氧羰基-3-氨基哌啶的方法，其特征是：在以异丙胺作为氮源的条件下，通过酶催化转化N-Cbz-3-哌啶酮直接制备式II的(R)-N-Cbz-3-氨基哌啶；反应式如下：

。

2.如权利要求 1 所述的方法，其特征是：还包括以常规方法分离出式II所述的氨化产物。

3. 如权利要求 1 所述的方法，其特征是：其中所述反应在有机溶剂和水的混合物，或纯水中进行。

4. 如权利要求 3 所述的方法，其特征是：其中所述有机溶剂是与水可混溶的。

5. 如权利要求 1 所述的方法，其特征是：其中所述反应在 pH 范围为 7~9，所述反应在温度为 15~60℃的条件下进行。

6. 如权利要求 1 所述的方法，其特征是其中所述酶是氨基转移酶。

7. 如权利要求 6 所述的方法，其特征是氨基转移酶为采购自美国药企Codexis,Inc.公司的ATA-412、ATA-426、ATA-P2-A07或ATA-P2-B01中的一种。

8.如权利要求1所述的方法，其特征是：反应需加入辅酶磷酸吡哆醛。