MX2011000658A - Bacterias y productos derivados para fortalecer las defensas y reducir el riesgo de enfermedad. - Google Patents
Bacterias y productos derivados para fortalecer las defensas y reducir el riesgo de enfermedad.Info
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Abstract
Esta invención aporta una nueva cepa del género Bifidobacterium y los componentes de sus sobrenadantes de cultivo en forma de diversos preparados (alimentos funcionales y nuevos, probióticos, simbióticos, suplementos, nutracéuticos, y fármacos) destinados a mejorar las defensas y reducir el riesgo de enfermedad. Sus mecanismos de acción incluyen: (i) la regulación de la glicosilación intestinal favoreciendo la propia de individuos sanos, (ii) la modulación de las interacciones entre las células epiteliales y la microbiota intestinal, favoreciendo la adhesión de bifidobacterias beneficiosas y (iii) regulando la respuestas inmunológicas. Los productos incluidos son estables en condiciones gastrointestinales y tecnológicas, garantizando su explotación.
Description
BACTERIAS Y PRODUCTOS DERIVADOS PARA FORTALECER LAS DEFENSAS Y REDUCIR EL RIESGO DE ENFERMEDAD
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención pertenece al sector de la Industria Alimentaria y Farmacéutica. Más concretamente, esta invención se enmarca dentro del campo de los probióticos y productos derivados en forma de alimentos funcionales y nuevos alimentos, probióticos, simbióticos, nutracéuticos o suplementos alimentarios y formulaciones farmacéuticas con aplicaciones clínicas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La mucosa del tracto gastrointestinal constituye una de las principales zonas de contacto con agentes ambientales potencialmente nocivos (bacterias, virus, toxinas y alérgenos). Como consecuencia el tracto gastrointestinal ha desarrollado complejos mecanismos de defensa, desempeñando una importante función protectora adicional a la digestiva. La microbiota comienza a adquirirse después del nacimiento, y su composición tiene una gran repercusión en el desarrollo de las funciones fisiológicas del individuo así como en la predisposición a padecer infecciones y patologías de base ¡nmunológica. El género Bifidobacterium es uno de los predominantes en el colon y representa normalmente entre el 3 y el 7% de la microbiota intestinal en adultos y hasta el 91 % en lactantes (Harmsen et al., 2000. Analysis of intestinal flora development in breast-fed and formula-fed infants by using molecular identification and detection methods. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2000 Jan;30(1):61-7.). La menor susceptibilidad de los niños amamantados con leche materna a sufrir enfermedades se considera asociada a su relación con el predominio de bifidobacterias intestinales. Estas bacterias contribuyen al estado de salud del individuo a través de diversos mecanismos como la exclusión de patógenos y la regulación de las respuestas inmunológicas y funciones metabólicas del mismo (Boirivant y Strober 2007. The mechanism of action of probiotics. Curr Opin Gastroenterol. 23:679-692; Sanz et al. 2007 Probiotics as drugs against human gastrointestinal infections. Recent Patents Anti-lnfect Drug Disc. 2 ; 2:148-56; Toba Takahiro et al. 2007. Bifidobacterium or lactic acid bacterium having effect of preventing infection via ss-defensin and food/pharmaceutical composition containing the same. WO2007023912; Petay et al., 2006. Immunomodulatory product obtained from a Bifidobacterium culture and compositions containing the same. EP1615657, etc.). Como consecuencia, cepas del género Bifidobacterium constituyen uno de los principales probióticos comercializados para consumo humano con distintas finalidades.
El mucus que cubre la mucosa intestinal, las células epiteliales, el flujo sanguíneo que la irriga, y las secreciones (fosfolípidos, bilis, péptidos antimicrobianos, etc.) constituyen conjuntamente una barrera protectora innata de naturaleza físico-química (Bourlioux et al. 2002. The intestine and its microflora are partners for the protection of the host. Am J Clin Nutr 2003; 78, 675-683). El mucus intestinal, integrado por mucinas, representa uno de los primeros mecanismos de defensa previo a la activación de las células inmunocompetentes. Las mucinas son glicoproteínas de alto peso molecular secretadas por las células epiteliales (Singh y Hollingsworth 2006. Cell surface-associated mucins in signal transduction Trends in Cell Biol. 16, 467-476). La mucinas pueden estar compuestas por los siguientes hidratos de carbono: N-acetilglucosamina, galactosa, N-acetilgalactosamina, fucosa, ácido N-acetilneuraminico, ácido siálico, mañosa, glucosa y xilosa (Freitas et al. 2005. Indigenous microbes and their soluble factors differentially modulate intestinal glycosylation steps in vivo. Histochem. Cell. Biol. 124: 423-433). Las mucinas están implicadas en el reconocimiento celular, la adhesión e invasión de patógenos, la transducción de señales, y la proliferación y diferenciación de células tumorales (Sudha et al. 2001. Adherence of Shigella dysenteriae 1 to human colonic mucin Curr. Microbiol. 42: 381-387; Leteurtre et al. 2004. Differential mucin expression in colon carcinoma HT-29 clones with variable resistance to 5-fluorouracil and methotrexate Biol.of the cell 96: 145-151 ; Singh y Hollingsworth 2006. Cell surface-associated mucins in signal transduction Trends in Cell Biol. 16: 467-476). La expresión y composición de las mucinas está regulada genéticamente en cada individuo; además, se ha descrito que la microbiota intestinal puede contribuir a su regulación modificando la expresión génica de las enzimas del hospedador implicadas en su síntesis (por ejemplo glicosiltransferasas y glicosidasas) o bien mediante su utilización como nutrientes (Hooper y Gordon. 2001. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science; 292: 1 1 15-1 1 18.). Utilizando animales libres de gérmenes y convencionales se ha demostrado que el proceso de colonización por bacterias comensales favorece la síntesis de glicoconjugados fucosilados [fucosa a(1 ,2)-galactosa ß] en el intestino delgado (Hooper y Gordon. 2001. