SK500502016A3

SK500502016A3 - Probiotický prípravok, spôsob jeho prípravy a použitie probiotického prípravku

Info

Publication number: SK500502016A3
Application number: SK50050-2016A
Authority: SK
Inventors: Eva Styková; Radomíra Nemcová; Igor Valocký
Original assignee: Univerzita Veterinárskeho Lekárstva A Farmácie V Košiciach
Priority date: 2016-08-07
Filing date: 2016-08-07
Publication date: 2018-03-05
Also published as: WO2018029595A1; SK288782B6

Abstract

Ako nosič probiotickej kultúry sa použije alginit, ktorý sa rozdrobí na zrná s frakciou do 3 mm, výhodne do 1,3 mm. Alginitové zrná sa sterilizujú a nasýtia sa substrátom, ktorý obsahuje laktózu a/alebo glukózu. Pri nasycovaní sa môže využiť vákuovanie a následne pôsobenie tlaku okolitej atmosféry, keď substrát vniká do alginitových zŕn. Ako výhodné sa ukázalo využitie frakcie 1-1,3 mm a nasýtenie 40 % laktózou. Následne sa na alginitové zrná nanesie inokulovaný kultivačný roztok a počas fermentácie sa vytvára biofilm z probiotických mikroorganizmov, najmä z rodu Lactobacillus. Fermentácia prebieha pri teplote do 40 °C, výsledná hmota sa suší. Finálny produkt sa použije ako aditívum do kŕmnych zmesí pre zvieratá alebo po rozpustení vo vode ako emulzia aplikovateľná na postihnutú kožu zvierat alebo ľudí, alebo ako medziprodukt pre prípravu finálnych produktov vo forme kapsúl, tabliet, emulzií na humánne, veterinárne alebo kozmetické účely.

Description

Probiotický prípravok, spôsob jeho prípravy a použitie probiotického prípravku

Oblasť techniky

Vynález sa týka nového nosiča probiotických mikroorganizmov najmä pre veterinárnu alebo humánnu potrebu, farmaceutiku, potravinárstvo, kozmetiku. Vynález opisuje spôsob prípravy probiotického prípravku, pri ktorom sa na novú aplikačnú formu nosiča naviažu prospešné živé mikroorganizmy. Predmetom vynálezu je tiež nové špecifické použitie probiotického prípravku vo veterinárnej a humánnej medicíne.

Doterajší stav techniky

Pozitívny vplyv probiotík je známy. Čisté kultúry živých mikroorganizmov sa aplikujú vo forme kapsúl, tabliet, sirupov a podobne. Pri perorálnom podávaní je dôležité, aby probiotické kultúry boli viazané na nosič, ktorý im umožní prežiť prechod medzi žalúdkom a tenkým črevom.

Živé kultúry majú podstatné aplikačné obmedzenia, najmä majú krátku trvanlivosť prípravku (spravidla do 21 dni) a špeciálne podmienky pre uskladňovanie (najmä nízke teploty). Lyofilizáciou sa často (v závislosti od podmienok v procese lyofilizácie) významne znižuje podiel prítomných živých baktérií, čo v konečnom dôsledku znamená, že výsledný prípravok nemusí mať požadované probiotické vlastnosti.

Zverejnený patentový spis CZ 303986 B6 opisuje prípravok, ktorý obsahuje jednodruhovú alebo viacdruhovú probiotickú kultúru a nosič, kde probiotické kultúra je v prípravku vo forme biofilmu priľnutého k nosiču. Základné vlastnosti biofilmov vo vzťahu k pevným povrchom sú známe a opísané (Costerton et al., 1985). Ako kultivačné médium je použité sterilné mlieko alebo srvátka alebo syntetické látky s obsahom kazeínu alebo kazeínhydrolyzátu alebo peptónu. Ako nosič je použitá mikrokryštalická celulóza alebo škrob. Na takomto nosiči sa nedosahuje účinná tvorba biofilmu z viacerých druhov laktobacilov, napríklad kmeňa Lactobacillus reuteri.

Zverejnenie US 2015/0202136 A1 ozrejmuje dermatologicky akceptovateľný nosič probiotík pri aplikácií širokej skupiny probiotík na koži. Toto zverejnenie sa nezaoberá perorálnou aplikáciou. Zverejnenie US 2015/0150295 A1 opisuje spôsob výroby porézneho prášku, ktorý slúži ako nosič probiotických mikroorganizmov. Riadený proces premeny tekutého koncentrátu na penu a jej sušenie umožňuje kontrolovať viaceré výsledné vlastnosti produktu. Spis US 2014/0010918 A1 zverejňuje spôsob ako vytvoriť mikrokapsulový nosič s rôznymi typmi matrice na nesenie probiotických kultúr.

Je žiadaný a nie je známy široko použiteľný, čisto prírodný nosič probiotických kultúr, ktorý bude ľahko dostupný, zabezpečí symbiózu s probiotickými kultúrami, umožní ich postupné a dlhodobé uvoľňovanie.

Podstata vynálezu

Uvedené nedostatky v podstatnej miere odstraňuje probiotický prípravok, ktorý zahrňuje živé mikroorganizmy tvoriace biofilm na pevnom nosiči aspoň čiastočne nasýtenom substrátom podľa tohto vynálezu, ktorého podstata spočíva v tom, že nosič je alginit, výhodne alginit vo forme zŕn s veľkosťou do 3 mm, obzvlášť výhodne do 1,3 mm. Alginit tvorí základný skelet, pevnú poréznu matricu pre SSF (solid state) fermentáciu s cieľom vytvoriť bakteriálny biofilm.

Alginit je organicko-minerálna hornina ílovitého charakteru, vznikajúca v kráteri sopiek usadzovaním odumretých častí rias a anorganického materiálu s vysokým obsahom humusu, minerálnych živín a stopových prvkov. Obsahuje tiež humínové kyseliny. Alginit je úplne ekologickou surovinou s unikátnou štruktúrou a výborným zložením na výhradne prírodnej báze, neobsahuje žiadne prírode cudzie chemikálie či umelé prísady a má prirodzene nízky obsah solí a ťažkých kovov. Doteraz bol alginit známy ako hnojivo alebo substrát pre poľnohospodárstvo, ako prírodný fertilizér pôdy. Účinky alginitu v tejto oblasti sú preskúmané, alginit zvyšuje úrodnosť a pomáha rastlinám bez väčšej ujmy preklenúť suchá počas vegetačného obdobia. Použitie alginitu v jeho základnej prírodnej forme na farmaceutické, lekárske alebo potravinárske účely nie je známe.

