CZ308165B6 - Nosič určený ke kultivaci probiotických kultur, kompozice, která takovýto nosič obsahuje - Google Patents

Abstract

Nosič určený ke kultivaci probiotických kultur, který obsahuje koloidní SiO, prebiotickou složku a hydroxypropylmethylcelulózu. Kompozice, která obsahuje alespoň jednu probiotickou kulturu adherovanou na takovýto nosič, přičemž probiotická kultura je alespoň v iniciačním stádiu tvorby biofilmu.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nosiče určeného ke kultivaci probiotických kultur, kompozice, která takovýto nosič obsahuje. Kompozice obsahuje alespoň jednu probiotickou kulturu adherovanou na nosič, přičemž probiotická kultura je alespoň v iniciačním stádiu tvorby biofilmu. Dále se vynález týká potravinářského, farmaceutického nebo veterinárního výrobku, který tuto kompozici obsahuje. Mezi tyto výrobky patří doplňky stravy, produkty pro zvláštní výživu, potraviny, nápoje, léčiva, zdravotnické prostředky, kosmetické a hygienické produkty, veterinární krmivá a doplňky s obsahem probiotických kultur.

Dosavadní stav techniky

Díky pestré škále fenotypových projevů představují mikroorganizmy nejúspěšnější formu existence života na Zemi. Mohou žít buď volně ve vodním prostředí, tzv. planktonické buňky (rovněž solitérní, jednotlivé), nebo ve společenství, které vytváří tenkou vrstvu na pevných tělesech - biofilm. Tato forma je pro mikroorganizmy z mnoha důvodů výhodnější a ve většině prostředí je i základním způsobem jejich přirozeného výskytu (kameny v rybníce, žumpy, průmyslové odpady, bioreaktory, zuby atd.). Vhodné podmínky pro tvorbu biofilmu jsou rovněž cizí tělesa v lidském těle (kanyly, katetry, implantáty), na druhou stranu přátelský biofilm střevní sliznice chrání před kolonizací patogenních mikroorganizmů a napomáhá správné funkci GIT (Huang a kol., 2011, Schindler, 2001). Růst ve formě biofilmu poskytuje buňkám také větší ochranu (Huang a kol., 2011, Hoiby a kol., 2010).

Tloušťka (cca 1 až 1000 pm) biofilmu závisí na dostupnosti živin, kyslíku a na počtu rodů či druhů, které biofilm vytváří. V přirozeném prostředí je naprosto převažující vícedruhové společenství mikroorganizmů. Biofilm se skládá z agregátů a dutin, které jsou propojeny kanálky. Pomocí kanálků mohou pronikat jak živiny, tak metabolity či signální molekuly do hlubších vrstev biofilmové struktury. Přesto se například koncentrace kyslíku liší v závislosti na vzdálenosti od povrchu biofilmu: nižší vrstvy jsou zpravidla méně zásobeny kyslíkem a převládá v nich anaerobní prostředí. Vytváří se tak specifické oblasti biofilmu a biofilm nemá homogenní strukturu. Bakterie jsou v rámci biofilmové struktury rozloženy nerovnoměrně a rostou v tzv. mikrokoloniích (Schindler, 2001). Podrobně popsané jsou „směsné biofilmy tvořené rody Saccharomyces, Lactobacillus plantarum a Leuconoctoc mesenteroides (Furukawa a koi., 2015).

Vznik biofilmu je podmíněn přítomností vhodného materiálu, na který se mikroorganizmus může uchytit, dostatečným množstvím živin a jednotlivými solitérními buňkami. Přichycení buněk na povrch je komplexní proces, který je usnadněn, pokud je povrch hydrofobní (Donlan, 2002). Jakmile buňky pomocí speciálních látek, tzv. adhezinů (bílkoviny, polysacharidy, glykopeptidy), přilnou k povrchu, změní svůj fenotypový projev (bičíky, fimbrie, produkce proteinů, bílkoviny pórů buněčné stěny atd.) a začnou produkovat do prostředí velké množství polysacharidu s lepivými vlastnostmi. Tyto látky, které tvoří zhruba 50 až 90 % mokré biomasy biofilmu, slouží jako jakási hlenová matrice (EPS, extracellular polymeric substances), drží buňky pohromadě a umožňují rozšiřování a zvětšení biofilmu. Regulace genové exprese nastává v řádu minut po přichycení jednotlivých buněk k povrchu (Donlan, 2002), výrazně se liší u planktonické a biofilmové formy (Watnick a Kolter, 2000). U přibližně 22 % genů dochází ke zvýšení exprese. Jedná se o geny, jejichž produkty jsou potřebné pro rozvoj biofilmu (např. produkce exopolysacharidů), u 16 % genů dochází ke snížení exprese (Flemming a Wingender, 2010, Watnick a Kolter, 2000). Extracelulámí matrix je dobře hydratovaná, je tvořena zejména polysacharidy, bílkovinami, nukleovými kyselinami a lipidy. Poskytuje mechanickou stabilitu biofilmu, zprostředkovává adhezi k povrchu a tvoří kohezní 3D strukturu, která drží buňky pohromadě a umožňuje komunikaci buněk a jejich imobilizaci v biofilmu. Zároveň chrání buňky

- 1 CZ 308165 B6 před extracelulámími enzymy. Extracelulámí matrix se může mezi jednotlivými biofilmy významně lišit v rozpustnosti a ve svém složení, které odpovídá druhovému zastoupení, teplotě i dostupnosti živin, a její množství roste se stářím biofilmu. Extracelulámí bakteriální struktury, fimbrie a bičíky, mohou mít význam při stabilizaci biofilmu.

Exopolysacharidy produkované kmenem Lactobacillus plantarum YW32 a jejich bioaktivita byly detailně charakterizovány. Byly složeny z manózy, fruktózy, galaktózy, glukózy v přibližném poměru 8,2 : 1 : 4,1 : 4,2. Mikrostruktumí studie potvrdila pavučinovou strukturu složenou z kompaktních vláken a přítomnost mnoha homogenních tyčinkovitých zduřelin. Exopolysacharidy vykazovaly vysokou teplotní stabilitu (teplota degradace zhruba 283 °C) a odolnost vůči hydroxylovým a superoxid-radikálům při množství 5 mg/ml. Dále inhibovaly tvorbu biofilmu některých patogenních bakterií, např. E. Coli 0157, Shigella flexneri CMCC(B), Staphylococcus aureus AC1, Salmonella typhimurium S50333, tato vlastnost ale byla závislá na koncentraci těchto exopolysacharidů. Dobrá inhibiční aktivita byla zaznamenána proti buňkám rakoviny střeva HT-29. Tyto výsledky naznačují, že samotné exopolysacharidy by mohly být užívány jako doplňky stravy (Wang a kol., 2015).

V plně vytvořeném biofilmu spolu buňky komunikují díky tzv. quorum sensing a díky speciálním chemickým signálům (jednoduché látky či peptidy), které řídí dělení buněk, hustotu populace, aktivaci či umlčení genové exprese, tvorbu hlenové matrice či tvorbu proteinů, které je štěpí (Schindler, 2001). Pokud populace dosáhne určité hustoty, tedy i tyto signály dosáhnou určité koncentrace, aktivují se geny, které ovlivňují diferenciaci biofilmu (Donlan, 2002).

