CN114381401B - 一种降解污废水中cod的厌氧复合菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种降解污废水中COD的厌氧复合菌剂，包含蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌，蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的活菌数之比为1:4‑7:1，其中所述地中海短波单胞菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24126，使用本发明的复合菌剂后可有效提高厌氧系统的启动速度，提高系统的处理能力及抗冲击能力，增加水体的可生化性，降低难降解的有机污染物的比例，减少剩余污泥的产生量，改善污泥沉降性能。

Description

一种降解污废水中COD的厌氧复合菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种复合微生物菌剂，具体涉及一种能够在厌氧条件下降解工业污废水中COD的复合微生物菌剂，属于环境微生物技术领域。
背景技术
我国是工业大国，工业废水的排放量巨大。我国工业废水的来源主要包括造纸、焦化、制药和纺织印染等行业，这些行业产生的废水大多为高浓度难降解的有机废水，具有高化学需氧量(COD)、难降解、水质复杂和毒性大的特点。目前，工业废水的无害化和资源化已经成为解决环境污染和水资源短缺问题的关键环节。
处理有机工业废水的主要方法有化学氧化法、萃取法、吸附法、焚烧法、催化氧化法和生化法等，但只有生化法的工艺相对成熟，也是废水处理中应用最广的方法。普通生物法处理污废水具有COD降解效率低下、出水COD不达标、系统启动速率慢、抗冲击能力差、容易产生二次污染和原始工艺成本高、工艺复杂等问题。而厌氧生物技术因其有机负荷高、运行能耗低、运行费用低廉、污泥产量少及资源可回收等多重优势，已成为国内外废水处理领域的研究热点。厌氧生物处理技术从1860年研发至今，该技术在无氧的条件下，依靠体系中的兼性厌氧和厌氧微生物的代谢活动将污水中的大分子有机物转化为甲烷、二氧化碳和水，实现污水的能源化回收，是一种可持续发展型污水处理技术，被广泛的应用于高浓度有机工业废水的处理中。
厌氧生物处理技术主要依靠微生物的特性进行处理。大量研究表明，筛选分离培养出的特种微生物功能菌与传统微生物法相比在COD降解领域表现出更加优越的特性，因此对特种微生物的培养和驯化就显得尤为重要，经过培养的厌氧微生物能降解水中的酚类、含氮杂环类和多环芳烃类等难降解污染物。
复合厌氧菌剂能够在结合各个菌种作用效果的基础上，不同菌株之间产生协同配合作用，在污废水的处理中发挥更好的增效作用，进而降低企业的运行成本，具有更广的应用领域和普适性。
发明内容
本发明针对污废水的厌氧处理中现有的微生物菌种在COD降解效率上所存在的不足，提供一种对废水环境适应性强、成本低、无二次污染且在高难有机废水中对COD的降解率可达到80％以上的厌氧复合微生物菌剂。
一种降解污废水中COD的厌氧复合菌剂，包含蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌(Brevundimonas mediterranea)COD-Y-1，其中所述地中海短波单胞菌COD-Y-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物所，保藏编号为：CGMCC No.24126，保藏日期为：2021年12月17日，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示，在没有特别说明的情况下，本发明中所述的地中海短波单胞菌均是指地中海短波单胞菌COD-Y-1菌株。
优选的，所述蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的活菌数之比为1:4-7:1，更优选1:3-3:1，最优选1:1.5-2.5:1。
优选的，每g或每ml的厌氧复合菌剂中包含的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的活菌量之和不低于60×108CFU，更优选80×108CFU以上，最优选(80-110)×108CFU。
优选的，所述厌氧复合菌剂中还包含枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、乳酸菌、酵母中的任意一种或多种的复配。
优选的，所述厌氧复合菌剂呈固态，包含如下活菌量：蜡样芽孢杆菌(20-60)×108CFU/g，优选40×108CFU/g；地中海短波单胞菌(40-80)×108CFU/g，优选60×108CFU/g。
进一步优选的，固态的厌氧复合菌剂包含如下菌粉：蜡样芽孢杆菌20-60wt％，优选40wt％；地中海短波单胞菌40-80wt％，优选60wt％，其中蜡样芽孢杆菌菌粉的活菌量为(100-120)×108CFU/g，地中海短波单胞菌菌粉的活菌量为(70-90)×108CFU/g。
本发明厌氧复合菌剂中所选用的菌株特性及功能如下：
(1)蜡样芽孢杆菌：可产生酸类物质，有效的将有机废水中含有的多种大分子有机物降解为小分子物质，增加水体的可生化性，使功能菌更好的发挥作用，大大增加COD的降解效率。
(2)地中海短波单胞菌(Brevundimonas mediterranea)：产酶微生物，可产生过氧化氢酶等多种酶类物质，高效降解水体中的有机物，并对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。
本发明提供的厌氧复合菌剂的有益效果为：
(1)菌剂添加量低，见效速度快，COD降解效果好；实验室条件下，分别以造纸废水和丝绸废水为测试对象，在添加量为100-1000ppm时，即可达到83％以上的COD降解率；
