CN111118076B - 一种生物催化还原硝基化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种生物催化还原硝基化合物的方法，以辅酶作为氢供体，以烯烃还原酶作为催化剂，催化还原硝基化合物,生成羟胺化合物或胺化合物。本发明提供的生物催化还原硝基化合物的方法，取代了传统上产物提取复杂、危险、污染的化学还原硝基化合物方法，采用市场上可购买获取或自己制备的烯烃还原酶作为催化剂，即可建立一种快速简便并有效的生物催化法还原硝基化合物的方案，将硝基化合物还原为稳定的羟胺化合物或胺化合物，并具有较为广泛的底物适用性，能够实现高通量和快速的硝基还原反应。
Description
技术领域
本发明涉及胺、羟胺化合物制备领域，具体涉及一种生物催化还原硝基化合物的方法。
背景技术
硝基化合物的还原，特别是不同烷基芳香胺、芳基羟胺化合物的合成是化学合成和化工生产中常见的反应类别。传统上，通过铁、锌等还原性金属粉末还原或者高压下的催化加氢完成这类反应。但这类方法有较多副产物的生成,可能会破坏化合物的其它结构，并且反应中需要大量使用重金属，后处理非常繁琐，产品难于分离处理且存在污染，高压加氢也存在安全隐患。
因此，为了避免化学法的污染和危险操作，需要提供一种还原硝基化合物的新方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种高效生物催化还原硝基化合物的方法，采用烯烃还原酶作为催化剂，即可将硝基化合物还原为羟胺化合物或胺化合物，又可避免了化学法的污染和危险操作的问题,合成方法简便、快捷。
本发明提供一种生物催化还原硝基化合物的方法，以辅酶作为氢供体，以烯烃还原酶作为催化剂，催化还原硝基化合物，生成羟胺化合物或胺化合物。
进一步，所述烯烃还原酶包括ERED-101、ERED-103、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09、1430001、1430002；
其中烯烃还原酶ERED-101、ERED-103、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09为从Codexis公司购买获取，烯烃还原酶1430001、1430002来源于淀粉样芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的NAD(P)依赖型烯烃还原酶。
可选的，所述辅酶包括NADPH或NADH。
进一步，所述辅酶选择NADPH。
进一步，还包括辅酶再生系统、助溶剂、缓冲液、非离子表面活性剂。
进一步，所述辅酶再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶或异丙醇和羰基还原酶。
辅酶再生系统主要是用于将NADP+制备和再生为NADPH，构建出一个高效的辅酶NADPH再生系统；还可采用NAD+，用于制备辅酶NADH并构建其再生系统。辅酶再生系统构建的NADH作为氢供体与NADPH作为氢供体的催化效果一致。
进一步，所述助溶剂包括二甲基亚砜、异丙醇、1,3-二氧六环或乙酸乙酯；
所述缓冲液的pH为5.0～10.0，包括磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液。
进一步，所述非离子表面活性剂包括曲拉通、吐温或聚乙二醇。
进一步，包括如下步骤：取硝基化合物、辅酶、辅酶再生系统、烯烃还原酶、助溶剂、缓冲液和非离子表面活性剂进行混合，建立反应体系，进行振荡反应。
进一步，振荡速度为150～400r/min，反应温度为15～45℃，反应时间为20～24h。
本发明还公开了一种所述的生物催化还原硝基化合物的方法的应用，用于医药中间体、农药中间体、染料中间体的制备。
本发明为硝基化合物被催化为胺化合物或羟胺化合物的反应，反应式包括：
(1)
(2)
其中，X为1、2、3、4或5个基团，最优X为1或2个基团；X与硝基位置为邻、间、对位；X可为卤素I、Cl、Br、F，最优X为Cl；X可为甲基、乙基、丙基、异丙基、羟基、酮，最优为甲基、丙酮基；当X为甲基时，最优为与硝基为对位。
或(3)
其中，硝基在吡啶的1、2、3、4或5位上，最优为3位；R在吡啶的1、2、3、4或5位上，当硝基在3位上时，R在2位上，R可为卤素I、Cl、Br、F，R最优为Cl。