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science; 292: 1 1 15-11 18). Posteriormente, se demostró que Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 secretaba un compuesto soluble que modificaba el proceso de galactosilación en cultivos celulares y modelos animales; no obstante su posibles efectos beneficiosos sobre la salud no han sido investigados (Freitas et al., 2001 ; Freitas et al., 2005. Indigenous microbes and their soluble factors differentially modulate intestinal glycosylation steps in vivo. Histochem. Cell. Biol. 124: 423-433). Los cambios en la glicosilación pueden favorecer la adhesión y retención de bacterias y antígenos que de otro modo pasarían por el lumen intestinal sin interaccionar con el epitelio. Un determinado patrón de glicosilación puede favorecer la adhesión y colonización de bacterias comensales con efectos beneficiosos sobre la salud, mientras que otro puede aumentar la adhesión de patógenos y la susceptibilidad a infecciones microbianas, o favorecer las enfermedades inflamatorias (alergias, enfermedades inflamatorias intestinales, autoinmunidad, cáncer, etc.). Por ejemplo los receptores que permiten la adhesión de Escherichia coli contienen galactosa y ácido siálico, y los que permiten la adhesión de Helicobacter pylori contienen fucosa por lo que patrones de glicosilación ricos en estos residuos serían buenos receptores para estos patógenos favoreciendo su colonización. Por otro lado, el aumento en el contenido de ácido siálico en los extremos terminales y la reducción de la sulfatación se han asociado a enfermedades inflamatorias intestinales y cáncer (Campbell et al., 2001. Altered glycosylation in inflammatory bowel disease: a possible role in cáncer development. Glycoconj J. 18, 851-8). En algunos estudios los cambios en la glicosilación intestinal se han detectado mediante el uso de lectinas, que son proteínas que unen específicamente determinados residuos de hidratos de carbono, actuando como marcadores de la composición de los glicoconjugados. En el yeyuno de individuos con sensibilidad al gluten se ha detectado unión de la lectina UEA (L-fucosa) pero no en sanos, indicando que los correspondientes residuos de hidratos de carbono eran característicos de la mucosa de los pacientes estudiados (Vecchi et al., 1989. Evidence of altered structural and secretory glycoconjugates in the jejunal mucosa of patients with gluten sensitive enteropathy and subtotal villous atrophy. Gut. 30, 804-10). Estudios más recientes han demostrado que la mucosa de pacientes celiacos presenta una estructura particular que hace que se tiñan fuertemente con la lectina UEA (a 1 ,2-fucosa) y no con la PNA (Gal ß [1 - 3] GalNAc) característica de sanos (Forsberg et al. 2004. Presence of bacteria and innate immunity of intestinal epithelium in childhood celiac disease. Am. J. Gastroenterol. 99:894-904).
Se han atribuido numerosos efectos beneficiosos a cepas del género Bifidobacterium; no obstante, la función de distintas especies de este género en la glicosilación de la mucosa intestinal como mecanismo para modificar el proceso de colonización de la microbiota beneficiosa y su influencia en el riesgo de enfermedad no se ha descrito, tal como se propone en la presente invención. Tampoco se han caracterizado los compuestos bioactivos de origen bacteriano implicados en este proceso, producidos por cepas del género Bifidobacterium, que puedan constituir la base de aplicaciones para mejorar el estado de salud. Los estudios realizados hasta ahora sólo se han centrado en la caracterización de enzimas implicadas en la degradación mucus como fuente de carbono para el crecimiento de estas bacterias en el colon (Ruas- adiedo et al. 2008. Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota. Appl Environ Microbiol. 2008 Jan 25) o en la utilización de prebióticos que administrados a través de la dieta favorezcan su crecimiento y posibilidad de supervivencia (Viscomi, et al. 2006. SI1398369T; Vriesema et al. 2006. WO20061 12714). Por otro lado, existe un método para seleccionar microorganismos que modulen la glicosilación, incluyendo bacterias lácticas; sin embargo, no se han caracterizado los compuestos responsables de estos procesos, ni se han demostrado los efectos beneficiosos que estas modificaciones pueden tener para mejorar la salud (Jean-Michel et al., 2004. Micro-organisms with glycosylation modulating action of intestinal cell surface. 20040058409).
La microbiota intestinal también regula distintos aspectos de la inmunidad innata y adquirida, protegiendo al hospedador frente a las infecciones y procesos de inflamación crónica (por ejemplo enfermedad de Crohn y la enfermedad celiaca) Las células epiteliales y las células presentadoras de antígenos del sistema inmune innato poseen receptores celulares (Toll- like receptors' y 'Nod-like recpetors') capaces de discriminar entre la microbiota comensal y la patógena, induciendo la síntesis de distintos mediadores de la repuesta inmune innata (citoquinas, quemoquinas, moléculas de adhesión, etc.) y de adecuadas respuestas adaptativas
destinadas a combatir al patógeno (Werner y Haller. 2007. Intestinal epithelial cell signalling and chronic inflammation: From the proteome to specific molecular mechanisms. Mutat Res. 1 ;622(1 -2):42-57). La inducción moderada de la síntesis de quemoquinas y citoquinas pro-inflamatorias por bacterias beneficiosas, como las del género Bifidobacterium, puede contribuir a activar las defensas frente a infecciones. Por otro lado, la inducción de la síntesis de altas concentraciones de citoquinas reguladoras y anti-inflamatorias puede ayudar al desarrollo de un correcto equilibrio de las repuestas de los linfocitos Th1/h2 evitando los procesos patológicos de inflamación crónica (Sanz et al. 2007 Probiotics as drugs against human gastrointestinal infections. Recent Patents Anti-lnfect Drug Disc. 2 ; 2:148-56). Dichas propiedades aportan un valor adicional a cepas de Bifidobacterium con miras a su aplicación para mejorar las defensas naturales del hospedador y reducir el riesgo de enfermedad, tal y como se propone en la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Descripción breve
La presente invención aporta una nueva cepa del género Bifidobacterium (IATA-ES2), los compuestos liberados a los sobrenadantes de cultivo y su formulación a modo de diversos preparados (alimentos funcionales y nuevos alimentos, probióticos, simbióticos, suplementos, nutracéuticos, y formulaciones farmacéuticas) con capacidad de modular la composición de las glicoproteínas de las células epiteliales intestinales que constituyen el mucus y representan la primera línea de defensa frente a agentes nocivos. Los productos objeto de la invención favorecen, de este modo, el patrón de glicosilación propio de un intestino sano y la residencia de la microbiota intestinal beneficiosa en detrimento de la perjudicial, reduciendo globalmente el riesgo de enfermedad.