(2)使用本发明的复合菌剂后可有效提高厌氧系统的启动速度，提高系统的处理能力及抗冲击能力，增加水体的可生化性，降低难降解的有机污染物的比例，减少剩余污泥的产生量，改善污泥沉降性能；
(3)菌种数量少，成本低，仅包含两种菌种，且蜡样芽孢杆菌可选自市场上任一厂家的产品，可合理控制成本；
(4)使用本发明的复合菌剂后可在水体中同时产生抗生素类物质，抑制致病菌的生长，净化水体，且不破坏原始环境、无二次污染、处理效果好且操作简便。
本发明还要求保护上述厌氧复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：无菌条件下分别取蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌接种于富集培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h，得到一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下分别将蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的一级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于富集培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h，得到二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的二级种子培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)、150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得两种菌株的发酵液；
(4)制备复合菌剂，不同形态的复合菌剂制备方法如下：
液体复合菌剂：将步骤(3)所得的两种菌株的发酵液和其他菌株的发酵液进行稀释，按比例灌装，即得液体复合菌剂；
固体复合菌剂：将步骤(3)所得的两种菌株的发酵液离心后制成菌泥，蜡样芽胞杆菌的菌泥置于50-70℃的烘箱中烘干，地中海短波单胞菌的菌泥中添加保护剂后冷冻干燥，后粉碎制得菌粉，将各菌种的菌粉按质量比混合，即得固体的复合菌剂。
本发明中所述的通气比是指每分钟内通入发酵罐的空气体积与发酵液总体积之比。
进一步，所述富集培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
进一步，所述蜡样芽孢杆菌的发酵培养基组成为：碳源10-30g/L、氮源15-30g/L、PO4 3-0.6-1.5g/L、K+0.4-1.0g/L、Mg2+0.05-0.15g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
进一步，所述地中海短波单胞菌的发酵培养基组成为：碳源20-40g/L、氮源5-15g/L、PO4 3-1.0-2.0g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.05-0.15g/L、Zn2+0.05-0.2g/L、Mn2+0.01-0.02g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8。
优选的，所述K+的来源为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸钾、氯化钾、硝酸钾中的一种或多种，所述Mg2+的来源为硫酸镁、氯化镁中的一种或多种，所述Na+的来源为氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、碳酸钠、醋酸钠、琥珀酸钠中的一种或多种，所述Zn2+的来源为硫酸锌、氯化锌、硝酸锌中的一种或多种。
进一步，所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种。
进一步，所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、豆饼粉、尿素、硫酸铵中的一种或多种。
进一步，所述保护剂为淀粉、甘油或麸皮中的一种或多种，优选的，所述保护剂的添加量为地中海短波单胞菌菌粉质量的30-50wt％。
本发明还要求保护使用上述的厌氧复合菌剂净化水体的方法，包括向水体中施加厌氧复合菌剂的步骤，优选的，厌氧复合菌剂的施加量为50ppm以上，更优选50-2000ppm，进一步优选100-1000ppm，最优选200-500ppm。
本发明还要求保护上述的厌氧复合菌剂在水净化领域的应用，优选的，所述厌氧复合菌剂用于降解水中的COD。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：地中海短波单胞菌COD-Y-1的筛选与分离
(1)菌株的筛选分离
采集临沂市费县某工业污水处理站生化段厌氧池污水，采用梯度稀释法将该污水稀释至10-2、10-3和10-4，分别吸取各稀释液100μl至分离培养基(蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂粉15g，自来水1000mL)中，涂布均匀后倒置于厌氧罐中，30℃条件下培养，约72h长出单菌落。挑选形态相异的单菌落转接至试管斜面分离培养基上，置于厌氧罐中30℃条件下培养约72h，然后转移至4℃冰箱中保藏备用。
按上述分离方法共得到菌株4株，分别编号：COD-Y-1、COD-Y-2、COD-Y-3、COD-Y-4。
(2)效果评价
无菌环境中，将初筛得到的4株菌分别挑取1环接种于盛有100mL活化培养基(蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g，自来水1000mL)的250mL三角瓶中，30℃、220rpm条件下培养24h进行活化，得活化液。
使用印染废水作为评价培养基，分别吸取0.1mL各菌株的活化液接种至盛有100mL评价培养基的100mL厌氧瓶中，30℃条件下静置培养。设置1组，用无菌水代替活化液作为对照组，各实验组设置3个平行，定期检测评价培养基中COD的含量。
