CZ303986B6

CZ303986B6 - Prípravek obsahující probiotickou kulturu, zpusob jeho výroby a pouzití

Info

Publication number: CZ303986B6
Application number: CZ20110631A
Authority: CZ
Inventors: Rysávka@Petr
Original assignee: Rysávka@Petr
Priority date: 2011-10-07
Filing date: 2011-10-07
Publication date: 2013-07-31
Also published as: CZ2011631A3

Abstract

Prípravek obsahující jednodruhovou nebo vícedruhovou probiotickou kulturu a nosic, pricemz probiotická kultura je alespon cástecne ve forme biofilmu prilnutého k nosici. Zpusob výroby tohoto prípravku a jeho pouzití v potravinárském prumyslu, humánní i veterinární farmacii a v kosmetickém prumyslu, a výrobek, který prípravek obsahuje.

Description

Vynález se týká přípravku obsahujícího jednodruhovou nebo vícedruhovou probiotickou kulturu a nosič, přičemž probiotická kultura je alespoň částečně ve formě biofilmu přilnutého k nosiči. Dále se vynález týká způsobu výroby tohoto přípravku a jeho použití pro humánní i veterinární doplňky stravy, zvláštní výživu, potraviny, nápoje, léčiva, zdravotnické prostředky, kosmetické a ío hygienické produkty, veterinární krmivá a doplňky s obsahem probiotických kultur.

Dosavadní stav techniky

Základní schopnost mikroorganismů tvořit na pevném povrchu přisedlá společenstva byla popsána u mořských mikroorganismů již počátkem dvacátého století (Zobe let al., 1935). Zdá se, že takový způsob života je pro většinu mikroorganismů bazálním způsobem jejich základní existence a mikroorganismy mohou existovat v přírodním prostředí, na těle živých organismů nebo umělém povrchu ve formě specifických adherovaných populací. Tato sofistikovaná, organizo20 váná a obvykle mnohovrstevná společenstva mikroorganizmů, pevně adorující k biologickým či umělým povrchům a obalená extracelulární polymerní matrix, byla později nazvána biofilmem (Costerton et al., 1985).

Díky spolupráci a komunikaci mezi jednotlivými buňkami se biofilm formuje jako poměrně slo25 žitá struktura s náznaky cirkulačního systému, umožňující výživu a odvod metabolitů v celé vrstvě. V přírodě se běžně setkáváme s biofilmy tvořenými nejčastěji smíšenými bakteriálními populacemi, zatímco biofilm tvořený jedním bakteriálním druhem je poměrně často popsán spíše v klinické praxi. Bakteriální populace je však značně heterogenní, a to i v případě, že jde o jednopruhový biofilm.

Podmínkou vzniku biofilmu je adheze bakteriálních buněk na různé typy povrchů, jako je například živá tkáň, lékařské pomůcky a implantáty zavedené do makroorganizmu, vodní potrubí, vhodně zvolené nosiče při biotechnologických kultivacích a další. V první fázi tvorby biofilmu, adhezi, proto hrají hlavní roli faktory, které adhezi umožňují nebo alespoň usnadňují. Vedle fyzi35 kálně-chemických vlastností adhezního povrchu, včetně přítomnosti adorovaných makromolekul usnadňujících adhezi (nejčastěji proteiny jako je fibrin a fibronektin), je to také přítomnost faktorů adhezivity příslušného mikroorganizmu, zvláště vrstva polymerní extracelulární matrix (Donlan, 2001), fimbrie a receptory na povrchu mikroorganizmů.

Po přilnutí mikroorganizmů k povrchu následuje fáze akumulace a maturace biofilmu. Je stimulována exprese genů podílejících na tvorbě složité struktury biofilmu, zvláště na tvorbě extracelulámí polymerní matrix, a mění se fyziologie bakteriálních buněk. Bakterie vzájemně agregují, množí se a vytvářejí tak tzv. mikrokolonie (Costerton J.W. 1999, Stoodley et al., 2002). Na rozdíl od pojmu „kolonie“ užívaném v mikrobiologii pro skupinu mikrobů vzniklých dělením jedné mateřské buňky, mikrokolonie vzniklé agregací bakterií mohou být tvořeny i více druhy mikroorganizmů.