Predložený vynález ozrejmuje, že alginit sa môže výhodne využiť ako nosič probiotických kultúr, výhodne pre laktobacilové kmene. Alginitové zrná sú pokryté biofílmom z príslušných probiotických mikroorganizmov, kde väčšina bakteriálnych buniek v biofilme je v dorminantnom, kľudovom stave s minimálnym metabolizmom. Predložený vynález poskytuje zásadnú výhodu vtom, že mikroorganizmy, napr. laktobacily sú stabilizované vo forme biofilmu, kde sú prítomné v dorminantnom stave. V tomto stave vykazujú zvýšenú odolnosť voči rôznym typom stresu a nevyžadujú si špeciálne podmienky pre skladovanie. Vo výslednom produkte odolávajú prítomné mikroorganizmy prostrediu, pre ktoré nie sú určené (pažerák, žalúdok a pod.), pričom sa aktivizujú v cielenom prostredí (dolný gastrointestinálny trakt), kde absorbujú potrebné živiny a začnú sa množiť. Následne dochádza k rozpadu biofilmu a rekolonizácii gastrointestinálneho traktu, čím nastáva aj uvoľnenie látok obsiahnutých v samotnom alginite. Porovnania výsledkov z testov preukazujú väčší podiel preživších mikroorganizmov (v testoch konkrétne laktobacilov) ako v prípade aplikácie živých kultúr, čo je zásadná výhoda.

Alginit má vďaka obsahu riasovej organickej hmoty a vďaka prítomnosti ílového minerálu smektitu, ktorý pohlcuje vodu, vysokú prirodzenú vlhkosť a vysokú pórovitosť. Tieto vlastnosti prispievajú k dobrými podmienkam pre fermentáciu s tvorbou bakteriálnych biofilmov. Povrch alginitových zŕn vytvára výborné podmienky na tvorbu stabilného biofilmu.

Keďže alginit sa ťaží zo zeme, je vhodné, aby zrná alginitu potrebnej frakcie boli najskôr sterilizované. V praxi sa vyťažený alginit čistí od kamienkov, melie a sterilizuje.

Alginitové zrná sú následne nasýtené kultivačným médiom a mikroorganizmy sú potom kultivované na alginitových zrnách.

Na vytvorenie účinného biofilmu je vhodné, ak je alginit nasýtený vhodným substrátom, napríklad laktózou alebo glukózou alebo ich kombináciou. Ako vhodné pre spojenie s alginitom sa ukázali laktobacilové kmene, napríklad Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri. Lactobacillus reuteri má pozitívne účinky na živé organizmy, tento kmeň bol identifikovaný aj priamo v tráviacom trakte zvierat, čo do značnej miery predurčuje jeho potenciálne využitie. Zistené boli aj pozitívne účinky na ľudí, zvlášť na novorodencov a deti. Pozitívne ovplyvňuje rôzne typy ochorení zažívacieho traktu a zdravie ústnej dutiny.

Spojenie alginitu s laktobacilovými kmeňmi vedie k stabilizácií prospešných mikroorganizmov kultivovaných na alginitových zrnách. Väzba na alginitový nosič, ktorý je nasýtený vhodným kultivačným médiom, stabilizuje mikroorganizmy pri skladovaní aj po ich aplikácii. Probiotické mikroorganizmy tvoriace biofilm na alginitových zrnách sú dlhodobo živé a schopné rozmnožovať sa v mikroenviromentoch zvierat a ľudí. Probiotické mikroorganizmy sa uvoľňujú z biofilmu postupne a dlhodobo.

Prechod bakteriálnych buniek v biofilme do nekultivovanej (kľudovej - nemnožiacej sa) formy má pozitívny vplyv na ich prežitie počas prechodu agresívnym prostredím žalúdka a tenkého čreva. Takto efektívne prekonávajú Gl bariéru, potom sa obnovuje ich schopnosť množiť sa a tiež sa aktivujú iné biologické funkcie prispievajúce k stabilizácii a harmonizácii rezidentnej mikroflóry čreva, ktorá vytvára kľúčovú bariéru voči patogénnym baktériám. Tieto vlastnosti probiotického biofilmu na alganitovom nosiči sa potvrdili experimentálne.

Experiment bol zameraný na testovanie kolonizačnej kapacity kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného v biofilme na alginite v tráviacom trakte modelových zvierat v definovaných podmienkach - BALB/c germ-free myši. Bola porovnávaná prvá skupina zvierat LR2/6A, ktorej bol aplikovaný kmeň Lactobacillus reuteri L2/6 s druhou skupinou zvierat - LR 2/6, ktorej bol podávaný kmeň bez alginitu. Lactobacillus reuteri L2/6 bol podávaný podľa tohto vynálezu vo forme biofilmu na sterilných alginitových zrnách (0,05 % suchej hmoty 72 hod. fermentovaných zŕn alginitu do sterilného krmiva). Druhej skupine zvierat - LR 2/6 bol podávaný kmeň bez alginitu a to ako pomnožená nočná kultúra planktonických buniek kmeňa aplikovaná do krmiva.

Pokus pozostával z troch po sebe nasledujúcich periód: obdobie adaptácie (4 dni), obdobie aplikácie aditív v krmive (21 dní) a obdobie po ukončení aplikácie aditív (5 dní). Vzorky trusu na mikrobiologické vyšetrenie počas obdobia aplikácie aditív boli odoberané na 5.,10., 15. a 20. deň od začiatku aplikácie individuálne od každého zvieraťa. Posledný odber trusu počas obdobia po ukončení aplikácie aditív bol uskutočnený na 25. deň. Počas celého obdobia aplikácie aditív v krmive boli počty kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 v skupine LR2/6A signifikantne vyššie (p<0,001) v porovnaní so skupinou LR 2/6. Počty kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 v skupine LR2/6A boli vyrovnané až do ukončenie obdobia aplikácie (8,11 ±0,48 8,25±0,21 log/g trusu). V skupine LR 2/6 mali počty kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 mierne vzrastajúcu tendenciu od 6,38±0,43 do 6,75±0.21 log/g trusu avšak tieto hodnoty v porovnaní so skupinou LR 2/6A boli približne o 1,2 -1,7 log nižšie. Počas obdobia po ukončení aplikácie aditív došlo k poklesu počtov kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 v skupine LR2/6A na hodnotu log 4,42±0,11/g. V skupine myší, ktorým bol aplikovaný L2/6 v čerstvej forme sme po 5 dňoch od ukončenia podávania zaznamenali prítomnosť testovaného kmeňa v truse približne log 1±0,22/g.

Probiotický prípravok vo forme 0,05 % 72 hodín fermentovanej zmesi s počtom približne 3x10⁴ KTZ/g bol namiešaný do krmiva myší. Myš o priemernej váhe 25 g skonzumovala približne 9 g suchého krmiva za deň, tým príjme 0,0045 g fermentovaných zŕn alginitu a teda 130-140 KTZ laktobacila. Detekcia aplikovaného kmeňa v truse do 5 dní po poslednom kŕmení myši s Lactobacillus reuteri L2/6 svedči o kolonizácii čreva zvierat týmto kmeňom a o jeho schopnosti množiť sa v tomto prostredí.