La bifidobacteria objeto de la invención, Bifidobacterium IATA-ES2, fue aislada a partir de heces de lactantes sanos e identificadas por secuenciación del gen del ARNr 16S y del gen tuf con la especie Bifidobacteium bifidum y diferenciada por RAPDs de otras cepas pertenecientes a la misma especie, demostrando su exclusividad. La nueva cepa secreta compuestos capaces de modular el patrón de glicosilación del mucus intestinal, que constituye la primera línea de defensa innata, favoreciendo el patrón de glicosilación propio de un intestino sano caracterizado por una elevada abundancia de residuos galactosil ß(1 -»3) N-acetil galactosamina (Gal ß [1 ->3] GalNAc) demostrado por la alta tinción con la lectína PNA que reconoce estos residuos (Ejemplo 1 , Figura 1). El aumento de la síntesis de estos residuos por acción de bifidobacterias o sus metabolitos u otras bacterias no ha sido demostrado en ninguno de los estudios precedentes (Freitas et al., 2001. A heat labile soluble factor from Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 specifically increases the galactosylation pattern of HT29-MTX cells. Cell Microbiol. 3:289-300; Freitas et al. 2005. Indigenous microbes and their soluble factors differentially modulate intestinal glycosylation steps in vivo. Histochem. Cell. Biol. 124: 423-433). Por el contrario, esta cepa no favorece especialmente la presencia de residuos como la fucosa a (1 ,2) Gal ß (1 ,4) GIcNAc, cuya abundancia es propia de pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas (como la enfermedad celíaca) y que favorecen la adhesión de patógenos como Helicobacter pylori, y se caracterizan por teñirse con la lectina UEA-I.
La modificación del patrón de glicosilación producido por la cepa y productos secretados al medio actúa también favoreciendo la adhesión de especies de bifidobacterias beneficiosas típicas de niños lactantes y utilizadas como probióticos, como 8. longum bv longum, B. longum bv infantis, B breve, B. bifidum y B. animalis, y reduciendo la adhesión de bacterias patógenas y pro-inflamatorias como Shigella (Ejemplo 2; Figura 2). El aumento de adhesión más significativo a células epiteliales es el de la propia cepa objeto de la patente, demostrando un relación de simbiosis con el hospedador que favorecería su propia colonización. Los compuestos con actividad biológica secretados por la bifidobacteria objeto de la invención son de naturaleza proteica, y su masa molecular determinada por ultrafiltración es mayor de 30 kDa.. Sus características bioquímicas no coinciden con las descritas con anterioridad en el caso de los productos secretados por Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 (Freitas et al., 2005. Indigenous microbes and their soluble factors differentially modulate intestinal glycosylation steps in vivo. Histochem. Cell. Biol. 124: 423-433).
La bifidobacteria objeto de la invención también (vivas e inactivadas) y sus sobrenadantes poseen propiedades inmunoreguladoras y anti-inflamatorias caracterizadas por estimular la síntesis de altas concentraciones de IL-10, y moderadas de citoquinas pro-inflamatorias IL8, TNF-alpha e IFN-? en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y epiteliales HT29-MTX. Además, esta cepa reduce ligeramente la expresión de los marcadores de activación de superficie de las PBMCs como los co-receptores CD4.y CD8 y la molécula co-estimuladora CD86, evitando una activación excesiva de la población de linfocitos T. La cepa ß. bifidum ES-2 induce, globalmente, la síntesis de mediadores de la inflamación en proporciones equilibradas, lo que le permitiría activar las defensas de forma controlada evitando el desarrollo de procesos de inflamación excesivos y crónicos.
La cepa objeto de la invención y los productos secretados toleran las condiciones gastrointestinales y los procesos tecnológicos, garantizado así su explotación comercial. Su formulación incluye y sin que limite el alcance de la invención su incorporación a alimentos funcionales, nuevos alimentos, suplementos, nutracéuticos, prebióticos, simbióticos y
formulaciones farmacéuticas de forma individual o combinada con otros
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microorganismos o ingredientes funcionales de otra naturaleza.
Globalmente, la invención constituye un método natural para mejorar las defensas naturales del individuo y reducir el riesgo de enfermedad con diversas aplicaciones, tanto dirigidas a la población general, como a grupos de riesgo de padecer enfermedades específicas como infecciones o enfermedades inflamatorias crónicas. Está especialmente indicada para grupos de población con bajas defensas como los niños y ancianos o con necesidades específicas, ya que puede favorecer la colonización de bifidobacterias propias de lactantes que aumentan nuestras defensas y regulan nuestro sistema inmunológico. También posee la ventaja de no tener efectos secundarios a diferencia de las estrategias farmacológicas (antibióticos, anti-inflamatorios, inmunosupresores, etc.)
Descripción detallada
El objeto de la presente invención es un microorganismo útil para la producción de formulaciones que mejoran las defensas del individuo y reducen el riesgo de padecer enfermedades, preferentemente las infecciones microbianas y las enfermedades de base inmunológica, mediante su capacidad para modular la composición del mucus y sus interacciones con la microbiota intestinal, caracterizado por ser un microorganismo no modificado genéticamente, aislado y seleccionado de la flora intestinal natural de individuos sanos. En adelante microorganismo objeto de la presente invención.
La invención comprende un microorganismo y su uso para mejorar las defensas del individuo y reducir el riesgo de enfermedad con diversas aplicaciones, tanto dirigidas a la población general, como a grupos de riesgo de padecer enfermedades específicas como infecciones o
enfermedades inflamatorias crónicas. Está especialmente indicada para grupos de población con bajas defensas, como los niños y ancianos, o con necesidades específicas ya que puede favorecer la colonización de bifidobacterias propias de lactantes que aumentan nuestras defensas y regulan nuestro sistema inmunológico. También posee la ventaja de no tener efectos secundarios a diferencia de las estrategias farmacológicas (antibióticos, anti-inflamatorios, inmunosupresores, etc.).