本发明中，所述硝基化合物为间硝基苯丙酮、对硝基苯酚(4-nitrophenol)、3-硝基-1-羰基丙苯(1-(3-nitrophenyl)propan-1-one)、4-硝基苯基棕榈酸酯(4-nitrophenylpalmitate)、对硝基甲苯(4-nitrotoluene)、2-氯-6-硝基甲苯或其它硝基化合物。
本发明还公开了一种烯烃还原酶在硝基化合物还原反应中的应用，通过条件的改变，控制得到的产物为芳基羟胺、芳基胺或其它胺化合物。主要用于制备医药中间体、农药中间体、染料中间体，例如：乙胺嘧啶、对胺甲苯、哌仑西平、苯甲酰胺、抗艾滋病类药物、抗溃疡药物、抗抑郁类药物。
本发明的有益效果：本发明提供的生物催化还原硝基化合物制备羟胺化合物或胺化合物的方法，取代了传统上产物提取复杂、危险、污染的化学还原硝基化合物方法。
将有机化合物中含有的硝基进行生物还原，通常是通过一类专一性的生物催化剂来完成的。鉴于生物学上一般认为酶具有高度专一性，有关于这类生物反应的技术研究，一般不会考虑其它类别的酶或生物催化剂。
本发明所涉及的烯烃还原酶，是一种依赖黄素类辅酶和烟酰胺类辅酶的氧化还原酶，也是一种将烯烃还原为烷烃的生物催化剂，此前，没有发现其可用于催化烯烃以外的物质发生氧化还原反应；本发明通过一系列工作发现了烯烃还原酶可用于催化非天然的硝基还原反应生成羟胺或胺化合物，这是未见报道的新观点，也是烯烃还原酶还未被发现的新用途。而烯烃还原酶是可商品化购得的酶，易于购买获取。
本发明公开的方法不会改变化合物除硝基外的其它部分,操作简便快捷，并具有较为广泛的底物适用性，能够实现高通量和快速的硝基还原反应。
附图说明
图1为实施例一制得的样品的液相图谱，图中：间硝基苯丙酮保留时间为4.079min，羟胺产物保留时间：2.710min；
图2为实施例一制得的羟胺产物的质谱图；
图3为实施例二制得的的样品的液相图谱，图中：对硝基甲苯保留时间：4.234min，羟胺产物：3.366min；
图4为实施例二制得的羟胺产物的质谱图；
图5为实施例三制得的的样品的液相图谱，图中：2-氯-6-硝基甲苯保留时间：4.798min，羟胺产物保留时间：3.538min；
图6为实施例三制得的羟胺产物的质谱图；
图7为实施例四制得的胺产物的质谱图；
图8为实施例四制得的胺产物的核磁共振氢谱图；
图9为实施例五制得的胺产物的核磁共振氢谱图；
图10为实施例六制得的胺产物的质谱图；
图11为实施例六制得的胺产物的核磁共振氢谱图。
具体实施方式
以下为具体实施例：
实施例一
取0.25g间硝基苯丙酮(3-硝基苯丙酮)、10mL二甲基亚砜(10％v/v)、2g葡萄糖(20g/L)、1g烯烃还原酶ERED-103、0.1g葡萄糖脱氢酶、1mL曲拉通X-100、5mg NADP+和89mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH7.0)混合后，在30℃温度下，300r/min的摇床反应24h，反应结束后，取样品并加入乙醇，离心，过滤收集滤液，即可制得羟胺化合物。采用LC-MS进行分析，测得硝基化合物转化为羟胺化合物的转化率为95％。
本实施例中，葡萄糖脱氢酶、NADP+、葡萄糖主要是用于NADPH(还原型辅酶Ⅱ)的制备和再生，构建出一个高效的辅酶NADPH再生系统；还可采用NAD+，用于制备辅酶NADH并构建其再生系统。
本实施例中，所述助溶剂还可采用异丙醇、1,3-二氧六环或乙酸乙酯；所述缓冲液还可为三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液，所述缓冲液的pH为5.0～9.0；所述非离子表面活性剂还可为吐温或聚乙二醇。其中，使用吐温作为非离子表面活性剂其转化率为94.5％；以聚乙二醇为非离子表面活性剂其转化率为94％。
本实施例中，烯烃还原酶还可采用ERED-101、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09。
实施例二
取0.25g对硝基甲苯(4-硝基甲苯)、10mL二甲基亚砜(10％v/v)、2g葡萄糖(20g/L)、1g烯烃还原酶ERED-103、0.1g葡萄糖脱氢酶、1mL曲拉通X-100、5mg NADP+和89mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH7.0)混合后，在30℃温度下，300r/min的摇床反应24h，反应结束后，取样品并加入乙醇，离心，过滤收集滤液，即可制得羟胺化合物。羟胺化合物为4-(羟基氨基)甲苯。