COD的检测方法按照《HJ828-2017水质化学需氧量的测定重铬酸盐法》执行，结果如表1所示。
表1.各菌株降解COD的效果
根据8天后的检测结果可知，与其他菌株相比，COD-Y-1菌株在降解COD方面具有突出优势。该菌株在两天之后开始明显起效，到第四天水体COD值大幅下降，降解到第八天时COD值基本稳定，降解率可达66.78％。
实施例2：地中海短波单胞菌COD-Y-1的检测鉴定
1、实验方法
1.1细菌基因组DNA的提取
(1)用2ml离心管收集1.0×109(1ml菌液OD600为1-1.5)的细菌培养物，12,000×g离心30s，弃尽上清。用150μl已加入RNase A的Buffer S悬浮沉淀。
(2)加入20μl溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5min。
(3)加入30μl 0.25mol/L EDTA(pH 8.0)，混合均匀，冰浴5min。
(4)加入450μl Buffer G-A，旋涡振荡15s，65℃水浴10min。
(5)加入400μl Buffer G-B和1ml Buffer DV(4℃预冷)，用力混合，12,000×g离心2min。
(6)尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1ml 4℃预冷Buffer DV，用力混合，12,000×g离心2min。
(7)丢弃上相，将下相转移至滤器(滤器置于2ml离心管中)，12,000×g离心1min。
(8)弃滤器，在滤液中加入400μl Buffer BV，混合均匀。
(9)将制备管置于2ml离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000×g离心1min。
(10)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入500μl Buffer W1，12,000×g离心1min。
(11)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12,000×g离心1min。
(12)以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。
(13)弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12,000×g离心1min。
(14)将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加100-200μlEluent或去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
2、细菌基因组PCR扩增
表2 PCR扩增引物设计
引物名称 序列
27F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3
PCR扩增反应体系
在0.2ml离心管中加入以下成分：
表3 PCR扩增反应体系
试剂 体积
基因组DNA(20ng/μl) 1.0μl
10×Buffer(含2.5mmol/L Mg2+) 5.0μl
Taq聚合酶(5u/μl) 1.0μl
dNTP(10mM) 1.0μl
27F引物(10uM) 1.5μl
1492R引物(10uM) 1.5μl
ddH2O 39.0μl
总体积 50.0μl
轻弹混匀，瞬时离心收集管壁上的液滴至管底，在PCR扩增仪上进行PCR反应，反应参数如表4所示：
表4 PCR扩增反应程序
预变性 变性 退火 延伸 终延伸 循环数
95℃，5min 95℃，30s 58℃，30s 72℃，1min30s 72℃，7min 35
反应完成后，取3μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR扩增片段。
3、PCR产物的回收
PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行，步骤如下：
(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶放入干净的离心管中，称取重量。
(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热直至凝胶块完全熔化。
(3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；当分离的DNA片段小于400bp时，加入1个凝胶体积的异丙醇。
(4)将混合液转移到DNA制备管12,000×g离心1min，弃滤液。
(5)将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。
(6)将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700μl Buffer W2，12,000×g离心1min。
(7)将制备管置回2ml离心管中，12,000×g离心1min。
(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加25-30μl去离子水，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
4、序列测定与分析
取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序，菌株COD-Y-1的16S rDNA基因序列测定结果如SEQ ID No:1所示。
5、序列分析
用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，即为鉴定结果。