El microorganismo objeto de la presente invención comprende esencialmente una cepa del género Bifidobacterium. Las ventajas de la bifidobacteria específicamente seleccionada para la formulación de preparados farmacéuticos, probióticos, simbióticos, nutracéuticos o alimentos funcionales destinados a aumentar las defensas del individuo son múltiples. Las bifidobacterias tienen una habilidad especial para colonizar el tracto intestinal de los recién nacidos, contribuyendo de forma significativa al desarrollo de sus mecanismos de defensa (inmunológicos y de otra naturaleza) y a la tolerancia oral a los antígenos de la dieta y a los microorganismos comensales. Este grupo bacteriano es uno de los constituyentes mayoritarios de la microbiota intestinal en los primeros años de vida favorecido por la lactancia materna (representando hasta el 91 %) y su predominio se asocia a una mayor resistencia a las infecciones y menor susceptibilidad a enfermedades de base inmunológica (Harmsen, et al. 2000. Analysis of intestinal flora development in breast-feed and formula-feed infants by using molecular Identification and detection methods. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30: 61 -67; Biavati, et al. 2001. The family Bifidobacteriaceae. In: Dworkin, et al. (eds.), The Prokaryotes. pp. 1-70. Springer, Nueva York). Asimismo, las cepas del género Bifidobacterium se consideran globalmente inductoras de respuestas inmunológicas reguladoras, con un carácter menos pro-inflamatorio que los lactobacilos y otras bacterias comensales (Zeuthen et al. 2006. Lactic acid bacteria inducing a weak interleukin-12 and tumor necrosis factor alpha response in human dendritic cells inhibit strongly stimulating lactic acid bacteria but act synergistically with gram-negative bacteria. Clin Vaccine Immunol. 13(3):365-75).
Un objeto particular de la presente invención consiste en la aportación de una nueva cepa de la especie Bifidobacterium bifidum, y en particular Bifidobacterium IATA-ES2. Un cultivo de Bifidobacterium IATA-ES2 ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjassot (Valencia), el día 20 de diciembre de 2007, correspondiéndole el número de depósito CECT 7365. Esta cepa pertenece a la especie S. bifidum de acuerdo con la homología de la secuencia del gen del ARNr 16S y del gen tuf con otras actualmente disponibles en las bases de datos (GenBank). Constituye un ejemplo de una cepa de esta especie que posee las propiedades y aplicaciones objeto de la invención.
Como ejemplo, y sin. que limite el alcance de la invención, la cepa ha sido aislada a partir de heces de lactantes sanos e identificadas por secuenciación del gen del ARNr 16S. El fragmento secuenciado (1304 bases) se amplificó por PCR utilizando los cebadores Y1f y 1401 r y para la secuenciación se empleó además el cebador 530f, de acuerdo con los procedimientos descrito por otros autores (Satokari et al., 2001 . Bifidobacterial Diversity in Human Feces Detected by Genus-Specific PCR and Denaturating Gradient Gel Ejectrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 67, 504-513; Favier et al. 2002. Molecular Monitoring of Sucesión of Bacterial Communities in Human Neonatos. Appl. Environ. Microbiol. 68, 219-226). Mediante el alineamiento de la secuencia obtenida con las existentes en las bases de datos se detectó máxima similitud con las secuencias equivalentes de cepas de la especie B. bifidum. La máxima identidad (99%) se obtuvo con la cepa Bifidobacterium bifidum KCTC 3202 depositada en el GenBank (número de acceso U25952.1 ). Asimismo, se
ha confirmado la identidad mediante secuenciación del gen tuf. El fragmento secuenciado se amplificó por PCR utilizando los cebadores Btu y Btuf-2 de acuerdo con los procedimiento descrito por otros autores (Ventura et al., 2003. Analysis, characterization, and loci of the tuf genes in lactobacillus and Bifidobacteríum species and their direct application for species Identification. Appl Environ Microbiol. 2003 Nov;69(1 1 ):6908-22). Al igual que en el caso anterior, mediante el alineamiento de la secuencia obtenida (392 pb) con las existentes en las bases de datos se detectó máxima similitud (100%) con la secuencia equivalente de la cepa S. bifidum ATCC 29521 depositada en el GenBank (número de acceso AY372041.1 ).
La diferenciación de esta cepa de otras de la misma especie se realizó mediante el estudio del perfil de ADN obtenido por PCR realizando amplificaciones aleatorias con cebadores inespecíficos (RAPDS). Por ejemplo, el uso de la técnica de RAPD con el cebador M13 permitió diferenciar la cepa ES-2 de otras dos cepas de la misma especie aisladas en el laboratorio y de la cepa de colección B. longum LMG 1041T en al menos 3 bandas de ADN. Esto indica que se aporta una cepa exclusiva.
La nueva cepa objeto de esta invención sintetiza y secreta al medio de cultivo compuestos que modulan la composición en carbohidratos de los glicoconjugados que forman el mucus intestinal y esto conlleva modificaciones en las interacciones con la microbiota intestinal
La cepa objeto de la invención produce compuestos capaces de modular el patrón de glicosilación del mucus intestinal, que constituye la primera línea de defensa innata, favoreciendo el patrón de glicosilación propio de un intestino sano caracterizado por una elevada abundancia de residuos galactosil ß(1 ->3) N-acetil galactosamina demostrado por la alta tinción con la lectina PNA que reconoce estos residuos (Ejemplo 1 , Figura 1 ). Por ejemplo, en células HT29-MTX que constituyen un modelo de células intestinales, la adición del sobrenadante libre de células de un cultivo de Bifidobacterium IATA-ES2 da lugar a una tinción con la lectina PNA hasta 7 veces superior a la detectada en el control (MRS) y con los sobrenadantes de cultivo de otras especies de bifidobacterias, como B. animalis, B. longum y S. breve. El aumento de la síntesis de estos residuos a los que se une la lectina PNA por acción de otras bacterias o sus metabolitos no ha sido demostrado en ninguno de los estudios precedentes (Freitas et al., 2001 . A heat labile soluble factor from Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 specifically increases the galactosylation pattern of HT29-MTX cells. Cell Microbiol. 3:289-300; Freitas et al. 2005. Indigenous microbes and their soluble factors differentially modulate intestinal glycosylation steps in vivo. Histochem. Cell. Biol. 124: 423-433). Por el contrario, esta cepa no favorece especialmente la síntesis de residuos propios de pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo la enfermedad celíaca) como la Fucosa a (1 ,2) Gal ß (1,4) GIcNAc caracterizados por alta tinción con la lectina UEA-I y que también favorece la adhesión de patógenos como Helicobacter pylori (Ejemplo 1 ).