Struktura biofilmu je heterogenní a neustále se mění v závislosti na vnějších i vnitřních procesech. Bylo dokázáno, že buňky z jednotlivých mikrokolonií migrují v rámci biofilmu. Struktura mikrokolonií se mění z kompaktní do volné a jednotlivé buňky mohou opouštět biofilm (Donlan, 2002). Malá vzdálenost mezi mikrokoloniemi představuje ideální prostředí pro vytváření gradientu živin, výměnu genů a quorum sensing. 3D struktura biofilmu, a to zejména povrchové parametry ukazující heterogenitu biofilmu a objemové parametry, které popisují velikost a morfologii biomasy, byla detailně popsána v práci Beyenala a kol. (2004).

Hlavní mechanizmy pro přežívání biofilmu a uvnitř biofilmu jsou: ochrana proti oxidativnímu stresu specifická pro biofilm, exprese efluxních pump a ochrana pomocí matrixových polysacharidů (de Angelis a kol., 2015).

Biofilm v lidském těle

Za normálních podmínek je v lidském organizmu biofilm přítomen jako zubní plak, který lze odstranit, ale vždy se vytvoří znovu. Biofilm v ústech je zpravidla tvořen grampozitivními bakteriemi (Streptococcus, Staphylococcus) a kvasinkami. Bylo identifikováno zhruba 700 druhů bakterií kolonizujících jazyk, zuby a dutinu ústní. Biofilm v ústech a jeho produkty přispívají ke zdravému stavu dásní a zubů (Huang a kol., 2011).

V nekrotických tkáních, ve žlučových cestách, při infekci kostní dřeně, zánětu prostaty či cystické fibróze se biofilm může rozvinout i ve tkáních a může být zdrojem ohniskové infekce. Je-li do těla (arterie, žíly, močové trubice) zavedena cévka, může se biofilm rozvinout na jejím povrchu v rámci několika dní a představovat zdroj nákazy. Velkým problémem je osídlení umělých srdečních chlopní či děložního tělíska. Největší „výhodou biofilmu je vyšší odolnost, nepropustnost pro látky a vyšší kontakt mezi buňkami, tedy i snadnější možnost výměny genů, zejména pro virulenci a rezistenci k antibiotickým látkám. Typickým příkladem jednodruhového biofilmu jsou infekce srdečních chlopní, kdy se tvoří fibrinový matrix, který chrání bakterie před leukocyty (Donlan, 2002).

Největší množství biofilmu obsahuje gastrointestinální trakt (GIT). Výzkum vývoje a funkce biofilmu v GIT je do značné míry omezen pouze na nemocné pacienty z důvodu odebírání vzorků

-2CZ 308165 B6 biopsií či materiálem z chirurgických zákroků. To je spojeno i s užíváním antibiotik či „vypláchnutím“ střeva před endoskopií nebo kolonoskopií (Macfarlane a Dillon, 2007). Získané vzorky tedy nemusí být reprezentativním příkladem kolonizovaného střeva.

Epiteliální buňky jsou přirozeně pokryty vrstvou slizu, který znemožňuje usednutí patogenních mikroorganizmů. Mikroorganizmy v tlustém střevě mohou existovat j ako individuální buňky, v mikrokoloniích či ve shlucích s ostatními druhy (Macfarlane a Dillon, 2007). V ojedinělých případech může biofilm tvořit pouze jeden mikrobiální druh (infekce srdečních chlopní, katetrů, prostetik). Biofilm v prostředí GIT je obvykle vícedruhový a jeho rozvoj je ovlivněn podmínkami prostředí, živinami a obrannými vlastnostmi imunitního systému jedince (Macfarlane a Dillon, 2007). Jednotlivé buňky se liší od biofilmových zejména v metabolické aktivitě, vyšší rezistencí k antibiotikům a ostatním nepříznivým vlivům jako např. nízké pH.

Horní část GIT (žaludek, jícen) obsahuje převážně fakultativně anaerobně kultivovatelné mikroorganizmy, které se sem dostávají z dutiny ústní (streptokoky, laktobacily). V žaludku se běžně vyskytují bakterie rodu Lactobacillus, Helicobacter pyroli a bakterie tolerantní k nízkému pH. Hodnota pH nižší než 4 výrazně eliminuje růst mikroorganizmů. Biofilm v lumen střeva je tvořen živými i mrtvými buňkami, je účinnější při štěpení polysacharidů oproti neadherujícím buňkám a vytváří jako koncový produkt acetát oproti butyrátu u neadherujících (Macfarlane a Dillon, 2007). Byly zaznamenány drobné rozdíly v enzymatické aktivitě zejména pro enzymy s proteolytickou či peptidolytickou aktivitou, která usnadňuje narušení mucinu na povrchu epiteliálních buněk. Mukózní biofilm je tvořen zejména eubakteriemi, bifidobakteriemi, klostridiemi a širokou škálou grampozitivních koků. Patrné je ale i odlišné druhové zastoupení u každého jedince s ohledem na stravu a zdravotní stav. Složení mukózního biofilmu je výrazně odlišné od složení mikrobiomu ve stolici (Macfarlane a Dillon, 2007).

Probiotické bakterie mohou inhibovat či pomoci předcházet infekcím močového ústrojí. Inhibice tvorby biofilmu E. coli NTC 9001 a Enterococcus faecalis NTC 00775 byla prokázána bez ohledu, zda bylo použito jednodruhové či vícedruhové probiotikum (Chapman a kol., 2013, Chapman a kol., 2014).

Biofilm probiotických bakterií

Biofilm chrání buňky před antibakteriálními látkami, fágy, imunitním systémem hostitelského organizmu, zvyšuje jejich rezistenci k nízkému pH, organickým kyselinám, k nedostatku živin, vysychání a umožňuje setrvání na jednom místě v proudícím tekutém prostředí. Extracelulámí polysacharidy, které tvoří matrix biofilmu, ovlivňují adhezi bakterií na mukózu, což je předpokladem pro jejich pozitivní působení v makroorganizmu. Biofilm by rovněž mohl být enkapsulován místo solitérních buněk a tak přispět ke zvýšení rezistence produkovaných mikrokapslí dále přidávaných např. do funkčních potravin (Peržinová, 2014).

Tvorba biofilmu u probiotických bakterií je považována za výhodnou vlastnost, neboť usnadňuje kolonizaci a dlouhodobé přetrvání v hostitelském organizmu (Terraf a kol., 2012). Druhy i jednotlivé kmeny se mezi sebou liší v probiotických vlastnostech, např. místně specifická adheze v GIT, vliv na imunitu hostitele i jeho zdravou, případně zanícenou sliznici (Soccol a kol., 2010). Všechny testované kmeny rodu Lactobacillus prokázaly schopnost vytvářet biofilm na polystyrénovém povrchu, přičemž Lactobacillus acidophilus vykazoval nej vyšší mim tvorby biofilmu. Byla prokázána ko-agregace mezi laktobacily a třemi patogenními kmeny (Ventolini, 2014). Ve studii Lin a kol. (2015) byla prokázána inhibice kmene Streptococcus mutans testovanými probiotickými kmeny Lactobacillus casei Shirota, Lactobacillus casei LC01, Lactobacillus plantarum ST-ΠΙ, Lactobacillus paracasei Lpc-37 a Lactobacillus rhamnosus HN001. Supernatant pouze dvou kmenů (Shirota, HN001) byl schopen inhibovat S. mutans rostoucí v biofilmu. Inhibice byla zapříčiněna tvorbou kyselého prostředí a bakteriocinům podobnými peptidy.

