CZ37899A3 - Zlepšený způsob výroby alkoholických nápojů za použití sladových semen - Google Patents
Zlepšený způsob výroby alkoholických nápojů za použití sladových semen Download PDFInfo
- Publication number
- CZ37899A3 CZ37899A3 CZ99378A CZ37899A CZ37899A3 CZ 37899 A3 CZ37899 A3 CZ 37899A3 CZ 99378 A CZ99378 A CZ 99378A CZ 37899 A CZ37899 A CZ 37899A CZ 37899 A3 CZ37899 A3 CZ 37899A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- enzymes
- malt
- enzyme
- ser
- plant
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 title claims abstract description 11
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 74
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 title description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 122
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 122
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 120
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 57
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 claims abstract description 41
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 22
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims abstract description 19
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 66
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 36
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 claims description 13
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims description 5
- -1 arabinofuranosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000013124 brewing process Methods 0.000 abstract description 11
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 abstract description 7
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 abstract description 7
- 235000015041 whisky Nutrition 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 48
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 13
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 13
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 13
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 13
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 12
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 12
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 9
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 7
- 238000004890 malting Methods 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 6
- 108010001817 Endo-1,4-beta Xylanases Proteins 0.000 description 6
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 6
- 101001090725 Leuconostoc gelidum Bacteriocin leucocin-A Proteins 0.000 description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 241000959173 Rasamsonia emersonii Species 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 241000131386 Aspergillus sojae Species 0.000 description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 3
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- XDMACMMTPGFUCZ-UHFFFAOYSA-N Tetra-Ac-Benzyl glucopyranoside Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(COC(=O)C)OC1OCC1=CC=CC=C1 XDMACMMTPGFUCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002573 hemicellulolytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 3
- 238000005360 mashing Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YNJBLTDKTMKEET-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ser-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YNJBLTDKTMKEET-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N Ser-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO PBUXMVYWOSKHMF-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N Thr-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XDARBNMYXKUFOJ-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 2
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N Thr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMNUBQWPVOUKH-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001033 granulometry Methods 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 2
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 2
- PKZFFNJDFBBUIS-ZSCHJXSPSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;4-nitroaniline Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 PKZFFNJDFBBUIS-ZSCHJXSPSA-N 0.000 description 1
- BKUKXOMYGPYFJJ-UHFFFAOYSA-N 2-ethylsulfanyl-1h-benzimidazole;hydrobromide Chemical compound Br.C1=CC=C2NC(SCC)=NC2=C1 BKUKXOMYGPYFJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710102786 ATP-dependent leucine adenylase Proteins 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 108700038091 Beta-glucanases Proteins 0.000 description 1
- 101000726146 Brassica napus Cruciferin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108010008885 Cellulose 1,4-beta-Cellobiosidase Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N D-ribulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-NQXXGFSBSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N Gly-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N Gly-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)CN CUVBTVWFVIIDOC-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 1
- 108700011203 Phaseolus vulgaris phaseolin Proteins 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101100242848 Streptomyces hygroscopicus bar gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O CKHWEVXPLJBEOZ-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- GQVZBMROTPEPIF-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GQVZBMROTPEPIF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WPSXZFTVLIAPCN-WDSKDSINSA-N Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O WPSXZFTVLIAPCN-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010076955 arabinogalactan endo-1,4-beta-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 1
- 108010052439 arabinoxylanase Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 229940098396 barley grain Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000004464 cereal grain Substances 0.000 description 1
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 description 1
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 1
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 description 1
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940111205 diastase Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- YERABYSOHUZTPQ-UHFFFAOYSA-P endo-1,4-beta-Xylanase Chemical compound C=1C=CC=CC=1C[N+](CC)(CC)CCCNC(C(C=1)=O)=CC(=O)C=1NCCC[N+](CC)(CC)CC1=CC=CC=C1 YERABYSOHUZTPQ-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 108010041969 feruloyl esterase Proteins 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011868 grain product Nutrition 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01073—Licheninase (3.2.1.73)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
- C12C5/004—Enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C5/00—Other raw materials for the preparation of beer
- C12C5/004—Enzymes
- C12C5/006—Beta-glucanase or functionally equivalent enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C7/00—Preparation of wort
- C12C7/04—Preparation or treatment of the mash
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
- C12C7/00—Preparation of wort
- C12C7/04—Preparation or treatment of the mash
- C12C7/047—Preparation or treatment of the mash part of the mash being unmalted cereal mash
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
- C12N9/248—Xylanases
- C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01001—Alpha-amylase (3.2.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
- Alcoholic Beverages (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby alkoholických nápojů, zejména piva a whisky.
Dosavadní stav techniky
Alkoholické nápoje, například pivo, lze vyrábět ze semen sladovaného a/nebo nesladovaného ječmene. Charakteristickou chuť a barvu dodává pivu kromě kvasnic slad. Slad navíc působí jako zdroj fermentovatelného cukru a enzymů. To, zdali se při varném procesu použije slad, závisí na typu piva a na zemi, ve které se toto pivo vyrábí. V afrických zemích se například slad do piva tradičně nepřidává.
Obecný postup sladování a vaření alkoholických nápojů nedávno popsal R. C. Hoseney (Cereal Foods World, 39 (9), 675-679, 1994). Sladování je proces řízeného klíčení, po kterém následuje řízené sušení zrna ječmene. Zrno se převede na slad postupným máčením, klíčením, růstem a sušením (pražením). Důležitým krokem pro získání exprese řady enzymů, které umožňují modifikaci endospermu, je v tomto ohledu klíčení. Tato modifikace produkuje fermentovatelné cukry.
01-221-99 Če které jsou součástí chuť a barvu díky (Maillard).
Následné sušení/ohřívání, sladovacího procesu, poskytuje neenzymatickým hnědnoucím reakcím
Proces sladování je velmi komplikovanou a finančně náročnou součástí výroby piva. Mezi několik nevýhod sladovacího procesu, které lze změnit, patří:
slad obsahuje různé koncentrace enzymů, takže nelze spolehlivě předvídat dosažené výsledky, ne každá enzymatická aktivita, která je žádaná, je během klíčení vytvořena nebo je vytvořena v dostatečném množství, takže je nezbytné tyto enzymy dodávat, podmínky, které podporují získání výrazné chuti a barvy, mohou mít škodlivý vliv na enzymatickou aktivitu sladu, tento způsob je drahý, během klíčení dochází v důsledku respirace a růstu kořínků (které se odstraní během čištění sladu) k 10 až 20% hmotnostním ztrátám, vzhledem k nepříznivým klimatickým podmínkám není možné produkovat slad na jakémkoliv požadovaném místě, použití sladu může vést ke koloidní nestabilitě v důsledku solubilizace proteinů proteázou přítomnou ve sladu, může docházet ke tvorbě biogenních aminů (J. Food
Science 59 (5), 1104-1107, 1994), což může vést například k histaminové intoxikaci.
Slad a/nebo ječmen byl tradičně jediným zdrojem fermentovatelných cukrů a enzymů a v mnoha zemích je jediným zdrojem doposud. Nicméně v dnešní době se stále více a více piva vyrábí za použití jiných zdrojů cukrů.
01-221-99 Če
Jako zdroj těchto cukrů lze v podstatě použít jakýkoliv zdroj škrobu nebo zkapalněný/degradovaný škrob. Tyto alternativní zdroje se označují jako tzv. doplňky. Protože slad nemá pouze funkci jako zdroj fermentovatelných cukrů, ale rovněž jako zdroj enzymů, je třeba v případě nahrazení více než přibližně 50 % sladu nesladovaným ječmenem a/nebo doplňky poskytnout alternativní zdroje enzymů. Kromě toho poskytuje slad pivu jeho charakteristickou chuť a barvu.
Při výrobě sladu se vždy zohledňuje buď chuť, barva nebo enzymatická aktivita. Slad, který poskytuje výraznou chuť a tmavou barvu, lze získat extenzivnějším sušením při relativně vysokých teplotách. To jsou podmínky, které mají nežádoucí dopad na aktivitu enzymů. Doplnění enzymů z exogenního zdroje je tedy nezbytné z několika důvodů. Po určitou dobu bylo běžnou praxí používání mikrobiálních enzymů. Při vaření piva se například zrna a/nebo sladovaná zrna zkapalňovala a sacharizovala, s cílem získat fermentovatelné cukry. Zkapalnění lze zlepšit použitím termostabilní alfa-amylázy, které je například popsáno v patentech US 4,285,975 nebo US 5,180,669. Pro zvýšení množství volně dostupného dusíku ve kvasné kapalině a zlepšení fermentace lze rovněž použít proteázu.
Vedle škrobu jsou v obilných zrnech přítomny i další polysacharidy, například β-glukany (Henry R. J. a kol., J. Sci. Food Agric. 36, 1243-1253, 1985). β-Glukanáza, která je přítomna ve sladu, není dostatečně tepelně stabilní, aby mohla být aktivní během varného procesu. Tyto β-glukany jsou vysoce viskózní a způsobují problémy při filtraci kvasné kapaliny a piva. To je důvodem, proč se mikrobiální β-glukanázy používají v širokém měřítku při varném procesu.
01-221-99 Če
Mezi neškrobové polysacharidy rovněž patří pentosany, jejichž struktura byla v nedávné době důkladně prostudována (Gruppen H. a kol., Carbohydr. Res. 233, 45-64, 1992), zejména ty pentosany, které jsou obsaženy v ječmeni a sladu (Vietor R. J. a kol., Carbohydr. Res. 254, 245-255, 1994). Zjistilo se, že pentosanáza z Penicillum emersonii zvyšuje produkci a extrakci fermentovatelných cukrů během varného procesu (GB 2,150,933).
Použití xylanázy B, které zlepšuje kvalitu kvasné kapaliny, je rovněž zmíněno v patentu WO 94/14965.
Navzdory pokroku, kterého bylo v této oblasti dosaženo, ještě stále existuje potřeba nalézt způsoby vaření piva za použití zde popsaných enzymatických přípravků.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje způsob výroby alkoholických nápojů, například piva, do kterých se přidává směs enzymů, která obsahuje alespoň endo-β-(1,4)xylanázu, arabinofuranosidázu, alfa-amylázu, endo-proteázu a β-(1,3;1,4)glukanázu a případně rovněž sacharizující amylázu a/nebo exopeptidázu. Enzymy, které jsou nezbytné pro výrobu piva jsou výhodně poskytovány transgenními semeny.
Vynález dále popisuje transgenní semena exprimující enzymy nezbytné pro výrobu piva.
Nyní se překvapivě zjistilo, že varný proces lze provádět, v přítomnosti směsi enzymů podle vynálezu, s minimálním množstvím sladu. Tento způsob se použil při
01-221-99 Če
výrobě klasického sladového piva, ale stejně dobře lze použit při jakémkoliv způsobu, u kterého se slad používá jako zdroj enzymatické aktivity.
Enzymy použitelné v rámci vynálezu se zvolí ze skupiny enzymů nezbytných pro vaření alkoholických nápojů. Mezi tyto enzymy patří enzymy zvolené ze skupiny amylolytických enzymů, ze skupiny celulolytických enzymů, ze skupiny hemicelulolytických enzymů a ze skupiny proteolytických enzymů.
