ES2659648T3 - Compuestos terapéuticos de glicano y métodos relacionados de los mismos - Google Patents

Compuestos terapéuticos de glicano y métodos relacionados de los mismos Download PDF

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Abstract

Composición farmacéutica para su uso en la prevención de una recaída de una infección por Clostridium difficile en un sujeto humano al que se le ha administrado previamente un fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile, comprendiendo la composición una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para prevenir la recaída, en la que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01; ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano; y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1.

Description

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DESCRIPCIÓN
Compuestos terapéuticos de glicano y métodos relacionados de los mismos Antecedentes
La microbiota de los seres humanos es compleja, y varía de un individuo a otro dependiendo de la genética, la edad, el sexo, el estrés, la nutrición y la dieta. La microbiota realiza muchas actividades y puede influir en la fisiología del huésped. El cambio de los números y las especies de la microbiota intestinal puede alterar la función e interacción de la comunidad con el huésped. En la técnica se conoce un número limitado de bacterias probióticas, y algunas asociaciones con beneficios para la salud documentados cuando las toman seres humanos. Algunos alimentos se consideran alimentos “prebióticos” ya que contienen sustancias que pueden promover el crecimiento de determinadas bacterias que se cree que son beneficiosas para el huésped humano. Los resultados de ensayos clínicos con estas sustancias son conflictivos con respecto a su eficacia, y su influencia sobre la salud humana se considera generalmente modesta. Por tanto, existe la necesidad de compuestos terapéuticos novedosos para aportes terapéuticos novedosos que puedan estimular desplazamientos de la microbiota beneficiosa y mejorar la salud humana.
Los documentos US 2004/235789 A1, US 2005/004070 A1, WO 2004/052121 A1 y WO 2009/082214 A1 dan a conocer composiciones de oligosacáridos para su uso en el tratamiento de diversas enfermedades.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona reivindicaciones de productos farmacéuticos, métodos y composiciones farmacéuticas tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.
Más generalmente, la presente divulgación presenta, en un aspecto, métodos de modulación de la abundancia de taxones bacterianos en la microbiota intestinal de un sujeto humano, comprendiendo el método administrar al sujeto humano una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para modular la abundancia de los taxones bacterianos, en los que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en los que el grado de ramificación promedio (DB, puntos de ramificación por residuo) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1), ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano, y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente. En algunas realizaciones de la presente divulgación, los taxones bacterianos comprenden al menos un primer y un segundo taxón bacteriano.
En algunas realizaciones, la preparación comprende oligosacáridos ramificados. En algunas realizaciones, el grado de ramificación promedio en la preparación (DB) es de al menos 0,05 (por ejemplo, al menos 0,1).
En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más de los enlaces glicosídicos comprenden independientemente un enlace glicosídico 1->2, un enlace glicosídico 1->3, un enlace glicosídico 1 ->4 o un enlace glicosídico 1 ->6. En algunas realizaciones, están presentes uno o más, dos o más o tres o más enlaces glicosídicos en la configuración tanto alfa como beta.
En algunas realizaciones, una unidad de glicano comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres o más de un monosacárido seleccionado del grupo de una tetrosa, una pentosa, una hexosa y una heptosa. En algunas realizaciones, una unidad de glicano comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres o más de un monosacárido seleccionado del grupo de glucosa, galactosa, arabinosa, manosa, fructosa, xilosa, fucosa y ramnosa.
En algunas realizaciones, al menos una pluralidad de los glicanos, por ejemplo, al menos el 10, el 20, el 30 el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o el 99% (en peso o en número), o sustancialmente todos los glicanos en la preparación, no comprenden más que un nivel de referencia preseleccionado, de una unidad de repetición de unidades de glicano, por ejemplo, una unidad de repetición de 2, 3, 4 o más unidades de glicano. En una realización, el nivel de referencia preseleccionado es del 10, el 20, el 30, el 40, el 50 o el 60% de las unidades de glicano totales en un glicano. A modo de ejemplo, en una realización, un glicano constituido por 20 monómeros de sacárido, menos del 50% de esos 20 monómeros son unidades de repetición de una repetición de 2 ó 3 glicanos.
En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos es sintética y no se aísla de una fuente de oligosacáridos o polisacáridos natural.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, la abundancia de los taxones bacterianos (por ejemplo, de cada uno de un primer y un segundo taxón bacteriano) en la microbiota gastrointestinal de un sujeto humano se modula en al menos aproximadamente el 5%, el 10%, el 25% el 50%, el 75%, el 100%, el 250%, el 500%, el 750% o en al menos el 1000%. En algunas realizaciones, la modulación comprende un aumento o una disminución en la
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abundancia de los taxones bacterianos (por ejemplo, de cada uno de un primer y un segundo taxón bacteriano) en la microbiota gastrointestinal de un sujeto humano.
En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden taxones bacterianos comensales. En otras realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden taxones bacterianos patógenos.
En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden un género seleccionado del grupo de Akkermansia, Alistipes, Anaerofilum, Bacteroides, Bilophila, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Campylobacter, Candidatus, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Coprococcus, Desulfovibrio, Dialister, Dorea, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Faecalibacterium, Fusobacteríum, Haemophilus, Klebsiella, Lachnospira, Lactobacillus, Odoribacter, Oscillospira, Parabacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus, Phascolarctobacterium, Porphyromonas, Portiera, Prevotella, Providencia, Pseudomonas, Roseburia, Ruminococcus, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Subdoligranulum, Vibrio y Yersinia. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden un género seleccionado del grupo de Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium
(Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y Enterococcus. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden un género seleccionado del grupo de Akkermansia, Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus y Parabacteroides. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden un género seleccionado del grupo de Akkermansia y Blautia.
En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden taxones predominantes en el intestino delgado o intestino grueso. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) predominantes en el intestino delgado comprenden un género seleccionado del grupo de Achromobacter, Agrobacterium, Blautia, Burkholderia, Coprococcus, Cryocola, Enterococcus, Eubacterium, Holdemania, Lactococcus, Mycobacterium, Pseudoramibacter, Ralstonia, Sphingomonas, Streptococcus y Turicibacter. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) predominantes en el intestino grueso comprenden un género seleccionado del grupo de Anaerotruncus, Akkermansia, Bacteroides, Bilophila, Butyricimonas, Odoribacter, Parabacteroides, Phascolarctobacterium, Prevotella y Ruminococcus.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además una preparación de polifenoles. En algunas realizaciones, la preparación de polifenoles comprende un polifenol vegetal aislado de una material de fuente vegetal. En algunas realizaciones, el material de fuente vegetal comprende arándano, arándano rojo, uva, melocotón, ciruela, granada, soja, vino tinto, té negro o té verde.
En algunas realizaciones, la modulación de la abundancia de taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) trata una disbiosis, por ejemplo, una disbiosis descrita en el presente documento.
En otro aspecto, la presente divulgación presenta un método de reducción de un síntoma inducido por tratamiento o fármaco en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto humano una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para reducir un síntoma inducido por un fármaco o un tratamiento, en el que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en el que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1), ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano, y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente.
En algunas realizaciones, el síntoma inducido por tratamiento o fármaco se selecciona del grupo de meteorismo, diarrea, vómitos, náuseas y estreñimiento. En algunas realizaciones, el síntoma inducido por tratamiento o fármaco es diarrea. En algunas realizaciones, el síntoma inducido por tratamiento o fármaco es estreñimiento.
En algunas realizaciones, la composición reduce los síntomas inducidos por fármaco y la composición se administra antes de, simultáneamente con o después de la administración del fármaco. En algunas realizaciones, el fármaco es un fármaco antidiabético, un fármaco inmunosupresor, un fármaco antimicrobiano, un fármaco quimioterápico, un fármaco antipsicótico, un fármaco inhibidor de la bomba de protones o un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). En algunas realizaciones, el fármaco se selecciona del grupo de ciprofloxacino, clindamicina, amoxicilina- clavulanato, cefixima, cefalosporinas, fluoroquinolonas, azitromicina, claritromicina, eritromicina, tetraciclina, azitromicina, irinotecán (camptosar), 5-fluorouracilo, leucovorina, oxaliplatino, bortezomib, imatinib, lenalidomida, imbruvica, ipilimumab, pertuzumab, capecitabina, docetaxel, lapatinib, erlotinib, carmustina, etopósido, aracitina, melfalán, citarabina, daunorubicina, amsacrina, mitoxantrona, olanzapina, ranitidina, famotidina, cimetidina, omeprazol, sucralfato, esomeprazol, naproxeno, diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, ketoprofeno, piroxicam, celecoxib, nimesulida, aspirina, metformina, paroxetina, ácido valproico y clozapina.
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En algunas realizaciones, la composición reduce síntomas inducidos por tratamiento y el tratamiento comprende tratamiento con radiación o cirugía.
En algunas realizaciones, el síntoma inducido por tratamiento o fármaco lo presenta el sujeto durante un régimen de tratamiento. En algunas realizaciones, la reducción de uno o más síntomas aumenta el cumplimiento por el sujeto del régimen de tratamiento. En algunas realizaciones, la reducción de uno o más síntomas aumenta la tolerancia del sujeto a una dosis superior del fármaco que va a administrarse durante el régimen de tratamiento.
En otro aspecto, la presente divulgación presenta un método para modular la diversidad microbiana en el tubo digestivo de un sujeto humano, comprendiendo la composición una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para modular la diversidad microbiana, en el que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en el que el grado de ramificación promedio (Db, puntos de ramificación por residuo) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1), ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano; y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente. En algunas realizaciones, la diversidad microbiana comprende diversidad bacteriana. En algunas realizaciones, la modulación comprende un aumento o una disminución en la diversidad microbiana.
En algunas realizaciones, la diversidad microbiana se determina (por ejemplo, se mide) mediante o se expresa a través del uso del índice de diversidad de Shannon. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente el 5%. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente el 15%. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente 0,3 veces logarítmicas. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente 0,6 veces logarítmicas. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente 1 vez logarítmica.
En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo de géneros Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y
Enterococcus. En algunas realizaciones, la abundancia de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo de géneros Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y
Enterococcus aumenta en al menos aproximadamente el 5%.
En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos dos taxones bacterianos seleccionados del grupo de géneros Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y
Enterococcus. En algunas realizaciones, la abundancia de al menos dos taxones bacterianos seleccionados del grupo de géneros Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y Enterococcus aumenta en al menos aproximadamente el 5%.
En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo de géneros Akkermansia, Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus y Parabacteroides. En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos dos taxones bacterianos seleccionados del grupo de géneros Akkermansia, Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus y Parabacteroides. En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo de géneros Akkermansia y Blautia. En algunas realizaciones, se modula la abundancia de ambos de los géneros bacterianos Akkermansia y Blautia. En algunas realizaciones, la modulación de la diversidad microbiana trata una disbiosis.
En otro aspecto, la presente divulgación presenta un método de tratamiento de un sujeto humano que lo necesita, comprendiendo el método: a) identificar un sujeto humano que necesita tratamiento para disbiosis, y b) administrar al sujeto humano una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para tratar la disbiosis, en el que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en el que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1), ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano, y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente.
En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado infeccioso. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado infeccioso se selecciona del grupo de infección por Clostridium difficile (CDI); infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE), colitis infecciosa o colitis por C. difficile. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado infeccioso es diarrea seleccionada del grupo de diarrea asociada a Clostridium difficile (CDAD), diarrea asociada a antibióticos (AAD), diarrea inducida por antibióticos,
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diarrea del viajero (TD), diarrea pediátrica y diarrea infecciosa (aguda).
En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado metabólico. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado metabólico se selecciona del grupo de obesidad, prediabetes (resistencia a la insulina), diabetes tipo II, azúcar en sangre en ayunas alta (hiperglucemia) y síndrome metabólico. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado metabólico es un factor de riesgo cardiovascular seleccionado del grupo de colesterol en sangre alto, LDL altas, tensión arterial alta (hipertensión), niveles de triglicéridos altos, HDL bajas.
En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado inflamatorio. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado inflamatorio se selecciona del grupo de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), inflamación intestinal y colitis microscópica. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado inflamatorio se selecciona del grupo de síndrome del intestino irritable (IBS), estreñimiento, diarrea, indigestión y dispepsia no ulcerosa.
En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado autoinmunitario. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado autoinmunitario se selecciona del grupo de artritis autoinmunitaria, diabetes tipo I, esclerosis múltiple y psoriasis. En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una alergia. En algunas realizaciones, la alergia comprende asma o dermatitis atópica.
En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado neurológico. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado neurológico se selecciona del grupo de autismo, hiperamoniaquemia y encefalopatía hepática.
En algunas realizaciones, el tratamiento comprende además administrar un segundo fármaco o agente farmacéutico. En algunas realizaciones, el segundo fármaco o agente farmacéutico es un agente o fármaco de referencia. En algunas realizaciones, los efectos de tratamiento de la composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos y el segundo fármaco o agente farmacéutico son aditivos. En algunas realizaciones, los efectos de tratamiento de la composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos y el segundo fármaco o agente farmacéutico son sinérgicos.
En algunas realizaciones, la composición se administra diariamente. En algunas realizaciones, la composición se administra cada día durante un número de días predeterminado (el periodo de tratamiento). En algunas realizaciones, el periodo de tratamiento comprende entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 30 días. En algunas realizaciones, el periodo de tratamiento comprende entre aproximadamente 1 mes y aproximadamente 6 meses. En algunas realizaciones, se administra al sujeto la composición durante un único periodo de tratamiento. En algunas realizaciones, se administra al sujeto la composición durante más de un periodo de tratamiento.
En algunas realizaciones, al tratar la disbiosis se trata la enfermedad del sujeto humano.
En otro aspecto, la presente invención divulga un método de modulación de una ruta funcional de la microbiota del tubo digestivo de un sujeto humano, comprendiendo la composición una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para modular la ruta funcional, en el que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en el que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1); ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano; y
iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente.
En algunas realizaciones, la ruta funcional modula la producción de un agente antimicrobiano, un ácido biliar secundario, un ácido graso de cadena corta, un sideróforo o un metabolito enumerado en la tabla 2 por la microbiota. En algunas realizaciones, el agente antimicrobiano comprende una bacteriocina o peróxido de hidrógeno. En algunas realizaciones, el ácido graso de cadena corta comprende formiato, butirato, acetato, propionato o valerato. En algunas realizaciones, el metabolito comprende 2-hidroxiisobutirato, 3-hidroxiisovalerato, 3-metilcrotonilglicina, 3-metilcrotonilglicina, alantoína, betaína, formiato, manitol, glucurónido de p-cresol, fenilacetilglicina, sarcosina, taurina, ácido acético, acetilaldehído, ácido ascórbico, butanodiona, ácido butírico, ácido desoxicólico, sulfato de etilfenilo, ácido fórmico, indol, ácido isobutírico, ácido isovalérico, ácido propiónico, serotonina, ácido succínico, succinato, TMAO, triptófano, ácido valérico, ácido ursodesoxicólico, lactato, ácido láctico o peróxido de hidrógeno.
En algunas realizaciones, la ruta funcional modula el nivel de una citocina inflamatoria o inmunomoduladora en el sujeto humano. En algunas realizaciones, la citocina inflamatoria e inmunomoduladora comprende interleucina-la (IL- 1a), IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-23, factor de necrosis tumoral (TNF), ligando 5 de quimiocina (motivo C-C) (CCL5, también conocido como RANTES), factor de crecimiento transformante beta (TGF-P) o interferón gamma (IFN-y).
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En algunas realizaciones, la ruta funcional aumenta el nivel de un ácido graso de cadena corta en el sujeto. En algunas realizaciones, el aumento en el ácido graso de cadena corta induce la generación de células T reguladoras (Treg) por el sujeto. En algunas realizaciones, el aumento en el ácido graso de cadena corta reduce la permeabilidad del intestino o el nivel de endotoxinas en plasma en el sujeto. En algunas realizaciones, el aumento de un ácido graso de cadena corta reduce la respuesta inflamatoria del sujeto. En algunas realizaciones, el ácido graso de cadena corta lo produce al menos una especie bacteriana de la familia Ruminocaccaceae y/o Lachnospiraceae.
En algunas realizaciones, el sujeto es obeso.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de prevención de una recaída de una infección por Clostridium difficile en un sujeto humano al que se le ha administrado previamente un fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile, comprendiendo el método administrar una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para prevenir la recaída, en el que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en el que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1); ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano; y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente.
En algunas realizaciones, la recaída comprende la reaparición de uno o más síntomas asociados con una infección por C. difficile. En algunas realizaciones, la recaída se produce durante o después de un régimen de tratamiento farmacológico de primera línea o de referencia.
En algunas realizaciones, el fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile es un antibiótico. En algunas realizaciones, el antibiótico se selecciona del grupo de vancomicina, metronidazol y fidaxomicina. En algunas realizaciones, la composición se administra simultáneamente o después de la administración del fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile.
En algunas realizaciones, la composición se administra en combinación con un segundo fármaco o tratamiento. En algunas realizaciones, el segundo fármaco o tratamiento comprende un antibiótico. En algunas realizaciones, el antibiótico se selecciona del grupo de vancomicina, metronidazol y fidaxomicina.
En algunas realizaciones, la administración de la composición da como resultado una reducción de la gravedad de un síntoma asociado con una infección por C. difficile en el sujeto pero no elimina la población de C. difficile en el sujeto. En algunas realizaciones, la administración de la composición da como resultado una reducción de la gravedad de un síntoma asociado con una infección por C. difficile en el sujeto pero no cambia el nivel de la población de C. difficile en el sujeto.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación de una composición farmacéutica, comprendiendo el método a) proporcionar una preparación que comprende una mezcla de glicanos sintéticos, b) obtener un valor para las siguientes características de la preparación, c) el grado de polimerización (DP), d) el grado de ramificación promedio (DB), e) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta, y f) formular la preparación como una composición farmacéutica si se cumplen los siguientes criterios: i) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un DP de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano, ii) el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1), iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente.
En algunas realizaciones, el método comprende además a) obtener un valor para una cualquiera o ambas características adicionales de la preparación: i) la identidad de las unidades de glicano, ii) la razón de unidades de glicano, y b) formular la preparación como una composición farmacéutica si: iii) la razón de unidades de glicano en la preparación es aproximadamente la misma que la razón del aporte de unidades de glicano.
En algunas realizaciones, el método comprende además: b) obtener un valor para una cualquiera o ambas características adicionales de la preparación: iv) el nivel de crecimiento bacteriano, en medios complementados con la preparación, de cepas comensales seleccionadas del grupo que consiste en Bacteroides caccae ATCC 43185, Prevotella copri DSM 18205, Bacteroides thetaiotaomicron AtCC 29741, Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838, Clostridium scindens ATCC 35704, Ruminococcus obeum ATCC 29714, Clostridium nexile ATCC 27757 y Parabacteroides distasonis ATCC 8503, v) el nivel de crecimiento bacteriano, en medios complementados con la preparación, de cepas patógenas seleccionadas del grupo que consiste en Clostridium difficile ATCC BAA-1382, Clostridium difficile ATCC 43255, Enterococcus faecium ATCC 700221 y Salmonella enterica ATCC 27869, y c) formular la preparación como una composición farmacéutica si se cumplen uno o ambos de los siguientes criterios:
vi) promoción por los medios complementados con la preparación del crecimiento de al menos 5 cepas comensales,
vii) promoción por los medios complementados con la preparación del crecimiento de no más de 2 cepas patógenas. En algunas realizaciones, la etapa (b) puede realizarse antes de, simultáneamente con, otra etapa en el
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procedimiento.
En algunas realizaciones, la etapa de formular la preparación como una composición farmacéutica comprende uno o más de: i) eliminar constituyentes no deseados de la preparación, ii) reducir el volumen de la preparación, iii) esterilizar la preparación, iv) mezclar la preparación con un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, v) mezclar la preparación con un segundo fármaco o agente farmacéutico, vi) formular la preparación para dar un jarabe o disolución acuosa, vii) formular la preparación para dar un comprimido o píldora, y viii) formular la preparación para dar una cápsula.
En algunas realizaciones, la etapa de formular la preparación como una composición farmacéutica comprende uno o más de ix) envasar la preparación, x) etiquetar la preparación envasada, y xi) vender o poner a la venta la preparación envasada y etiquetada.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de preparación de una composición farmacéutica, comprendiendo el método: (i) proporcionar una preparación terapéutica de glicanos que comprende al menos una unidad de glicano seleccionada del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa y manosa, (ii) determinar si un pico de RMN o grupo de picos de RMN preseleccionados están asociados con la preparación de glicanos, y (iii) si está presente el pico o grupo de picos preseleccionados, formular la preparación como una composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, el pico es un pico de 1H-13C-RMN de HSQC. En algunas realizaciones, la determinación comprende obtener un valor para la identidad de un pico o grupo de picos de 1H-13C HSQC asociados con la preparación, y si está presente un pico preseleccionado, formular la preparación como una composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, i) para glicanos que comprenden glucosa, los picos comprenden al menos un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,42, 92,5; 5,21, 92,8; 5,18, 93,9; 5,08, 97,0; 5,36, 98,4; 5,34, 99,8; 5,38, 100,3; 4,95, 98,6; 4,62, 96,6; 4,70, 103,6; 4,49, 103,4 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; ii) para glicanos que comprenden galactosa, los picos comprenden al menos un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,37, 92,9; 5,24, 93,1; 5,14, 96,0; 4,96, 99,3; 5,31, 98,7; 5,39, 101,4; 5,00, 101,8; 4,80, 101,3; 4,63, 97,0; 4,56, 97,2; 4,53, 103,1; 4,43, 104,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; iii) para glicanos que comprenden fucosa, los picos comprenden al menos un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,18, 92,9; 5,33, 92,4; 5,04, 96,3; 4,90, 99,7; 4,52, 97,0; 4,39, 103,6 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; iv) para glicanos que comprenden xilosa, los picos comprenden al menos un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,18, 93,0; 5,10, 94,3; 5,34, 98,2; 5,31, 99,6; 5,11, 100,8; 4,91, 99,4; 4,56, 97,3; 4,64, 104,2; 4,54, 103,4; 4,44, 102,6; 4,44, 104,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; v) para glicanos que comprenden arabinosa, los picos comprenden al menos un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,22, 93,2; 5,13, 93,2;5,29, 96,0; 5,26, 97,2; 5,12, 96,6; 5,18, 99,6; 5,06, 99,2; 4,99, 100,0; 5,26, 101,9; 5,06, 102,1; 4,55, 97,4; 4,54, 105,2; 4,50, 105,5; 4,38, 103,9 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; vi) para glicanos que comprenden ramnosa, los picos comprenden al menos un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,21, 93,2; 5,10, 94,5; 4,85, 94,1; 5,01, 95,8; 5,35, 100,5; 5,15, 102,2; 5,04, 102,9; 4,78, 97,9; 4,71, 99,0; 4,72, 101,0 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; vii) para glicanos que comprenden manosa, los picos comprenden al menos un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,37, 93,0; 5,16, 94,6; 4,88, 94,2; 5,39, 101,7; 5,24, 101,9; 5,13, 102,8; 5,03, 102,7; 5,24, 105,6; 5,09, 108,0; 4,88, 94,2; 4,89, 100,0; 4,70, 101,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente.
En algunas realizaciones, i) para glicanos que comprenden glucosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HsQc de 1H-13C seleccionados de 5,42, 92,5; 5,21, 92,8; 5,18, 93,9; 5,08, 97,0; 5,36, 98,4; 5,34, 99,8; 5,38, 100,3; 4,95, 98,6; 4,62, 96,6; 4,70, 103,6; 4,49, 103,4 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; ii) para glicanos que comprenden galactosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,37, 92,9; 5,24, 93,1; 5,14, 96,0; 4,96, 99,3; 5,31, 98,7; 5,39, 101,4; 5,00, 101,8; 4,80, 101,3; 4,63, 97,0; 4,56, 97,2; 4,53, 103,1; 4,43, 104,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; iii) para glicanos que comprenden fucosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,18, 92,9; 5,33, 92,4; 5,04, 96,3; 4,90, 99,7; 4,52, 97,0; 4,39, 103,6 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; iv) para glicanos que comprenden xilosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,18, 93,0; 5,10, 94,3; 5,34, 98,2; 5,31, 99,6; 5,11, 100,8; 4,91, 99,4; 4,56, 97,3; 4,64, 104,2; 4,54, 103,4; 4,44, 102,6; 4,44, 104,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; v) para glicanos que comprenden arabinosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HsQc de 1H-13C seleccionados de 5,22, 93,2; 5,13, 93,2;5,29, 96,0; 5,26, 97,2; 5,12, 96,6; 5,18, 99,6; 5,06, 99,2; 4,99, 100,0; 5,26, 101,9; 5,06, 102,1; 4,55, 97,4; 4,54, 105,2; 4,50, 105,5; 4,38, 103,9 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; vi) para glicanos que comprenden ramnosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC
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En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos que comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB) es de al menos 0,01, en la que i) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano, ii) la preparación de glicanos comprende enlaces glicosídicos tanto alfa como beta, iii) al menos uno de los enlaces glicosídicos presentes en los glicanos de la preparación comprende un enlace glicosídico 1->2, un enlace glicosídico 1->3, un enlace glicosídico 1->4 o un enlace glicosídico 1->6, y iv) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1.
En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más de los enlaces glicosídicos comprenden independientemente un enlace glicosídico 1->2, un enlace glicosídico 1->3, un enlace glicosídico 1->4 o un enlace glicosídico 1->6. En algunas realizaciones, uno o más, dos o más, o tres o más enlaces glicosídicos están presentes en configuración tanto alfa como beta.
En algunas realizaciones, una unidad de glicano comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres o más de un monosacárido seleccionado del grupo de una tetrosa, una pentosa, una hexosa y una heptosa. En algunas realizaciones, una unidad de glicano comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres o más de un monosacárido seleccionado del grupo de glucosa, galactosa, arabinosa, manosa, fructosa, xilosa, fucosa y ramnosa.
En algunas realizaciones, al menos una pluralidad de los glicanos, por ejemplo, al menos el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o el 99% (en peso o en número), o sustancialmente todos los glicanos en la preparación, no comprenden más que un nivel de referencia preseleccionado, de una unidad de repetición de unidades de glicano, por ejemplo, una unidad de repetición de 2, 3, 4 o más unidades de glicano. En una realización, el nivel de referencia preseleccionado es del 10, el 20, el 30, el 40, el 50 o el 60% de las unidades de glicano totales en un glicano. A modo de ejemplo, en una realización, un glicano constituido por 20 monómeros de sacárido, menos del 50% de esos 20 monómeros son unidades de repetición de una repetición de 2 ó 3 glicanos.
En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos es sintética y no se aísla de una fuente de oligosacáridos o polisacáridos natural.
En algunas realizaciones, la composición comprende además una preparación de polifenoles. En algunas realizaciones, la composición comprende además una preparación de bacterias probióticas. En algunas realizaciones, la composición comprende además un fármaco o agente terapéutico. En algunas realizaciones, la composición comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la composición se formula como una forma de dosificación unitaria. En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria se formula para administración oral. En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria se formula para disolverse en una disolución acuosa y se administra por vía oral como una bebida, un jarabe, una disolución o una suspensión.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria se formula como un sistema controlado en el tiempo o de liberación retardada. En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria se formula para liberar la preparación terapéutica de glicanos en una región específica del tubo digestivo. En algunas realizaciones, la región específica del tubo digestivo comprende el estómago, intestino delgado, intestino grueso o colon.
En algunas realizaciones, la composición modula la abundancia de un género bacteriano presente en el tubo digestivo. En algunas realizaciones, la composición modula la abundancia de un género bacteriano presente en uno o ambos del intestino delgado o intestino grueso. En algunas realizaciones, la composición modula la abundancia de un género bacteriano predominante en el intestino delgado seleccionado del grupo de géneros Achromobacter, Agrobacterium, Blautia, Burkholderia, Coprococcus, Cryocola, Enterococcus, Eubacterium, Holdemania, Lactococcus, Mycobacterium, Pseudoramibacter, Ralstonia, Sphingomonas, Streptococcus y Turicibacter. En algunas realizaciones, la composición modula la abundancia de un género bacteriano predominante en el intestino grueso seleccionado del grupo de géneros Anaerotruncus, Akkermansia, Bacteroides, Bilophila, Butyricimonas, Odoribacter, Parabacteroides, Phascolarctobacterium, Prevotella y Ruminococcus.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml de la preparación terapéutica de glicanos, se formula para administración oral y se formula para liberar la preparación terapéutica de glicanos en una región específica del tubo digestivo. En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg
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de la preparación terapéutica de glicanos, se formula para administración oral y se formula para liberar la preparación terapéutica de glicanos en una región específica del tubo digestivo.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml de la preparación terapéutica de glicanos, se formula para administración oral y la composición modula la abundancia de un género bacteriano seleccionado del grupo de Bacteroides, Butyricimonas, Odoribacter, Parabacteroides, Prevotella, Anaerotruncus, Phascolarctobacterium, Ruminococcus, Bilophila,
Akkermansia, Cryocola, Mycobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Turicibacter, Blautia, Coprococcus, Holdemania, Pseudoramibacter, Eubacterium, Agrobacterium, Sphingomonas, Achromobacter,
Burkholderia y Ralstonia.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de la preparación terapéutica de glicanos, se formula para administración oral y la composición modula la abundancia de un género bacteriano seleccionado del grupo de Bacteroides, Butyricimonas, Odoribacter, Parabacteroides, Prevotella, Anaerotruncus, Phascolarctobacterium, Ruminococcus, Bilophila,
Akkermansia, Cryocola, Mycobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Turicibacter, Blautia, Coprococcus, Holdemania, Pseudoramibacter, Eubacterium, Agrobacterium, Sphingomonas, Achromobacter,
Burkholderia y Ralstonia.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a un kit farmacéutico que comprende a) una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para modular la abundancia de los taxones bacterianos, en el que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en el que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01; ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano; y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1, b) al menos un segundo constituyente seleccionado del grupo de una preparación de polifenoles, una preparación de bacterias probióticas, un fármaco o agente terapéutico, y un componente dietético, c) material de instrucciones y d) envases.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos que comprende al menos una unidad de glicano seleccionada del grupo de: glucosa, galactosa, fucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa y manosa, en la que la preparación comprende una unidad de glicano asociada con uno o más de los siguientes picos de HSQC de 1H-13C: i) para glicanos que comprenden glucosa, los picos comprenden al menos uno de un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,42, 92,5; 5,21, 92,8; 5,18, 93,9; 5,08, 97,0; 5,36, 98,4; 5,34, 99,8; 5,38, 100,3; 4,95, 98,6; 4,62, 96,6; 4,70, 103,6; 4,49, 103,4 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; ii) para glicanos que comprenden galactosa, los picos comprenden al menos uno de un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,37, 92,9; 5,24, 93,1; 5,14, 96,0; 4,96, 99,3; 5,31, 98,7; 5,39, 101,4; 5,00, 101,8; 4,80, 101,3; 4,63, 97,0; 4,56, 97,2; 4,53, 103,1; 4,43, 104,1 de
desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; iii) para glicanos que
comprenden fucosa, los picos comprenden al menos uno de un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,18, 92,9; 5,33, 92,4; 5,04, 96,3; 4,90, 99,7; 4,52, 97,0; 4,39, 103,6 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; iv) para glicanos que comprenden xilosa, los picos comprenden al menos uno de un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,18, 93,0; 5,10, 94,3; 5,34, 98,2; 5,31, 99,6; 5,11, 100,8; 4,91, 99,4; 4,56, 97,3; 4,64, 104,2; 4,54, 103,4; 4,44, 102,6; 4,44, 104,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; v) para glicanos que comprenden arabinosa, los picos comprenden al menos uno de un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,22, 93,2; 5,13, 93,2; 5,29, 96,0; 5,26, 97,2; 5,12, 96,6; 5,18, 99,6; 5,06, 99,2; 4,99, 100,0; 5,26, 101,9; 5,06, 102,1; 4,55, 97,4; 4,54, 105,2; 4,50, 105,5; 4,38, 103,9 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; vi) para glicanos que
comprenden ramnosa, los picos comprenden al menos uno de un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,21,
93,2; 5,10, 94,5; 4,85, 94,1; 5,01, 95,8; 5,35, 100,5; 5,15, 102,2; 5,04, 102,9; 4,78, 97,9; 4,71, 99,0; 4,72, 101,0 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; vii) para glicanos que comprenden manosa, los picos comprenden al menos uno de un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,37, 93,0; 5,16, 94,6; 4,88, 94,2; 5,39, 101,7; 5,24, 101,9; 5,13, 102,8; 5,03, 102,7, 5,24, 105,6; 5,09, 108,0; 4,88, 94,2; 4,89, 100,0; 4,70, 101,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una preparación terapéutica de glicanos que comprende al menos una unidad de glicano seleccionada del grupo de: glucosa, galactosa, fucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa y manosa, en la que la preparación comprende una unidad de glicano asociada con dos o más de los siguientes picos de HSQC de 1H-13C: i) para glicanos que comprenden glucosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,42, 92,5; 5,21,92,8; 5,18, 93,9; 5,08, 97,0; 5,36, 98,4; 5,34, 99,8; 5,38, 100,3; 4,95, 98,6; 4,62, 96,6; 4,70, 103,6; 4,49, 103,4 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; ii) para glicanos que comprenden galactosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,37, 92,9; 5,24, 93,1; 5,14, 96,0; 4,96, 99,3; 5,31, 98,7; 5,39, 101,4; 5,00, 101,8; 4,80, 101,3; 4,63, 97,0; 4,56, 97,2; 4,53, 103,1; 4,43, 104,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; iii) para glicanos que comprenden fucosa, los picos comprenden al menos dos, al
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menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,18, 92,9; 5,33, 92,4; 5,04, 96,3; 4,90, 99,7; 4,52, 97,0; 4,39, 103,6 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; iv) para glicanos que comprenden xilosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,18, 93,0; 5,10, 94,3; 5,34, 98,2; 5,31, 99,6; 5,11, 100,8; 4,91, 99,4; 4,56, 97,3; 4,64, 104,2; 4,54, 103,4; 4,44, 102,6; 4,44, 104,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; v) para glicanos que comprenden arabinosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,22, 93,2; 5,13, 93,2;5,29, 96,0; 5,26, 97,2; 5,12, 96,6; 5,18, 99,6; 5,06, 99,2; 4,99, 100,0; 5,26, 101,9; 5,06, 102,1; 4,55, 97,4; 4,54, 105,2; 4,50, 105,5; 4,38, 103,9 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; vi) para glicanos que comprenden ramnosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,21, 93,2; 5,10, 94,5; 4,85, 94,1; 5,01, 95,8; 5,35, 100,5; 5,15, 102,2; 5,04, 102,9; 4,78, 97,9; 4,71, 99,0; 4,72, 101,0 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente; vii) para glicanos que comprenden manosa, los picos comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,37, 93,0; 5,16, 94,6; 4,88, 94,2; 5,39, 101,7; 5,24, 101,9; 5,13, 102,8; 5,03, 102,7; 5,24, 105,6; 5,09, 108,0; 4,88, 94,2; 4,89, 100,0; 4,70, 101,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente.
En otro aspecto, la presente divulgación presenta una composición farmacéutica para su uso en la modulación de la abundancia de taxones bacterianos en la microbiota intestinal de un sujeto humano, comprendiendo la composición una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para modular la abundancia de los taxones bacterianos, en la que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB, puntos de ramificación por residuo) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1), ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano, y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos comprenden al menos un primer y un segundo taxón bacteriano.
En algunas realizaciones, la preparación comprende oligosacáridos ramificados. En algunas realizaciones, el grado de ramificación promedio en la preparación (DB) es de al menos 0,05 (por ejemplo, al menos 0,1).
En algunas realizaciones, al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o más de los enlaces glicosídicos comprenden independientemente un enlace glicosídico 1->2, un enlace glicosídico 1->3, un enlace glicosídico 1->4 o un enlace glicosídico 1->6. En algunas realizaciones, uno o más, dos o más o tres o más enlaces glicosídicos están presentes en configuración tanto alfa como beta.
En algunas realizaciones, una unidad de glicano comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres o más de un monosacárido seleccionado del grupo de una tetrosa, una pentosa, una hexosa y una heptosa. En algunas realizaciones, una unidad de glicano comprende al menos uno, al menos dos, al menos tres o más de un monosacárido seleccionado del grupo de glucosa, galactosa, arabinosa, manosa, fructosa, xilosa, fucosa y ramnosa.
En algunas realizaciones, al menos una pluralidad de los glicanos, por ejemplo, al menos el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 95 o el 99% (en peso o en número), o sustancialmente todos los glicanos en la preparación, no comprenden más que un nivel de referencia preseleccionado, de una unidad de repetición de unidades de glicano, por ejemplo, una unidad de repetición de 2, 3, 4 o más unidades de glicano. En una realización, el nivel de referencia preseleccionado es del 10, el 20, el 30, el 40, el 50 o el 60% de las unidades de glicano totales en un glicano. A modo de ejemplo, en una realización, un glicano constituido por 20 monómeros de sacárido, menos del 50% de esos 20 monómeros son unidades de repetición de una repetición de 2 ó 3 glicanos.
En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos es sintética y no se aísla de una fuente de oligosacáridos o polisacáridos natural.
En algunas realizaciones, la abundancia de los taxones bacterianos (por ejemplo, de cada uno de un primer y un segundo taxón bacteriano) en la microbiota gastrointestinal de un sujeto humano se modula en al menos aproximadamente el 5%, el 10%, el 25%, el 50%, el 75%, el 100%, el 250%, el 500%, el 750% o en al menos el 1000%. En algunas realizaciones, la modulación comprende un aumento o una disminución en la abundancia de los taxones bacterianos (por ejemplo, de cada uno de un primer y un segundo taxón bacteriano) en la microbiota gastrointestinal de un sujeto humano.
En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden taxones bacterianos comensales. En otras realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden taxones bacterianos patógenos.
En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprende un género seleccionado del grupo de Akkermansia, Alistipes, Anaerofilum, Bacteroides, Bilophila, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Campylobacter, Candidatus, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Coprococcus,
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Desulfovibrío, Dialister, Dorea, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Faecalibacteríum, Fusobacteríum, Haemophilus, Klebsiella, Lachnospira, Lactobacillus, Odoribacter, Oscillospira, Parabacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus, Phascolarctobacterium, Porphyromonas, Portiera, Prevotella, Providencia, Pseudomonas, Roseburia, Ruminococcus, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Subdoligranulum, Vibrio y Yersinia. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden un género seleccionado del grupo de Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium
(Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y Enterococcus. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden un género seleccionado del grupo de Akkermansia, Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus y Parabacteroides. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden un género seleccionado del grupo de Akkermansia y Blautia.
En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) comprenden un taxón predominante en el intestino delgado o intestino grueso. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) predominantes en el intestino delgado comprenden un género seleccionado del grupo de Achromobacter, Agrobacterium, Blautia, Burkholderia, Coprococcus, Cryocola, Enterococcus, Eubacterium, Holdemania, Lactococcus, Mycobacterium, Pseudoramibacter, Ralstonia, Sphingomonas, Streptococcus y Turicibacter. En algunas realizaciones, los taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) predominantes en el intestino grueso comprenden un género seleccionado del grupo de Anaerotruncus, Akkermansia, Bacteroides, Bilophila, Butyricimonas, Odoribacter, Parabacteroides, Phascolarctobacterium, Prevotella y Ruminococcus.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además una preparación de polifenoles. En algunas realizaciones, la preparación de polifenoles comprende un polifenol vegetal aislado de un material de fuente vegetal. En algunas realizaciones, el material de fuente vegetal comprende arándano, arándano rojo, uva, melocotón, ciruela, granada, soja, vino tinto, té negro o té verde.
En algunas realizaciones, la modulación de la abundancia de taxones bacterianos (por ejemplo, un primer y un segundo taxón bacteriano) trata una disbiosis, por ejemplo, una disbiosis descrita en el presente documento.
En otro aspecto, la presente divulgación presenta una composición farmacéutica para su uso en la reducción de un síntoma inducido por tratamiento o fármaco en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto humano una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para reducir un síntoma inducido por un fármaco o un tratamiento, en la que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1), ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano, y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente.
En algunas realizaciones, el síntoma inducido por tratamiento o fármaco se selecciona del grupo de meteorismo, diarrea, vómitos, náuseas y estreñimiento. En algunas realizaciones, el síntoma inducido por tratamiento o fármaco es diarrea. En algunas realizaciones, el síntoma inducido por tratamiento o fármaco es estreñimiento.
En algunas realizaciones, la composición reduce síntomas inducidos por fármaco y la composición se administra antes de, simultáneamente con o después de la administración del fármaco. En algunas realizaciones, el fármaco es un fármaco antidiabético, un fármaco inmunosupresor, un fármaco antimicrobiano, un fármaco quimioterápico, un fármaco antipsicótico, un fármaco inhibidor de la bomba de protones o un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). En algunas realizaciones, el fármaco se selecciona del grupo de ciprofloxacino, clindamicina, amoxicilina- clavulanato, cefixima, cefalosporinas, fluoroquinolonas, azitromicina, claritromicina, eritromicina, tetraciclina, azitromicina, irinotecán (camptosar), 5-fluorouracilo, leucovorina, oxaliplatino, bortezomib, imatinib, lenalidomida, imbruvica, ipilimumab, pertuzumab, capecitabina, docetaxel, lapatinib, erlotinib, carmustina, etopósido, aracitina, melfalán, citarabina, daunorubicina, amsacrina, mitoxantrona, olanzapina, ranitidina, famotidina, cimetidina, omeprazol, sucralfato, esomeprazol, naproxeno, diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, ketoprofeno, piroxicam, celecoxib, nimesulida, aspirina, metformina, paroxetina, ácido valproico y clozapina.
En algunas realizaciones, la composición reduce síntomas inducidos por tratamiento y el tratamiento comprende tratamiento con radiación o cirugía.
En algunas realizaciones, el síntoma inducido por tratamiento o fármaco lo presenta el sujeto durante un régimen de tratamiento. En algunas realizaciones, la reducción de uno o más síntomas aumenta el cumplimiento por el sujeto del régimen de tratamiento. En algunas realizaciones, la reducción de uno o más síntomas aumenta la tolerancia del sujeto a una dosis superior del fármaco que va a administrarse durante el régimen de tratamiento.
En otro aspecto, la presente divulgación presenta una composición farmacéutica para su uso en la modulación de la
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diversidad microbiana en el tubo digestivo de un sujeto humano, comprendiendo la composición una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para modular la diversidad microbiana, en la que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB, puntos de ramificación por residuo) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1), ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano; y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente. En algunas realizaciones, la diversidad microbiana comprende diversidad bacteriana. En algunas realizaciones, la modulación comprende un aumento o una disminución en la diversidad microbiana.