-3 CZ 308165 B6

Byla provedena řada testů na antimikrobiální účinky různých probiotických kmenů včetně kmenů izolovaných z epitelů hostitelských organismů. Některé probiotické účinky jsou v biofilmu zesíleny, např. kmeny L. reuteri produkovaly v biofilmu více reuterinu - antimikrobiálního faktoru inhibujícího grampozitivní i gramnegativní bakterie, kvasinky i protozoa (Jones a Versalovic, 2009). Kmeny rodu Lactobacillus a Enterococcus izolované z vaginální mikroflóry klisen byly charakterizovány (adheze k vaginálnímu epitelu, antimikrobiální aktivita, tvorba biofilmu) za účelem získání vhodných kmenů, které by mohly být využity jako probiotika koní (Fraga a kol., 2008). Lactobacillus fermentum SK5 izolovaný z vaginální mikroflóry zdravé ženy byl testován jako možné probiotikum. Tento kmen přežíval v pH 3 až 4 a 0,1 až 0,2% žluči, nebyl ovlivněn pepsinem (3 g/1) ani pankreatinem (1 g/1). Kmen L. fermentum SK5 má antimikrobní potenciál vůči gastrointestinálnímu patogenu E. coli, vaginálnímu patogenu Gardnerella vaginalis, zároveň u něho byla prokázána schopnost adheze k epiteliálním buňkám (HeLa, HT-29 a Caco-2) a tvorba biofilmu (Kaewnopparat et al., 2013). Lactobacillus iners, nejčastěji izolovaný mikroorganizmus z vagíny zdravých žen, narušoval povrch, hustotu i hloubku biofilmu rodu Gardnerella (Saunders a kol., 2007). Klinické studie potvrdily, že kmeny Lactobacillus rhamnosus GR-1 a Lactobacillus reuteri RC-14 snižovaly riziko bakteriálních vaginóz (Saunders a kol., 2007). Dále byly testovány (autoagregace, adheze k mucinu a tvorba biofilmu) kmeny druhů Lactobacillus gasseri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri izolované z vagíny (Tomáš a kol., 2005, Terraf a kol., 2014). U kmenů Lactobacillus izolovaných z vagín zdravých žen byla prokázána tvorba hydrogen peroxidu a při nej nižší koncentraci 280 pg/ml prokazatelně inhibovaly růst cervikálních i jiných patogenů, Salmonella, Gardnerella, Chlamydia, Trichomonas, Neisseria (Dasari a koi., 2014). V práci Pascuala a koi. (2010) bylo testováno 100 kmenů rodu Lactobacillus izolovaných z vagín zdravých žen. Kmen L. fermentum L23 byl vybrán (schopnost tvořit bakteriociny, schopnost kolonizace, autoagregace, adherence k vaginálnímu epitelu, agregace k bakteriálním patogenům) jako vhodný kandidát pro pokusy na myších, které potvrdily, že tento kmen by mohl být vhodnou alternativou při léčbě genitálních infekcí. Kmeny Lactobacillus plantarum LP01 a Lactobacillus fermentum LF15 by mohly přispívat k dlouhodobé ochraně díky jejich integraci do vaginálního mikrobiomu a adhezi k epiteliálním buňkám při použití vaginálních tablet, které pomalu uvolňují obsah. Oba kmeny byly schopny potlačit růst Gardnerella vaginalis a in vitro i E. coli, mohou tak potlačit nejen anaerobní patogeny (Vicariotto a kol., 2014).

Ve studii Tulumoglu a kol. (2013) bylo testováno 20 kmenů rodu Lactobacillus z dětské stolice (věk dětí 4 až 15 let) pro jejich schopnost přežít i za nízkého pH (2; 2,5 a 3), v přítomnosti žlučových solí (0,25; 0,5 a 0,75 % žlučových solí). U kmenů byl testován vliv na růst patogenů a citlivost vůči 13 vybraným antibiotikům. Všechny použité kmeny inhibovaly růst E. coli ATCC11229, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213 a byly rezistentní k teikoplaninu, vankomycinu a bacitracinu. Kmeny produkovaly 70 až 290 mg/1 exopolysacharidů. Dosažené výsledky naznačují, že testy pro produkci exopolysacharidů, toleranci ke žlučovým solím, antimikrobiální aktivitu, antibiotickou rezistenci, agregaci laktobacilů mohou být využity při testování vhodných humánních probiotických kmenů (Tulumoglu a kol., 2013).

Studie Aoudia a kol. (2016) srovnávala tři kmeny rodu Lactobacillus izolované z lidské stolice nebo slin (L. plantarum, L. fermentum). Kmeny tvořily biofilm na abiotickém povrchu s rozdílným množstvím biomasy. Pomocí metody růstu v mikrotitrační destičce s napodobením prostředí GIT bylo zjištěno, že osmolarita a nízká koncentrace žluči výrazně ovlivnila prostorovou organizaci laktobacilů. Kmeny L. plantarum tvořily biofilm i za vysoké koncentrace žluči a hlenu. Dále bylo prokázáno, že supernatant laktobacilů produkoval v biofilmu molekuly, které inhibovaly patogeny vyskytující se v jídle. Supernatant buněk biofilmu, ne však supernatant volných buněk, potlačil produkci tumor nekrotizujícího faktoru a.

Probiotické bakterie či bakteriální biofilm by se mohl využívat při prevenci proti zubnímu kazu. Antimikrobiální aktivita proti ústním streptokokům byla sledována v práci Lee a Kim (2014). Probiotika byla přidána k bakteriím ve slinách, které obsahovaly i Streptococcus mutans. Kmeny

-4CZ 308165 B6 rodu Lactobacillus silně inhibovaly růst ústních streptokoků a tvorbu biofilmu, který přispívá k zubnímu kazu.

Supernatant kultury Lactobacillus casei ATCC334 jak planktonních buněk, tak biofilmu byl použit pro ošetření makrofágních monocytických buněk THP-1. Produkce tumor nekrotizujícího faktoru a byla potlačena pouze v přítomnosti supematantu biofilmové formy kultury (konkrétně GroEL) a bylo potvrzeno, že rozvoj biofilmu u rodu Lactobacillus ovlivňoval imunitní odpověď (Rieu a kol., 2014).

