CN105039466A

CN105039466A - 一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法

Info

Publication number: CN105039466A
Application number: CN201510313216.8A
Authority: CN
Inventors: 魏雪纹
Original assignee: HAINAN CHUNTCH PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Hainan Zhuoke Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2035-06-10
Also published as: CN105039466B

Abstract

本发明公开了一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，以β-D-阿糖腺苷为起始原料，加入反应酶进行酶促合成反应，经过滤、析晶后既得所述单磷酸阿糖腺苷。具体包括以下步骤：1）配制反应液：在温度为25℃~45℃的条件下，将去离子水、ATP.Na₂、β-D-阿糖腺苷、甘油、镁离子溶液搅拌得混合液，在混合液中加入碱性溶液调节PH值至7.5~9.0，加入二硫苏糖醇，既得所述反应液；2）酶促合成反应：在所述反应液中加入反应酶进行酶促合成反应，控制反应液的PH值为7.6~8.6，反应时间为24h~72h，完成酶促合成反应；3）过滤、析晶：将步骤2）中完成酶促合成反应的反应液冷却，过滤得滤液，将滤液冷却析晶，再过滤，既得所述单磷酸阿糖腺苷。本发明成本较低，产品易分离纯化，纯度高，对环境污染小。

Description

一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法

技术领域

本发明涉及抗病毒药物的制备技术领域，尤其涉及一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法。

背景技术

单磷酸阿糖腺苷(vidarabinemonophosphate，Am-AMP)是β-D-阿糖腺苷(Ara-A)的单磷酸化合物，是一种人工合成的腺嘌呤核苷类抗病毒药。目前在我国主要用于慢性病毒性肝炎、单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、牛痘病毒以及多种动物疱疹病毒和少数致癌RNA病毒等。单磷酸阿糖腺苷已在欧洲、美国、日本等许多国家上市。由于单磷酸阿糖腺苷临床用药剂量很大，为满足临床用药需要，适合工业化生产的单磷酸阿糖腺苷的合成工艺开发非常必要。现有的单磷酸阿糖腺苷的制备方法主要有化学法、生物转化法以及基因工程法，化学法因研究开发技术比较成熟，目前市场上的单磷酸阿糖腺苷普遍采用化学法制备。

中国专利公布号CN103204890A公开了一种磷酸化制备单磷酸阿糖腺苷的方法，具体的说，以阿糖腺苷为起始原料，经惰性气体保护在缚酸剂和催化剂的作用下经磷酸化后，通过活性炭脱色等后处理即得粗品单磷酸阿糖腺苷，此工艺路线简单，成本低，收率高，相对于现有技术，生产过程毒性大大降低，适合工艺化生产。但是该方法使用惰性气体保护，在缚酸剂和催化剂的作用下反应，反应后产生大量含有有机溶剂和三氯氧磷的废液，三氯氧磷遇水蒸气分解成磷酸与氯化氢，含磷可致磷中毒，对皮肤、粘膜有刺激腐蚀作用，毒性与光气类似。短期内吸入大量蒸气，可引起上呼吸道刺激症状、咽喉炎、支气管炎；严重者可发生喉头水肿窒息、肺炎、肺水肿、紫绀、心力衰竭。亦可发生贫血、肝脏损害、蛋白尿，与眼和皮肤接触引起灼伤。长期低浓度接触可引起口、眼及呼吸道刺激症状，对环境污染较大。

中国专利公布号CN104372050A公开了一种单磷酸阿糖腺苷的方法，通过先制备共表达嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶的基因工程菌，再利用该基因工程菌制备单磷酸阿糖腺苷的方法。于通过分子克隆的方法在基因工程菌中共同表达嘌呤核苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶，获得具有高酶比活的阿糖腺苷生物转化菌，应用本发明得到的菌体生产阿糖腺苷，将得到的阿糖腺苷经惰性气体保护在缚酸剂、催化剂的作用下经磷酸化后，处理即得单磷酸阿糖腺苷。最终还是将得到的阿糖腺苷经惰性气体保护在缚酸剂、催化剂的作用下经磷酸化后，处理即得单磷酸阿糖腺苷，该方法与中国专利公布号CN103204890A一样存在着相同的问题。

因此，亟需提供一种构思不同的单磷酸阿糖腺苷的制备方法，以解决上述问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，解决了现有技术中制备单磷酸阿糖腺苷的过程对环境污染较大的技术问题。

本发明采用的技术手段如下：一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，以β-D-阿糖腺苷为起始原料，加入反应酶进行酶促合成反应，经析晶、过滤后既得所述单磷酸阿糖腺苷。