Vplyv probiotického prípravku podľa tohto vynálezu na obnovu mikrobiálneho osídlenia čreva konvenčných myší po liečbe antibiotikami (ATB) bol testovaný v nasledovnom experimente. Probiotický kmeň Lactobacillus reuteri L2/6 bol stabilizovaný na alginite v zmysle skôr uvedeného opisu. Črevná dysbióza u myší bola spôsobená dennou aplikáciou ATB amikacín v množstve 5 mg/myš počas 7 dní. Amikacín zapríčiňuje reverzibilné zníženie hladiny laktobacilov v hrubom čreve. U experimentálnej skupiny po ukončení ATB terapie na 8. deň experimentu sa začala aplikácia diéty (0,05 % suchej hmoty 72 hod. fermentovaných zŕn alginitu do sterilného krmiva) a trvala 15 dní a ďalších 5 dní bolo skrmované krmivo bez aditív.

V prvej kontrolnej skupine K1 po ukončení ATB terapie na 8. deň experimentu sa začala aplikácia diéty (0,05 % suchej hmoty nefermentovaných zŕn alginitu do sterilného krmiva) a trvala 20 dní. V druhej kontrolnej skupine K2 zvieratá prijímali namiesto antibiotika fyziologický roztok. Zvieratá, ktorým bol aplikovaný po ukončení ATB liečby kmeň Lactobacillus reuteri L2/6 vo forme biofilmu na alginitových zrnách, mali vyššie počty celkových laktobacilov (p<0,01) v truse v porovnaní s kontrolnou skupinou zvierat (K1), ktorým bol aplikovaný samotný alginit. Na 27. deň experimentu (5 dní od poslednej aplikácie aditív) počty celkových laktobacilov v experimentálnej skupine korešpondovali s počtami celkových laktobacilov zistenými u zvierat bez aplikácie antibiotika a aditív (K2) zatiaľ čo počty celkových laktobacilov v skupine s aplikáciou antibiotika a nefermentovaných zŕn alginitu (K1) boli o 2,2 log nižšie.

Ďalší expreriment mal za úlohu zistiť účinky kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite na mikrobiocenózu TT konvenčných myší. Experiment bol zameraný na sledovanie vplyvu kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite na počty vybranej mikroflóry jejuna, ilea, céka a trusu a koncentráciu organických kyselín u konvenčných myší (BALB/c). Zvieratá boli rozdelené do troch skupín: skupina 2/6A - kmeň

Lactobacillus reuteri L2/6 ríf stabilizovaný na alginite (0,05 % suchej hmoty 72 hod. fermentovaných zŕn alginitu do sterilného krmiva), skupina A - alginit bez laktobacilového kmeňa, skupina K - kontrola bez aditív. Aditíva boli aplikované kontinuálne v krmive počas 14 dní trvania experimentu.

Mikrobiologická analýza črevného traktu myší po 14 dňovej aplikácii aditív preukázala vplyv kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 na počty vybraných črevných baktérií v tráviacom trakte myší. V jejune, ileu a truse bolo zaznamenané v skupine 2/6A signifikantné zvýšenie zástupcov rodu Lactobacillus (p<0,001) a signifikantné zníženie zástupcov rodu Enterobacteriaceae (p<0,001; p<0,01) oproti skupine A (aplikácia alginitu bez kmeňa) a skupine K (bez aditív). Podobne v céku sa zistilo v skupine 2/6A signifikantné zvýšenie zástupcov rodu Lactobacillus (p<0,05; p<0,01) a signifikantné zníženie zástupcov rodu Enterobacteriaceae (p<0,001) oproti skupine A a skupine K. Navyše boli ovplyvnené aj ostatné sledované skupiny baktérií. V skupine 2/6A sa detegovalo signifikantné zvýšenie zástupcov rodu Bifidobacterium (p<0,001) a signifikantné zníženie zástupcov rodu Clostridium a Bacteroides (p<0,001) oproti skupine A a skupine K.

Počty baktérií patriace k druhu Lactobacillus reuteri boli tiež pozitívne ovplyvnené (p<0,001) v skupine, ktorej bol aplikovaný Lactobacillus reuteri L2/6 ríf oproti ostatným skupinám. Celkové baktérie boli výraznejšie ovplyvnené v skupine 2/6A v predných úsekoch čreva -v jejune a ileu (p<0,01; p<0,01). V prítomnosti komplexnej autochtónnej mikroflóry počty Lactobacillus reuteri 2/6 ríf v skupine 2/6A stanovené kultivačnou metódou po 14 dňovej aplikácii kmeňa boli nasledovné: jejunum - 6,55±0,23 log/g; ileum - 7,02±0,25 log/g; cekum 7,20±0,26 log/g; trus - 7,26±0,38 log/g. Najvýznamnejšia produkcia organických kyselín (p<0,05) v truse pokusnej skupiny 2/6A v porovnaní s ostatnými skupinami bola zistená na

14. deň aplikácie aditív. a to u kyseliny acetoctovej a octovej. Podobný trend vyššej produkcie kyselín u skupiny 2/6A bol pozorovaný aj u kyseliny propionovej, maslovej a mliečnej, avšak ich hodnoty nepresahovali úroveň 2 mmol/l. V kaudálnom úseku tráviaceho traktu myší (céku) bola na 14. deň aplikácie aditív u pokusnej skupiny 2/6A zaznamenaná vyššia koncentrácia (p<0,01) kyseliny acetoctovej, mliečnej a octovej.

Protektívny účinok kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite bol testovaný experimentom, pri ktorom infekcia u modelových zvierat (myši) bola vyvolaná kmeňom Salmonella Typhimurium CCM 7205. Experiment bol zameraný na testovanie účinku kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite na inhibíciu Salmonella Typhimurium CCM 7205 a na morfologické, biochemické a imunologické parametre u modelových zvierat (myši). Zvieratá boli rozdelené do troch skupín: skupina LAB - kmeň Lactobacillus reuteri L2/6 ako biofilm stabilizovaný na alginite (0,05 % suchej hmoty 72 hod. fermentovaných zŕn alginitu do sterilného krmiva), skupina PK - pozitívna kontrola (alginit bez laktobacilového kmeňa), skupina NK1 - negatívna kontrola (bez aditív), skupina NK2 negatívna kontrola (alginit bez laktobacilového kmeňa). Aditíva boli aplikované kontinuálne v krmive počas 14 dní trvania experimentu. Na 7. deň aplikácie aditív boli zvieratá skupiny LAB a skupiny PK jednorázovo infikované perorálne 0,1 ml Salmonella Typhimurium CCM 7205_NAl (1 x 10⁸KTZ/ml). 7 dní po infekcii boli odobrané vzorky na analýzy.