En algunas realizaciones, la diversidad microbiana se determina (por ejemplo, se mide) mediante o se expresa a través del uso del índice de diversidad de Shannon. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente el 5%. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente el 15%. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente 0,3 veces logarítmicas. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente 0,6 veces logarítmicas. En algunas realizaciones, la diversidad de Shannon aumenta o disminuye en al menos aproximadamente 1 veces logarítmicas.
En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo de géneros Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y
Enterococcus. En algunas realizaciones, la abundancia de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo de géneros Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y
Enterococcus aumenta en al menos aproximadamente el 5%.
En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos dos taxones bacterianos seleccionados del grupo de géneros Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y
Enterococcus. En algunas realizaciones, la abundancia de al menos dos taxones bacterianos seleccionados del grupo de géneros Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides,
Lactobacillus y Enterococcus aumenta en al menos aproximadamente el 5%.
En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo de géneros Akkermansia, Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus y Parabacteroides. En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos dos taxones bacterianos seleccionados del grupo de géneros Akkermansia, Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus y Parabacteroides. En algunas realizaciones, se modula la abundancia de al menos un taxón bacteriano seleccionado del grupo de géneros Akkermansia y Blautia. En algunas realizaciones, se modula la abundancia de ambos de los géneros bacterianos Akkermansia y Blautia. En algunas realizaciones, la modulación de la diversidad microbiana trata una disbiosis.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un sujeto humano que lo necesita, comprendiendo el tratamiento: a) identificar un sujeto humano que necesita tratamiento para disbiosis, y b) administrar al sujeto humano una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para tratar la disbiosis, en la que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1), ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano, y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente.
En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado infeccioso. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado infeccioso se selecciona del grupo de infección por Clostridium difficile (CDI); infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE), colitis infecciosa o colitis por C. difficile. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado infeccioso es diarrea seleccionada del grupo de diarrea asociada a Clostridium difficile (CDAD), diarrea asociada a antibióticos (AAD), diarrea inducida por antibióticos, diarrea del viajero (TD), diarrea pediátrica y diarrea infecciosa (aguda).
En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado metabólico. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado metabólico se selecciona del grupo de obesidad, prediabetes (resistencia a la insulina), diabetes tipo II, azúcar en sangre en ayunas alta (hiperglucemia) y síndrome metabólico. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado metabólico es un factor de riesgo cardiovascular seleccionado del grupo de colesterol en sangre alto, LDL altas, tensión arterial alta (hipertensión), niveles de triglicéridos altos, HDL bajas.
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En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado inflamatorio. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado inflamatorio se selecciona del grupo de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), inflamación intestinal y colitis microscópica. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado inflamatorio se selecciona del grupo de síndrome del intestino irritable (IBS), estreñimiento, diarrea, indigestión y dispepsia no ulcerosa.
En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado autoinmunitario. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado autoinmunitario se selecciona del grupo de artritis autoinmunitaria, diabetes tipo I, esclerosis múltiple y psoriasis. En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una alergia. En algunas realizaciones, la alergia comprende asma o dermatitis atópica.
En algunas realizaciones, el sujeto humano tiene una enfermedad, trastorno o estado neurológico. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado neurológico se selecciona del grupo de autismo, hiperamoniaquemia y encefalopatía hepática.
En algunas realizaciones, el tratamiento comprende además administrar un segundo fármaco o agente farmacéutico. En algunas realizaciones, el segundo fármaco o agente farmacéutico es un agente o fármaco de referencia. En algunas realizaciones, los efectos de tratamiento de la composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos y el segundo fármaco o agente farmacéutico son aditivos. En algunas realizaciones, los efectos de tratamiento de la composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos y el segundo fármaco o agente farmacéutico son sinérgicos.
En algunas realizaciones, la composición se administra diariamente. En algunas realizaciones, la composición se administra cada día durante un número de días predeterminado (el periodo de tratamiento). En algunas realizaciones, el periodo de tratamiento comprende entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 30 días. En algunas realizaciones, el periodo de tratamiento comprende entre aproximadamente 1 mes y aproximadamente 6 meses. En algunas realizaciones, se administra al sujeto la composición durante un único periodo de tratamiento. En algunas realizaciones, se administra al sujeto la composición durante más de un periodo de tratamiento.
En algunas realizaciones, al tratar la disbiosis se trata enfermedad del sujeto humano.
En otro aspecto, la presente divulgación presenta una composición farmacéutica para su uso en la modulación de una ruta funcional de la microbiota del tubo digestivo de un sujeto humano, comprendiendo la composición una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para modular la ruta funcional, en la que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1); ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano; y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1 globalmente.
En algunas realizaciones, la ruta funcional modula la producción de un agente antimicrobiano, un ácido biliar secundario, un ácido graso de cadena corta, un sideróforo o un metabolito enumerado en la tabla 2 por la microbiota. En algunas realizaciones, el agente antimicrobiano comprende una bacteriocina o peróxido de hidrógeno. En algunas realizaciones, el ácido graso de cadena corta comprende formiato, butirato, acetato, propionato o valerato. En algunas realizaciones, el metabolito comprende 2-hidroxiisobutirato, 3-hidroxiisovalerato, 3-metilcrotonilglicina, 3-metilcrotonilglicina, alantoína, betaína, formiato, manitol, glucurónido de p-cresol, fenilacetilglicina, sarcosina, taurina, ácido acético, acetilaldehído, ácido ascórbico, butanodiona, ácido butírico, ácido desoxicólico, sulfato de etilfenilo, ácido fórmico, indol, ácido isobutírico, ácido isovalérico, ácido propiónico, serotonina, ácido succínico, succinato, TMAO, triptófano, ácido valérico, ácido ursodesoxicólico, lactato, ácido láctico o peróxido de hidrógeno.
En algunas realizaciones, la ruta funcional modula el nivel de una citocina inflamatoria o inmunomoduladora en el sujeto humano. En algunas realizaciones, la citocina inflamatoria e inmunomoduladora comprende interleucina-la (IL- 1a), IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-23, factor de necrosis tumoral (TNF), ligando 5 de quimiocina (motivo C-C) (CCL5, también conocido como RANTES), factor de crecimiento transformante beta (TGF-P) o interferón gamma (IFN-y).
En algunas realizaciones, la ruta funcional aumenta el nivel de un ácido graso de cadena corta en el sujeto. En algunas realizaciones, el aumento en el ácido graso de cadena corta induce la generación de células T reguladoras (Treg) por el sujeto. En algunas realizaciones, el aumento en el ácido graso de cadena corta reduce la permeabilidad del intestino o el nivel de endotoxinas en plasma en el sujeto. En algunas realizaciones, el aumento de un ácido graso de cadena corta reduce la respuesta inflamatoria del sujeto. En algunas realizaciones, el ácido graso de cadena corta lo produce al menos una especie bacteriana de la familia Ruminocaccaceae y/o Lachnospiraceae.
En algunas realizaciones, el sujeto es obeso.
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En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en la prevención de una recaída de una infección por Clostridium difficile en un sujeto humano al que se le ha administrado previamente un fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile, comprendiendo la composición una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para prevenir la recaída, en la que i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01 (por ejemplo, al menos 0,05, o al menos 0,1); ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano; y iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos es de entre aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1 globalmente.
En algunas realizaciones, la recaída comprende la reaparición de uno o más síntomas asociados con una infección por C. difficile. En algunas realizaciones, la recaída se produce durante o después de un régimen de tratamiento farmacológico de primera línea o de referencia.
En algunas realizaciones, el fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile es un antibiótico. En algunas realizaciones, el antibiótico se selecciona del grupo de vancomicina, metronidazol y fidaxomicina. En algunas realizaciones, la composición se administra simultáneamente o después de la administración del fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile.
En algunas realizaciones, la composición se administra en combinación con un segundo fármaco o tratamiento. En algunas realizaciones, el segundo fármaco o tratamiento comprende un antibiótico. En algunas realizaciones, el antibiótico se selecciona del grupo de vancomicina, metronidazol y fidaxomicina.
En algunas realizaciones, la administración de la composición da como resultado una reducción de la gravedad de un síntoma asociado con una infección por C. difficile en el sujeto pero no elimina la población de C. difficile en el sujeto. En algunas realizaciones, la administración de la composición da como resultado una reducción de la gravedad de un síntoma asociado con una infección por C. difficile en el sujeto pero no cambia el nivel de la población de C. difficile en el sujeto.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Una curva de SEC representativa entre 16 y 20,5 minutos de una muestra de glu100 que muestra el PM promedio y el PM al 10% de absorción máxima en tanto el borde delantero como trasero de la curva.
Figura 2. Una región anomérica representativa de un espectro de HSQC de 1H-13C de una muestra de glu100 que muestra la distribución de señal de enlaces glicosídicos alfa y beta.
Figura 3. Una región anomérica representativa de un espectro de HSQC de 1H-13C de muestras de a) glu100, b) glu50ga150 y c) gal100, que demuestra el efecto aditivo de los picos de huella.
Figura 4. Cromatogramas de CG representativos de tres glicanos permetilados e hidrolizados representativos que muestran la distribución de regioquímica tal como se asigna mediante comparación con patrones conocidos.
Figura 5. Una asignación parcial representativa de los picos en la región anomérica de un espectro de HSQC de 1H- 13C de una muestra de glu100 que muestra la separación entre isómeros alfa y beta en el eje de 1H, con isómeros alfa campo abajo (1H >4,8 ppm este caso) e isómeros beta campo arriba (1H <4,8 ppm este caso). Además, pueden distinguirse azúcares terminales e internos en el eje de 13C con azúcares terminales campo arriba (13C<94 ppm para alfa y 13C<100 ppm para beta en este caso) y azúcares internos campo abajo (13C>94 ppm para alfa y 13C>100 ppm para beta en este caso).
Figura 6. En la figura 6A se ilustra una porción de un catalizador a modo de ejemplo con una estructura principal polimérica y cadenas laterales. En la figura 6B se ilustra una porción de un catalizador a modo de ejemplo, en el que una cadena lateral con el grupo ácido está conectada a la estructura principal polimérica mediante un ligador y en el que una cadena lateral con el grupo catiónico está conectada directamente a la estructura principal polimérica.
Figura 7. Se calcularon las distancias para cada ratón entre la microbiota muestreada 1 día antes y 5 días después de administrarse glicano o agua tal como se describe en el ejemplo 10. Se observa que cuanto mayor es la distancia, mayor es el cambio en la composición microbiana.
Figura 8. Índice de diversidad de Shannon. Se usó la prueba de Wilcoxon para datos apareados para calcular la significación de las diferencias observadas tal como se describe en el ejemplo 10.
Figura 9. En la figura 9A se muestra la abundancia relativa de secuencias asignadas al género Akkermansia, filo Verrucomicrobia. En la figura 9B se muestra la abundancia relativa de secuencias asignadas al género Blautia, filo Firmicutes.
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Figura 10. Curva de supervivencia de Kaplan-Meier tras la infección por C. difficile por grupo de tratamiento para todos los grupos de tratamiento corto tal como se describe en el ejemplo 12.
Figura 11. Cambio de peso 10 días tras la infección por C. difficile para todos los grupos de tratamiento corto (media +/- e.e.) tal como se describe en el ejemplo 12.
Figura 12. Cambio en la abundancia relativa de bacterias por género desde directamente antes del tratamiento con glicanos y la infección por C. difficile (día -1) hasta directamente después de 6 días de tratamientos con glicanos y 4 días de tratamiento con vancomicina (día 6) tal como se describe en el ejemplo 12. Sólo se muestran los géneros que cambian en promedio el 5% de abundancia relativa. Sólo 1 jaula en el grupo de tratamiento con agua tenía animales supervivientes el día 6.
Figura 13. Abundancia relativa predicha de la ruta de biosíntesis de ácidos biliares secundarios el día 6, directamente tras el tratamiento con glicanos o vancomicina tal como se describe en el ejemplo 12. Los círculos blancos representan jaulas y los círculos negros representan la media con +/- d.e. Se produjo la infección por C. difficile el día 0 y sólo se muestran las jaulas con animales que sobrevivieron a la infección (n=4 jaulas el día 0). (*P<0,05, prueba de suma de rangos de Wilcoxon).
Figura 14. Cambio en veces logarítmicas en la diversidad alfa (tal como se mide mediante el índice de Shannon) desde el día -1, directamente antes del tratamiento con glicanos en la infección con C. difficile, hasta el día 6, tras el tratamiento con glicanos o vancomicina tal como se describe en el ejemplo 12. Los puntos representan la diversidad alfa de una única jaula y las líneas representan la mediana de la diversidad alfa.
Figura 15. Cambio de peso en tanto por ciento de ratones en comparación con el día 0 de estudio (media +/- e.e.). Se administró DSS al 2,5% desde los días 0 hasta 5 en todos los grupos tal como se describe en el ejemplo 13. Se administraron fibra de acacia, glu100 y man52glu29gal19 desde los días -7 hasta el día 14 en los grupos de tratamiento.
Figura 16. Puntuación de endoscopia que mide la inflamación colónica el día 14 del estudio tal como se describe en el ejemplo 13. Las barras horizontales representan la mediana de la puntuación de endoscopia. **P<0,01,*P<0,05; prueba de suma de rangos de Wilcoxon con corrección de Bonferroni para múltiples hipótesis.
Figura 17. Pendientes del cambio de peso en % desde el día 0 hasta el día 41 en ratones tratados con glu100 (el 0,3%; figura 17A), man52glu29gal19 (el 1%; figura 17B) y agua (ambos gráficos) tal como se describe en el ejemplo 14. Las pendientes de los grupos tratados con glu100 y man52glu29gal19 eran significativamente diferentes de la pendiente de los ratones tratados con agua (P<0,001; modelo de efectos mixtos lineales con interacción significativa entre el día de estudio y el cambio de peso; se muestran las líneas de regresión representando el sombreado +/- error estándar de la pendiente). Se representan gráficamente los cambios de peso en % de animales individuales (triángulos o círculos).
Figura 18. Niveles de glucosa en sangre el día 39 en ratones alimentados con una dieta alta en grasas, una dieta baja en grasas o una dieta alta en grasas con tratamiento con glu100 (0,3%) o man52glu29gal19 (1%) tal como se describe en el ejemplo 14. Las bisagras superior e inferior en el gráfico de cajas corresponden a los cuartiles primero y tercero y el bigote superior e inferior se extienden hasta el valor más alto y más bajo que está dentro de 1,5 veces el intervalo intercuartílico, la distancia entre los cuartiles primero y tercero. Se alimentaron los ratones mediante sonda nasogástrica con 2 g/kg (a una tasa de dosis de 5 ml/kg) de glucosa en agua y se evaluaron los niveles de glucosa en sangre a las 2 horas tras la dosis. Las unidades en el eje y son mg/dl de glucosa.
Figura 19. Peso de la almohadilla grasa epididimal el día 41 como porcentaje del peso corporal total en ratones alimentados con una alta cantidad de grasa, ratones alimentados con una baja cantidad de grasa y ratones alimentados con una alta cantidad de grasa tratados con man52glu29gal19 (1%), fos (0,3%, 1%), y glu100 (0,3%) tal como se describe en el ejemplo 14.
Descripción detallada
En seres humanos, la microbiota gastrointestinal es en gran medida estable cuando el huésped goza de buena salud; sin embargo, el ecosistema de la microbiota gastrointestinal varía dependiendo de la edad del huésped, la enfermedad, incluyendo infecciones con patógenos, el estrés, la dieta y los tratamientos farmacéuticos y puede entrar en un estado de disbiosis. La divulgación se refiere a preparaciones de productos terapéuticos de glicanos y composiciones farmacéuticas de los mismos (y alimentos médicos o suplementos dietéticos de los mismos), y métodos relacionados, que se ha encontrado que son eficaces para tratar la disbiosis. Las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos y composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento tienen sorprendentemente un efecto terapéutico sobre varias enfermedades, trastornos o estados patológicos, que pueden estar asociados con disbiosis. Sin querer restringirse a la teoría, se cree que las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos y composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento funcionan modulando organismos microbianos dentro del tubo digestivo de un huésped humano provocando un efecto fisiológico deseado,
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tal como mejora de la salud, en el huésped. Los productos terapéuticos de glicanos pueden digerirlos selectivamente determinados constituyentes microbianos induciendo de ese modo cambios específicos en el tubo digestivo, tanto en la composición como/o la actividad (por ejemplo función) de la microbiota que confieren beneficios sobre la salud y el bienestar del huésped. Los productos terapéuticos de glicanos pueden actuar como moduladores adaptados, finamente ajustados para la microbiota residente o adquirida, por ejemplo, potenciando o restaurando el crecimiento de bacterias beneficiosas y/o suprimiendo el crecimiento de microbios patógenos o microbios que están asociados con una enfermedad o estado.
Los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento pueden mediar en desplazamientos en la abundancia de taxones importantes de la microbiota gastrointestinal (y desplazamientos funcionales o genómicos asociados), y se proporcionan métodos mediante los cuales productos terapéuticos de glicanos pueden alterar la composición o función de la microbiota gastrointestinal. En algunas realizaciones, los desplazamientos microbianos permiten que se introduzcan, modulen, aumenten, disminuyan o estimulen múltiples propiedades importantes de la microbiota. En algunas realizaciones, la modulación incluye alteraciones en i) la resiliencia del ecosistema a la alteración (o disbiosis), ii) la diversidad de la microbiota, iii) la producción de metabolitos, iv) la colonización patobionte y patógena y v) los efectos alterados sobre funciones metabólicas, inmunitarias y otras del huésped o cualquier combinación de las mismas.
Se describen en el presente documento métodos, composiciones y kits útiles para el tratamiento y/o la prevención de disbiosis y enfermedades posiblemente asociadas con una disbiosis de la microbiota gastrointestinal y/o la reducción de síntomas de las mismas en un sujeto que lo necesita, y para mejorar la salud global del huésped. Se describen además en el presente documento formas de dosificación para productos terapéuticos de glicanos. En algunas realizaciones, las formas de dosificación se formulan para su administración específica a regiones específicas del tubo digestivo, tales como, por ejemplo, el intestino delgado o grueso. La administración de las composiciones farmacéuticas, alimentos médicos o suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de productos terapéuticos de glicanos puede tratar o prevenir la disbiosis, por ejemplo, estados en los que se altera una microbiota bacteriana beneficiosa y en la que la microbiota presenta una disbiosis. En algunas realizaciones, la alteración puede mejorarse mediante el uso de los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento de modo que puede lograrse una función y un crecimiento fisiológicos mejorados de tanto la microbiota beneficiosa como del huésped. Tal tratamiento o prevención puede producirse directamente, por ejemplo, un producto terapéutico de glicanos descrito en el presente documento puede provocar el desplazamiento de un microbio patógeno por un microbio no patógeno o aumentar el crecimiento de microbios beneficiosos o comensales, o puede producirse indirectamente, por ejemplo, un producto terapéutico de glicanos descrito en el presente documento puede afectar al metabolismo u otras funciones de la microbiota, modulando así la fisiología del huésped, por ejemplo, a través del efecto de uno o más productos metabólicos posteriores. La administración de los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento puede mejorar la salud global del huésped y puede restaurar un equilibrio de salud en un nicho seleccionado, tal como el tubo digestivo, influyendo en uno o más miembros de la comunidad microbiana.
Generación de preparaciones terapéuticas de glicanos
Pueden generarse preparaciones que comprenden una pluralidad de glicanos tales como mezclas de oligo y polisacáridos, usando un catalizador no enzimático, por ejemplo, el catalizador polimérico descrito en la patente estadounidense n.° 8.466.242, o mediante otros métodos adecuados. Pueden encontrarse métodos para preparar los catalizadores poliméricos y con soporte sólido descritos en el presente documento en el documento WO 2014/031956. Los glicanos generados, por ejemplo, usando el catalizador, pueden ser estructuralmente glicanos mucho más diversos que los producidos por reacciones enzimáticas.
Se proporcionan también métodos para generar las preparaciones de glicanos (por ejemplo compuestos de oligo o polisacáridos) descritas en el presente documento: a) proporcionando una o más unidades de glicano de mono o disacárido, o una combinación de las mismas, b) poniendo en contacto los mono o disacáridos con cualquiera de los catalizadores poliméricos descritos en el presente documento y un disolvente adecuado (tal como, por ejemplo agua o un disolvente no acuoso) durante un periodo de tiempo suficiente para producir una población de especies polimerizadas (con un grado de polimerización promedio deseado); y c) aislando y/o recuperando al menos una porción de la preparación de glicanos polimerizados.
En algunas realizaciones, las preparaciones de glicanos (por ejemplo oligo o polisacáridos) son polimoleculares. En algunas realizaciones, las preparaciones de glicanos (por ejemplo oligo o polisacáridos) son polimoleculares y polidispersas. Por ejemplo, las preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden una mezcla de distintas especies de oligosacáridos (por ejemplo de diferente grado de polimerización y grado de ramificación y diferentes razones de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta). En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden una pluralidad de especies distintas (por ejemplo oligosacáridos) y pueden consistir en 1x103, 1x104, 1x105, 1x106, 1x107, 1x108, 1x109, 1x1010, 1X1011, 1x10, 1x1013, 1x1014 o más especies en diversas proporciones entre sí. En el presente documento se describen las propiedades promedio de las preparaciones terapéuticas de glicanos, tales como grado de polimerización, grado de ramificación, razones de enlaces glicosídicos alfa y beta, etc.
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En determinadas realizaciones, el material de partida (que comprende las unidades de glicano) se pone en contacto con un catalizador de polímero en condiciones que promueven la formación de uno o más enlaces glicosídicos entre unidades de glicano, produciendo de ese modo una preparación de glicanos. En algunas realizaciones, la unidad de glicano es un monosacárido. Catalizadores de polímero adecuados comprenden monómeros ácidos y monómeros iónicos que se conectan para formar una estructura principal polimérica, en la que cada monómero ácido tiene al menos un ácido de Bronsted-Lowry, y cada monómero iónico tiene independientemente al menos un grupo catiónico que contiene nitrógeno o grupo catiónico que contiene fósforo. En algunas realizaciones, cada monómero ácido del catalizador de polímero puede tener un ácido de Bronsted-Lowry, y opcionalmente los ácidos de Bronsted-Lowry son distintos. En algunas realizaciones, cada monómero iónico del catalizador de polímero tiene un grupo catiónico que contiene nitrógeno o grupo catiónico que contiene fósforo. En algunas realizaciones, al menos un monómero iónico del catalizador de polímero tiene dos grupos catiónicos que contienen nitrógeno o grupos catiónicos que contienen fósforo. En las figuras 6a y 6b se muestra un resumen esquemático de los grupos funcionales generales.
En determinadas realizaciones, la síntesis de los glicanos (por ejemplo oligo o polisacáridos) usando el catalizador polimérico se lleva a cabo en un entorno acuoso. Un disolvente acuoso adecuado es agua, que puede obtenerse de diversas fuentes. Generalmente, son preferibles fuentes de agua con menores concentraciones de especies iónicas, ya que tales especies iónicas pueden reducir la eficacia del catalizador polimérico. En algunas realizaciones en las que el disolvente acuoso es agua, el agua tiene menos del 10% de especies iónicas (por ejemplo, sales de sodio, fósforo, amonio, magnesio).
Generalmente, el catalizador polimérico y las unidades de glicano se introducen en una cámara interior de un reactor, o bien simultánea o bien secuencialmente. La síntesis de glicanos (por ejemplo oligo o polisacáridos) puede realizarse en un procedimiento discontinuo o un procedimiento continuo. Por ejemplo, en una realización, la síntesis de glicanos se realiza en un procedimiento discontinuo, en el que el contenido del reactor se mezcla o se combina de manera continua, y toda o una cantidad sustancial de los productos de la reacción se retiran (por ejemplo se aíslan y/o se recuperan). En una variación, la síntesis de glicanos se realiza en un procedimiento discontinuo, en el que el contenido del reactor se entremezcla o se mezcla inicialmente pero no se realiza un mezclado físico adicional. En otra variación, la síntesis de glicanos se realiza en un procedimiento discontinuo, en el que una vez realizado el mezclado adicional del contenido, o mezclado periódico del contenido del reactor (por ejemplo, a una o más veces por hora), toda o una cantidad sustancial de los productos de la reacción se retiran (por ejemplo se aíslan y/o se recuperan) tras un determinado periodo de tiempo.
En otras realizaciones, la síntesis de glicanos (por ejemplo oligo o polisacárido) se realiza en un procedimiento continuo, en el que el contenido fluye a través del reactor con una velocidad de flujo continua promedio pero sin mezclado explícito. Tras la introducción del catalizador polimérico y unidades de glicano en el reactor, el contenido del reactor se mezcla o se combina continua o periódicamente, y tras un periodo de tiempo, menos de todos los productos de la reacción se retiran (por ejemplo se aíslan y/o se recuperan). En una variación, la síntesis de glicanos se realiza en un procedimiento continuo, en el que la mezcla que contiene el catalizador y las unidades de glicano no se mezcla de manera activa. Adicionalmente, el mezclado del catalizador y las unidades de glicano puede producirse como resultado de la redistribución de catalizadores poliméricos que se asientan por gravedad, o el mezclado no activo que se produce a medida que el material fluye a través de un reactor continuo.
En algunas realizaciones del método, el material de partida para la reacción de polimerización son una o más unidades de glicano seleccionadas de uno o más monosacáridos, uno o más disacáridos, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones del método, el material de partida para la reacción de polimerización son una o más unidades de glicano seleccionadas de un azúcar de furanosa y un azúcar de piranosa. En algunas realizaciones del método, el material de partida para la reacción de polimerización son una o más unidades de glicano seleccionadas de una tetrosa, una pentosa, una hexosa o una heptosa. En algunas realizaciones del método, el material de partida para la reacción de polimerización son una o más unidades de glicano seleccionadas de una glucosa, una galactosa, una arabinosa, una manosa, una fructosa, una xilosa, una fucosa y una ramnosa, todas opcionalmente en su forma o bien L o bien D, en configuración alfa o beta (para dímeros), y/o una forma desoxi, cuando sea aplicable, y cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, las unidades de glicano están sustituidas o derivatizadas con uno o más de un éster de acetato, semiéster de sulfato, éster de fosfato o un grupo acetal cíclico de piruvilo, o se han derivatizado de otra forma, por ejemplo, en uno o más grupos hidroxilo.
Las unidades de glicano usadas en los métodos descritos en el presente documento pueden incluir uno o más azúcares. En algunas realizaciones, el uno o más azúcares se seleccionan de monosacáridos, disacáridos y trisacáridos, o cualquier mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, el uno o más azúcares son monosacáridos, tales como uno o más monosacáridos C5 o C6. En algunas realizaciones, el uno o más azúcares son monosacáridos C5. En otras realizaciones, el uno o más azúcares son monosacáridos C6.
En algunas realizaciones del método, el material de partida para la reacción de polimerización son una o más unidades de glicano seleccionadas de aminoazúcares, desoxiazúcares, iminoazúcares, ácidos de azúcar, ácidos grasos de cadena corta y alcoholes de azúcar para producir glicanos híbridos.
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En algunas realizaciones, el material de partida para la reacción de polimerización son una o más unidades de glicano seleccionadas de monosacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo, pero sin limitarse a glicolaldehído, gliceraldehído, dihidroxiacetona, eritrosa, treosa, eritrulosa, arabinosa, lixosa, ribosa, xilosa, ribulosa, xilulosa, alosa, altrosa, galactosa, glucosa, gulosa, idosa, manosa, talosa, fructosa, psicosa, sorbosa, tagatosa, fucosa, fuculosa, ramnosa, manoheptulosa, sedoheptulosa, ácido neuramínico, ácido N-acetilneuramínico, N-acetilgalactosamina, N- acetilglucosamina, fructosamina, galactosamina, glucosamina, sorbitol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, xilitol, manitol, sorbitol, galactitol, fucitol y ácido láctico.
En algunas realizaciones, el material de partida para la reacción de polimerización son una o más unidades de glicano seleccionadas de disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo, pero sin limitarse a acarviosina, N- acetil-lactosamina, alolactosa, celobiosa, quitobiosa, galactosa-alfa-1,3-galactosa, gentiobiosa, isomalt, isomaltosa, isomaltulosa, kojibiosa, lactitol, ácido lactobiónico, lactosa, lactulosa, laminaribiosa, maltitol, maltosa, manobiosa, melibiosa, melibiulosa, neohesperidosa, nigerosa, robinosa, rutinosa, sambubiosa, soforosa, sucralosa, sacarosa, acetato-isobutirato de sacarosa, octaacetato de sacarosa, trehalosa, turanosa, vicianosa y xilobiosa.
En algunas realizaciones, el material de partida para la reacción de polimerización son una o más unidades de glicano seleccionadas de un aminoazúcar, un desoxiazúcar, un iminoazúcar, un ácido de azúcar, un ácido graso de cadena corta y un alcohol de azúcar.
En algunas realizaciones, la unidad de glicano puede existir como una sal (por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable), tal como, por ejemplo, una sal de clorhidrato, yodhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato, metanosulfonato, acetato, formiato, tartrato, malato, citrato, succinato, lactato, gluconato, piruvato, fumarato, propionato, aspartato, glutamato, benzoato, ascorbato.
Las unidades de glicano adecuadas incluyen aminoazúcares, tales como, por ejemplo acarbosa, N- acetilemanosamina, ácido N-acetilmurámico, ácido N-acetilneuramínico, ácido N-acetiletalosaminurónico, arabinopiranosil-N-metil-N-nitrosourea, D-fructosa-L-histidina, ácido N-acetilglicolineuramínico, quetosamina, quidamicina, manosamina, 1B-metilseleno-N-acetil-D-galactosamina, ácido murámico, dipéptido de muramilo, fosforibosilamina, PUGNAc, sialil-Lewis A, sialil-Lewis X, validamicina, voglibosa, N-acetilgalactosamina, N- acetilglucosamina, aspartilglucosamina, bacilitiol, daunosamina, desosamina, fructosamina, galactosamina, glucosamina, meglumina y perosamina.
Las unidades de glicano adecuadas incluyen desoxiazúcares, tales como, por ejemplo 1-5-ahidroglucitol, cladinosa, colitosa, 2-desoxi-D-glucosa, 3-desoxiglucasona, desoxirribosa, didesoxinucleótido, digitalosa, fludesoxiglucosa, sarmentosa y sulfoquinovosa.
Las unidades de glicano adecuadas incluyen iminoazúcares, tales como, por ejemplo castanospermina, 1- desoxinojirimicina, iminoazúcar, miglitol, miglustat y swainsonina.
Las unidades de glicano adecuadas incluyen ácidos de azúcar, tales como, por ejemplo ácido N-acetilneuramínico, ácido N-acetiltalosaminurónico, ácido aldárico, ácido aldónico, ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico, ácido glucurónico, ácido glucosaminurónico, ácido glicérico, ácido N-glicolilneuramínico, ácido idurónico, ácido isosacarínico, ácido pangámico, ácido siálico, ácido treónico, ácido ulosónico, ácido urónico, ácido xilónico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido cetodesoxioctulosónico, ácido galacturónico, ácido galactosaminurónico, ácido manurónico, ácido manosaminurónico, ácido tartárico, ácido múcico, ácido sacárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido oxálico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido butírico, ácido cítrico, ácido glucosamínico, ácido málico, ácido succinámico, ácido sebácico y ácido cáprico.
Las unidades de glicano adecuadas incluyen ácidos grasos de cadena corta, tales como, por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico y ácido isovalérico.
Las unidades de glicano adecuadas incluyen alcoholes de azúcar, tales como, por ejemplo, metanol, etilenglicol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, ribitol, xilitol, manitol, sorbitol, galactitol, iditol, volemitol, fucitol, inositol, maltotritol, maltotetraitol y poliglicitol.
Las unidades de glicano (por ejemplo azúcares) usadas en los métodos descritos en el presente documento pueden obtenerse de cualquier fuente comercialmente conocida, o producirse según cualquier método conocido en la técnica.
Condiciones de reacción
En algunas realizaciones, la unidad de glicano y el catalizador (por ejemplo, catalizador polimérico o catalizador con soporte sólido) se permite que reaccionen durante al menos 1 hora, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 4 horas, al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 16 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas o al menos 48 horas; o entre 1-24 horas, entre 2-12 horas, entre 3-6 horas, entre 1-96 horas, entre 12-72 horas o entre 12-48 horas.
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En algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos producidos según los métodos descritos en el presente documento puede regularse mediante el tiempo de reacción. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos se aumenta aumentando el tiempo de reacción, mientras que en otras realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos se disminuye disminuyendo el tiempo de reacción.
Temperatura de reacción
En algunas realizaciones, la temperatura de reacción se mantiene en el intervalo de aproximadamente 25°C a aproximadamente 150°C. En determinadas realizaciones, la temperatura es de desde aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 125°C, de aproximadamente 60°C a aproximadamente 120°C, de aproximadamente 80°C a aproximadamente 115°C, de aproximadamente 90°C a aproximadamente 110°C, de aproximadamente 95°C a aproximadamente 105°C o de aproximadamente 100°C a 110°C.
Cantidad de unidades de glicano
La cantidad de la unidad de glicano usada en los métodos descritos en el presente documento en relación con la cantidad de disolvente usada puede afectar a la velocidad de reacción y el rendimiento. La cantidad de la unidad de glicano usada puede caracterizarse mediante el contenido en sólidos secos. En determinadas realizaciones, el contenido en sólidos secos se refiere a los sólidos totales de una suspensión como un porcentaje en una base en peso seco. En algunas realizaciones, el contenido en sólidos secos de la unidad de glicano es de entre aproximadamente el 5% en peso y aproximadamente el 95% en peso, entre aproximadamente el 10% en peso y aproximadamente el 80% en peso, entre aproximadamente el 15% en peso y aproximadamente el 75% en peso, o entre aproximadamente el 15% en peso y aproximadamente el 50% en peso.
Cantidad de catalizador
La cantidad del catalizador usada en los métodos descritos en el presente documento puede depender de varios factores incluyendo, por ejemplo, la selección del tipo de unidad de glicano, la concentración de la unidad de glicano, y las condiciones de reacción (por ejemplo, temperatura, tiempo y pH). En algunas realizaciones, la razón en peso del catalizador con respecto a la unidad de glicano es de aproximadamente 0,01 g/g a aproximadamente 50 g/g, de aproximadamente 0,01 g/g a aproximadamente 5 g/g, de aproximadamente 0,05 g/g a aproximadamente 1,0 g/g, de aproximadamente 0,05 g/g a aproximadamente 0,5 g/g, de aproximadamente 0,05 g/g a aproximadamente 0,2 g/g, o de aproximadamente 0,1 g/g a aproximadamente 0,2 g/g.
Disolvente
En determinadas realizaciones, los métodos de uso del catalizador se llevan a cabo en un entorno acuoso. Un disolvente acuoso adecuado es agua, que puede obtenerse de diversas fuentes. Generalmente, son preferibles fuentes de agua con menores concentraciones de especies iónicas (por ejemplo, sales de sodio, fósforo, amonio o magnesio), ya que tales especies iónicas pueden reducir la eficacia del catalizador. En algunas realizaciones en las que el disolvente acuoso es agua, el agua tiene una resistividad de al menos 0,1 megaohmios-centímetro, de al menos 1 megaohmios-centímetro, de al menos 2 megaohmios-centímetro, de al menos 5 megaohmios-centímetro o de al menos 10 megaohmios-centímetro.
Contenido en agua
Además, a medida que avanza la reacción de deshidratación de los métodos, se produce agua con cada acoplamiento de la una o más unidades de glicano. En determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden incluir además la monitorización de la cantidad de agua presente en la mezcla de reacción y/o la razón de agua con respecto a monómero o catalizador a lo largo de un periodo de tiempo. En algunas realizaciones, el método incluye además eliminar al menos una porción del agua producida en la mezcla de reacción (por ejemplo, eliminando al menos aproximadamente cualquiera del 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 97%, el 99% o el 100%, tal como mediante filtración a vacío). Sin embargo, debe entenderse que la cantidad de agua con respecto a monómero puede ajustarse basándose en las condiciones de reacción y el catalizador específico usado.
Cualquier método conocido en la técnica puede usarse para eliminar el agua en la mezcla de reacción, incluyendo, por ejemplo, mediante filtración a vacío, destilación a vacío, calentamiento y/o evaporación. En algunas realizaciones, el método comprende incluir agua en la mezcla de reacción.
En algunos aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos de producción de una composición de oligosacáridos: combinando una unidad de glicano y un catalizador que tiene restos ácidos e iónicos para formar una mezcla de reacción, en los que el agua se produce en la mezcla de reacción; y eliminando al menos una porción del agua producida en la mezcla de reacción. En determinadas variaciones, al menos una porción del agua se elimina
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para mantener un contenido en agua en la mezcla de reacción de menos del 99%, menos del 90%, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 1% en peso.
En algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos producidos según los métodos descritos en el presente documento puede regularse ajustando o controlando la concentración de agua presente en la mezcla de reacción. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos se aumenta disminuyendo la concentración de agua, mientras que en otras realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos se disminuye aumentando la concentración de agua. En algunas realizaciones, el contenido en agua de la reacción se ajusta durante la reacción para regular el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos producidos.
En un ejemplo, a un matraz de fondo redondo equipado con un agitador superior y un condensador de trayectoria corta con camisa pueden añadírsele uno o más mono, dímero, trímero u otros oligosacáridos junto con el 1-50% (el 1-10%, el 1-20%, el 1-30%, el 1-40%, el 1-60%, el 1-70%) en peso seco de uno o más de los catalizadores descritos en el presente documento. Puede añadirse agua u otro disolvente compatible (0,1-5 equiv., 1-5 equiv., 1-4 equiv., 0,1-4 equiv.) a la mezcla seca y la suspensión puede combinarse a baja velocidad (por ejemplo 10-100 rpm, 50-200 rpm, 100-200 rpm) usando una paleta dimensionada para coincidir con el contorno del matraz de fondo redondo seleccionado tan estrechamente como sea posible. La mezcla se calienta hasta 70-180°C (70-160°C, 75-165°C, 80- 160°C) bajo una presión de vacío de 10-1000 mbar. La reacción puede agitarse durante de 30 minutos a 6 horas, eliminando constantemente el agua de la reacción. El progreso de la reacción puede monitorizarse mediante HPLC. La masa sólida obtenida mediante el proceso puede disolverse en un volumen de agua suficiente para crear una disolución de aproximadamente 50 Brix (gramos de azúcar por 100 g de disolución). Una vez completada la disolución, el catalizador sólido puede retirarse por filtración y la disolución de oligómeros puede concentrarse hasta aproximadamente 50-75 Brix, por ejemplo, mediante evaporación rotatoria. Opcionalmente, puede usarse un disolvente orgánico y los disolventes inmiscibles con agua pueden eliminarse mediante extracción bifásica y los disolventes miscibles con agua pueden eliminarse, por ejemplo, mediante evaporación rotatoria concomitante a la etapa de concentración.
Etapas de procesamiento adicionales
Opcionalmente, la preparación puede someterse a etapas de procesamiento adicionales. Las etapas de procesamiento adicionales pueden incluir, por ejemplo, etapas de purificación. Las etapas de purificación pueden incluir, por ejemplo, separación, dilución, concentración, filtración, desalación o intercambio iónico, separación cromatográfica o decoloración, o cualquier combinación de las mismas.
Decoloración
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen además una etapa de decoloración. El uno o más oligosacáridos producidos pueden someterse a una etapa de decoloración usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, tratamiento con un absorbente, carbono activado, cromatografía (por ejemplo, usando resina de intercambio iónico), hidrogenación y/o filtración (por ejemplo, microfiltración).
En determinadas realizaciones, el uno o más oligosacáridos producidos se ponen en contacto con un material absorbente de color a una temperatura particular, a una concentración particular, y/o durante una duración de tiempo particular. En algunas realizaciones, la masa de la especie absorbente de color en contacto con el uno o más oligosacáridos es de menos del 50% de la masa del uno o más oligosacáridos, menos del 35% de la masa del uno o más oligosacáridos, menos del 20% de la masa del uno o más oligosacáridos, menos del 10% de la masa del uno o más oligosacáridos, menos del 5% de la masa del uno o más oligosacáridos, menos del 2% de la masa del uno o más oligosacáridos o menos del 1% de la masa del uno o más oligosacáridos.
En algunas realizaciones, el uno o más oligosacáridos se ponen en contacto con un material absorbente de color. En determinadas realizaciones, el uno o más oligosacáridos se ponen en contacto con un material absorbente de color durante menos de 10 horas, menos de 5 horas, menos de 1 hora o menos de 30 minutos. En una realización particular, el uno o más oligosacáridos se ponen en contacto con un material absorbente de color durante 1 hora.
En determinadas realizaciones, el uno o más oligosacáridos se ponen en contacto con un material absorbente de color a una temperatura de desde 20 hasta 100 grados Celsius, de 30 a 80 grados Celsius, de 40 a 80 grados Celsius o de 40 a 65 grados Celsius. En una realización particular, el uno o más oligosacáridos se ponen en contacto con un material absorbente de color a una temperatura de 50 grados Celsius.
En determinadas realizaciones, el material absorbente de color es carbono activado. En una realización, el material absorbente de color es carbono activado en polvo. En otras realizaciones, el material absorbente de color es una resina de intercambio iónico. En una realización, el material absorbente de color es una resina de intercambio catiónico de base fuerte en una forma de cloruro. En otra realización, el material absorbente de color es poliestireno
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reticulado. En aún otra realización, el material absorbente de color es poliacrilato reticulado. En determinadas realizaciones, el material absorbente de color es Amberlite FPA91, Amberlite FPA98, Dowex 22, Dowex Marathon MSA o Dowex Optipore SD-2.
Intercambio iónico/desalación (desmineralización)
En algunas realizaciones, el uno o más oligosacáridos producidos se ponen en contacto con un material para eliminar sales, minerales y/o otras especies iónicas. En determinadas realizaciones, el uno o más oligosacáridos se hacen fluir a través de un par de columnas de intercambio aniónico/catiónico. En una realización, la columna de intercambio aniónico contiene una resina de intercambio de base débil en una forma de hidróxido y la columna de intercambio catiónico contiene una resina de intercambio de ácido fuerte en una forma protonada.