Amylolytické enzymy zahrnují například alfa-amylázu, sacharizující amylázu, amyloglukosidázu, exo-amylázu a pululanázu.
Celulolytické enzymy zahrnují například β-1,4endoglukanázu, celobiohydrolázu a β-glukosidázu.
Hemiculolytické enzymy zahrnují například β-l,3-1,4glukanázu, xylanázu, endo-arabinanázu, arabinofuranosidázu, arabinoxylanázu, arabinogalaktanázu a esterázu kyseliny ferulové.
Proteolytické enzymy zahrnují takové enzymy, jakými jsou například exo-peptidázy a endo-peptidázy (rovněž označované jako prote(in)ázy).
Volba konkrétního amylolytického, celulolytického, hemicelulolytického nebo proteolytického enzymu není pro vynález kritická kromě toho, že vlastnosti zvoleného enzymu (například pH a teplotní rozmezí) by měly být slučitelné se specifickými podmínkami varného procesu.
Odborníkům v daném oboru je dostupná celá řada genů, kódujících amylolytické, celulolytické, hemicelulolytické a • · · · · ·
01-221-99 Če • · · · · • · · ·· ·· ·« proteolytické enzymy. Geny, kódující tyto důležité enzymy, lze získat z různých rostlinných, živočišných nebo mikrobiálních zdrojů. Výhodně se tyto geny získávají z mikrobiálního zdroje.
Endo-β-(1,4)xylanázu lze získat z kultury Aspergillus niger (EP 0 463 706). Arabinofuranosidáza je dostupná ve formě isoenzymu A nebo isoenzymu B (EP 0 506 190) nebo ve formě arabinoxylanhydrolázy (EP 0 730 653), které lze získat z kultury Aspergillus niger. Termostabilní amylázu lze odvodit z Bacillus licheniformis (WO 91/14772, WO 92/05259) a je například komerčně dostupná pod obchodním označením Brewers Amyliq Thermostable (B.A.T.S.). Aktivita termostabilní amylázy se vyjadřuje v TAU jednotkách. Endoproteázu lze odvodit z Bacillus amyloliquefaciens a je rovněž komerčně dostupná pod obchodním označením Brewers protease (+) a její aktivita se vyjadřuje v PC jednotkách. Ze stejné bakterie lze rovněž odvodit β-(1,3;1,4)glukanázu (Hofemeister a kol., Gene 49, 177, 1986), která je rovněž komerčně dostupná pod obchodním označením Filtrase L 3000 (+). Aktivita glukanázy se vyjadřuje v BGLU jednotkách. Případně použitelnou sacharizující amylázu lze rovněž získat z komerčně dostupných zdrojů (amyláza z Aspergillus oryzae pod obchodním označením Brewers Fermex, jejíž aktivita se vyjadřuje ve FAU jednotkách), ale lze ji rovněž získat z čisté kultury Penicillium emersonii (lze získat z ATCC (American Type Culture Collection), kde je uložena pod číslem ATCC16479). Případně použitelnou exopeptidázu lze odvodit z čisté kultury Aspergillus sojae, která je uložena v Cetraal Bureau for Schimmelcultures (CBS), Oosterstraat 1, Baarn, The Netherlands, pod číslem CBS 209.96 (A. sojae (DS 8351), 12. února 1996).
• ·
01-221-99 Če • · · · · ·· · · · « · ··· · · · · · · · · • ····· · · · · ··· ··· • ····· · · • · · · 9 · * ·· · · · ·
Enzymatickými aktivitami, které jsou v současnosti známé jako aktivity nezbytné pro výrobu piva, jsou alfa- a β-amyláza, které jsou nezbytné pro převedeni škrobu endospermu na fermentovatelné cukry, proteáza, která je nezbytná pro rozpad proteinu na rozpustné dusíkové sloučeniny, které mají funkci kvasnicových živin, a β-glukanáza a xylanáza, které jsou potřebné pro hydrolýzu β-1,3-1,4-glukanů resp. xylanů ječmene na oligo-sacharidy, čímž se snižuje viskozita a zlepšuje filtrovatelnost kvasné kapaliny. Pro získání všech nezbytných enzymů z exogenního zdroje, tj . mikrobiálního zdroje, by tedy bylo žádoucí přidání alespoň pěti různých enzymů. Pro výrobu všech enzymů lze sice použít jeden mikroorganismus, ale pro optimální produkci všech enzymů je třeba vytvořit různé fermentační podmínky.
Použitím enzymů z mikrobiálních zdrojů lze překonat některé nevýhody výše zmíněného sladovacího způsobu. Nicméně použití mikroorganismů jako zdroje enzymů, má rovněž své nevýhody:
pro získání jednotlivých enzymů v dostatečném množství je potřebná řada různých fermentací alespoň jednoho mikroorganismu, enzymatické přípravky mohou obsahovat nežádoucí vedlejší aktivity, konzumenti nejsou příznivě nakloněni přidávání jiných materiálů než jsou rostlinné materiály, voda a kvasnice, omezenou stabilitu enzymatického přípravku během skladování při pokojové teplotě.
Obecné použití transgenních semen obsahujících zvýšené množství enzymu v průmyslových, enzymy katalyzovaných, • ·
01-221-99 Če ί * ί ίί ί* ί ··· · · · · · *· · · ·· procesech je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO 91/14772. Přímé použití semene obsahujícího enzym v průmyslových procesech obchází potřebu extrakce a/nebo izolace enzymu. Semeno může působit jako stabilní a skladovatelná forma enzymů.
Pro jeden jediný enzym, β-1,3-1,4-glukanázu byla popsána exprese v zrnech ječmene jako alternativa pro exogenní přidání.
Východoněmecká patentová přihláška DD 275704 popisuje konstrukci expresního vektoru, který umožňuje pro semeno specifickou expresi Bacillus β-1,3-1,4-glukanázy v ječmeni. Nicméně v této době nebyla ještě známa účinná transformace ječmene. Použitím semen exprimujících Bacillus β-glukanázu lze slad nahradit větším množstvím zrna bez toho, že by došlo k závažnějším problémům s filtrací. Nicméně další enzymatické aktivity, které jsou nezbytné při vaření piva, se musí stále ještě získávat ze sladu nebo exogenně doplňovat.
Mannonen a kol. (1993) navrhuje zabudovat do semene ječmene fungální β-1,3-1,4-glukanázu. V tomto případě by se varný proces zlepšil expresí β-1,3-1,4-glukanázy, která má vyšší tepelnou stabilitu než endogenní enzym ječmene, přímo v semenu. Nicméně i v tomto případě je záměrem získat semeno normálním sladovacím procesem. Další enzymatické aktivity, které jsou nezbytné při vaření piva, se musí i v tomto případě získávat ze sladu nebo doplňovat exogenně.
U výhodného způsobu podle vynálezu se enzymy, které jsou nezbytné pro varný proces, exprimují v transgenních semenech. Takto vyprodukovaná transgenní semena exprimující tyto nezbytné enzymy se potom použijí ve varném procesu • ·
01-221-99 Če
piva. V tomto případě se zredukuje použití sladu, zatímco přidání exogenních mikrobiálních enzymů se zcela eliminuje.
Transgenní semena exprimující enzymy, které jsou nezbytné při vaření piva, jsou společně označeny jako „sladové semeno.
Rostlinný druh, který je schopen produkovat ve svých semenech požadovaný enzym, zahrnuje druhy jejichž zrna nebo produkty zrn se tradičně používají při vaření piva. Nicméně jako zdroj transgenního semene exprimujícího požadovaný enzym lze rovněž použít rostlinné druhy, které se při vaření piva běžně nepoužívají, zejména v těch případech, kdy se do varného procesu přidává pouze minimální množství uvedeného transgenního semene. Rostlinnými druhy, které splňují tato kritéria, jsou například ječmen, kukuřice, rýže, pšenice, čirok, proso, oves, kassava apod.
Gen, kódující požadovaný enzym, se exprimuje v rostlinném semenu pomocí regulačních sekvencí, funkčních v rostlině nebo v rostlinném semenu. Tyto regulační sekvence zahrnují sekvence promotoru, sekvence terminátoru a případně sekvence zesilovače transkripce.
Pokud jde o sekvence promotoru, lze použít ty sekvence, které vedou ke konstitutivní expresi genu v celé rostlině. Jinak lze použít ty promotorové sekvence, které jsou účinné při řízení exprese genu do semene rostliny.
Kromě toho lze expresi požadovaného enzymu směrovat buď do specifické buněčné jednotky, například do cytosolu, endoplasmatického retikula, vakuoly a proteinového těla, nebo do extracelulárního prostoru pomocí specifických směrovacích (targetingových) sekvencí.
• ·
01-221-99 Če
Volba konkrétní buněčné jednotky nebo extracelulárního prostoru závisí na vlastnostech požadovaného enzymu a měla by být provedena tak, aby se enzymu vytvořilo optimální okolní prostředí. Požadovaný enzym by se například měl nacházet v prostředí, které umožní proteinu během klíčení semen optimální stabilitu. Kromě toho by se měl požadovaný enzym nacházet v prostředí, ve kterém exprese enzymu neinhibuje základní metabolické procesy rostliny nebo nevyvolává nežádoucí účinky na životnost rostliny nebo semene.
Aby se umožnila exprese DNA sekvence, kódující zvolený enzym v rostlinné buňce, opatřuje se zpravidla regulačními prvky, které jsou hostitele a které otevřeného čtecího rozpoznatelné biochemickým aparátem umožňují transkripci a translaci rámce do hostitele. DNA sekvence zpravidla obsahuje oblast transkripční iniciace, kterou lze genu, který je schopen rovněž oblast translační zachycení ribosomu. V vhodně odvodit z libovolného exprimovat rostlinné buňky, a iniciace pro rozpoznání a eukaryotických rostlinných buňkách taková expresní kazeta zpravidla navíc obsahuje transkripční terminační oblast, která je umístěna za uvedeným otevřeným čtecím rámcem a která umožňuje ukončení transkripce a provedení polyadenylace primárního transkriptu. Kromě toho lze použití kodonu přizpůsobit použití přijatého kodonu zvolené hostitelské rostliny. Principy řízení exprese DNA konstruktu v rostlinné buňce jsou odborníkům v daném oboru obecně známy a konstrukce exprimovatelných chimérických DNA konstruktů je v současnosti běžnou rutinou.