COD-Y-1菌株斜面经过16S rDNA基因序列测序，将测序结果在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYP E＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)中比对，选择相似度最大的序列作为物种鉴定结果，鉴定为地中海短波单胞菌Brevundimonas mediterranea，结果如表5所示。
表5样品的NCBI比对结果
实施例3:菌剂配方中各菌种不同比例的效果评价
3.1降解COD评价实验：
菌剂配方中各菌粉分别按照不同比例(质量比)进行复配的效果评价，其中蜡样芽孢杆菌菌粉的活菌量为(100-120)×108CFU/g，地中海短波单胞菌菌粉的活菌量为(70-90)×108CFU/g；
分别将100mL生化段造纸废水分装于100mL厌氧瓶中，115℃灭菌30分钟，后冷却至室温。在无菌条件下，分别向其中加入蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌以不同比例进行复配的固体菌剂200ppm，后置于30℃条件下静置培养，每隔2d检测废水中的COD含量。每个实验组设置3个平行实验，并设置1个未添加菌剂的空白对照组，具体实验安排如下：
(1)空白对照组：未加菌剂；
(2)实验组1：地中海短波单胞菌100wt％；
(3)实验组2：蜡样芽孢杆菌20wt％、地中海短波单胞菌80wt％；
(4)实验组3：蜡样芽孢杆菌30wt％、地中海短波单胞菌70wt％；
(5)实验组4：蜡样芽孢杆菌40wt％、地中海短波单胞菌60wt％；
(6)实验组5：蜡样芽孢杆菌50wt％、地中海短波单胞菌50wt％；
(7)实验组6：蜡样芽孢杆菌60wt％、地中海短波单胞菌40wt％；
(8)实验组7：蜡样芽孢杆菌70wt％、地中海短波单胞菌30wt％；
(9)实验组8：蜡样芽孢杆菌80wt％、地中海短波单胞菌20wt％；
(10)实验组9：蜡样芽孢杆菌100wt％。
各实验组最终复配所得菌剂的活菌量均为80×108-110×108CFU/g。
3.2实验结果
COD的检测方法按照《HJ828-2017水质化学需氧量的测定重铬酸盐法》执行，效果评价实验结果见表6：
表6.不同配比的复合菌剂降解COD的效果评价
由表6中的结果可知，不同实验组均有一定的COD降解效果，但由于菌种的比例不同，效果也有较大差距。其中实验组9的COD降解效果最差，八天降解率仅为43.3％，可见地中海短波单胞菌对COD的降解起到重要作用；实验组1的COD降解率也仅为61.4％，说明蜡样芽孢杆菌也是菌剂的重要组成成分，只有两者协同使用才可达到最优效果。
实验组3-6的COD降解效果较好，实验组3的降解效果达到79％，效果最好的为实验组4，八天降解率达84.4％，由此确定为该厌氧菌剂的最佳配比。
实施例4：复合菌剂在丝绸废水中降解COD效果评价
4.1复合菌剂的准备固体复合菌剂的制备方法如下：
(1)一级种子培养：无菌条件下分别取蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌接种于富集培养基中，富集培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，且pH＝7-7.5，于25℃、220rpm的条件下培养36h，得到一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下分别将蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的一级种子培养液按照5vol％的接种量接种于富集培养基中，于35℃、220rpm的条件下培养12h，得到二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的二级种子培养液按照5vol％的接种量接种于发酵培养基中，其中，蜡样芽孢杆菌的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨12g/L、磷酸氢二钾2g/L、酵母浸粉7g/L、硫酸镁0.5g/L，溶剂为水，且pH＝7-7.5；地中海短波单胞菌的发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L、豆饼粉10g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.5g/L，硫酸锌0.25g/L、硫酸锰0.05g/L，溶剂为水，且pH＝7-7.5，控制温度为25℃，通气比为1:(1-2)、220rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的发酵液；
(4)制备固体复合菌剂：将步骤(3)所得的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的发酵液离心后制成菌泥，蜡样芽孢杆菌的菌泥置于50℃的烘箱中烘干，地中海短波单胞菌的菌泥中添加与菌泥质量相等的淀粉做保护剂后冷冻干燥，后均粉碎制得菌粉，将两种菌粉按质量比混合，即得固体复合菌剂。
降解COD的固体复合菌剂由以下菌粉按照质量比复配组成：蜡样芽孢杆菌40％、地中海短波单胞菌60％，其中蜡样芽孢杆菌菌粉的活菌量为(100-120)×108CFU/g，地中海短波单胞菌菌粉的活菌量为(70-90)×108CFU/g，最终复配得到复合菌剂的活菌量约为(80-100)×108CFU/g。
4.2降解COD效果评价实验
分别将100mL丝绸废水分装于100mL厌氧瓶中，115℃灭菌30分钟，后冷却至室温。在无菌条件下，分别向其中加入固体复合菌剂50ppm、100ppm、200ppm、500ppm、1000ppm和2000ppm，置于30℃条件下静置培养，每隔2天检测废水中的COD含量。每个实验组设置3个平行实验，并设置1个未添加菌剂的空白对照组。具体实验安排如下：
空白对照组：未加菌剂；
实验组1：固体复合菌剂添加量50ppm；
实验组2：固体复合菌剂添加量100ppm；
实验组3：固体复合菌剂添加量200ppm；