Separación y concentración
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen además aislar el uno o más oligosacáridos producidos. En determinadas variaciones, el aislamiento del uno o más oligosacáridos comprende separar al menos una porción del uno o más oligosacáridos de al menos una porción del catalizador, usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, centrifugación, filtración (por ejemplo, filtración a vacío, filtración por membrana) y asentamiento por gravedad. En algunas realizaciones, el aislamiento del uno o más oligosacáridos comprende separar al menos una porción del uno o más oligosacáridos de al menos una porción de cualquier azúcar sin reaccionar, usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, filtración (por ejemplo, filtración por membrana), cromatografía (por ejemplo, fraccionamiento cromatográfico), solubilidad diferencial y centrifugación (por ejemplo, centrifugación diferencial).
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen además una etapa de concentración. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los oligosacáridos aislados se someten a evaporación (por ejemplo, evaporación a vacío) para producir una composición de oligosacáridos concentrada. En otras realizaciones, los oligosacáridos aislados se someten a una etapa de secado por pulverización para producir un polvo de oligosacárido. En determinadas realizaciones, los oligosacáridos aislados se someten a tanto una etapa de evaporación como una etapa de secado por pulverización.
Contenido en agua
Además, a medida que progresa la reacción de deshidratación de los métodos, se produce agua con cada acoplamiento del uno o más azúcares. En determinadas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden incluir además monitorizar la cantidad de agua presente en la mezcla de reacción y/o la razón de agua con respecto a azúcar o catalizador a lo largo de un periodo de tiempo. En algunas realizaciones, el método incluye además eliminar al menos una porción del agua producida en la mezcla de reacción (por ejemplo, eliminando al menos aproximadamente cualquiera del 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 97%, el 99% o el 100%, tal como mediante filtración a vacío). Sin embargo, debe entenderse que la cantidad de agua con respecto a azúcar puede ajustarse basándose en las condiciones de reacción y catalizador específico usado.
Cualquier método conocido en la técnica puede usarse para eliminar el agua en la mezcla de reacción, incluyendo, por ejemplo, mediante filtración a vacío, destilación a vacío, calentamiento y/o evaporación. En algunas realizaciones, el método comprende incluir agua en la mezcla de reacción.
En algunos aspectos, se proporcionan en el presente documento métodos de producción de una composición de oligosacáridos: combinando una unidad de glicano y un catalizador que tiene restos ácidos e iónicos para formar una mezcla de reacción, en los que se produce agua en la mezcla de reacción; y eliminando al menos una porción del agua producida en la mezcla de reacción. En determinadas variaciones, al menos una porción del agua se elimina para mantener un contenido en agua en la mezcla de reacción de menos del 99%, menos del 90%, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos de 1% en peso.
En algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos producidos según los métodos descritos en el presente documento puede regularse ajustando o controlando la concentración de agua presente en la mezcla de reacción. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos se aumenta disminuyendo la concentración de agua, mientras que en otras realizaciones, el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos se disminuye aumentando la concentración de agua. En algunas realizaciones, el contenido en agua de la reacción se ajusta durante la reacción para regular el grado de polimerización del uno o más oligosacáridos producidos.
Fraccionamiento
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento incluyen además una etapa de
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fraccionamiento. Los oligo o polisacáridos preparados y purificados pueden separarse posteriormente mediante el peso molecular usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, cromatografía de líquidos de alta resolución, adsorción/desorción (por ejemplo cromatografía de carbono activado a baja presión) o filtración (por ejemplo, ultrafiltración o diafiltración). En determinadas realizaciones, los glicanos preparados y purificados se separan en conjuntos que representan el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98% o más del 98% de especies cortas (aproximadamente DP1-2), medias (aproximadamente DP3-10), largas (aproximadamente DP11-18) o muy largas (aproximadamente DP>18).
En determinadas realizaciones, los glicanos preparados se fraccionan mediante adsorción sobre un material carbonoso y la posterior desorción de las fracciones lavando el material con mezclas de un disolvente orgánico en agua a una concentración del 1%, el 5%, el 10%, el 20%, el 50% o el 100%. En una realización, el material de adsorción es carbón activado. En otra realización, el material de adsorción es una mezcla de carbón activado y un agente de carga tal como tierra de diatomeas o Celite 545 en una porción del 5%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40% o el 50% en volumen o en peso.
En realizaciones adicionales, los glicanos preparados se separan mediante el paso a través de un sistema de cromatografía de líquidos de alta resolución. En determinadas variaciones, los glicanos preparados se separan mediante cromatografía de afinidad iónica, cromatografía de interacción hidrófila o cromatografía de exclusión molecular incluyendo permeación en gel y filtración en gel.
En otras realizaciones, los materiales de bajo peso molecular se eliminan mediante métodos de filtración. En determinadas variaciones, los materiales de bajo peso molecular pueden eliminarse mediante diálisis, ultrafiltración, diafiltración o filtración de flujo tangencial. En determinadas realizaciones, la filtración se realiza en un aparato de tubo de diálisis estática. En otras realizaciones, la filtración se realiza en un sistema de filtración de flujo dinámico. En otras realizaciones, la filtración se realiza en cartuchos de filtración impulsada por fuerza centrífuga.
Características de preparaciones terapéuticas de glicanos
Los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento pueden comprender oligosacáridos y/o polisacáridos. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos comprenden homo-oligo o polisacáridos (u homoglicanos), en los que todos los monosacáridos en un polisacárido son del mismo tipo. Los productos terapéuticos de glicanos que comprenden homopolisacáridos pueden incluir monosacáridos unidos entre sí por medio de un solo tipo de enlace glicosídico o de múltiples tipos.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos comprenden hetero-oligo o polisacáridos (o heteroglicanos), en los que están presentes más de un tipo de monosacárido. Los productos terapéuticos de glicanos que comprenden heteropolisacáridos pueden incluir distintos tipos de monosacáridos unidos entre sí por medio de un solo tipo de enlace glicosídico o de múltiples tipos.
Los monosacáridos son los elementos estructurales de disacáridos (tales como sacarosa y lactosa) y polisacáridos (tales como celulosa y almidón). Los productos terapéuticos de glicanos pueden comprender un solo tipo de monosacárido (denominados homopolímeros u homoglicanos) o una mezcla (denominados heteropolímeros o heteroglicanos). Un oligosacárido es un polímero de sacáridos que contiene un pequeño número (normalmente de dos a nueve) de unidades de glicano (en este caso, monosacáridos).
Por ejemplo, los fructo-oligosacáridos (FOS), que se encuentran en muchos vegetales, consisten en cadenas cortas de moléculas de fructosa, algunas de las cuales están terminadas con una molécula de glucosa. Los galactooligosacáridos (GOS), que también se producen de manera natural, consisten en cadenas cortas de moléculas de galactosa. Estos compuestos pueden digerirse sólo parcialmente por los seres humanos. Los oligosacáridos se producen principalmente a partir de la descomposición de polímeros naturales tales como almidón o inulina, a partir de extracciones directas de sustancias naturales, tales como soja, o a partir de síntesis químicas o enzimáticas.
Los polisacáridos son moléculas de hidratos de carbono poliméricas compuestas por cadenas largas de unidades de glicano unidas entre sí mediante uniones, tales como, por ejemplo uniones glicosídicas. Los polisacáridos contienen más de diez unidades de glicano (en este caso, monosacáridos). Los polisacáridos que se producen de manera natural pueden tener una fórmula general de Cx(H2O)y en donde x es habitualmente un número grande, por ejemplo entre 10 y 2500. En algunas realizaciones, puede usarse hidrólisis para generar los monosacáridos u oligosacáridos constituyentes que son adecuados para producir los glicanos descritos en el presente documento. Las unidades de glicano, tales como por ejemplo monosacáridos, pueden existir en muchas formas diferentes, por ejemplo, confórmeros, formas cíclicas, formas acíclicas, estereoisómeros, tautómeros, anómeros e isómeros.
En algunas realizaciones, se crean preparaciones terapéuticas de glicanos (por ejemplo oligo o polisacáridos) que son polidispersas, que presentan un intervalo de grados de polimerización. Opcionalmente, las preparaciones pueden estar fraccionadas, por ejemplo representando el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98% o más del 98% de especies cortas (aproximadamente DP1-2), medias (aproximadamente DP3-
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En una realización, se proporciona una preparación terapéutica de glicanos polidispersa, fraccionada que comprende al menos el 85%, el 90% o al menos el 95% de especies de longitud media con un DP de aproximadamente 3-10. En una realización, se proporciona una preparación terapéutica de glicanos polidispersa, fraccionada que comprende al menos el 85%, el 90% o al menos el 95% de especies de longitud larga con un DP de aproximadamente 11-18. En una realización, se proporciona una preparación terapéutica de glicanos polidispersa, fraccionada que comprende al menos el 85%, el 90% o al menos el 95% de especies de longitud muy larga con un DP de aproximadamente 18-30. En algunas realizaciones, las preparaciones fraccionadas medias, largas y muy largas comprenden una razón de enlace glicosídico alfa con respecto a beta de desde 0,8:1 hasta 5:1 o desde 1:1 hasta 4:1. En algunas realizaciones, las preparaciones fraccionadas tienen un grado de ramificación promedio de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,2 o entre aproximadamente 0,05 y 0,1.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos que usan el catalizador polimérico dado a conocer para controlar la distribución de peso molecular de los glicanos. Por ejemplo, una mayoría, por ejemplo aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un DP de entre 2 y 25, entre 3 y 25, entre 4 y 25, entre 5 y 25, entre 6 y 25, entre 7 y 25, entre 8 y 25, entre 9 y 25, entre 10 y 25, entre 2 y 30, entre 3 y 30, entre 4 y 30, entre 5 y 30, entre 6 y 30, entre
7 y 30, entre 8 y 30, entre 9 y 30, o entre 10 y 30.
En una realización, la preparación terapéutica de glicanos tiene un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano.
En algunas realizaciones, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un DP de al menos 5 y menos de 30 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un DP de al menos
8 y menos de 30 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un DP de al menos 10 y menos de 30 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un DP de entre 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un DP de entre 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 unidades de glicano. En algunas realizaciones, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un DP de entre 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 unidades de glicano.
En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos tiene una distribución de grado de polimerización (DP) tras combinar la una o más unidades de glicano (por ejemplo azúcares) con el catalizador polimérico (por ejemplo, a las 2, 3, 4, 8, 12, 24 ó 48 horas tras combinar la una o más unidades de glicano (por ejemplo azúcares) con el catalizador) que es: DP2 = el 0%-40%, tal como menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos de 2%; o el 10%-30% o el 15%-25%; DP3 = el 0%-20%, tal como menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%; o el 5%-15%; y DP4+ = mayor del 15%, mayor del 20%, mayor del 30%, mayor del 40%, mayor del 50%; o el 15%-75%, el 20%-40% o el 25%-35%.
El rendimiento de conversión para la una o más unidades de glicano (por ejemplo azúcares) en los métodos descritos en el presente documento puede determinarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). En algunas realizaciones, el rendimiento de conversión en una preparación terapéutica de glicanos con DP > 1 tras combinar la una o más unidades de glicano con el catalizador (por ejemplo, a las 2, 3, 4, 8, 12, 24 ó 48 horas tras combinar la una o más unidades de glicano con el catalizador) es mayor de aproximadamente el 50% (por ejemplo, mayor de aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, 85%, el 90%, el 95% o el 98%). En algunas realizaciones, el rendimiento de conversión en una preparación terapéutica de glicanos con > DP2 tras combinar la una o más unidades de glicano con el catalizador (por ejemplo, a las 2, 3, 4, 8, 12, 24 ó 48 horas tras combinar la una o más unidades de glicano con el catalizador) es mayor del 30% (por ejemplo, mayor del 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 98%).
En una realización, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un DP de al menos 2. En una realización, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un DP de al menos 3.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones terapéuticas de glicanos, en las que al menos el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el
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En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones terapéuticas de glicanos, en las que al menos el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98%, el 99%, el 99,8% o al menos el 99,9% o incluso el 100% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un grado de polimerización (DP) de al menos 5 y menos de 30 unidades de glicano, al menos 8 y menos de 30 unidades de glicano.
En algunas realizaciones, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un grado de polimerización (DP) promedio de aproximadamente DP5, DP6, DP7, DP8, DP9, DP10, DP11 o DP12.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones terapéuticas de glicanos en las que al menos el 50%, el 60%, el 70% o el 80% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un grado de polimerización de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano, o de al menos 5 y menos de 25 unidades de glicano. En algunas realizaciones, el DP promedio de la preparación terapéutica de glicanos es de entre aproximadamente DP7 y DP9 o entre aproximadamente DP6 y DP10. En algunas realizaciones, estas preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden una razón de enlace glicosídico alfa con respecto a beta de desde 0,8:1 hasta 5:1 o desde 1:1 hasta 4:1. En algunas realizaciones, las preparaciones fraccionadas tienen un grado de ramificación promedio de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,2 o entre aproximadamente 0,05 y 0,1.
En algunas realizaciones, aproximadamente el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 97% de la preparación terapéutica de glicanos tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300,
1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800 g/mol y menos de 1900, 2000, 2100, 2200, 2300,
2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100,
4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900 y 5000 g/mol.
En algunas realizaciones, las preparaciones de glicanos (por ejemplo oligo o polisacáridos) oscilan en estructura de lineal a altamente ramificada. Los glicanos no ramificados pueden contener sólo uniones alfa o sólo uniones beta. Los glicanos no ramificados pueden contener al menos una unión alfa y al menos una unión beta. Los glicanos ramificados pueden contener al menos una unidad de glicano que está unida por medio de un enlace glicosídico alfa o uno beta de modo que se forma una ramificación. La tasa de ramificación o grado de ramificación (DB) puede variar, de manera que aproximadamente cada 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a, 8a, 9a, 10a, 15a, 20a, 25a, 30a, 35a, 40a, 45a, 50a, 60a o 70a unidad comprende al menos un punto de ramificación. Por ejemplo, el glucógeno animal contiene un punto de ramificación aproximadamente cada 10 unidades.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en las que la preparación comprende una mezcla de glicanos ramificados, en los que el grado de ramificación promedio (DB, puntos de ramificación por residuo) es de 0, 0,01,0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 0,95, 0,99, 1 ó 2. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en los que el grado de ramificación promedio es de al menos 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3 o al menos 0,4. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en los que el grado de ramificación promedio es de entre aproximadamente 0,01 y 0,1, 0,01 y 0,2, 0,01 y 0,3, 0,01 y 0,4, o 0,01 y 0,5. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en los que el grado de ramificación promedio no es 0. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en los que el grado de ramificación promedio no es de entre al menos 0,1 y menos de 0,4 o al menos 0,2 y menos de 0,4. En algunas realizaciones, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos comprenden glicanos lineales. En algunas realizaciones, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos comprenden glicanos que presentan una estructura ramificada o de ramificación sobre ramificación.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos en los que el grado de ramificación promedio (DB) no es 0, pero es de al menos 0,01, 0,05, 0,1 o al menos 0,2, o intervalos entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,2 o entre aproximadamente 0,05 y 0,1.
Algunos glicanos comprenden oligosacáridos que tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, ya sea o no el sacárido en el extremo reductor un azúcar reductor. Según la nomenclatura aceptada, la mayoría de los oligosacáridos se representan en el presente documento con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha. La mayoría de los oligosacáridos descritos en el presente documento se describen con el mismo nombre o abreviatura para el sacárido no reductor (por ejemplo, Gal o D-Gal), precedido o seguido por la configuración del enlace glicosídico (alfa o beta), el enlace al anillo, la posición del anillo del sacárido reductor implicado en el enlace, y luego el nombre o la abreviatura del sacárido reductor (por ejemplo, Glc o D-Glc). La unión (por ejemplo, unión glicosídica, unión galactosídica, unión glucosídica, etc.) entre dos unidades de azúcar puede
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expresarse, por ejemplo, como 1,4, 1->4 o (1-4), usados de manera intercambiable en el presente documento. Cada sacárido puede estar en forma cíclica (por ejemplo forma de piranosa o furanosa). Por ejemplo, la lactosa es un disacárido compuesto por formas cíclicas de galactosa y glucosa unidas mediante una unión beta (1-4) en la que el puente de oxígeno del acetal está en la orientación beta.
Las uniones entre las unidades de glicano individuales encontradas en preparaciones de productos terapéuticos de glicanos pueden incluir alfa 1->2, alfa 1->3, alfa 1->4, alfa 1->6, alfa 2->1, alfa 2->3, alfa 2->4, alfa 2->6, beta 1->2, beta 1 ->3, beta 1 ->4, beta 1 ->6, beta 2->1, beta 2->3, beta 2->4 y beta 2->6.
En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden sólo uniones alfa. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos comprenden sólo uniones beta. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos comprenden mezclas de uniones alfa y beta. En algunas realizaciones, la razón de enlace glicosídico alfa:beta en una preparación es de aproximadamente 0,1:1, 0,2:1, 0,3:1, 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,2:1, 1,5:1, 1,7:1, 2:1, 2,2:1, 2,5:1, 2,7:1, 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 o aproximadamente 10:1.
En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos comprende enlaces glicosídicos tanto alfa como beta seleccionados del grupo que consiste en enlace glicosídico 1->2, un enlace glicosídico 1->3, un enlace glicosídico 1->4, un enlace glicosídico 1->5 y un enlace glicosídico 1->6. En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos comprende al menos dos o al menos tres enlaces glicosídicos alfa y beta 1->2, enlaces glicosídicos alfa y beta 1->3, enlaces glicosídicos alfa y beta 1->4, enlaces glicosídicos alfa y beta 1->5, y/o enlaces glicosídicos alfa y beta 1->6. En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden una razón de enlace glicosídico alfa:beta en una preparación de aproximadamente 0,8:1, 1:1,2:1, 3:1, 4:1 o 5:1, u oscila entre aproximadamente 0,8:1 y aproximadamente 5:1 o entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 4:1.
En algunas realizaciones, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprenden una mezcla deseada de unidades de glicano con configuración alfa o beta, por ejemplo la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende una razón deseada, tal como: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:100, 1:150 de configuración alfa con respecto a beta o beta con respecto a alfa.
En algunas realizaciones, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprenden sustancialmente todas las unidades de glicano configuradas en alfa o beta, opcionalmente comprendiendo aproximadamente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, o el 20% de la otra configuración respectiva.
En algunas realizaciones, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos comprenden al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98%, el 99%, al menos el 99,9% o incluso el 100% de glicanos con enlaces glicosídicos alfa. En algunas realizaciones, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos comprenden al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98%, el 99%, al menos el 99,9% o incluso el 100% de glicanos con enlaces glicosídicos beta. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en las que al menos el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, o al menos el 85% de los glicanos con enlaces glicosídicos que son enlaces glicosídicos alfa, al menos el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80% o al menos el 85% de los glicanos con enlaces glicosídicos que son enlaces glicosídicos beta, y en las que el porcentaje de enlaces glicosídicos alfa y beta no supera el 100%.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en las que al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98%, el 99%, al menos el 99,9% o incluso el 100% de los enlaces glicosídicos de glicanos son uno o más de: enlaces glicosídicos 1->2, enlaces glicosídicos 1->3, enlaces glicosídicos 1->4 y enlaces glicosídicos 1->6. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en las que al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, al menos el 20% o el 25% cada de los enlaces glicosídicos de glicanos son enlaces glicosídicos 1->2, 1->3, 1->4 y 1->6. Opcionalmente, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos comprenden además al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80% o al menos el 85% de enlaces glicosídicos de glicanos que se seleccionan del grupo que consiste en: enlaces glicosídicos alfa 2->1, alfa 2->3, alfa 2->4, alfa 2->6, beta 2->1, beta 2->3, beta 2->4 y beta 2- >6.
En algunas realizaciones, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos comprenden glicanos con al
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menos dos enlaces glicosídicos seleccionados del grupo que consiste en alfa 1->2 y alfa 1->3, alfa 1->2 y alfa 1->4, alfa 1 ->2 y alfa 1 ->6, alfa 1 ->2 y beta 1 ->2, alfa 1 ->2 y beta 1 ->3, alfa 1 ->2 y beta 1 ->4, alfa 1 ->2 y beta 1 ->6, alfa 1 - >3 y alfa 1->4, alfa 1->3 y alfa 1->6, alfa 1->3 y beta 1->2, alfa 1->3 y beta 1->3, alfa 1->3 y beta 1->4, alfa 1->3 y beta 1 ->6, alfa 1 ->4 y alfa 1 ->6, alfa 1 ->4 y beta 1 ->2, alfa 1 ->4 y beta 1 ->3, alfa 1 ->4 y beta 1 ->4, alfa 1 ->4 y beta 1 - >6, alfa 1->6 y beta 1->2, alfa 1->6 y beta 1->3, alfa 1->6 y beta 1->4, alfa 1->6 y beta 1->6, beta 1->2 y beta 1->3, beta 1 ->2 y beta 1 ->4, beta 1 ->2 y beta 1 ->6, beta 1 ->3 y beta 1 ->4, beta 1 ->3 y beta 1 ->6, y beta 1 ->4 y beta 1 ->6.
Para preparaciones que comprenden productos terapéuticos de glicanos ramificados (por ejemplo aquellos con un DB de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 0,95, 0,99, 1 ó 2) que comprenden una cadena lateral, que puede ser una cadena lateral igual o diferente, la cadena lateral puede unirse por medio de una o más uniones beta y alfa, tales como (1-2), (1-3), (1-4), (1-6), (2-3), (2-6) u otras uniones adecuadas a la cadena principal.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en las que al menos una unidad de glicano es un azúcar en forma L. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de glicanos, en las que al menos una unidad de glicano es un azúcar en forma D. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de glicanos, en las que las unidades de glicano son azúcares en forma L o D tal como se producen de manera natural o son más comunes (por ejemplo D-glucosa, D-xilosa, L-arabinosa).
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende una mezcla deseada de formas L y D de unidades de glicano, por ejemplo de una razón deseada, tal como: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:100, 1:150 formas L con respecto a D o formas D con respecto a L.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende glicanos con sustancialmente todas las formas L o D de unidades de glicano, opcionalmente comprendiendo aproximadamente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19% o el 20% de la otra forma respectiva.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en las que al menos una unidad de glicano es una tetrosa, una pentosa, una hexosa o una heptosa. Opcionalmente, las unidades de glicano implicadas en la formación de los glicanos (por ejemplo una mezcla de polisacáridos u oligosacáridos ramificados) de la preparación terapéutica de glicanos varían. Los ejemplos de unidades de glicano de monosacárido incluyen hexosas, tales como glucosa, galactosa y fructosa, y pentosas, tales como xilosa. Los monosacáridos tienen generalmente la fórmula química: Cx(H2O)y, en donde convencionalmente x > 3. Los monosacáridos pueden clasificarse mediante el número x de átomos de carbono que contienen, por ejemplo: diosa (2), triosa (3), tetrosa (4), pentosa (5), hexosa (6) y heptosa (7). Las unidades de glicano de monosacárido pueden existir en una forma acíclica (cadena abierta). Los monosacáridos de cadena abierta con el mismo trazado molecular pueden existir como dos o más estereoisómeros. Los monosacáridos también pueden existir en una forma cíclica a través de una reacción de adición nucleófila entre el grupo carbonilo y uno de los hidroxilos de la misma molécula. La reacción crea un anillo de átomos de carbono cerrado mediante un átomo de oxígeno en puente. En estas formas cíclicas, el anillo tiene habitualmente 5 (furanosas) o 6 átomos (piranosas).
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende una mezcla deseada de diferentes unidades de glicano de monosacárido, tal como una mezcla de una diosa (2), una triosa (3), tetrosa (4), pentosa (5), hexosa (6) o heptosa (7), en cualquier razón deseada, por ejemplo para dos cualesquiera unidades de glicano: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:100, 1:150, etc., para tres cualesquiera unidades de glicano: 1:1:1, 1:2:1, 1:3:1, 1:4:1, 1:5:1, 1:6:1, 1:7:1, 1:8:1, 1:9:1, 1:10:1, 1:12:1, 1:14:1, 1:16:1, 1:18:1, 1:20:1, 1:1:2, 1:2:2, 1:3:2, 1:4:2, 1:5:2, 1:6:2, 1:7:2, 1:8:2, 1:9:2, 1:10:2, 1:1:3, 1:2:3, 1:3:3, 1:4:3, 1:5:3, 1:6:3, 1:7:3, 1:8:3, 1:9:3, 1:10:3, 1:1:4, 1:2:4, 1:3:4, 1:4:4, 1:5:4, 1:6:4, 1:7:4, 1:8:4, 1:9:4, 1:10:4, 1:1:5, 1:2:5, 1:3:5, 1:4:5, 1:5:5, 1:6:5, 1:7:5, 1:8:5, 1:9:5, 1: 10:5, etc., para cuatro cualesquiera unidades de glicano: 1:1:1:1, 1:2:2:1, 1:3:2:1, 1:4:2:1, 1:5:2:1, 1:6:2:1, 1:7:2:1, 1:8:2:1, 1:9:2:1, 1:10:2:1, 1:1:1:2, 1:2:2:2, 1:3:2:2, 1:4:2:2, 1:5:2:2, 1:6:2:2, 1:7:2:2, 1:8:2:2, 1:9:2:2, 1:10:2:2, etc., para cinco cualesquiera unidades de glicano: 1:1:1:1:1, 1:2:2:1:1, etc., para seis cualesquiera unidades de glicano: 1:1:1:1:1:1, 1:1:1:1:1:2, etc., para siete cualesquiera unidades de glicano: 1:1:1:1:1:1:1, 1:1:1:1:1:1:2, etc., y así sucesivamente.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende una mezcla deseada de dos, tres, cuatro o cinco unidades de glicano diferentes, tal como una mezcla de, por ejemplo, i) una o más unidades de glicano seleccionadas de monosacáridos, seleccionados de glucosa, una galactosa, una arabinosa, una manosa, una fructosa, una xilosa, una fucosa y una ramnosa; ii) una o más unidades de glicano seleccionadas de disacáridos seleccionados de acarviosina, n-acetil-lactosamina, alolactosa, celobiosa, quitobiosa, galactosa-alfa-1,3-galactosa, gentiobiosa, isomalt, isomaltosa, isomaltulosa, kojibiosa, lactitol, ácido lactobiónico, lactosa, lactulosa, laminaribiosa, maltitol, maltosa, manobiosa, melibiosa, melibiulosa, neohesperidosa, nigerosa, robinosa, rutinosa, sambubiosa, soforosa, sucralosa, sacarosa, acetato-isobutirato de sacarosa, octaacetato de sacarosa, trehalosa, turanosa,
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vicianosa y xilobiosa; iii) una o más unidades de glicano seleccionadas de aminoazúcares seleccionados de acarbosa, N-acetilemanosamina, ácido N-acetilmurámico, ácido N-acetilneuramínico, ácido N- acetiletalosaminurónico, arabinopiranosil-N-metil-N-nitrosourea, D-fructosa-L-histidina, ácido N- acetilglicolineuramínico, quetosamina, quidamicina, manosamina, 1B-metilseleno-N-acetil-D-galactosamina, ácido murámico, dipéptido de muramilo, fosforibosilamina, PUGNAc, sialil-Lewis A, sialil-Lewis X, validamicina, voglibosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, aspartilglucosamina, bacilitiol, daunosamina, desosamina, fructosamina, galactosamina, glucosamina, meglumina y perosamina; iv) una o más unidades de glicano seleccionadas de desoxiazúcares seleccionados de 1-5-ahidroglucitol, cladinosa, colitosa, 2-desoxi-D-glucosa, 3- desoxiglucasona, desoxirribosa, didesoxinucleótido, digitalosa, fludesoxiglucosa, sarmentosa y sulfoquinovosa; v) una o más unidades de glicano seleccionadas de iminoazúcares seleccionados de castanospermina, 1- desoxinojirimicina, iminoazúcar, miglitol, miglustat y swainsonina; una o más unidades de glicano seleccionadas de ácidos de azúcar seleccionados de ácido N-acetilneuramínico, ácido N-acetiletalosaminurónico, ácido aldárico, ácido aldónico, ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosónico, ácido glucurónico, ácido glucosaminurónico, ácido glicérico, ácido N-glicolilneuramínico, ácido idurónico, ácido isosacarínico, ácido pangámico, ácido siálico, ácido treónico, ácido ulosónico, ácido urónico, ácido xilónico, ácido glucónico, ácido ascórbico, ácido cetodesoxioctulosónico, ácido galacturónico, ácido galactosaminurónico, ácido manurónico, ácido manosaminurónico, ácido tartárico, ácido múcico, ácido sacárico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido oxálico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido butírico, ácido cítrico, ácido glucosamínico, ácido málico, ácido succinámico, ácido sebácico y ácido cáprico; vi) una o más unidades de glicano seleccionadas de ácidos grasos de cadena corta seleccionados de ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico y ácido isovalérico; y vii) una o más unidades de glicano seleccionadas de alcoholes de azúcar seleccionados de metanol, etilenglicol, glicerol, eritritol, treitol, arabitol, ribitol, xilitol, manitol, sorbitol, galactitol, iditol, volemitol, fucitol, inositol, maltotritol, maltotetraitol y poliglicitol.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende una unidad de glicano o pluralidad de unidades de glicano presentes en una forma de sal (por ejemplo, una forma de sal farmacéuticamente aceptable), tal como, por ejemplo, una sal de clorhidrato, yodhidrato, bromhidrato, fosfato, sulfato, metanosulfonato, acetato, formiato, tartrato, malato, citrato, succinato, lactato, gluconato, piruvato, fumarato, propionato, aspartato, glutamato, benzoato, ascorbato.
Los glicanos a modo de ejemplo se describen mediante un código de tres letras que representa el componente de azúcar monomérico seguido por un número de cien que refleja el porcentaje del material que constituye el monómero. Por tanto, ‘glu100’ se atribuye a un glicano generado a partir de un aporte del 100% de D-glucosa (unidad de glicano) y ‘glu50gal50’ se atribuye a un glicano generado a partir de un aporte del 50% de D-glucosa y el 50% de D-galactosa (unidades de glicano) o, alternativamente a partir de un aporte de dímero de lactosa (unidad de glicano). Tal como se usa en el presente documento: xil = D-xilosa; ara = L-arabinosa; gal = D-galactosa; glu = D- glucosa; rha = L-ramnosa; fuc = L-fucosa; man = D-manosa; sor = D-sorbitol; gli = D-glicerol; neu = ácido NAc- neuramínico.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende una unidad de glicano A seleccionada de i) a vii) anteriores, en la que la unidad de glicano A comprende el 100% del aporte de unidades de glicano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos se selecciona de los homoglicanos xyl100, rha100, ara100, gal100, glu100 y man100. En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos se selecciona de los homoglicanos fuc100 y fru100.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende una mezcla de dos unidades de glicano A y B seleccionadas independientemente de i) a vii) anteriores, en la que A y B pueden seleccionarse de un grupo igual o diferente i) a vii) y en la que A y B pueden seleccionarse en cualquier razón deseada (por ejemplo una cualquiera desde el 1 -99% de A y el 99-1 % de B, sin superar el 100%).
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos se selecciona de los heteroglicanos ara50gal50, xil75gal25, ara80xil20, ara60xil40, ara50xyl50, glu80man20, glu60man40, man60glu40, man80glu20, gal75xyl25, glu50gal50, man62glu38, y los glicanos híbridos glu90sor10 y glu90gly10.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende una mezcla de tres unidades de glicano A, B y C seleccionadas independientemente de i) a vii) anteriores, en la que A, B y C pueden seleccionarse de un grupo igual o diferente i) a vii) y en la que A, B y C pueden seleccionarse en cualquier razón deseada (por ejemplo una cualquiera desde el 1 -99% de A, el 1 -99% de B, el 1 -99% de C, sin superar el 100%).
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos se selecciona de los heteroglicanos xil75glu12gal12, xil33glu33gal33, glu33gal33fuc33, man52glu29gal19, y el glicano híbrido glu33gal33neu33.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende una mezcla de cuatro unidades de glicano A, B, C y D seleccionadas independientemente de i) a vii) anteriores, en la que A, B, C y D pueden seleccionarse de un grupo igual o diferente i) a vii) y en la que A, B, C y D pueden seleccionarse en cualquier razón deseada (por ejemplo una cualquiera desde el 1-99% de A, el 1-99% de B, el 1-99% de C, el 1-99%
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de D, sin superar el 100%).
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende una mezcla de cinco unidades de glicano A, B, C, D y E seleccionadas independientemente de i) a vii) anteriores, en la que A, B, C, D y E pueden seleccionarse de un grupo igual o diferente i) a vii) y en la que A, B, C, D y E pueden seleccionarse en cualquier razón deseada (por ejemplo una cualquiera desde el 1-99% de A, el 1-99% de B, el 1-99% de C, el 1-99% de D, el 1-99% de E, sin superar el 100%).
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en las que al menos una unidad de glicano se selecciona del grupo que consiste en una glucosa, una galactosa, una arabinosa, una manosa, una fructosa, una xilosa, una fucosa y una ramnosa.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende una mezcla deseada de dos unidades de glicano de monosacárido diferentes, tales como una mezcla de, por ejemplo, glucosa y galactosa, glucosa y arabinosa, glucosa y manosa, glucosa y fructosa, glucosa y xilosa, glucosa y fucosa, glucosa y ramnosa, galactosa y arabinosa, galactosa y manosa, galactosa y fructosa, galactosa y xilosa, galactosa y fucosa, y galactosa y ramnosa, arabinosa y manosa, arabinosa y fructosa, arabinosa y xilosa, arabinosa y fucosa, y arabinosa y ramnosa, manosa y fructosa, manosa y xilosa, manosa y fucosa, y manosa y ramnosa, fructosa y xilosa, fructosa y fucosa, y fructosa y ramnosa, xilosa y fucosa, xilosa y ramnosa, y fucosa y ramnosa, por ejemplo en una razón de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, o 1:100 o la razón inversa de las mismas.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende una mezcla deseada de tres unidades de glicano de monosacárido diferentes, tales como una mezcla de, por ejemplo para preparaciones terapéuticas de glicanos que contienen glucosa, glucosa, galactosa y arabinosa; glucosa, galactosa y manosa; glucosa, galactosa y fructosa; glucosa, galactosa y xilosa; glucosa, galactosa y fucosa, glucosa, galactosa y ramnosa; glucosa, arabinosa, y manosa; glucosa, arabinosa y fructosa; glucosa, arabinosa y xilosa; glucosa, arabinosa y fucosa; glucosa, arabinosa y ramnosa; glucosa, manosa y fructosa; glucosa, manosa y xilosa; glucosa, manosa y fucosa; glucosa, manosa ramnosa; glucosa, fructosa y xilosa; glucosa, fructosa y fucosa; glucosa, fructosa y ramnosa; glucosa, fucosa y ramnosa, por ejemplo en una razón de 1:1:1, 1:2:1, 1:3:1, 1:4:1, 1:5:1, 1:6:1, 1:7:1, 1:8:1, 1:9:1, 1:10:1, 1:12:1, 1:14:1, 1:16:1, 1:18:1, 1:20:1, 1:1:2, 1:2:2, 1:3:2, 1:4:2, 1:5:2, 1:6:2, 1:7:2, 1:8:2, 1:9:2, 1:10:2, 1:1:3, 1:2:3, 1:3:3, 1:4:3, 1:5:3, 1:6:3, 1:7:3, 1:8:3, 1:9:3, 1:10:3, 1:1:4, 1:2:4, 1:3:4, 1:4:4, 1:5:4, 1:6:4, 1:7:4, 1:8:4, 1:9:4, 1:10:4, 1:1:5, 1:2:5, 1:3:5, 1:4:5, 1:5:5, 1:6:5, 1:7:5, 1:8:5, 1:9:5, 1:10:5, etc.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende sustancialmente todas las unidades de monosacárido de diosa (2), comprendiendo opcionalmente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19% o el 20% de una triosa (3), tetrosa (4), pentosa (5), hexosa (6) o heptosa (7), o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende sustancialmente todas las unidades de monosacárido de triosa (3), comprendiendo opcionalmente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19% o el 20% de una diosa (2), tetrosa (4), pentosa (5), hexosa (6) o heptosa (7), o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende sustancialmente todas las unidades de monosacárido de tetrosa (4), comprendiendo opcionalmente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19% o el 20% de una diosa (2), triosa (3), pentosa (5), hexosa (6) o heptosa (7), o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende sustancialmente todas las unidades de monosacárido de pentosa (5), comprendiendo opcionalmente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19% o el 20% de una diosa (2), triosa (3) tetrosa (4), hexosa (6) o heptosa (7), o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende sustancialmente todas las unidades de monosacárido de hexosa (6), comprendiendo opcionalmente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19% o el 20% de una diosa (2), triosa (3), tetrosa (4), pentosa (5) o heptosa (7), o cualquier combinación de las mismas.
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En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende sustancialmente todas las unidades de monosacárido de heptosa (7), comprendiendo opcionalmente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19% o el 20% de una diosa (2), triosa (3), tetrosa (4), pentosa (5) o hexosa (6), o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, en las que al menos una unidad de glicano es un azúcar de furanosa. En algunas realizaciones, se proporcionan preparaciones de glicanos, en las que al menos una unidad de glicano es un azúcar de piranosa. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos comprenden mezclas de azúcares de furanosa y piranosa. En algunas realizaciones, la razón de azúcar de furanosa:piranosa en una preparación es de aproximadamente 0,1:1, 0,2:1,
0. 3:1, 0,4:1, 0,5:1,0,6:1, 0,7:1, 0,8:1, 0,9:1, 1:1, 1,2:1, 1,5:1, 1,7:1,2:1,2,2:1, 2,5:1, 2,7:1, 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 o aproximadamente 10:1.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo oligosacáridos y polisacáridos) comprende una mezcla deseada de azúcares de furanosa y piranosa, por ejemplo de una razón deseada, tal como: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:100, 1:150 de furanosa con respecto a piranosa o de piranosa con respecto a furanosa.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende sustancialmente todo el azúcar de furanosa o piranosa, comprendiendo opcionalmente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19% o el 20% del otro azúcar respectivo.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende sustancialmente todo el azúcar de piranosa y no más de aproximadamente el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, o no más del 5% de unidades de glicano monoméricas en la preparación en forma de furanosa. En algunas realizaciones, no más del 3%, el 2% o no más del 1% de unidades de glicano monoméricas en la preparación están en forma de furanosa.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos no comprende N-acetilgalactosamina o N-acetilglucosamina. En algunas realizaciones, la preparación de glicanos no comprende ácido siálico. En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos no comprende un lípido y ácido graso. En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos no comprende un aminoácido.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos no comprende una unidad de repetición detectable. En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos no comprende una cantidad estadísticamente significativa de una unidad de repetición. En algunas realizaciones, la unidad de repetición tiene un DP de al menos 2, 3, 4, 5 o al menos 6 unidades de glicano. Por ejemplo, el hialuronano es un glucosaminoglucano con una unidad de disacárido de repetición que consiste en dos derivados de glucosa, glucuronato (ácido glucurónico) y N-acetilglucosamina. Las uniones glicosídicas son beta (1->3) y beta (1->4). La celulosa es un polímero compuesto por unidades de glucosa repetidas unidas por uniones beta. La presencia y cantidad de unidades de repetición puede determinarse, por ejemplo usando hidrólisis total (por ejemplo para determinar la proporción de unidades de glicano), análisis de metilación (por ejemplo para determinar la distribución de tipos de enlaces) y HSQC (por ejemplo para determinar la distribución de alfa- y beta-glicósidos). Un experto en la técnica conoce métodos estadísticos para determinar la significación.
Si se desea, las unidades de glicano de monosacárido u oligosacárido de los glicanos se sustituyen o derivatizan adicionalmente, por ejemplo, los grupos hidroxilo pueden eterificarse o esterificarse. Por ejemplo, los glicanos (por ejemplo oligo o polisacárido) pueden contener unidades de sacárido modificadas, tales como 2’-desoxirribosa en la que un grupo hidroxilo se elimina, 2’-fluororribosa en la que un grupo hidroxilo se reemplaza por un flúor, o N- acetilglucosamina, una forma de glucosa que contiene nitrógeno (por ejemplo, 2’-fluororribosa, desoxirribosa y hexosa). El grado de sustitución (DS, número promedio de grupos hidroxilo por unidad de glicosilo) puede ser de 1, 2 ó 3, u otro DS adecuado. En algunas realizaciones, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% de las unidades de glicano se sustituyen o derivatizan. En algunas realizaciones, el grado de sustitución varía entre las subunidades, por ejemplo, un determinado porcentaje no se derivativa, presenta un DS de
1, presenta un DS de 2 o presenta un DS de 3. Puede generarse cualquier mezcla deseada, por ejemplo el 0-99% de las subunidades no se derivatizan, el 0-99% de las subunidades presentan un DS de 1, el 0-99% de las subunidades presentan un DS de 2 y el 0-99% de las subunidades presentan un DS de 3, constituyendo el total el 100%. El grado de sustitución puede controlarse ajustando el número promedio de moles de sustituyente añadido a un resto glicosilo (sustitución molar (MS)). La distribución de sustituyentes a lo largo de la longitud de la cadena de oligo o polisacárido del glicano puede controlarse ajustando las condiciones de reacción, el tipo de reactivo y la magnitud de sustitución. En algunas realizaciones, las subunidades monoméricas se sustituyen con uno o más de
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un éster de acetato, semiéster de sulfato, éster de fosfato o un grupo acetal cíclico de piruvilo.
El porcentaje molar de especies con un grado de polimerización (DP) de n (indicado en el presente documento como DP(n)) en una población se determina mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), por ejemplo, en un instrumento de la serie Agilent 1260 BioInert equipado con un detector de índice de refracción (RI) y una variedad de columnas familiares para los expertos en la técnica usando agua como fase móvil. Las columnas se seleccionan de químicas incluyendo, pero sin limitarse a, HILIC, coordinación de metales y cromatografía de exclusión molecular acuosa que aíslan de la mejor manera la especie de interés. El % molar DP(n) se determina mediante la fórmula:
% DP(n) = 100 * AUC [DP(n)] / AUC [DP(total)],
en donde AUC se define como el área bajo la curva para la especie de interés tal como se determina mediante calibración con patrones conocidos. El porcentaje molar de isómeros de enlace glicosídico (% de alfa y % de beta) se determina mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) usando una variedad de técnicas bidimensionales familiares para los expertos en la técnica. Los isómeros alfa y beta pueden distinguirse, por ejemplo, por su desplazamiento distinto en el espectro de RMN y el porcentaje molar se determina mediante la fórmula:
% de (isómero glicosídico n) de enlaces glicosídicos = 100 * AUC [desplazamiento (isómero n)] / AUC [desplazamiento (isómero alfa + isómero beta)],
en donde AUC se define como el área bajo la curva a un valor de desplazamiento específico que se sabe que representa el isómero n deseado. El porcentaje molar de isómeros regioquímicos se determina de un modo análogo usando la fórmula:
% de (regioisómero n) de regioisómeros = 100 * AUC [desplazamiento (regioisómero n)] / AUC [desplazamiento (todos los regioisómeros)].