Speciálním typem replikonu je replikon, který je schopen transferovat sám sebe nebo svou část do další
01-221-99 Če • ·
Β 4
Β 1 ♦ · • · · · » · · 1
I · · 4
49 44 t rostlinné odvozeny hostitelské buňky, jakou je například rostlinná buňka, a tak ko-transferovat otevřený čtecí rámec, kódující enzym(y) podle vynálezu do uvedené rostlinné buňky. Replikony s touto schopností jsou zde označeny jako vektory. Příkladem takového vektoru je Ti-plasmidový vektor, který, pokud je přítomen ve vhodném hostiteli, například Agrobacterium tumefaciens, je schopen transferovat svou část, tzv. T-oblast, do rostlinné buňky. Pro přenos chimérických DNA sekvencí do rostlinných buněk nebo protoplastů, z nichž lze generovat nové rostliny, které mají stabilně ve svých genomech zabudovanou chimérickou DNA, se nyní běžně používají různé typy Ti-plasmidových vektorů (například viz EP 0 116 718 Bl) . Zvláště výhodnou formou Ti-plasmidových vektorů jsou tzv. binární vektory, nárokované například v patentových dokumentech EP 0 120 516 Bl a US 4,940,838. Dalšími vhodnými vektory, které lze použít pro zavedení DNA podle vynálezu do vhodného rostlinného hostitele, jsou například virové vektory, zejména neintegrační virové vektory, například ty vektory, které jsou ze dvoušroubovicovitých rostlinných virů (například CaMV) a jednošroubovicových virů, zdvojených virů apod. Použití těchto vektorů může být výhodné zejména tehdy, pokud je složité stabilně transformovat rostlinného hostitele, jako je tomu například v případě dřevinných druhů, zejména stromů a vinné révy.
Výrazem „hostitelské buňky zabudovávající chimérickou DNA sekvenci podle vynálezu do svého genomu se rozumí buňky a stejně tak vícebuněčné organismy obsahující tyto buňky nebo v podstatě tvořené těmito buňkami, které stabilně zabudovávají chimérickou DNA do svého genomu a tak zachovávají chimérickou DNA a výhodně transmitují kopii této chimérické DNA do dceřinných buněk prostřednictvím • ·
01-221-99 Če mitosy nebo meiosy. Podle výhodného provedení vynálezu se použijí rostliny, které jsou v podstatě tvořeny buňkami, které zabudovávají jednu nebo více kopií uvedené chimérické DNA do svého genomu a které jsou schopny transmitovat kopii nebo kopie do své dceřinné rostliny, výhodně způsobem podle Mendela. Díky transkripci a translaci chimérické DNA podle vynálezu budou tyto buňky produkovat enzymy. Ačkoliv principy, které řídí transkripci DNA v rostlinných buňkách, nejsou vždy zřejmé, je vytvoření chimérické DNA, která se bude schopna exprimovat, rutinní záležitostí. Iniciační oblasti transkripce, které se běžně používají při expresi transformovaného polynukleotidu konstitutivním způsobem jsou promotory, které lze získat z viru květákové mozaiky, tzv. 35S RNA a 19S RNA transkripční promotory a tzv. T-DNA promotory Agrobacterium tumefaciens. Za zmínku stojí zejména nopalinsyntázový promotor, oktopinsyntázový promotor (popsaný v EP 0 122 791 Bl) a mannopinsyntázový promotor. Kromě toho lze použít rostlinné promotory, které mohou být v podstatě konstitutivní, například genový promotor rýžového aktinu. Při pro semeno specifické expresi může být příslušný gen cDNA vložen za promotory pocházející z genů, které se specificky exprimují v semenu rostliny. Tyto promotory zahrnují promotory genů, kódujících zásobní proteiny semene, například Brassica napus cruciferinový promotor, Phaseolus vulgaris phaseolinový promotor, glutelinový promotor z Oryza sativa, zeinový promotor ze Zea mays a hordeinový promotor z Hordeum vulgare.
Rovněž je známo, že duplikace určitých prvků, tzv. zesilovačů, může podstatně zesílit expresní úroveň DNA za jejího režimu (viz například Kay R. a kol. (1987), Science 236, 1299-1302: duplikace sekvence mezi -343 a -90 CaMV 35S promotoru zvyšuje aktivitu tohoto promotoru). Kromě
| • | • · ·· ·· ·· ·· ·· · · · · ···· | |
| 01-221-99 | Če • | • · ···· ···· ··· · · · · · · ··· ··· • · · · · · · • · · · · · · · · · · |
| 13 | ||
| j ednoduše | nebo dvojitě zesíleného | konstitutivního 35S |
| promotoru | lze mezi vysoce úrovňové | promotory zahrnout |
| například | promotor světlem indukovatelné ribulózobisfosfát- |
karboxylázové malé podjednotky (rbcSSU) a promotor a/b vazebného proteinu chlorofylu (Cab). Dalšími promotory, které lze použít podle vynálezu jsou hybridní promotory, které obsahují prvky různých fyzikálně spojených oblastí promotoru. Dobře známým příkladem hybridního promotoru je tzv. CaMV zesílený mannopinsyntázový promotor (patent US 5,106,739), který obsahuje prvky mannopin-syntázového promotoru navázané na CaMV zesilovač.
Použití intronů mezi promotorem a genem volitelného markéru zesiluje expresi, konkrétně v případě transformace jednoděložných rostlin. Výraz „promotor tedy označuje oblast DNA, která se nachází před strukturním genem a je zahrnuta v rozlišovací a vazebné RNA polymeráze a dalších proteinech, které iniciují transkripci. Výraz „rostlinný promotor tedy označuje promotor, který je schopen iniciovat transkripci v rostlinných buňkách. Výraz „konstitutivní promotor označuje promotor, který je aktivní za většiny okolních podmínek a určuje vývoj nebo buněčnou diferenciaci.
Pokud jde o nezbytnost transkripční terminační oblasti, obecně se předpokládá, že tato oblast zvyšuje spolehlivost a rovněž účinnost transkripce v rostlinných buňkách. Její použití je tedy pro obsah vynálezu velmi výhodný.
Přestože některá provedení vynálezu nemusí být v současnosti prakticky proveditelná, například proto, že některé rostlinné druhy jsou doposud nepřístupné genetické transformaci, je provedení vynálezu u těchto rostlinných
01-221-99 Če
druhů pouze otázkou času a nikoli otázkou principu, protože přístupnost ke genetické transformaci není závislá na předložených provedeních vynálezu.
V současné době je transformace rostlinných druhů pro velký počet rostlinných druhů včetně Dicotyledoneae a Monocotyledoneae rutinní záležitostí. Pro zavedení chimérické DNA podle vynálezu do vhodné hostitelské buňky lze použít v podstatě libovolný transformační způsob. Mezi vhodné způsoby, ze kterých lze vybírat, patří například kalcium/polyethylenglykolová metoda určená pro protoplasty (Krens, F. A. a kol., 1982, Nátuře 296, 72-74/ Negrutiu I. a kol., červen 1987, Plant Mol. Biol. É3, 363-373), elektroporace protoplastů (Shillito R. D. a kol., 1985, Bio/Technol. 3, 1099-1102), mikrovstřikování do rostlinného materiálu (Crossway A. a kol., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), bombardování různých rostlinných materiálů (DNA nebo RNA-potaženými) částicemi (Klein T. M. a kol., 1987, Nátuře 327, 70), infikace (neintegračními) viry v rostlinném Agrobacterium tumefaciens mediovaném genovém transferu infiltrací dospělých rostlin nebo transformací zralého pylu nebo mikrospór (EP 0 301 316) apod. Výhodný způsob podle vynálezu zahrnuje transfer Agrobacteriummediované DNA. Zvláště výhodné je použití tzv. technologie binárních vektorů, která je popsána v EP A 120 516 a patentu US 4,940,838.
Pokud jde o zvážení přístupnosti ke genetické transformaci jednoděložné rostliny, jsou k této transformaci přístupné, přičemž plodné transgenní rostliny lze regenerovat z transformovaných buněk nebo zárodků nebo z dalšího rostlinného materiálu. V současnosti je za výhodný způsob transformace jednoděložných rostlin
01-221-99 Ce • 9 » 9
99 9 • · «
9 9 9 považováno mikroprojektilové bombardování zárodků, explantátů nebo suspenzních buněk a přímá digerace DNA nebo (tkáňová) elektroporace (Shimamoto a kol., 1989, Nátuře 338, 274-276) . Transgenní kukuřičné rostliny se získaly zavedením genu Streptomyces hygroscopicus bar, který kóduje fosfinothricinacetyltransferázu (enzym, který inaktivuje herbicidní fosfinothricin), do embryogenních buněk suspenze kukuřičné kultury mikroprojektilovým bombardováním (GordonKamm, 1990, Plant Cell, 2, 603-618). Zavedení genetického materiálu do aleuronových protoplastů dalších jednoděložných plodin, například pšenice a ječmene, již bylo zaznamenáno (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13, 21-30). Rostliny pšenice se regenerovaly ze suspenze embryogenní kultury selekcí embryogenního hojivého pletiva pro založení suspenze embryogenních kultur (Vasil, 1990, Bio/Technol. 8, 429-434). Kombinace s transformačními systémy pro tyto plodiny umožní aplikovat způsob podle vynálezu na jednoděložné rostliny.
Jednoděložné rostliny zahrnující komerčně důležité plodiny, například rýži a kukuřici, jsou přístupné DNA transferu řetězci Agrobacteríum (viz WO 94/00977; EP 0 159 418 Bl; Gould J., Michael D., Hasegawa 0., Ulian E.C., Peterson G., Smith R. H. (1991), Plant. Physiol. 95, 426-434). Výhodný transformační způsob pro ječmen popsal Tingay S. a kol. (The Plant J., 11 (6), 1369-1376, 1997).
Pro získání transgenních rostlin, které jsou schopny konstitutivně exprimovat více než jeden chimérický gen, je dostupná celá řada alternativ včetně následujících:
A. Použití DNA, například T-DNA, na binární plasmid s celou řadou modifikovaných genů fyzikálně navázaných na sekundární volitelný markerový gen. Výhodou tohoto způsobu
01-221-99 Če ► ·· ·· • · · · · » · · · · • · ··· ··· je, že chimérické geny jsou fyzikálně spojené a migruji tedy jako jediné Mendelovské centrum.
B. Křížové opylování transgenních rostlin, které jsou již schopny exprimovat jeden nebo více chimérických genů, výhodně navázaných na volitelný markerový gen, pylem z transgenní rostliny, která obsahuje jeden nebo více chimérických genů navázaných na další volitelný markér. Potom se semeno, které se tímto křížením získá, může vybrat na základě přítomnosti dvou volitelných markérů nebo na základě přítomnosti samotných chimérických genů. Rostliny získané z vybraných semen lze potom využít k dalšímu křížení. Chimérické geny se v zásadě nenacházejí na jednom místě a lze je tedy segregovat jako nezávislá centra.
C. Použití celé řady množin chimérických DNA molekul, například plasmidů, které mají jeden nebo více chimérických genů, a volitelný markér. Pokud je frekvence kotransformace vysoká, potom je selekce na základě pouze jediného markéru dostatečná. V dalších případech je výhodná selekce na bázi více než jednoho markéru.
D. Konsekutivní (postupná) transformace transgenních rostlin, které již obsahují první, druhý, (atd.) chimérický gen s novou chimérickou DNA, která případně obsahuje volitelný markerový gen. Stejně jako u způsobu B se chimérické geny v podstatě nenacházejí na jednom místě a mohou se tedy segregovat jako nezávislá centra.
E. Kombinace výše zmíněných strategií.
Aktuální strategie může záviset na celé řadě faktorů, například na účelu použití rodičovských linií (přímý růst, použití v pěstitelském programu, použití pro produkci hybridů), ale není kritická pro popsaný vynález.