Po 72 hodinách od infekcie bolo zaznamenané signifikantné zníženie (p<0,001) počtov Salmonella Typhimurium v LAB skupine oproti PK skupine v truse infikovaných zvierat. Signifikantné redukcia (p<0,05) počtov Salmonella Typhimurium v LAB skupine oproti PK skupine v orgánoch (z 3,0 na 1,3 log KTZ v pečeni a zo 4,0 na 1,8 log KTZ v slezine) bola pozorovaná na 7. deň od infekcie.

Histologická analýza pečeňového parenchýmu myší po 14 dňovej aplikácii aditív preukázala vplyv kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 na zmiernenie postinfekčného poškodenia pečeňového parenchýmu myší. V LAB skupine myší bolo na 7. deň po infekcii Salmonella Typhimurium pozorované významne nižšie (p< 0,05) zastúpenie zápalového infiltrátu, ktoré predstavovalo 1,67 ± 0,09 % pečeňového parenchýmu, v porovnaní so skupinou PK (bez aplikácie probiotického kmeňa) a percentuálnym zastúpením 5,70 ± 1,23% zápalového infiltrátu v parenchýme pečene. Pečeň myší z experimentálnych skupín inokulovaných baktériou Salmonella Typhimurium mala typický obraz zápalovej odpovede prezentovaný infiltráciou zápalových buniek vrodenej a získanej zložky imunity, najmä zvýšeným počtom Kupfferových buniek v intersticiálnom priestore a difúziou týchto buniek z lúmenu vén a artérií. Pozorované prekrvené zápalové ložiská u PK skupiny potvrdzovali porušenie celistvosti parenchýmu. U skupiny LAB sa pozorovala výrazne nižšia intenzita zápalových ložísk, ktoré mali charakter špecifického granulačného ložiska a na rozdiel od skupiny PK nebol zaznamenaný neohraničený difúzny zápal naprieč celým parenchýmom pečene. V priestore zápalových ložísk dochádzalo k nekróze pečeňových buniek, čo sa prejavovalo narušením ich štruktúry a integrity.

V rámci sledovania vybraných parametrov enzymaticko-hepatálneho profilu z krvného séra sa u infekčných skupín myší (PK a LAB) zaznamenala ich zvýšená špecifická aktivita. Pri infekčnej skupine myší so súčasnou aplikáciou alginitu (PK) sa pozorovala významne vyššia aktivita enzýmu AST (p < 0,01) a vyššia, štatisticky nevýznamná aktivita enzýmu ALT (7,77 ± 1,14 pkat/l), v porovnaní so skupinou myší LAB, čo poukazuje na významné poškodenie parenchýmu pečene. Avšak u skupiny s aplikáciou kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 (LAB) aj napriek zvýšenej aktivite ALT enzýmu, pohybujúcej sa na úrovni 6,47 ± 0,48 pkat/l, nedochádzalo k významnejšiemu poškodeniu pečeňového parenchýmu. Priaznivý efekt aplikácie laktobacilov stabilizovaných na alginite pozorujeme aj v pozitívnom ovplyvnení sérových celkových bielkovín. Zatiaľ čo u skupiny PK sa pozoruje hypoproteinémia a hypoalbuminémia v dôsledku zníženej syntézy bielkovín vplyvom významných zápalových a nekrotických zmien na parenchýme pečene, u skupiny LAB sa zaznamenáva v porovnaní s PK skupinou myší významne vyššia koncentrácia celkových bielkovín (p<0,001), ako aj albumínu (p< ,05). Dôležitý je aj pozitívny vplyv na minerálny (Ca, P) metabolizmus, ktorý bol pozorovaný u všetkých skupín s aplikáciou alginitu. Významne vyššia hladina Ca (p<0,05) bola pozorovaná u LAB skupiny v porovnaní so skupinou, ktorej sa podávalo čisté krmivo bez alginitu (NK1). Najvyššia koncentrácia P bola zaznamenaná u skupiny myší s aplikáciou samotného alginitu, kde hladina P bola významne vyššia (p<0,05; p<0,01; p<0,001) oproti skupinám (Ι_ΑΒ, NK1 a PK). Vyššie koncentrácie P boli pozorované aj u LAB skupiny (p<0,05), a to v porovnaní s infekčnou skupinou PK.

Významná produkcia mastných kyselín s krátkym reťazcom v truse skupiny LAB v porovnaní so skupinami NK2 a PK bola pozorovaná už na prvý deň po aplikácii aditív, a to u kyseliny mliečnej (p< 0,001), kyseliny acetoctovej (p<0,01) a kyseliny propiónovej (p<0,05). Na

1. deň po infekcii Salmonella Typhimurium bc^lla zaznamenaná u IlAB skupiny vyššia pr^<^<^i^l^<cia kyseliny propiónovej (p<0,001), a to oproti všetkým ostatným sledovaným skupinám. Najvýznamnejšia produkcia organických kyselín v truse skupiny l_AB v porovnaní so skupinou PK bola zistená na 7. deň po infekcii a zároveň 14. deň aplikácie aditív, a to u kyseliny acetoctovej (p<0,001), kyseliny mliečnej a octovej (p<0,01) a kyseliny propiónovej (p<0,05). V kaudálnom úseku tráviaceho traktu myší (céku) bola na 14. deň aplikácie aditív u pokusnej skupiny LAB zaznamenaná vyššia koncentrácia (p<0,05) kyseliny acetoctovej oproti NK1 a kyseliny propiónovej v porovnaní so skupinami (NK2, p<0,05) a (NK1 p<0,01).

V periférnej krvi bolo zaznamenané signifikantné zvýšenie fagocytárnej aktivity (p<0,001) v skupinách LAB, PK a NK2 oproti skupine NK1 (negatívna kontrola bez aditív) a signifikantné zvýšenie fagocytárnej aktivity (p<0,01) v skupine PK oproti skupine LAB a NK2. Zistená nižšia FA v LAB skupine, v porovnaní s PK skupinou môže súvisieť so zisteným lepším klinickým stavom v tejto skupine. Najvyššia pohlcovacia schopnosť fagocytov oproti všetkým ostatným skupinám bola zaznamenaná v LAB skupine, ale aj samotný alginit v skupine NK2 ju signifikantné zvýšil v porovnaní sNK1. Signifikantné najvyššie (p<0,001) zastúpenie CD4+ lymfocytov v periférnej krvi oproti ostatným skupinám bolo zaznamenané v skupine PK, naopak alginit u zvierat bez infekcie v skupine NK2 percento CD4+ lymfocytov signifikantné znížil (p<0,05) oproti NK1 skupine. Signifikantné najvyšší pomer CD4:CD8, ako aj najvyššie zastúpenie dvojitopozitívnych CD4+CD8+ lymfocytov bolo zaznamenané v LAB skupine (p<0,01) v porovnaní so všetkými ostatnými skupinami, čo svedčí o imunostimulácii. V tejto skupine bolo najvyššie aj zastúpenie DX5+CD8+ subpopulácie NK buniek, naopak subpopulácia DX5+CD8- bola najnižšia. Pamäťové CD4+CD25+ lymfocyty neboli signifikantné ovplyvnené. Laktobacily tiež štatisticky významne (p<0,001) zvýšili zastúpenie B-lymfocytov v periférnej krvi oproti ostatným skupinám. V slezine bol rovnako ako v periférnej krvi pozorovaný signifikantné najvyšší pomer CD4:CD8, najvyššie zastúpenie CD4+CD8+ aj NK buniek v LAB skupine. Na rozdiel od periférnej krvi bolo v slezine zastúpenie CD4+ ako aj CD8+ lymfocytov štatisticky významne nižšie vo všetkých experimentálnych skupinách v porovnaní s NK1 skupinou. V mezenteriálnych lymfatických uzlinách bol rovnako ako v slezine zaznamenaný signifikantné najvyšší pomer CD4:CD8, najvyššie zastúpenie