Rozdíl mezi biofilmovou a solitérní buňkou

Práce de Angelis a kol. (2015) porovnává solitérní a biofilmovou formu buněk Lactobacillus plantarum DB200. Buňky rostoucí v biofilmu byly delší a shlukovaly se ve větší míře než solitérní buňky. Poměr mezi spotřebovanou glukózou a syntézou laktátu významně poklesl v „biofilmových podmínkách“. Při srovnání proteomu byl rozdíl 115 bodů u exoproteomu (extracelulámí bílkoviny a bílkoviny buněčné stěny) a 44 bodů u proteomu (cytoplazmatické bílkoviny) mezi oběma formami. Snížená či zvýšená regulace (nejméně 2x) byla zaznamenána u těchto funkčních kategorií: stavba buněčné stěny a katabolické procesy, buněčný cyklus a adheze, transport, glykolýza, metabolizmus uhlovodíků, metabolizmus exopolysacharidů, metabolizmus aminokyselin a bílkovin, biosyntéza mastných kyselin a tuků, metabolizmus nukleotidů a purinu, odpověď na stres, oxidačně/redukční procesy a energetický metabolizmus. Biofilmová kultura vykazovala vysoký stupeň exprese stresových proteinů (např. DnaK, GroEL, ClpP, GroES, kataláza), který jí napomáhá k přežití nepříznivých podmínek v prostředí. U rodu Lactobacillus dochází ke zvýšené syntéze extracelulámích bílkovin a bílkovin (včetně molekulárních chaperonů, enzymů, lipoproteinů), umístěných na povrchu buňky, které jsou zodpovědné za adhezi při růstu ve formě biofilmu.

Rozdílná morfologie biofilmů L. plantarum subsp. plantarum JCM 1149, L. brevis JCM1059 a L. fructivorans JCM 1117 na krycích sklíčkách byla prokázána (Kubota a kol., 2008). Povrch vytvořených biofilmů (hladký či drsný) i tvar buněk laktobacilů se lišil. Většina buněk L. fructivorans a některé buňky L. brevis byly v biofilmu delší než v suspenzi (solitérní buňky), v případě L. plantarum vykazovaly buňky stejnou morfologii. U kmene L. rhamnosus CRL 1332 a L. reuteri CRL 1324 nebyly zaznamenány žádné změny v morfologii buněk v biofilmu oproti planktonním buňkám (Terraf a kol., 2012). Změny morfologie u části buněk v biofilmu L. plantarum 8-RA-3 vytvořeném na otrubách byly popsány v práci Ushakova a kol. (2012).

Modelový systém pro interakci patogenního a probiotického biofilmu, který mění podmínky prostředí (místní zvýšení koncentrace kyseliny mléčné a snížení pH prostředí) byl vytvořen v práci Eberl a kol. (2010).

Probiotika, probiotické mikroorganizmy

Lidský GIT je osídlen mikrobiálním společenstvem tvořeným stovkami různých druhů. Střevní mikroflóra hraje významnou roli nejenom při trávení potravy, metabolizmu endogenních a exogenních látek a produkci esenciálních vitaminů, ale i při zvyšování imunitní odpovědi organizmu a při prevenci infekcí způsobených patogenními bakteriemi (Gibson a Robefroid, 1995).

Dle definice jsou probiotika živé mikrobiální doplňky stravy, které prospěšně působí na hostitele zlepšováním rovnováhy mikroflóry ve střevě (Fuller, 1989). Aktuálnější definici pro výživu člověka navrhli Salminen a kol. (1998): probiotika jsou živé mikrobiální složky potravy, které jsou zdraví prospěšné. Podle FAO/WFIO (2002) jsou probiotika definována jako živé mikroorganizmy, jejichž podávání hostiteli v adekvátním množství vede ke zlepšení zdraví hostitele.

-5 CZ 308165 B6

Kromě prokázaných terapeutických vlastností musí probiotické mikroorganizmy splňovat další požadavky. Zvláštní důraz je kladen na bezpečnost (Fric, 2007). Jedná se minimálně o tyto vlastnosti: nepatogenní vlastnosti (včetně produkce toxinů), rezistence k žaludečním kyselinám a žluči, adheze na buňky střevního epitelu, schopnost kolonizovat střevo, prokázaný příznivý vliv na hostitele, bezpečnost. Kmeny musí být jednoznačně identifikované a zároveň uložené v mezinárodní sbírce mikroorganizmů.

Bakterie mléčného kvašení

Bakterie mléčného kvašení jsou významné probiotické mikroorganizmy, které působí především v GIT člověka. Zástupci jsou klasifikováni pomocí fenotypových vlastností, morfologie, způsobu fermentace glukózy, růstu při různých teplotách, konfigurace kyseliny mléčné a fermentace sacharidů (Holzapfel a kol., 2001). Mezi probiotické bakterie mléčného kvašení patří rody Lactobacillus, Bifidobacterium a Enterococcus faecium, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Lactococcus lactis (Holzapfel a koi., 2001).

Do skupiny bakterií mléčného kvašení podle novější nomenklatury nepatří rod Bifidobacterium, náleží do zcela jiné větve (Actinobacteria') než ostatní mléčné bakterie. Vzhledem k podobným fýziologickým vlastnostem, způsobu využití v potravinářském průmyslu a také s ohledem na společnou historii bývá do této skupiny přiřazován (Borriello a kol., 2003).

Kultivace probiotických bakterií

Životaschopnost probiotických mikroorganizmů závisí na mnoha faktorech, např. kmeni mikroorganizmu, složení kultivačního média, uchovávání. Pro kultivaci skupiny probiotických laktobacilů se využívá specifické médium, které obsahuje zdroje uhlíku (nejčastěji cukry s krátkým řetězcem - maltóza, sacharóza, glukóza, fruktóza), růstové faktory (zdroje dusíku, peptidy a aminokyseliny, minerály, vitamíny) a má pufrovací kapacitu. Uchování probiotických preparátů závisí na jeho formě - tekutá nebo sušená forma. Příprava tekuté formy probiotik je snazší a může být využita ihned, nevýhodou je kratší životnost preparátů. Sušené kultury (mrazem či sprejově) vyžadují vícekrokový postup, ale životnost preparátu je delší (Puphan a kol., 2013).

Kultivace probiotických laktobacilů probíhá v tekutých bujónech s provzdušňováním či třepáním (Puphan a kol., 2013, Ushalcova a kol., 2012). Nejčastěji se využívá MRS médium, případně jiné médium složené např. z kvasničného extraktu, vitamínů, Tweenu 80, tryptonu, glukózy či jiných zdrojů cukrů (Ling, 2004). Složení média je závislé na použitém kmeni a typu kultivace. Důležitá je při kultivaci rovněž optimalizace pH, aerace, třepání, inokulační dávky a teploty pro daný mikrobiální kmen. Dobrých výsledků pro produkci biomasy u kmene L. rhamnosus ATCC 7469 bylo dosaženo při kontinuální kultivaci oproti vsádkové (statické) kultivaci (Ling, 2004).

Výše zmíněné kultivace probíhají v tekutých médiích za provzdušňování či míchání v baňkách nebo fermentorech, získané buňky jsou tedy ve vznosu v solitérní, nikoli v biofilmové formě.