具体地，包括如下步骤：

1）配制反应液：在温度为25℃~45℃的条件下，将ATP.Na₂、β-D-阿糖腺苷、甘油、镁离子溶液搅拌得混合液，所述ATP.Na₂、β-D-阿糖腺苷、镁离子溶液的摩尔质量比为1：1~5：10~15：0.05~0.2，在混合液中调节PH值至7.5~9.0，加入二硫苏糖醇既得所述反应液。

2）酶促合成反应：在所述反应液中加入浓度为10^-5~10^-3mmol/L反应酶进行酶促合成反应，加入碱性溶液控制反应液的PH值为7.6~8.6，反应时间为24h~72h，完成酶促合成反应。

3）过滤析晶：将步骤2）中完成酶促合成反应的反应液冷却至15℃~24℃，过滤得滤液，将所述滤液冷却至-2℃~14℃析晶，再过滤，干燥，既得所述单磷酸阿糖腺苷。

其化学反应式如下：

优选地，在步骤2）中，反应液的pH值不再变化时取样做HPLC分析，当β-D-阿糖腺苷含量小于3%时，完成酶促合成反应。

优选地，在步骤1）中，所述镁离子溶液为醋酸镁、硫酸镁、氯化镁的一种。

优选地，在步骤2）中，所述合成酶为肌酸激酶、磷酸激酶、腺苷激酶的一种。

优选地，在步骤2）中，在反应时间为24h后，每间隔6h~10h取样做HPLC分析，当β-D-阿糖腺苷含量小于3%时，完成酶促合成反应。

优选地，在步骤3）中，所述过滤为通过粗蛋白膜过滤。

优选地，在步骤1）中，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液、浓氨水、碳酸氢钠溶液、碳酸钠溶液的一种。

采用本发明所提供的一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，相对于现有采用化学有机溶剂制备单磷酸阿糖腺苷的方法，其成本较低，产品易分离纯化，产品纯度高，对环境污染小。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，包括以下步骤：

1）配制反应液：向2L锥形瓶中分别加入700ml去离子水、1.1mol甘油、0.4mlTritonX-100、0.007mol硫酸镁和0.1mol的ATP.Na₂，然后搅拌下用10NNaOH（约15ml~20ml）调节溶液的PH值至7.5±0.1；向以上溶液中加124mg二硫苏糖醇并搅拌溶解，补加去离子水至总体积800ml；加入0.1molAra-A，搅拌均匀后通过水浴加热至内温达到27℃±2℃。

2）酶促合成反应：溶液加入肌酸激酶，使其浓度为1.0×10^-3mmol/L，水浴加热保温27℃±2℃并开始计时反应；反应期间需要及时检测溶液的PH值，当PH值至7.2±0.3是向溶液中缓慢加入氨水使PH值恢复至7.5±0.1；保温反应时间36小时以后每间隔10h取样HPLC分析，当Ara-A≤3%时反应结束。

3）过滤析晶：1、析晶：反应完成后将溶液冷却至15℃，然后通过粗蛋白膜过滤；滤液冷却至10℃；大量固体析出后降温至0℃，保温搅拌5小时后过滤。2、溶解：搅拌状态下，400ml0.25NNaOH溶液中分批加入固体，加入期间溶液温度控制在10℃；全部加完后继续搅拌50min后测PH值，加入10NNaOH使最终PH值达到6.0±0.1。3、析晶：保温在10℃的条件下，加入6NHCl使溶液PH值达到1.8±0.05；然后降温至0℃并保温搅拌5小时后析晶结束。4、过滤、干燥：抽滤至无明显流出液，然后用20L0.01NHCl水溶液淋洗，湿品在50℃鼓风干燥5h后，既得成品单磷酸阿糖腺苷，收率为77.15%，纯度为99.6%。

实施例2

一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，包括以下步骤：

1）配制反应液：向2000L反应釜中分别加入700L去离子水、1100mol甘油、0.4LTritonX-100、9.03mol氯化镁和100molATP.Na₂；然后搅拌下用10NNaOH（约15-20L）调节溶液的PH值至9.0±0.1；溶液中加124g二硫苏糖醇和分批加入100molAra-A，加入期间搅拌速度至60Hz，搅拌均匀后再次检测PH值并可用氨水调节PH值至9.0±0.1，控制反应温度为32℃±2℃。