CD4+CD8+ aj NK buniek v LAB skupine. Najvyššie zastúpenie CD4+ bolo pozorované v skupinách LAB a PK v porovnaní s NK1 a NK2 skupinou.

Imunostimulácia v l_AB skupine na úrovni bunkovej imunitnej odpovede bola potvrdená aj prostredníctvom relatívnej génovej expresie mRNA jednotlivých cytokinov (TGF-β, TNF-a, MCP-1, IL-1 β) použitín qPCR. V skupine LAB sa pozorovala signifikantne zvýšená expresia génu pre TGF-β v porovnaní so skupinou NK1 (p<0,01). Podobná signifikancia bola sledovaná aj v prípade skupiny l_AB v porovnaní so skupinou PK. Signifikatné pôsobenie Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite po infekcii Salmonella Typhimurium na prozápalový cytokín TNF-α produkovaný epitelovými bunkami ilea sa zistil v pokusnej skupine LAB, pričom jeho zvýšená expresia bola na úrovni mRNA štatisticky významná (p<0,001) v porovnaní so skupinou zvierat NK1, NK2, ale aj PK. Podobný výsledok ako v prípade TNF-α bol preukázaný aj pri prozápalovom cytokíne IL-1 β, pri ktorom sa v pokusnej skupine LAB stanovila zvýšená génová expresia (p<0,001) v porovnaní so skupinou zvierat NK1, NK2, a tiež PK. V prípade MCP-1 sa v skupine LAB preukázala jeho zvýšená expresia na úrovni mRNA v porovnaní so skupinami zvierat NK1 a NK2 so štatistickou významnosťou p<0,01.

V inom experimente bol testovaný probiotický prípravok podľa tohto vynálezu s kmeňom Lactobacillus buchneri 5/K pri rekolonizácii kože distálnych častí končatín koní s dermatitídou. Experiment bol zameraný na otestovanie účinnosti kmeňa Lactobacillus buchneri 5/K stabilizovaného na alginite pri liečbe dermatitíd na distálnych častiach končatín u koní. Významné problémy chovateľom spôsobujú dermatitídy na distálnych častiach končatín súhrnne označované ako „podlom“ (pastern dermatitis) Je to syndróm spôsobený rozličnými ochoreniami, kde sa vyskytujú zmiešané infekcie stafylokokové, plesňové, kvasinkové, svrab. V podstate sa dá povedať že sa jedná o multifaktoriálne ochorenie so zmenou mikroekosystému kože.

V pokuse boli použité plemenné žrebce plemena norik muránsky a plemena sliezsky norik. Vek koni bol 3-22 rokov a ustajnenie bez prístupu k pastve. Kone trpeli chronickými podlomami, ojedinele aj akútnymi. K zhoršeniu klinických nálezov dochádzalo najmä na jeseň a na jar. Od postihnutých plemenných žrebcov boli odobraté stery z kožných lézií. Z kožných lézii boli izolované a identifikované nasledujúce kmene: Streptococcus dysgalactiae, Staphylococcus warneri, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium glutamicum, Streptococcus porcinus a Bacillus spp. Kmene preukazovali hemolytickú aktivitu. Výsledky vyšetrení vzoriek na prítomnosť svrabu a Dermatophilus congolensis boli negatívne. Pred začiatkom experimentu v marci bola na končatinách koní pristrihnutá srsť. Kmeň Lactobacillus buchneri 5/K bol vybraný na základe predchádzajúcej in vitro selekcie. Vyznačoval sa inhibičnou aktivitou voči hore uvedeným kmeňom získaných z lézií, produkciou organických kyselín, bakteriocín-like aktivitou, produkciou peroxidu vodíka, bol schopný rásť v rozpätí teplôt 15-48°C a v rozmedzí 3,6-7,2 hodnôt pH a vykazoval rast v prítomnosti sekrétov potných žliaz koní. Na končatiny postihnutých koní bol kmeň Lactobacillus buchneri 5/K (vlhká hmota 72 hod. fermentovaných zŕn alginitu) nanášaný pomocou jednorazových vyšetrovacích rukavíc 1x denne počas 2 týždňov, v tenkej vrstve tak, aby boli pokryté lézie a ich okolie. Ako kontrolná skupina nám slúžili kone z toho istého chovu vtom istom ročnom období, ktoré neboli zaradené do liečby. Kontrolné kone boli v tomto období ustajnené bez prístupu k pastve. Podlomy u nich boli chronické a recidivujúce. K miernemu zlepšeniu klinických príznakov došlo spontánne počas pastevného obdobia od mája do septembra. Po ustajnení sa klinické príznaky opäť zhoršili a pribudli nové lézie.

Klinický nález pred aplikáciou kmeňa Lactobacillus buchneri 5/K: Chronické kožné lézie sa vyskytovali distálne od karpálneho a pätového kĺbu. Výskyt akútnych kožných lézií bol ojedinelý. U dvoch koní boli postihnuté iba panvové končatiny. Lézie boli mokvavé alebo suché. Druhy lézií: noduly (hyperkeratózne, hyperplastické až granulomatózne až hypergranulomatózne prominujúce útvary), noduly s tendenciou krvácať, suché praskajúce ragády (praskliny na zrohovatenej koži), krvácajúce ragády, mokvavé lézie, suché odlupujúce sa lézie bez exsudácie, suché lézie, ktoré po zoškrabe mokvajú, hyperkeratóza (zhrubnutie stratum corneum často spojené s prítomnosťou abnormálne zvýšeného množstva keratínu), lichenifikácia (výsledok neustáleho škrabania a trenia). Vonkajšia vrstva kože (epidermis) podľahne hypertrofii - zhrubnutie kože a zvýraznenie kožných znakov, čo koži dodáva kožený vzhľad podobný kôre), seborrhoea (nadmerná produkcia mazu mazovými žľazami a jeho akumulácia na povrchu kože). Kone nekrívali, teplota lézií bola rovnaká ako teplota okolia.