El porcentaje relativo de azúcares monoméricos que constituyen la población oligomérica se determina, por ejemplo, mediante digestión ácida total de la muestra oligomérica seguido por conversión en el acetato de alditol seguido por análisis de cromatografía de gases (CG) de las disoluciones monoméricas resultantes en comparación con CG de patrones conocidos. El porcentaje molar de monómero (n), en donde n puede ser cualquier azúcar, se determina mediante la fórmula:
% de (azúcar n) = 100 * AUC [azúcar n] / AUC [total de todos los azúcares monoméricos].
En algunas realizaciones, la solubilidad de la preparación de productos terapéuticos de glicanos puede controlarse, por ejemplo seleccionando la carga, estructura (por ejemplo DP, grado de ramificación) y/o derivatización de las unidades de glicano.
Las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos que consisten en un único tipo de unidad de azúcar unida de manera uniforme en cadenas lineales son habitualmente insolubles en agua a 23°C incluso cuando los glicanos tienen un peso molecular bajo con grados de polimerización (DP) de entre 20 y 30. El grado de solubilidad de los productos terapéuticos de glicanos puede ajustarse, por ejemplo mediante la introducción de uniones (1->6) y enlaces glicosídicos alternos en los glicanos. Los grados de libertad extra proporcionados por la rotación alrededor de los enlaces C-5 a C-6 proporcionan mayores valores de entropía de disolución. Homoglicanos con dos tipos de uniones de azúcar o heteroglicanos compuestos por dos tipos de azúcares son generalmente más solubles que polímeros homogéneos. La ionización de homoglicanos lineales puede añadir solubilidad, por ejemplo a la de los geles. La viscosidad de las disoluciones depende a menudo de las estructuras terciarias de los glicanos.
En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos están altamente ramificadas, por ejemplo tienen un DB promedio de al menos 0,01, 0,05 ó 0,1. En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos tienen un DB promedio de 0,1 a 0,2. Las preparaciones terapéuticas de glicanos que comprenden oligosacárido ramificado son altamente solubles. En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos pueden concentrarse hasta al menos 55 Brix, 65 Brix, 60 Brix, 65 Brix, 70 Brix, 75 Brix, 80 Brix o al menos 85 Brix sin solidificación o cristalización obvias a 23°C (límite de solubilidad final). En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos se concentran hasta al menos aproximadamente 0,5 g/ml, 1 g/ml, 1,5 g/ml, 2 g/ml, 2,5 g/ml, 3 g/ml, 3,5 g/ml o al menos 4 g/ml sin solidificación o cristalización obvias a 23°C (límite de solubilidad final).
En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos (por ejemplo oligosacáridos) están ramificadas, por ejemplo tienen un DB promedio de al menos 0,01, 0,05 ó 0,1 y tienen un límite de solubilidad final en agua de al menos aproximadamente 70 Brix, 75 Brix, 80 Brix o al menos aproximadamente 85 Brix a 23°C o es al menos de aproximadamente 1 g/ml, 2 g/ml o al menos aproximadamente 3 g/ml.
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En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos tiene un límite de solubilidad final de al menos 0,001 g/l, 0,005 g/l, 0,01 g/l, 0,05 g/l, 0,1 g/l, 0,2 g/l, 0,3 g/l, 0,4 g/l, 0,5 g/l, 0,6 g/l, 0,7 g/l, 0,8 g/l, 0,9 g/l, 1 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 100 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 600 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l en agua desionizada, o en un tampón adecuado tal como, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 o pH fisiológico similar) y a 20°C. En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos tiene una solubilidad mayor del 50%, mayor del 60%, mayor del 70%, mayor del 80%, mayor del 90%, mayor del 95%, mayor del 96%, mayor del 97%, mayor del 98%, mayor del 99% o mayor del 99,5% sin precipitación observada a una concentración de más de 0,001 g/l, 0,005 g/l, 0,01 g/l, 0,05 g/l, 0,1 g/l, 0,2 g/l, 0,3 g/l, 0,4 g/l, 0,5 g/l, 0,6 g/l, 0,7 g/l, 0,8 g/l, 0,9 g/l, 1g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l, 50 g/l, 100 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l, 500 g/l, 600 g/l, 700 g/l, 800 g/l, 900 g/l, 1000 g/l en agua desionizada, o en un tampón adecuado tal como, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4 o pH fisiológico similar) y a 20°C.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos tiene un grado de dulzor deseado. Por ejemplo, la sacarosa (azúcar de mesa) es el prototipo de una sustancia dulce. La sacarosa en disolución tiene una clasificación de percepción del dulzor de 1, y otras sustancias se clasifican en relación a esto (por ejemplo, la fructosa se clasifica a 1,7 veces el dulzor de la sacarosa). En algunas realizaciones, el dulzor de la preparación de productos terapéuticos de glicanos oscila entre 0,1 y 500.000 en relación con la sacarosa. En algunas realizaciones, el dulzor relativo es de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 25000, 50000, 75000, 100000, 150000, 200000, 250000, 300000, 350000, 40000, 450000, 500000 o más de 500.000 en relación con la sacarosa (con la sacarosa puntuada como uno). En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos es ligeramente dulce, o tanto dulce como amarga.
En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos, por ejemplo una preparación que es sustancialmente DP2+ o Dp3+ (por ejemplo al menos el 80%, el 90% o al menos el 95%, o una preparación fraccionada de DP2+ o DP3+), tiene un dulzor sustancialmente imperceptible y el dulzor relativo es de aproximadamente 0, 0,0001, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o aproximadamente 0,8 en relación con la sacarosa (con la sacarosa puntuada como uno).
Identificación y caracterización de preparaciones terapéuticas de glicanos
Si se desea, las preparaciones terapéuticas de glicanos pueden caracterizarse. Por ejemplo, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos que se ha identificado en uno o más ensayos in vitro o in vivo que aumentan el crecimiento de bacterias que promueven la salud o que suprimen el crecimiento de patógenos microbianos pueden caracterizarse adicionalmente mediante cualquier método conocido en la técnica y mediante los métodos descritos en el presente documento. Se describen adicionalmente métodos adecuados en los ejemplos.
Para preparaciones terapéuticas de glicanos, los elementos estructurales monoméricos (por ejemplo la composición de monosacáridos o unidades de glicano), la configuración anomérica de cadenas laterales, la presencia y ubicación de grupos sustituyentes, el grado de polimerización/peso molecular y el patrón de unión pueden identificarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo análisis de metilación, escisión reductora, hidrólisis, CG-EM (cromatografía de gases-espectrometría de masas), MALDI-EM (espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz), ESI-EM (espectrometría de masas de ionización por electrospray), HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución con detección por ultravioleta o índice de refracción), HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada), CE (electroforesis capilar), técnicas de espectroscopía de IR (infrarrojos)/espectroscopía de Raman y RMN (resonancia magnética nuclear). Para polímeros de consistencia cristalina, la estructura cristalina puede resolverse usando, por ejemplo, RMN en estado sólido, FT-IR (espectroscopía intrarroja con transformada de Fourier) y WAXS (dispersión de rayos X de ángulo ancho). El DP, distribución de DP y polidispersidad pueden determinarse, por ejemplo, mediante viscosimetría y SEC (SEC-HPLC, cromatografía de exclusión molecular de alta resolución). Pueden identificarse grupos foráneos, grupos de extremo y sustituyentes, por ejemplo, usando SEC con marcaje, analítica acuosa, MALDI-EM, FT-IR y RMN. Para identificar los componentes monoméricos de los glicanos pueden usarse métodos tales como, por ejemplo hidrólisis catalizada por ácido, HPLC (cromatografía de líquidos de alta resolución) o GLC (cromatografía de gases-líquidos) (tras la conversión en acetatos de alditol). Para determinar las uniones presentes en los glicanos, en un ejemplo, el polisacárido se metila con yoduro de metilo y se realiza una hidrólisis de base fuerte en DMSO, se logra una reducción a alditoles parcialmente metilados, se realiza una acetilación a acetatos metilados, y se lleva a cabo el análisis mediante gLc/EM (cromatografía de gases-líquidos acoplada con espectrometría de masas). En algunas realizaciones, para determinar la secuencia del polisacárido se lleva a cabo una despolimerización parcial usando un ácido o enzimas para determinar las estructuras. Se comparan las posibles estructuras del polisacárido con las de los oligómeros hidrolíticos, y se determina cuál de las posibles estructuras podría producir los oligómeros. Para identificar la configuración anomérica, en un ejemplo, se somete el polisacárido intacto o una preparación de oligosacáridos a análisis enzimático, por ejemplo se ponen en contacto con una enzima que es específica para un tipo particular de unión, por ejemplo, p-galactosidasa, o a-glucosidasa, etc., y puede usarse RMN para analizar los productos.
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Por ejemplo, la distribución de grado de polimerización (DP) (o promedio) de una preparación terapéutica de glicanos puede medirse inyectando una muestra con una concentración de, por ejemplo, 10-100 mg/ml sobre un instrumento de HPLC Agilent 1260 BioPure (o similar) equipado con una columna BioRad Aminex HPX-42A de 7,8x300 (o similar) y detector de RI tal como se describe, por ejemplo, en Gómez et al. (Purification, Characterization, and Prebiotic Properties of Pectic Oligosaccharides from Orange Peel Wastes, J Agric Food Chem, 2014, 62:9769). Alternativamente, puede inyectarse una muestra con una concentración en un instrumento de HPLC Dionex ICS5000 (o similar) equipado con una columna Dionex CarboPac PA1 de 4x250 mm (o similar) y detector de PAD tal como se describe, por ejemplo, en Holck et al., (Feruloylated and nonferuloylated arabino-oligosaccharides from sugar beet pectin selectively stimulate the growth of Bifidobacterium spp. in human fecal in vitro fermentations, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(12), 6511-6519). La integración del espectro resultante en comparación con una disolución patrón de oligómeros permite la determinación del DP promedio.
La distribución de pesos moleculares puede medirse, por ejemplo, por espectrometría de masas de MALDI. La concentración de oligosacáridos puede medirse con un refractrómetro de azúcar de Mettler-Toledo (o similar) con el valor final ajustado frente a una curva normalizada para compensar diferencias de refracción entre monómeros y oligómeros.
La distribución de la regioquímica de glicósidos puede caracterizarse, por ejemplo, mediante una variedad de técnicas de 2D-RMN incluyendo análisis de COSY, HMBC, HSQC, DEPT y TOCSY usando secuencias de pulso convencionales y un espectrómetro Bruker 500 MHz. Los picos pueden asignarse mediante correlación con los espectros de polisacáridos que se producen de manera natural con regioquímica conocida.
En algunas realizaciones, la asignación de picos relativos de una muestra depende de varios factores incluyendo, pero sin limitarse a, la concentración y pureza de la muestra, la identidad y calidad del disolvente (por ejemplo, el disolvente marcado isotópicamente), y la secuencia de pulsos utilizada. Como tal, en realizaciones, la asignación de picos relativos de, por ejemplo, un glicano que comprende glucosa puede variar (por ejemplo, en aproximadamente 0,01 ppm, aproximadamente 0,02 ppm o aproximadamente 0,05 ppm) cuando el espectro de RMN se obtiene en condiciones similares debido a dichos factores. En estos casos, tal como se usa en el presente documento, los términos “pico correspondiente” o “picos correspondientes” se refieren a picos de RMN asociados con la misma muestra pero que varían (por ejemplo, en aproximadamente 0,01 ppm, aproximadamente 0,02 ppm o aproximadamente 0,05 ppm) debido a factores que incluyen, por ejemplo, la concentración y pureza de la muestra, la identidad y calidad del disolvente marcado isotópicamente, y la secuencia de pulsos utilizada.
Las composiciones monoméricas de oligómeros pueden medirse, por ejemplo, mediante el método de hidrólisis completa en el que una cantidad conocida de oligómero se disuelve en un ácido fuerte a temperatura elevada y se deja suficiente tiempo para que se produzca una hidrólisis total. La concentración de monómeros individuales puede medirse entonces mediante los métodos de HPLC o CG descritos en el presente documento y conocidos en la técnica para lograr mediciones de abundancia relativa como en Holck et al. Las cantidades absolutas pueden medirse realizando adiciones conocidas a la muestra de HPLC con una cantidad conocida de patrón activo de detector seleccionado para el solapamiento con cualquiera de las señales críticas.
El grado de ramificación en cualquier población dada puede medirse mediante el método de análisis de metilación establecido, por ejemplo, por Hakomori (J. Biochem. (Tokyo), 1964, 55, 205). Con estos datos, puede establecerse la identificación de posibles unidades de repetición combinando datos de la hidrólisis total, DP promedio y análisis de metilación y comparándolos con el espectro de RMN de DEPT. La correlación del número de señales de carbono anomérico con estos datos indica si una unidad de repetición regular se requiere para satisfacer los datos recogidos tal como se demuestra, por ejemplo, en Harding, et al. (Carbohydr. Res. 2005, 340, 1107).
La preparación de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo los que comprenden unidades de glicano de monosacárido o disacárido tales como glucosa, galactosa, fucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa y manosa) puede identificarse usando uno, dos, tres o cuatro de los siguientes parámetros: a) la presencia de 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más (por ejemplo al menos 4 ó 5) picos de RMN anoméricos de diagnóstico representando cada uno un tipo de enlace glicosídico diferente, b) una razón de enlace alfa con respecto a beta entre de aproximadamente 0,8 a 1 y de aproximadamente 5 a 1 (por ejemplo entre aproximadamente 1:1 y 4:1, favoreciendo comúnmente el tipo de enlace alfa), c) al menos 2 o al menos 3 regioquímicas de glicósidos diferentes de la lista de sustituidos en 1,2; 1,3; 1,4; y 1,6 y al menos 2 o al menos 3 regioquímicas de glicósidos diferentes de la lista de sustituidos en 1,2,3; 1,2,4; 1,2,6; 1,3,4; 1,3,6; y 1,4,6, y d) una distribución de DP en la que al menos el 50%, el 60%, el 70% o al menos el 80% de las especies individuales tienen un DP de al menos 2, al menos 3, entre 3 y 30 o entre 5 y 25. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos representan una clase estructural única distinta de oligosacáridos que se producen de manera natural. En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos tienen propiedades promedio novedosas (por ejemplo, DP, DB, razón de enlace glicosídico alfa:beta) que son distintas de las preparaciones de oligosacáridos que se producen de manera natural. Estas características estructurales pueden cuantificarse mediante los métodos descritos en el presente documento. Las preparaciones terapéuticas de glicanos descritas en el presente documento tienen al menos una, dos, tres, cuatro o al menos cinco de las siguientes características:
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(i) una distribución de pesos moleculares que oscila, por ejemplo entre aproximadamente DP3 y aproximadamente DP30 o entre aproximadamente DP5 y aproximadamente DP25 que puede identificarse mediante mediciones de espectrometría de masas cuantitativa, SeC-HPLC, IAC-HPLC o IEC-HPLC;
(ii) una proporción significativa de enlaces tanto alfa como beta, con razones de enlaces, por ejemplo, que oscila entre 0,8:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 y 5:1 (favoreciendo generalmente la esteroquímica alfa) que puede identificarse mediante una variedad de técnicas de RMN incluyendo la secuencia de pulso de HSQC que permite una discriminación y cuantificación explícitas de señales de glicósidos alfa y beta. La presencia de enlaces glicosídicos tanto alfa como beta en las razones observadas (véase la tabla 6, que muestra la presencia de una gran proporción de enlaces tanto alfa como beta a lo largo de los glicanos de un único o de múltiples azúcares sometidos a prueba) en la preparación terapéutica de glicanos de algunas realizaciones, es distinta de preparaciones de oligo o polisacáridos que se producen de manera natural que favorecen generalmente una estereoquímica glicosídica primaria y opcionalmente comprenden sólo una porción relativamente pequeña de la estereoquímica opuesta;
(iii) presencia de al menos uno, dos, tres o cuatro regioquímicas de glicósidos que pueden identificarse o bien mediante un procedimiento de RMN de huella o bien mediante la identificación de ramificaciones de permetilación desarrollada por Hakomori, et al. En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos tienen al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9% o al menos el 10% de uno, dos, tres o cuatro de los tipos de enlace glicosídico 1,2; 1,3; 1,4 y 1,6. En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos tienen al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9% o al menos el 10% de dos de los tipos de enlaces glicosídicos 1,2; 1,3; 1,4 y 1,6. En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos tienen al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9% o al menos el 10% de tres de los tipos de enlaces glicosídicos 1,2; 1,3; 1,4 y 1,6. En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos tienen al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9% o al menos el 10% de los cuatro tipos de enlaces glicosídicos 1,2; 1,3; 1,4 y 1,6. En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos comprende adicionalmente al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4% o al menos el 5% de tipos de enlaces ramificados. En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos comprende al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4% o al menos el 5% de al menos uno, dos o al menos tres tipos de enlaces ramificados incluyendo pero sin limitarse a glicósidos 1,3,6; 1,4,6; o 1,2,4. En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos comprende al menos dos tipos de enlaces ramificados de glicósidos 1,3,6; 1,4,6; o 1,2,4. En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos comprende al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4% o al menos el 5% de tres tipos de enlaces ramificados de glicósidos 1,3,6; 1,4,6; o 1,2,4. Los azúcares que no tienen un grupo hidroxilo en una posición dada X no tendrán el tipo de enlace 1,X, por ejemplo la fucosa (6-deshidroxi-galactosa) no tendrá enlaces glicosídicos 1,6 pero tendrá enlaces glicosídicos 1,2; 1,3; y 1,4. En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos comprende al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2% o al menos el 3% de unidades de glicano monoméricas en forma de furanosa. La presencia de un gran número de regioquímicas de glicósidos y ramificación (véase la figura 4 para 3 glicanos a modo de ejemplo) en la preparación terapéutica de glicanos de algunas realizaciones, es distinta de las preparaciones de oligo o polisacáridos que se producen de manera natural que favorecen generalmente arquitecturas de enlaces específicas. Aunque se sabe que todas estas regioquímicas se producen en oligosacáridos de fuentes naturales, las preparaciones de oligosacárido de fuentes naturales no comprenden el número y la complejidad de regioquímicas que presentan preparaciones terapéuticas de glicanos de algunas realizaciones.
(iv) Una distribución de enlaces glicosídicos que representa al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80% o al menos el 90% de todas las posibles combinaciones de regio y estereoquímicas. Individualmente, la distribución regioquímica puede determinarse mediante análisis de ramificación y la distribución estereoquímica puede determinarse mediante RMN. La HSQC-RMN. En algunas realizaciones, las preparaciones terapéuticas de glicanos presentan una diversidad de picos en la región anomérica que están asociados con una combinación multiplicativa de tanto regioquímica como estereoquímica. En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos comprende al menos dos o al menos tres de glicósidos alfa-1,2; alfa-1,3; alfa-1,4; y alfa-1,6 y al menos dos, o al menos tres de glicósidos beta-1,2; beta-1,3; beta-1,4; y beta-1,6. En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos comprende los cuatro de glicósidos alfa-1,2; alfa-1,3; alfa-1,4; y alfa-1,6 y los cuatro de glicósidos beta-1,2; beta-1,3; beta-1,4; y beta-1,6. Como ejemplo, HSQC de una preparación de glu100 muestra que la preparación contiene todos de glicósidos alfa-1,2; alfa-1,3; alfa-1,4; y alfa-1,6 así como todos de glicósidos beta-1,2; beta-1,3; beta-1,4; y beta- 1,6. Los azúcares que no tienen un grupo hidroxilo en una posición dada X no tendrán el tipo de enlace 1,X, por ejemplo fucosa (6-deshidroxi-galactosa) no tendrá enlaces glicosídicos 1,6 pero tendrá enlaces glicosídicos 1,2; 1,3; y 1,4;
(v) una “huella” de HSQC única que es el resultado de la naturaleza aditiva de la secuencia de pulsos de HSQC. Para cualquier glicano dado, los espectros de HSQC permiten la identificación de picos que son únicos para una disposición de enlaces regio y estereoquímica específica. Por ejemplo, la figura 5 muestra una asignación parcial de los espectros de una preparación de glu100 que demuestra cómo estos picos pueden usarse para identificar regio y estereoquímicas glicosídicas específicas. Las unidades de glicano componentes (por ejemplo azúcares) dentro de un glicano demuestran un aislamiento de espín en la secuencia de pulso de HSQC y el espectro de HSQC de
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cualquier glicano que consiste en múltiples azúcares es la suma de picos de sus azúcares individuales. Los constituyentes de unidad de glicano (por ejemplo monómeros) pueden identificarse mediante un espectro de HSQC que muestra 4, 5, 6 o más de los picos enumerados en la tabla 7 para cada una de sus unidades de glicano componentes (por ejemplo azúcares). Los espectros en las figuras 3 a-c ejemplifican esto comparando los espectros de preparaciones de glu100, gal100 y glu50gal50.
Composiciones farmacéuticas, alimentos médicos y formas de dosificación unitarias
Se proporcionan en el presente documento también métodos de producción de composiciones farmacéuticas que comprenden una preparación terapéutica de glicanos que cumple una o más, dos o más, tres o más o cuatro o más de las características de las preparaciones descritas en el presente documento (incluyendo los criterios (i)-(v) anteriores). En particular, los métodos incluyen proporcionar una preparación terapéutica de glicanos y obtener el/los valor(es) para una o más, dos o más, o tres o más características de la preparación, incluyendo, por ejemplo, i) el grado de polimerización (DP), ii) el grado de ramificación promedio (DB, puntos de ramificación por residuo), iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta, iv) la identidad de las unidades de glicano y v) la razón de unidades de glicano, y producir una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos si se cumplen los criterios deseados o predeterminados de la preparación dentro de un intervalo de desviación deseado.
Se conocen en la técnica métodos para formular la preparación terapéutica de glicanos para dar una composición farmacéutica, alimento médico o suplemento dietético y pueden incluir una o más, dos o más, tres o más, o cuatro o más de las siguientes etapas: (i) formular la preparación para dar un producto farmacológico, (ii) envasar la preparación, (iii) etiquetar la preparación envasada y (iv) vender o poner a la venta la preparación envasada y etiquetada. La formulación de la preparación terapéutica de glicanos para dar un producto farmacológico se conoce en la técnica y puede incluir una o más, dos o más, tres o más, o cuatro o más de las siguientes etapas: (i) eliminar constituyentes no deseados de la preparación, (ii) reducir el volumen de la preparación, (iii) esterilizar la preparación, (iv) mezclar la preparación con un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, (v) mezclar la preparación con un segundo fármaco o agente farmacéutico, (vi) formular la preparación para dar una consistencia adecuada, tal como, por ejemplo, disolución diluida acuosa, un jarabe o un sólido, (vii) formular la preparación para dar una forma de dosificación adecuada, por ejemplo para dar un comprimido, una píldora o una cápsula.
En algunas realizaciones, la preparación terapéutica de glicanos se somete a procesamiento adicional para producir o bien un polvo o bien un jarabe terapéutico de glicanos. Por ejemplo, en una variación, la preparación terapéutica de glicanos se concentra para formar un jarabe. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para concentrar una disolución, tal como el uso de un evaporador a vacío. En otra variación, la preparación terapéutica de glicanos se seca por pulverización para formar un polvo. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para secar por pulverización una disolución para formar un polvo.
Se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas, alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos. Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas, alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden además un segundo agente, por ejemplo, una sustancia prebiótica y/o una bacteria probiótica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden además un micronutriente. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos no contienen una sustancia prebiótica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos no contienen una bacteria probiótica. Además, opcionalmente, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden uno o más excipientes o portadores, incluyendo diluyentes, aglutinantes, disgregantes, dispersantes, lubricantes, deslizantes, estabilizadores, tensioactivos, agentes aromatizantes y colorantes.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas o alimentos médicos y suplementos dietéticos
comprenden una preparación terapéutica de glicanos de glu 100, ara100, xyl100, gal100, glu50gal50, gal75xyl25,
ara50gal50, man62glu38, ara50xyl50, man52glu29gal19 o glu33gal33fuc33.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas o alimentos médicos y suplementos dietéticos
comprenden una preparación terapéutica de glicanos de glu100, ara100, xyl100, glu50gal50, man52glu29gal19 o glu33gal33fuc33.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas o alimentos médicos y suplementos dietéticos
comprenden una preparación terapéutica de glicanos de glu100 y man52glu29gal19.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos (y kits que comprenden las mismas) comprenden uno o más micronutrientes. En algunas realizaciones, el micronutriente se selecciona del grupo que consiste en un
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oligoelemento, colina, una vitamina y un polifenol.
En algunas realizaciones, el micronutriente es un oligoelemento. Los oligoelementos adecuados como micronutriente incluyen, pero no se limitan a, boro, cobalto, cromo, calcio, cobre, flúor, yodo, hierro, magnesio, manganeso, molibdeno, selenio y zinc.
En algunas realizaciones, el micronutriente es una vitamina. Las vitaminas adecuadas como micronutriente incluyen, pero no se limitan a, complejo de vitamina B, vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina), vitamina B5 (ácido pantoténico), grupo de vitamina B6 (piridoxina, piridoxal, piridoxamina), vitamina B7 (biotina), vitamina B8 (ácido ergadenílico), vitamina B9 (ácido fólico), vitamina B12 (cianocobalamina), colina, vitamina A (retinol), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina D, vitamina E (tocoferol), vitamina K, carotenoides (alfa caroteno, beta caroteno, criptoxantina, luteína, licopeno) y zeaxantina.
En algunas realizaciones, el micronutriente es un polifenol. Los polifenoles son compuestos químicos o moléculas que se caracterizan por tener al menos un anillo aromático con uno o más grupos hidroxilo. En algunas realizaciones, el polifenol es un polifenol sintético o un polifenol que se produce de manera natural. En algunas realizaciones, el polifenol es un polifenol que se produce de manera natural y se deriva de material de fuente vegetal.
En algunas realizaciones, es polifenol es un flavonoide o una catequina. En algunas realizaciones, el flavonoide o la catequina se selecciona de antocianinas, chalconas, dihidrochalconas, dihidroflavonoles, flavanoles, flavanonas, flavonas, flavonoles e isoflavonoides. En algunas realizaciones, el polifenol es un lignano.
En algunas realizaciones, el polifenol se selecciona de alquilmetoxifenoles, alquilfenoles, curcuminoides, furanocumarinas, hidroxibenzaldehídos, hidroxibenzocetonas, hidroxicinamaldehídos, hidroxicumarinas, hidroxifenilpropenos, metoxifenoles, naftoquinonas, terpenos fenólicos y tirosoles. En algunas realizaciones, el polifenol es un tanino o ácido tánico.
En algunas realizaciones, el polifenol se selecciona de ácidos hidroxibenzoicos, ácidos hidroxicinámicos, ácidos hidroxifenilacéticos, ácidos hidroxifenilpropanoicos y ácidos hidroxifenilpentanoicos. En algunas realizaciones, el polifenol es un estilbeno.
En algunas realizaciones, el polifenol es uno cualquiera de los polifenoles enumerados en la tabla 5.
Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos pueden comprender agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas y/o bacterias probióticas. Alternativamente o además, los agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas y/o bacterias probióticas pueden administrarse por separado (por ejemplo antes de, simultáneamente con o después de la administración de los productos terapéuticos de glicanos) y no como parte de la composición farmacéutica o alimento médico o suplemento dietético (por ejemplo como una coformulación) de productos terapéuticos de glicanos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas o alimentos médicos o suplementos dietéticos que comprenden preparaciones de productos terapéuticos de glicanos se administran en combinación con una dieta recomendada o prescrita, por ejemplo una dieta que es rica en alimentos que contienen probióticos y/o prebióticos, tal como puede determinarlo un médico u otro profesional sanitario. Pueden administrarse agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas y/o bacterias probióticas para modular el microbioma intestinal del sujeto. En algunas realizaciones, el efecto combinado (por ejemplo sobre el número o la intensidad de los desplazamientos microbianos, genómicos o funcionales) es aditivo. En otras realizaciones, el efecto combinado (por ejemplo sobre el número o la intensidad de los desplazamientos microbianos, genómicos o funcionales) es sinérgico.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos descritas en el presente documento comprenden además una sustancia prebiótica o preparación de la misma.
En algunas realizaciones, pueden administrarse prebióticos a un sujeto que recibe las composiciones farmacéuticas o alimentos médicos o suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos descritas en el presente documento. Los prebióticos son sustancias no digeribles que cuando se consumen pueden proporcionar un efecto fisiológico beneficioso sobre el huésped estimulando selectivamente el crecimiento o la actividad favorables de un número limitado de bacterias nativas en el intestino (Gibson G R, Roberfroid M B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr. Junio de 1995; 125(6): 1401-12.). Un prebiótico tal como una fibra dietética o un oligosacárido prebiótico (por ejemplo celulosa cristalina, salvado de trigo, salvado de avena, fibra de maíz, fibra de soja, fibra de remolacha y similares) puede estimular adicionalmente el crecimiento de bacterias probióticas y/o comensales en el intestino proporcionando una dosis fermentable de hidratos de carbono a las bacterias y aumentar los niveles de esas poblaciones microbianas (por ejemplo lactobacilos y bifidobacterias) en el tubo digestivo.
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Los prebióticos incluyen, pero no se limitan a, diversos galactanos y gomas a base de hidratos de carbono, tales como zaragatona, goma guar, carragenanos, goma gellan, lactulosa y goma konjac. En algunas realizaciones, el prebiótico es uno o más de galactooligosacáridos (GOS), lactulosa, rafinosa, estaquiosa, lactosacarosa, fructo- oligosacáridos (FOS, por ejemplo oligofructosa o oligofructano), inulina, isomaltooligosacárido, xilo-oligosacáridos (XOS), oligosacárido de paratinosa, oligosacáridos de isomaltosa (IMOS), oligosacáridos transgalactosilados (por ejemplo transgalacto-oligosacáridos), disacáridos de transgalactosilato, oligosacáridos de soja (por ejemplo oligosacáridos de soja), oligosacárido de quitosano (quiosas), gentiooligosacáridos, oligosacáridos de soja y pectina, glucooligosacáridos, pecticoligosacáridos, policondensados de palatinosa, anhídrido de difructosa III, sorbitol, maltitol, lactitol, polioles, polidextrosa, dextranos lineales y ramificados, pululano, hemicelulosas, paratinosa reducida, celulosa, beta-glucosa, beta-galactosa, beta-fructosa, verbascosa, galactinol, xilano, inulina, quitosano, beta-glucano, goma guar, goma arábiga, pectina, alginato de sodio alto y carragenanos lambda, o mezclas de los mismos.
Los prebióticos pueden encontrarse en determinados alimentos, por ejemplo raíz de achicoria, alcachofa de Jerusalén, diente de león, ajo, puerro, cebolla, espárrago, salvado de trigo, harina de trigo, plátano, leche, yogur, sorgo, bardana, brócoli, coles de Bruselas, repollo, coliflor, berza, col rizada, rábano y colinabo, y miso. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento se administran a un sujeto conjuntamente con una dieta que incluye alimentos ricos en prebióticos. Están disponibles comercialmente fuentes adecuadas de fibras solubles e insolubles.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden además una bacteria probiótica o preparación de la misma, por ejemplo, derivada de cultivos bacterianos que se reconocen generalmente como seguros (GRAS) o microbios comensales o probióticos conocidos. En algunas realizaciones, para maximizar el efecto beneficioso de microbios comensales endógenos o microorganismos probióticos administrados de manera exógena, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos se administran para estimular el crecimiento y/o la actividad de bacterias ventajosas en el tubo digestivo.
Los ejemplos de probióticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, organismos clasificados como los géneros Bacteroides, Blautia, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Akkermansia, Faecalibacterium, Roseburia, Prevotella, Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacillus, Enterococcus, Escherichia, Streptococcus, Saccharomyces, Streptomyces, y la familia Christensenellaceae. Los ejemplos no exclusivos de bacterias probióticas que pueden usarse en los métodos y las composiciones descritos en el presente documento incluyen L. acidophilus, especies de Lactobacillus, tales como L. crispatus, L. casei, L. rhamnosus, L. reuteri, L. fermentum, L. plantarum, L. sporogenes y L. bulgaricus, así como especies de Bifidobacterum, tales como B. lactis, B. animalis, B. bifidum, B. longum, B. adolescentis y B. infantis. Levaduras, tales como Saccharomyces boulardii, también son adecuadas como probióticos para su administración al intestino, por ejemplo por medio de formas de dosificación orales o alimentos. Por ejemplo, el yogur es un producto que ya contiene especies de bacterias, tales como Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus.
Las bacterias beneficiosas para la modulación de la microbiota gastrointestinal pueden incluir bacterias que producen ácidos orgánicos (ácidos láctico y acético) o que producen agentes citotóxicos o citostáticos (para inhibir el crecimiento patógeno), tal como, por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2) y bacteriocinas. Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos pequeños que pueden destruir tanto bacterias estrechamente relacionadas, o presentar un espectro de actividad más amplio (por ejemplo, nisina).
Las bacterias beneficiosas pueden incluir uno o más de los géneros Akkermansia, Anaerofilum, Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Clostridium, Coprococcus, Dialister, Dorea, Fusobacterium, Eubacterium,
Faecalibacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Phascolarctobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Prevotella, Roseburia, Ruminococcus y Streptococcus, y/o una o más de las especies Akkermansia municiphilia, Christensenella minuta, Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Clostridium scindens, Dialister invisus, Eubacterium rectal, Eubacterium eligens, Faecalibacterium prausnitzii, Streptococcus salivarius y Streptococcus thermophilus. En algunas realizaciones, las bacterias probióticas o comensales incluyen una o más de las bacterias enumeradas en la tabla 1.
Las sustancias prebióticas y cepas probióticas que pueden combinarse con productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento para producir una composición o kit pueden aislarse a cualquier nivel de pureza por métodos convencionales y la purificación puede lograrse mediante medios convencionales conocidos por los expertos en la técnica, tales como destilación, recristalización y cromatografía. Las bacterias cultivadas que van a usarse en la composición se separan del caldo de cultivo con cualquier método incluyendo, sin limitaciones, centrifugación, filtración o decantación. Las células separadas del caldo de fermentación se lavan opcionalmente mediante agua, solución salina (NaCl al 0,9%) o con cualquier tampón adecuado. La masa celular húmeda obtenida puede secarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante liofilización.
En algunas realizaciones, las bacterias probióticas son células vegetativas liofilizadas. En algunas realizaciones, se
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usan las preparaciones de esporas de bacterias probióticas en esporulación.
En una realización, una composición terapéutica de glicanos farmacéutica comprende además un prebiótico y un probiótico. En una realización, la composición farmacéutica comprende probióticos cuya viabilidad se ha atenuado parcialmente (por ejemplo una mezcla que comprende el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50% o más de bacterias no viables), o probióticos que consisten únicamente en microbios no viables. Las composiciones pueden comprender además membranas microcianas y/o paredes celulares que se han aislado y purificados de microbios muertos. Si se desea, el organismo probiótico puede incorporarse en la composición terapéutica de glicanos farmacéutica como un cultivo en agua u otro medio líquido o semisólido en el que el probiótico permanece viable. En otra técnica, puede incorporarse un polvo secado por congelación que contiene el organismo probiótico en un material particulado o material líquido o semisólido mediante mezclado o combinación.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas y alimentos médicos y suplementos dietéticos que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden además un segundo agente terapéutico o preparación del mismo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es un antibiótico, un agente antifúngico, un agente antiviral o un agente antiinflamatorio (por ejemplo una citocina, hormona, etc.). Los antibióticos incluyen aminoglicósidos, tales como amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, estreptomicina y tobramicina; cefalosporinas, tales como cefamandol, cefazolina, cefalexina, cefaloglicina, cefaloridina, cefalotina, cefapirina y cefradina; macrólidos, tales como eritromicina y troleandomicina; penicilinas, tales como penicilina G, amoxicilina, ampicilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, feneticilina y ticarcilina; antibióticos polipeptídicos, tales como bacitracina, colistimetato, colistina, polimixina B; tetraciclinas, tales como clortetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, metaciclina, minociclina, tetraciclina y oxitetraciclina; y antibióticos misceláneos tales como cloramfenicol, clindamicina, cicloserina, lincomicina, rifampina, espectinomicina, vancomicina, viomicina y metronidazol.
Las preparaciones terapéuticas de glicanos descritas en el presente documento, otros agentes terapéuticamente activos, sustancias prebióticas, micronutrientes y probióticos pueden entremezclarse o mezclarse en una única composición farmacéutica o alimento médico o suplemento dietético. En otras realizaciones, pueden estar contenidos en recipientes separados (y/o en diversas formas de dosificación unitarias adecuadas) pero envasados juntos en uno o más kits. En algunas realizaciones, las preparaciones o composiciones no están envasadas o colocadas juntas. Un médico puede administrar entonces las preparaciones o composiciones juntas, por ejemplo una antes de, simultáneamente con, o después de la otra. En algunas realizaciones, las preparaciones o composiciones actúan de manera sinérgica en la modulación de la microbiota en un sujeto, por ejemplo, en el tubo digestivo.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende entre el 0,1% y el 100% de preparación terapéutica de glicanos en p/p, p/v, v/v o % molar. En otra realización, una composición farmacéutica comprende aproximadamente el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22%, el 23%, el 24%, el 25%, el 26%, el 27%, el
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98%, el 99%, 99,5% o el 100% de preparación terapéutica de glicanos en p/p, p/v, v/v o % molar. En una realización, una composición farmacéutica comprende aproximadamente el 1-90%, aproximadamente el 10-90%,
aproximadamente el 20-90%, aproximadamente el 30-90%, aproximadamente el 40-90%, aproximadamente el 40- 80%, aproximadamente el 40-70%, aproximadamente el 40-60%, aproximadamente el 40-50%, aproximadamente el 50-90%, aproximadamente el 50-80%, aproximadamente el 50-70%, aproximadamente el 50-60%,
aproximadamente el 60-90%, aproximadamente el 60-80%, aproximadamente el 60-70%, aproximadamente el 70- 90%, aproximadamente el 70-80%, aproximadamente el 70-90%, aproximadamente el 70-80%, aproximadamente el 80-90%, aproximadamente el 90-96%, aproximadamente el 93-96%, aproximadamente el 93-95%,
aproximadamente el 94-98%, aproximadamente el 93-99% o aproximadamente el 90-100% de preparación terapéutica de glicanos en p/p, p/v, v/v o % molar.
Una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos puede comprender opcionalmente uno o más excipientes o portadores. La composición farmacéutica puede comprender desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 90% del uno o más excipientes o portadores en p/p, p/v, v/v o % molar. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender aproximadamente el 1-90%, el 1-75%, el 1- 60%, el 1-55%, el 1-50%, el 1-45%, el 1-40%, el 1-25%, el 1-15%, el 1-10%, el 10-90%, el 10-75%, el 10-60%, el 10- 55%, el 10-50%, el 10-45%, el 10-40%, el 10-25%, el 10-15%, el 15-90%, el 15-75%, el 15-60%, el 15-55%, el 15-

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75%, el 75-90% del uno o más excipientes o portadores en p/p, p/v, v/v o % molar.
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Alimento médico
También se proporcionan en el presente documento preparaciones de productos terapéuticos de glicanos formuladas como un alimento médico. Cualquier preparación terapéutica de glicanos descrita en el presente documento puede formularse como un alimento médico así como composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos.
Un alimento médico se define en la sección 5(b)(3) de la Orphan Drug Act (21 U.S.C. 360ee(b)(3)). Un alimento médico se formula para consumirse (ingesta oral) o administrarse por vía entérica (por ejemplo tubo nasogástrico/de alimentación) bajo supervisión médica, por ejemplo por un médico. Está destinado a la gestión dietética específica de una enfermedad o estado, tal como, por ejemplo disbiosis de la microbiota gastrointestinal o una enfermedad del tubo digestivo descrita en el presente documento. Los alimentos médicos tal como se usa en el presente documento no incluyen un alimento meramente recomendado por un médico como parte de una dieta global para gestionar los síntomas o reducir el riesgo de una enfermedad o estado. Los alimentos médicos que comprenden una preparación de productos terapéuticos de glicanos son alimentos que son sintéticos (por ejemplo, productos formulados y/o procesados, tales como, que se formulan para la alimentación parcial o exclusiva de un paciente mediante ingesta oral o alimentación entérica por tubo) y productos alimenticios que no se producen de manera natural usados en un estado natural. Los alimentos médicos que comprenden una preparación de productos terapéuticos de glicanos pueden representar un componente importante de la gestión de un estado o enfermedad del tubo digestivo, por ejemplo el alimento médico puede representar una fuente parcial o exclusiva de alimento para el sujeto que necesita un alimento médico. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una capacidad limitada o alterada para ingerir, digerir, absorber o metabolizar productos alimenticios habituales o determinados nutrientes. En otras realizaciones, el sujeto tiene otros requisitos de nutrientes especiales determinados médicamente, cuya gestión dietética no puede lograrse mediante la modificación de la dieta normal solo. Se administran alimentos médicos que comprenden una preparación de productos terapéuticos de glicanos a un sujeto que lo necesita bajo supervisión médica (que puede ser activa y estar en curso) y habitualmente, el sujeto recibe instrucciones sobre el uso del alimento médico. Los alimentos médicos pueden comprender uno o más aditivos alimentarios, aditivos de color, excipientes GRAS y otros agentes o sustancias adecuadas para alimentos médicos. Las preparaciones de alimentos médicos pueden ser fórmulas nutricionalmente completas o incompletas.
Suplementos dietéticos
Cualquier preparación terapéutica de glicanos descrita en el presente documento puede formularse como un suplemento dietético, por ejemplo, para su uso en un método descrito en el presente documento.
Los suplementos dietéticos se regulan según la Dietary Supplement Health and Education Act (DSHEA) de 1994. Un suplemento dietético es un producto tomado por la boca que contiene un “ingrediente dietético” destinado a suplementar la dieta. Los “ingredientes dietéticos” en estos productos pueden incluir, además de una preparación terapéutica de glicanos descrita en el presente documento, uno o más de: vitaminas, minerales, hierbas u otros productos botánicos, aminoácidos y sustancias tales como enzimas, tejidos orgánulos, glandulares y metabolitos. Los suplementos dietéticos pueden ser también extractos o concentrados, y pueden encontrarse en muchas formas tales como comprimidos, cápsulas, cápsulas blandas, cápsulas de gelatina, líquidos o polvos. También pueden estar en otras formas, tales como una barra, pero si lo están, la información en su etiqueta no debe representar al producto como un alimento convencional o un único artículo de una comida o dieta. DSHEA requiere que cada suplemento se etiquete como un suplemento dietético y no como un alimento general.