V této fázi je bakteriemi produkováno poměrně velké množství extracelulární substance, tzv. slizu, různého chemického složení. Ta bývá z větší části složena ze substituovaných i nesubsti50 tuovaných polysacharidů, zvaných též extracelulární polysacharidová substance (EPS). Dále může obsahovat proteiny, nukleové kyseliny nebo fosfolipidy. EPS je společně s bakteriálními buňkami v mikrokoloniích základní stavební složkou biofilmu a výrazně ovlivňuje jeho vlastnosti. Jejím hromaděním v okolí mikrokolonií se postupně vytváří vyzrálá vrstva biofilmu. Dosažení kritického množství buněk i masy biofilmu vede nakonec k přechodu do další fáze, fáze disperze, při které se uvolňují jednotlivé buňky i jejich shluky obalené v EPS z biofilmu, a tak

- 1 CZ 303986 B6 k jejich dalšímu šíření (Donlan, 2001). Hlavní faktory, které se na této fázi podílí, jsou vedle mechanických účinků prostředí (síla vodního proudu) a dostupnosti živin a kyslíku, koncentrace metabolitů i regulační systémy, především systém quorum sensing (Brading et al., 1995; Davies et al., 1998). Mikroorganizmy rostoucí ve formě biofilmu se od svých planktonických forem odlišují transkripcí odlišných genů a tudíž i svými fyziologickými vlastnostmi a vzniká tak jakýsi „biofilmový fenotyp“ (OToole et al., 2000; Donlan et Costerton 2002). Navíc prostředí v biofilmu není homogenní a bakterie jsou vystaveny odlišným podmínkám, jako jsou různé koncentrace signálních molekul, živin, kyslíku a odpadních metabolitů v jednotlivých vrstvách biofilmu. To vede ke vzniku značné heterogeniky i v rámci bakteriální populace v biofilmu. K heterogenitě přispívá i způsob vzniku mikrokolonií agregací, kdy dochází k agregaci buněk s „biofilmovým“ a „planktonickým“ fenotypem (/Rickard et al., 2003).

Struktura a tvar biofilmu jsou značně proměnlivé a jsou ovlivněny jak mikrobiálními druhy tvořícími biofilm, tak podmínkami zevního prostředí, zvi. vlastnostmi povrchu, dostupnosti živin a kyslíku, pH, osmotickým tlakem nebo hydrodynamikou prostředí (Davey et O'Toole, 2000).

V prostředí s vysokým obsahem živin se vytváří biofilm v silné, relativně homogenní vrstvě, často bez vytvořených kanálků. Naopak v prostředí chudém na živiny je biofilm tvořen buď nízkou mozaikovitou strukturou, nebo vytváří houbovité útvary s dobře vytvořenými kanálky a póry, pomocí kterých mohou být snadno hlubší vrstvy biofilmu zásobeny živinami, kyslíkem a zbavovány metabolitů (Costerton et al., 1995; Costerton et al., 1999, Stoodley et al., 2002).

Růst ve formě biofilmu je pro mikroorganizmy výhodný. Oproti bakteriím rostoucím v planktonické formě biofilm poskytuje bakteriálním buňkám ochranu, udržuje určitý stupeň homeostázy a vytvořená biofilmová vrstva i EPS obklopující buňky představuje bariéru, která izoluje bakterie od okolí. Buňky v biofilmu tak mají například vyšší odolnost vůči toxickým látkám, UV záření, mechanickému poškození, bakteriofágům či predátorům. V těle člověka nebo zvířete lépe odolávají působení imunitního systému nebo antibiotikům (Donlan et Costerton 2002).

Buňky v biofilmu spolu metabolicky spolupracují a dochází u nich k vyššímu stupni genetické výměny (Costerton et al., 1995; O'Tooley et al., 2000). Kromě toho zde dochází díky poměrně úzkému kontaktu mezi jednotlivými buňkami k intenzivní výměně genetické informace, zvi. o konjugaci a přenos plazmidů. Tímto způsobem se mohou mezi jednotlivými populacemi v biofilmu poměrně rychle šířit např. plazmidy nesoucí geny, které kódují rezistenci k antibiotikům aj. (Hausner et al., 1999).