Tvorba biofilmu je převážně studována na abiotických površích, které mohou být potaženy biologickými molekulami. Nej častěji se využívá statická kultivace v polystyrénové mikrotitrační destičce, průtoková kyveta či kultivace v Petriho misce (Peržinová, 2014). Vznik i množství biofilmu je závislé na kultivačních podmínkách i kmeni mikroorganizmu. Například tvorba biofilmu u kmene L. fermentum izolovaného ze zubního plaku ve skleněné průtokové kyvetě potažené mucinem MUC5B z lidských slin byla prokázána (Wickstrom a kol., 2013).

Metody pro kultivaci biofilmu v laboratorních podmínkách závisí na vybraném mikrobiálním kmeni či společenstvu kmenů (McBain, 2009). Uzavřené systémy používané pro kultivaci jsou: agary, mikrotitrační destičky; otevřené systémy: suspendovaný substrátový chemostat (jakýkoli

-6CZ 308165 B6 substrát, na který se buňky mohou uchytit, přidaný do reaktoru, např. skleněné kuličky, smaltovaná či emailová hmota, biomateriály, skleněná vlna, hydroxyapatitový substrát). Suspendovaný substrátový chemostat má výhodu i v tom, že volné buňky mohou vytvářet biofilm na rozhraní pevné látky a tekutiny. Využití suspendovaného substrátového chemostatu je zejména při studiu zubního, ústního a střevního biofílmu a genové exprese v biofilmu. Tento systém je dostupný i komerčně. Dalším typem jsou průtokové kyvety (možnost mikroskopického monitorování a odnímání částí biofilmu), Robbinsův přístroj, tj. plastová či železná tyč, do které se vsunuje kolíček, CDFF (constant depth film fermenter), DFBR (drip flow biofilm reactor), promývací biofilmový reaktor, promývací membránový reaktor, Sorbarod biofilm reaktor.

Ke kultivaci biofilmu je možné využít řady metod (statická, dynamická i kontinuální kultivace) s tím, že většina metod je využitelná pouze pro laboratorní měřítko. Největším problémem je nedostatek standardizace, obtížné nastavení přesně definovaných podmínek a omezené využití při řešení specifických výzkumných cílů (Peržinová, 2014). Při kontinuální kultivaci probiotik může snáze docházet ke kontaminaci a buňky mohou časem ztrácet své vlastnosti (Lacroix a Yildirim, 2007).

Pro kultivaci bifidobakterií je nutno dodat komplexní hydrogenní substrát (hovězí kasein, syrovátka, kvasničný extrakt). Růst v odstředěném mléce je nízký a kmenově specifický (Doleyeres a Lacroix, 2005). Další možností je kultivace mléčných bakterií a bifidobakterií v imobilizovaném systému - uchycení v polymemí síti, přichycení či adsorpce k nosiči, uchycení k membráně či mikroenkapsulace, což je výhodnější z hlediska zisku biomasy a tvorby metabolitů (hustota buněk, opakované využití biokatalyzátorů, odolnost ke kontaminaci a bakteriofágům, předcházení vymývání při kontinuální kultivaci, fyzikální a chemická ochrana buněk). Dva typy imobilizačních metod byly testovány pro propagaci bifidobakterií: membránové bioreaktory a kuličky z póly sacharidového gelu.

U membránových systémů s kontinuálním průtokem jsou buňky udržovány v systému díky ultrafiltrům či mikrofiltrům (membrány) zatímco malé molekuly přes filtry procházejí. Produkce buněk bifidobakterií jev některých případech až 15x vyšší než při klasické kultivaci v tekutém médiu. Nevýhodou metody je, že buňky nejsou vhodné pro opakované použití z důvodu nízké viability a snížené metabolické aktivity, vysoké pořizovací ceny, údržby a zanášení membrán (Doleyres a Lacroix, 2005, Lacroix a Yildirim, 2007).

Sférické polymemí kuličky (0,3 až 3 mm) se vyrábí lisovací nebo emulzní tepelnou technikou (např. agaróza, želatina) či ionotropní (alginát, chitosan) želatinací kapek. Inkubace imobilizovaných buněk v živném médiu vytváří oblasti s vysokou koncentrací buněk, které se šíří z kuličky. Růst mimo kuličku je limitován nedostatkem substrátu, akumulací inhibičních produktů a nízkým pH. Pokud buňky v kuličce rostou ve formě biofilmu, velké množství buněk se uvolňuje ze svrchní vrstvy do fermentačního média jako následek expanze buněk, kolizí mezi sebou a střižných sil v reaktoru. Limitujícím faktorem imobilizovaných mléčných bakterií a bifidobakterií je inhibice metabolity a hodnotami pH (Doleyres a Lacroix, 2005, Lacroix a Yildirim, 2007). Tento typ kultivace umožňuje výrobu směsné kultury v případně nezávislé imobilizace více druhů, např. Bifidobacterium longum a Lactococcus lactis, v závislosti na teplotě a době kultivace (Doleyres a Lacroix, 2005).

Podstata vynálezu

Nedostatky řešení dosavadního stavu techniky zvláště v oblasti zlepšení adheze probiotik ke sliznici řeší probiotická kompozice, která obsahuje alespoň jednu probiotickou kulturu, která je alespoň částečně ve formě biofilmu na nosiči. Výrazně lepší adhezi kompozice zajišťuje především díky přítomnosti fixační složky, kterou je hydroxypropylmethylcelulóza. Ta je součástí nosiče určeného ke kultivaci probiotických kultur. Podstatou nosiče podle vynálezu je, že obsahuje koloidní SiCL, prebiotickou složku a hydroxypropylmethylcelulózu (dále HPMC).

-7CZ 308165 B6

Podle dalšího provedení nosiče podle vynálezu je množství koloidního S1O2 0,001 až 50 % hmota., s výhodou 0,1 až 5 % hmota., množství probiotické složky je 0,01 až 99 % hmota, s výhodou 10 až 60 % hmota, a množství hydroxypropylmethylcelulózy je 0,1 až 95 % hmota, s výhodou 5 až 60 % hmota. Povrch koloidního S1O2 dosahuje hodnoty v rozsahu 2 m²/g až 200 m²/g. Prebiotická složka obsažená v nosiči podle vynálezu je vybrána ze skupiny zahrnující inulin, dextrin, maltodextrin, kukuřičný škrob, bramborový škrob, fruktooligosacharidy, galaktooligosacharidy, ovocné extrakty, zeleninové extrakty, obilné extrakty, luštěninové extrakty, lyofilizované ovoce, s výhodou banán; lyofilizovanou zeleninu, s výhodou mrkev nebo dýni; nebo jejich směsi.

Probiotická kompozice podle vynálezu obsahuje alespoň jednu probiotickou kulturu kultivovanou s nosičem v množství 1.10³ až 1.10¹⁴ CFU na 1 g finální kompozice, ve výhodném množství IxlO⁹ CFU/g a nosič podle vynálezu v množství alespoň 0,001 % hmota., přičemž probiotická kultura je alespoň částečně ve formě biofilmu přilnutého k nosiči. Obsah nosiče v kompozici podle vynálezu je s výhodou 0,01 až 10 % hmota.