Klinický nález po 2 týždňovej aplikácii kmeňa Lactobacillus buchneri 5/K: Po aplikácii došlo vo väčšine prípadov k zníženiu výskytu mokvavých kožných lézií a zmenšeniu veľkosti lézií príp. až ich eliminácii. Najlepšie výsledky boli dosiahnuté pri výskyte akútnych lézií. Oproti kontrolnej skupine došlo k rýchlejšiemu ústupu príznakov až ich eliminácii a počas najbližších 2 mesiacov nedošlo k recidíve napriek tomu, že pokusné zvieratá boli oproti kontrolným ustajnené celoročne bez prístupu k pastve.

Realizáciou in vivo experimentov sa zistili viaceré pozitívne vlastnosti a účinky probiotického prípravku podľa tohto vynálezu.

Pasážovanie kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite v hostiteľskom organizme viedlo k indukcii jeho množenia, čo sa prejavilo vyššími počtami kmeňa v truse zvierat a dlhšou prežívateľnosťou kmeňa v tráviacom trakte. Aplikácia kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite mala pozitívny vplyv na obnovu osídlenia čreva konvenčných myší laktobacilmi po liečbe ATB.

Multicolor FISH analýza črevného traktu konvenčných myší po 14 dňovej aplikácii kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 stabilizovaného na alginite preukázala jeho schopnosť kolonizovať jejunum, ileum a cékum myší v prítomnosti kompetitívnej mikroflóry a modulovať sledovanú črevnú mikroflóru so sprievodným zvýšením produkcie organických kyselín. Tento efekt sa prejavil signifikantným zvýšením zástupcov rodu Lactobacillus a Bifidobacterium a signifikantným znížením zástupcov rodu Clostridium, Bacteroides a Enterobacteriaceae.

Zároveň aplikovaný kmeň stimuloval populáciu cekálnych laktobacilov patriacich k druhu Lactobacillus Reuteri. Lactobacillus reuteri L2/6 redukoval inváziu salmonel do pečene a sleziny, čo sa prejavilo aj miernejším negatívnym dopadom na pečeňový parenchým myší.

Aplikácia kmeňa Lactobacillus reuteri L2/6 výrazne stimulovala bunkovú imunitnú odpoveď, čo sa prejavilo signifikantným zvýšením pomeru CD4:CD8 lymfocytov, vyšším zastúpením mladých prípadne pamäťových T-lymfocytov, NK buniek a B lymfocytov a to ako v periférnej krvi, tak aj v slezine a mezenteriálnych lymfatických uzlinách. Aj samotný alginit pozitívne ovplyvnil pohlcovaciu schopnosť fagocytov. Imunostimulačný účinok bol potvrdený aj signifikantne zvýšenou expresiou génov pre prozápalové cytokíny TNF-α, IL-1 b, MCP-1.

Alginit pozitívne ovplyvnil vybrané parametre minerálneho metabolizmu, predovšetkým Ca a P.

Aplikácia kmeňa Lactobacillus buchneri 5/K stabilizovaného na alginite mala pozitívny vplyv na elimináciu výskytu akútnych kožných lézií distálnych častiach končatín u koní.

Nedostatky uvedené v stave techniky v podstatnej miere odstraňuje aj spôsob prípravy probiotického prípravku, pri ktorom sa na pevný nosič nanáša inokulovaný kultivačný roztok obsahujúci živé probiotické mikroorganizmy, následne prebieha fermentácia pri teplote do 40°C a nosič sa aspoň čiastočne pokrýva biofilmom z probiotických mikroorganizmov podľa tohto vynálezu, ktorého podstata spočíva v tom, že alginit sa rozdrobí na zrná s frakciou do 3 mm, alginitové zrná sa sterilizujú a nasýtia sa substrátom, ktorý obsahuje laktózu a/alebo glukózu. Následne sa na alginitové zrná nanesie inokulovaný kultivačný roztok a počas fermentácie sa vytvára biofilm z probiotických mikroorganizmov.

Na sterilizáciu alginitových zŕn sa môže výhodne použiť gama žiarenie, s ktorým sa rýchlejšie dosahuje účinná sterilizácia ako pri použití bežného autoklávu.

Ako mimoriadne vhodné sa ukázalo nasycovanie sterilných alginitových zŕn opakovaným procesom vytvorenia vákua v skelete zŕn alginitu. Povrch zŕn je pritom prevrstvený roztokom cukru. Po prerušení evakuácie je roztok cukru podtlakom nasiaknutý do evakuovaných pórov alginitu.

Pri vynaliezaní sa overoval vzťah medzi frakciou alginitových zŕn a koncentráciou glukózy alebo laktózy. Použili sa pritom tri frakcie alginitových zŕn 0,2 - 1 mm, 1-13 mm a 1,6 - 2 mm. Glukóza a laktóza mali postupne koncentráciu 10, 25 a 40%. Alginitové zrná sa nasycovali tak, že sa vytvorilo vákuum v skelete zŕn, ktorý bol prevrstvený roztokom glukózy alebo laktózy rôznej koncentrácie. Po prerušení evakuácie bol roztok nasiaknutý do evakuovaných pórov alginitu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Vynález je bližšie vysvetlený pomocou obrázkov 1 a 2.

Na obrázku 1 je graf, ktorý zobrazuje nasýtenie alginitových zŕn substrátom glukózy pri rôznej frakcii alginitu. Vodorovná os zobrazuje 10%, 25% a 40% glukózu. Na zvislej osi je nasýtenie v percentách, pričom hodnota nasýtenia je určená priemerom z troch nameraných hodnôt.

Na obrázku 2 je graf, ktorý zobrazuje nasýtenie alginitových zŕn substrátom laktózy pri rôznej frakcii alginitu. Vodorovná os zobrazuje 10%, 25% a 40% laktózu. Na zvislej osi je nasýtenie v percentách, pričom hodnota nasýtenia je určená priemerom z troch nameraných hodnôt.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Alginit sa melie na zrná s frakciou na úrovni 1-1,3 mm. Pomleté a preosiate zrná sú sterilizované gama žiarením. Následne sú v tomto príklade nasýtené 40% laktózou. Pri tejto koncentrácií sa na alginitové zrná naviazalo cca 7% laktózy.

Lyofilizovaný kmeň Lactobacillus reuteri L2/6 (10¹⁰ KTZ/g) sa resuspendoval v sterilnom kultivačnom médiu (peptón, kvasničný autolyzát, kazeínový hydrolyzát, humínová kyselina) na hodnotu absorbancie 0,9 - 1 (OD₆2o), čo zodpovedá približne 1 x 10⁹ KTZ/ml.

Pripravené alginitové zrná v množstve 5g s naviazanou laktózou sa umiestnili do sterilnej kultivačnej nádoby o objeme 50 ml a zaliali sa inokulovaným kultivačným roztokom (10 ml). Kultivačná nádoba sa uzavrela a jej obsah sa dôkladne premiešal. Kultivačná nádoba sa vložila do mixéru v termostate a pri nízkych otáčkach a pri teplote 37°C sa spustila fermentácia na pevnom substráte. Po 72 hodinách sa fermentovaná masa sušila pri 45°C po dobu 2 hodín alebo pokým obsah vody klesne pod 7%.