V dnešní době existují moderní kombinované systémy uplatňující kombinaci suspendované formy růstu bakterií s růstem nárostových kultur na pevných nosičích ponořených v aktivaci (typu náplní biologických filtrů) či na pevných nosičích ve fluidním loži (typu polyuretanových pěnových náplní např kuličkového tvaru) využívané u čistíren odpadních vod. Velkou výhodou těchto systémů je akumulace suspendované a biofilmové kultury v jednom reaktoru. Tato skutečnost výrazným způsobem umožňuje navýšení zásoby biomasy v systému, což v důsledku znamená navýšení kapacity COV. Rozdílnost biologických kultur rostoucích v těchto reaktorech navíc dokáže výrazně zefektivnit procesy biologické nitrifikace a denitrifikace, stabilizovat funkci systému a v mnoha případech vyřešit problém vláknitého bytnění aktivovaného kalu. V potravinářské biotechnologii jsou nosiče používány zejména v octářství. Bakterie, které se v ocetnicích používají, musí mít schopnost dobré adheze k danému materiálu. Tato vlastnost je doprovázena tvorbou slizu (mázdry), jejíž chemickou podstatou jsou převážně polysacharidy. Jsou známy náplně (korek, pemza) a v poslední době se začínají používat i nosiče ze silikátových materiálů. Hlavním předpokladem dobré funkce ocetnice je, aby se dosáhlo co největšího styku kyslíku a substrátu s bakteriemi.

V oblasti funkčních potravin, doplňků stravy a léčiv s obsahem probiotických kultur nebyl do současné doby uvedený postup aplikován. Vynález přináší inovovaný úhel pohledu na probiotické přípravky nové generace. Do současné doby byly sledovány pouze adherenční schopnosti probiotických bakterií ke střevnímu epitelu a tvorba biofilmu ve fyziologických podmínkách. Nebyla . 9 .

však intenzivně řešena problematika přípravy probiotických kultur v biofilmové struktuře již při vlastním výrobním postupu účinné látky doplňků stravy, léčiv, kosmetiky, zdravotních prostředků, potravin apod.

Podstata vynálezu

Pro účely tohoto vynález jsou v textu používány výrazy, které jsou definovány níže:

Biofilm je struktura skládající se zjednovrstevného nebo mnohovrstevnatých seskupení bakteriálních buněk jednoho nebo více bakteriálních druhů, které jsou usazeny v amorfním extracelulárním materiálu složeného zejména z exopolysacharidu nebo exopolysacharidů (EPS) bakteriálního původu, který(é) pevně přilepuje buňky k povrchu nosiče a k sobě navzájem.

Bakterie usazené v biofilmu se vyznačují vyšší odolností vůči negativním vlivům vnějšího prostředí než bakterie v suspenzi, což má v praxi vliv na stabilitu produktu a jeho biologický účinek, což je dáno tím, že bakterie v živých systémech standardně tvoří biofilmovou strukturu.

Nosičem se zde míní látky organického či anorganického charakteru určená jako podklad pro kultivaci bakterií.

Cílem vynálezu je tedy poskytnout přípravek s obsahem probiotické kultury nebo kultur, který by měl zlepšené vlastnosti oproti stávajícím přípravkům, a to zejména pokud jde o jeho účinnost a odolnost vůči vlivům vnějšího prostředí.

Vynález se týká přípravku pro použití v potravinářství, farmacii, humánní nebo veterinární medicíně nebo kosmetice, který obsahuje jednodruhovou nebo vícedruhovou probiotickou kulturu v množství 1.10³ až 1.10¹⁴ CFU na 1 g přípravku a nosič v množství 0.001 až 99 % hmotnosti, přičemž probiotická kultura v přípravku je alespoň částečně ve formě biofilmu přilnutého k nosiči. Probiotická kultura může být vybrána ze skupiny zahrnující například rod Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Sacharomyces nebo jiné bakterie a kvasinky příznivě působící na zdraví člověka nebo zvířat nebo tvořící přirozenou součást lidské nebo zvířecí mikroflóry, nebo jejich směs. Nosič může být vybrán ze skupiny zahrnující oligosacharidy a polysacharidy jako je mikrokrystalická celulóza (MCC), pektin, inulin, dextrin, maltodextrin, glykogen, kukuřičný, bramborový a jiný škrob, proteiny mikrobiálního, rostlinného nebo živočišného původu, krystaly minerálů, HMC, nanotextilie, FOS, GOS, a jiné fyziologicky akceptovatelné nosiče nebo jejich směs, aje v přípravku obsažen v množství minimálně 0.001 % hmotnostních. Přípravek s výhodou obsahuje probiotickou kulturu v množství lxlO¹⁰ CFU/g, přičemž 0,1 až 100 % hmotn. probiotické kultury je s výhodou ve formě biofilmu. Probiotická kultura by neměla být kontaminována.