S výhodou alespoň 0,1 až 100 % hmota, probiotické kultury přilnuté k nosiči (ve formě biofilmu), s výhodou 10 až 60 % hmota. Probiotická kultura by neměla být kontaminována.

Podle dalšího provedení vynálezu jsou kmeny probiotické kultury vybrány ze skupiny zahrnující rod Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Saccharomyces, Enterococcus nebo jejich směsi.

Podle ještě dalšího provedení vynálezu kompozice dále obsahuje vitamíny, minerály, rostlinné extrakty, standardně kultivovanou probiotickou kulturu nebo směsi kultur, a jiné fýziologicky prospěšné substance či látky s prebiotickým potenciálem v maximálním množství do 99 % hmota.

Standardně kultivované probiotické kultury nebo směsi kultur jsou takové kultury, které nejsou kultivovány na nosiči podle vynálezu. Množství standardně kultivované probiotické kultury nebo směsi kultur je alespoň 1.10⁴ CFU na 1 g finální kompozice.

Podle dalšího provedení, je kompozice ve formě tablety, tobolky, pulvisu, gelu, roztoku nebo granulátu.

Potravinářský, kosmetický, hygienický, farmaceutický nebo veterinární výrobek obsahující kompozici podle vynálezu.

Pro účely tohoto vynálezu jsou v textu používány výrazy, které jsou definovány níže:

Biofilm je struktura skládající se z jedno vrstevného nebo mnoho vrstevnatého seskupení bakteriálních buněk jednoho nebo více bakteriálních druhů, které jsou usazeny v amorfním extracelulámím materiálu složeném zejména z exopolysacharidu nebo exopolysacharidů (EPS) bakteriálního původu, který pevně přilepuje buňky k povrchu nosiče a k sobě navzájem. Hmota. % jsou vztažena k celkové hmotnosti nosiče nebo kompozice.

Bakterie usazené v biofilmu se vyznačují vyšší odolností vůči negativním vlivům vnějšího prostředí než bakterie v suspenzi, což má v praxi vliv na stabilitu produktu a jeho biologický účinek, což je dáno tím, že bakterie v živých systémech standardně tvoří biofilmovou strukturu. Také morfologie, fýziologie a metabolické produkty biofilmu jsou odlišné a specifické oproti planktonním formám téže kultury.

Nosičem se zde míní směs koloidního S1O2 s prebiotickou látkou nebo jejich směsí a hydroxypropylmethylcelulózou.

Koloidní S1O2 má vysoký povrch dosahující hodnoty až 200 m²/g a vysokou afinitu k hydrofilním molekulám, díky čemuž slouží jako vysoce adheživní podklad pro kultivaci bakterií adherujících ve vysoké míře na částici. Prebiotická složka podporuje růst a životaschopnost kultury a HPMC má funkci fixačního agens.

Nejdříve se kultivační médium s nosičem a inokulačním roztokem obsahujícím probiotickou kulturu kultivuje při teplotě 20 až 40 °C do doby, kdy je alespoň 0,5 % hmota, nosiče pokryto probiotickou kulturou, poté se směs zkoncentruje a vysuší. Ve výhodném provedení se nejprve kultivační médium sterilizuje společně s nosičem, pak se do média přidá inokulační roztok obsahující probiotickou kulturu, následně se směs kultivuje při teplotě 30 až 40 °C po dobu 8 až 48 hodin, a nakonec se směs zkoncentruje a vysuší.

Kultivační médium, které je možné použít, může být vybráno ze skupiny zahrnující sterilní mléko nebo syrovátku nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kasein hydrolyzátu nebo peptonu, jako je např. Man-Rogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton. Kultivaci probiotické kultury lze provádět v jednom kultivačním médiu nebo ve směsi kultivačních médií nebo s výhodou postupně ve dvou nebo více různých kultivačních médiích nebo jejich směsích. Kultivace může probíhat staticky nebo s mícháním nebo kombinovaně, tj. po určitou dobu staticky a po určitou dobu s mícháním.

/koncentrování může proběhnout například formou odstředění nebo ultrafiltrace a sušení může proběhnout například formou sušení na fluidní sušárně nebo lyofilizací.

S výhodou se zkoncentrovaná kompozice suší společně s přídavkem protektivní látky vybrané ze skupiny zahrnující maltodextrin, inulin, rozpustnou i nerozpustnou vlákninu, škrob, fruktooligosacharidy, karagenan, galaktooligosacharidy, glukooligosacharidy, manitol, trehalózu nebo jejich směsi, což usnadní sušení, zvýší výtěžek a usnadní následnou práci s materiálem.

Po sušení může následovat lisování kompozice do tablet, plnění do tobolek nebo plnění kompozice ve formě pulvisu či granulátu do sáčků či nádob nebo nápojů.

Kompozice podle vynálezu najde uplatnění například jako humánní i veterinární doplněk stravy, zvláštní výživa, potravina, nápoj, léčivo, zdravotnický prostředek, kosmetický a hygienický produkt, veterinární krmivo a doplněk s obsahem probiotických kultur.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Probiotická kultura Lactobacillus acidophillus je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 100 ml MRS média. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 16 až 24 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do dvoulitrového fermentoru s předem vysterilizovanými dvěma litry kultivačního média, jako je sterilní mléko nebo syrovátka nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzáta, jako je např. Man-Rogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton a jiná. Médium je předem vysterilizováno s kombinovaným nosičem, kterým je základní nosič na bázi siliky s povrchem minimálně 10 m²/g (3 % hmota.), HPMC (47 % hmota.) a mrkvovým extraktem = prebiotickou složkou (50 % hmota.). Kultivace probíhá při 37 °C po dobu 24 hodin při otáčkách 90 rpm. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 5

-9CZ 308165 B6 % hmoto, nosiče bakteriemi alespoň z 5 % povrchu nosiče, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizuje s přídavkem 40 % hmota, maltodextrinu. Případně se obdobně nakultivuje kmen Bifidobacterium longum (s ohledem na druh vhodného kultivačního média) a získané lyofilizáty se homogenně smísí.

Příklad 2

Fáze přípravy nosiče

0,3 g koloidní siliky s povrchem min. 2 m²/g se důkladně promíchá s 30 g jemně namleté lyofilizované mrkve a 10 g HPMC. Směs se zvlhčí 25 ml vody. Vzniklá kašovitá substance se důkladně promíchá a suší při 85 °C do zbytkové vlhkosti 2 až 7 %. Následuje přesíťování přes 0,1 až 0,5 mm síto. Vzniklý komplex se suší a sterilizuje v horkovzdušné sušárně při teplotě 150 °C po dobu 6 hodin.

Fáze kultivace

Probiotická kultura Streptococcus salivarius je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 100 ml MRS média. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 16 až 24 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do dvoulitrového fermentoru s předem vysterilizovanými dvěma litry kultivačního média, jako je sterilní mléko nebo syrovátka nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu, jako je např. Man-Rogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton a jiná. Médium je předem vysterilizováno s kombinovaným nosičem, kterým je základní nosič na bázi siliky (3 % hmota.), mrkvový extrakt a HPMC. Následuje statická kultivace bez míchání při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 7 % hmota, nosiče bakteriemi alespoň ze 3 % povrchu nosiče, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizuje. Případně se obdobně nakultivuje kmen Bifidobacterium longum (s ohledem na druh vhodného kultivačního média) a získané lyofilizáty se homogenně smísí.