Získaný probiotický prípravok bol s pozitívnym výsledkom použitý na rekolonizáciu biocenózy gastrointestinálneho traktu zvierat a tiež na rekolonizáciu biocenózy kože. Pri vnútornej aplikácií sa alginitové zrná s biofilmom použili ako ako aditívum do kŕmnych zmesí pre zvieratá. Predpokladá sa, že rovnaké pozitívne účinky bude mať aj humánne využitie. Pri dermatologickej aplikácií sa alginitové zrná s biofilmom rozmiešali vo vode na formu emulzie, ktorá sa aplikuje priamo na postihnutú kožu.

Príklad 2

Alginitové zrná s biofilmom vytvoreným podľa predchádzajúceho príkladu tvoria základ pre výrobu kapsúl a tabliet.

n

V tomto príklade sa vykonala solid substráte fermentácia Lactobacillus reuteri L2/6 na alginitových zrnách, pričom sa testovali tri rôzne frakcie alginitových zŕn a tri rôzne koncentrované substráty. Pomletý alginit bol separovaný podľa veľkostí zŕn na frakcie:

0,2 -1,0 mm

1,0-1,3 mm

1,6-2,0 mm

Substráty tvorené glukózou alebo laktózou mali koncentrácie 10 - 25 - 40%. Testovacie vzorky s 1g alginitu sú umiestnené v nádobách nasledovne:

Príklad 3

10% laktóza alginit 0,2-1 mm	25% laktóza alginit 0,2-1 mm	40% laktóza alginit 0,2-1 mm	10% glukóza alginit 0,2-1 mm	25% glukóza alginit 0,2-1 mm	40% glukóza alginit 0,2-1 mm
10% laktóza alginit 1-1,3 mm	25% laktóza alginit 1-1,3 mm	40% laktóza alginit 1-1,3 mm	10% glukóza alginit 1-1,3 mm	25% glukóza alginit 1-1,3 mm	40% glukóza alginit 1-1,3 mm
10% laktóza alginit 1,6-2 mm	25% laktóza alginit 1,6-2 mm	40% laktóza alginit 1,6-2 mm	10% glukóza alginit 1,6-2 mm	25% glukóza alginit 1,6-2 mm	40% glukóza alginit 1,6-2 mm

Nádoby sa vložili do lyofilizátora a spustilo sa vákuovanie, aby sa v zrnách alginitu vytváral podtlak, vákuum. Na alginitových zrnách sa pritom tvoria bublinky vzduchu. Po dosiahnutí nastaveného podtlaku sa lyofilizátor vypol a vzorky sa ponechali stáť 30 minút. Alginit sa nasycoval roztokom cukru tak, že sa komora lyofilizátora zavdušnila, vyrovnal sa tlak s okolitou atmosférou, do pórov alginitových zŕn je vtláčaný roztok cukru. Vzorky sú ponechané v tomto stave 30 minút a následne sa vákuovanie a nasycovanie zopakuje.

Nasýtený alginit je premytý sterilnou vodou pri centrifugácií po dobu 30 minút, v tomto príklade pri otáčkach 4500/min. Sediment je zamrazený a lyofilizovaný po dobu 24 hod. Sušenie infračerveným žiarením prebiehalo pri teplote 105°C. Následne je vypočítaný hmotnostný rozdiel oproti pôvodnému nenasýtenému alginitu. Výsledky sú zobrazené na obrázku 1 a 2.

Z analýzy vyplýva, že pri 40% koncentrácii bolo vo frakcii 1-1,3 mm naviazané 7% laktózy a vo frakcii 1,6-2 mm bolo naviazané 5% laktózy. Pri 40% koncentrácii bolo vo frakcii 0,2-1 mm naviazané 1% laktózy. Pri 40% koncentrácii bolo vo frakcii 1-1,3 mm naviazané 3% glukózy a vo frakcii 1,6-2 mm bolo naviazané 5% glukózy. Pri 40% koncentrácii bolo vo frakcii 0,2-1 mm naviazané 2% glukózy. Z výsledkov teda vyplýva, že pri vysokej koncentrácii cukrov je významne lepšia väzba testovaných cukrov na alginit. Malé frakcie nie sú vhodné pre nasycovanie, pretože sa cukor neinkorporuje dostatočne do skeletu alginitu. Ako výhodné sa ukázalo využitie frakcie 1-1,3 mm nasýtenej 40% laktózou.

Príklad 4

Probiotický prípravok stabilizovaný na alginite je v tomto príklade použitý na rekolonizáciu biocenózy kože. Probiotický prípravok sa nanáša na postihnutú kožu končatín zvierat, napríklad koní. Úspešne je odskúšané aj preventívne použitie na zdravú kožu.

Príklad 5

Probiotický prípravok podľa tohto vynálezu je v tomto príklade použitý na rekolonizáciu biocenózy gastrointestnálneho traktu. Prípravok je aplikovaný do kŕmnych zmesí alebo ho zvieratá priamo skrmujú.

Príklad 6

V tomto príklade bol v zmysle záverov z analýzy podľa príkladu 3 použitý alginit s frakciou 1-1,3 mm nasýtený 40% laktózou. Po 24 hodinovej solid substráte kultivácii bolo pozorované signifikantné (p<0,001) zvýšenie počtov baktérií z 5,6 x 10⁸ na 23,2 x 10® KTZ/g. Tieto výsledky poukazujú na schopnosť kmeňa množiť sa v podmienkach solid substráte kultivácie. Rast baktérií bol sprevádzaný znížením pH zo 5, 70 na 4,55.

Ďalšia kultivácia v prostredí prakticky s konštantným obsahom vlhkosti fermentačnej masy viedla k útlmu metabolických procesov a redukcii aktívnej tvorby kyselín. pH sa znížilo na 4,1 po 48 hodinovej kultivácii a zostalo bez zmien pri 72 hodinovej kultivácii. Bola pozorovaná tendencia redukcie počtu buniek desorbovaných z povrchu pevného substrátu z 27,1±13,9 x 10⁸ /g pri 24 hodinovej kultivácii na 17,9±6,8 x 10® /g pri 72 hodinovej kultivácii. Snímky SEM mikroskopie (scanning electron microscope, rastrovací elektrónový mikroskop) 24 hodinovej kultivácie preukázali aktívne sa deliace bunky laktobacilov na povrchu zŕn alginitu. Po 48 hodinovej kultivácii bola pozorovaná tvorba biofilmu - baktérie ponorené do intercelulárnej matrice. Kompletný biofilm bol vytvorený po 72 hodinovej kultivácii.