Je známo, že prakticky všechny rostliny lze regenerovat z kultivovaných buněk nebo tkání. Prostředky
01-221-99 Če • *4 4 · 4 4 4 4 44 • 4 · 4 4 44 4 4 44 4 • 4« 4444 4444 4 444 4 4 4 « 44 444 444 4 44444 · 4
444 44 44 44 44 44 pro regeneraci se u rostlin liši druh od druhu, ale zpravidla představuji suspenzi transformovaných protoplastů nebo transformované explantáty umístěné v Petriho misce. Výhonky lze indukovat přímo nebo nepřímo z hojivého pletiva, přes organogenezi nebo embryogenezi a následně je nechat zakořenit. Vedle volitelného markéru bude kultivační médium zpravidla obsahovat různé aminokyseliny a hormony, například auxiny a cytokininy. Do média se rovněž výhodně přidává kyselina glutamová a prolin. Účinná regenerace bude závislá na médiu, na genotypu a na historii kultury. Pokud se tyto tři proměnné řídí, potom je regenerace zpravidla reprodukovatelná a může se opakovat.
Po stabilním zabudování transformovaných genových sekvencí do transgenních rostlin se mohou znaky, poskytnuté těmito sekvencemi, transferovat do dalších rostlin pohlavním křížením. V závislosti na druhu, který má být křížen, lze použít libovolnou standardní techniku množení.
U jednoho provedení podle vynálezu se používají transgenní semena, která jsou zpracována takovým způsobem, že produkují jeden jediný enzym, což umožňuje pružnou produkci enzymových směsí s požadovaným poměrem aktivit jednotlivých enzymů. U dalšího provedení může být více než jedna enzymatická aktivita obsažena v semenech jednotlivých transgenních rostlinných linií.
Transgenní semena, která obsahují sledované enzymy, lze přidat najednou v požadovaném stupni varného procesu. Alternativně lze transgenní semena obsahující sledovaný enzym přidat jednotlivě, každé vždy v nejvhodnějším okamžiku.
01-221-99 Če • *9 9» »9 ·· 99 ♦ 9 9 · 9 99 9 9 99 9 « 9 · 9 · 9 9999 • «99 99 9» 99 999 «99 9 99999 9 9 ·«· 99 · · 99 99 9 ·
Způsob podle vynálezu umožňuje získat slad s výraznou chutí a barvou bez toho, že by se muselo počítat s enzymatickou aktivitou sladu. U způsobu podle vynálezu se použití sladu velkou měrou obchází. Pro dosažení charakteristické chuti a barvy piva je potřebné pouze minimální množství sladu.
Transgenní semena obsahující požadované enzymy lze aplikovat v nej optimálnějším poměru se zrnem a případně s množstvím sladu, které je dostatečné pro získání charakteristické chuti a barvy. Transgenní semena lze předtím smísit se zrnem a sladem. Alternativně lze jednotlivé sloučeniny, zrno, transgenní semeno a slad přidat do varného procesu při výrobě piva v samostatných stupních.
Výhodně se jednotlivé sloučeniny, transgenní semena, zrno a slad nebo směs transgenních semen, zrna a sladu před přidáním do varného procesu umelou.
Transgenní semeno obsahuje požadované enzymy v průměrné koncentraci, která se pohybuje od 0,001 do 2,5 %, výhodně od 0,01 do 1,0 %, výhodněji od 0,05 do 0,25 % hmotnosti semene. V závislosti na stupni exprese v semenu lze pouze část semen nebo celý objem semen, který se zpravidla použije ve varném procesu, nahradit transgenními semeny. Pokud se dosáhne vysokých stupňů exprese, je rovněž možné přidat transgenní semena jiného rostlinného druhu než který se zpravidla používá při varném procesu bez toho, že by došlo k přílišné změně varné směsi.
V případě sladu je část sladu výhodně zpracována speciálním způsobem, při kterém se slad zahřeje během pražení a poskytne tak maximální množství sloučenin, které
01-221-99 Če • · 0 • «« 00 44 4· • · · 4 0 · 0 0 4 · « • · · 4 4 4 4 ··· • 4·4 < 4 44 44 4·· • 44444 0 4
4·· 4· 04 40 44 44 dodávají sladu barvu a chuť. Zbývající enzymatická aktivita je po tomto ošetření neznatelná.
Exprese enzymů v semenu podle vynálezu poskytuje možnost eliminace přidání exogenních mikrobiálních enzymů do varného procesu. Náklady na výrobu transgenních semen obsahujících enzymy jsou mnohem nižší než náklady na výrobu enzymů fermentačními způsoby. Kromě toho jsou transgenní semena snáze použitelná, protože poskytují stabilní a kontrolovatelně skladovatelnou formu enzymů a umožňují snadnou manipulaci. Redukce nákladů a pohodlnost použití, které souvisí s použitím transgenních semen, se zvláště projevují u způsobu podle vynálezu, při kterém se eliminuje aplikace několika různých enzymů získaných v několika mikrobiálních fermentačních krocích při výrobě piva.
Průběh varného procesu prováděného způsobem podle vynálezu, je mnohem lépe předvídatelný než průběh procesu, při kterém se slad používá jako zdroj enzymů, protože transgenní semena neobsahují žádné další enzymatické aktivity ve vyšších koncentracích než ty enzymatické aktivity, které se exprimovaly zavedením genů. Kromě toho je průběh způsobu podle vynálezu mnohem lépe předvídatelný než průběh způsobu využívajícího mikrobiální enzymy, protože mikrobiální enzymatické přípravky vykazují nedefinované a proměnné úrovně vedlejších aktivit.
Jednou z oblastí, ve kterých je možné v zásadě použít způsob podle vynálezu, jsou africké země, do kterých je dovoz sladu zakázán. Enzymy by se v tomto případě mohly exprimovat v čiroku, který by se potom mohl přidávat do varného procesu.
01-221-99 Če • ·♦ *· ·· ·· ·· ·· · 9 ··«· ···· • · · ···· · · · · • ··· · · · · · · ··· ··· • · · · · · · · ··· ·· ·· ·« ·· ··
Vedle použití při vaření alkoholických nápojů lze rovněž předvídat další uplatnění sladových semen jako náhražku sladovaného zrna. Mlynáři používají sladovaný ječmen a/nebo sladovanou pšenici ke standardizaci diastázové energie mouky. Do mouky se rovněž přidávají hemicelulázy (například xylanázy), které zvyšují plynovou retenční kapacitu těsta vyrobeného z mouky. Přidání nebo použití enzymů v mouce lze nahradit použitím sladového semene, které je velmi vhodné, protože poskytuje enzymy ve formě zrn, která mohou být využita libovolným způsobem. Rovněž lze enzymy přidat namísto sladu do pekařských těst. Enzymy, které zkvalitňují pekařský proces, jsou xylanáza, amyláza, arabinofuranosidáza a exopeptidáza. V semenech pro pekárenské účely lze rovněž exprimovat glukózooxidázu z Aspergillus niger.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Měření aktivity endo-beta-1,4-xylanázy
Endoxylanáza se získá z čisté kultury Aspergillus niger ve sterilní nádobě a sterilním médiu. Kultivační médium obsahuje vhodný zdroj uhlíku a dusíku pouze ve formě minerálních solí. Fermentace se provádí při konstantní teplotě, která se pohybuje v rozmezí od 30 do 40°C a pH hodnota se udržuje v rozmezí od 3 do 5.
Aktivita enzymů se měří hydrolýzou xylanu z ovsa, suspendovaného (35 g/l) v 1M glycinovém pufru s pH 2,75.
• · • ·
01-221-99 Če
Viskozita tohoto roztoku se stanoví za použití kapilárního viskozimetru (typ Ubbelhode) při 47°C. Čas dt, potřebný k tomu, aby horní meniskus kapaliny klesl mezi dva referenční body se měřil během doby T. Směrnice křivky T vs. 1/dt poskytla kinetickou konstantu. 1 Lyx jednotka odpovídá množství enzymu, které je potřebné pro dosažení hodnoty 1 min-1 pro tuto kinetickou konstantu.
Příklad 2
Měření aktivity exopeptidázy
Aspergillus sojae je vyjádřena v (Leu-A) : 1 Leu-A
Kultivuje se produkční kmen (DS 8351). Exopeptidázová aktivita Leucinaminopeptidázových j ednotkách odpovídá množství enzymu potřebnému pro produkci 1 gmolu p-nitroanilinu za 1 minutu při pH 7,2 a teplotě 20°C z L-leucin-p-nitroanilinu. Test je prováděn následujícím způsobem: Leucinparanitroanilid (SIGMA) se rozpustí ve vodě při koncentraci 9 mmolů. 1 ml roztoku se smísí s 1,5 ml 0,1 M fosfátového pufru s pH 7,2. V čase t=0 se zavede 0,5 ml enzymu a nechá zreagovat při 20°C. O patnáct minut později se reakce zastaví přidáním 1 ml IN roztoku kyseliny chlorovodíkové. Při kontrolním běhu se IN roztok kyseliny chlorovodíkové zavede v čase t=0. Optická hustota se určí pro kontrolní běh (ODbiank) a pro testovaný běh (0Dassay) při 400 nm. Aktivita se vypočte pomocí následující rovnice:
' ODblemk ~ OD, assay/
Leu-A/ml
9,8 x 15
0,5 • ·
01-221-99 Če
Příklad 3
Měření aktivity arabinofuranosidázy
Isoenzym A nebo isoenzym B nebo arabinoxylanhydroláza se získá z kultury kmenů Aspergillus niger nebo Aspergillus nidulands. Aktivita isoenzymu A a B se měří hydrolýzou p-nitrofenyl-alfa-L-arabinofuranózy. 1 ARF jednotka odpovídá množství enzymu potřebnému pro uvolnění 1 gmolu p-nitrofenolu za 1 minutu, za podmínek, které popsal Gunata Z. a kol. (J. Agric. Food Chem. 38, 772, 1989).
Příklad 4
Měření aktivity sacharizující amylázy
Sacharizující amyláza se získá z čisté kultury Penicillium emersonii ve sterilní nádobě a sterilním médiu, které obsahuje vhodný zdroj uhlíku a dusíku pouze ve formě minerálních solí. Nádoba se po 10 až 30 hodinách po zahájení fermentace (výhodně po 24 hodinách) naplní maltodextriny. Teplota se udržuje v rozmezí 40 až 50°C (výhodně 45°C) a pH hodnota se udržuje v rozmezí 4,5 až 5,5 (výhodně 5,0). Fermentace se ukončí 40 až 55 hodin (výhodně 48 hodin) po startu.
Aktivita sacharizující amylázy se měří za použití testu BETAMYL, který je komerčně dostupný od společnosti MEGAZYME (Irsko). 1 BTU jednotka odpovídá množství enzymu, které je potřebné pro produkci 1 pmolu p-nitrof enolu při pH 6,2 a 42°C z komerčního substrátu společnosti Megazyme.