本实施例中，葡萄糖脱氢酶、NADP+、葡萄糖主要是用于NADPH(还原型辅酶Ⅱ)的制备和再生，构建出一个高效的辅酶NADPH再生系统；还可采用NAD+，用于制备辅酶NADH并构建其再生系统。
本实施例中，所述助溶剂还可采用异丙醇、1,3-二氧六环或乙酸乙酯；所述缓冲液还可为三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液，所述缓冲液的pH为5.0～9.0；所述非离子表面活性剂还可为吐温或聚乙二醇。
本实施例中，烯烃还原酶还可采用ERED-101、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09。
实施例三
取0.25g1-氯-2-甲基-3-硝基苯、10mL二甲基亚砜(10％v/v)、2g葡萄糖(20g/L)、1g烯烃还原酶ERED-103、0.1g葡萄糖脱氢酶、1mL曲拉通X-100、5mg NADP+和89mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH7.0)混合后，在30℃温度下，300r/min的摇床反应24h，反应结束后，取样品并加入乙醇，离心，过滤收集滤液，即可制得羟胺化合物。羟胺化合物为3-氯-2-甲基苯羟胺。
本实施例中，葡萄糖脱氢酶、NADP+、葡萄糖主要是用于NADPH(还原型辅酶Ⅱ)的制备和再生，构建出一个高效的辅酶NADPH再生系统；还可采用NAD+，用于制备辅酶NADH并构建其再生系统。
本实施例中，所述助溶剂还可采用异丙醇、1,3-二氧六环或乙酸乙酯；所述缓冲液还可为三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液，所述缓冲液的pH为5.0～9.0；所述非离子表面活性剂还可为吐温或聚乙二醇。
本实施例中，烯烃还原酶还可采用ERED-101、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09。
实施例四
取0.25g对硝基甲苯、10mL二甲基亚砜(10％v/v)、2g异丙醇(20g/L)、1g烯烃还原酶1430001、0.1g羰基还原酶、1mL曲拉通X-100、5mg NADP+和89mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH9.0)混合后，在30℃温度下，300r/min的摇床反应24h，经薄层层析(TLC)判断原料完全转化后，用等体积乙酸乙酯萃取反应液、分层，浓缩有机相至干，即可制得胺化合物。通过核磁共振氢谱1H-NMR分析，所得产品为对氨基甲苯。
本实施例中，羰基还原酶、NADP+、异丙醇主要是用于NADPH(还原型辅酶Ⅱ)的制备和再生，构建出一个高效的辅酶NADPH再生系统；还可采用NAD+，用于制备辅酶NADH并构建其再生系统。
本实施例中,烯烃还原酶还可用烯烃还原酶1430002、烯烃还原酶ERED-101、ERED-103、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09，异丙醇还可用葡萄糖代替，羰基还原酶还可用葡萄糖脱氢酶代替；所述助溶剂还可采用异丙醇、1,3-二氧六环或乙酸乙酯；所述缓冲液还可为三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液，所述缓冲液的pH为8.0～10.0；所述非离子表面活性剂还可为吐温或聚乙二醇，萃取所用乙酸乙酯还可用甲基叔丁基醚、二氯甲烷、醋酸异丙脂代替。
实施例五
取0.25g 3-硝基-2-氯吡啶、10mL二甲基亚砜(10％v/v)、2g异丙醇(20g/L)、1g烯烃还原酶1430001、0.1g羰基还原酶、1mL曲拉通X-100、5mg NADP+和89mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH9.0)混合后，在30℃温度下，300r/min的摇床反应24h，经薄层层析(TLC)判断原料完全转化后，用等体积乙酸乙酯萃取反应液、分层，浓缩有机相至干，即可制得胺化合物。通过核磁共振氢谱1H-NMR分析，所得产品为3-氨基-2-氯吡啶。