Formas de dosificación
Las preparaciones terapéuticas de glicanos descritas en el presente documento pueden formularse para dar cualquier forma de dosificación adecuada, por ejemplo para administración oral o entérica. Las formas de dosificación descritas en el presente documento pueden formularse usando procedimientos que conocen los expertos en la técnica.
La forma de dosificación puede ser un paquete, tal como cualquier recipiente individual que contiene una composición terapéutica de glicanos farmacéutica en forma de, por ejemplo, un líquido (lavado/enjuague), un gel, una crema, una pomada, un polvo, un comprimido, una píldora, una cápsula, un depósito, un aplicador de un solo uso o un dispositivo médico (por ejemplo una jeringa). Por ejemplo, se proporciona también un artículo de fabricación, tal como un recipiente que comprende una forma de dosificación unitaria de la composición terapéutica de glicanos farmacéutica, y una etiqueta que contiene instrucciones para el uso de tal producto terapéutico de glicanos.
Las formas de las composiciones que pueden usarse por vía oral incluyen comprimidos, gélulas hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Pueden prepararse comprimidos mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes auxiliares. Pueden prepararse comprimidos producidos por compresión comprimiendo en una máquina adecuada el principio activo en una forma de flujo libre tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con aglutinantes (por
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ejemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa), diluyentes inertes, agentes conservantes, antioxidantes, disgregantes (por ejemplo, glicolato sódico de almidón, povidona reticulada, carboximetilcelulosa de sodio reticulada) o lubricantes, agentes activos de superficie o dispersantes. Pueden prepararse comprimidos moldeados mediante moldeo en una máquina adecuada de una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden recubrirse o ranurarse opcionalmente y pueden formularse para proporcionar una liberación lenta o controlada del principio activo en el mismo. Los comprimidos pueden proporcionarse opcionalmente con un recubrimiento entérico, para proporcionar liberación en partes del intestino (por ejemplo, colon, intestino inferior) distintas del estómago. Todas las formulaciones para administración oral pueden estar en dosificaciones adecuadas para tal administración. Las gélulas pueden contener los principios activos en mezcla con una carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos y/u otros agentes (por ejemplo, prebióticos o probióticos) pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizadores. Se proporcionan núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar con recubrimientos adecuados. Para este fin, pueden usarse disoluciones de azúcar concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol o dióxido de titanio, disoluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Pueden añadirse productos colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de comprimidos recubiertos de azúcar para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las formulaciones para uso oral pueden presentarse también como cápsulas de gelatina duras en las que el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blandas en las que el principio activo se mezcla con un portador soluble en agua tal como polietilenglicol o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
En una realización, una composición terapéutica de glicanos proporcionada incluye una formulación de cápsula blanda. Una cápsula blanda puede contener una cubierta a base de gelatina que roda un relleno líquido. La cubierta puede estar hecha de gelatina, plastificante (por ejemplo, glicerina y/o sorbitol), modificador, agua, color, antioxidante o aroma. La cubierta puede estar hecha con almidón o carragenanos. La capa externa puede tener un recubrimiento entérico. En una realización, una formulación de cápsula blanda puede incluir una disolución de relleno soluble en agua o aceite, o suspensión de una composición cubierta por una capa de gelatina.
Las formulaciones sólidas para uso oral pueden comprender un recubrimiento entérico, que puede controlar la ubicación en la que una composición terapéutica de glicanos se absorbe en el sistema digestivo. Por ejemplo, un recubrimiento entérico puede diseñarse de manera que una composición terapéutica de glicanos no se disuelve en el estómago sino que más bien se desplaza al intestino delgado, donde se disuelve. Un recubrimiento entérico puede ser estable a bajo pH (tal como en el estómago) y puede disolverse a un pH superior (por ejemplo, en el intestino delgado). El material que puede usarse en recubrimientos entéricos incluye, por ejemplo, ácido algínico, acetato-ftalato de celulosa, plásticos, ceras, laca y ácidos grasos (por ejemplo, ácido esteárico, ácido palmítico).
Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse en una forma de dosificación líquida. Las preparaciones líquidas pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones, disoluciones acuosas u oleosas, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales, tales como agentes de suspensión, por ejemplo sorbitol, metilcelulosa, jarabe de glucosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas, agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, monooleato de sorbitano, goma arábiga; vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo aceite de almendras, ésteres oleosos tales como glicerina, propilenglicol o alcohol etílico; conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sórbico y, si se desea, agentes colorantes o aromatizantes convencionales. En algunas realizaciones, las formulaciones líquidas pueden comprender, por ejemplo, un agente en forma de agua en disolución y/o suspensión; y un vehículo que comprende aceite de ricino polietoxilado, alcohol y/o un monooleato de sorbitano polioxietilado con o sin aromatizante. Cada forma de dosificación puede comprender una cantidad eficaz de un producto terapéutico de glicanos y puede comprender opcionalmente agentes farmacéuticamente inertes, tales como excipientes, vehículos, cargas, aglutinantes, disgregantes, sustancias de ajuste del pH, tampón, disolventes, agentes solubilizantes, edulcorantes, agentes colorantes convencionales, y cualquier otro agente inactivo que puede incluirse en formas de dosificación farmacéuticas para su administración. Pueden encontrarse ejemplos de tales vehículos y aditivos en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17a edición (1985).
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden estar en formas de dosificación unitarias o formas de dosificación múltiples. Una forma de dosificación unitaria, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una unidad físicamente diferenciada para su administración a un ser humano que lo necesita. En una realización, la forma de dosificación unitaria se proporciona en un envase. Cada dosis unitaria puede contener una cantidad predeterminada de uno(s) principio(s) activo(s) suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con otros portadores o excipientes farmacéuticos. Los ejemplos de formas de dosificación unitarias incluyen, pero no se limitan a, ampollas, jeringas y comprimidos y cápsulas envasados
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individualmente. Pueden administrarse formas de dosificación unitarias en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosificación múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas envasadas en un único recipiente, que pueden administrarse en forma de dosificación unitaria segregada. Los ejemplos de formas de dosificación múltiples incluyen, pero no se limitan a, viales, frascos de comprimidos o cápsulas, o frascos de pintas o galones. En otra realización las formas de dosificación múltiples comprenden diferentes agentes farmacéuticamente activos. Por ejemplo puede proporcionarse una forma de dosificación múltiple que comprende un primer elemento de dosificación que comprende una composición que comprende un producto terapéutico de glicanos y un segundo elemento de dosificación que comprende un prebiótico, un agente terapéutico y/o un probiótico, que puede estar en una forma de liberación modificada. En este ejemplo un par de elementos de formulación pueden constituir una única dosificación unitaria. En una realización se proporciona un kit que comprende múltiples dosificaciones unitarias, en las que cada unidad comprende un primer elemento de dosificación que comprende una composición que comprende un compuesto terapéutico de glicano y un segundo elemento de dosificación que comprende un probiótico, un agente farmacéutico, un prebiótico o una combinación de los mismos, que pueden estar en una forma de liberación modificada. En otra realización el kit comprende además un conjunto de instrucciones.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 10 g del producto terapéutico de glicanos (por ejemplo, un producto terapéutico de glicanos dado a conocer en el presente documento). Por ejemplo, la forma de dosificación unitaria puede comprender de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 9,5 g, de aproximadamente 0,005 mg a aproximadamente 9 g, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 8,5 g, de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 8 g, de aproximadamente 0,075 mg a aproximadamente 7,5 g, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 7 g, de aproximadamente 0,25 mg a aproximadamente 6,5 g, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 6 g, de

aproximadamente 0,75 mg a aproximadamente 5,5 g, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 g, de

aproximadamente 2,5 mg a aproximadamente 4,5 g, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 4 g, de

aproximadamente 7,5 mg a aproximadamente 3,5 g, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 3 g, de

aproximadamente 12,5 mg a aproximadamente 2,5 g, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 2 g, de

aproximadamente 17,5 mg a aproximadamente 1,5 g, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 1 g, de
aproximadamente 25 mg a aproximadamente 750 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 500 g o de aproximadamente 75 mg a aproximadamente 250 mg del producto terapéutico de glicanos.
En determinadas realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 0,005 mg a aproximadamente 75 mg, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7,5 mg o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg del producto terapéutico de glicanos. En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 2,5 mg a aproximadamente 75 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 50 mg o de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 25 mg del producto terapéutico de glicanos. En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 10 g, de aproximadamente 250 mg a aproximadamente 7,5 g, de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 5 g, de aproximadamente 750 mg a aproximadamente 2,5 g o de aproximadamente 1 g a aproximadamente 2 g del producto terapéutico de glicanos.
En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende entre aproximadamente 0,001 ml y aproximadamente 1000 ml del producto terapéutico de glicanos (por ejemplo, un producto terapéutico de glicanos dado a conocer en el presente documento). Por ejemplo, la forma de dosificación unitaria puede comprender de aproximadamente 0,001 ml a aproximadamente 950 ml, de aproximadamente 0,005 ml a aproximadamente 900 ml, de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 850 ml, de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 800 ml, de aproximadamente 0,075 ml a aproximadamente 750 ml, de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 700 ml, de aproximadamente 0,25 ml a aproximadamente 650 ml, de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 600 ml, de aproximadamente 0,75 ml a aproximadamente 550 ml, de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 500 ml, de aproximadamente 2,5 ml a aproximadamente 450 ml, de aproximadamente 5 ml a aproximadamente 400 ml, de aproximadamente 7,5 ml a aproximadamente 350 ml, de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 300 ml, de aproximadamente 12,5 ml a aproximadamente 250 ml, de aproximadamente 15 ml a aproximadamente 200 ml, de aproximadamente 17,5 ml a aproximadamente 150 ml, de aproximadamente 20 ml a aproximadamente 100 ml o de aproximadamente 25 ml a aproximadamente 75 ml del producto terapéutico de glicanos.
En determinadas realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,001 ml a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 0,005 ml a aproximadamente 7,5 ml, de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 5 ml, de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 2,5 ml, de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 1 ml, de aproximadamente 0,25 ml a aproximadamente 1 ml o de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1 ml del producto terapéutico de glicanos. En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 0,025 ml a aproximadamente 7,5 ml, de aproximadamente 0,05 ml a aproximadamente 5 ml o de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 2,5 ml del producto terapéutico de glicanos. En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria comprende de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 10 ml, de aproximadamente 0,25 ml a aproximadamente 7,5 ml, de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 5 ml, de aproximadamente 0,5 ml a
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aproximadamente 2,5 ml o de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 1 ml del producto terapéutico de glicanos.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria, por ejemplo, un comprimido, una cápsula (por ejemplo, una cápsula dura, gélula o cápsula blanda), o cápsula suave, tiene una longitud de cuerpo de entre aproximadamente 0,25 cm (0,1 pulgadas) y aproximadamente 3,81 cm (1,5 pulgadas) (por ejemplo, entre aproximadamente 1,27 cm (0,5 pulgadas) y aproximadamente 2,54 cm (1 pulgada), o de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 50 mm (por ejemplo, aproximadamente de 10 mm a aproximadamente 25 mm). En algunas realizaciones, la forma de dosificación unitaria, por ejemplo, un comprimido, una cápsula (por ejemplo, una cápsula dura, gélula o cápsula blanda), o cápsula suave, tiene un diámetro externo de aproximadamente 0,13 cm (0,05 pulgadas) a aproximadamente 2,54 cm (1 pulgada) (por ejemplo, de aproximadamente 0,25 cm (0,1 pulgadas) a aproximadamente 1,27 cm (0,5 pulgadas), o de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 25 mm (por ejemplo, de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 10 mm).
Cada forma de dosificación unitaria del producto terapéutico de glicanos puede tener un valor calórico de entre aproximadamente 0,01 kcal y aproximadamente 1000 kcal. Por ejemplo, la forma de dosificación unitaria puede tener un valor calórico de aproximadamente 0,01 kcal a aproximadamente 900 kcal, de aproximadamente 0,05 kcal a aproximadamente 800 kcal, de aproximadamente 0,1 kcal a aproximadamente 700 kcal, de aproximadamente 0,25 kcal a aproximadamente 600 kcal, de aproximadamente 0,5 kcal a aproximadamente 500 kcal, de aproximadamente 0,75 kcal a aproximadamente 400 kcal, de aproximadamente 1 kcal a 300 kcal, de aproximadamente 5 kcal a aproximadamente 200 kcal o de aproximadamente 10 kcal a aproximadamente 100 kcal. En determinadas realizaciones, la forma de dosificación unitaria del producto terapéutico de glicanos tiene un valor calórico de entre 10 kcal y aproximadamente 500 kcal. En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria del producto terapéutico de glicanos tiene un valor calórico de entre 50 kcal y aproximadamente 500 kcal.
En todavía otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria puede tener un valor calórico de aproximadamente 0,001 kcal a aproximadamente 100 kcal, de aproximadamente 0,005 kcal a aproximadamente 90 kcal, de aproximadamente 0,01 kcal a aproximadamente 80 kcal, de aproximadamente 0,025 kcal a aproximadamente 70 kcal, de aproximadamente 0,05 kcal a aproximadamente 60 kcal, de aproximadamente 0,075 kcal a aproximadamente 50 kcal, de aproximadamente 0,1 kcal a 40 kcal, de aproximadamente 0,25 kcal a aproximadamente 30 kcal, de aproximadamente 0,5 kcal a aproximadamente 25 kcal, de aproximadamente 0,25 kcal a aproximadamente 20 kcal o de aproximadamente 0,1 kcal a aproximadamente 10 kcal.
La forma de dosificación unitaria del producto terapéutico de glicanos puede formularse para disolverse en una disolución acuosa (por ejemplo, agua, leche, zumo, y similares) y se administra por vía oral como una bebida, jarabe, disolución o suspensión. Por ejemplo, la dosificación de forma unitaria del producto terapéutico de glicanos puede comprender un cubo, paquete, pastilla para chupar, píldora, comprimido, cápsula, caramelo, polvo, elixir o jarabe concentrado formulado para disolverse en una disolución acuosa antes de la administración oral. En otras realizaciones, la forma de dosificación unitaria del producto terapéutico de glicanos puede comprender un cubo, paquete, pastilla para chupar, píldora, comprimido, cápsula, caramelo, polvo, elixir o jarabe concentrado formulado para disolverse in vivo, por ejemplo, en la boca, estómago, intestino o colon del sujeto tras la administración oral.
En algunas realizaciones, la composición terapéutica de glicanos se administra por vía entérica. Esto incluye preferentemente administración oral, o mediante un tubo oral o nasal (incluyendo nasogástrico, nasoyeuunal, oral gástrico u oral yeyunal). En otras realizaciones, la administración incluye administración rectal (incluyendo enema, supositorio o colonoscopia).
Las formas de dosificación descritas en el presente documento pueden fabricarse usando procedimientos que conocen los expertos en la técnica. Por ejemplo, para la fabricación de comprimidos, puede dispersarse uniformemente una cantidad eficaz de un prebiótico en uno o más excipientes o aditivos, por ejemplo, usando granulación a alta cizalladura, granulación a baja cizalladura, granulación en lecho fluidizado o mediante combinación para compresión directa. Los excipientes y aditivos incluyen diluyentes, aglutinantes, disgregantes, dispersantes, lubricantes, deslizantes, estabilizadores, tensioactivos, antiadherentes, sorbentes, edulcorantes y colorantes, o una combinación de los mismos. Los diluyentes, también denominados cargas, pueden usarse para aumentar el volumen de un comprimido de modo que se proporcione un tamaño práctico para la compresión. Los ejemplos no limitativos de diluyentes incluyen lactosa, celulosa, celulosa microcristalina, manitol, almidón seco, almidones hidrolizados, azúcar en polvo, talco, cloruro de sodio, dióxido de silicio, óxido de titanio, difosfato de calcio dihidratado, sulfato de calcio, carbonato de calcio, alúmina y caolín. Los aglutinantes pueden conferir calidades cohesivas a una formulación de comprimido y pueden usarse para ayudar a que un comprimido permanezca intacto tras la compresión. Los ejemplos no limitativos de aglutinantes adecuados incluyen almidón (incluyendo almidón de maíz y almidón pregelatinizado), gelatina, azúcares (por ejemplo, glucosa, dextrosa, sacarosa, lactosa y sorbitol), celulosas, polietilenglicol, ácido algínico, dextrina, caseína, metilcelulosa, ceras, gomas naturales y sintéticas, por ejemplo, acacia, tragacanto, alginato de sodio, goma arábiga, goma xantana y polímeros sintéticos tales como polimetacrilatos, poli(alcoholes vinílicos), hidroxipropilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los lubricantes también pueden facilitar la fabricación de comprimidos; los ejemplos no limitativos de los mismos incluyen estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y polietilenglicol. Los disgregantes pueden facilitar la
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disgregación del comprimido tras la administración, y los ejemplos no limitativos de los mismos incluyen almidones, ácido algínico, polímeros reticulados tales como, por ejemplo, polivinilpirrolidona reticulada, croscarmelosa sódica, glicolato sódico o potásico de almidón, arcillas, celulosas (por ejemplo, carboximetilcelulosas (por ejemplo, carboximetilcelulosa (CMC), CMC-Na, CMC-Ca)), almidones, gomas y similares. Los ejemplos no limitativos de deslizantes adecuados incluyen dióxido de silicio, talco, y similares. Los estabilizadores pueden inhibir o retardar reacciones de descomposición de fármacos, incluyendo reacciones oxidativas. Los tensioactivos también pueden incluir y pueden ser aniónicos, catiónicos, anfóteros o no iónicos. Los edulcorantes a modo de ejemplo pueden incluir extracto de estevia, aspartamo, sacarosa, alitamo, sacarina, y similares. Si se desea, los comprimidos también pueden comprender sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes tamponantes del pH, conservants, por ejemplo, antioxidantes, agentes humectantes o emulsionantes, agentes solubilizantes, agentes de recubrimiento, agentes aromatizantes (por ejemplo, menta, cereza, anís, melocotón, albaricoque, regaliz, frambuesa, vainilla), y similares. Los excipientes y aditivos adiconales pueden incluir acetato de aluminio, alcohol bencílico, butilparabeno, hidroxitolueno butilado, EDTA de calcio y disodio, hidrogenofosfato de calcio dihidratado, fosfato de calcio dibásico, fosfato de calcio tribásico, cera candelilla, cera carnauba, aceite de ricino hidrogenado, cloruro de cetilpiridina, ácido cítrico, dióxido de silicona coloidal, copolividona, almidón de maíz, cisteína HCl, dimeticona, hidrogenofosfato de disodio, eritrosina sódica, etilcelulosa, gelatina, glicerina, monooleato de glicerilo, monoestearato de glicerilo, glicina, ftalato de HPMC, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hipromelosa, óxido de hierro rojo u óxido férrico, óxido de hierro amarillo, óxido de hierro u óxido férrico, carbonato de magnesio, óxido de magnesio, estearato de magnesio, metionina, copolímero de ácido metacrílico, metilparabeno, celulosa microcristalina silicificada, aceite mineral, ácido fosfórico, fosfato de calcio común, fosfato de calcio anhidro, polaxámero 407, polaxámero 188, polaxámero común, poli(óxido de etileno), estearato de polioxi140, polisorbato 80, bicarbonato de potasio, sorbato de potasio, almidón de patata, povidona, propilenglicol, propilenparabeno, propilparabeno, palmitato de retinilo, sacarina sódica, selenio, sílice, gel de sílice, sílice pirogénica, benzoato de sodio, carbonato de sodio, citrato de sodio dihidratado, crosmelosa sódica, laurilsulfato de sodio, metabisulfito de sodio, propionato de sodio, almidón sódico, glicolato sódico de almidón, estearilfumarato de sodio, ácido sórbico, sorbitol, monooleato de sorbitano, almidón pregelatinizado, ácido succínico, triacetina, citrato de trietilo, estearina vegetal, vitamina A, vitamina E, vitamina C, o una combinación de los mismos. Las cantidades de estos excipientes y aditivos pueden seleccionarse apropiadamente basándose en su relación con otros componentes y propiedades de la preparación y método de producción.
Las formulaciones de liberación inmediata de una cantidad eficaz de una composición terapéutica de glicanos pueden comprender uno o más combinaciones de excipientes que permiten una liberación rápida de un agente farmacéuticamente activo (tal como desde 1 minuto hasta 1 hora tras la administración). Las formulaciones de liberación controlada (también denominadas de liberación sostenida (SR), liberación prolongada (ER, XR o XL), liberación temporal o liberación en el tiempo, liberación controlada (CR) o liberación continua) se refieren a la liberación de una composición terapéutica de glicanos a partir de una forma de dosificación en un punto en el tiempo deseado particular tras administrarse la forma de dosificación a un sujeto.
En una realización una forma de dosificación de liberación controlada comienza su liberación y continúa esa liberación a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. La liberación puede producirse comenzando casi inmediatamente o puede ser sostenida. La liberación puede ser constante, puede aumentar o disminuir a lo largo del tiempo, puede ser pulsada, puede ser continua o intermitente, y similares. En una realización, una dosificación de liberación controlada se refiere a la liberación de un agente a partir de una composición o forma de dosificación en la que el agente se libera según un perfil deseado a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. En un aspecto, liberación controlada se refiere a liberación retardada de un agente a partir de una composición o forma de dosificación en la que el agente se libera según un perfil deseado en el que la liberación se produce tras un periodo de tiempo.
Los portadores o vehículos farmacéuticos adecuados para la administración de los compuestos proporcionados en el presente documento incluyen todos de tales portadores conocidos por los expertos en la técnica por ser adecuados para el modo de administración particular. Además, las composiciones pueden tener uno o más componentes que no confieren la acción deseada, o componentes que complementan la acción deseada, o tienen otra acción.
En un aspecto adicional, la forma de dosificación puede ser una forma de dosificación efervescente. Efervescente significa que la forma de dosificación, cuando se mezcla con un líquido, incluyendo agua y saliva, desprende un gas. Algunos agentes efervescentes (o pareja efervescente) desprenden gas por medio de una reacción química que tiene lugar tras la exposición del agente de disgregación efervescente a agua o a saliva en la boca. Esta reacción puede ser el resultado de la reacción de una fuente de ácido soluble y una fuente de carbonato o monocarbonato alcalino. La reacción de estos dos compuestos generales produce gas dióxido de carbono tras el contacto con agua o saliva. Una pareja efervescente (o el ácido y la base individuales por separado) puede recubrirse con un disolvente de recubrimiento entérico o protector frente al disolvente para evitar una reacción prematura. Una pareja de este tipo puede mezclarse también con partículas previamente liofilizadas (tales como un producto terapéutico de glicanos). Las fuentes de ácido pueden ser cualquiera que sea segura para consumo humano y pueden incluir generalmente ácidos alimentarios, antácidos de hidrita y ácido tales como, por ejemplo: cítrico, tartárico, amálico, fumérico, adípico y succínicos. Las fuentes de carbonato incluyen sal de bicarbonato y carbonato sólido seco tal como bicarbonato de
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sodio, carbonato de sodio, bicarbonato de potasio y carbonato de potasio, carbonato de magnesio y similares. También se incluyen reactantes que desprenden oxígeno u otros gases y que son seguros para consumo humano. En una realización se usan ácido cítrico y bicarbonato de sodio.
En otro aspecto, la forma de dosificación puede estar en forma de un caramelo (por ejemplo, matriz), tal como una piruleta o pastilla para chupar. En una realización se dispersa una cantidad eficaz de un producto terapéutico de glicanos dentro de una matriz de caramelo. En una realización la matriz de caramelo comprende uno o más azúcares (tales como dextrosa o sacarosa). En otra realización la matriz de caramelo es una matriz sin azúcar. La elección de una matriz de caramelo particular es sujeto de una amplia variación. Pueden emplearse edulcorantes convencionales (por ejemplo, sacarosa), alcoholes de azúcar adecuados para su uso con pacientes diabéticos (por ejemplo, sorbitol o manitol), u otros edulcorantes (por ejemplo, edulcorantes descritos en el presente documento). La base de caramelo puede ser muy blanda y de disolución rápida, o puede ser dura y de disolución más lenta. Diversas formas tendrán ventajas en diferentes situaciones.
Una composición de masa de caramelo que comprende una cantidad eficaz del producto terapéutico de glicanos puede administrarse por vía oral a un sujeto que lo necesita de modo que una cantidad eficaz del producto terapéutico de glicanos se liberará en la boca del sujeto a medida que la masa de caramelo se disuelve y se traga. Un sujeto que lo necesita incluye un niño o adulto humano.
Las formas de dosificación descritas en el presente documento también pueden adoptar la forma de partículas farmacéuticas fabricadas mediante una variedad de métodos, incluyendo pero sin limitarse a homogeneización a alta presión, molienda con bolas en húmedo o en seco, o precipitación de partículas pequeñas (por ejemplo, NanoSpray de nGimat). Otros métodos útiles para preparar una formulación de polvo adecuada son la preparación de una disolución de principios activos y excipientes, seguido por precipitación, filtración y pulverización, o seguido por eliminación del disolvente mediante secado por congelación, seguido por pulverización del polvo hasta el tamaño de partícula deseado. En una realización, las partículas farmacéuticas tienen un tamaño final de 3-1000 micrómetros, tal como como máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 micrómetros. En otra realización las partículas farmacéuticas tienen un tamaño final de 10-500 micrómetros. En otra realización las partículas farmacéuticas tienen un tamaño final de 50-600 micrómetros. En otra realización las partículas farmacéuticas tienen un tamaño final de 100-800 micrómetros.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un método de preparación de una forma de dosificación unitaria descrita en el presente documento, que comprende proporcionar un producto terapéutico de glicanos (por ejemplo, un producto terapéutico de glicanos descrito en el presente documento); formular el producto terapéutico de glicanos para dar una forma de dosificación unitaria (por ejemplo, una forma de dosificación unitaria descrita en el presente documento), envasar la forma de dosificación unitaria, etiquetar la forma de dosificación unitaria envasada, y/o vender o poner a la venta la forma de dosificación unitaria envasada y etiquetada.
Las formas de dosificación unitarias descritas en el presente documento también pueden procesarse. En una realización, el procesamiento comprende uno o más de: procesar la forma de dosificación para dar una composición farmacéutica, por ejemplo, formular, combinar con un segundo componente, por ejemplo, un excipiente o tampón; repartir en alícuotas más pequeñas o más grandes; disponer en un recipiente, por ejemplo, un recipiente estanco a gases o líquidos; envasar; asociar con una etiqueta; enviar o transportar a una ubicación diferente. En una realización, el procesamiento comprende uno o más de: clasificar, seleccionar, aceptar o descartar, liberar o retener, procesar para dar una composición farmacéutica, enviar, transportar a una ubicación diferente, formular, etiquetar, envasar, liberar al comercio, o vender o poner a la venta, dependiendo de si se cumple el umbral predeterminado. En algunas realizaciones, las formas de dosificación procesadas comprenden un producto terapéutico de glicanos descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, el procesamiento comprende uno o más de: procesar la forma de dosificación para dar una composición farmacéutica, por ejemplo, formular, combinar con un segundo componente, por ejemplo, un excipiente o tampón; repartir en alícuotas más pequeñas o más grandes; disponer en un recipiente, por ejemplo, un recipiente estanco a gases o líquidos; envasar; asociar con una etiqueta; enviar o transportar a una ubicación diferente. En una realización, el procesamiento comprende uno o más de: clasificar, seleccionar, aceptar o descartar, liberar o retener, procesar para dar una composición farmacéutica, enviar, transportar a una ubicación diferente, formular, etiquetar, envasar, liberar al comercio, o vender o poner a la venta, dependiendo de la determinación. En otra realización, se proporciona una forma de dosificación oral que comprende una composición terapéutica de glicanos, en la que la forma de dosificación oral es un jarabe. El jarabe puede comprender aproximadamente el 1%, el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80% o el 85% de sólido. El jarabe puede comprender aproximadamente el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45% o el 50% de líquido, por ejemplo, agua. El sólido puede comprender una composición terapéutica de glicanos. El sólido puede ser, por ejemplo, aproximadamente el 1-96%, el 10-96%, el 20-96%, el 30-96%, el 40-96%, el 50-96%, el 60-96%, el 70-96%, el 80-96% o el 90-96% la composición terapéutica de glicanos. En otra realización, una composición terapéutica de glicanos se formula como un fluido viscoso.
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En una realización, la composición comprende un componente espumante, un componente neutralizante o una fibra dietética insoluble en agua. Un componente espumante puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en hidrogenocarbonato de sodio, carbonato de sodio y carbonato de calcio. En una realización un componente neutralizante puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en ácido cítrico, ácido L-tartárico, ácido fumárico, ácido L-ascórbico, ácido DL-málico, ácido acético, ácido láctico y ácido cítrico anhidro. En una realización una fibra dietética insoluble en agua puede ser al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en celulosa cristalina, salvado de trigo, salvado de avena, fibra de maíz, fibra de soja y fibra de remolacha. La formulación puede contener un éster de ácido graso de sacarosa, azúcar en polvo, polvo de zumo de frutas y/o material aromatizante.
En algunas realizaciones, las formas de dosificación se formulan para liberar las composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos en una(s) región/regiones específica(s) del tubo digestivo, tal como el intestino delgado o grueso. En algunas realizaciones, las formas de dosificación se formulan para liberar las composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos en una(s) región/regiones específica(s) del tubo digestivo, tal(es) como el ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente, colon sigmoide y/o recto.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un sistema de administración sensible a enzimas. Por ejemplo, pueden prepararse polímeros sensibles a tripsina usando hidrogeles que se reticulan mediante péptidos que se degradan por tripsina. La tripsina es activa en el intestino delgado. Pueden usarse sistemas de administración sensibles a tripsina para dirigir la administración de las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas al intestino delgado. En otro ejemplo, los hidrogeles digeribles por enzimas que consisten en poli(vinilpirrolidona) reticulada con albúmina se degradan en presencia de pepsina.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un dispositivo de administración que permite la retención prolongada en un sitio específico en el tubo digestivo. Por ejemplo, un sistema de administración gastrorretentivo permite la liberación prolongada de las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas al estómago. Puede usarse administración gastrorretentiva para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas que modulan las bacterias en el estómago o en el intestino delgado superior.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un sistema de administración mucoadhesivo que se adhiere a las superficies mucosas del estómago. Se componen normalmente de polímeros con numerosos grupos de enlaces de hidrógeno, por ejemplo, poli(ácidos acrílicos) reticulados, carboximetilcelulosa de sodio, alginato de sodio, carragenanos, Carbopol 934P o policarbófilo tiolado.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un sistema de administración de expansión que aumenta rápidamente de tamaño en el estómago, lo que ralentiza su paso a través del píloro. Tales sistemas incluyen sistemas que se despliegan en el estómago. Por ejemplo, formas geométricas tales como tetraedros, anillos, discos, etc. pueden envasarse en una cápsula de gelatina. Cuando la cápsula se disuelve, la forma se despliega. Los sistemas pueden estar compuestos por uno o más polímeros erosionables (por ejemplo, hidroxipropilcelulosa), uno o más polímeros no erosionables (por ejemplo, poliolefinas, poliamidas, poliuretanos). El producto terapéutico de glicanos puede dispersarse entonces dentro de la matriz de polímero. Los tiempos de retención pueden ajustarse mediante la combinación de polímero. Alternativamente, pueden usarse dispositivos hechos de polímeros elásticos que son estables en el pH ácido del estómago pero se disuelven en las condiciones neutras/alcalinas más a lo largo del tubo digestivo. Tales formulaciones de polímero pueden evitar la obstrucción intestinal cuando el dispositivo sale del estómago. También pueden usarse geles de polímeros supramoleculares reticulados mediante enlaces de hidrógeno entre grupos carboxilo, por ejemplo compuestos por poli(ácido acriloil-6-aminocaproio) (PA6ACA) y poli(ácido ácido metacrílico-co-acrilato de etilo) (EUDRAGIT L 100-55). Otros sistemas incluyen excipientes hinchables, tales como esponjas de colágeno. Por ejemplo, una matriz de hidrogel (por ejemplo un núcleo hinchable: polivinilpirrolidona XL, Carbopol 934P, carbonato de calcio) se hincha 2-50 veces en el estómago. Los materiales compuestos de hidrogel superporoso se hinchan cientos de veces su volumen original en unos pocos minutos. Algunos sistemas aprovechan la generación de gas para lograr la expansión, por ejemplo sistemas expandibles que generan dióxido de carbono que están rodeados por una membrana hidrófila.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un sistema de administración controlado por densidad. Estos sistemas están diseñados para o bien flotar o bien hundirse en fluidos gástricos, lo que retarda su vaciado del estómago. Por ejemplo, sistemas de alta densidad permiten que el dispositivo se asiente en el fondo del estómago, por debajo del píloro, y por tanto evita el vaciado gástrico. Otros sistemas son sistemas de baja densidad/de flotación. Tales dispositivos pueden comprender, por ejemplo, aire atrapado en cámaras huecas o pueden incorporar materiales de baja densidad como grasas, aceites o polvo de espuma. La baja densidad puede lograrse a través de hinchamiento,
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por ejemplo cápsulas que contienen hidrocoloides se disuelven tras el contacto con fluido gástrico y los hidrocoloides se hinchan formando un cuerpo mucoso. Los polímeros alternativos incluyen: quitosanos, alginato de sodio y matriz de monooleato de glicerol. La baja densidad puede lograrse a través de la generación de gas. Por ejemplo, comprimidos cargados con carbonato y opcionalmente ácido cítrico generan dióxido de carbono tras el contacto con medios acuosos ácidos. El dióxido de carbono generado queda atrapado dentro del hidrocoloide en gelificación provocando que el sistema flote. Los hidrocoloides incluyen hidroxipropilmetilcelulosa y carbopol 934P.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento emplea un diseño para retener un dispositivo en el intestino delgado o grueso. La naturaleza específica de ubicación del dispositivo se proporciona mediante un método de desencadenamiento específico, por ejemplo pH, enzima, etc. Estos incluyen sistemas diseñados para mucoadhesión y también píldoras de microagujas. Las píldoras de microagujas comprenden un depósito de fármaco con punzante con microagujas que se encapsula en un recubrimiento sensible al pH. Cuando la píldora alcanza la ubicación deseada en el tubo digestivo y el recubrimiento se disuelve, las microagujas permiten que la píldora se adhiera al revestimiento del tubo digestivo. En otras realizaciones, las píldoras de microagujas comprenden una cápsula que consiste en dos compartimentos químicos llenos de ácido cítrico y bicarbonato de sodio, respectivamente. A medida que la píldora se disuelve en el sistema digestivo, las barreras entre las dos sustancias se erosionan, permitiéndolas mezclarse y crear una reacción química que empuja las microagujas de sacáridos a través de la capa externa de la cápsula y al interior del revestimiento del intestino delgado. Las agujas de sacárido pueden estar llenas de fármacos que se administran a los vasos sanguíneos cercanos a medida que el sacárido se absorbe.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento emplea un recubrimiento de polímero sensible al pH. Por ejemplo, los polímeros dependientes de pH (bi o trifásicos) pueden ser insolubles a niveles de pH bajos (por ejemplo resistencia a ácidos en el estómago, pH 1-2) y volverse cada vez más solubles a medida que se eleva el pH, por ejemplo hasta aproximadamente 5,5 - 6,2 en el duodeno, hasta aproximadamente pH 5,7 en el colon ascendente, hasta aproximadamente pH 6,4 en el ciego, hasta aproximadamente pH 6,6 en el colon transverso, hasta aproximadamente pH 7,0 en el colon descendente, hasta aproximadamente 7,2 - 7,5 en el íleon, o hasta aproximadamente pH 7,5 en el intestino delgado distal. En un ejemplo, puede usarse la tecnología TARGIT™ para administración específica de sitio de las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas en el tubo digestivo. El sistema emplea recubrimientos sensibles al pH sobre cápsulas de almidón moldeadas por inyección para seleccionar como diana el íleon terminal y el colon.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un sistema de liberación retardada o un sistema de liberación controlada en el tiempo. Tales sistemas emplean habitualmente recubrimientos entéricos que pueden combinarse con funciones de liberación en el tiempo y sensibles al pH. Por ejemplo, pueden usarse comprimidos ETP (recubiertos en prensa de liberación en el tiempo con recubrimiento entérico) que se componen de tres componentes: un comprimido de núcleo que contienen producto terapéutico de glicanos (función de liberación rápida), una capa de polímero hidrófoba hinchable, recubierta en prensa (por ejemplo capa de hidroxipropilcelulosa (HPC), y una función de liberación en el tiempo. La duración de la fase de retardo puede controlarse o bien mediante el peso o bien la composición de capa de polímero y una capa de recubrimiento entérico (función de resistencia a ácidos).
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento emplea recubrimiento entéricos de Eudragit® de comprimidos y cápsulas. Otros polímeros sintéticos adecuados incluyen: recubrimientos de laca, etilcelulosa, acetato-ftalato de celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, poli(acetato-ftalato de vinilo) y poli(ácido glutámico), tales como poli-y-ácido glutámico (y- PGA). Estos recubrimientos combinan tanto estrategias mucoadhesivas como de liberación dependiente del pH. Para potenciar la administración dirigida al colon, Eudragits® son copolímeros metacrílicos con composiciones de grupo secundario variable que alteran el pH al que son solubles. Por ejemplo, para sistemas recubiertos con Eudragit® no se produce liberación de fármaco significativa en el estómago (por ejemplo a pH 1,4) y en el intestino delgado (por ejemplo a pH 6,3), mientras que puede observarse una liberación de fármaco significativa a pH 7,8 en la región ileocecal.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un sistema desencadenado por microbios, tal como un sistema de administración basado en polisacáridos. Los sistemas de administración basados en polisacáridos contienen recubrimientos de polímeros biodegradables y mucoadhesivos, incluyendo recubrimientos de quitosano y pectina. Otros polímeros naturales adecuados incluyen, por ejemplo, goma guar, inulina, ciclodextrina, dextrano, amilasa, sulfato de condroitina y goma de algarrobo. Estos sistemas de administración pueden usarse para dirigir el producto terapéutico de glicanos al intestino delgado. Los recubrimientos con polisacáridos que se producen de manera natural como goma guar, goma xantana, quitosano, alginatos, etc. se degradan por la microbiota colónica del intestino, por ejemplo enzimas tales como xilosidasa, arabinosidasa, galactosidasa, etc. Por ejemplo, puede usarse la tecnología CODES™ para administrar las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas. Este sistema combina el recubrimiento de polisacárido con un recubrimiento sensible al pH. En algunas realizaciones, el sistema consiste en un comprimido de núcleo recubierto con tres capas de recubrimientos de polímero: el recubrimiento
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externo se compone de Eudragit L. Este recubrimiento se disuelve en el duodeno y expone el siguiente recubrimiento. El siguiente recubrimiento se compone de Eudragit E. Esta capa permite la liberación de lactulosa presente en el núcleo interno. La lactulosa se metaboliza para dar ácidos grasos de cadena corta que reducen el pH circundante en donde se disuelve la capa de Eudragit E. La disolución de Eudragit E da como resultado la exposición del producto terapéutico de glicanos. Las bacterias presentes en el colon son responsables de la degradación de los polisacáridos que se liberan del comprimido de núcleo. La degradación de polisacáridos puede dar como resultado la formación de ácidos orgánicos que reducen el pH del contenido que rodea al comprimido.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un sistema de administración controlado por presión. El sistema emplea el hecho de que se encuentren presiones superiores en el colon que en el intestino delgado. Por ejemplo, para sistemas de etilcelulosa que son insolubles en agua, la liberación de productos terapéuticos de glicanos se produce tras la disgregación de una cápsula de polímero insoluble en agua como resultado de la presión en la luz del colon. El perfil de liberación puede ajustarse variando el grosor de la etilcelulosa, el tamaño de cápsula y/o la densidad de la cápsula.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un sistema de administración dirigido al colon pulsátil. Por ejemplo, el sistema puede ser un sistema Pulsincap. La cápsula que se emplea comprende un tapón que se coloca en la cápsula que controla la liberación del producto terapéutico de glicanos. Un hidrogel hinchable (por ejemplo hidroxilpropilmetilcelulosa (HPMC), poli(metacrilato de metilo) o poli(acetato de vinilo) sella el contenido de fármaco. Cuando la cápsula entra en contacto con un fluido el tapón se retira por empuje de la cápsula y el producto terapéutico de glicanos se libera. El perfil de liberación puede controlarse variando la longitud y/o el punto de intersección del fármaco con el cuerpo de la cápsula. Otro sistema es un sistema de orificio. El cuerpo de la cápsula se encierra en una membrana semipermeable. El tapón insoluble consiste en un agente osmóticamente activo y el producto terapéutico de glicanos. Cuando la cápsula entra en contacto con un fluido, la membrana semipermeable permite el flujo hacia dentro del fluido, lo que aumenta la presión en el cuerpo de la cápsula. Esto conduce a que se eyecte el tapón y se libere el producto terapéutico de glicanos.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es un sistema de administración dirigido al colon controlado osmóticamente. Un sistema a modo de ejemplo, OROS-CT, consiste en unidades osmóticas (hasta 5 ó 6 unidades de tirar-empujar) encapsuladas en una cápsula de gelatina dura. Las unidades de tirar-empujar tienen dos capas con una membrana impermeable externa y una membrana semipermeable interna. La parte central, interna de la unidad de tirar-empujar consiste en la capa de fármaco y la capa de empujar. El producto terapéutico de glicanos se libera a través de la membrana semipermeable. El cuerpo de la cápsula que encierra las unidades de tirar-empujar se disuelve inmediatamente tras la administración. En el tubo digestivo le membrana impermeable entérica impide la absorción de agua. El recubrimiento entérico se disuelve en el intestino delgado (pH superior, >7), entra agua en la unidad a través de la membrana semipermeable provocando que la capa de empujar se hinche y fuerce a salir al producto terapéutico de glicanos.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es una “píldora inteligente” que puede usarse para liberar el producto terapéutico de glicanos justo antes de alcanzar la válvula ileocecal.
En algunas realizaciones, la forma de dosificación para las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es una formulación administrada por vía rectal. Por ejemplo, los enemas introducen una composición terapéutica de glicanos farmacéutica en formulación líquida en el recto. El volumen administrado es normalmente de menos de 10 ml. Los supositorios introducen una composición terapéutica de glicanos farmacéutica en el recto. Los supositorios son formas de dosificación sólidas que se funden o se disuelven cuando se insertan en el recto, liberando los productos terapéuticos de glicanos. Los excipientes típicos para las formulaciones de supositorios incluyen manteca de cacao, polietilenglicoles y agar.