2）酶促合成反应：搅拌速度降至35Hz，向以上溶液中加入肌酸激酶，使其浓度为1.0×10^-5mmol/L，反应釜密闭状态下保温32℃±2℃开始计时反应；反应期间及时检测溶液PH值，当PH值至7.2±0.3时是向溶液中缓慢加入氨水使PH值恢复至9.0±0.1；检测溶液PH值为反应前6h内每60min检测一次，4h~24h内每1h~2h检测一次，24h以后每3~5h检测一次。保温反应时间72小时以后每6小时取样HPLC分析，当Ara-A≤1%时反应结束。

3）过滤析晶：反应完成后将溶液冷至18℃，然后通过粗蛋白膜过滤；滤液进入3000L反应釜，并冷却至5℃；保温子5℃的条件下，加入6NHCl使溶液PH值达到1.2±0.1。控制溶液温度为5℃的条件下，加入Ara-AMP晶种85g，然后保温搅拌至大量固体析出后降温至0℃，保温搅拌5小时后每隔2h测上清OD，至两次相差小于3%后溶液温度降至-2℃±1℃，然后保温搅拌5小时；离心至无明显流出液，然后用25L0.01NHCl水溶液淋洗，再离心2小时后取出固体。

4）重结晶：1、溶解：搅拌状态下，400L0.25NNaOH溶液中分批加入固体，加入期间溶液温度控制在15℃；全部加完后继续搅拌60分钟后测PH值，加入10NNaOH使最终使PH值达到6.0±0.1。2、过滤：溶液经过高压超滤后进入1000L结晶釜并用不超过50L的去离子水淋洗设备和超滤膜。3、析晶：待结晶液测OD260nm，用去离子水稀释至1650-1700个OD/ml；保持温度为15℃，加入6NHCl使溶液PH达到1.8±0.05；然后降温至2℃并保温搅拌5小时后每隔2小时测上清OD260nm：当≤原液8%时析晶结束。4、离心：离心至无明显流出液，然后用23L0.01NHCl水溶液淋洗，再离心1小时后取出固体；进入鼓风干燥箱后设置温度38℃并开始鼓风干燥，至K.F<8%时结束；既得成品单磷酸阿糖腺苷，收率为75.14%，纯度为99.5%。

实施例3

一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，包括如下步骤：

1）配制反应液：向2L锥形瓶中分别加入700ml去离子水、1.5mol的甘油、0.4mlTritonX-100、0.02mol的四水醋酸镁和0.1mol的ATP.Na₂，然后搅拌下用10NNaOH（约15ml~20ml）调节溶液的PH值至8.3±0.1；向以上溶液中加124mg二硫苏糖醇并搅拌溶解，补加去离子水至总体积800ml；加入0.4mol的Ara-A，搅拌均匀后通过水浴加热至内温达到43℃±2℃。

2）酶促合成反应：溶液加入磷酸激酶，使其浓度为1.0×10^-3mmol/L，水浴加热保温43℃±2℃并开始计时反应；反应期间需要及时检测溶液的PH值，当PH值至7.2±0.3时，向溶液中缓慢加入氨水使PH值恢复至8.3±0.1；保温反应时间24小时以后每间隔8h取样HPLC分析，当Ara-A≤3%时反应结束。

3）过滤析晶：1、析晶：反应完成后将溶液冷却至20℃，然后通过粗蛋白膜过滤；滤液冷却至14℃；大量固体析出后降温至2℃，保温搅拌5小时后过滤。2、溶解：搅拌状态下，400ml0.25NNaOH溶液中分批加入固体，加入期间溶液温度控制在14℃；全部加完后继续搅拌55分钟后测PH值，加入10NNaOH使最终PH值达到6.0±0.1。3、析晶：保温在14℃的条件下，加入6NHCl使溶液PH值达到1.8±0.05；然后降温至2℃并保温搅拌5小时后析晶结束。4、过滤、干燥：抽滤至无明显流出液，然后用22L0.01NHCl水溶液淋洗，湿品在50℃鼓风干燥5h后，既得成品单磷酸阿糖腺苷，收率为78.38%，纯度为99.1%。

实施例4

一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，包括如下步骤：

1）配制反应液：向2L锥形瓶中分别加入800ml去离子水、1.2mol的甘油、0.5mlTritonX-100、0.0089mol的四水醋酸镁和0.1mol的ATP.Na₂，然后搅拌下用10NNaOH（约15ml~20ml）调节溶液的PH值至8.3±0.1；向以上溶液中加124mg二硫苏糖醇并搅拌溶解，补加去离子水至总体积800ml；加入0.1mol的Ara-A，搅拌均匀后通过水浴加热至内温达到38℃±2℃。