Přípravek může dále obsahovat i vitamíny, minerály, rostlinné extrakty a jiné fyziologicky prospěšné substance, v maximálním množství do 99 % hmotn.

Přípravek podle vynálezu může být například ve formě tablety, tobolky, pulvisu nebo granulátu.

Dále se vynález týká způsobu výroby přípravku podle vynálezu, kde se kultivační médium s nosičem a inokulačním roztokem obsahujícím probiotickou kulturu kultivuje při teplotě 20 až 40 °C do doby, kdy je alespoň 5 % nosiče, s výhodou 10% nosiče, ještě výhodněji 20% nosiče a nejvýhodněji 100 % nosiče, pokryto probiotickou kulturou, poté se směs zkoncentruje a vysuší. Tyto hodnoty procentuálního pokrytí nosiče nemají být nijak limitující pro rozsah vynálezu, kultivaci lze ukončit i v době, kdy je pokryto 30 %, 40 %, 50 % až do maximálního pokrytí nosiče 100%. Procentuální pokrytí nosiče znamená, že alespoň 5% z celkového povrchu nosiče je pokryto biofilmem nebo alespoň 5 % z celkového množství nosiče je pokryto biofilmem (například je-li nosič ve formě kuliček, pak alespoň 5 % z celkového počtu kuliček je pokryto nosi-3 CZ 303986 B6 čem). Ve výhodném provedení se nejprve kultivační médium sterilizuje společně s nosičem, pak se do média přidá inokulační roztok obsahující probiotickou kulturu, následně se směs kultivuje při teplotě 30 až 40 °C po dobu 8 až 48 hodin a nakonec se směs zakoncentruje a vysuší.

Kultivační médium, které lze ve způsobu výroby podle vynálezu použít, může být vybráno ze skupiny zahrnující například sterilní mléko nebo syrovátku nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu nebo peptonu, jako je např. Man-RogosaSharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton nebo jejich směs. Ve způsobu podle vynálezu lze provádět kultivaci probiotické kultury v jednom kultivačním médiu nebo ve směsi kultivačních médií nebo postupně ve dvou nebo více různých kultivační médiích nebo jejich směsí. Kultivace může probíhat staticky nebo s mícháním nebo kombinovaně, tj. po určitou dobu staticky a po určitou dobu s mícháním.

Zakoncentrování může proběhnout například formou odstředění nebo ultrafiltrace a sušení může proběhnout například formou sušení na fluidní sušárně nebo lyofilizací.

Ve výhodném provedení se zkoncentrovaný přípravek suší společně s přídavkem dalšího nosiče vybraného ze skupiny zahrnující maltodextrin, inulin nebo jejich směs, což usnadní sušení, zvýší výtěžek a usnadní následnou práci s materiálem.

Po sušení může následovat lisování přípravku do tablet, plnění do tobolek nebo plnění přípravku ve formě pulvisu či granulátu do sáčků či nádob nebo nápojů.

Přípravek podle vynálezu najde uplatnění například jako humánní nebo veterinární doplněk stravy, zvláštní výživa, potravina, nápoj, léčivo, zdravotnický prostředek, kosmetický a hygienický produkt, veterinární krmivo a doplněk s obsahem probiotických kultur.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Probiotická kultura Lactobacillus acidophillus je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 hodiny. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanýmí 100 ml MRS média. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 16 až 24 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do 21itrového fermentonu s předem vysterilizovanými dvěma litry kultivačního média, jako je sterilní mléko nebo syrovátka nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu, jako na např. ManRogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton a jiná. Médium je předem vysterilizováno s nosičem, kterým je kukuřičný škrob (20 % hmotnostních procent). Kultivace probíhá při 37 °C po dobu 20 hodin při otáčkách 90 rpm. Následuje statická kultivace bez míchání při teplotě 37 °C po dobu 6 až 8 hodin. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 5 % nosičů bakteriemi, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizuje s přídavkem 40 % hmotnostních maltodextrinu.