实验组4：固体复合菌剂添加量500ppm；
实验组5：固体复合菌剂添加量1000ppm；
实验组6：固体复合菌剂添加量2000ppm。
3.3实验结果
COD的检测方法按照《HJ828-2017水质化学需氧量的测定重铬酸盐法》执行，效果评价实验结果见表7：
表7.固体复合菌剂降解COD效果评价
由以上结果可知，虽然复合菌剂添加量有差异，但COD降解效果均较为理想，各实验组COD均由4089mg/L降至703mg/L以下，降解率均在83％以上。而且，各实验组几乎都在两天之后开始明显起效，COD出现大幅下降，八天左右逐渐趋于稳定。
由各组数据对比可知，随着复合菌剂添加量的增加，对COD的降解效果也越来越好，其中效果最好的实验组6的降解率可达85.88％。但是，实验组5和实验组6的降解效果差距很小，说明添加量高于1000ppm时，添加量对COD的降解效果影响微弱。同时，由数据可以看出实验组1与实验组2最终效果差距相对明显，说明添加量最好不宜低于100ppm，因此菌剂添加量在100-1000ppm范围内较为合适。
实施例5.复合菌剂在造纸处理厂废水中降解COD的应用效果评价
5.1复合菌剂的准备固体复合菌剂的制备方法如下：
(1)一级种子培养：无菌条件下分别取蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌接种于富集培养基中，富集培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，且pH＝7-7.5，于35℃、220rpm的条件下培养12h，得到一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下分别将蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的一级种子培养液按照1vol％的接种量接种于富集培养基中，于25℃、220rpm的条件下培养36h，得到二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的二级种子培养液按照10vol％的接种量接种于发酵培养基中，其中，蜡样芽孢杆菌的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨12g/L、磷酸氢二钾2g/L、酵母浸粉7g/L、硫酸镁0.5g/L，溶剂为水，且pH＝7-7.5；地中海短波单胞菌的发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L、豆饼粉10g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁0.5g/L，硫酸锌0.25g/L、硫酸锰0.05g/L，溶剂为水，且pH＝7-7.5，控制温度为35℃，通气比为1:(1-2)、220rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的发酵液；
(4)制备固体复合菌剂：将步骤(3)所得的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的发酵液离心后制成菌泥，蜡样芽孢杆菌的菌泥置于70℃的烘箱中烘干，后粉碎制得菌粉，地中海短波单胞菌的菌泥中添加与菌泥质量相等的麸皮做保护剂后冷冻干燥，后粉碎制得菌粉，最后将两种菌种的菌粉按质量比混合，再向其中按质量比添加少量枯草芽孢杆菌和索诺拉沙漠芽孢杆菌，该两种菌种均可从市场上购买任一厂家的产品。
降解COD的固体复合菌剂由以下菌株按照质量比复配组成：蜡样芽孢杆菌30％、地中海短波单胞菌50％、枯草芽孢杆菌10％、索诺拉沙漠芽孢杆菌10％。其中蜡样芽孢杆菌菌粉的活菌量为(100-120)×108CFU/g，地中海短波单胞菌菌粉的活菌量为(70-90)×108CFU/g，枯草芽孢杆菌菌粉的活菌量为(90-100)×108CFU/g，索诺拉沙漠芽孢杆菌菌粉的活菌量为(90-100)×108CFU/g，最终复配得到固体复合菌剂的活菌量约为(80-100)×108CFU/g。
5.2降解COD效果评价实验
分别将100mL造纸废水分装于100mL厌氧瓶中，115℃灭菌30分钟，冷却至室温。在无菌条件下，分别向其中加入固体复合菌剂100ppm、200ppm、500ppm和1000ppm，置于30℃条件下静置培养，每隔2天检测废水中的COD含量。每个实验组设置3个平行实验，并设置1个未添加菌剂的空白对照组。具体实验安排如下：
空白组：未加菌剂；
实验组1：固体复合菌剂添加量100ppm；
实验组2：固体复合菌剂添加量200ppm；
实验组3：固体复合菌剂添加量500ppm；
实验组4：固体复合菌剂添加量1000ppm。
5.3实验结果
COD的检测方法按照《HJ828-2017水质化学需氧量的测定重铬酸盐法》执行，效果评价实验结果见表8：
表8.固体复合菌剂在造纸废水中的降解COD效果
从以上结果可知，不同实验组的降解效果均较为理想，各实验组数据对比而言，添加量仍然在一定程度上对COD的降解效果产生了影响，但总体降解率均能达到83％以上，其中降解效果最好的为实验组4，降解率可达84.5％，但实验组3与实验组4的降解效果相比差距很小，表明添加量在500ppm以上时添加量增加带来的效果已很微弱。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司
<120> 一种降解污废水中COD的厌氧复合菌剂及其制备方法和应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1382
<212> DNA
<213> 地中海短波单胞菌(Brevundimonas mediterranea)
<400> 1
gtggtcgcct gcccccttgc ggtcagcgca gcgccttcgg gtagaaccaa ctcccatggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccaacttca tgccctcgag ttgcagagga caatccgaac tgagacgact 180