• · • 9
01-221-99 Če
Příklad 5
Příprava kvasné kapaliny za použití mikrobiálních enzymů
Kvasná kapalina se připravila ze zrn surového ječmene variety PLAISANT. Ječmen se mlel v mlýnu EBC MIAG a dosáhl tak granulometrie typu filtrového lisu. 57 g umletého ječmene se suspendovalo ve 300 ml teplé vody (50°C), která obsahovala:
650 Lyx jednotek endo-β-(1,4)xylanázy
850 ARF jednotek arabinofuranosidázy mg B.A.T.S. (tepelně stabilní amylázy) mg Brewers Protease (+) (endo-proteázy) mg Flitrase L3000 (+) (β-(1,3;1,4)glukanázy).
Teplota se udržovala po dobu 30 minut na 50°C a následně se zvýšila na 63°C (rychlostí l°C/min); potom se 30 minut udržovala teplota při 63°C a po jejich uplynutí se opět zvýšila na 72°C (rychlostí l°C/min) a při této teplotě udržovala dalších 30 minut. V závěru se teplota zvýšila na 76°C (rychlostí l°C/min) a při této teplotě se udržovala 5 minut. Odpařená voda se doplnila a kaše se potom nalila do nálevky obsahující papírový filtr Schleicher a Schull. Z hustoty přefiltrované kvasné kapaliny se způsobem, který se používá v pivovarech, určil výtěžek a za po užití standardních EBC postupů se rovněž určila viskozita a obsah volných aminokyselin (FAA).
Výtěžek byl v tomto případě 71,5%, viskozita 2,52 mPa.s a obsah volných aminokyselin 66 mg/1.
• · • · • ·
01-221-99 Če • · · · · • · · · • · · »
Příklad 6
Porovnání sacharizující amylázy
Kvasná kapalina se připravila ze zrn surového ječmene variety PLAISANT. Ječmen se mlel v mlýnu EBC MIAG a dosáhl tak granulometrie typu filtrového lisu. 57 g umletého ječmene se suspendovalo ve 300 ml teplé vody (50°C), která obsahovala:
650 Lyx jednotek endo-β-(1,4)xylanázy
850 ARF jednotek arabinofuranosidázy mg B.A.T.S. (tepelně stabilní amylázy) mg Brewers Protease (+) (endo-proteázy)
100 Leu-A jednotek exopeptidázy mg Flitrase L3000 (+) (β-(1,3;1,4)glukanázy).
Do varné směsi se přidaly sacharizující enzymy v dávkách naznačených v Tabulce 1.
Tabulka 1 Dávky sacharizujících enzymů
| Varná směs č. | Sacharizující enzym | |
| 1 | žádný | 0 |
| 2 | Brewers Fermex | 510 FAU |
| 3 | Amyláza z P. emersonii | 10 BTU |
| 4 | Brewers Fermex + amyláza z P. emersonii | 510 FAU + 10 BTU |
Teplota se udržovala po dobu 30 minut na 50°C a následně se zvýšila na 63°C (rychlostí l°C/min); potom se 30 minut udržovala teplota při 63°C a po jejich uplynutí opět zvýšila na 72°C (rychlostí l°C/min) a při této teplotě udržovala dalších 30 minut. V závěru se teplota zvýšila na 76°C (rychlostí l°C/min) a při této teplotě se udržovala • 4
4 4 · · 4 4 · · ·· ·
4 4 4··· 4444 • ··· 44 · 4 44 444 444
44444 4 4
444 44 44 44 44 44
01-221-99 Če minut. Odpařená voda se doplnila a kaše se potom nalila do nálevky obsahující papírový filtr Schleicher a Schull. Z hustoty přefiltrované kvasné kapaliny se způsobem, který se používá v pivovarech, určil výtěžek a za po užití standardních EBC postupů se rovněž určila viskozita a obsah volných aminokyselin (FAA).
Výsledky naměřených výtěžků, viskozity a FAA, které jsou shrnuty v níže uvedené Tabulce 2, prezentují účinky sacharizujícího enzymu Pění clili um emersonii jako náhrady Brewers Fermex. Ze získaných výsledků vyplývá, že použití obou enzymů nepřináší žádný skutečně synergický výtěžek. Zvláště překvapivým je poměrně pozitivní vliv amylázy Penicillium emersonii na zvýšení koncentrace FAA a snížení viskozity.
Tabulka 2 Výsledky
| Varná směs č. | Výtěžek (%) | Viskozita (mPa. s) | FAA (12 Plato) (mg/1) |
| 1 | 71, 2 | 3,12 | 116 |
| 2 | 74,6 | 2,73 | 114 |
| 3 | 78,2 | 1, 99 | 153 |
| 4 | 79, 6 | 1, 99 | 152 |
Příklad 7
Konstrukce binárního vektoru obsahujícího pro semeno specifickou expresní kazetu
Expresní konstrukt se zkonstruuje tak, že se za použití Oryza sativa L. glutelinového zásobního proteinu (Zheng a kol., Plant Physiol (1995) 109; 77-786) získá pro semeno specifická exprese. Pro dosažení stejného cíle lze • ·
01-221-99 Če tyto sekvence nahradit sekvencemi z podobných pro semeno specifických genů.
Při konstrukci expresního konstruktu pro semena specifickou expresi, se z glutelinového (Gtl) genu Oryza sativa L. syntetizovaly za použití PCR technologie s genomovým klonem Gtl (Okita a kol., J. Biol. Chem. 264, 12573-12581, 1989) sekvence promotoru a terminátoru jako matrice. Tento gen vykazoval pro semeno specifickou expresi. Stanovila se jeho kódovací a lemovací sekvence (EMBL, Genebank Nucleotide Sequence Database, přístupové číslo D00584)) . Syntetizovaly se dvě sady oligonukleotidů. Jedna se použila pro amplifikaci 2,4 Kb fragmentu obsahujícího Gtl 5' lemovací oblasti kódující jako Xhol/Sphl fragment:
5'Gtl.l 5' GCACAATTCTCGAGGAGACCG 3'
5'Gtl.2 5' ATGGATGGCATGCTGTTGTAG 3'
Další amplifikace 3' lemovacích sekvencí jako BamHI/EcoRI fragment (725bp):
3'Gtl.3 5 ' CCTCTTAAGGATCCAATGCGG 3'
3'Gtl.4 5' CTTATCTGAATTCGGAAGCTC 3'
Oligonukleotidy jsou navrženy tak, že obsahují na svých koncích vhodná restrikční místa, která umožňují po digeraci fragmentů s restrikčními enzymy přímé sestavení expresního konstruktu. Geny pro enzymy směsi podle vynálezu lze nalést v literatuře tj. gen pro endo-xylanázu (Mol. Microbiol. 12, 479-490, 1994), pro arabinofuranosidázový isoenzym A a isoenzym B (EP 0 506 190), pro amylázu z Bacillus licheniformis (EP 0 449 376), pro ptoteázu z Bacillus amyloliquefaciens (J. Bact. 159, 811-819) a pro
01-221-99 Ce glukanázovou formu z Bacillus amyloliquefaciens (Gene 49, 177-187, 1986). Geny pro sacharizující amylázu z Penicillium a pro exopeptidázu z Aspergillus sojae lze, jak je zřejmé odborníkům v daném oboru, snadno získat z čistého enzymu, který lze izolovat z kultur označených v popisné části vynálezu.
Použití kodonu genů kódujících enzymy, které se mají exprimovat v semenech, se optimalizuje pro expresi jednoděložných semen. Této optimalizace se dosahuje syntetickou přípravou kompletního genu. Za účelem klonování se BspHI místo zavede na ATG startovací kodon a BamHI místo se zavede za TAA koncový kodon.
2,4 kb PCR produkt obsahující 5' lemující oblast Gtl se digeruje Xhol/Sphl a klonuje ve vektoru pSL1180, linearizovaném Xhol/Sphl. Výsledný vektor se linearizuje SphI/BamHI a použije jako vektor ve třícestné ligaci genem kódujícím syntetický enzym a případně oligonukleotidovým duplexem kódujícím targetingový signál. Targeting lze směrovat na vakuolu, na apoplast, na amyloplast nebo (například KDEL-retenčním signálem) na endoplasmatické retikulum.
Z tohoto vektoru se izoluje fragment obsahující fúze Gtl glutelinového promotoru, případně signální frekvenci a syntetický gen. Tento fragment se klonuje ve třícestné ligaci 725 bp PCR produktem obsahujícím 3' terminační sekvenci Gtl digerovanou BamHI/EcoRI do binárního vektoru pMOG22 (v E. coli K-12 kmen DH5-alfa, uložený v Centraal Bureau voor Schimmelcultures 29. ledna 1990 pod přístupovým číslem CBS 101.90).
01-221-99 Če • · • ·
Příklad 8
Konstrukce binárního vektoru obsahujícího endo-xylanázový gen v pro semeno specifické expresní kazetě
Endoxylanázový gen z Aspergillus niger se použije pro optimalizaci využití kodonu v ječmeni. Výslednou DNA sekvenci popisuje SEQ ID NO:1.
Pro expresi endoxylanázového genu se extracelulární zacílení provádí za použití oligonukleotidového duplexu
PRS.l 5' AACTrCCTCAAGACCnCCCCTrrrATCCCnCCrrrGrrnGCCCAATACTTrGTAGCTGnACGCATGC 3'
PRS.2 3' GTACTrGAAGGAGTTCTCGAAGGGGAAAATACGGAAGGAAACAAAACCGGTTATGAAACATCGACAATGCGTACGGTACC 5' kódujícího signální peptid tabákového PR-S proteinu a použije se třícestná ligace syntetického xylanázového genu digerovaného BspHI/BamHI. Z tohoto vektoru se izoluje 3,1 Kb Xhol/BamHI fragment, který obsahuje fúze Gtl glutelinového promotoru, PR-S signální sekvenci a syntetický xylanázový gen. Tento fragment je uzavřen v třícestné ligaci 725 bp PCR produktem obsahujícím 3' terminační sekvenci Gtl digerovanou BamHI/EcoRI do binárního vektoru pMOG22. Byl navržen výsledný vektor pMOG1265.
Příklad 9
Transformace ječmene
Způsob použitý pro transformaci nezralých zárodků Hordeum vulgare cv. Golden Promise za použití Agrobacterium tumefaciens obecně popsal Tingay, S. a kol. v The Plant J.
01-221-99 Če
11(6), 1369-1376, 1997. Tento protokol v krátkosti obsahuje následující postup:
Dárcovské rostliny poskytující výchozí materiál se pěstují v phytotronu při teplotě 10 až 20°C, při šestnáctihodinové světelné periodě 10 000 až 30 000 luxů a při 50 až 95% relativní vlhkosti. Nezralé semeno se sklidí 10 až 15 dní po opylení a 20 až 40 minut se sterilizuje v bělícím roztoku. Nezralé zárodky se zbaví mladých caryopsis a osa zárodku se odstraní ostřím skalpelu. Explantáty se umístí na médium indukující tvorbu hojivého pletiva tak, že scutellum je orientováno směrem nahoru, a inkubují se ve tmě při 24°C po dobu 16 hodin až 7 dní.