La modificación del patrón de glicosilación producido por la cepa y productos secretados al medio actúa también favoreciendo la adhesión de especies de bifidobacterias beneficiosas típicas de niños lactantes y probióticos, como B. longum bv longum, B. longum bv infantis, B breve, B. bifidum y S. animalis, y reduciendo la adhesión de patógenos oportunistas o potencialmente pro-inflamatorias como Shigella. (Ejemplo 2; Figura 2). El aumento de adhesión más significativo a células epiteliales es el de la propia cepa objeto de la invención, demostrando un relación de simbiosis con el hospedador que favorece su propia colonización.
La nueva cepa produce compuestos capaces de modular la composición del mucus y sus interacciones con la microbiota intestinal. Los compuestos con actividad biológica secretados por la bifidobacteria al medio de cultivo son de naturaleza proteica, ya que su actividad se destruye por incubación como proteasas como la proteinasa K, pero no por incubación en presencia de amilasas ni de lipasas. Su masa molecular determinada por filtración es mayor de 30 kDa. Sus características bioquímicas, por tanto, no coinciden con las descritas con anterioridad para los productos secretados por Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 (Freitas et al., 2005. Indigenous microbes and their soluble factors differentially modulate intestinal glycosylation steps in vivo. Histochem. Cell. Biol. 124: 423-433).
Además, la bifidobacteria objeto de la invención (viva o inactivada) y los productos secretados al medio de cultivo poseen propiedades inmunoreguladoras y anti-inflamatorias caracterizadas por estimular la síntesis de altas concentraciones de IL-10, y moderada de citoquinas pro-inflamatorias como el TNF-a, e IFN-? en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), y también moderada de la quemoquina IL8, en células HT29-MTX (Ejemplo 3, Tabla 1 ). La estimulación de la síntesis de citoquinas pro-inflamatorias (por ejemplo TNF-a, IFN-?) y de la quemoquina IL-8 que atrae células fagocíticas para activar las defensas frente a patógeno, es inferior a las generadas por bacterias Gram-negativas como Bacteroides y otras bifidobacterias evaluadas, y por el contrario la síntesis de la citoquina anti-inflamatoria IL-10, que evitaría una activación excesiva de los mediadores de la inflamación, es superior a la detectada en la mayoría de cepas. Además, esta cepa reduce la expresión de los marcadores de activación de superficie de las PBMCs como por ejemplo los co-receptores CD4 y CD8 y la molécula co-estimuladora CD86, evitando una activación excesiva de la población de linfocitos T citotóxicos y T colaboradores. Así, se demuestra que la cepa B. bifidum ES-2, globalmente, induce la síntesis de mediadores de la inflamación en proporciones equilibradas, lo que le permitiría activar las defensas de forma controlada evitando el desarrollo de procesos de inflamación excesivos y crónicos.
El microorganismo objeto de la invención pertenece a una de las especies del género Bifldobacteríum identificada predominantemente en niños y a la que se atribuyen propiedades beneficiosas para la salud del recién nacido, así como administrada en forma de probiótico a otros grupos de población, de forma individual o combinada con otros pro- y prebióticos. Por ejemplo, la administración de una cepa de la especie B. bifidum combinada con otros prebióticos fue efectiva para el tratamiento de la diarrea aguda en niños (Canani et al., 2007 Probiotics for treatment of acute diarrhoea in children: randomised clinical trial of five different preparations. BMJ. 2007 Aug 18;335(7615):340), una combinación de Lactobacillus acidophilus y 8. bifidum mostró eficacia significativa en la prevención de la diarrea del viajero (McFarland . 2007. Meta-analysis of probiotics for the prevention of traveler's diarrhea. Travel Med Infecí Dis. Mar;5(2):97-105), la administración de B. bifidum Bb12 a adultos aumentó la capacidad fagocítica frente a patógenos (Schiffrin et al. , 1997. Immune modulation of blood leukocytes in humans by lactic acid bacteria: criteria for strain selection. Am J Clin Nutr. 1997 Aug; 66(2):515S-520S). El consumo de Lactobacillus gasseri PA 16/8, 8. longum SP 07/3, 8. bifidum MF 20/5 durante 3 semanas redujo los episodios y duración del resfriado común (De Vrese, et al., 2005. Effect of Lactobacillus gasseri PA 16/8, Bifidobacterium longum SP 07/3, 8. bifidum MF 20/5 on common cold episodes: a double blind, randomized, controlled trial. Clin Nutr. 2005 Aug;24(4):481-91 ).
La cepa objeto de la invención presenta una supervivencia superior al 50% tras su incubación en condiciones gástricas (solución salina con 3g/l de pepsina, ajustada a pH 3,0) y una capacidad de crecimiento del 70% en
presencia de las concentraciones de bilis presentes en el intestino delgado (0,5 % oxgall, Sigma), lo que confirma que es capaz de mantener su viabilidad y actividad metabólica en condiciones gastrointestinales y, por tanto, su posible uso como probiótico. También es capaz de crecer en matrices alimentarias, como la leche, que puedan actuar como vehículo del probióticos y ser origen de nuevos alimentos funcionales. La cepa objeto de la invención también resiste la liofilización, lo que asegura su comercialización y posible administración en forma, entre otras, de preparados farmacéuticos.