tttaaggatt aaccctctgt agtcgccatt gtagcacgtg tgtagcccac cctgtaaggg 240
ccatgaggac ttgacgtcat ccccaccttc ctccggctta gcaccggcag tcccattaga 300
gttcccaact aaatgatggc aactaatggc gagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc 360
aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtgtcctag tccccgaagg 420
gaaagccaga tctctctggc ggtccaggca tgtcaaaagg tggtaaggtt ctgcgcgttg 480
cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt 540
taatcttgcg accgtactcc ccaggcggat tgcttaatgc gttagctgcg tcaccgaaat 600
gcatgcatcc cgacaactag caatcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc 660
ctgtttgctc cccacgcttt cgagcctcag cgtcagtaat gagccagtat gtcgccttcg 720
ccactggtgt tcttccgaat atctacgaat ttcacctcta cactcggagt tccacatacc 780
tctctcacac tcaagacacc cagtatcaaa ggcaattccg aggttgagcc ccgggatttc 840
acccctgact taaatgtccg cctacgctcc ctttacgccc agtaattccg agcaacgcta 900
gcccccttcg tattaccgcg gctgctggca cgaagttagc cggggcttct tctgtaggta 960
ccgtcattat cgtccctact gaaagaattt tacaatccta agaccttcat cattcacgcg 1020
gcatggctgc gtcaggcttt cgcccattgc gcaagattcc ccactgctgc ctcccgtagg 1080
agtttgggcc gtgtctcagt cccaatgtgg ctgatcatcc tctcagacca gctactgatc 1140
gtcgccttgg tgagccttta cctcaccaac tagctaatca gacgcgggcc gctctaaagg 1200
cgataaatct ttcccccgaa gggcacattc ggtattagca caagtttccc tgagttattc 1260
cgaacctaaa ggcacgttcc cacgtgttac tcacccgtcc gccactaact ccgaagagtt 1320
cgttcgactt gcatgtgtta ggcctgccgc cagcgttcgc tctgagccag gttccaaact 1380
ct 1382

Claims (25)

1.一种降解污废水中COD的厌氧复合菌剂，其特征在于，包含蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌(Brevundimonas mediterranea)，所述蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的活菌数之比为1:4-7:1，其中所述地中海短波单胞菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.24126。
2.根据权利要求1所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的活菌数之比为1:3-3:1。
3.根据权利要求2所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的活菌数之比为1:1.5-2.5:1。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，每g或每ml厌氧复合菌剂中包含的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的活菌量之和不低于60×108CFU。
5.根据权利要求4所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，每g或每ml厌氧复合菌剂中包含的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的活菌量之和为80×108CFU以上。
6.根据权利要求5所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，每g或每ml厌氧复合菌剂中包含的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的活菌量之和为(80-110)×108CFU。
7.根据权利要求1-3、5-6中任一项所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述厌氧复合菌剂中还包含枯草芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌中的任意一种或二者的复配。
