CN113025602A - 固定化精氨酸消旋酶及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了固定化精氨酸消旋酶及其制备方法、应用，固定化精氨酸消旋酶的制备方法，包括以下步骤：S1、将产精氨酸消旋酶的大肠杆菌发酵液制备成重悬液；S2、将步骤S1获得的重悬液依次经过破胞、絮凝获得粗酶液；S3、向步骤S2获得的粗酶液中加入环氧型固定化酶载体，搅拌，加入三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾固体，继续搅拌固定化，一段时间后进行固液分离，获得固定化精氨酸消旋酶。本方法制备的固定化精氨酸消旋酶与游离精氨酸消旋酶酶相比具有更佳的热稳定性、保存稳定性。本方法制备的固定化精氨酸消旋酶催化L‑精氨酸生成DL‑精氨酸方法简单，后处理工艺步骤少且固定化酶可以重复使用，大大降低了转化成本，特别适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及固定化精氨酸消旋酶及其制备方法、应用。
背景技术
DL-精氨酸是L-精氨酸的消旋体，对成人为非必需氨基酸，但体内生成速度较慢，对婴幼儿为必需氨基酸，有一定的解毒作用，其作为D-精氨酸的生产原料，在医药化工领域有着相当广泛的应用。
目前，DL-精氨酸的制备方法有化学合成法和生物酶催化法。文献报道涉及L-精氨酸化学法消旋的方法主要是以水杨醛为催化剂，在冰乙酸溶液中消旋L-精氨酸制备DL-精氨酸。生物酶催化法主要以含精氨酸消旋酶的大肠杆菌全细胞催化L-精氨酸生成DL-精氨酸。化学消旋法用到的水杨醛和冰乙酸对呼吸道有刺激性，吸入后引起咳嗽、胸痛，对眼和皮肤有刺激性且水杨醛可燃，有毒，遇高热、明火及强氧化剂易引起燃烧并放出有毒气体。生物酶全细胞催化法虽然避免了有毒有机试剂的使用，但存在酶不可回收重复利用的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供固定化精氨酸消旋酶及其制备方法，将制备的固定化精氨酸消旋酶用于合成DL-精氨酸，不仅避免了化学消旋过程中有毒有机试剂的使用，又解决了全细胞催化法酶不可回收重复使用的问题。
本发明通过下述技术方案实现：
固定化精氨酸消旋酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、将产精氨酸消旋酶的大肠杆菌发酵液制备成重悬液；
S2、将步骤S1获得的重悬液依次经过破胞、絮凝获得粗酶液；
S3、向步骤S2获得的粗酶液中加入环氧型固定化酶载体，搅拌一段时间后，加入三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾固体，继续搅拌固定化一段时间后进行固液分离，获得固定化精氨酸消旋酶。
本发明所述环氧型固定化酶载体采用市售商业性环氧基酶载体，含有环氧基，粗酶液中的精氨酸消旋酶表面含有可与环氧基共价结合的氨基酸残基，本发明的构思在于：
利用环氧基酶载体的环氧基和精氨酸消旋酶表面的氨基酸残基的共价结合，使酶蛋白稳定且不可逆的固定在环氧基酶载体上。
通过本发明所述方法制备的固定化精氨酸消旋酶用于制备DL-精氨酸与全细胞催化法相比，虽然单次转化率不如全细胞催化高，但可重复使用，累计总转化率远高于全细胞催化法。1g湿菌体用于全细胞转化24h最大极限为消旋70gL-精氨酸，将1g湿菌体所含的酶制成固定化酶在相同条件下转化单次最大极限为消旋50gL-精氨酸，可重复使用5次，若降低底物浓度或延长转化时间，固定化精氨酸消旋酶还可继续使用。为了延长固定化精氨酸消旋酶的使用寿命以获得最大的总产量，在具体实施例中不以单次极限转化率为条件。
进一步地，步骤S3中，搅拌的温度为25-37℃，时间为1h。
进一步地，步骤S3中，
所述三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的加入量以使体系中磷酸盐浓度达到1-2M/L，pH值达到7.0-8.0为计。
进一步地，步骤S3中，固化时间为18-24h。
进一步地，步骤S1中，重悬液的制备过程如下：
大肠杆菌发酵液经过冷冻离心获得湿菌体，湿菌体用生理盐水洗涤后离心，得到的湿菌体用磷酸盐缓冲液重悬获得重悬液。
进一步地，步骤S2中，破胞采用超声破胞或高压匀浆破胞；使用的絮凝剂为十六烷基三甲基溴化铵或聚季铵盐-6。
采用上述制备方法所制备的固定化精氨酸消旋酶。