Los productos activos liberados al medio de cultivo, descritos anteriormente, son estables a los tratamientos industriales y de conservación como por ejemplo y sin que limite el alcance de la invención la congelación, la concentración por filtración, cromatrografía, congelación y liofilización, lo que permite su formulación en forma de diversos preparados. El hecho de que los compuestos activos sean secretados al medio de cultivo por la cepa objeto de la invención hace que su aplicación no requiera necesariamente el mantenimiento de la viabilidad de la bacteria en el producto en el que se comercialice, ampliando el número de aplicaciones industriales.
Las formulaciones elaboradas mediante el microorganismo objeto de la presente invención puede desarrollarse industrialmente dando lugar a, entre otras y sin que limite el alcance de la invención, diferentes formas de presentación al consumidor: alimentos, alimentos nuevos suplementos, nutracéuticos, preparados farmacéuticos, probióticos y/o simbióticos.
Un objeto particular de la presente invención comprende el uso del microorganismo de la presente invención o los compuestos bioactivos derivados en la elaboración de formulaciones en forma de un alimento. De esta manera el microorganismo objeto de la presente invención, formaría parte de un alimento formulado para aportar, más allá de su valor nutricional habitual, un efecto beneficioso sobre la reducción de riesgos de padecer enfermedades.
Otro objeto particular de la presente invención comprende el uso del microorganismo objeto de la misma o los compuestos bioactivos derivados en la elaboración de preparados en forma de nutracéuticos, definidos como sustancias naturales bioactivas presentadas en una matriz no alimenticia.
Otro objeto de la presente invención es el uso del microorganismo objeto de la misma o los compuestos bioactivos derivados para la obtención de un suplemento dietético o alimentario, que incluiría en su composición el microorganismo o los compuestos bioactivos derivados del mismo a fin de complementar la dieta con fines saludables.
Otro objeto particular de la presente invención comprende el uso del microorganismo o los compuestos activos derivados en la elaboración de preparados farmacéuticos. De esta forma se utilizarían en la preparación de composiciones biológicamente activas, capaces de ser utilizadas como medicamentos para obtener los efectos beneficiosos descritos sobre la salud.
Otro objeto adicional de la presente invención es el uso del microorganismo en la preparación de probióticos y/o simbióticos (combinaciones de probióticos y prebióticos), que contendrían estos microorganismos vivos o liofilizados, mantendrían su actividad biológica en el intestino e ingeridos en cantidades adecuadas ejercerían efectos beneficiosos.
Otro objeto particular de la presente invención es su uso como nuevo alimento, entendiendo como tal cualquier alimento o ingrediente que no se haya usado de forma habitual para consumo humano en la Unión Europea a partir del 15 de mayo de 1997.
Un último objeto de la invención sería su uso en forma de alimentos, alimentos nuevos, suplementos, nutracéuticos, composiciones farmacéuticas, probióticos y/o simbióticos en combinación con otros microorganismos (probióticos o cultivos iniciadores) u otros ingredientes funcionales distintos de los microorganismos vivos.
DESCRIPCIONES DE LAS FIGURAS
Figura 1. Efecto de la incubación de células epiteliales HT29-MTX con los compuestos secretados al sobrenadante de cultivos de distintas bacterias sobre el mareaje con la lectina PNA marcada con fluoresceína, que reconoce los residuos galactosil ß(1 ->3) N-acetil galactosamina propios de un intestino sano. Control (PBS); BH (control de bacteroides); MRS (control de bifidobacterias); Bac (Bacteroides spp.), ES1 (Bifídobacteríum longum IATA-ES1); B. breve LMG11042T; ES2 (Bifídobacteríum bifidum IATA-ES2), 324 (Bifídobacteríum longum BIR-324), A2 (Bifídobacteríum animalis). *EI efecto del sobrenadante de ES2 fue significativamente diferente al del resto aplicando el test de ann-Whitney U a P< 0.05.
Figura 2. Diferencias significativas entre el porcentaje de adhesión de B. bifidum ES2 y otras bacterias intestinales a células HT29-MTX, tras su estimulación con los compuestos secretados al sobrenadante de cultivo por la misma cepa frente y con medio de cultivo estéril como control (MRS) aplicando el test de Mann-Whitney (*P < 0.05).).
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
EJEMPLO 1. PROCEDIMIENTO DE EVALUACIÓN DE LA MODULACIÓN DEL PATRÓN DE GLICOSILACIÓN INTESTINAL POR BACTERIAS
1. Preparación de los cultivos y sobrenadantes de bifidobacterias y otras bacterias lácticas intestinales.
Las cepas del género Bifidobacteríum se inocularon en 10 mi de caldo RS (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, España) conteniendo un 0,05% de cisterna (MRS-C) al 1 % con un cultivo de 24 h y se incubaron durante 22 h a 37°C en anaerobiosis. (AnaeroGen; Oxoid, Basingstoke, UK). Las cepas del género Bacteroides se inocularon en caldo Brain Herat (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, España) siguiendo el mismo procedimiento. Las células se recogieron por centrifugación (6,000 g, 15 min.), se lavaron dos veces en PBS (10 mM fosfato sódico, 130 mM cloruro sódico, pH 7,4), y se re-suspendieron en PBS conteniendo un 20% de glicerol. Alícuotas de estas suspensiones se congelaron con nitrógeno líquido y se conservaron a -80°C. El número de viables tras el ciclo de congelación-descongelación se determinó mediante recuento en placas de MRSC y Schadler tras incubar 48 h. La viabilidad fue superior al 90% en todos los casos. Los sobrenadantes de los medios de cultivo se esterizaron por filtración (0.22-µG? tamaño de poro, Millipore, Bedford, MA) para eliminar la posible presencia de células viables y alícuotas de éstos sobrenadantes libres de células se conservaron a -80°C hasta su uso.