本实施例中，羰基还原酶、NADP+、异丙醇主要是用于NADPH(还原型辅酶Ⅱ)的制备和再生，构建出一个高效的辅酶NADPH再生系统；还可采用NAD+，用于制备辅酶NADH并构建其再生系统。
本实施例中，烯烃还原酶还可用烯烃还原酶1430002、烯烃还原酶ERED-101、ERED-103、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09，异丙醇还可用葡萄糖代替，羰基还原酶还可用葡萄糖脱氢酶代替；所述助溶剂还可采用异丙醇、1,3-二氧六环或乙酸乙酯；所述缓冲液还可为三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液，所述缓冲液的pH为8.0～10.0；所述非离子表面活性剂还可为吐温或聚乙二醇，萃取所用乙酸乙酯还可用甲基叔丁基醚、二氯甲烷、醋酸异丙脂代替。
实施例六
取0.25g 2-氯-6-硝基甲苯、10mL二甲基亚砜(10％v/v)、2g异丙醇(20g/L)、1g烯烃还原酶1430001、0.1g羰基还原酶、1mL曲拉通X-100、5mg NADP+和89mL磷酸钠缓冲液(100mM,pH9.0)混合后，在30℃温度下，300r/min的摇床反应24h，产物为2-氯-6-氨基甲苯。
本实施例中，羰基还原酶、NADP+、异丙醇主要是用于NADPH(还原型辅酶Ⅱ)的制备和再生，构建出一个高效的辅酶NADPH再生系统；还可采用NAD+，用于制备辅酶NADH并构建其再生系统。
本实施例中，烯烃还原酶还可用烯烃还原酶1430002、烯烃还原酶ERED-101、ERED-103、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09，异丙醇还可用葡萄糖代替，羰基还原酶还可用葡萄糖脱氢酶代替；所述助溶剂还可采用异丙醇、1,3-二氧六环或乙酸乙酯；所述缓冲液还可为三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液，所述缓冲液的pH为8.0～10.0；所述非离子表面活性剂还可为吐温或聚乙二醇，萃取所用乙酸乙酯还可用甲基叔丁基醚、二氯甲烷、醋酸异丙脂代替。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种生物催化还原硝基化合物的方法，其特征在于：以辅酶作为氢供体，以烯烃还原酶作为催化剂，催化还原硝基化合物，生成羟胺化合物，
取硝基化合物、辅酶、辅酶再生系统、烯烃还原酶、助溶剂、缓冲液和非离子表面活性剂进行混合，建立反应体系，进行振荡反应；
所述烯烃还原酶为ERED-101、ERED-103、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09；
其中烯烃还原酶ERED-101、ERED-103、ERED-110、ERED-112、ERED-120、ERED-P1-A04、ERED-P1-E01、ERED-P1-H09从Codexis公司购买获取；
硝基化合物为间硝基苯丙酮、对硝基甲苯或1-氯-2-甲基-3-硝基苯，
所述非离子表面活性剂为曲拉通、吐温或聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的生物催化还原硝基化合物的方法，其特征在于：所述辅酶包括NADPH或NADH。
3.根据权利要求1所述的生物催化还原硝基化合物的方法，其特征在于：所述辅酶再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
4.根据权利要求1所述的生物催化还原硝基化合物的方法，其特征在于：所述助溶剂包括二甲基亚砜、异丙醇、1,3-二氧六环或乙酸乙酯；所述缓冲液的pH为5.0～10.0，包括磷酸盐缓冲液、三羟甲基甲胺-盐酸缓冲液或三乙醇胺-盐酸缓冲液。
5.根据权利要求1所述的生物催化还原硝基化合物的方法，其特征在于：振荡速度为150～400r/min，反应温度为15～45℃，反应时间为20～24h。
6.一种如权利要求1所述的生物催化还原硝基化合物的方法的应用，其特征在于：用于医药中间体、农药中间体、染料中间体的制备。
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