Zárodky se ponoří do suspenze bakterie Agrobacterium (přibližně 0,1 až 10 χ 109 bakterií na ml), ve které zmíněná bakterie Agrobacterium obsahuje konstrukty DNA kódující zvolený enzym, na 5 až 20 minut a potom se přemístí do média indukujícího tvorbu hojivémo pletiva.
Zárodky se potom inkubují ve tmě, dva nebo tři dny při teplotě 24°C. Po ko-kultivaci se zárodky přemístí do média indukujícího tvorbu hojivého pletiva, které obsahuje antibiotika ničící bakterie Agrobacterium, a přímo smísí se selekčním činidlem, které zahájí selekci transgenních buněk. Selekční proces trvá až 8 týdnů. Rezistentní linie zárodečného hojivého pletiva se přemístí do regenerečního média a inkubují za zvýšené světelné intenzity (500 až 3 000 luxů) při šestnáctihodinové světelné periodě a 24 °C. Regenerované rostliny se přemístí do média indukujícího tvorbu hojivého pletiva, které neobsahuje žádný hormon nebo obsahuje vysokou koncentraci cytokininu a které obsahuje nebo neobsahuje selekční činidlo. Potom, co se vyvine • ·
01-221-99 Če • · · · • · · · · · · • ·· · · ··· • · · · · · • · · · · · kořenový systém, se rostliny přemístí do půdy a po samoopylení pěstují až do úplné zralosti.
Příklad 10
Byly provedeny tři kompletní zkušební várky piva. Při dvou testovaných várkách se podstatným způsobem snížilo množství použitého sladu (20 % surového materiálu) a v případě kontrolní várky se použilo normální množství sladu (viz Tabulka 3) . Dvě testované várky se od sebe lišily použitou technologií mletí a filtrování (viz Tabulka 3). Diagram várky pro všechny tři případy je znázorněn na Obr. 1.
Tabulka 3 Složení surového materiálu, filtrace a mletí
| Kontrolní | Testovaná várka 1 | Testovaná várka 2 | |
| Plzeňský slad | 75 % | 20 % | 20 % |
| Kukuřičná krupice | 25 % | 25 % | 25 % |
| Nesladovaný j ečmen | — | 55 % | 55 % |
| Filtr | Lautertun | Lautertun | Meura 20001 |
| Mletí | Válcový mlýn | Válcový mlýn | Kladivový mlýn |
Z kontrolní směsi se ve vařiči obilnin použilo 8 % sladu spolu s kukuřičnou krupicí a dalších 67 % sladu se přidalo do konverzní nádoby. V případě testovaných várek se ve vařiči obilnin použilo společně s kukuřičnou krupicí 8 % nesladovaného ječmene a dalších 47 % nesladovaného ječmene se přidalo do konverzní nádoby spolu se sladem.
• 0
01-221-99 Če • ·· ··
0« 0 · 0*0
0« 0· • 00000 00 t 0 t 0 ·
0 0 ·· « ·
Tabulka 4 Kódy enzymů a množství přidaná na 100 kg surového materiálu
| Kód enzymu | Enzym | Vařič obilnin | Konverzní nádoba |
| 1 | Endo-β-(1,4)-xylanáza | 117 000 Lyx | |
| 2 | Arabinofuranosidáza | 112 500 ARF | |
| 3 | B.A.T.S. | 16,5 g | |
| 4 | Brewers Fermex | 75 g | |
| 5 | Brewers protease (+) | 75 g | |
| 6 | Exo-peptidáza | - | |
| 7 | Filtrase L3000 (+) | 23 g |
Enzymy 1, 2, 4, 5 a 7 se přidaly do konverzní nádoby, zatímco enzym 3 se přidal do vařiče obilnin (viz Tabulka 4, kde jsou uvedeny kódy enzymů a přidaná množství).
Výsledky zpracování sladiny (rmutování a filtrace) jsou v případě testovaných várek a kontrolní várky podobné. Dvě testované várky se provedou podobným způsobem v pivovaru. Testované várky poskytnou zhruba stejnou sladinu, což ukazuje, že rozdíly ve filtraci a mletí nejsou podstatné. Ze srovnání chuti testovaných várek a kontrolní várky vyplývá, že všechna tři piva mají velmi podobný profil. Testované várky mají v porovnání s kontrolní várkou výraznější chuť. To může být způsobeno vyšší hladinou dextrinu, která se zjistila při analýze sladiny. Testované várky mají v porovnání s kontrolní várkou nižší, ale stále ještě přijatelnou, hladinu aminokyselin. Hladiny aminokyselin lze zvýšit přidáním exopeptidázy (viz Příklad 11). Testovaná piva byla klasifikována týmem ochutnávačů jako dobré plzeňské pivo, což ukazuje, že částečná náhrada sladu směsí enzymů poskytuje pivo, které • «· ·· ·· ·· ·· ·· 9 · ···· ···· ··· · · ·· ···· μ-ι ηο-ι rs r\ Λ · ··· · · · · · · ··· ···
01-221-99 Ce .·.····· ··· ·· ·· ·· ·· ·· je srovnatelné s pivem vyrobeným za použití množství sladu, které se v pivovarnictví běžně používá.
Příklad 11
Provedly se dvě kompletní zkušební várky. Při testované várce se použilo snížené množství sladu, zatímco při kontrolní várce se použilo normální množství sladu (viz Tabulka 5). Pro filtraci se použil filtr Lautertun. Diagramy testované várky 1 a kontrolní várky znázorňuje Obr. 2.
Tabulka 5 Složení surového materiálu
| Kontrolní | Testovaná várka 1 | |
| Plzeňský slad | 75 % | 20 % |
| Kukuřičná krupice | 25 % | 25 % |
| Nesladovaný ječmen | - | 55 % |
Z kontrolní směsi se ve vařiči obilnin použilo 8 % sladu spolu s kukuřičnou krupicí a dalších 67 % sladu se přidalo do konverzní nádoby. V případě testovaných várek se ve vařiči obilnin použilo společně s kukuřičnou krupicí 8 % nesladovaného ječmene a dalších 47 % nesladovaného ječmene se přidalo do konverzní nádoby spolu se sladem.
U testované várky se do konverzní nádoby přidaly enzymy 1 až 7, zatímco enzym 3 se přidal do vařiče obilnin (viz Tabulka 6, kde jsou uvedeny kódy enzymů a použitá množství enzymů).
Výsledky zpracování sladiny (rmutování a filtrování) byly pro testovanou a kontrolní várku podobné. Testovaná a kontrolní várka měly podobný obsah volného
01-221-99 Če • · · · · aminokyselinového dusíku ve sladině. Testovaná várka poskytla pivo, které mělo v podstatě stejný chuťový profil jako pivo získané kontrolní várkou. Tým ochutnávačů ohodnotil pivo získané testovanou várkou jako dobré plzeňské pivo, což ukázalo, že částečné nahrazení sladu směsí enzymů poskytuje pivo, které je srovnatelné s pivem vyrobeným za použití množství sladu běžně používaného v pivovarnictví.
Tabulka 6 Kódy enzymů a množství přidaná na 100 kg surového materiálu v testované várce
| Kód enzymu | Enzym | Vařič obilnin | Konverzní nádoba |
| 1 | Endo-β-(1,4)xylanáza | 117 000 Lyx | |
| 2 | Arabinofuranosidáza | 112 500 ARF | |
| 3 | B.A.T.S. | 16,5 g | 33,5 g |
| 4 | Brewers Fermex | 75 g | |
| 5 | Brewers protease (+) | 75 g | |
| 6 | Exo-peptidáza | 105 000 LeuA | |
| 7 | Filtrase L3000 (+) | 23 g |
Příklad 12
Zrna transgenního ječmene ze sedmi linií, z nichž každá exprimuje jeden z enzymů uvedených v Tabulce 9, se vzájemně smísí v takových množstvích, která poskytnou sladová semena, která pokud se smísí s 10 % surového ječmene, potom poskytnou enzymatickou aktivitu, která je uvedena v Tabulce 9. Sladové semeno se smísí a umele s netransgenním ječmenem, se kterým tvoří společně 55 % surového materiálu testované várky. Složení surového materiálu ve vařiči obilnin a v konverzní nádobě při
01-221-99 Če ! ! ’ I ί! ί ’ • · · · fc fcfc ·· ·· · testované várce uvádí Tabulka 8. Při kontrolní várce se ve vařiči obilnin použilo spolu s kukuřičnou krupicí 8 % sladu. Zbytek surového materiálu se použil v konverzní nádobě. Distribuce sladových semen poskytne enzymatické aktivity, které uvádí Tabulka 10 jak pro konverzní nádobu tak pro vařič obilnin.
Provedly se dvě zkušební várky. Při testované várce se použilo snížené množství sladu a při kontrolní várce se použilo normální množství sladu (viz Tabulka 7). Při testované várce se použila vyšší sacharizační teplota (viz Tabulka 7). Filtrace se prováděla na filtru Lautertun. Diagram testované a kontrolní várky je znázorněn na Obr. 2.
Tabulka 7 Složení surového materiálu
| Kontrolní | Testovaná várka 1 | |
| Plzeňský slad | 75 % | 20 % |
| Kukuřičná krupice | 25 % | 25 % |
| Nesladovaný ječmen + sladové semeno | — | 55 % |
Tabulka 8
Složení surového materiálu na 100 kg celkové hmotnosti v testované várce
| Surový materiál | Vařič obilnin (kg) | Konverzní nádoba (kg) |
| Slad | 20 | |
| Nesladovaný ječmen | 7,2 | 42,3 |
| Sladové semeno | 0, 8 | 4,7 |
| Kukuřičná krupice | 25 | |
| Celkem (kg) | 33 | 67 |
01-221-99 Če • ·
·· ·· ·· ·· • ·· 9 9 9 9 · · 99 9 9 9 9
9 9 99 99 9 99 9
9 9 9 9 9
Výsledky zpracování sladiny (rmutování a filtrování) byly podobné pro testovanou várku a pro kontrolní várku. Testovaná várka poskytla piva, která měla podobný chuťový profil jako piva, která poskytla kontrolní várka. Testovaná várka byla klasifikována jako klasické sladové pivo, což ukazuje, že slad může být (částečně) nahrazen enzymy, které poskytují transgenní semena exprimující tyto enzymy.
Tabulka 9 Množství enzymatické aktivity získané přidáním sladového semena (jednotky na 100 kg surového materiálu) v testované várce 1
| Kód enzymu | Enzym | Vařič obilnin | Konverzní nádoba |
| 1 | Endo-β-(1,4)xylanáza | 19 915 Lyx | 117 000 Lyx |
| 2 | Arabinofuranosidáza | 19 149 ARF | 112 500 ARF |
| 3 | B.A.T.S. | 107 250 TAU | 630 094 TAU |
| 4 | Brewers Fermex | 57 872 FAU | 340 000 FAU |
| 5 | Brewers protease (+) | 115 745 PC | 680 000 PC |
| 6 | Exo-peptidáza | 17 872 Leu-A | 105 000 Leu-A |
| 7 | Filtrase L3000 (+) | 11 701 BGLU | 68 745 BGLU |
Výše uvedené příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.