固定化精氨酸消旋酶的应用，将固定化精氨酸消旋酶用于制备DL-精氨酸。
进一步地，向L-精氨酸水溶液中投入固定化精氨酸消旋酶，25-45℃下反应，直到转化液的比旋光为0，获得DL-精氨酸水溶液，DL-精氨酸水溶液依次经过强酸型阳离子交换树脂吸附、氨水洗脱并减压浓缩结晶获得DL-精氨酸。
一种DL-精氨酸的制备方法，包括以下步骤：
向L-精氨酸水溶液中投入固定化精氨酸消旋酶，25-45℃下反应，直到转化液的比旋光为0，获得DL-精氨酸水溶液，DL-精氨酸水溶液经过后处理获得DL-精氨酸。
本发明所述DL-精氨酸的制备方法以固定化精氨酸消旋酶催化L-精氨酸生成DL-精氨酸，方法简单，后处理工艺步骤少且固定化酶可以重复使用，大大降低了转化成本，特别适合大规模工业化生产。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、通过本发明所述方法制备的固定化精氨酸消旋酶用于制备DL-精氨酸与化学消旋法相比具有更佳的操作安全性、产品安全性和环保性。
2、通过本发明所述方法制备的固定化精氨酸消旋酶用于制备DL-精氨酸与全细胞催化法相比，虽然单次转化率不如全细胞催化高，但可重复使用，累计总转化率远高于全细胞催化法。
3、本发明原料价格低廉、工艺简单，反应条件温和、环境友好，具有更高的经济性和环保性，适用于大规模工业化生产。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
固定化精氨酸消旋酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、取100ml产精氨酸消旋酶的发酵液离心，收集10g湿菌体用50ml生理盐水洗涤离心并重复一次，用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)重悬至100ml，获得重悬液；
S2、将步骤S1获得的重悬液冰浴超声破胞，功率为300W，超声3秒停3秒，超声20min，超声完毕向破胞液中加入1g十六烷基三甲基溴化铵搅拌絮凝30min后离心；收集上清液并用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)定容至100ml，获得粗酶液，磷酸盐缓冲液可以是磷酸钾缓冲液，也可以采用磷酸钠缓冲液；
S3、向步骤S2获得的粗酶液中加入10g LX-1000EP环氧型固定化酶载体，载体(g)与湿菌体(g)重量比为1：1，搅拌1h后，投加磷酸二氢钾1.16g、三水磷酸氢二钾21.15g，37℃水浴保温搅拌固定化18h后过滤，用纯水洗涤2次过滤，获得固定化精氨酸消旋酶。
将实施例1制备的固定化精氨酸消旋酶用于制备DL-精氨酸：
用纯水和6M的盐酸配制pH7.5-8.5，浓度200g/L的L-精氨酸水溶液底物若干，取100ml底物和上述制备的固定化精氨酸消旋酶在37℃下转化5h后，转化液比旋光为0，固液分离回收固化酶重复使用至第20次时，转化时间延长至12h。回收固化酶于4℃保存30天后继续反应，此时转化初始时间为18h，重复使用至第52次时转化液比旋光为0，第53次时转化液比旋光为+2.19，此时转化时间已延长至24h。
由上述应用可知：上述制备的固定化精氨酸消旋酶在上述条件下至少可重复使用50次以上。
实施例2：
固定化精氨酸消旋酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、取1000ml产精氨酸消旋酶的发酵液离心，收集100g湿菌体用500ml生理盐水洗涤离心并重复一次，用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)重悬至1000ml，获得重悬液；
S2、将步骤S1获得的重悬液高压匀浆破胞，压力70-80Mpa，破胞3次，全程控温在15℃以下；向破胞液中加入10ml含量为20％的聚季铵盐-6溶液搅拌絮凝30min后离心；收集上清液并用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)定容至1000ml，获得粗酶液；
S3、向步骤S2获得的粗酶液中加入100g LX-1000EP环氧型固定化酶载体搅拌1h后，投加磷酸二氢钾46.5g、三水磷酸氢二钾147.9g，30℃水浴保温搅拌固定化20h后过滤，用纯水洗涤2次过滤，获得固定化精氨酸消旋酶。
将实施例2制备的固定化精氨酸消旋酶用于制备DL-精氨酸：