Příklad 2

Probiotická kultura Bifidobacterium je pomnožena na pevném kaseinhydrolyzátovém agarovém médiu při 37 °C po dobu 24 až 48 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna

-4CZ 303986 B6 nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 50 až 100 ml MRS média (Man-Rogosa-Sharpe). Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 8 až 16 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do lOlitrové kultivační láhve s předen vysterilizovanými 6 litry kultivačního MRS média. Probiotic5 ká kultura je získána statickou kultivací, která probíhá po dobu 8-16 hodin. Následuje příprava 170 1 média (15 kg sušené syrovátky je rozpuštěno ve 170 1 purifikované vody a je vysterilizováno s nosičem, kterým je mikrokrystalická celulóza, kteráje přidána v množství 15 kg), do nějž se přenese obsah lOlitrové kultivační láhve. Kultivace probíhá při 37 °C po dobu 20 hodin při otáčkách míchadla 90 rpm, následně probíhá statická kultivace při 37 °C po dobu 4 hodin a minimálio ním vzdušnění (10 litrů atmosférického vzduchu/min). Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů, V čase, kdy je pokryto minimálně 5 % nosičů bakteriemi, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce a suší na fluidní sušárně s přídavkem maltodextrinu nebo inulinu v poměru 2 : 8.

Příklad 3

Probiotická kultura Lactobacillus rhamnosus je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 až 48 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 50 až 100 ml Trypticase Soy Broth media s pH upraveným na 6. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 12 až 16 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do lOlitrové kultivační lahve spředem vysterilizovanými 6 litry kultivačního média. Probiotická kultura je získána statickou kultivací, která probíhá po dobu 8 až 16 hodin. Následuje příprava kultivačního média (7 kg Reinforced clostridial broth je rozpuštěno ve 190 1 purifikované vody a je vysterilizováno s 15 kg nosiče, kterým je mikrokrystalická celulóza ve směsi s kukuřičným škrobem v poměru 1 : 1), do nějž se převede obsah lOlitrové kultivační láhve. Kultivace probíhá při 37 °C po dobu 20 hodin při otáčkách míchadla 120 rpm, následně probíhá statická kultivace při 37 °C po dobu 4 až 16 hodin a minimálním vzdušnění (10 litrů atmosférického vzduchu/min).

Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 5 % nosičů bakteriemi, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce a suší na fluidní sušárně s přídavkem maltodextrinu nebo inulinu v poměru 2:10.

Příklad 4

Probiotická kultura Streptococcus thermophilus je pomnožena na pevném MRS médiu při 39 °C po dobu 24 až 48 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 50 až 100 ml Bacto

Proteose Pepton mediem. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 39 °C po dobu 12 až 16 hodin. Následuje inokulace přenesení obsahu Erlenmayerovy baňky do lOlitrové kultivační lahve s předem vysterilizovanými 6 litry kultivačního média. Probiotická kultura je získávána statickou kultivací, která probíhá po dobu 8 až 16 hodin. Následuje příprava kultivačního média (7 kg práškového Bacto Proteose Pepton média je rozpuštěno ve 190 1 purifikované vody a je vysterilizováno s 25 kg nosiče, kterým je mikrokrystalická celulóza ve směsi s kukuřičným škrobem v poměru 1 : 1), do nějž se převede obsah lOlitrové kultivační láhve. Kultivace probíhá při 39 °C po dobu 12 až 16 hodin při otáčkách míchadla 120 rpm, následně probíhá statická kultivace při 37 °C po dobu 4 až 16 hodin a vzdušnění (20 litrů atmosférického vzduchu/min). Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 5 % nosičů bakteriemi, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce a suší na fluidní sušárně s přídavkem maltodextrinu nebo inulinu v poměru 2:10.