2. Evaluación del patrón de glicosilación
El patrón de glicosilación se determinó utilizando el modelo de células epiteliales intestinales secretoras de mucus HT29-MTX, proporcionadas
por la Dra. Lesuffleur (INSERM U843, París, Francia). Las células se cultivaron en medio DMEM glutamax, conteniendo 4.5 g/L D-glucosa, 25 mM de piruvato (Gibco, Barcelona, España), 100 U/ml penicilina, 100 µ?/ml estreptomicina (Sigma, St. Luis, MO) y 10% de suero fetal bovino (Gibco, Barcelona, España) inactivado durante 30 minutos a 56°C. Las células se crecieron en frascos de 75 cm2 , y placas de 6 y 24 pocilios (Corning, Madrid, España) a 37°C en una atmósfera de un 5% CO2. Los cultivos se inocularon en las placas a . una densidad de 5 ? 105 células por mi. Para la detección del patrón de glicosilación por mareaje con lectinas, las células HT29-MTX se incubaron 7 días en placas de 6 pocilios hasta que alcanzar confluencia. Las monocapas se lavaron con PBS estéril libre de Ca2+ y Mg2+ (Gibco, Barcelona, España) y se incubaron en presencia de medio fresco DMEM conteniendo un 20% (v/v) del sobrenadante libre de células de los cultivos de las bacterias evaluadas o medio fresco BHI o MRS , utilizados como controles, durante 7 días adicionales. Las células también se incubaron en presencia de suspensiones de células bacterianas adicionadas a una concentración de 106 cfu/ml durante 2 días. Después de la estimulación las células HT29-MTX se lavaron 3 veces con PBS libre de Ca + y Mg2+ PBS (Gibco, Barcelona, España) y se incubaron durante 5 minutos a 37 °C con un 0.25% de tripsina y 1 mM EDTA, resuspendidos en DMEM y, posteriormente, se centrifugó para recoger las células (1800 r.p.m. , 10 min., a 4°C). Las células se lavaron 2 veces con PBS y se tíñeron con lectinas marcadas con fluoresceína (FITC) durante 40 minutos. Las lectinas utilizadas y sus concentraciones fueron las siguientes: UEA (Ulex europaeus) [a(1 ,2)-fucosa] (Sigma), 50 pg/ml; PNA (Arachys hypogaea, ß -gal(1 -^3)galNAc (Sigma), 10 pg/ml; HPA (Helix pomatia), a-NAc residuos (Molecular Probes, Barcelona, Spain), 10 pg/ml; SBA (Gycine max), a- y ß-Nac. y galactopiranosil (Molecular Probes, Barcelona, Spain), 10 pg/ml. Después, las células se lavaron 3 veces y se resuspendíeron en 400 µ? de PBS. El grado de tinción con las lectinas se cuantificó en un citómetro de flujo (EPICS® XL-MCL flow cytometer; Beckman Coulter, Florida, US).
EJEMPLO 2. PROCEDIMIENTO DE EVALUACIÓN DE LA ADHESIÓN DE BACTERIAS A UN MODELO DE CÉLULAS EPITELIALES INTESTINALES.
Las suspensiones de bacterias se tiñeron mediante incubación con 10 mM de 5-diacetato de carboxifluoresceina (Sigma, St. Louis, MO), a 37 °C, durante 1 hora. Las suspensiones de células marcadas se ajustaron a una densidad óptica de 0.50 + 0.05 a 600 nm y se adicionaron a cultivos confluentes de células HT29-MTX y se incubaron a 37°C durante 1 hora. Las células se lavaron con PBS para eliminar las bacterias no adheridas y las adheridas se recogieron mediante incubación con 200 µ? de 1 % SDS (Sigma, St Louis, MO) en 0.1 M NaOH a 37 °C durante 1 hora. La fluorescencia liberada se midió en un fluorímetro de placas multipocillo (Fluoroskan Ascent, Labsystem, Oy, Finland) a 485 y 538 nm de longitud de onda de excitación y emisión, respectivamente. La adhesión se expresó como porcentaje de la fluorescencia recuperada tras la adhesión de las bacterias a células HT29-MTX respecto a la fluorescencia inicial de la suspensión bacteriana añadida por pocilio.
EJEMPLO 3. PROCEDIMIENTO DE EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES INMUNOLÓGICAS DE Bifidobacterium bifidum ES-2
1. Preparación de los cultivos y sobrenadates de bifidobacterias y otras bacterias intestinales.
Las cepas se inocularon en 10 mi de caldo MRS (Scharlau Chemie S.A., Barcelona, España) conteniendo un 0.05% de cisterna (MRS-C) al 1 % con un cultivo de 24 h y se incubaron durante 22 h a 37°C en anaerobiosis. (AnaeroGen; Oxoid, Basingstoke, UK). Las células se recogieron por centrifugación (6,000 g, 15 min), se lavaron dos veces en PBS (10 mM fosfato sódico, 130 mM cloruro sódico, pH 7.4), y se re-suspendieron en PBS conteniendo un 20% de glicerol. Alícuotas de estas suspensiones se congelaron con nitrógeno líquido y se conservaron a -80°C. El número de viables tras el ciclo de congelación-descongelación se determinó mediante recuento en placas de MRSC tras incubar 48 h. La viabilidad fue superior al 90% en todos los casos. Cada alícuota se utilizó para un solo ensayo. A fin de evaluar los efectos de bacterias muertas, algunas de las alícuotas se inactivaron por frío (3 ciclos de congelación a -20°C y descongelación) y por calor (30 min a 80°C). Los valores de pH de los sobrenadantes obtenidos se ajustaron a 7.2 con NaOH y se esterizaron por filtración (0.22-µ?t? tamaño de poro, Millipore, Bedford, MA) para eliminar la posible presencia de células viables. Alícuotas de los sobrenadantes libres de células se conservaron a -80°C hasta su uso.