V procese zrenia biofilmu sa zvyšujú intercelulárne interakcie, ktoré sú príčinou zaznamenaného poklesu počtu baktérií desorbovaných z povrchu substrátu. Počnúc 48 hodinovou kultiváciou, bol zaznamenaný pokles podielu kolónie tvoriacich zárodkov medzi desorbovanými bunkami. Po 48 hod. bolo 80% buniek (18,4±6,0 x10⁸ KTZ/g) a po 72 hod. iba 9,8% buniek (1,7514,5 x10⁸ KTZ/g) schopných tvoriť KTZ. Mikrobiálne bunky tvoriace zrelý biofilm strácajú svoju schopnosť reprodukovať sa na umelých živných médiách. Nekultivovateľné formy (živé ale nemnožiace sa, tzv. dorminantné) charakterizované minimálnym až nulovým metabolizmom sú odolnejšie voči nepriaznivým vonkajším vplyvom, čo je dôležité hľadisko pre vývoj technológie výroby a pri aplikácii probiotík.

Za účelom študovania vplyvu dehydratácie na životaschopnosť laktobacilov v biofilme, boli vzorky hmoty (0 - 24 - 48 a 72 hod. solid substráte kultivácia) podrobené sušeniu pri 45 °C po dobu 2 hod., reps. až kým obsah vody presahoval 7 %. Sušenie vzoriek viedlo k zníženiu počtov laktobacilov schopných tvoriť kolónie z 23,2± 3,5 x 10® na 6,5±1,7 x 105 KTZ/g v 24 hod. hmote a v 48 a 72 hod. vzorkách na približne 10⁴ KTZ/g. Avšak na základe údajov cytometrie viac ako polovica buniek desorbovaných zo vzoriek vysušenej hmoty bola živá. Tiež bolo zistené, že v prípade 72 hod. vzoriek, keď už bol vytvorený úplný biofilm, viac ako 75 % živých ale nekultivovateľných laktobacilov malo kokobacilus-like formu. Tento počet bol signifikantne vyšší ako podiel kokobacilus-like buniek v kontrole (p<0,05) a v prípade 24 hod. biofilmu (p<0,01).

Kmeň Lactobacillus reuteri L2/6 vykazoval schopnosť množiť sa a tvoriť biofilm na alginitových zrnách v podmienkach solid substráte fermentácie. Pri 72 hod. kultivácii bol zaznamenaný pokles podielu kultivovateľných kolónií tvoriacich zárodkov medzi desorbovanými bunkami z biofilmu. Väčšina bakteriálnych buniek v biofilme bola v dorminantnom (kľudovom) stave s minimálnym metabolizmom. Solid substráte kultivácia laktobacilov s následným sušením hmoty viedla k tvorbe signifikantne vyššieho počtu nekultivovateľných, ale živých buniek, ktoré mali vzhľad kokobacilov so všetkými rysmi pokojových foriem: rezistencia na stres, strata schopnosti rásť na živných médiách.

Priemyselná využiteľnosť

Priemyselná využiteľnosť je zrejmá. Podľa tohto vynálezu je možné opakovane a priemyselne vyrábať probiotický prípravok. Probiotický prípravok je stabilizovaný na alginite pomocou tvorby biofilmu na alginitových zrnách, čo sa opakovane preukázalo ako efektívna aplikačná forma prospešných mikroorganizmov určených na harmonizáciu (rekolonizáciu) mikroenviromentov zvierat a ľudí.

Zoznam skratiek

SEM - scanning electron microscope

SSF - solid state fermentation

ATB - antibiotikum

10% G - 10% glukóza

25% G - 25% glukóza

40% G - 40% glukóza

10% L - 10% laktóza

25% L - 25% laktóza

40% L - 40% laktóza

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Probiotický prípravok, ktorý zahrňuje živé mikroorganizmy tvoriace biofilm na pevnom nosiči, ktorý je aspoň čiastočne nasýtený živným substrátom, vyznačujúci sa tým, že nosičje alginit.
2. Probiotický prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že alginit je vo forme zŕn s veľkosťou do 3 mm,
3. Probiotický prípravok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že zrná alginitu majú veľkosť 1 až 1,3 mm.
4. Probiotický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1až3, vyznačujúci sa tým, že mikroorganizmy sú z rodu Lactobacillus.

5. Probiotický prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci s a tým, že mikroorganizmy sú Lactobacillus reuteri. 6. Probiotický prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci s a tým, že mikroorganizmy sú Lactobacillus plantarum. 7. Probiotický prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci s a tým , že

mikroorganizmy sú Lactobacillus buchneri.
8. Probiotický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1až7, vyznačujúci sa tým, že alginitové zrná sú aspoň čiastočne nasýtené laktózou a/alebo glukózou.
9. Spôsob prípravy probiotického prípravku, pri ktorom sa na pevný nosič nanáša inokulovaný kultivačný roztok obsahujúci živé probiotické mikroorganizmy, následne prebieha fermentácia pri teplote do 40°C, kedy sa nosič aspoň čiastočne pokrýva biofilmom z probiotických mikroorganizmov, vyznačujúci sa tým, že nosič sa vytvorí z alginitu, ktorý sa rozdrobí na zrná, alginitové zrná sa sterilizujú a nasýtia sa substrátom, ktorý obsahuje laktózu a/alebo glukózu a následne sa na alginitové zrná nanesie inokulovaný kultivačný roztok a počas fermentácie sa vytvára biofilm z probiotických mikroorganizmov.
10. Spôsob prípravy probiotického prípravku podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že alginitové zrná sa rozdrobia na frakciu do 3 mm.
11. Spôsob prípravy probiotického prípravku podľa nároku 9 alebo 10, vyznačujúci sa t ý m , že alginitové zrná sa sterilizujú gama žiarením.
12. Spôsob prípravy probiotického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 11, vyznačujúci sa tým, že alginitové zrná sa nasycujú substrátom tak, že sa ponoria do roztoku substrátu, následne sa vákuujú a potom sa vystavia tlaku okolitej atmosféry, pričom substrát vniká do alginitových zŕn.
13. Spôsob prípravy probiotického prípravku podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že kroky vákuovania a pôsobenia tlaku okolitej atmosféry sa aspoň raz opakujú.
14. Spôsob prípravy probiotického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 13, vyznačujúci sa tým, že alginitové zrná sa nasycujú 10 až 40% laktózou alebo glukózou.
15. Spôsob prípravy probiotického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 14 vyznačujúci sa tým, že fermentácia prebieha aspoň 24 hodín, výhodne 72 hodín.
16. Spôsob prípravy probiotického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 až 15 vyznačujúci sa tým, že fermentovaný produkt sa suší, výhodne pri teplote do 45°C, pokým obsah vody klesne pod 7%.
17. Použitie probiotického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na rekolonizáciu biocenózy gastrointestinálneho traktu u zvierat alebo ľudí.
18. Použitie probiotického prípravku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na rekolonizáciu biocenózy kože u zvierat alebo ľudí.