-5 CZ 303986 B6

Příklad 5

Směs probiotických kultur Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium breve, Lactobcillus casei, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum je získávána fermentaci kultivací na tekutém médiu připraveném ze sušené syrovátky rozpuštěné v deminerilazované vodě. Ampule s lyofilizáty jednotlivých kultur jsou rehydratovány 1 ml fyziologického roztoku a rozpuštěný obsah je přenesen do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanýmí 200 ml sterilního média připraveného z 18 g sušené syrovátky rozpuštěné ve 200 ml demineralizované vody. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepaní při 37 °C po dobu 12 a ž 16 hodin. Následuje přenesení obsahu Erlenmayerovy baňka do lOlitrové kultivační láhve s předem vysterilizovanými 6 litry kultivačního média připraveného z 540 g sušené syrovátky rozpuštěné v 6 litrech demineralizované vody. Probiotická kultura je získávána statickou kultivací, která probíhá po dobu 8 až 16 hodin. Následuje příprava kultivačního média (9 kg sušené syrovátky rozpuštěné ve 100 litrech demineralizované vody a je vysterilizováno s 25 kg nosiče, kterým může být mikrokrystalická celulóza nebo škrob nebo inulin nebo glykogen nebo dextran, a to samostatně nebo ve směsi). Po přečerpání 6 litrů inokula do 100 litrů média probíhá kultivace při 37 °C po dobu 12 až 16 hodin při otáčkách míchadla 120 rpm, následně probíhá statická kultivace při 34 °C po dobu 4 až 16 hodin. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 5 % nosičů bakteriemi lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo zkoncentruje na ultrafiltračním zařízení a suší na fluidní sušárně s přídavkem maltodextrinu nebo inulinu v poměru 2:3. '

Příklad 6

Probiotická kultura Lactobacillus acidophillus je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 až 48 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 50 až 100 ml MRS média s pH upraveným na 6. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 12 až 16 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do lOlitrové kultivační láhve s předem vysterilizovanými 6 litry MRS kultivačního média. Probiotická kultura je získána statickou kultivací, která probíhá po dobu 8 až 16 hodin. Následuje příprava kultivačního 170 litru MRS média, které je vysterilizováno s 15 kg nosiče, kterým je mikrokrystalická celulóza ve směsi s kukuřičným škrobem v poměru 1:1). Médium je připraveno ve fermentoru. Do vysterilizovaného média se převede obsah lOlitrové kultivační láhve. Kultivace probíhá při 37 °C po dobu 12 až 16 hodin při otáčkách míchadla 120 rpm, následně probíhá statická kultivace při 37 °C po dobu 2 až 16 hodin a minimálním vzdušnění (10 litrů atmosférického vzduchu/min). Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 5 % nosičů bakteriemi, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce a suší na fluidní sušárně s přídavkem maltodextrinu nebo inulinu v poměru

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Přípravek pro použití v potravinářství, farmacii, humánní nebo veterinární medicíně nebo kosmetice, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje jednodruhovou nebo vícedruhovou probiotickou kulturu vybranou ze skupiny zahrnující rod Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus a Sacharomyces v množství 1.10³ až 1.10¹⁴ CFU na 1 g přípravku a nosič vybraný ze skupiny zahrnující mikrokrystalickou celulózu (MCC), pektin, inulin, dextrin, maltodextrin, glykogen, kukuřičný, bramborový a jiný škrob, proteiny mikrobiálního, rostlinného nebo živočišného původu, krystaly minerálů, HMC, nanotextilie, FOS, GOS, a jiné fyziologicky akceptovatelné nosiče

-6- AB^«4-^(fc<Wl>i.ri ,4. _ť nebo jejich směsi, v množství 0,001 až 99 % hmotn., přičemž probiotická kultura je alespoň částečně ve formě biofilmu přilnutého k nosiči.
2. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že nosič je v přípravku obsažen

5 v množství min. 1 % hmotn.
3. Přípravek podle kteréhokoli z nároků la 2, vyznačující se tím, že probiotická kultura je v přípravku obsažena v množství 1.10¹⁰ CFU/g.

io
4. Přípravek podle kteréhokoli z nároků laž3, vyznačující se tím, že 0,1 až 100 % hmotn probiotické kultury je ve formě biofilmu.
5. Přípravek podle kteréhokoli z nároků laž4, vyznačující se tím, že dále obsahuje vitamíny, minerály, rostlinné extrakty a jiné fyziologicky prospěšné substance v maximál15 ním množství 99 % hmotn.
6. Přípravek podle kteréhokoli z nároků laž 5, vyznačující se tím, že je ve formě tablety, tobolky, pulvisu nebo granulátu.