··
01-221-99 Če
| SEKVENČNÍ PROTOKOL | |
| INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1: | |
| (i) | SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: (A) DÉLKA: 558 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C> DRUH ŘETĚZCE: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární |
| (ii) | TYP MOLEKULY: cDNA |
| (iii) | HYPOTETICKÝ: žádný |
(iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (ix) ZNAK (A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POZICE: 1 až 558 (D) JINÉ INFORMACE: /produkt = „zralý protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
| ATG AGC GCG | GGA ATC | AAC Asn | TAC GTC | CAG AAC TAC AAT GGC AAC CTC | GGC Gly | 48 | ||||||||||
| Met 1 | Ser | Ala | Gly | Ile 5 | Tyr | Val | Gin | Asn 10 | Tyr | Asn | Gly | Asn | Leu 15 | |||
| GAC | TTT | ACT | TAC | GAC | GAG | TCA | GCG | GGA | ACT | TTC | AGC | ATG | TAT | TGG | GAG | 96 |
| Asp | Phe | Thr | Tyr 20 | Asp | Glu | Ser | Ala | Gly 25 | Thr | Phe | Ser | Met | Tyr 30 | Trp | Glu | |
| GAT | GGC | GTG | TCC | TCA | GAC | TTC | GTC | GTG | GGA | CTG | GGC | TGG | ACC | ACT | GGA | 144 |
| Asp | Gly | Val 35 | Ser | Ser | Asp | Phe | Val 40 | Val | Gly | Leu | Gly | Trp 45 | Thr | Thr | Gly | |
| TCA | TCC | AAT | GCG | ATC | ACC | TAC | AGC | GCC | GAG | TAC | TCC | GCG | TCA | GGA | TCA | 192 |
| Ser | Ser 50 | Asn | Ala | Ile | Thr | Tyr 55 | Ser | Ala | Glu | Tyr | Ser 60 | Ala | Ser | Gly | Ser | |
| GCC | TCC | TAT | CTG | GCC | GTG | TAC | GGA | TGG | GTG | AAC | TAC | CCG | CAG | GCC | GAG | 240 |
| Ala 65 | Ser | Tyr | Leu | Ala | Val 70 | Tyr | Gly | Trp | Val | Asn 75 | Tyr | Pro | Gin | Ala | Glu 80 | |
| TAC | TAC | ATC | GTG | GAG | GAT | TAC | GGA | GAT | TAC | AAC | CCA | TGC | AGC | TCA | GCG | 288 |
| Tyr | Tyr | Ile | Val | Glu 85 | Asp | Tyr | Gly | Asp | Tyr 90 | Asn | Pro | Cys | Ser | Ser 95 | Ala | |
| ACC | TCC | CTC | GGA | ACT | GTG | TAC | AGC | GAC | GGC | TCC | ACC | TAC | CAG | GTC | TGC | 336 |
| Thr | Ser | Leu | Gly 100 | Thr | Val | Tyr | Ser | Asp 105 | Gly | Ser | Thr | Tyr | Gin 110 | Val | Cys | |
| ACC | GAC | ACC | CGC | ACT | AAC | GAG | CCG | TCA | ATC | ACC | GGC | ACT | TCC | ACC | TTC | 384 |
| Thr | Asp | Thr | Arg | Thr | Asn | Glu | Pro | Ser | Ile | Thr | Gly | Thr | Ser | Thr | Phe |
115 120 125 ··
01-221-99 Ce
| ACC Thr | CAG Gin 130 | TAC Tyr | TTC Phe | AGC GTG CGC | GAG Glu | TCC ACT CGC ACC | TCA GGA ACC GTG | |||||||||
| Ser | Val | Arg 135 | Ser | Thr | Arg | Thr 140 | Ser | Gly | Thr Val | |||||||
| ACC | GTC | GCG | AAC | CAC | TTC | AAC | TTC | TGG | GCG | CAG | CAC | GGA | TTC | GGC | AAC | |
| Thr | Val | Ala | Asn | His | Phe | Asn | Phe | Trp | Ala | Gin | His | Gly | Phe | Gly | Asn | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| AGC | GAC | TTT | AAC | TAC | CAG | GTG | GTC | GCA | GTG | GAG | GCA | TGG | TCA | GGA | GCG | |
| Ser | Asp | Phe | Asn | Tyr | Gin | Val | Val | Ala | Val | Glu | Ala | Trp | Ser | Gly | Ala | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| GGC | TCA | GCG | TCC | GTC | ACT | ATC | AGC | TCC | TG | |||||||
| Gly | Ser | Ala | Ser | Val | Thr | Ile | Ser | Ser | ||||||||
| 180 | 185 |
432
480
528
558 (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 185 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
| Met 1 | Ser | Ala | Gly | Ile 5 | Asn | Tyr | Val | Gin | Asn 10 | Tyr | Asn | Gly | Asn | Leu 15 | Gly | |
| Asp | Phe | Thr | Tyr 20 | Asp | Glu | Ser | Ala | Gly 25 | Thr | Phe | Ser | Met | Tyr 30 | Trp | Glu | |
| - | Asp | Gly | Val 35 | Ser | Ser | Asp | Phe | Val 40 | Val | Gly | Leu | Gly | Trp 45 | Thr | Thr | Gly |
| - | Ser | Ser 50 | Asn | Ala | Ile | Thr | Tyr 55 | Ser | Ala | Glu | Tyr | Ser 60 | Ala | Ser | Gly | Ser |
| Ala 65 | Ser | Tyr | Leu | Ala | Val 70 | Tyr | Gly | Trp | Val | Asn 75 | Tyr | Pro | Gin | Ala | Glu 80 | |
| Tyr | Tyr | Ile | Val | Glu 85 | Asp | Tyr | Gly | Asp | Tyr 90 | Asn | Pro | Cys | Ser | Ser 95 | Ala |
01-221-99 Ce • ··
| Thr | Ser Leu | Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gin Val Cys | |||||||||||||
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Thr | Asp | Thr | Arg | Thr | Asn | Glu | Pro | Ser | Ile | Thr | Gly | Thr | Ser | Thr | Phe |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Thr | Gin | Tyr | Phe | Ser | Val | Arg | Glu | Ser | Thr | Arg | Thr | Ser | Gly | Thr | Val |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Thr | Val | Ala | Asn | His | Phe | Asn | Phe | Trp | Ala | Gin | His | Gly | Phe | Gly | Asn |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ser | Asp | Phe | Asn | Tyr | Gin | Val | Val | Ala | Val | Glu | Ala | Trp | Ser | Gly | Ala |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Gly | Ser | Ala | Ser | Val | Thr | Ile | Ser | Ser | |||||||
| 180 | 185 | ||||||||||||||
| 1) INFORMACE | PRO | SEQ | ID | NO: | 3: |
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 71 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Nicotiana tabacum (tabák virginský) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
AACTTCCTCA AGAGCTTCCC CTTTTATGCC ttcctttgtt TTGGCCAATA CTTTGTAGCT
GTTACGCATG C (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 80 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý
01-221-99 Če ·· (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: ano (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4
CCATGGCATG CGTAACAGCT ACAAAGTATT GGCCAAAACA AAGGAAGGCA TAAAAGGGGA 60
AGCTCTTGAG GAAGTTCATG on (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5
ATGGATGGCA
TGCTGTTGTA G (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
GCACAATTCT CGAGGAGACC G
01-221-99 Ce
| (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 7: | |
| (i) | SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY: (A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární |
| (ii) | TYP MOLEKULY: cDNA |
| (iii) | HYPOTETICKÝ: žádný |
| (iii) | PROTISMYSLNÝ: žádný |
| (xi) | POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7 |
CCTCTTAAGG
ATCCAATGCG (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 8:
(i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKY:
(A) DÉLKA: 21 bazických párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÝ: žádný (iii) PROTISMYSLNÝ: žádný (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:
CTTATCTGAA TTCGGAAGCT C
Claims (8)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby alkoholických nápojů, vyznačený tím, že se do těchto alkoholických nápojů přidá směs enzymů, která obsahuje alespoň endo-β(1,4)xylanázu, arabinofuranosidázu, alfa-amylázu, endoproteázu a β-(1,3;1,4)glukanázu.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že směs rovněž obsahuje sacharizujíci amylázu.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že směs rovněž obsahuje exo-peptidázu.
- 4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3, vyznačený tím, že alkoholickým nápojem je pivo.
- 5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že každý z uvedených enzymů je poskytnut semeny jednotlivých transgenních rostlinných linií.01-221-99 Če • · 9 • «9 9· 99 ·· • 9 9« 9 999 99*V Λ 9 *·«· ·«· • **· ·· 9« ·· ·*· • · · 9 9 9 · *·«·· *· ·· ··
- 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačený tím, že více než jeden enzym je poskytnut semeny jednotlivých transgenních rostlinných linií.
- 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačený tím, že alespoň jeden enzym je poskytnut semeny jednotlivých rostlinných linií.