Generación de polifenoles, síntesis y preparación de extractos
Se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos y preparaciones de polifenol. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden al menos un polifenol. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos comprenden una pluralidad de polifenoles.
Las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos y las preparaciones de polifenoles pueden generarse por separado. Por ejemplo, la preparación de productos terapéuticos de glicanos puede sintetizarse y la preparación de polifenoles puede extraerse tal como se describe en el presente documento. En otro ejemplo, la preparación de productos terapéuticos de glicanos puede sintetizarse y la preparación de polifenoles puede sintetizarse también tal como se describe en el presente documento. En aún otro ejemplo, la preparación de productos terapéuticos de
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glicanos puede sintetizarse y la preparación de polifenoles puede comprender una pluralidad de polifenoles que se extrajeron de una fuente y una pluralidad que se sintetizaron.
En algunas realizaciones, se generan preparaciones de polifenoles a partir de extractos que contienen los polifenoles. En otras realizaciones, las preparaciones de polifenoles comprenden polifenoles que se sintetizan.
Pueden generarse composiciones farmacéuticas y alimentos médicos mezclando la preparación de productos terapéuticos de glicanos con la preparación de polifenoles mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, las preparaciones se mezclan en una razón de 0,000000001:1, 0,00000001:1, 0,0000001:1, 0,000005:1, 0,00001:1, 0,0001:1. 0,001:1, 0,01:1, 0,1:1, 0,5:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1000.000 (v/v), (p/p), (p/v) o molar (glicano:polifenol, polifenol:glicano).
En algunas realizaciones, las preparaciones de polifenoles se extraen de plantas, partes de plantas, células vegetales o productos vegetales. Ejemplos de partes de plantas son pero no se limitan a corteza, flor, pétalo, tallo, pedúnculo, tubérculo, raíz, fruto, baya, semilla, nuez, hoja. Los ejemplos de productos vegetales incluyen pero no se limitan a jugo de orujo, pulpa, piel, papilla, pasta y suspensión. Los ejemplos de plantas pueden incluir pero no se limitan a arándano, arándano rojo, uva, melocotón, ciruela, granada, soja, vino tinto, té negro, té verde. En algunas realizaciones, los polifenoles se extraen de múltiples plantas, partes de plantas o productos vegetales. En algunas realizaciones el extracto de polifenol se combina de múltiples plantas, partes de plantas o productos vegetales.
Los polifenoles pueden extraerse de cualquier fuente adecuada, tal como, por ejemplo alimentos ricos en polifenoles, incluyendo, pero sin limitarse a, clavo, menta, anís estrellado, polvo de cacao, orégano, semilla de apio, cornijuelo negro, chocolate negro, harina de semilla de lino, baya de saúco negro, castaña, salvia común, romero, menta verde, tomillo común, arándano de arbusto bajo, grosella negra, alcaparras, aceituna negra, arándano de arbusto alto, avellana, nuez pecana, harina de soja, ciruela, aceituna verde, albahaca dulce, curry, polvo, cereza dulce, cabezas de alcachofa, mora, soja tostada, chocolate con leche, fresa, achicoria roja, frambuesa roja, café, filtro, jengibre, harina de trigo duro integral, ciruela, almendra, uva negra, cebolla roja, achicoria verde, tomillo común, harina de maíz refinada, reciente, soja, tempeh, harina de arroz integral, manzana, espinaca, chalota, hierba luisa, té negro, vino tinto, té verde, yogur de soja, cebolla amarilla, carne de soja, harina de trigo integral, zumo de manzana puro, zumo de granada puro, aceite de oliva virgen extra, judías negras, melocotón, zumo de naranja sanguina puro, comino, zumo de uva puro, judías blancas, canela china, zumo de naranja blanca puro, brócoli, grosella roja, tofu de soja, zumo de limón puro, harina de avena integral, albaricoque, alcaravea, harina de centeno refinada, espárrago, nuez, patata, canela de Ceilán, perejil, nectarina, escarola, mejorana, lechuga roja, bebida de chocolate con leche, membrillo, endivia (escarola), leche de soja, zumo de pomelo puro, aceite de colza, pera, brotes de soja, uva verde, zanahoria, vinagre, queso de soja, vino blanco y vino rosado.
En algunas realizaciones, los polifenoles pueden extraerse de zumo de plantas. En algunas realizaciones, el zumo de plantas es el zumo de un arándano, mora, frambuesa, baya de Hocken, grosella espinosa, baya de Boysen, baya de acai, baya de Actea, agracejo, gayuba, Vaccinium, cornijuelo, Cornus canadensis, baya de los búfalos, cornijuelo, Vaccinium vites-idaea, baya de saúco, arándano rojo, baya de rocío, grosella, Vaccinium arboreum, baya de goji, grosella espinosa, uva, baya de acebo, baya de Huckle, baya de hiedra, Amelanchier alnifolia, baya de enebro, arándano, baya de Logan, baya de muérdago, Viburnum lentago, uva de Oregón, caqui, Phytolacca americana, ligustro, Rubus spectabilis, fresa, Celtis laevigata, mora más frambuesa, Rubus parviflorus, morera blanca, morera roja, morera negra, Rubus phoenicolasius, gaulteria, baya de tejo o Rubus urcinos var. Young.
En algunas realizaciones, pueden extraerse polifenoles de plantas o tejido de plantas que se han modificado, cultivado, modificado por ingeniería genética o cambiado de otra forma, por ejemplo, para alterar la composición o cantidad de contenido en polifenoles. En algunas realizaciones, las plantas o tejido de plantas se trata, se somete a o se pone en contacto con un agente inductor de polifenoles (por ejemplo un agente químico o radiación, tal como UV) antes de o después de recoger o aislar la planta o el tejido de plantas para inducir o estimular la producción de polifenoles por la planta o tejido de planta o para aumentar la cantidad relativa de polifenoles en la planta o tejido de planta, en comparación por ejemplo con una planta o tejido no tratado o una planta o tejido que no se ha sometido a ni se ha puesto en contacto con el agente inductor de polifenoles.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de productos terapéuticos de glicanos comprenden preparaciones de polifenoles que pueden extraerse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el método de extracción puede comprender una o más de las siguientes etapas: i) secar la fuente; ii) moler, triturar, machacar, combinar u homogeneizar de otra forma la fuente; iii) extraer los polifenoles de la fuente, por ejemplo usando un disolvente.
El material de fuente puede pretratarse opcionalmente con enzimas o tratarse con enzimas durante la extracción. Los ejemplos de enzimas incluyen pero no se limitan a enzimas pectinolíticas y de degradación de polisacáridos de la pared celular.
El disolvente puede ser cualquier disolvente adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, el disolvente puede ser un disolvente orgánico, tal como pero sin limitarse a, metanol, etanol, acetona y acetato de etilo, opcionalmente un
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disolvente acuoso (que comprende agua). Si se desea, el disolvente puede incluir ácidos orgánicos, tales como pero sin limitarse a ácido trifluoroacético, ácido fórmico, ácido acético, ácido cítrico, ácido clorhídrico, ácido tartárico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico. El disolvente puede ser una mezcla de un disolvente orgánico y un ácido en cualquier razón adecuada. El disolvente puede incluir CO2 supercrítico.
La extracción puede llevarse a cabo a entre 0 y 100°C. Los métodos de extracción incluyen: maceración y extracción Soxhlet, evaporación rotatoria, extracción asistida por microondas, extracción asistida por ultrasonidos, extracción con agua subcrítica, extracción con fluido supercrítico, extracción con fluido presurizado, extracción con líquido a presión y extracción con disolvente acelerada.
En algunas realizaciones, la extracción puede realizarse múltiples veces sobre el mismo material de fuente. Si se desea, pueden combinarse múltiples extracciones a partir del material de fuente. En otras realizaciones, pueden combinarse múltiples extracciones de diferentes materiales de fuente.
La purificación y el fraccionamiento del extracto de polifenol puede lograrse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a: i) extracción secuencial o reparto líquido-líquido, ii) extracción en fase sólida, iii) cromatografía en contracorriente y iv) centrifugación. Para la extracción secuencial, el extracto en bruto puede lavarse con disolventes no polares para eliminar lípidos. Ejemplos de disolventes no polares son pero no se limitan a hexano, diclorometano y cloroformo. Para extracción en fase sólida, el extracto en bruto puede lavarse sobre un sustrato de unión a fase sólida para separar los sustituyentes de polifenoles y/o eliminar azúcares. En algunas realizaciones, se eliminan constituyentes solubles en agua tales como ácidos orgánicos y azúcar con agua acidificada. Ejemplos de sustratos de unión a fase sólida son pero no se limitan a C18, Amberlite XAD-2, XAD-7, XAD-16, Oasis HLB, C8 a base de sílice, HLB a base de polímero, PH, ENV+, RP-C18, Toyopearl, LH-20, resina de poliamida y MCX. Si se desea, los polifenoles pueden fraccionarse además ajustando el pH del disolvente y disolvente eluyente. Los ejemplos de eluyentes incluyen pero no se limitan a etanol, metanol, acetona y agua, y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, se eluyen ácidos fenólicos con agua. En algunas realizaciones, se eluyen fenoles no poliméricos con acetato de etilo acidificado. En algunas realizaciones, se eluyen fenoles poliméricos con una combinación de agua, acetona, etanol y/o metanol. En algunas realizaciones, se eluyen procianidinas con acetona y agua.
Como ejemplo, pueden aislarse proantocianidinas de hollejos de uva. Los hollejos de uva pueden recogerse tras exprimirse el zumo de las uvas y retirarse. Un disolvente adecuado, por ejemplo una mezcla de acetona/agua puede usarse para extraer polifenoles de los hollejos de uva. El disolvente se retira entonces. La extracción en fase acuosa puede llevarse a cabo, por ejemplo con cloroformo y los extractos pueden secarse por congelación opcionalmente. El polvo resultante puede purificarse usando cromatografía de adsorción. Las proantocianidinas pueden lavarse y eluirse con un disolvente (por ejemplo metanol, acetona) y ácido trifluoroacético. El disolvente se retira y la fase acuosa se seca por congelación opcionalmente para generar polvos de proantocianidinas.
Pueden usarse diversos métodos para caracterizar las mezclas de protoantocianidinas resultantes. Puede usarse catálisis con ácido en presencia de floroglucinol en exceso para determinar la composición de subunidades, el rendimiento de conversión y el grado de polimerización medio. La distribución de masa de polifenoles se determina con espectrometría de masas. El método de espectroscopía de masas consiste en la disolución de polifenoles en un disolvente adecuado (por ejemplo metanol/acetonitrilo) e infusión en el electropulverizador. La cromatografía de permeación en gel puede proporcionar espectros de picos de elución y se ejecuta con dos columnas en serie (por ejemplo, TSKgel G3000 Hxl tamaño de partícula de 6 um seguido por G2500 Hxl tamaño de partícula de 5 um, ambas de 300 x 7,8 mm de d.i.), llevada a cabo en condiciones isocráticas con la fase móvil como dimetilformamida. Las protoantocianidinas pigmentadas pueden caracterizarse con espectrofotometría UV-Vis. Finalmente, puede realizarse análisis elemental para C, H, y N cargando una muestra de polvo en una copa de estaño y ejecutando el análisis usando un analizador elemental, tal como, por ejemplo, un instrumento Carlo Erba EZ 1108.
En algunas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden polifenoles sintéticos. Los polifenoles pueden no sólo derivarse de fuentes vegetales adecuadas (por ejemplo extractos de plantas) sino que también pueden sintetizarse. Los polifenoles pueden sintetizarse por medio de una combinación adecuada de métodos químicos, bioquímicos o biotecnológicos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los polifenoles se extraen de fuentes naturales y posteriormente se modifican por medio de métodos químicos, bioquímicos o biotecnológicos. En algunas realizaciones, las estructuras químicas de polifenoles sintetizados o modificados no se encuentran en la naturaleza. Los ejemplos de modificaciones químicas incluyen pero no se limitan a metilación, hidroxilación, prenilación, glicosilación, dimerización y polimerización. Los ejemplos de glicosilación incluyen pero no se limitan a glucósidos, galactósidos, arabinósidos y ramnósidos.
Se conocen en la técnica métodos para la síntesis química de polifenoles y se describen, por ejemplo, en Quideau S et al. “Plant Polifenols: Chemical Properties, Biological Activities, and Synthesis”, Angewandte Chemie 2011, 50, 586-621. En algunas realizaciones, los polifenoles se sintetizan o se modifican por medio de métodos biotecnológicos, por ejemplo usando enzimas para catalizar reacciones adecuadas. Las reacciones pueden producirse dentro de células (por ejemplo en bacterias, levaduras, células vegetales) o en extractos o lisados en u obtenidos de por ejemplo bacterias, levaduras o células vegetales. En algunas realizaciones, se aíslan enzimas
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específicas y se usan en sistemas de tampón adecuados y en condiciones de reacción adecuadas. Se conocen en la técnica métodos para la síntesis biotecnológica de polifenoles y se describen, por ejemplo, en Cress B et al. “Isoflavonoid Production By Genetically Engineered Microorganisms”, Natural Products. Springer-Verlag Berlín Heidelberg, 2013. 1647-1681; Trantas EA et al. “When Plants Produce Not Enough Or At All: Metabolic Engineering Of Flavonoids In Microbial Hosts”, Frontiers in Plant Science 2015, 6.
Los polifenoles pueden cuantificarse o medirse mediante cualquier método adecuado. En algunas realizaciones, se usan concentraciones conocidas de un patrón de referencia (por ejemplo un polifenol o pluralidad de polifenoles) para comparación en una medición. En algunas realizaciones, se cuantifican los polifenoles totales por medio del método de Folin-Denis, el método de Folin-Ciocalteau, valoración con permanganato, colorimetría con sales de hierro, HPLC, precipitación de sustratos o absorbancia electromagnética.
En algunas realizaciones, se cuantifican las clases de polifenoles. Por ejemplo, las antocianinas pueden cuantificarse usando absorbancia electromagnética entre la longitud de onda de 490 y 550 nM a uno o múltiples pH. Las protoantocianidinas pueden cuantificarse usando métodos colorimétricos, precipitación de sustratos o ensayos de unión a proteínas, o una combinación de los mismos. En otro ejemplo, los taninos pueden cuantificarse usando yoduro de potasio, rodanina o nitrito de sodio, o ensayos de unión a proteínas, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, se usa cromatografía de gases para la separación y cuantificación de polifenoles o una pluralidad de polifenoles. Si se desea, los polifenoles pueden modificarse antes de la cromatografía de gases, por ejemplo para hacer que los polifenoles sean más volátiles. Alternativamente o además, los polifenoles se cuantifican por medio de HPLC, opcionalmente usando diversos soportes sólidos y fases móviles. Los polifenoles también pueden cuantificarse por medio de espectrometría de masas (EM). En algunas realizaciones, los polifenoles se cuantifican con HPLC-EM opcionalmente usando diversos soportes sólidos y fases móviles. En algunas realizaciones, se mide la capacidad antioxidante de los polifenoles. Por ejemplo, la capacidad antioxidante de los polifenoles puede medirse por medio del ensayo de capacidad antioxidante equivalente Trolox, ensayo de capacidad de absorbancia de radicales de oxígeno, ensayo de parámetros antioxidantes de atrapamiento de radicales totales, ensayo de polvo antioxidante de reducción de ión férrico, ensayo de capacidad antioxidante de reducción de ión cúprico, o una combinación de los mismos.
Otros métodos para la extracción, purificación, análisis y cuantificación fenólicos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Dai J. y Mumper RJ, “Plant Fenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties”, Molecules 2010, 15(10), 7313-7352.
En algunas realizaciones, los polifenoles pueden extraerse y/o concentrarse usando proteínas de diversas fuentes y opcionalmente variando el pH, por ejemplo, descrito en Raskin et al., publicación de patente estadounidense n.° 20140328997.
En algunas realizaciones, el rendimiento de polifenoles extraídos es de pg/kg de material de fuente. En algunas realizaciones, el rendimiento de polifenoles extraídos es de mg/kg de material de fuente. En algunas realizaciones el rendimiento de polifenoles extraídos es de g/kg de material de fuente.
En algunas realizaciones, la preparación de polifenoles incluye flavonoides. En algunas realizaciones, los flavonoides son antocianinas, antocianidinas, chalconas, dihidrochalconas, dihidroflavonoles, flavanoles, flavan-3- oles, flavanonas, flavonas, flavonoles, isoflavonoides, protoantocianidinas, taninos condensados, taninos no hidrolizables. En algunas realizaciones los flavonoides son monómeros. En algunas realizaciones los flavonoides son dímeros. En algunas realizaciones los flavonoides son polímeros. En algunas realizaciones los flavonoides están químicamente modificados. Ejemplos de modificaciones químicas son pero no se limitan a metilación, hidroxilación, prenilación, glicosilación. Ejemplos de glicosilación son pero no se limitan a glucósidos, galactósidos, arabinósidos, ramnósidos.
En algunas realizaciones, la preparación de polifenoles incluye taninos hidrolizables, florotaninos, lignanos, alquilmetoxifenoles, alquilfenoles, curcumoides, furanocumarinas, hidroxibenzaldehídos, hidroxibenzocetonas, hidroxicinamaldehído, hidroxicumarinas, hidroxifenilpropenos, metoxifenoles, naftoquinonas, terpenos fenólicos, tirosoles, arbutina, catecol, pirocatecol, resorcinol, coumestrol, fenol, florina, porogalol, floroglucinol, ácido salvianólico, ácido hidroxibenzoico, ácido hidroxicinámico, ácido hidroxifenilacético, ácido hidroxifenilpropánico, ácido hidroxifenilpentanoico, estilbenos. En algunas realizaciones los polifenoles son monómeros. En algunas realizaciones los polifenoles son dímeros. En algunas realizaciones los polifenoles son polímeros. En algunas realizaciones los polifenoles están químicamente modificados. Ejemplos de modificaciones químicas son pero no se limitan a metilación, hidroxilación, prenilación, glicosilación. Ejemplos de glicosilación son pero no se limitan a glucósidos, galactósidos, arabinósidos, ramnósidos.
En algunas realizaciones, los extractos comprenden una pluralidad de uno o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más) polifenoles enumerados en la tabla 5. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento comprenden una pluralidad de uno o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más) polifenoles enumerados en la tabla 5.
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Kits
También se contemplan kits. Por ejemplo, un kit puede comprender formas de dosificación unitarias de la composición terapéutica de glicanos farmacéutica, y un prospecto que contiene instrucciones para el uso del producto terapéutico de glicanos en el tratamiento de un trastorno o estado gastrointestinal. Los kits incluyen una composición terapéutica de glicanos farmacéutica en un envase adecuado para su uso por un sujeto que lo necesita. Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede envasarse en forma de un kit. Un kit puede contener una cantidad de una composición terapéutica de glicanos farmacéutica (opcionalmente que comprende adicionalmente una sustancia prebiótica, una bacteria probiótica y/o un segundo agente terapéutico) suficiente para un ciclo de tratamiento completo, o para una porción de un ciclo de tratamiento. Las dosis de una composición terapéutica de glicanos farmacéutica pueden envasarse individualmente, o la composición terapéutica de glicanos farmacéutica puede proporcionarse a granel, o combinaciones de las mismas. Por tanto, en una realización, un kit proporciona, en un envase adecuado, dosis individuales de una composición terapéutica de glicanos que corresponden a puntos de dosificación en un régimen de tratamiento, en el que las dosis se envasan en uno o más paquetes.
En una realización, la composición terapéutica de glicanos farmacéutica puede proporcionarse a granel en un único recipiente, o en dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco recipientes. Por ejemplo, cada recipiente puede contener suficiente de una composición terapéutica de glicanos farmacéutica para una semana particular de un programa de tratamiento que dura un mes. Si se proporciona más de un recipiente a granel, los recipientes a granel pueden envasarse juntos adecuadamente para proporcionar una composición terapéutica de glicanos farmacéutica suficiente para todo o una porción de un periodo de tratamiento. El recipiente o recipientes pueden etiquetarse con una etiqueta que indica información útil para el sujeto que lo necesita o el médico que realiza el protocolo de tratamiento, tal como, por ejemplo programas de dosificación.
La composición terapéutica de glicanos farmacéutica puede envasarse con otras sustancias adecuadas, tales como bacterias probióticas, sustancias prebióticas u otras, tal como se describe en el presente documento. La otra sustancia o sustancias pueden envasarse por separado de la composición terapéutica de glicanos farmacéutica, o mezclarse con la composición terapéutica de glicanos farmacéutica, o combinaciones de las mismas. Por tanto, en una realización, los kits incluyen una forma de dosificación que contiene todos los componentes destinados a usarse en un ciclo de tratamiento o una porción de un ciclo de tratamiento, por ejemplo, una composición terapéutica de glicanos farmacéutica y opcionalmente tampones, excipientes, etc., un probiótico, prebiótico o un agente terapéutico. En una realización, una composición terapéutica de glicanos farmacéutica se envasa en un envase o conjunto de envases, y componentes adicionales, tales como bacterias probióticas, prebióticos y agentes terapéuticos se envasan por separado de la composición terapéutica de glicanos farmacéutica.
Los kits pueden incluir además materiales escritos, tales como instrucciones, resultados esperados, testimonios, explicaciones, advertencias, datos clínicos, información para profesionales sanitarios, y similares. En una realización, los kits contienen un marcador u otra información que indica que el kit es sólo para su uso bajo la dirección de un profesional sanitario. El recipiente puede incluir además cucharas, jeringas, frascos, copas, aplicadores u otros dispositivos para servir o medir.
Métodos de modulación de taxones microbianos, estados genómicos y funcionales del microbioma
Se dan a conocer en el presente documento métodos para la modulación de la abundancia de taxones bacterianos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o más taxones) en la microbiota intestinal de un sujeto humano. Estos métodos incluyen administrar al sujeto humano una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para modular la abundancia de los taxones. La abundancia de taxones bacterianos puede aumentar en relación con otros taxones (o en relación con un punto en el tiempo a otro) cuando se administra el producto terapéutico de glicanos y el aumento puede ser un aumento de al menos el 5%, el 10%, el 25% el 50%, el 75%, el 100%, el 250%, el 500%, el 750% o al menos un aumento del 1000%. La abundancia de taxones bacterianos también puede disminuir en relación con otros taxones (o en relación con un punto en el tiempo a otro) cuando se administra el producto terapéutico de glicanos y la disminución puede ser una disminución de al menos el 5%, el 10%, el 25% el 50%, el 75%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99%, o al menos una disminución del 99,9%. En algunas realizaciones, una disbiosis ha desplazado la microbiota y ha aumentado uno o más taxones no deseados y/o ha aumentado uno o más taxones deseados. La administración del producto terapéutico de glicanos puede modular la abundancia de los taxones bacterianos deseados y/o no deseados en la microbiota gastrointestinal del sujeto, tratando de ese modo la disbiosis.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos puede modular (por ejemplo aumentar o disminuir) el crecimiento de una o más bacterias, tales como, por ejemplo, las que pertenecen a los géneros Bacteroides, Odoribacter, Parabacteroides, Alistipes, Blautia, Clostridium, Coprococcus, Dorea, Eubacterium, Lachnospira, Roseburia, Ruminococcus, Faecalibacterium, Oscillospira y Subdoligranulum que pueden encontrarse en el tubo digestivo. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos puede modular (por ejemplo aumentar o disminuir) el crecimiento de una o más bacterias, tales como, por ejemplo, las que se cree que están asociadas con
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un estado gastrointestinal sano, tales como, por ejemplo, uno o más de los géneros Akkermansia, Anaerofilum, Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Clostridium, Coprococcus, Dialister, Dorea, Fusobacteríum, Eubacterium, Faecalibacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Phascolarctobacterium, Peptococcus,
Peptostreptococcus, Prevotella, Roseburia, Ruminococcus y Streptococcus, y/o una o más de las especies Akkermansia municiphilia, Christensenella minuta, Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Clostridium scindens, Dialister invisus, Eubacterium rectal, Eubacterium eligens, Faecalibacterium prausnitzii, Streptococcus salivarius y Streptococcus thermophilus.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos puede modular (por ejemplo aumentar o disminuir) el crecimiento de al menos dos taxones bacterianos seleccionados de Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium (Erysipelotrichaceae), Clostridium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostridium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides, Lactobacillus y Enterococcus. Los productos terapéuticos de glicanos a modo de ejemplo incluyen glu100, ara100, glu50gal50 y glu33ga133fuc33, En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos puede modular el crecimiento de los dos taxones bacterianos: Akkermensia y Blautia. Un producto terapéutico de glicanos a modo de ejemplo es xyl100.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos dirigen cambios selectivos en tanto la composición como la actividad (o función) de la microbiota gastrointestinal, confiriendo de ese modo beneficios para la salud al huésped. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos es un sustrato selectivo para una o un número limitado de bacterias potencialmente beneficiosas que residen en el tubo digestivo, estimulando su crecimiento y/o actividad metabólica. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos puede alterar la composición de la microbiota gastrointestinal a una composición superior o inferior en bacterias específicas. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos estimula selectivamente el crecimiento y/o actividad selectiva de bacterias gastrointestinales asociadas con la salud y el bienestar. En un ejemplo, las composiciones de productos terapéuticos de glicanos descritas en el presente documento disminuyen la abundancia o el número relativo o la densidad de una bacteria patógena.
La relación entre la microbiota y su huésped no es meramente comensal (una coexistencia no perjudicial), sino que en muchos casos hay una relación simbiótica. Aunque los sujetos pueden sobrevivir sin la microbiota, los microorganismos realizan una variedad de funciones útiles, tales como fermentar sustratos energéticos sin usar, entrenar al sistema inmunitario, prevenir el crecimiento de bacterias patógenas, regular el desarrollo del intestino, producir vitaminas para el huésped (tales como biotina y vitaminas) (véase, por ejemplo, Dominguez-Bello M G y Blaser M J, 2008 Microbes Infect, 10(9): 1072-1076). Los taxones bacterianos gastrointestinales comunes incluyen los géneros Bacteroides, Odoribacter, Parabacteroides, Alistipes, Blautia, Clostridium, Coprococcus, Dorea, Eubacterium, Lachnospira, Roseburia, Ruminococcus, Faecalibacterium, Oscillospira y Subdoligranulum. Se cree que algunos géneros y especies bacterianos están asociados con un estado de salud del tubo digestivo, tales como, por ejemplo, los géneros Akkermansia, Anaerofilum, Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Clostridium, Coprococcus, Dialister, Dorea, Fusobacteríum, Eubacterium, Faecalibacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Phascolarctobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Prevotella, Roseburia, Ruminococcus y Streptococcus, y/o las especies Akkermansia municiphilia, Christensenella minuta, Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Clostridium scindens, Dialister invisus, Eubacterium rectal, Eubacterium eligens, Faecalibacterium prausnitzii, Streptococcus salivarius y Streptococcus thermophilus.
Sin embargo, en determinadas condiciones, están presentes en el nicho especies patógenas y patobiontes que pueden provocar enfermedad, por ejemplo induciendo una infección y/o inflamación y/o bacterias asociadas con un estado patológico sin ser necesariamente un agente causante. En algunas realizaciones, las bacterias, patobiontes o patógenos asociados con enfermedad que pueden modularse mediante los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento se seleccionan del grupo que consiste en los géneros Bilophila, Campylobacter, Candidatus, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Desulfovibrio, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Fusobacteríum, Haemophilus, Klebsiella, Lachnospiraceae, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Portiera, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio y Yersinia.
En algunas realizaciones, las bacterias, patobiontes o patógenos asociados con enfermedad que pueden modularse mediante los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento se seleccionan del grupo que consiste en las especies Bilophila wadsworthia, Campylobacter jejuni, Citrobacter farmer, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Collinsella aerofaciens, Enterobacter hormaechei, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Fusobacterium varium, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumonía, Peptostreptococcus stomatis, Porphyromonas asaccharolytica, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Streptococcus infantarius, Vibrio cholera y Yersinia enterocolitica.
En algunas realizaciones, las bacterias, patobiontes o patógenos asociados con enfermedad que pueden modularse mediante los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento pueden residir predominantemente en una o más regiones específicas del tubo digestivo.
Por ejemplo, las siguientes bacterias, patobiontes y patógenos asociados con enfermedad residen
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predominantemente en el intestino grueso (colon): Listeria, Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Basidiobolus ranarum, Trypanosoma cruzi, Clostridium botulinum, Fasciola hepatica, Histoplasma capsulatum, Rotavirus, Schistosoma mansoni, Schistosoma japonicum y Schistosoma mekongi, Shigella, Brachyspira aalborgi, Serpulina pilosicoli, Trichuris trichiura y Yersinia enterocolitica.
Las siguientes bacterias, patobiontes y patógenos asociados con enfermedad residen predominantemente en el intestino delgado: Vibrio, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Clostridium perfringens, Capillaria philippinensis, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis y virus CMV.
Las siguientes bacterias, patobiontes y patógenos asociados con enfermedad residen predominantemente en el intestino grueso y delgado: Campylobacter y Salmonella.
En otro ejemplo, las siguientes bacterias, patobiontes y patógenos asociados con enfermedad residen predominantemente en el estómago: virus CMV, Bacillus anthracis, Candida, Cryptosporidium, EBV (virus de Epstein-Barr), Giardia lamblia, Helicobacter pylori, Helicobacter felis, Helicobacter fennelliae, Helicobacter cinaedi, Mycobacterium avium, virus del herpes-varicela zóster, Histoplasma y Toxoplasma.
Una comunidad microbiana sana protege al huésped, por ejemplo, potenciando la barrera intestinal, mediante exclusión competitiva de patógenos potenciales o bacterias asociadas a enfermedad, y mediante inhibición del crecimiento de patógenos bacterianos y bacterias asociadas a enfermedad. Una comunidad bacteriana sana puede ejercer efectos antibacterianos directos sobre los patógenos y las bacterias asociadas a enfermedad a través de la producción de sustancias antibacterianas, incluyendo bacteriocinas y ácido (Cotter P D, et al. 2005 Nat Rev, 3:777- 788; Servin A L, 2004 FEMS Microbiol Rev, 28: 405-440). Las sustancias antibacterianas ejercen sus efectos solas o sinérgicamente inhibiendo el crecimiento de patógenos o bacterias asociadas a enfermedad. Una comunidad bacteriana sana puede disminuir la adhesión de tanto los patógenos como sus toxinas al revestimiento gastrointestinal.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos que residen en el tubo digestivo, tales como, por ejemplo, los que pertenecen a los géneros Bacteroides, Odoribacter, Parabacteroides, Alistipes, Blautia, Clostridium, Coprococcus, Dorea, Eubacterium, Lachnospira, Roseburia, Ruminococcus, Faecalibacterium, Oscillospira y Subdoligranulum que pueden encontrarse en el tubo digestivo. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos, tales como los que se cree que están asociados con un estado gastrointestinal sano, por ejemplo, uno o más de los géneros Akkermansia, Anaerofilum, Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Clostridium, Coprococcus, Dialister, Dorea, Fusobacteríum, Eubacterium, Faecalibacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Phascolarctobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Prevotella, Roseburia, Ruminococcus y Streptococcus, y/o una o más de las especies Akkermansia municiphilia, Christensenella minuta, Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Clostridium scindens, Dialister invisus, Eubacterium rectal, Eubacterium eligens, Faecalibacterium prausnitzii, Streptococcus salivarius y Streptococcus thermophilus. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos, tales como taxones del filo Verrucomicrobia, por ejemplo, los del género Akkermansia.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos que residen predominantemente en el intestino delgado. Por ejemplo, el producto terapéutico de glicanos modula uno o más (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) taxones bacterianos que residen predominantemente en el intestino delgado, tales como, por ejemplo Actinobacteria, Firmicutes (bacilos, clostridios) y Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria). En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula uno o más (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) taxones bacterianos que residen predominantemente en el intestino delgado seleccionados de los géneros: Cryocola, Mycobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Turicibacter, Blautia, Coprococcus, Holdemania, Pseudoramibacter Eubacterium, Agrobacterium, Sphingomonas, Achromobacter, Burkholderia y Ralstonia.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos que residen predominantemente en el intestino grueso. Por ejemplo, el producto terapéutico de glicanos modula uno o más (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) taxones bacterianos que residen predominantemente en el intestino grueso, tales como, por ejemplo Bacteroidetes, Firmicutes (clostridios), Verrucomicrobia y Proteobacteria (Deltaproteobacteria). En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula uno o más (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) taxones bacterianos que residen predominantemente en el intestino grueso seleccionados de los géneros: Bacteroides, Butyricimonas, Odoribacter, Parabacteroides, Prevotella, Anaerotruncus, Phascolarctobacterium, Ruminococcus, Bilophila y Akkermansia.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos que residen predominantemente en el ciego, tales como, por ejemplo Actinobacteria, Bacteroides, Bacilli, Clostridia, Mollicutes, Alfa Proteobacteria y Verrucomicrobia.
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En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos que residen predominantemente en el colon ascendente, tales como, por ejemplo Actinobacteria, Bacteroides, bacilos, clostridios, Fusobacteria, Beta Proteobacteria, Delta/Épsilon Proteobacteria, Gamma Proteobacteria y Verrucomicrobia.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos que residen predominantemente en el colon transverso, tales como, por ejemplo Actinobacteria, Bacteroides, clostridios, Mollicutes, Fusobacteria y Gamma Proteobacteria.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos que residen predominantemente en el colon descendente, tales como, por ejemplo Bacteroides, clostridios, Mollicutes, Fusobacteria, Delta/Epsilon Proteobacteria y Verrucomicrobia.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos que residen predominantemente en el colon sigmoide, tales como, por ejemplo Actinobacteria, Bacteroides, bacilos, clostridios, Mollicutes, Alfa Proteobacteria, Beta Proteobacteria y Verrucomicrobia.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos que residen predominantemente en el recto, tales como, por ejemplo Bacteroides, clostridios, Mollicutes, Alfa Proteobacteria, Gamma Proteobacteria y Verrucomicrobia.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos modulan (por ejemplo estimulan/aumentan o suprimen/disminuyen) el crecimiento de uno o más (por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100, 150, 200, o más de 200) taxones microbianos comensales endógenos o taxones bacterianos probióticos administrados de manera exógena de diversos géneros incluyendo, por ejemplo Alistipes, Akkermansia, Anaerofilum, Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Clostridium, Coprococcus, Dialister, Dorea, Fusobacterium, Eubacterium, Faecalibacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Odoribacter, Oscillospira, Parabacteroides, Phascolarctobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Prevotella, Roseburia, Ruminococcus y Streptococcus y Subdoligranulum.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos modulan (por ejemplo estimulan/aumentan o suprimen/disminuyen) el crecimiento de uno o más (por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 100, 150, 200, o más de 200) taxones microbianos comensales o simbióticos endógenos o taxones bacterianos probióticos administrados de manera exógena de diversos géneros incluyendo, pero sin limitarse a, taxones bacterianos seleccionados del grupo que consiste en los géneros Akkermansia, Anaerofilum, Bacteroides, Blautia, Bifidobacterium, Butyrivibrio, Clostridium, Coprococcus, Dialister, Dorea, Fusobacterium, Eubacterium, Faecalibacterium, Lachnospira, Lactobacillus, Phascolarctobacterium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Prevotella, Roseburia, Ruminococcus y Streptococcus y de las especies Akkermansia municiphilia, Christensenella minuta, Clostridium coccoides, Clostridium leptum, Clostridium scindens, Dialister invisus, Eubacterium rectal, Eubacterium eligens, Faecalibacterium prausnitzii, Streptococcus salivarius y Streptococcus thermophilus que se cree que están asociados con la salud gastrointestinal pueden modularse mediante los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos modulan (por ejemplo aumentan sustancialmente o disminuyen sustancialmente) el crecimiento (y el número total) de (o aumentan sustancialmente o disminuyen sustancialmente la representación relativa en la comunidad gastrointestinal total) de uno o más de (por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más de 50) los géneros, las especies o los clados filogenéticos enumerados en la tabla 1. La tabla 1 proporciona una lista a nivel de género de los constituyentes microbianos del tubo digestivo.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos aumentan sustancialmente el crecimiento, por ejemplo el número total o la representación relativa en la comunidad gastrointestinal total, la comunidad del intestino grueso o la comunidad del intestino delgado de uno o más de (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más de 50) de las OtU, los géneros, las especies o los clados filogenéticos enumerados en las tablas 1, 3 y 4.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos disminuyen sustancialmente el crecimiento, por ejemplo el número total o la representación relativa en la comunidad gastrointestinal total, la comunidad del intestino grueso o la comunidad del intestino delgado de uno o más de (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más de 50) de las OtU, los géneros, las especies o los clados filogenéticos enumerados en las tablas 1, 3 y 4.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos aumentan y disminuyen sustancialmente el crecimiento, por ejemplo el número total o la representación relativa en la comunidad gastrointestinal total, la
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comunidad del intestino grueso o la comunidad del intestino delgado de uno o más de (por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más de 50) de las OTU, los géneros, las especies o los clados filogenéticos enumerados en las tablas 1,3 y 4.
En algunas realizaciones, se proporcionan en el presente documento productos terapéuticos de glicanos que son sustratos solo para bacterias de grupos seleccionados que pueden utilizar el producto terapéutico de glicanos como fuente de alimento. La descomposición del producto terapéutico de glicanos ejerce entonces efectos beneficiosos sobre la salud del huésped. Los efectos beneficiosos sobre la salud se deben a una estimulación selectiva del crecimiento y/o la actividad biológica de un número seleccionado de géneros, especies o cepas microbianos en la microbiota gastrointestinal que pueden utilizar el producto terapéutico de glicanos como fuente de alimento y conferir beneficios para la salud del huésped. Los efectos del producto terapéutico de glicanos, en determinadas realizaciones, se deben a una estimulación selectiva del crecimiento de las bacterias beneficiosas en el tubo digestivo. Tales aumentos y disminuciones en la abundancia de determinados taxones pueden ser suficientes para “normalizar” la microbiota residente, por ejemplo para reinstalar un estado de salud o equilibrio. El aumento o la disminución es con respecto a la razón presente en el sujeto humano antes de la ingestión de la composición terapéutica de glicanos farmacéutica, o con respecto a un grupo de control que no toma la composición terapéutica de glicanos farmacéutica. Pude usarse el índice prebiótico (PI) como aproximación para los efectos de los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento. PI se refiere a la suma de: (bifidobacterias/bacterias totales) + (lactobacilos/bacterias totales) - (Bacteroides/bacterias totales) - (clostridios/bacterias totales), (véase Palframan et al, 2003, Lett Appl Microbiol 37:281-284). En algunas realizaciones, la razón de Eubacterium recta/e/bacterias totales también puede considerarse. Eubacterium rectale produce butirato que es ventajoso para la barrera intestinal en adultos.
Por ejemplo, la estimulación del crecimiento de determinados taxones bacterianos puede reducir el pH del colon, aumentar la producción de ácidos grasos de cadena corta, impedir la proliferación y adhesión de microorganismos patógenos (efecto de barrera), aumentar el metabolismo de compuestos aminados potencialmente carcinogénicos y/o aumentar la producción de vitaminas.
En algunas realizaciones, se proporcionan en el presente documento productos terapéuticos de glicanos que pueden digerirse por la microbiota (por ejemplo mediante fermentación de hidratos de carbono) sin determinados efectos secundarios o con una reducción sustancial de los síntomas de fermentación, tales como aumento de la formación de gas que puede causar flatulencia, molestias y/o meteorismo.
En determinadas realizaciones, la razón de determinados taxones bacterianos o su abundancia relativa puede desplazarse. Tales desplazamientos pueden medirse con respecto a la razón presente en el sujeto antes de la administración de la composición terapéutica de glicanos farmacéutica, o con respecto a un grupo de control que no toma la composición terapéutica de glicanos farmacéutica.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos es un sustrato selectivo para uno o un número limitado de taxones bacterianos potencialmente beneficiosos que residen en el tubo digestivo, estimulando su crecimiento y/o actividad metabólica. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos puede alterar la composición de la microbiota gastrointestinal a una composición superior o inferior en taxones bacterianos específicos. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos estimula selectivamente el crecimiento y/o la actividad selectiva de taxones bacterianos gastrointestinales asociados con la salud y el bienestar.
Se dan a conocer métodos que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita una composición terapéutica de glicanos farmacéutica en una cantidad eficaz para modular la diversidad microbiana. En algunas realizaciones, la administración del producto terapéutico de glicanos modula (por ejemplo aumenta o disminuye) la diversidad microbiana en el tubo digestivo (o específicamente en el intestino grueso o el intestino delgado) de un sujeto humano. La diversidad puede aumentar o disminuir cuando se administra una cantidad eficaz del producto terapéutico de glicanos.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos aumenta la diversidad. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos disminuye la diversidad. Los productos terapéuticos de glicanos a modo de ejemplo que modulan la diversidad microbiana incluyen glu 100, ara100, xy1100, glu50ga150 y glu33gal33fuc33.
En algunas realizaciones, una disbiosis ha desplazado la microbiota y ha aumentado o disminuido la diversidad microbiana de manera que se alcanza un estado alterado. La administración del producto terapéutico de glicanos puede modular la diversidad microbiana, tratando de ese modo la disbiosis. En algunas realizaciones, la diversidad microbiana disminuye y la abundancia de uno o más, dos o más, tres o más, o cuatro o más taxones bacterianos aumenta, incluyendo Akkermansia, Blautia, Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus y Parabacteroides.
La diversidad microbiana puede medirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo análisis de secuencias de ADNr 16S tal como se describe en el presente documento. La diversidad puede expresarse, por ejemplo usando el índice de diversidad de Shannon (entropía de Shannon), el número de OTU observadas, el índice de Chao1, etc. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos modulan (por
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ejemplo aumentan o disminuyen) la diversidad dentro de una comunidad microbiana, por ejemplo la del tubo digestivo, que puede expresarse usando la entropía de Shannon como medida.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos aumentan la diversidad microbiana y la entropía de Shannon asociada en el 0,0001%, el 0,0005%, el 0,001%, el 0,005%, el 0,01%, el 0,05%, el 0,1%, el 0,5%, el 1%, el 5%, el 10%, el 50%, el 100%, el 500%, el 1000%, el 5000% o el 10000%. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos aumentan la diversidad microbiana y la entropía de Shannon asociada en (log) 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o más. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos disminuyen la diversidad microbiana y la entropía de Shannon asociada en el 0,0001%, el 0,0005%, el 0,001%, el 0,005%, el 0,01%, el 0,05%, el 0,1%, el 0,5%, el 1%, el 5%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 99% o más. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos disminuyen la diversidad microbiana y la entropía de Shannon asociada en (log) 1 vez, 2 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, o más.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos aumentan la diversidad microbiana y la entropía de Shannon asociada en al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 10%, el 15% el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45% o en al menos el 50%.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos aumentan la diversidad microbiana y la entropía de Shannon asociada en al menos (log) 0,2 veces, 0,3 veces, 0,4 veces, 0,5 veces, 0,8 veces, 1 vez, 1,2 veces, 1,5 veces, 1,8 veces o al menos 2 veces.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos disminuyen la diversidad microbiana y la entropía de Shannon asociada en al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 10%, el 15% el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70% o en al menos el 75%.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos disminuyen la diversidad microbiana y la entropía de Shannon asociada en al menos (log) 0,2 veces, 0,3 veces, 0,4 veces, 0,5 veces, 0,8 veces, 1 vez, 1,2 veces, 1,5 veces, 1,8 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces o al menos 5 veces.