20
7. Způsob výroby přípravku uvedeného v kterémkoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se připraví směs zahrnující kultivační médium s nosičem a inokulačním roztokem obsahujícím probiotickou kulturu, směs se nejprve kultivuje při teplotě 20 až 40 °C a otáčkách 90 až 120 rpm po dobu 12 až 20 hodin, a následně se směs kultivuje staticky do doby, kdy je alespoň 5 % nosiče pokryto probiotickou kulturou, poté se směs zakoncentruje a vysuší.
8. Způsob výroby přípravku podle nároku 7, vyznačující se tím, že se nejprve kultivační médium sterilizuje společně s nosičem, pak se do média přidá inokulační roztok obsahující probiotickou kulturu za vzniku směsi, která se následně kultivuje při teplotě 20 až 40 °C a otáčkách 90 až 120 rpm po dobu 12 až 20 hodin, a následně se směs staticky kultivuje do doby,

30 kdy je alespoň 10 % nosiče pokryto probiotickou kulturou, a nakonec se směs zakoncentruje a vysuší.
9. Způsob výroby přípravku podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že doba statické kultivace je 2 až 16 hodin a teplota je 30 až 40 °C.
10. Způsob výroby přípravku podle nároku 7, vyznačující se tím, že se nejprve probiotická kultura postupně kultivuje ve dvou stejných nebo různých kultivačních médiích nebo jejich směsích bez obsahu nosiče, a potom se kultivuje ve směsi kultivačního média a nosiče při teplotě 20 až 40 °C a otáčkách 90 až 120 rpm po dobu 12 až 20 hodin, a následně se směs kulti40 vuje staticky do doby, kdy je alespoň 5 % nosiče pokryto probiotickou kulturou, poté se směs zakoncentruje a vysuší.
11. Způsob výroby přípravku podle kteréhokoli z nároků 7 až 9, v y z n a č u j í c í se tím, že se kultivační médium s nosičem a inokulačním roztokem obsahujícím probiotickou kulturu

45 kultivuje při teplotě 37 až 39 °C a otáčkách 90 až 120 rpm po dobu 12 až 20 hodin, a následně se směs kultivuje staticky do doby, kdy je alespoň 20 % nosiče pokryto probiotickou kulturou, poté se směs zakoncentruje a vysuší.
12. Způsob výroby přípravku podle kteréhokoli z nároků 7 až 9, vyznačující se

50 tím, že se kultivační médium s nosičem a inokulačním roztokem obsahujícím probiotickou kulturu kultivuje při teplotě 37 až 39 °C a otáčkách 90 až 120 rpm po dobu 12 až 20 hodin, a následně se směs kultivuje staticky do doby, kdy je 100 % nosiče pokryto probiotickou kulturou, poté se směs zakoncentruje a vysuší.

-7CZ 303986 B6
13. Způsob výroby přípravku podle kteréhokoli z nároků 7 až 12, vyznačující se tím, že kultivační médium je vybráno ze skupiny zahrnující sterilní mléko nebo syrovátka nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu nebo peptonu.
14. Způsob výroby přípravku podle kteréhokoli z nároků 7 až 13, vyznačující se tím, že zakoncentrování proběhne formou odstředění nebo ultrafiltrace.
15. Způsob výroby přípravku podle kteréhokoli z nároků 7 až 14, vyznačující se tím, že sušení proběhne formou sušení na fluidní sušárně nebo formou lyofilizace.
16. Způsob výroby přípravku podle kteréhokoli z nároků 7 až 15, vyznačující se tím, že se zakoncentrovaný přípravek suší společně s přídavkem dalšího nosiče vybraného ze skupiny zahrnující maltodextrin, inulin nebo jejich směs.
17. Způsob výroby přípravku podle kteréhokoli z nároků 7 až 16, vyznačující se tím, že se přípravek po vysušení lisuje do tablet, plní do tobolek nebo ve formě pulvisu či granulátu se plní do sáčků či nádob nebo nápojů.
18. Potravinářský, farmaceutický nebo veterinární výrobek obsahující přípravek uvedený k kterémkoli z nároků 1 až 6.
19. Použití přípravku uvedeného v kterémkoli z nároků 1 až 6 pro humánní i veterinární doplňky stravy, zvláštní výživu, potraviny, nápoje, léčiva, zdravotnické prostředky, kosmetické a hygienické produkty, veterinární krmivá a doplňky s obsahem probiotických kultur.