2 Aislamiento y estimulación de PB Cs
Las PBMCs se aislaron de sangre periférica de 4 voluntarios sanos (edad media 30 años, intervalo 24-40) en tubos con heparina. El aislamiento de PBMCs se realizó por centrifugación en gradiente de Ficoll (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Las células se lavaron con medio RPMI 640 (Cambrex, New York, USA) y se ajustaron a una densidad de 1 ? 10 6 células/ml en medio RPMI 1640 conteniendo además 10 % de suero fetal bovino (Gibco, Barcelona, España), 2 mM de L-glutamina, 100 µg/ml de estreptomicina y 100 U/ml penicilina (Sigma). Las PBMCs se incubaron en placas de poliestireno de fondo plano de 24 pocilios (Corning, Madrid, España) en presencia o ausencia de agentes estimulantes a 37° C, al 5% de C02, durante 24 h. Como estímulo se utilizaron suspensiones bacterias vivas y muertas de 1 ? 10 6 CFU/ml, y volúmenes de sobrenadantes de 150 µ?. Como control positivo se uso lipopolisacárido (LPS) purificado de E. coli 01 11 :B4 (Sigma, St. Louis, MO) a una concentración de 1 µg/ml. Como control negativo se ensayó la producción de citoquinas en PBMCs no estimuladas. Cada tipo de estímulo fue ensayado por duplicado en cada experimento. Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron por centrifugación, se fraccionaron y se almacenaron en alícuotas a -20°C hasta la detección de citoquinas.
3. Estimulación de células HT29-MTX
Las células epiteliales intestinales secretoras de mucus HT29- MTX, se cultivaron como se ha descrito en el ejemplo 1 y, posteriormente, se incubaron en presencia de suspensiones celulares y sobrenadantes de cultivo libres de células de bifidobacterias y otras bacterias intestinales durante 24 h, siguiendo el mismo procedimiento descrito para la estimulación de PBMCs. Tras este período, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos por centrifugación, se fraccionaron y se almacenaron en alícuotas a -20°C hasta la detección de citoquinas.
4. Determinación de citoquinas
Las concentraciones de citoquinas (IL-8, IL-1 , IFN-?, IL-10, y TGF-ß) de los sobrenadantes se midieron mediante kits ELISA de Bioscience (BD Biosciences, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones de la casa comercial.
Tabla 1. Propiedades inmunomoduladoras de bifidobacterias y otras bacterias lácticas intestinales. Efecto de células viables sobre la producción de citoquinas (pg/ml) por PBMCs y de células viables y sobrenadantes de cultivo sobre la producción de la quemioquina IL8 por células epiteliales HT29MTX.
ND , no detectada
-, no evaluada
1 Bifidobacteríum animalis IATA-A2, 2Bifidobacterium bifidum IATA-ES2, 2Bifidobacteríum longum BIR-324, 4Bifidobacterum longum W11 , 6Bifidobacterum longum BB536.
Tabla 1
Estímulo Citoquinas (pg/ml)
IL-1 IL-10 IL-8 IL8
Células Células Células Células Sobren
RPMI ND 9,0 (1 ,0) 488,5 488,5
58,0 (3,0)
(5,5) (5,5)
LPS ND 12,0 (0,5) 399,0 (8,0) - - Bacteroides - - 937,9 2500,2
- (80,9) (52,1 )
1A2 255,0±1 ,0 13,0±2,0 461 , 1 462,0
699,0±396,0
(48,2) (50,8)
2ES2 65,0±4,0 52,0±12,0 837,0 639,7
1091 ,0±329,0
(60,4) (21 ,8)
3BIR-324 ND 1 1 ,0±5,0 1558,8 935,2
469,0±15,0
(21 ,9) (83,6) W1 1 - 160,4±6,8 486,0±236,4 - 5BB536 - 143,7±18,3 1390,0±268,8 -
Claims (23)
1. Cepa de Bifidobacterium bifidum con número de depósito CECT 7365.
2. Cepa según la reivindicación 1 , donde dicha cepa está en forma de células viables.
3. Cepa según la reivindicación 1 , donde dicha cepa está en forma de células no viables.
4. Combinación de microorganismos que comprende la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Combinación de microorganismos según la reivindicación 4 que además comprende al menos otro microorganismo.
6. Combinación de microorganismos según la reivindicación 5, donde el otro microorganismo es una bacteria intestinal o una bacteria láctica.
7. Compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones, obtenidos a partir de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o a partir de la combinación de microorganismos según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Composición alimentaria que comprende la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7.
9. Composición alimentaria según la reivindicación 8, donde dicha composición alimentaria es un alimento, probiótico, simbiótico, suplemento o nutracéutico.
10. Composición farmacéutica que comprende la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7.
1 1. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7; o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para la prevención y/o tratamiento de al menos una infección microbiana.
12. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7; o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de enfermedades de base inmunológica.
13. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6, para la producción de compuestos con capacidad para modular la composición del mucus.
14. Uso según la reivindiación 13, donde los compuestos producidos son de naturaleza proteica de masa molecular mayor de 30 kDa.
15. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7, para la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad celíaca.
16. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7, para la fabricación de un medicamento para aumentar la adhesión de especies bacterianas beneficiosas para la salud a células epiteliales.
17. Uso según la reivindicación 16, donde las especies bacterianas beneficiosas son bifidobacterias.
18. Uso según la reivindicación 17, donde las bifidobacterias se seleccionan de la lista que comprende 8. longum subsp. longum, B. longum subsp. infantis, B breve, B. bifidum o B. animalis.
19. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7, para la fabricación de un medicamento para reducir la adhesión de bacterias patógenas a células epiteliales.
20. Uso según la reivindicación 19, donde las bacterias patógenas son de la familia Enterobacteriaceae o del género Shigella.
21. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7, para la fabricación de un medicamento para estimular la síntesis de citoquinas y reducir los marcadores celulares de activación.
22. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7, para la fabricación de un medicamento para estimular la síntesis citoquina anti-inflamatoria IL-10, y de las citoquinas y quemoquinas pro-inflamatorias IL8, TNF-alpha e IFN-?; y para estimular la reducción de los marcadores celulares de activación CD4, CD8 y CD86.
23. Uso de la cepa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; o de la combinación de microorganismos según las reivindicaciones 4 a 6; o de los compuestos secretados, metabolitos, o cualquiera de sus combinaciones según la reivindicación 7, para la preparación de un alimento funcional, un probiótico, un simbiótico, un suplemento, un nutracéutico o una composición farmacéutica.
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