将实施例2制备的固定化精氨酸消旋酶按照实施例1所述催化条件在2L酶反应器中进行1L转化，固定化精氨酸消旋酶回收并不间断重复使用了67次。
实施例3：
固定化精氨酸消旋酶的制备方法，包括以下步骤：
S1、取70L产精氨酸消旋酶的发酵液离心，收集7kg湿菌体用35L生理盐水洗涤离心并重复一次，用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)重悬至70L，获得重悬液；
S2、将步骤S1获得的重悬液高压匀浆破胞，压力70-80Mpa，破胞3次，全程控温在15℃以下；向破胞液中加入0.7L含量为40％的聚季铵盐-6溶液搅拌絮凝30min后离心；收集上清液在100L罐中用20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)定容至70L，获得粗酶液；
S3、向步骤S2获得的粗酶液中加入7kg LX-1000EP环氧型固定化酶载体搅拌1h后，投加磷酸二氢钾1.17kg、三水磷酸氢二钾22.21kg，25℃保温搅拌固定化24h后过滤，用纯水洗涤2次过滤，获得固定化精氨酸消旋酶。
将实施例3制备的固定化精氨酸消旋酶用于制备DL-精氨酸：
将实施例3制备的固定化精氨酸消旋酶按照实施例1所述催化条件在100L转化罐中进行70L转化，固定化酶回收并不间断重复使用了58次。
将实施例1-实施例3制备的DL-精氨酸经001*7强酸型阳离子树脂吸附(每升柱体积的树脂吸附0.5升转化液中的DL-精氨酸)，用8％的氨水洗脱，65℃减压浓缩用无水乙醇结晶干燥后，纯度和含量均在98.5％以上。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.固定化精氨酸消旋酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将产精氨酸消旋酶的大肠杆菌发酵液制备成重悬液；
S2、将步骤S1获得的重悬液依次经过破胞、絮凝获得粗酶液；
S3、向步骤S2获得的粗酶液中加入环氧型固定化酶载体，搅拌一段时间后，加入三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾固体，继续搅拌固定化，一段时间后进行固液分离，获得固定化精氨酸消旋酶。
2.根据权利要求1所述的固定化精氨酸消旋酶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，搅拌的温度为25-37℃，时间为1h。
3.根据权利要求1所述的固定化精氨酸消旋酶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，
所述三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾的加入量以使体系中磷酸盐浓度达到1-2M/L，pH值达到7.0-8.0为计。
4.根据权利要求1所述的固定化精氨酸消旋酶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，固化时间为18-24h。
5.根据权利要求1所述的固定化精氨酸消旋酶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，重悬液的制备过程如下：
大肠杆菌发酵液经过冷冻离心获得湿菌体，湿菌体用生理盐水洗涤后离心，得到的湿菌体用磷酸盐缓冲液重悬获得重悬液。
6.根据权利要求1所述的固定化精氨酸消旋酶的制备方法，其特征在于，步骤S2中，破胞采用超声破胞或高压匀浆破胞；使用的絮凝剂为十六烷基三甲基溴化铵或聚季铵盐-6。
7.如权利要求1-6任一项所述制备方法所制备的固定化精氨酸消旋酶。
8.如权利要求7所述固定化精氨酸消旋酶的应用，其特征在于，将固定化精氨酸消旋酶用于制备DL-精氨酸。
9.根据权利要求8所述固定化精氨酸消旋酶的应用，其特征在于，向L-精氨酸水溶液中投入固定化精氨酸消旋酶，25-45℃下反应，直到转化液的比旋光为0，获得DL-精氨酸水溶液。
10.一种DL-精氨酸的制备方法，其特征在于，向L-精氨酸水溶液中投入权利要求1-6任一项所制备的固定化精氨酸消旋酶，25-45℃下反应，直到转化液的比旋光为0，获得DL-精氨酸水溶液。
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