- 8. Způsob podle některého z nároků 5 až 7, vyznačený tím, že transgenní rostlinnou linií je rostlinná linie ječmene.Zastupuj e:·· ·« ·· ·· fc··· ···· ·· ···· ···· ··· · to · · · fc ··· ··· fc · · · * · · ·· ·· ·· ·· ··01-221-99 Če3% ·· • ·TUObr. 1Diagram várky • Vařič obilnin/rmutový vařič » Konverzní nádoba/rmutový mixérTeplota1/201-221-99 Če • ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ···· ··· ···· ···· • ··· · · · · · · ··· ··· • ····· · · ··· ·· ·· ·· ·· ··Obr. 2Diagram várky pro testovanou várku 1 a kontrolní várku • Vařič obilnin/rmutový vařič Konverzní nádoba/rmuťový mixér
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96202195 | 1996-08-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ37899A3 true CZ37899A3 (cs) | 1999-10-13 |
| CZ296732B6 CZ296732B6 (cs) | 2006-05-17 |
Family
ID=8224258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0037899A CZ296732B6 (cs) | 1996-08-05 | 1997-07-23 | Zpusob výroby alkoholických nápoju |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6361808B1 (cs) |
| EP (1) | EP0915985A1 (cs) |
| JP (1) | JP2000515381A (cs) |
| CN (1) | CN1230225A (cs) |
| AU (1) | AU720139B2 (cs) |
| BG (1) | BG64681B1 (cs) |
| BR (1) | BR9711620A (cs) |
| CA (1) | CA2262436A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ296732B6 (cs) |
| MX (1) | MXPA99001239A (cs) |
| PL (1) | PL191456B1 (cs) |
| WO (1) | WO1998005788A1 (cs) |
Families Citing this family (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7033627B2 (en) * | 1990-03-23 | 2006-04-25 | Syngenta Mogen B.V. | Production of enzymes in seeds and their use |
| EP0996709B1 (en) * | 1997-04-30 | 2004-12-29 | K.U. LEUVEN RESEARCH & DEVELOPMENT | Inhibitors of cellulolytic, xylanolytic and beta-glucanolytic enzymes |
| EP0979830A1 (en) * | 1998-08-12 | 2000-02-16 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | A novel class of xylanase inhibitors |
| WO2001059141A2 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-16 | Washington State University Research Foundation | Methods and compositions that utilize barley as a foodstuff for animals |
| US20030172403A1 (en) | 2000-05-02 | 2003-09-11 | Ning Huang | Plant transcription factors and enhanced gene expression |
| US7417178B2 (en) | 2000-05-02 | 2008-08-26 | Ventria Bioscience | Expression of human milk proteins in transgenic plants |
| US6991824B2 (en) | 2000-05-02 | 2006-01-31 | Ventria Bioscience | Expression of human milk proteins in transgenic plants |
| AU7242200A (en) * | 2000-06-12 | 2001-12-13 | Academia Sinica | Protein production in transgenic plant seeds |
| US20030091691A1 (en) * | 2000-06-23 | 2003-05-15 | Olsen Hans Sejr | Stepping process |
| DE60210749T2 (de) * | 2001-02-19 | 2007-03-29 | Kirin Beer K.K. | Verfahren zur präparation von hefe für fermentationstest |
| US20040115779A1 (en) * | 2002-03-19 | 2004-06-17 | Olsen Hans Sejr | Fermentation process |
| US7008652B2 (en) * | 2002-06-14 | 2006-03-07 | Brown-Forman Corporation | Method for production of a flavorless malt base |
| BRPI0417686B1 (pt) | 2003-12-19 | 2019-12-10 | Novozymes As | processos para a produção de uma infusão tendo filtrabilidade realçada e/ou rendimento melhorado do extrato depois da filtração |
| EP1705998B1 (en) * | 2004-01-30 | 2014-05-21 | DSM IP Assets B.V. | Use of a carboxypeptidase |
| WO2005118769A1 (en) * | 2004-06-03 | 2005-12-15 | Novozymes A/S | Mashing process and enzyme composition useful therein |
| EP1781081A4 (en) * | 2004-07-07 | 2008-07-02 | Commw Scient Ind Res Org | TOLERANT BARLEY WITH ALUMINUM |
| GB2418431A (en) * | 2004-09-27 | 2006-03-29 | Multigerm Uk Entpr Ltd | Metabolically active micro organisms and methods for their production |
| JP2006288379A (ja) * | 2005-03-18 | 2006-10-26 | Suntory Ltd | 分画したコーンを用いた発酵飲料 |
| WO2007102850A1 (en) * | 2006-03-06 | 2007-09-13 | Lakefront Brewery, Inc. | Gluten-free beer and method for making the same |
| JP4627296B2 (ja) * | 2006-10-27 | 2011-02-09 | キリンホールディングス株式会社 | 発酵麦芽飲料製造用麦汁の製造方法 |
| GB0702844D0 (en) * | 2007-02-14 | 2007-03-28 | Leuven K U Res & Dev | Improving taste of beer |
| JP5357253B2 (ja) | 2008-07-23 | 2013-12-04 | アトレオ メディカル インコーポレイテッド | 心肺蘇生中に圧迫パラメータを測定するためのｃｐｒ補助装置 |
| JP5658489B2 (ja) * | 2010-06-16 | 2015-01-28 | アサヒビール株式会社 | 発酵麦芽飲料の製造方法 |
| EP3061816A1 (en) * | 2011-09-14 | 2016-08-31 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Use of enzymes with endo-1,4-xylanase activity to reduce off flavour in products |
| BR112014027861A2 (pt) * | 2012-05-11 | 2017-12-12 | Novozymes As | método de preparação de um mosto |
| US20150366238A1 (en) * | 2013-02-21 | 2015-12-24 | Direvo Industrial Biotechnology Gmbh | Prebiotic animal feed product |
| US20160215244A1 (en) * | 2013-09-05 | 2016-07-28 | Novozymes A/S | Method for Production of Brewers Wort |
| WO2017191109A1 (en) * | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Carlsberg Breweries A/S | Beverages containing barley beta-glucan |
| CA3062969C (en) * | 2017-05-09 | 2021-12-07 | Suntory Holdings Limited | Saccharified liquid, method for producing saccharified liquid, food and beverage, distilled liquid for whiskey, and whiskey |
| CN111787788B (zh) | 2017-12-28 | 2024-03-19 | 嘉士伯有限公司 | 具有改善的细胞壁性质的谷类植物 |
| JP2020061988A (ja) * | 2018-10-18 | 2020-04-23 | サッポロビール株式会社 | ビールテイスト飲料の製造方法及びビールテイスト飲料の香味向上方法 |
Family Cites Families (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE275704C (cs) | ||||
| CA961432A (en) * | 1969-07-08 | 1975-01-21 | Martin F. Walmsley | Process for making a brewers' wort and beer derived therefrom |
| CH572519A5 (cs) * | 1972-10-25 | 1976-02-13 | Ciba Geigy Ag | |
| US4285975A (en) * | 1980-01-29 | 1981-08-25 | Miles Laboratories, Inc. | Production of brewer's wort |
| ZA821071B (en) | 1981-03-03 | 1983-01-26 | Flogates Ltd | Improvements in the pouring of molten metals |
| JPS57152888A (en) * | 1981-03-14 | 1982-09-21 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | Alcoholic fermentation of raw potato by enzymatic process |
| GB2150933B (en) * | 1983-11-28 | 1987-08-19 | Glaxo Group Ltd | Pentosan-degrading enzyme |
| CA1280704C (en) | 1985-12-03 | 1991-02-26 | Paul Ducroo | Production of beer |
| US5487989A (en) * | 1988-08-31 | 1996-01-30 | Bioenergy International, L.C. | Ethanol production by recombinant hosts |
| DD275704A1 (de) * | 1988-09-23 | 1990-01-31 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur herstellung von gerstenpflanzen |
| PT93181A (pt) | 1989-02-16 | 1990-08-31 | Carlsberg As | Processo para a preparacao de (1,3-1,4)-beta-glucanase e a aperfeicoamentos relativos a enzimas |
| PT97110B (pt) * | 1990-03-23 | 1998-11-30 | Gist Brocades Nv | Processo para catalisar reaccoes acelaraveis por enzimas, mediante adicao ao meio reaccional de sementes de plantas transgenicas e para obtencao das referidas sementes |
| IE913215A1 (en) | 1990-09-13 | 1992-02-25 | Gist Brocades Nv | Transgenic plants having a modified carbohydrate content |
| US5180669A (en) * | 1991-03-27 | 1993-01-19 | Genencor International, Inc. | Liquefaction of granular-starch slurries using alpha-amylase in the presence of carbonate ion |
| EP0628080A1 (en) * | 1992-12-24 | 1994-12-14 | Gist-Brocades N.V. | Cloning and expression of xylanase b |
| CN1134726A (zh) * | 1993-10-04 | 1996-10-30 | 诺沃挪第克公司 | 一种包含修饰酶的酶制剂 |
| ES2204963T3 (es) * | 1994-08-26 | 2004-05-01 | Dsm Ip Assets B.V. | Enzimas degradadoras de arabinoxilano. |
| US6265000B1 (en) * | 1994-10-20 | 2001-07-24 | Hokkaido Wine Co, Ltd | Process for the production of carbonated alcoholic beverages using koji, malt, and various fermentation media |
| GB9505479D0 (en) * | 1995-03-17 | 1995-05-03 | Danisco | Enzyme |
| AU723656B2 (en) * | 1996-05-03 | 2000-08-31 | Gist-Brocades B.V. | Method for making wort having improved filterability and/or increased yield |
-
1997
- 1997-07-23 CZ CZ0037899A patent/CZ296732B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-07-23 US US09/230,590 patent/US6361808B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-07-23 CA CA2262436A patent/CA2262436A1/en not_active Abandoned
- 1997-07-23 MX MXPA99001239A patent/MXPA99001239A/es unknown
- 1997-07-23 PL PL331493A patent/PL191456B1/pl unknown
- 1997-07-23 EP EP97938858A patent/EP0915985A1/en not_active Withdrawn
- 1997-07-23 JP JP10507549A patent/JP2000515381A/ja not_active Ceased
- 1997-07-23 BR BR9711620-3A patent/BR9711620A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-07-23 AU AU41161/97A patent/AU720139B2/en not_active Ceased
- 1997-07-23 CN CN97197918A patent/CN1230225A/zh active Pending
- 1997-07-23 WO PCT/EP1997/004016 patent/WO1998005788A1/en not_active Application Discontinuation
-
1999
- 1999-02-23 BG BG103199A patent/BG64681B1/bg unknown
-
2001
- 2001-10-04 US US09/970,616 patent/US6699515B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-01-07 US US10/765,716 patent/US20050095315A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020164399A1 (en) | 2002-11-07 |
| BG103199A (en) | 2000-05-31 |
| US20050095315A1 (en) | 2005-05-05 |
| PL331493A1 (en) | 1999-07-19 |
| CA2262436A1 (en) | 1998-02-12 |
| AU720139B2 (en) | 2000-05-25 |
| WO1998005788A1 (en) | 1998-02-12 |
| CZ296732B6 (cs) | 2006-05-17 |
| CN1230225A (zh) | 1999-09-29 |
| AU4116197A (en) | 1998-02-25 |
| BR9711620A (pt) | 2001-11-20 |
| MXPA99001239A (es) | 2003-09-12 |
| EP0915985A1 (en) | 1999-05-19 |
| PL191456B1 (pl) | 2006-05-31 |
| BG64681B1 (bg) | 2005-11-30 |
| US6361808B1 (en) | 2002-03-26 |
| US6699515B2 (en) | 2004-03-02 |
| JP2000515381A (ja) | 2000-11-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6699515B2 (en) | Process for the production of alcoholic beverages using maltseed | |
| James et al. | Glucoamylases: microbial sources, industrial applications and molecular biology—a review | |
| US5889189A (en) | Process for protein production in plants | |
| RU2312144C2 (ru) | Аутопроцессирующиеся растения и части растений | |
| EP2499227B1 (en) | A brewing method | |
| Nuutila et al. | Expression of fungal thermotolerant endo-1, 4-β-glucanase in transgenic barley seeds during germination | |
| US5665585A (en) | Recombinant production of glucoamylase P in trichoderma | |
| EP0910620B1 (en) | Method for making wort having improved filterability and/or increased yield | |
| Aspegren et al. | Secretion of a heat-stable fungal β-glucanase from transgenic, suspension-cultured barley cells | |
| CN102186965B (zh) | 酿造方法 | |
| US20110086132A1 (en) | Transgenic plant expressing maltogenic alpha-amylase | |
| US20060005286A1 (en) | Production of enzymes in seeds and their use | |
| Tull et al. | Enhanced amylolytic activity in germinating barley through synthesis of a bacterial alpha-amylase | |
| EP3271447B1 (en) | A brewing method | |
| NZ303969A (en) | Endo beta 1,4-glucanase from aspergillus | |
| CN110603322A (zh) | 热稳定的葡糖淀粉酶及其使用方法 | |
| AU1263100A (en) | Transgenic plant expressing maltogenic alpha-amylase | |
| JP2023516327A (ja) | 高い限界デキストリナーゼ活性を有する大麦植物 | |
| MXPA97007112A (en) | Endo-beta-1,4-glucanase from aspergil |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 19970723 |