Algunos métodos descritos en el presente documento incluyen la administración de productos terapéuticos de glicanos para modular las funciones inmunitarias del huésped y las funciones de células epiteliales intestinales. Los productos terapéuticos de glicanos pueden regular por incremento la función inmunitaria, por ejemplo para mejorar la capacidad del huésped para combatir infecciones, al tiempo que la regulación por disminución de la función inmunitaria puede prevenir la aparición de alergia o inflamación intestinal. Bacterias beneficiosas moduladas pueden estimular respuestas de células epiteliales intestinales, incluyendo la restitución de la barrera epitelial dañada, la producción de sustancias antibacterianas y proteínas protectoras de células, y el bloqueo de la apoptosis de células epiteliales intestinales inducida por citocinas.
Las bacterias pueden producir respuestas tanto pro como antiinflamatorias a partir de células del huésped (mamífero), y diferentes especies bacterianas pueden producir diferentes respuestas del huésped. En una realización, se usan productos terapéuticos de glicanos para alterar la población bacteriana para producir una respuesta del huésped deseada. La respuesta del huésped puede modularse por medio de interacciones directas con la población bacteriana o por medio de interacciones indirectas por medio de productos bacterianos secretados o desprendidos (por ejemplo, ácidos grasos de cadena corta). Los productos terapéuticos de glicanos pueden alterar la población bacteriana de manera que la población bacteriana, tras la interacción o bien directa o bien indirecta con células del huésped, estimula la producción de péptidos antimicrobianos (AMP), o modula (es decir, aumenta o disminuye la producción de) citocinas inflamatorias e inmunomoduladoras incluyendo interleucina-1a (IL-1a), IL-1 p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-23, factor de necrosis tumoral (TNF), ligando 5 de quimiocina (motivo C-C) (CCL5, también conocido como RANTES), factor de crecimiento transformante beta (TGF- P), interferón gamma (IFN-y), o modula otras respuestas inmunitarias adaptativas o innatas.
En algunas realizaciones, el estado inflamatorio del tubo digestivo se modula mediante administración oral de un producto terapéutico de glicanos. En algunas realizaciones, la fermentación bacteriana de productos terapéuticos de glicanos en el intestino produce ácidos grasos de cadena corta (SCFA). Los SCFA producidos por la microbiota intestinal sirven como fuentes de energía para células epiteliales colónicas y se cree que contribuyen al mantenimiento de una buena función de barrera intestinal, lo que a su vez limita los niveles de endotoxinas en plasma e impide la inflamación sistémica (Cani et al., Changes in gut microbiota control inglammation in obese mice through a mechanism involving GLP-2-driven improvement of gut permeability, Gut, 2009, 58:1091). Además, los SCFA promueven la generación de células T reguladoras (Treg), y se cree que desempeñan un papel en la limitación de respuestas inflamatorias (Arpaia et al., Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation, Nature, 2013, 504:451). En algunas realizaciones, se administran productos terapéuticos de glicanos para inducir efectos sistémicos, por ejemplo de SCFA y otras moléculas o metabolitos inmunomoduladores producidos por microbios para modular el estado inflamatorio de sitios distales.
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Los productos terapéuticos de glicanos, cuando se administran a un sujeto en una cantidad eficaz, pueden modular la producción de uno o más metabolitos microbianos, tales como los enumerados en la tabla 2. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos, cuando se administran a un sujeto en una cantidad eficaz, pueden modular (por ejemplo aumentar o disminuir) uno o más de los siguientes metabolitos microbianos: ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido valérico, ácido isovalérico, ácido ascórbico, ácido láctico, triptófano, serotonina y/o indol. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos, cuando se administran a un sujeto en una cantidad eficaz, pueden modular (por ejemplo aumentar o disminuir) uno o más de los siguientes metabolitos microbianos: ácido succínico, trimetilamina (TMA), TMAO (N- óxido de trimetilamina), ácido desoxicólico, sulfato de etifenilo, acetilaldehído, peróxido de hidrógeno y/o butanodiona. En algunas realizaciones, puede detectarse un aumento o una disminución sustancial en un metabolito. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos se digiere por la microbiota intestinal (por ejemplo clostridios), dando como resultado, por ejemplo, la liberación de ácidos grasos de cadena corta tales como butirato, acetato y propionato, que pueden actuar de manera inmunomoduladora (por ejemplo antiinflamatoria) y otros metabolitos (por ejemplo ácidos biliares y lactato) que pueden conferir efectos sobre la salud beneficiosos en el huésped.
Los productos terapéuticos de glicanos, cuando se administran a un sujeto en una cantidad eficaz, pueden modular una o más rutas del huésped. Los ácidos grasos de cadena corta (SCFA) son metabolitos bacterianos producidos en el intestino por bacterias comensales incluyendo miembros de las familias Ruminocaccaceae y Lachnospiraceae (Vital M, Howe AC, Tiedje JM. 2014. Revealing the bacterial butyrate synthesis pathways by analyzing (meta)genomic data. mBio 5(2):e00889-14. doi: 10.1128/mBio.00889-14). Los SCFA modulan varios factores inmunológicos humanos; por ejemplo, el tratamiento con propionato, un SCFA, en ratones o in vitro aumentó la expresión de Foxp3, un factor regulador de células T, e IL-10, una citocina antiinflamatoria, en células T reguladoras colónicas. Adicionalmente, se ha mostrado que la exposición a SCFA aumenta la frecuencia y el número de células T reguladoras colónicas (cTreg) y células T CD4+ en ratones libres de gérmenes (Smith PM et al. 2013. The microbial metabolites, short chain fatty acids, regulate colonic Treg cell homeostasis. Science; 341(6145). Los SCFA promueven la función de barrera intestinal afectando a la producción de mucina y el péptido gastrointestinal LL-37, y los SCFA modulan adicionalmente la inflamación suprimiendo NF-kB y la producción de citocinas inflamatorias tales como IL-6 y TNF-a (Kim CH et al. 2014. Gut Microbiota-Derived Short-Chain Fatty Acids, T Cells, and Inflammation. Immune Network 14(6):277-288). En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos, cuando se administran en an cantidad eficaz, modulan especies bacterianas que producen SCFA, tales como, por ejemplo, los de la familia Ruminocacceae y/o la familia Lachnospiraceae. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos modulan la inmunidad e inflamación del huésped. Por ejemplo, en el ensayo in vitro del ejemplo 8, el crecimiento de ROB.74, un miembro de la familia Ruminocacceae, lo soportaban 13 de 15 glicanos, y el crecimiento de CSC.32 y CNE.31, miembros de la familia Lachnospiraceae, lo soportaban 6 y 7 de 15 glicanos, respectivamente.
En algunas realizaciones, se dan a conocer métodos de modulación de una ruta funcional de la microbiota del tubo digestivo. Los métodos incluyen administrar al sujeto humano una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para modular la ruta funcional. En algunas realizaciones, la ruta funcional modula la producción de agente antimicrobiano, un ácido biliar secundario, un ácido graso de cadena corta, un sideróforo o un metabolito enumerado en la tabla 2 por la microbiota. En algunas realizaciones, el ácido graso de cadena corta lo produce uno o más miembros bacterianos de la familia Ruminocaccaceae y/o Lachnospiraceae. En algunas realizaciones, el sujeto es obeso.
En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas comprenden uno o más polifenoles. La preparación terapéutica de glicanos y el uno o más polifenoles en la composición farmacéutica pueden tener efectos aditivos o sinérgicos.
En algunas realizaciones, los polifenoles pueden modular uno o más constituyentes bacterianos en el tubo digestivo (por ejemplo para polifenoles de extracto de arándano rojo: Anhé FF et al. et al. “A polyphenol-rich cranberry extract protects from diet-induced obesity, insulin resistance and intestinal inflammation in association with increased Akkermansia spp. population in the gut microbiota of mice.” Gut. 2014; para extracto de arándano: Guglielmetti S et al. “Differential modulation of human intestinal bifidobacterium populations after consumption of a wild blueberry (Vaccinium angustifolium) drink. J Agric Food Chem. 2013; 61(34):8134-40; Lacombe A et al. “Phytochemicals in lowbush wild blueberry inactivate Escherichia coli O157:H7 by damaging its cell membrane.” Foodborne Pathog Dis. 2013; 10(11): 944-50; para extractos de uva: Choy YY et al. “Phenolic metabolites and substantial microbiome changes in pig feces by ingesting grape seed proanthocyanidins.” Food Funct. 2014; 5(9):2298-308; Roopchand DE et al. “Dietary polyphenols promote growth of the gut bacterium Akkermansia muciniphila and attenuate high fat diet- induced metabolic syndrome.” Diabetes. 2015; para extracto de melocotón y ciruela: Noratto GD et al. “Carbohydrate- free peach (Prunus persica) and plum (Prunus domestica) juice affects fecal microbial ecology in an obese animal model.” PLoS One. 2014; 9(7):e101723; para vino tinto y té negro: Kemperman RA, Gross G, Mondot S, et al. Impact of polyphenols from black tea and red wine/grape juice on a gut model microbiome. Food Res Int. 2013, 53(2):659-69; para soja (legumbre): Rafii F “The role of colonic bacteria in the metabolism of the natural isoflavone daidzin to equol.” Metabolites. Enero de 2015 14:56-73).
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En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende la preparación terapéutica de glicanos y la preparación de polifenoles modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de uno o más taxones bacterianos, tales como bacterias del filo Verrucomicrobia, por ejemplo, las del género Akkermansia. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende la preparación terapéutica de glicanos y la preparación de polifenoles aumenta la abundancia de bacterias del filo Verrucomicrobia, incluyendo el género Akkermansia.
En algunas realizaciones, los polifenoles en las composiciones tienen funciones antioxidantes. En algunas realizaciones, los polifenoles en las composiciones tienen funciones antibacterianas. En algunas realizaciones, la función antioxidante y/o antibacteriana de los polifenoles en la composición modula la abundancia de una o más bacterias que residen en el tubo digestivo.
En algunas realizaciones, la composición terapéutica de glicanos farmacéutica comprende polifenoles que actúan como antimicrobianos, por ejemplo, inhibiendo el crecimiento de subconjuntos de especies, tales como, por ejemplo patógenos o patobiontes. (Puupponen-Pimia R et al. “Antimicrobial properties of fenolic compounds from berries.” 2001. Journal of Applied Microbiology 90: 494-507; Puupponen-Pimia R et al. “Berry fenolics selectively inhibit the growth of intestinal pathogens.” 2005. Journal of Applied Microbiology 98: 991-1000).
En algunas realizaciones, los polifenoles en la composición son un sustrato selectivo para uno o más taxones bacterianos que residen en el tubo digestivo, (por ejemplo, Selma MV et al. “Interaction between Phenolics and Gut Microbiota: Role in Human Health.” 2009. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57: 6485-6501; Déprez S et al. “Polymeric Proanthocyanidins Are Catabolized by Human Colonic Microflora into Low-Molecular-Weight Phenolic Acids.” 2000. The Journal of Nutrition 131: 2733-2738; Tzounis X et al. “Flavanol monomer-induced changes to the human faecal microflora.” 2007. The British Journal of Nutrition 99: 782-792; Kutschera M et al. “Isolation of catechin- converting human intestinal bacteria.” 2011. Journal of Applied Microbiology 111: 165-175; Schneider H et al. “Anaerobic transformation of quercetin-3-glucoside by bacteria from the human intestinal tract.” 1999. Archives of Microbiology 171: 81-91; Hein EM et al. “Deconjugation and Degradation of Flavonol Glycosides by Pig Cecal Microbiota Characterized by Fluorescence in Situ Hybridization (FISH).” 2008. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56: 2281-2290).
Métodos de examen de una pluralidad de preparaciones terapéuticas de glicanos
Con el fin de caracterizar los efectos de los productos terapéuticos de glicanos, se proporciona un sistema de examen basado en microplaca in vitro que demuestra la eficacia de la preparación terapéutica de glicanos, incluyendo la capacidad para inhibir (o antagonizar/suprimir) el crecimiento de determinados constituyentes microbianos y la capacidad para promover (o aumentar) el crecimiento de otros constituyentes microbianos. Estos métodos proporcionan preparaciones terapéuticas de glicanos novedosas que pueden mejorar la salud del microbioma gastrointestinal y/o promover la salud del sujeto. En algunas realizaciones, los métodos de examen incluyen: i) proporcionar una pluralidad de preparaciones de productos terapéuticos de glicanos, ii) someter la preparación a uno o más exámenes, iii) seleccionar una preparación de productos terapéuticos de glicanos basándose en los exámenes, y opcionalmente iv) aislar la preparación de productos terapéuticos de glicanos seleccionada. En los ejemplos se describe un método de examen de una sola cepa adecuado. Un experto habitual en la técnica conoce otros exámenes adecuados y cualquier parámetro experimental necesario puede ajustarse con sólo experimentación de rutina.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos promueven el crecimiento de cepas bacterianas que pueden reducir significativamente la tasa de crecimiento de patógenos y/o pueden restaurar parcial o completamente una comunidad bacteriana que está asociada con un tubo digestivo sano.
En algunas realizaciones, se proporcionan productos terapéuticos de glicanos que promueven el crecimiento de bacterias beneficiosas. En la tabla 8 se enumeran glicanos a modo de ejemplo. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos que promueven el crecimiento comensal incluyen gal100, glu100, xy1100, ara100, ara50gal50, ara50xyl50, gal75xyl25, glu50ga150, man62glu38, glu33gal33fuc33 y man52glu29gal19.
En algunas realizaciones, se proporcionan productos terapéuticos de glicanos que no promueven el crecimiento de bacterias patógenas sino que promueven el crecimiento de bacterias beneficiosas. En la tabla 9 se enumeran glicanos a modo de ejemplo. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos selectivos para comensales (por ejemplo un producto terapéutico de glicanos que promueve preferentemente el crecimiento de bacterias comensales con respecto al crecimiento de bacterias patógenas) incluyen gal100, glu100, xy1100, ara50gal50 y ara50xyl50.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos que incluyen seleccionar un producto terapéutico de glicanos para su procesamiento adicional (por ejemplo formularlo para dar una composición farmacéutica) o pruebas adicionales (por ejemplo analizar características adicionales) usando examen de una sola cepa. Por ejemplo, el producto terapéutico de glicanos puede someterse a prueba para promover el crecimiento en medios complementados con la preparación de cepas comensales seleccionadas del grupo que consiste en Bacteroides caccae ATCC 43185, Prevotella copri DSM 18205, Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741, Bacteroides
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cellulosilyticus DSM 14838, Clostrídium scindens ATCC 35704, Ruminococcus obeum ATCC 29714, Clostrídium nexile ATCC 27757 y Parabacteroides distasonis ATCC 8503. Alternativamente o además, el producto terapéutico de glicanos puede someterse a prueba para promover el crecimiento en medios complementados con la preparación de cepas patógenas seleccionadas del grupo que consiste en Clostrídium difficile ATCC BAA-1382, Clostrídium difficile ATCC 43255, Enterococcus faecium AtCC 700221 y Salmonella enterica ATCC 27869. Puede seleccionarse un producto terapéutico de glicanos para pruebas o procesamiento adicional si se cumplen uno o ambos de los siguientes criterios: i) el producto terapéutico de glicanos promueve el crecimiento de al menos 4, 5 o al menos 6 cepas comensales, y ii) el producto terapéutico de glicanos promueve el crecimiento de no más de 3, 2, 1 o no más 0 cepas patógenas.
El efecto de los productos terapéuticos de glicanos sobre el crecimiento bacteriano también puede someterse a prueba en otros ensayos in vitro y usando modelos de animales de laboratorio. Las bacterias pueden recogerse de muestras tomadas del nicho de interés (por ejemplo una muestra de deposiciones que contiene heces) y propagarse mediante métodos conocidos en la técnica. Entonces pueden realizarse ensayos de crecimiento in vitro competitivos usando condiciones que son adecuadas para el crecimiento de bacterias del nicho de interés, por ejemplo condiciones que pueden imitar el entorno natural del nicho, por ejemplo el tubo digestivo o un subconjunto del mismo, tal como el intestino delgado y grueso. Tales condiciones incluyen, pero no se limitan a aerobias, anaerobias, pH bajo/alto/neutro, temperatura fisiológica (por ejemplo temperatura del cuerpo humano), etc.
En algunas realizaciones, se realizan ensayos in vivo para detectar el efecto del producto terapéutico de glicanos sobre el crecimiento bacteriano en el tubo digestivo. Con el fin de determinar si la preparación terapéutica de glicanos modula las poblaciones microbianas en el tubo digestivo de un sujeto, puede usarse un modelo animal de laboratorio, tal como un modelo de ratón de enfermedad humana. La microbiota de los ratones puede evaluarse y caracterizarse. Pueden lograrse evaluaciones cualitativas usando el perfil de ARNr 16S de la comunidad microbiana en el tubo digestivo de ratones normales. También pueden lograrse mediante secuenciación del genoma completo, secuenciación por shotgun de genoma completo (WGS) o técnicas microbiológicas tradicionales. Pueden realizarse evaluaciones cuantitativas usando PCR cuantitativa (qPCR) o usando técnicas microbiológicas tradicionales y recuento de la formación de colonias. Opcionalmente, los ratones pueden recibir un tratamiento con antibióticos para imitar la condición de una microbiota gastrointestinal alterada en la que la microbiota del tubo digestivo presenta una disbiosis. Se sabe que el tratamiento con antibióticos puede disminuir la riqueza taxonómica, diversidad y uniformidad de las comunidades intestinales, incluyendo una reducción de la abundancia de un número significativo de taxones bacterianos. (Detlefsen et al., The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing, PLoS Biology 6(11):3280 (2008)).
Diversos efectos de productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo evaluar la modulación de taxones bacterianos, modulación de la diversidad microbiana, modulación de síntomas inducidos por fármaco y efectos terapéuticos (por ejemplo evaluando la modulación de fenotipos asociados a enfermedad)), pueden evaluarse en modelos de animales adecuados para una determinada enfermedad, tales como, por ejemplo, un modelo de ratón de colitis por DSS (por ejemplo para evaluar enfermedades, trastornos o estados asociados con una inflamación o daño inducido por fármacos), un modelo de ratón de obesidad inducida por la dieta (por ejemplo para evaluar enfermedades, trastornos o estados metabólicos) y un modelo de ratón de infección por C. difficile (por ejemplo para evaluar enfermedades, trastornos o estados asociados con una infección o daño inducido por fármacos), y modelos de ratón de tipo natural sometidos a, por ejemplo, tratamientos farmacológicos (por ejemplo régimen de antibióticos, régimen de fármacos contra el cáncer, etc.) o cambios en la dieta, tales como, por ejemplo dieta sin fibra, dietas con bajo contenido en fibra, dieta de pienso normal, dieta con alto contenido en grasa, etc. para evaluar diversos estados de la microbiota del tubo digestivo.
En algunas realizaciones, los métodos de examen se llevan a cabo usando un modelo animal de laboratorio adecuado. Por ejemplo, una preparación de productos terapéuticos de glicanos puede administrarse a un animal de laboratorio y tras un periodo de tiempo se toma una muestra del tubo digestivo del animal de laboratorio y se analiza para detectar el crecimiento de taxones bacterianos. El animal de laboratorio, si se desea, puede ponerse en contacto con patógenos u otras bacterias para facilitar la colonización del animal antes de o simultáneamente con la administración del producto terapéutico de glicanos. En algunas realizaciones, se selecciona una preparación de productos terapéuticos de glicanos que puede modular (por ejemplo aumentar o disminuir) el crecimiento de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, o al menos 20 taxones bacterianos en el animal de laboratorio.
En una realización, el modelo animal es un modelo de ratón con C. difficile y el producto terapéutico de glicanos puede modular uno o más de Prevotella, Akkermansia, Bacteroides, Clostrídium (Erysipelotrichaceae), Clostrídium (Clostridiaceae), Bifidobacterium, Aggregatibacter, Clostrídium (Peptostreptococcaveae), Parabacteroides,
Lactobacillus y Enterococcus. En una realización, el modelo animal es un modelo de ratón de tipo natural sin fibras y pienso normal y el producto terapéutico de glicanos puede modular Akkermansia y Blautia. En algunas realizaciones, el glicano terapéutico es xy1100, glu 100, glu33gal33fuc33, glu50ga150 o ara100.
En algunas realizaciones, el examen es un ensayo in vitro en el que se hacen crecer uno o más taxones bacterianos en un medio de crecimiento y el crecimiento se monitoriza en presencia de los productos terapéuticos de glicanos y se compara con el crecimiento en ausencia de los productos terapéuticos de glicanos. Puede hacerse crecer
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cualquier número práctico de taxones bacterianos en el medio, tal como, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 ó 50 taxones. En algunas realizaciones, se selecciona una preparación de productos terapéuticos de glicanos que modula (por ejemplo aumenta o disminuye) el crecimiento de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o al menos 20 taxones bacterianos. En una realización, el examen es un ensayo de una sola cepa y el producto terapéutico de glicanos se selecciona de los enumerados en la tabla 8 que modifican al menos 5, 6, 7 u 8 cepas de la tabla 8.
En algunas realizaciones, el crecimiento de una o más bacterias aumenta en al menos el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 100%, el 110%, el 120%, el 130%, el 140%, el 150%, el 160%, el 170%, el 180%, el 190%, el 200%, el 250%, el 300%, el 350%, el 400%, el 450%, el 500%, el 600%, el 700%, el 800%, el 900% o en al menos el 1000% tras 1 hora, 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 48 horas o 72 horas de contacto.
En otras realizaciones, el crecimiento de una o más bacterias disminuye en al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o en al menos el 99,9% tras 1 hora, 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 48 horas o 72 horas de contacto.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos también modula la concentración de uno o más metabolitos microbianos seleccionados del grupo que consiste en los metabolitos enumerados en la tabla 2. En algunas realizaciones, la concentración de metabolitos aumenta en al menos el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 100%, el 110%, el 120%, el 130%, el 140%, el 150%, el 160%, el 170%, el 180%, el 190%, el 200%, el 250%, el 300%, el 350%, el 400%, el 450%, el 500%, el 600%, el 700%, el 800%, el 900% o en al menos el 1000% tras 1 hora, 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 48 horas o 72 horas de contacto. En otras realizaciones, la concentración de metabolito disminuye en al menos el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o en al menos el 99,9% tras 1 hora, 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 48 horas o 72 horas de contacto.
La digestibilidad es un parámetro que puede determinarse para los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos dados a conocer en el presente documento se examinan para evaluar su digestibilidad. La digestibilidad de los productos terapéuticos de glicanos puede evaluarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, la digestibilidad se evalúa mediante una reacción de digestión in vitro fisiológicamente relevante. Pueden analizarse muestras en diferentes fases de la digestión mediante técnicas de glicanos convencionales conocidas en la técnica y descritas en el presente documento. Monitorizando la cantidad de productos terapéuticos de glicanos intactos observados a lo largo del tiempo, puede calcularse la semivida de digestión. Pueden usarse ensayos adecuados para evaluar la digestibilidad comparativa (por ejemplo, frente a un glicano de referencia) o para evaluar la digestibilidad absoluta.
La digestibilidad de un producto terapéutico de glicanos es una función del número o la representación de enlaces glicosídicos hidrolizables en las especies de glicanos de la preparación. Las enzimas que pueden hidrolizar enlaces glicosídicos habitualmente son específicas para un enlace, estereoquímica y una composición de subunidades particulares. Determinados tipos de enlaces hidrolizables, por ejemplo, uniones glicosídicas alfa 1,4; alfa 1,6, alfa 1,2; y alfa 1,6 se reconocen por enzimas microbianas específicas (por ejemplo alfa-glucosidasa, ciclomaltodextrinasa, neopulunanasa, glucanotransferasa, trehalohidrolasa, y similares) y no son sustratos para enzimas de mamífero. La digestibilidad de los glicanos depende de muchos factores, incluyendo, por ejemplo, el grado de polimerización, el grado de ramificación, el tipo de uniones glicosídicas, la posición de las uniones, la configuración anomérica (por ejemplo configuración L o D, configuración alfa/beta) de la(s) unidad(es) de glicano (por ejemplo monosacárido), y la composición de unidades de glicano. Por ejemplo, los furanósidos son generalmente más susceptibles a la hidrólisis que los piranósidos. Los desoxiazúcares son generalmente más lábiles a ácidos que los que no son desoxiazúcares. Los ácidos urónicos son generalmente menos susceptibles a la hidrólisis que los monosacáridos no urónicos. La ramificación protege frente a la digestión por enzimas humanas, y se observa generalmente que cuanto mayor es la molécula, menor es la velocidad de fermentación (digestibilidad) en el colon. Estas características promueven generalmente la indigestibilidad por glicosidadas humanas y pueden promover una fermentación o digestión selectivas por la microbiota.
En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas que se administran por vía oral y que alcanzan el intestino comprenden una mezcla de una pluralidad de especies de glicanos con un grado de digestibilidad deseado en el intestino (o regiones específicas del intestino) del huésped. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos no es digerible para enzimas de mamifero y sólo puede hidrolizarse por enzimas microbianas. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos no puede metabolizarse por un ser humano y sólo puede metabolizarse (o fermentarse) por la microbiota del ser humano.
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Diferentes taxones microbianos tienen diferente enzimas de hidrolización. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos puede fermentarse en un ensayo de digestibilidad de una sola cepa in vitro por una, dos, tres, cuatro, cinco o más especies bacterianas comensales, por ejemplo Bacteroides caccae ATCC 43185, Prevotella copri DSM 18205, Bacteroides thetaiotaomicron AtCc 29741, Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838, Clostridium scindens ATCC 35704, Ruminococcus obeum ATCC 29714, Clostridium nexile ATCC 27757 y Parabacteroides distasonis ATCC 8503. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos no puede fermentarse en un ensayo de digestibilidad de una sola cepa in vitro por una, dos, tres, cuatro, cinco o más especies patógenas, por ejemplo, de Clostridium difficile ATCC bAA-1382, Clostridium difficile ATCC 43255, Enterococcus faecium ATCC 700221 y Salmonella enterica ATCC 27869. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos no puede fermentarse por taxones bacterianos específicos en un ensayo de digestibilidad in vitro de una sola cepa (por ejemplo al menos el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o el 98% de la preparación de glicanos no puede fermentarse) pero puede fermentarse por los taxones in vivo en un nicho bacteriano adecuado del huésped (por ejemplo el tubo digestivo o una región específica del mismo, tal como el colon o intestino). En algunas realizaciones, los taxones bacterianos incluyen Akkermansia, Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus y Parabacteroides. La fermentabilidad puede medirse, por ejemplo, monitorizando el crecimiento de los taxones bacterianos in vitro o in vivo.
En algunas realizaciones, la hidrólisis de enlaces glicosídicos se cataliza por una enzima y la tasa de catálisis puede medirse mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica y la tasa puede compararse con la de otra enzima. Una alta tasa de hidrólisis, transferencia de unidades de glicano y/o modificación de unidades de glicano puede sugerir que el enlace es un sustrato adecuado de la enzima. La facilidad de hidrólisis puede expresarse mediante una alta tasa de reacción catalítica. Otros enlaces son incompatibles con una enzima o un conjunto de enzimas y son difíciles de hidrolizar. En algunas realizaciones, la digestibilidad (expresada como semivida) es de 30 minutos o menos, 20 minutos o menos, 15 minutos o menos, 10 minutos o menos, 5 minutos o menos, 4 minutos o menos, 3 minutos o menos, 2 minutos o menos o 1 minuto o menos. En algunas realizaciones, la digestibilidad (expresada como semivida) es de 30 minutos o más, 45 minutos o más, 1 hora o más, 2 horas o más, 3 horas o más, 4 horas o más, 5 horas o más, o 10 horas o más. En algunas realizaciones, la preparación de productos terapéuticos de glicanos comprende menos del 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 12%, el 14%, el 16%, el 18%, el 20%, el 30%, el 40% o menos del 50% de enlaces que pueden hidrolizarse por una enzima amilasa de mamífero. La digestibilidad también puede evaluarse mediante la semivida de digestión gástrica.
Identificación de constituyentes bacterianos
En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas tal como se describen en el presente documento se administran a un sujeto para aumentar el crecimiento de bacterias beneficiosas y/o para disminuir el crecimiento de patógenos en el tubo digestivo. En algunas realizaciones, la comunidad microbiana se desplaza por el producto terapéutico de glicanos hacia la de un estado sano. Los cambios microbianos que se producen en el tubo digestivo pueden analizarse usando cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.
Como método cuantitativo para determinar si una preparación terapéutica de glicanos da como resultado un desplazamiento de la población de bacterias en el tubo digestivo, puede realizase PCR cuantitativa (qPCR). Puede extraerse ADN genómico de las muestras usando kits disponibles comercialmente, tales como el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil®-htp 96 Well Soil (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil® (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), o el minikit de ADN en deposiciones QIAamp (QIAGEN, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante, o mediante otros métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, puede realizarse la qPCR usando HotMasterMix (5PRIME, Gaithersburg, MD) y cebadores específicos para determinadas bacterias (por ejemplo beneficiosas o deseadas) y puede realizarse sobre una placa de 96 pocillos MicroAmp® Fast Optical con código de barras (0,1 ml) (Life Technologies, Grand Island, NY) y realizarse en un termociclador BioRad C1000™ equipado con un sistema en tiempo real CFX96™ (BioRad, Hercules, CA), con lecturas fluorescentes de los canales FAM y ROX. El valor de Cq para cada pocillo en el canal de FAM se determina mediante el software CFX Manager™ versión 2.1. El log10 (ufc/ml) de cada muestra experimental se calcula introducidndo el valor de Cq de una muestra dada en el modelo de regresión lineal generado a partir de la curva patrón comparando los valores de Cq de los pocillos de la curva patrón con la log10 (ufc/ml) conocida de esas muestras. El experto en la técnica puede emplear modos de qPCR alternativos.
En algunas realizaciones, los constituyentes microbianos se identifican caracterizando la secuencia de ADN secuencia del gen de ARN ribosómico de subunidad pequeña 16S microbiana (gen de ARNr 16S). El gen de ARNr 16s tiene aproximadamente 1.500 nucleótidos de longitud, y en general está altamente conservado a través de los organismos, pero contiene regiones variables e hipervariables específicas (V1-V9) que albergan una diversidad de nucleótidos suficiente para diferenciar taxones al nivel de especie y cepa de la mayoría de los organismos. Estas regiones en bacterias se definen mediante los nucleótidos 69-99, 137-242, 433-497, 576-682, 822-879, 986-1043, 1117-1173, 1243-1294 y 1435-1465 respectivamente usando la numeración basada en el sistema de nomenclatura
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de E. coli. (Véase, por ejemplo, Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978)).
La composición de una comunidad microbiana puede deducirse secuenciando el gen ARNr 16S completo, o al menos una de las regiones V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 y V9 de este gen o secuenciando cualuquier combinación de regiones variables de este gen (por ejemplo V1-3 o V3-5). En una realización, las regiones V1, V2 y V3 se usan para caracterizar una microbiota. En otra realización, las regiones V3, V4 y V5 se usan para caracterizar una microbiota. En otra realización, la región V4 se usa para caracterizar una microbiota.
Las secuencias que son al menos el 97% idénticas entre sí se agrupan en unidades taxonómicas operacionales (OTU). Las OTU que contienen secuencias con una similitud del 97% corresponden a tazones a nivel de especie aproximadamente. Se elige al menos una secuencia representativa de cada OTU, y se usa para obtener una asignación taxonómica para un OTU mediante comparación con una base de datos de referencia de secuencias de gen de ARNr 16S altamente curadas (tales como las bases de datos Greengenes o SILVA). La relación entre las OTU en una comunidad microbiana podría deducirse construyendo un árbol filogenético de secuencias representativas de cada OTU.
Usando técnicas conocidas, con el fin de determinar la secuencia de 16S completa o la secuencia de cualquier región variable de la secuencia de 16S, se extrae ADN genómico de una muestra bacteriana, se amplifica el ARNr 16S (región completa o regiones variables específicas) usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se limpian los productos de PCR y se delinean las secuencias de nucleótidos para determinar la composición genética del gen de ARNr 16S o una región variable del gen. Si se realiza secuenciación de 16S completa, el método de secuenciación usado puede ser, pero sin limitarse a, secuenciación de Sanger. Si se usan una o más regiones variables, tal como la región V4, la secuenciación puede realizarse, pero sin limitarse a, usando el método de Sanger o usando un método de secuenciación de la próxima generación, tal como un método de Illumina. Los cebadores diseñados para aparearse con las regiones conservadas de los genes de ARNr 16S (por ejemplo, los cebadores 515F y 805R para la amplificación de la región V4) podrían contener secuencias de código de barras únicas para permitir la caracterización de múltiples comunidades microbianas simultáneamente.
Como otro método para identificar la composición microbiana está la caracterización de genes o marcadores de nucleótidos, en particular genes altamente conservados (por ejemplo, genes de “mantenimiento”), o una combinación de los mismos, o secuencia de shotgun de genoma completo (WGS). Usando métodos definidos, el ADN extraído de una muestra bacteriana tendrá regiones genómicas específicas amplificadas usando PCR y secuenciadas para determinar la secuencia de nucleótidos de los productos amplificados. En el método de WGS, el ADN extraído se fragmentará en trozos de diversas longitudes (desde 300 hasta aproximadamente 40.000 nucleótidos) y se secuenciará directamente sin amplificación. Pueden generarse datos de secuencia usando cualquier tecnología de secuenciación incluyendo, pero sin limitarse a Sanger, Illumina, 454 Life Sciences, Ion Torrent, ABI, Pacific Biosciences y/o Oxford Nanopore.
Además del gen de ARNr 16S, se analiza un conjunto de genes seleccionados que se sabe que son genes marcadores para una especie o grupo taxonómico dado para evaluar la composición de una comunidad microbiana. Estos genes se someten a ensayo alternativamente usando una estrategia de ensayo basada en PCR. Por ejemplo, diversa cepas de Escherichia coli patógena se distinguen usando genes que codifican para toxinas termolábiles (LTI, LTIIa y lTiIb) y termoestables (STI y STII), tipos de verotoxina 1,2 y 2e (VT1, vT2 y VT2e, respectivamente), factores necrotizantes citotóxicos (CNF1 y CNF2), mecanismos de unión y borrado (eaeA), mecanismos enteroagregativos (Eagg) y mecanismos enteroinvasivos (Einv). Los genes óptimos a utilizar para determinar la composición taxonómica de una comunidad microbiana mediante el uso de genes marcadores son familiares para un experto habitual en la técnica de identificación taxonómica basada en secuencia.
Pueden prepararse bibliotecas de secuenciación para secuenciación de genoma completo microbiano (WGS) a partir de ADN genómico bacteriano. Para ADN genómico que se ha aislado de una muestra de animal de laboratorio o ser humano, el ADN puede enriquecerse opcionalmente en ADN bacteriano usando kits disponibles comercialmente, por ejemplo, el kit de enriquecimiento de ADN de microbioma NEBNext (New England Biolabs, Ipswich, MA) u otro kit de enriquecimiento. Pueden prepararse bibliotecas de secuenciación a partir del ADN genómico usando kits disponibles comercialmente también, tales como el kit de preparación de muestras Nextera Mate-Pair, TruSeq DNA PCR-Free o TruSeq Nano DNA, o el kit de preparación de muestras Nextera XT (Illumina, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante.
Alternativamente, pueden prepararse bibliotecas usando otros kits compatibles con la plataforma de secuenciación Illumina, tales como el kit de construcción de bibliotecas de ADN NEBNext (New England Biolabs, Ipswich, MA). Entonces pueden secuenciarse las bibliotecas usando tecnología de secuenciación convencional incluyendo, pero sin limitarse a, un secuenciador MiSeq, HiSeq o NextSeq (Illumina, San Diego, CA). Alternativamente, puede prepararse una biblioteca de fragmentos shotgun de genoma completo usando métodos convencionales en la técnica. Por ejemplo, la biblioteca de fragmentos shotgun podría construirse usando el kit de preparación de bibliotecas rápido GS FLX Titanium (454 Life Sciences, Branford, CT), amplificarse usando un kit GS FLX Titanium emPCR (454 Life Sciences, Branford, CT) y secuenciarse siguiendo protocolos de pirosecuenciación 454
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convencionales en un secuenciador 454 (454 Life Sciences, Branford, CT). El ARN bacteriano puede aislarse de cultivos microbianos o muestras que contienen bacterias mediante kits disponibles comercialmente, tales como el kit de purificación de ARN bacteriano RiboPure (Life Technologies, Carlsbad, CA). Otro método para el aislamiento de ARN bacteriano puede implicar el enriquecimiento de ARNm en muestras purificadas de ARN bacteriano a través de la eliminación de ARNt. Alternativamente, el ARN puede convertirse en ADNc, que se usa para generar bibliotecas de secuenciación usando métodos convencionales tales como el kit de preparación de muestras Nextera XT (Illumina, San Diego, CA).
Se analizan las secuencias de ácido nucleico para definir asignaciones taxonómicas usando métodos de colocación filogenética y de similitud de secuencia o una combinación de las dos estrategias. Se usa un enfoque similar para anotar los nombres de proteínas, la función de proteínas, los nombres de factores de transcripción, y cualquier otro esquema de clasificación para secuencias de ácido nucleico. Los métodos basados en similitud de secuencia incluyen BLAST, BLASTx, tBLASTn, tBLASTx, RDP-classifier, DNAclust, RapSearch2, DIAMOND, USEARCH, y diversas implementaciones de estos algoritmos tales como QIIME o Mothur. Estos métodos mapean una lectura de secuencia en una base de datos de referencia y seleccionan la mejor coincidencia. Las bases de datos comunes incluyen KEGG, MetaCyc, bases de datos no redundantes del NCBI, Greengenes, RDP y Silva para asignaciones taxonómicas. Para asignaciones funcionales, las lecturas se mapean en diversas bases de datos funcionales tales como COG, KEGG, BioCyc, MetaCyc y la base de datos enzimas activas en hidratos de carbono (CAZy). Se asignan clados microbianos usando software incluyendo MetaPhlAn.
Análisis proteómico de poblaciones microbianas
Pueden seleccionarse preparaciones de productos terapéuticos de glicanos basándose en su capacidad para aumentar la expresión de proteínas microbianas asociadas con estados sanos o para disminuir la expresión de proteínas microbianas asociadas con estados patológicos. El análisis proteómico de poblaciones microbianas puede realizarse siguiendo protocolos conocidos por un experto en la técnica (por ejemplo, Cordwell, Exploring and exploiting bacterial proteomes, Methods in Molecular Biology, 2004, 266:115). Para identificar proteínas expresadas de manera diferencial (por ejemplo, para identificar cambios en la expresión de proteínas tras el tratamiento de poblaciones microbianas con productos terapéuticos de glicanos), puede realizarse el análisis proteómico tal como se describe, por ejemplo, en Juste et al. (Bacterial protein signals are associated with Crohn’s disease, Gut, 2014, 63:1566). Por ejemplo, la proteína se aísla de lisados microbianos de dos muestras (por ejemplo, una población microbiana sin tratar y una población que se ha tratado con productos terapéuticos de glicanos). Cada muestra de proteína se marca (por ejemplo, con un colorante fluorescente, por ejemplo, colorante mínimo de flúor CyDye DIGE Cy3 o Cy5, GE Healthcare) y se analiza mediante electroforesis en gel diferencial bidimensional (2D-DIGE). Se tiñen los geles y los puntos de proteínas identificados como que son significativamente diferentes entre las dos muestras se cortan, se digieren y se analizan mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem (CL- EM/EM). Puede usarse X!TandemPipeline (
http://pappso.inra.fr/bioinfo/xtandempipeline/) para identificar proteínas expresadas de manera diferencial.
También pueden seleccionarse preparaciones de productos terapéuticos de glicanos para su administración a un sujeto humano basándose en su efecto sobre la presencia de productos de fermentación microbiana. Por ejemplo, pueden seleccionarse preparaciones de productos terapéuticos de glicanos por su capacidad para inducir o promover el crecimiento de bacterias que producen ácidos grasos de cadena corta tales como propionato (ácido propiónico), acetato y/o butirato (ácido butírico). De manera similar, pueden seleccionarse preparaciones de productos terapéuticos de glicanos por su capacidad para inducir o promover el crecimiento de bacterias que producen ácido láctico, que puede modular el crecimiento de otras bacterias al producir un entorno ácido. Tal análisis puede usarse también para aparear bacterias probióticas con productos terapéuticos de glicanos de manera que el producto terapéutico de glicanos sea un sustrato para la producción de los productos de fermentación deseados.
Los metabolitos que están presentes en medios de cultivo nuevos o gastados o en muestras biológicas recogidas de seres humanos pueden determinarse usando métodos descritos en el presente documento. Pueden usarse métodos no sesgados para determinar la concentración relativa de metabolitos en una muestra y los conoce un experto en la técnica, tales como cromatografía de gases o líquidos combinada con espectrometría de masas o 1H-RMN. Estas mediciones pueden validarse ejecutando patrones de metabolitos a través de los mismos sistemas analítcos.