Příklad 3

Fáze přípravy nosiče g koloidní fůmózní siliky se důkladně promíchá s 30 g jemně namleté lyofilizované nebo sušené mouky z banánu, která má funkci prebiotika a 80 g HPMC. Směs se zvlhčí 65 ml vody. Vzniklá kašovitá substance se důkladně promíchá a suší při 85 °C do zbytkové vlhkosti 2 až 8 %. Následuje přesíťování přes 0,5 mm síto. Vzniklý komplex lze sterilizovat v horkovzdušné sušárně při teplotě 150 °C po dobu 5 hodin.

Fáze kultivace

Probiotická kultura Lactobacillus acidophillus je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 100 ml MRS média. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 16 až 24 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do čtyřlitrového fermentoru s předem vysterilizovanými dvěma litry kultivačního média, jako je sterilní mléko nebo syrovátka nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu, jako je např. Man-Rogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose

- 10 CZ 308165 B6

Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton a jiná. Médium je předem vysterilizováno s kombinovaným nosičem, kterým je základní nosič na bázi siliky (3 % hmoto.) s mrkvovým extraktem. Následuje kultivace za současného míchání při 90 rpm při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 0,5 % hmoto, nosiče bakteriemi alespoň z 0,1 % povrchu nosiče, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizuje. Případně se obdobně nakultivuje kmen Bifidobacterium longum a Streptococcus thermophilus (s ohledem na druh je nutné zvolení vhodného kultivačního média) a získané lyofilizáty se homogenně smísí.

Příklad 4

Fáze přípravy nosiče

0,4 g koloidní siliky se důkladně promíchá s 80 g jemně namleté lyofilizované mrkve, 2 g čekankového mulinu a 40 g HPMC. Směs se zvlhčí 80 ml vody a následně přidají se 2 g alginátového gelu. Vzniklá kašovitá substance se důkladně promíchá v mlýnku a suší při 85 °C do zbytkové vlhkosti 2 až 4 %. Následuje přesíťování přes 0,5 mm síto. Vzniklý komplex lze sterilizovat v horkovzdušné sušárně při teplotě 150 °C po dobu 6 hodin.

Fáze kultivace

Probiotická kultura Bifidobacterium bifidum je anaerobně pomnožena na pevném MRS médiu s cysteinem při teplotě 37 °C po dobu 24 až 48 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 100 ml MRS média s cysteinem. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 16 až 24 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do dvoulitrového fermentoru s předem vysterilizovanými dvěma litry kultivačního média, jako je sterilní mléko nebo syrovátka nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu, jako je např. Man-Rogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton a jiná. Médium je předem vysterilizováno s kombinovaným nosičem, kterým je základní nosič na bázi siliky (3 % hmota.) s mrkvovým extraktem utvářející kompaktní částice za použití alginátového gelu. Následuje kultivace za současného míchání při 90 rpm při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 30 % hmota, nosiče bakteriemi alespoň z 10 % povrchu nosiče, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizuje. Obdobně je nakultivován kmen Bifidobacterium infantis a Streptococcus thermophilus (s ohledem na druh vhodného kultivačního média) a získané lyofilizáty se homogenně smísí a použijí k výrobě pulvisu, kdy 50 % hmota, tvoří maltodextrin, 40 % hmota, inulin a 10 % hmota, směs probiotických kultur v poměru 1:1:1.

Příklad 5

Fáze přípravy nosiče

0,3 g koloidní siliky se důkladně promíchá s 10 g bramborového rezistentního škrobu (nestravitelný škrob) a 1,5 g HPMC. Směs se zvlhčí 4 až 8 ml vody. Vzniklá kašovitá substance se důkladně promíchá a lyofilizuje do zbytkové vlhkosti 2 až 3 %. Následuje rozemletí na malé částice na tříštivém mlýnku. Vzniklý nosič je následně sterilizován v horkovzdušné sušárně při 180 °C po dobu 120 min.

Fáze kultivace

- 11 CZ 308165 B6

Probiotická kultura Streptococcus salivarius je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 100 ml MRS média. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 16 až 24 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do dvoulitrového fermentoru s předem vysterilizovanými dvěma litry kultivačního média, jako je sterilní mléko nebo syrovátka, sterilní odtučněné mléko, nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu, jako je např. Man-Rogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton a jiná. Médium je předem vysterilizováno s kombinovaným nosičem, kterým je základní nosič na bázi siliky (4,5 % hmota.), rezistentního bramborového škrobu a HPMC (hydroxypropylmethylcelulózy) (9 % hmota.). Následuje kultivace za současného míchání při 90 rpm při teplotě 37 °C po dobu 36 hodin. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 1 % nosičů bakteriemi, lze kultivaci ukončit. Optimálně je pokryto min 10 % hmota, nosiče alespoň z 5 % povrchu nosiče. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizuje. Obdobně je nakultivován kmen Bifidobacterium longum a Lactobacillus rhamnosus (s ohledem na druh vhodného kultivačního média) a získané lyofilizáty se homogenně smísí.

Příklad 6

Fáze přípravy nosiče

0,2 g koloidní siliky se důkladně promíchá s 3 g jemně namleté sušené banánové mouky a 0,5 g HPMC. Směs se zvlhčí 4 ml vody. Vzniklá kašovitá substance se důkladně promíchá a suší v horkovzdušné sušárně při 85 °C do zbytkové vlhkosti 2 až 4 %. Následuje přesíťování přes 0,5 mm síto.

Fáze kultivace

Probiotická kultura Lactobacillus acidophillus je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 100 ml MRS média. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 16 až 24 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do dvoulitrového fermentoru s předem vysterilizovanými dvěma litry kultivačního média, jako je sterilní mléko nebo syrovátka nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu, jako je např. Man-Rogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton a jiná. Médium je předem vysterilizováno s kombinovaným nosičem, kterým je základní nosič na bázi siliky (3 % hmota.), HPMC (30 % hmota.) a sušenou banánovou moukou (67 % hmota.). Následuje kultivace za současného míchání při 90 rpm při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 10 % nosičů bakteriemi, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizuje. Obdobně je nakultivován kmen Bifidobacterium longum a Streptococcus thermophilus (s ohledem na druh vhodného kultivačního média) a získané lyofilizáty se homogenně smísí ideálně v poměru 1:1.

Fáze výroby finálního produktu:

Sušená probiotická kultura Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus acidophilus, každá kultura s koncentrací min. IxlO⁸ CFU/g, jsou smíchány v poměrech 5 % hmota., kdy tvoří 20 % základu kasploviny. Nosič v každé probiotické kultuře tvoří po zakoncentrování minimálně 0,1 % hmota. Následně je do směsi přidáno 7 % hmota, krystalické celulózy, 1 % hmota, stearanu hořečnatého, 1 % hmota, talku, 1 % hmota.