8.根据权利要求4所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述厌氧复合菌剂中还包含枯草芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌中的任意一种或二者的复配。
9.根据权利要求1-3、5-6和8中任一项所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述厌氧复合菌剂呈固态。
10.根据权利要求4所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述厌氧复合菌剂呈固态。
11.根据权利要求7所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述厌氧复合菌剂呈固态。
12.根据权利要求9所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述厌氧复合菌剂中包含如下活菌量：蜡样芽孢杆菌(20-60)×108CFU/g、地中海短波单胞菌(40-80)×108CFU/g。
13.根据权利要求12所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述厌氧复合菌剂中包含如下活菌量：蜡样芽孢杆菌40×108CFU/g、地中海短波单胞菌60×108CFU/g。
14.根据权利要求10或11所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述厌氧复合菌剂中包含如下活菌量：蜡样芽孢杆菌(20-60)×108CFU/g、地中海短波单胞菌(40-80)×108CFU/g。
15.根据权利要求14所述的厌氧复合菌剂，其特征在于，所述厌氧复合菌剂中包含如下活菌量：蜡样芽孢杆菌40×108CFU/g、地中海短波单胞菌60×108CFU/g。
16.权利要求1-15中任一项所述的厌氧复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：无菌条件下分别取蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌接种于富集培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h，得到一级种子培养液；
(2)二级种子培养：无菌条件下分别将蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的一级种子培养液按照1-5vol％的接种量接种于富集培养基中，于25-35℃、150-300rpm的条件下培养12-36h，得到二级种子培养液；
(3)发酵：待发酵罐内的发酵培养基消毒完毕后，分别将步骤(2)所得的蜡样芽孢杆菌和地中海短波单胞菌的二级种子培养液按照5-10vol％的接种量接种于发酵培养基中，控制温度为25-35℃，通气比为1:(1-2)和转速150-300rpm的条件下发酵，待溶氧开始上升时停止发酵，得两种菌株的发酵液；
(4)制备复合菌剂，不同形态的复合菌剂制备方法如下：
液体复合菌剂：将步骤(3)所得的两种菌株的发酵液进行稀释，根据需要加入枯草芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌的发酵液，按比例灌装，即得液体复合菌剂；
固体复合菌剂：将步骤(3)所得的两种菌株的发酵液离心后制成菌泥，蜡样芽胞杆菌的菌泥置于50-70℃的烘箱中烘干，地中海短波单胞菌的菌泥中添加保护剂后冷冻干燥，后均粉碎制得菌粉，将各菌种的菌粉按质量比混合，即得固体的复合菌剂。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述富集培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8；
所述蜡样芽孢杆菌的发酵培养基组成为：碳源10-30g/L、氮源15-30g/L、PO4 3-0.6-1.5g/L、K+0.4-1.0g/L、Mg2+0.05-0.15g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8；
所述地中海短波单胞菌的发酵培养基组成为：碳源20-40g/L、氮源5-15g/L、PO4 3-1.0-2.0g/L、K+0.3-0.8g/L、Mg2+0.05-0.15g/L、Zn2+0.05-0.2g/L、Mn2+0.01-0.02g/L，溶剂为水，且pH＝6.5-8；
所述碳源选自葡萄糖、蔗糖、淀粉、醋酸钠或丁二酸钠中的一种或多种；
所述氮源选自酵母浸粉、蛋白胨、豆饼粉、尿素、硫酸铵中的一种或多种；
所述保护剂为淀粉、甘油或麸皮中的一种或多种。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述保护剂的添加量为地中海短波单胞菌菌粉质量的30-50wt％。
19.一种使用权利要求1-15中任一项所述的厌氧复合菌剂净化水体的方法，其特征在于，包括向水体中施加所述厌氧复合菌剂的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述厌氧复合菌剂的施加量为50ppm以上。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述厌氧复合菌剂的施加量为50-2000ppm。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述厌氧复合菌剂的施加量为100-1000ppm。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述厌氧复合菌剂的施加量为200-500ppm。
24.权利要求1-15中任一项所述的厌氧复合菌剂在水净化领域的应用。
25.根据权利要求24所述的应用，其特征在于，所述厌氧复合菌剂用于降解水中的COD。
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