2）酶促合成反应：溶液加入腺苷激酶，使其浓度为1.0×10^-4mmol/L，水浴加热保温38℃±2℃并开始计时反应；反应期间需要及时检测溶液的PH值，当PH值至7.2±0.3时，向溶液中缓慢加入氨水使PH值恢复至8.3±0.1；保温反应时间24小时以后每间隔8h取样HPLC分析，当Ara-A≤3%时反应结束。

3）过滤析晶：1、析晶：反应完成后将溶液冷却至20℃，然后通过粗蛋白膜过滤；滤液冷却至14℃；大量固体析出后降温至2℃，保温搅拌5小时后过滤。2、溶解：搅拌状态下，400ml0.25NNaOH溶液中分批加入固体，加入期间溶液温度控制在14℃；全部加完后继续搅拌55分钟后测PH值，加入10NNaOH使最终PH值达到6.0±0.1。3、析晶：保温在14℃的条件下，加入6NHCl使溶液PH值达到1.8±0.05；然后降温至2℃并保温搅拌5小时后析晶结束。4、过滤、干燥：抽滤至无明显流出液，然后用24L0.01NHCl水溶液淋洗，湿品在55℃鼓风干燥5h后，既得成品单磷酸阿糖腺苷，收率为78.73%，纯度为99.5%。

在实施例中反应酶均采用了肌酸激酶，肌酸激酶在哺乳动物肌肉细胞浆中的含量很高，可以从动物肌肉提取的肌酸激酶。腺苷激酶和磷酸激酶均属于核苷激酶，存在于肝脏、肾脏、酵母等。以三磷酸腺苷二钠（ATP.Na₂）和β-D-阿糖腺苷在最适合酶反应条件下生产单磷酸阿糖腺苷的过程，提高了产品的纯度，对反应的控制和产品纯化更为有利。

在生产过程中使用了监控PH值的方法来监控反应过程，用HPLC的方法检测反应终点，酶在反应过程中不断地释放H⁺，我们利用酶反应过程中pH值的变化来监测反应，通过滴加稀碱液来保持酶反应在恒定的碱性条件下进行。用HPLC检测β-D-阿糖腺苷的含量可以判断反应是否完成及完成的程度，从而使得所制备的单磷酸阿糖腺苷在纯度上更优越。

更重要的是，使用酶法制备单磷酸阿糖腺苷，反应过程中不采用有机溶剂，避免了反应中化学试剂尤其是三氯氧磷而造成对环境污染的问题，实现反应绿色环保无污染，具有显著的进步。

综上所述，采用本发明所提供的一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，反应过程可监控，成本较低，产品易分离纯化，纯度高，对环境污染小。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，其特征在于，以β-D-阿糖腺苷为起始原料，加入反应酶进行酶促合成反应，经过滤、析晶后既得所述单磷酸阿糖腺苷。

2.如权利要求1所述的一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1）配制反应液：在温度为25℃~45℃的条件下，将ATP.Na₂、β-D-阿糖腺苷、甘油、镁离子溶液搅拌得混合液，所述ATP.Na₂、β-D-阿糖腺苷、甘油、镁离子溶液的摩尔质量比为1：1~5：10~15：0.05~0.2，在混合液中加入调节PH值至7.5~9.0，加入二硫苏糖醇既得所述反应液；

2）酶促合成反应：在所述反应液中加入反应酶使其浓度为10^-5~10^-3mmol/L，进行酶促合成反应，加入碱性溶液控制反应液的PH值为7.6~8.6，反应时间为24h~72h，完成酶促合成反应；

3）过滤、析晶：将步骤2）中完成酶促合成反应的反应液冷却至15℃~24℃，过滤得滤液，将所述滤液冷却至-2℃~14℃析晶，再过滤，既得所述单磷酸阿糖腺苷。

3.如权利要求2所述的一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，反应液的pH值不再变化时取样做HPLC分析，当β-D-阿糖腺苷含量小于3%时，完成酶促合成反应。

4.如权利要求2所述的一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，其特征在于，在步骤1）中，所述镁离子溶液为醋酸镁、硫酸镁、氯化镁的一种。

5.如权利要求2所述的一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，所述反应酶为肌酸激酶、磷酸激酶、腺苷激酶的一种。

6.如权利要求2所述的一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，其特征在于，在步骤2）中，在反应时间为24h后，每间隔6h~10h取样做HPLC分析，当β-D-阿糖腺苷含量小于3%时，完成酶促合成反应。

7.如权利要求2所述的一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，其特征在于，在步骤3）中，所述过滤为通过粗蛋白膜过滤。

8.如权利要求2所述的一种单磷酸阿糖腺苷的制备方法，其特征在于，在步骤1）中，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液、浓氨水、碳酸氢钠溶液、碳酸钠溶液。