- 12 CZ 308165 B6 kyseliny askorbové a 40 % hmota, granulovaného čekankového inulinu a 30 % hmota, kukuřičného škrobu - maltodextrinu Takto připravená směs je plněna do tvrdých želatinových tobolek.

Příklad 7

Probiotická kultura Lactobacillus acidophilus je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 100 ml MRS média. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 16 až 24 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do dvoulitrového fermentoru s předem vysterilizovanými dvěma litry kultivačního média, jako je sterilní mléko nebo syrovátka nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu, jako je např. Man-Rogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton a jiná. Médium je předem vysterilizováno s kombinovaným nosičem, kterým je základní nosič na bázi siliky (3 % hmota.) s mrkvovým extraktem. Následuje kultivace za současného míchání při 90 rpm při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 15 % hmota, nosiče bakteriemi alespoň ze 3 % povrchu nosiče, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizuje. Obdobně je nakultivován kmen Bifidobacterium longum a Streptococcus thermophilus (s ohledem na druh vhodného kultivačního média). Po ukončení kultivací jsou získané kultury těchto kmenů smíchány s cílem získání kvalitně promísené směsi kmenů, odstředěny na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizovány.

Fáze výroby finálního produktu:

Sušená probiotická kultura Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilus a Lactobacillus acidophilus, každá kultura s koncentrací min. 1x10⁷ CFU/g, jsou smíchány v poměrech 5 % hmota., kdy tvoří 15 % základu tabletoviny. Tento základ obsahuje minimálně 0,1 % hmota, nosiče. Následně je do směsi přidáno 6 % hmota, krystalické celulózy, 1,5 % hmota, stearanu hořečnatého, 1 % hmota, talku, 1,5 % hmota, kyseliny askorbové a 40 % hmota, granulovaného čekankového inulinu a 35 % hmota, sorbitolu. Takto připravená směs je použita k výrobě tablet.

Příklad 8

Probiotická kultura Lactobacillus acidophilus je pomnožena na pevném MRS médiu při 37 °C po dobu 24 hodin. Následně je odebrána mikrobiologickou kličkou jedna nebo více kolonií a přenesena do 300 ml Erlenmayerovy baňky s předem vysterilizovanými 100 ml MRS média. Kultivace probíhá stacionárně nebo za mírného třepání při 37 °C po dobu 16 až 24 hodin. Následuje převedení obsahu Erlenmayerovy baňky do dvoulitrového fermentoru s předem vysterilizovanými dvěma litry kultivačního média, jako je sterilní mléko nebo syrovátka nebo syntetická komerčně vyráběná média s obsahem kaseinu nebo kaseinhydrolyzátu, jako je např. Man-Rogosa-Sharpe medium, AOAC medium, Trypticase Soy Broth medium, Bacto Proteose Pepton medium, Reinforced Clostridial Broth, Trypton, Pepton a jiná. Médium je po sterilizaci doplněno o sušený kombinovaný nosič, kterým je základní nosič na bázi siliky (3 % hmota.), standardního média dle kultury a agaru. Tento nosič je připravován jako standardní agarové médium s příměsí 3 % hmota, nosiče, následně vysušen, pomlet na drobné komplexní částice a sterilizován zářením. Takto připravený kombinovaný nosič je stabilní a po rehydrataci připraven k přidání do média (rehydratace může proběhnout samovolně již v médiu). Následuje kultivace za současného míchání při 90 rpm při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Průběžně se kontroluje tvorba bakteriálního pokrytí nosičů. V čase, kdy je pokryto minimálně 5 % nosičů bakteriemi, lze kultivaci ukončit. Po ukončení kultivace se kultura odstředí na průtočné odstředivce nebo na ultrafiltračním zařízení a lyofilizuje. Obdobně je nakultivován kmen Bifidobacterium longum a

- 13 CZ 308165 B6

Streptococcus thermophilus (s ohledem na druh vhodného kultivačního média) a získané lyofilizáty se homogenně smísí.

Příklad 9

Příprava nosiče

Nosič určený ke kultivaci probiotických kultur se připraví smícháním adhezivní složky, tj. koloidní S1O2 v množství 0,01 % hmota, s prebiotickou složkou - dýhovou moukou v množství 80 % hmota., a fixační složkou hydroxypropylmethylcelulózou v množství 19,99 % hmota, s výhodou 5 až 60 % hmota. Směs se tabletuje. Vyrobené tablety se rozemelou. Vzniklý prášek představuje nosič, který lze sterilizovat přímo v kultivačním médiu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (10)

1. Nosič určený ke kultivaci probiotických kultur, vyznačující se tím, že obsahuje koloidní S1O2, prebiotickou složku a hydroxypropylmethylcelulózu, přičemž množství koloidního S1O2 je 0,1 až 5 % hmota., množství prebiotické složky je 10 až 60 % hmota, a množství hydroxypropylmethylcelulózy je 5 až 60 % hmota.

2. Nosič podle nároku 1, vyznačující se tím, že povrch koloidní S1O2 dosahuje hodnoty v rozsahu 2 m²/g až 200 m²/g.

3. Nosič podle nároku 1 nebo nároku 2, vyznačující se tím, že prebiotická složka je vybrána ze skupiny zahrnující inulin, dextrin, maltodextrin, kukuřičný škrob, bramborový škrob, fruktooligosacharidy, galaktooligosacharidy, ovocné extrakty, zeleninové extrakty, obilné extrakty, luštěninové extrakty, lyofilizované ovoce, s výhodou banán; lyofilizovanou zeleninu, s výhodou mrkev nebo dýni; nebo jejich směsi.

4. Probiotická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu probiotickou kulturu kultivovanou s nosičem v množství 1.10³ až 1.10¹⁴ CFU na 1 g kompozice a nosič podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 v množství alespoň 3 % hmota., přičemž probiotická kultura je alespoň částečně ve formě biofilmu přilnutého k nosiči.

5. Kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že alespoň 0,1 až 100 % hmota, probiotické kultury je přilnuté k nosiči, s výhodou 10 až 60 % hmota.

6. Kompozice podle nároku 4 nebo nároku 5, vyznačující se tím, že kmeny probiotické kultury jsou vybrány ze skupiny zahrnující rod Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Saccharomyces, Enterococcus nebo jejich směsi.

7. Kompozice podle kteréhokoli z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že dále obsahuje vitamíny, minerály, rostlinné extrakty, standardně kultivovanou probiotickou kulturu nebo směsi kultur, a jiné fyziologicky prospěšné substance.

8. Kompozice podle nároku 7, vyznačující se tím, že množství standardně kultivované probiotické kultury nebo směsi kultur je alespoň 1.10⁴ CFU na 1 g kompozice.

9. Kompozice podle kteréhokoli z nároků 4 až 8, vyznačující se tím, že je ve formě tablety, tobolky, pulvisu, gelu, roztoku nebo granulátu.

- 14 CZ 308165 B6

10. Potravinářský, kosmetický, hygienický, farmaceutický nebo veterinární výrobek obsahující kompozici uvedenou v kterémkoli z nároků 4 až 9.