En el caso de análisis por cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) o cromatografía de líquidos- espectrometría de masas (CL-EM), podrían extraerse metabolitos polares y ácidos grasos usando sistemas monofásicos o bifásicos de disolventes orgánicos y una muestra acuosa y derivatizarse (Fendt et al., Reductive glutamine metabolism is a function of the a-ketoglutarate to citrate ratio in cells, Nat Commun, 2013, 4:2236; Fendt et al., Metformin decreases glucose oxidation and increases the dependency of prostate cancer cells on reductive glutamine metabolism, Cancer Res, 2013, 73:4429; Metallo et al., Reductive glutamine metabolism by IDH1 mediates lipogenesis under hypoxia, Nature, 2011,481:380). Un protocolo a modo de ejemplo para la derivatización de metabolitos polares implica la formación de derivados de metoxima-tBDMS a través de la incubación de los metabolitos con clorhidrato de metoxilamina al 2% en piridina seguido por la adición de N-terc-butildimetilsilil-N- metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA) con terc-butildimetilclorosilano (t-BDMCS) al 1%. Las fracciones no polares,
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incluyendo triacilglicéridos y fosfolípidos, pueden saponificarse a ácidos grasos libres y esterificarse para formar ásteres metílicos de ácidos grasos, por ejemplo, o bien mediante incubación con H2SO4 al 2% en metanol o bien usando reactivo Methyl-8 (Thermo Scientific). Entonces pueden analizarse las muestras derivatizadas mediante CG- EM usando métodos de CL-EM convencionales, por ejemplo, una columna DB-35MS (30 m x 0,25 mm de d.i. x 0,25 pm, Agilent J&W Scientific) instalada en un cromatógrafo de gases (CG) interconectado con un espectrómetro de masas (EM). Las distribuciones de isotopómeros de masa pueden determinarse integrando fragmentos iónicos de metabolitos y corregirse para la abundancia natural usando algoritmos convencionales, tales como los adaptados de Fernandez et al. (Fernandez et al., Correction of 13C mass isotopomer distributions for natural stable isotope abundance, J Mass Spectrom, 1996, 31:255). En el caso de cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM), los metabolitos polares pueden analizarse usando una CL-EM/EM de sobremesa convencional equipada con una columna, tal como una columna polimérica SeQuant ZIC-pHILIC (2,1 x 150 mm; EMD Millipore). Las fases móviles a modo de ejemplo usadas para la separación podrían incluir tampones y disolventes orgánicos ajustados a un valor de pH específico.
En combinación o como alternativa, las muestras extraídas pueden analizarse mediante resonancia magnética nuclear de 1H (1H-RMN). Las muestras pueden combinarse con disolventes enriquecidos isotópicamente tales como D2O, opcionalmente en presencia de una disolución tamponada (por ejemplo, Na2HPO4, NaH2PO4 en D2O, pH 7,4). Las muestras también pueden complementarse con un patrón de referencia para la calibración y determinación del desplazamiento químico (por ejemplo, sal de sodio de 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato 5 mM (DSS-d6, Isotec, EE.UU.)). Antes del análisis, la disolución puede filtrarse o centrifugarse para eliminar cualquier sedimento o precipitado, y luego transferirse a un recipiente o tubo de RMN adecuado para su análisis (por ejemplo, un tubo de RMN de 5 mm). Los espectros de 1H-RMN pueden adquirirse en un espectrómetro de RMN convencional, tal como un espectrómetro Avance II + 500 Bruker (500 MHz) (Bruker, DE), equipado con un cabezal de sonda QXI-Z C/N/P de 5 mm) y analizarse con software de integración de espectros (tal como Chenomx RMN Suite 7.1; Chenomx Inc., Edmonton, AB). (Duarte et al., 1H-NMR protocol for exometabolome analysis of cultured mammalian cells, Methods Mol Biol, 2014:237-47).
Alternativamente, puede realizarse 1H-RMN siguiendo otros protocolos publicados conocidos en la técnica (Chassaing et al., Lack of soluble fiber drives diet-induced adiposity in mice, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2015; Bai et al., Comparison of Storage Conditions for Human Vaginal Microbiome Studies, PLoS ONE, 2012:e36934).
Métodos de tratamiento
Se dan a conocer en el presente documento métodos para tratar un sujeto humano. Estos métodos, en algunas realizaciones de la presente divulgación, incluyen uno o ambos de i) identificar un sujeto humano que tiene o se sospecha que tiene una disbiosis de la microbiota gastrointestinal, y ii) administrar al sujeto humano una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para tratar la disbiosis. Las composiciones terapéuticas de glicanos descritas en el presente documento son adecuadas para su administración a seres humanos que lo necesitan. En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano que tiene uno o más síntomas de una disbiosis de la microbiota gastrointestinal, incluyendo pero sin limitarse a sobrecrecimiento de un patógeno no deseado o uno o más taxones bacterianos no deseados, representación reducida de taxones bacterianos clave asociados con salud, diversidad reducida o aumentada de especies microbianas en comparación con un individuo sano, o abundancia globalmente reducida de bacterias beneficiosas.
En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos son beneficiosos en el tratamiento de diversas enfermedades, trastornos o estados. Tales enfermedades, trastornos o estados pueden estar asociados con una disbiosis de la microbiota. Pueden producirse alteraciones en la microbiota beneficiosa debido a una variedad de factores (por ejemplo genéticos o ambientales) incluyendo, pero sin limitarse a, uso de antibióticos, productos quimioterápicos y otros fármacos o tratamientos inductores de disbiosis (por ejemplo tratamiento con radiación), infección por patógenos, actividad de patobiontes, ingesta calórica mal calibrada (por ejemplo alta cantidad de grasa, alta cantidad de azúcar), ingesta de fibra mal calibrada (no digerible) (por ejemplo poca o nada de fibra), factores del huésped (por ejemplo alteraciones genéticas del huésped), y similares.
En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o estado está asociado con una disbiosis de la microbiota gastrointestinal. En algunas realizaciones, al tratar la disbiosis se trata la enfermedad, trastorno o estado.
Los síntomas que pueden estar asociados con una disbiosis de la microbiota gastrointestinal y/o con una enfermedad, trastorno o estado gastrointestinal incluyen, pero no se limitan a gas, pirosis, molestias estomacales, meteorismo, flatulencia, diarrea, dolor abdominal, calambres, náuseas y vómitos. Los problemas digestivos menores relacionados con el tubo digestivo también incluyen meteorismo ocasional, diarrea, estreñimiento, gas o molestias estomacales.
Enfermedades infecciosas
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En algunas realizaciones, la administración del producto terapéutico de glicanos reduce la infección. En algunas realizaciones, se identifica que un sujeto es adecuado para el tratamiento si el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o estado que incluye: enfermedades infecciosas gastrointestinales incluyendo infección por Clostridium difficile (CDI); infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE), colitis infecciosa y colitis por C. difficile; micosis, tales como, por ejemplo, infección por Candida albicans, infección por Campylobacter jejuni, infección por Helicobacter pylori; diarrea, tal como, por ejemplo, diarrea asociada a Clostridium difficile (CDAD), diarrea asociada a antibióticos (AAD), diarrea inducida por antibióticos, diarrea del viajero (TD), diarrea pediátrica, diarrea infecciosa (aguda), cánceres de colon e hígado, ameboma; enterocolitis necrotizante (NEC) y sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado (SIBO); indigestión o dispepsia no ulcerosa; fisuras anales, absceso perianal y fístula anal; diverticulosis o diverticulitis; úlceras pépticas; y gastroenteritis.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene una infección por Clostridium difficile (CDI); una infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE), colitis infecciosa o colitis por C. difficile.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene micosis, tal como, por ejemplo, infección por Candida albicans, infección por Campylobacter jejuni o infección por Helicobacter pylori.
En algunas realizaciones, la infección del tubo digestivo es una infección bacteriana o viral, tal como una infección con, por ejemplo, VRE, C. difficile, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Campylobacter, Vibrio cholera, Clostridium perfringes, Bacillus cereus, Vibrio parahemolyticus, Yersinia enterocolitica, Helicobacter pylori, rotavirus o norovirus.
En algunas realizaciones, la infección del tubo digestivo es una infección fúngica, tal como una infección con, por ejemplo, Candida, Aspergillus, Mucor, Cryptococcus, Histoplasma o Coccidioides.
En algunas realizaciones, la infección del tubo digestivo es una infección protozoaria, tal como una infección con, por ejemplo, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene diarrea, tal como, por ejemplo, diarrea asociada a Clostridium difficile (CDAD), diarrea asociada a antibióticos (AAD), diarrea inducida por antibióticos, diarrea del viajero (TD), diarrea pediátrica o diarrea infecciosa (aguda).
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene enterocolitis necrotizante (NEC); gastroenteritis; sobrecrecimiento bacteriano en el intestino delgado (SIBO) o una enfermedad, trastorno o estado similar asociado con una infección del tubo digestivo.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene cáncer de colon, cáncer de hígado, ameboma; indigestión o dispepsia no ulcerosa; fisuras anales, absceso perianal y fístula anal; diverticulosis o diverticulitis; úlcera péptica o una enfermedad, trastorno o estado similar asociado con alteraciones estructurales del tubo digestivo.
En algunas realizaciones, pueden tratarse sujetos con colitis inducida por infección por Clostridium difficile (CDI) según los métodos dados a conocer en el presente documento. Los sujetos con colitis inducida por CDI pueden presentar diarrea acuosa, calambres, dolor abdominal, anorexia, malestar, fiebre, deshidratación, dolor a la palpación abdominal inferior y/o dolor de descompresión. La presencia de C. difficile en las deposiciones de pacientes puede someterse a prueba mediante cultivo de deposiciones, inmunoensayo enzimático con glutamato deshidrogenasa, ensayo de PCR para detectar genes para toxinas de C. difficile, ensayo de citotoxinas en deposiciones o inmunoensayo enzimático para detectar toxinas A y B de C. difficile. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con CDI primaria, sujetos con CDI recurrente, sujetos con diferentes gravedades de diarrea asociada a CDI (leve, moderada, grave) y sujetos en riesgo de CDI debido a la presencia de factores de riesgo tales como tratamiento con antibióticos, tratamiento con antibióticos de amplio espectro, residencia en un hospital o instalación de cuidado a largo plazo, cirugía del tubo digestivo, enfermedades del colon, un sistema inmunitario debilitado, quimioterapia, edad avanzada, enfermedad renal o uso de inhibidores de la bomba de protones. Los tratamientos convencionales para CDI incluyen antibióticos tales como metronidazol, fidaxomicina o vancomicina. Los tratamientos también pueden incluir probióticos, trasplante fecal y fluidos para prevenir la deshidratación. La resolución de la enfermedad se mide mediante la remisión de la diarrea (por ejemplo, la ausencia de un periodo de 24 horas con más de tres deposiciones no formadas) y la resolución de otros síntomas descritos anteriormente. El aclaramiento de la infección puede verificarse por la ausencia de una prueba de deposiciones positiva para C. difficile.
En una realización, se dan a conocer métodos para prevenir, tratar, mejorar síntomas de, y/o prevenir la colonización inicial o la recaída de la colonización por patógenos. En algunas realizaciones, la recaída se produce durante o después de un régimen de tratamiento de primera línea o de referencia. En algunos casos, una carga de patógenos
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puede aligerarse inicialmente tras el tratamiento de referencia pero luego la carga comienza a aumentar de nuevo, desencadenando posiblemente una recaída de la enfermedad. En algunas realizaciones, pueden administrarse productos terapéuticos de glicanos (por ejemplo al comienzo, durante o después del régimen de tratamiento inicial) para prevenir la recaída o tratar uno o más síntomas de recaída. En algunas realizaciones, las bacterias, patobiontes o patógenos asociados con enfermedad se seleccionan del grupo que consiste en las especies Bilophila wadsworthia, Campylobacter jejuni, Citrobacter farmer, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Collinsella aerofaciens, Enterobacter hormaechei, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Fusobacterium varium, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumonia, Peptostreptococcus stomatis, Porphyromonas asaccharolytica, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella enteric, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Streptococcus infantarius, Vibrio cholera y Yersinia enterocolitica.
En algunas realizaciones, las bacterias, patobiontes o patógenos asociados con enfermedad incluyen los géneros Bilophila, Campylobacter, Candidatus, Citrobacter, Clostridium, Collinsella, Desulfovibrio, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Fusobacterium, Haemophilus, Klebsiella, Lachnospiraceae, Peptostreptococcus, Porphyromonas, Portiera, Providencia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio y Yersinia.
En una realización, se da a conocer en el presente documento un método de prevención de la recaída de los síntomas de C. difficile en un sujeto que se ha tratado con un fármaco de primera línea (por ejemplo vancomicina, metronidazol, fidaxomicina). El método incluye las etapas de identificar un sujeto infectado con C. difficile y al que se le ha administrado un antibiótico y administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un producto terapéutico de glicanos en una cantidad eficaz para prevenir la reaparición de uno o más síntomas asociados con infección por C. difficile. En algunas realizaciones, el patógeno C. difficile viable se retiene en el tubo digestivo del sujeto (por ejemplo pueden detectarse recuentos de UFC en una muestra tomada del sujeto, por ejemplo una muestra fecal) incluso tras el tratamiento con el antibiótico pero los síntomas asociados con C. difficile se reducen significativamente.
En algunas realizaciones, los sujetos que presentan colonización e infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE) pueden tratarse según los métodos dados a conocer en el presente documento. Las bacterias del género Enterococcus son miembros comunes de la microbiota intestinal. Los miembros resistentes a vancomicina de este género, comúnmente E. faecalis y E. faecium, pueden provocar colonización e infección por enterococos resistentes a vancomicina (VRE). Los sujetos colonizados con VRE pueden presentar una muestra de deposiciones, hisopo rectal, hisopo perirrectal o muestra de otro sitio corporal positiva para VRE. La resistencia a la vancomicina puede evaluarse mediante cultivo bacteriano o mediante ensayos basados en PCR que detectan operones génicos de resistencia a vancomicina (Van). Aunque los sujetos colonizados pueden ser asintomáticos, esta población tiene un riesgo aumentado de infección con VRE. Sujetos con infección con VRE pueden presentar diarrea, fiebre, escalofríos, infección de las vías urinarias (UTI), bacteremia, endocarditis, infección intraabdominal y pélvica, infección respiratoria o infección en otro sitio corporal. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos que están colonizados con VRE, sujetos que padecen una infección con VRE y sujetos que están en riesgo de colonización o infección con VRE debido a la presencia de factores de riesgo tales como hospitalización, residencia en una instalación de cuidado a largo plazo, uso de antibióticos a largo plazo, inmunosupresión, cirugía, heridas abiertas, dispositivos permanentes (por ejemplo, líneas intravenosas o catéteres urinarios), o empleo como trabajador sanitario. Las medidas de prevención convencionales para la colonización o infección por VRE incluyen adherencia estricta a buenas prácticas de higiene (por ejemplo, lavarse las manos) y evitar factores de riesgo cuando sea posible (por ejemplo, eliminación de dispositivos permanentes). Los sujetos colonizados con VRE pero que no padecen una infección con VRE normalmente no se tratan. Las opciones de tratamiento de referencia para infecciones con VRE son limitadas debido a la resistencia a antibióticos convencionales, pero pueden incluir combinaciones de antibióticos y/o antibióticos tales como quinupristina-dalfopristina, linezolida, daptomicina y tigeciclina que se ha demostrado que conservan actividad contra muchas cepas de VRE. Los tratamientos también pueden incluir probióticos o cuidado de apoyo. La resolución de la enfermedad se mide por el aclaramiento de la infección y resolución de otros síntomas descritos anteriormente. El aclaramiento de la infección o colonización puede verificarse por la ausencia de una prueba positiva para VRE en una muestra biológica relevante. La prevención de la infección o colonización puede cuantificarse de una manera similar.
Enfermedades inflamatorias
En algunas realizaciones, la administración del producto terapéutico de glicanos reduce la inflamación. En algunas realizaciones, se identifica que un sujeto es adecuado para el tratamiento si el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o estado que incluye: enfermedades inflamatorias gastrointestinales incluyendo enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), inflamación idiopática del intestino delgado, colitis indeterminada, reservoritis; síndrome del intestino irritable (IBS), cánceres de colon e hígado, enterocolitis necrotizante (NEC), inflamación intestinal, estreñimiento, colitis microscópica, diarrea; enfermedad de injerto contra huésped (GVHD); alergias (alimentarias); colitis pseudomembranosa; indigestión o dispepsia no ulcerosa; diverticulosis o diverticulitis, colitis isquémica; colitis por radiación o enteritis; colitis colagenosa; gastroenteritis; y pólipos.
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En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), colitis ulcerosa (UC), enfermedad de Crohn (CD), inflamación intestinal, colitis microscópica o una enfermedad, trastorno o condición similar que está asociado con inflamación del intestino.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene inflamación idiopática del intestino delgado, colitis indetermianda, reservoritis, colitis pseudomembranosa, colitis isquémica, colitis por radiación (enteritis), colitis colagenosa o una enfermedad, trastorno o estado similar que está asociado con inflamación del intestino.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene gastroenteritis; enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) o una alergia (alimentaria).
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene síndrome del intestino irritable (IBS), estreñimiento, diarrea, indigestión, dispepsia no ulcerosa o una enfermedad, trastorno o estado similar que está asociado con un tránsito intestinal alterado.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene cáncer de colon, cánceres de hígado, enterocolitis necrotizante (NEC); diverticulosis o diverticulitis; pólipos o una enfermedad, trastorno o estado similar que está asociado con alteración estructural del intestino.
Los sujetos con enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) pueden presentar dolor o calambres abdominales, diarrea que puede ser sanguinolenta, urgencia de movimientos intestinales, estreñimiento, náuseas, vómitos, fiebre, pérdida de peso, pérdida de apetito y/o anemia por deficiencia de hierro debido a pérdida de sangre. Los síntomas de IBD pueden producirse en crisis, con periodos alternos de enfermedad sintomática y asintomática. La IBD puede diagnosticarse con una combinación de pruebas, incluyendo exámenes de deposiciones (para eliminar la posibilidad de causas infecciosas de la diarrea, comprobación de cantidades traza de sangre en la deposición y cuantificar biomarcadores asociados con IBD tales como calprotectina fecal), un hemograma completo para evaluar los niveles de inflamación, pruebas sanguíenas para evaluar biomarcadores incluyendo proteína C reactiva (CRP) y anticuerpo citoplasmático anti-neutrófilos perinucleares (pANCA), rayos X de bario, sigmoidoscopia, colonoscopia y endoscopia. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con colitis ulcerosa (UC; limitada al colon o intestino grueso), sujetos con enfermedad de Crohn (CD; que afecta a cualquier segmento del tubo digestivo) y sujetos con diferentes gravedades de enfermedad (leve, moderada, grave). Los tratamientos de referencia para IBD incluyen aminosalicilatos (por ejemplo, sulfasalazina, mesalamina, balsalazida, olsalazina), corticosteroides (por ejemplo, hidrocortisona, prednisona, metilprednisolona, prednisolona, budesonida, dexametasona), inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina, 6-mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina), antibióticos (por ejemplo, metronidazol, ciprofloxacino, rifaximina), inhibidores de factor de necrosis tumoral (por ejemplo, infliximab, adalimumab, certolizumab pegol), inhibidores de integrina (por ejemplo, natalizumab, vedolizumab) y cirugía. La resolución o el control de la enfermedad puede cuantificarse mediante evaluación endoscópica o sigmoidoscópica de la gravedad de la enfermedad según métricas de puntuación convencionales, remisión de los síntomas descritos anteriormente, reducción de la gravedad de la enfermedad tal como se determina mediante índices compuestos tales como el índice de actividad de la enfermedad de Crohn (CDAI), o la mejora en la calidad de vida relacionada con la salud tal como se mide mediante el cuestionario de IBD (IBD-Q).
Enfermedades metabólicas
En algunas realizaciones, se identifica que un sujeto es adecuado para el tratamiento si el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o estado que incluye: obesidad, prediabetes, diabetes tipo II, colesterol en sangre alto, LDL altas, tensión arterial alta, azúcar en sangre en ayunas alta, niveles de triglicéridos altos, HDL bajas, enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH); síndrome metabólico; hiperamoniaquemia, deficiencia de nutrientes esenciales, hemocromatosis, intolerancia a la lactosa, intolerancia al gluten; y acrodermatitis enteropática.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene obesidad, (resistencia a la insulina) prediabetes, diabetes tipo II, azúcar en sangre en ayunas alta (hiperglucemia), síndrome metabólico o una enfermedad, trastorno o estado similar asociado con síntomas de enfermedades metabólicas.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene colesterol en sangre alto, LDL altas, tensión arterial alta (hipertensión), niveles de triglicéridos altos, HDL bajas o un factor de riesgo cardiovascular similar.
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En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), hiperamoniaquemia o una enfermedad, trastorno o estado similar del hígado.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene intolerancia a la lactosa, intolerancia al gluten o una enfermedad, trastorno o estado similar que está asociada con intolerancia alimentaria.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene deficiencia de nutrientes esenciales, hemocromatosis, acrodermatitis enteropática o una enfermedad, trastorno o estado similar que está asociado con mala gestión de nutrientes.
En una realización, se da a conocer un método de tratamiento de un trastorno metabólico en un ser humano que lo necesita: administrando al ser humano una composición terapéutica de glicanos farmacéutica para tratar el trastorno metabólico. En una realización, el trastorno metabólico se selecciona de obesidad, adiposidad, resistencia a la insulina, diabetes y síndrome de hígado graso.
Los trastornos metabólicos pueden incluir trastornos, enfermedades y estados que están provocados por caracterizados por aumento de peso anómalo; uso o consumo de energía; respuestas alteradas a nutrientes, fuentes de energía, hormonas u otras moléculas de señalización; o metabolismo alterado de hidratos de carbono, lípidos, proteínas o ácidos nucleicos, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de trastornos metabólicos incluyen resistencia a la insulina, sensibilidad a la insulina, síndrome de hígado graso, obesidad, adiposidad y diabetes (por ejemplo, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2). En una variación, los métodos dados a conocer en el presente documento tratan la obesidad. Se dan a conocer en el presente documento métodos para tratar la obesidad en un sujeto que lo necesita usando una composición terapéutica de glicanos farmacéutica que puede alera la microbiota intestinal del sujeto de un modo que da como resultado pérdida de peso y/o disminución grasa corporal en el sujeto.
En una realización, se da a conocer un método de reducción de la adiposidad en un sujeto que lo necesita: administrando al ser humano una composición terapéutica de glicanos farmacéutica en una cantidad eficaz para reducir la adiposidad. La adiposidad puede determinarse usando cualquier método apropiado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, circunferencia de la cintura, razón de cintura con respecto a caderas, grosor de pliegues cutáneos, impedancia bioeléctrica, pesaje bajo el agua, pletismografía por desplazamiento de aire o hidrometría.
En una realización, se da a conocer un método de mejora del metabolismo de la glucosa en un sujeto que lo necesita: administrando al sujeto una composición terapéutica de glicanos farmacéutica en una cantidad eficaz para mejorar el metabolismo de la glucosa. El metabolismo de la glucosa puede determinarse mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, nivel de azúcar en sangre en ayunas, nivel de insulina en ayunas, prueba de azúcar en sangre posprandial, prueba de insulina posprandial, prueba de tolerancia a la glucosa oral, prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa, nivel de hemoglobina glicada o prueba de azúcar en sangre al azar.
En una realización, se da a conocer un método de aumento de la sensibilidad a la insulina en un ser humano: administrando al sujeto una composición terapéutica de glicanos farmacéutica en una cantidad eficaz para aumentar la sensibilidad a la insulina, en el que el ser humano tiene una sensibilidad a la insulina antes de la administración del producto terapéutico de glicanos y una sensibilidad a la insulina después de la administración del producto terapéutico de glicanos, y la sensibilidad a la insulina del ser humano después de la administración del producto terapéutico de glicanos es mayor que la sensibilidad a la insulina del ser humano antes de la administración del producto terapéutico de glicanos. La sensibilidad a la insulina puede determinarse mediante cualquier método apropiado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, nivel de azúcar en sangre en ayunas, nivel de insulina en ayunas, prueba de azúcar en sangre posprandial, prueba de insulina posprandial, prueba de tolerancia a la glucosa oral, prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa, nivel de hemoglobina glicada o prueba de azúcar en sangre al azar.
En algunas realizaciones, los sujetos con diabetes tipo 2 pueden tratarse según los métodos dados a conocer en el presente documento. Los sujetos con diabetes tipo 2 pueden presentar visión borrosa, neuropatía periférica, aumento de la micción, aumento de sed, fatiga, aumento de hambre, pérdida de peso, o infecciones por levaduras, de la vejiga, renales, cutáneas u otras. La diabetes tipo 2 se diagnostica mediante los criterios descritos por la American Diabetes Association (ADA), que incluyen los siguientes: glucosa en plasma en ayunas (FPG) de 126 mg/dl (7 mM) o mayor, o un nivel de glucosa en plasma a las 2 horas de 200 mg/dl (11,1 mM) o mayor durante una prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) de 75 g, o una glucosa en plasma al azar de 200 mg/dl (11,1 mM) o mayor en un paciente con síntomas clásicos de hiperglucemia o crisis hiperglicémicas, o un nivel de hemoglobina A1c (HbA1c) del 6,5% o mayor. Las poblaciones de pacientes incluyen adultos y niños con diabetes tipo 2, sujetos en riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 (por ejemplo, sujetos con prediabetes o sujetos que tienen sobrepeso), y sujetos con diabetes tipo 2 conjuntamente con estados de síndrome metabólico incluyendo obesidad, tensión arterial elevada, triglicéridos séricos elevados y bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL). Los tratamientos de referencia para diabetes tipo 2 incluyen gestión del estilo de vida (dieta, ejercicio y modificaciones del
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comportamiento), inhibidores de alfa-glucosidasa, biguanidas (por ejemplo, metformina), sulfonilureas, inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (DPP-4), análogos de péptido-1 similar al glucagón (GLP-1), meglitinidas, inhibidores del transportador 2 de sodio-glucosa selectivo (SGLT2), tiazolidindionas, insulina y miméticos de amilino. La eficacia de tratamiento puede evaluarse mediante la resolución de los síntomas o los criterios de diagnóstico enumerados anteriormente (por ejemplo, disminución de FPG hasta niveles sanos), o, en sujetos en riesgo de desarrollar diabetes tipo 2, mediante la disminución de las tasas de conversión en un estado de diabetes tipo 2.
En algunas realizaciones, los sujetos que presentan rnfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) y/o esteatohepatitis no alcohólica (NASH) pueden tratarse según los métodos dados a conocer en el presente documento. La enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) se caracteriza por una acumulación anómala de grasa en el hígado. La NAFLD puede progresar a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), que se caracteriza por inflamación hepática, fibrosis y cirrosis. Los sujetos con NAFLD pueden ser asintomáticos. Los sujetos con NAFLD o NASH pueden presentar un tamaño de hígado aumentado (notado durante el examen físico), fatiga, pérdida de peso, debilidad general y/o dolor en la parte superior derecha del vientre. El diagnosis de NAFLD/NASH incluye niveles en sangre elevados de alanina aminotransferasa (ALT) o aspartato aminotransferasa (AST), hígado agrandado y marcadores histopatológicos específicos (por ejemplo mediante biopsia hepática, ultrasonidos abdominales, exploración de CT o una exploración de MRI). Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con NAFLD, sujetos con NASH, sujetos en riesgo de desarrollar NAFLD/NASH (por ejemplo, sujetos que tienen sobrepeso o tienen niveles de colesterol elevados) y sujetos con NAFLD/NASH conjuntamente con estados de síndrome metabólico incluyendo obesidad, glucosa en plasma en ayunas elevada, tensión arterial elevada, triglicéridos séricos elevados y bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL). Los tratamientos de referencia para NAFLD/NASH incluyen gestión del estilo de vida (dieta, ejercicio, modificaciones del comportamiento y abstinencia de alcohol). Los tratamientos en ensayos clínicos o en desarrollo incluyen antagonistas del receptor de farnesoide X (FXR) (por ejemplo, ácido obeticólico), agonistas de receptor 5 acoplado a proteínas G de Takeda (TGR5), conjugados de ácido graso-ácido biliar (por ejemplo, aramchol), antioxidantes (por ejemplo, vitamina E), agentes antifibróticos, agonistas del receptor activado por proliferador del peroxisoma gamma (PPAR), agonistas de PPAR alfa/delta, inhibidores de caspasa (por ejemplo, Emricasan) y/o inhibidores de galectina-3. La eficacia de tratamiento puede evaluarse mediante la resolución de los síntomas o los criterios de diagnóstico enumerados anteriormente (por ejemplo, disminución en ALT hasta niveles sanos) o, en sujetos en riesgo de desarrollar NAFLD/NASH, mediante la disminución de las tasas de conversión en NAFLD/NASH.
En algunas realizaciones, los sujetos obesos pueden tratarse según los métodos dados a conocer en el presente documento. La obesidad es un problema de salud significativo, y puede tener un efecto negativo sobre la salud. Por ejemplo, la obesidad puede conducir a una reducción de la esperanza de vida y/o un aumento de los problemas de salud, tales como diabetes, tensión arterial alta, cardiopatía, accidente cerebrovascular, colesterol alto, apnea del sueño y artritis. Los sujetos obesos presentan un índice de masa corporal (IMC) de más de 30 kg/m2. Alternativamente, los sujetos obesos pueden clasificarse basándose en su porcentaje de grasa corporal (mayor del 25% para hombres o mayor del 33% para mujeres). El diagnóstico también puede incluir una evaluación de los niveles de lípidos en ayunas (colesterol, triglicéridos), función hepática, niveles de glucosa, niveles de insulina, hemoglobina glicosilada (HbA1c) y/o tolerancia a la glucosa. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con obesidad infantil, obesidad moderada, obesidad mórbida/grave, causas genéticas de obesidad (incluyendo síndrome de Prader-Willi, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Cohen y síndrome de MOMO), y obesidad en conjuntamente con otros estados de síndrome metabólico (tensión arterial elevada, glucosa en plasma en ayunas elevada, triglicéridos séricos elevados y bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad (HDL)). Los tratamientos de referencia para la obesidad incluyen gestión del estilo de vida (dieta, ejercicio y modificaciones del comportamiento), cirugía bariátrica, medicamentos que alteran la absorción de la dieta (por ejemplo, tetrahidrolipstatina), medicamentos que alteran la ingesta de la dieta, medicamentos que aumentan el gasto de energía y medicamentos que tratan comorbilidades comunes (por ejemplo, medicamentos para diabetes tipo 2 o hipertensión). Los criterios de valoración del tratamiento incluyen el cambio en el peso corporal, niveles de lípidos en ayunas, función hepática, niveles de glucosa, niveles de insulina, HbA1 C y/o tolerancia a la glucosa.
Otras enfermedades
En algunas realizaciones, se identifica que un sujeto es adecuado para el tratamiento si el sujeto tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o estado que incluye: artritis autoinmunitaria, diabetes tipo I, dermatitis atópica, autismo, asma, enfermedad cardiovascular, enfermedad renal crónica, esclerosis múltiple, cardiopatía, psoriasis, hiperamoniaquemia, encefalopatía hepática, caquexia, gota, intolerancia a fármacos (por ejemplo, a metformina), baja biodisponibilidad oral de fármacos, incontinencia fecal, enfermedad de Hirschsprung, anismo, cólico, íleo, hemorroides e invaginaciones intestinales.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene artritis autoinmunitaria, diabetes tipo I, esclerosis múltiple, psoriasis o una enfermedad, trastorno o estado autoinmunitario similar.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene asma, dermatitis atópica o alergia ambiental similar.
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En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene enfermedad renal crónica, cardiopatía, enfermedad cardiovascular o una enfermedad, trastorno o estado similar que está asociado con insuficiencia orgánica.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene autismo, hiperamoniaquemia, encefalopatía hepática o una enfermedad, trastorno o estado similar que está asociado con síntomas neurológicos.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene caquexia, gota o un trastorno nutricional similar.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene enfermedad de Hirschsprung, íleo, anismo, invaginaciones intestinales, incontinencia fecal, hemorroides o un trastorno gastrointestinal similar.
En algunas realizaciones, pueden tratarse sujetos con dermatitis atópica (AD) según los métodos dados a conocer en el presente documento. Los sujetos con dermatitis atópica (AD) pueden presentar una piel que está seca, con picor y/o inflamada. El diagnóstico y la gravedad de la AD puede determinarse usando el índice de SCORAD (Oranje, A. P., et al. “Practical issues on interpretation of scoring atopoc dermatitis: the SCORAD index, objective SCORAD and the three-item severity score.” British Journal of Dermatology 157,4 (2007): 645-648) o la puntuación de índice y gravedad del área de eccema (EASI) (Hanifin et al., The eczema area and severity index (EASI): assessment of reliability in atopic dermatitis, Experimental Dermatology, 2001, 10:11). La AD puede producirse en crisis, con periodos alternos de enfermedad sintomática y asintomática. Comúnmente está presente Staphylococcus aureus en sitios cutáneos con AD, y biomarcadores incluyendo IgE y citocinas y quimiocinas inflamatorias o Th2 también pueden estar elevadas en la piel enferma o de manera sistémica. Las poblaciones de pacientes incluyen lactantes con AD de aparición temprana, niños con AD pediátrica, adultos con AD de aparición tardía, mujeres embarazadas en riesgo de crisis de AD (“erupción atópica del embarazo”), sujetos con crisis de AD leves, moderadas o graves, o sujetos que están en riesgo de desarrollar AD. Los tratamientos de referencia para AD incluyen humectantes aplicados por vía tópica, pomadas de esteroides aplicadas de manera tópica tales como hidrocortisona, baños de blanqueamiento, antibióticos, agentes inmunomoduladores tales como tacrolimús, antihistamínicos, terapias basadas en anticuerpos (incluyendo anticuerpos para bloquear IgE, el receptor de IL-4, IL- 4 e IL-13), y otros agentes antiinflamatorios. El tratamiento también puede incluir probióticos. La resolución o el control de la enfermedad puede cuantificarse mediante los criterios de SCORAD o EASI convencionales descritos anteriormente.
En algunas realizaciones, pueden tratarse sujetos con asma según los métodos dados a conocer en el presente documento. Los sujetos con asma pueden presentar respiración sibilante, tos, dificultad para respirar y/o dolor u opresión torácica. Estos síntomas son comúnmente episódicos y pueden desencadenarse por factores tales como ejercicio o exposición a alérgenos. Adicionalmente, los niños con asma pueden presentar una historia de bronquitis recurrente, bronquiolitis o neumonía o una tos persistente con resfriados. El diagnóstico de asma se establece mediante pruebas de la función pulmonar con espirometría en presencia y ausencia de tratamiento con un broncodilador. Las poblaciones de pacientes incluyen lactantes con asma; sujetos con asma infantil; asma de aparición adulta; asma intermitente, persistente leve, persistente moderada o persistente grave; asma inducida por ejercicio; asma alérgica; asma con tos variante; asma ocupacional; asma nocturna; y sujetos que están en riesgo de desarrollar asma, por ejemplo, debido a una historia familiar de atopia. Los tratamientos de referencia para el asma incluyen corticosteroides inhalados (por ejemplo, budesonida, fluticasona, beclometasona, mometasona y ciclesonida), broncodilatadores de acción corta (por ejemplo, albuterol), broncodilatadores de acción larga (por ejemplo, salmeterol), modificadores de leucotrienos (por ejemplo, montelukast) u otros agentes antiinflamatorios, agentes anticolinérgicos (por ejemplo, ipratropio, tiotropio), anti-IgE (por ejemplo, omalizumab) para asma alérgica, y/o esteroides sistémicos (por ejemplo, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, dexametasona). Los tratamientos también pueden incluir probióticos. La eficacia de tratamiento puede evaluarse mediante una disminución en la frecuencia o la gravedad de los síntomas descritos anteriormente, una mejora en la función pulmonar (evaluada mediante mediciones tales como velocidad de flujo espiratorio pico (PEFR) o volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV1)), disminución en la necesidad de continuar o iniciar tratamientos para el asma, o cambios en los niveles de biomarcadores de inflamación de las vías respiratorias (por ejemplo, IgE en suero, óxido nítrico exhalado, recuentos de eosinófilos en sangre o esutos, citocinas inflamatorias, citocinas Th2, etc.).
En algunas realizaciones, pueden tratarse sujetos con enfermedad renal crónica (CKD) según los métodos dados a conocer en el presente documento. Los sujetos con CKD pueden presentar fatiga, problemas de concentración, apetito escaso, problemas de sueño, calambres musculares nocturnos, pies y tobillos hinchados, exantema/picor cutáneo, náuseas, vómitos, un sabor metálico en la boca, dificultad para respirar y/o aumento de la micción. El diagnóstico de la enfermedad renal, incluyendo CKD, se realiza mediante pruebas de la tasa de filtración glomerular (GFR), niveles en sangre de urea y creatinina, niveles en orina de albúmina, biopsia renal, ultrasonidos y/o exploración CT. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con CKD provocada por nefropatía diabética; sujetos
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con CKD provocada por tensión arterial alta; sujetos con enfermedad renal poliquística, pielonefritis o glomerulonefritis; sujetos con daño renal debido al uso a largo plazo de medicamentos que dañan el riñón; y sujetos en riesgo de desarrollar CKD debido a la presencia de factores de riesgo tales como diabetes, tensión arterial alta o historia familiar de enfermedad renal. Los tratamientos de referencia para CKD incluyen medicamentos para reducir la tensión arterial, controlar la glucosa en sangre y reducir el colesterol en sangre. Los tratamientos también pueden incluir modificaciones de la dieta y probióticos. La eficacia de tratamiento puede evaluarse mediante la resolución de los síntomas o los criterios de diagnóstico enumerados anteriormente (por ejemplo, disminución en la albúmina en orina y creatinina en suero), reducción de la necesidad de iniciar una diálisis o prolongación del tiempo antes de iniciar una diálisis, reducción en los niveles en sangre de solutos urémicos (por ejemplo, sulfato de p-cresol y sulfato de indoxilo) u otros factores circulantes potencialmente perjudiciales (por ejemplo, N-óxido de trimetilamina (TMAO), o, en sujetos en riesgo de desarrollar CKD, mediante la disminución de las tasas de conversión en CKD.
En algunas realizaciones, pueden tratarse sujetos con encefalopatía hepática (HE) según los métodos dados a conocer en el presente documento. La encefalopatía hepática incluye múltiples síntomas neurológicos adversos que se producen cuando el hígado no puede eliminar sustancias tóxicas tales como amoniaco de la sangre. Los sujetos con HE pueden presentar confusión, olvido, ansiedad o excitación, cambios súbitos en la personalidad o el comportamiento, cambios en los patrones de sueño, desorientación, aliento con olor dulce o rancio, habla farfullante y/o dificultad para controlar las funciones motoras. El diagnóstico de HE se realiza mediante pruebas de la función hepática, niveles de amoniaco en suero, EEG y otras pruebas sanguíneas y neurológicas. Las poblaciones de pacientes incluyen sujetos con HE leve, HE grave, HE manifiesta, sujetos que han experimentado anteriormente uno o más episodios de He y pacientes que están en riesgo de HE debido a la presencia de factores de riesgo tales como daño hepático. Los tratamientos de referencia para HE incluyen lactulosa, lactitol y antibióticos (por ejemplo, rifaximina o neomicina). Los tratamientos pueden incluir también modificaciones de la dieta y probióticos. La eficacia de tratamiento puede evaluarse mediante la resolución de los síntomas o los criterios de diagnóstico enumerados anteriormente (por ejemplo, reducción en los niveles de amoniaco en suero), disminución de la incidencia de episodios futuros de HE o, en sujetos en riesgo de HE, mediante una disminución de la aparición de un episodio inicial de HE.
Anomalías digestivas inducidas por tratamiento o fármaco
Se dan a conocer en el presente documento métodos de reducción de síntomas inducidos por tratamiento o fármaco en un sujeto humano. Tales síntomas inducidos por tratamiento o fármaco incluyen cualquier anomalía digestiva. Las anomalías digestivas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a aumento de peso, estreñimiento, pirosis, molestias estomacales, gas, meteorismo, flatulencia, diarrea, dolor abdominal, calambres, náuseas y vómitos. En algunas realizaciones, la anomalía digestiva es diarrea. El método incluye administrar al sujeto humano una composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para reducir uno o más síntomas inducidos por un fármaco o tratamiento. En una realización, el tratamiento es tratamiento con radiación.
En una realización, el sujeto que se identifica que es adecuado para el tratamiento con un producto terapéutico de glicanos tiene o se sospecha que tiene diarrea inducida por fármaco, estreñimiento inducido por fármaco, toxicidad inducida por fármaco, intolerancia inducida por fármaco (por ejemplo a metformina, a quimioterapias), daño al microbioma inducido por fármaco, enfermedad del microbioma inducida por fármaco, enfermedad gastrointestinal inducida por fármaco, enteritis o colitis inducida por fármaco o trastorno o estado inducido por fármaco similar.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos se administra antes de, simultáneamente con o después de la administración del fármaco (o tratamiento con radiación), cuya administración induce los síntomas. Los fármacos a modo de ejemplo que están asociados a menudo con síntomas inducidos por tratamiento o fármaco incluyen, pero no se limitan a un fármaco contra el cáncer, un antidiabético, un fármaco inmunosupresor, un fármaco antimicrobiano, un quimioterápico, un antipsicótico, un inhibidor de la bomba de protones y un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). La administración de estos fármacos está asociada generalmente con disbiosis que pueden producirse, por ejemplo, durante el régimen de tratamiento. En algunas realizaciones, la disbiosis provoca o amplifica los síntomas inducidos por tratamiento o fármaco, tales como anomalías digestivas. En algunas realizaciones, la administración del producto terapéutico de glicanos modula el microbioma de manera que los síntomas inducidos por tratamiento o fármaco se reducen. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos promueve el crecimiento de bacterias comensales y/o apoya el crecimiento de comunidades microbianas beneficiosas que se verían afectadas negativamente o se perderían en respuesta al tratamiento farmacológico o que pueden complementar a bacterias comensales que se han visto afectadas negativamente o se han perdido en respuesta al tratamiento farmacológico.
Los ejemplos específicos de fármacos asociados con síntomas de anomalías digestivas que pueden reducirse mediante la administración del producto terapéutico de glicanos incluyen, pero no se limitan a ciprofloxacino, clindamicina, amoxicilina-clavulanato, cefixima, cefalosporinas, fluoroquinolonas, azitromicina, claritromicina, eritromicina, tetraciclina, azitromicina, irinotecán (camptosar), 5-fluorouracilo, leucovorina, oxaliplatino, bortezomib, imatinib, lenalidomida, imbruvica, ipilimumab, pertuzumab, capecitabina, docetaxel, lapatinib, erlotinib, carmustina, etopósido, aracitina, melfalán, citarabina, daunorubicina, amsacrina, mitoxantrona, olanzapina, ranitidina, famotidina,
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cimetidina, omeprazol, sucralfato, esomeprazol, naproxeno, diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, ketoprofeno, piroxicam, celecoxib, nimesulida, aspirina, metformina, paroxetina, ácido valproico o clozapina.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con tratamiento del sujeto con un agente quimioterápico. En una realización, la anomalía digestiva es diarrea. En realizaciones específicas, el agente quimioterápico es irinotecán, 5-fluorouracilo, leucovorina, o combinaciones de los mismos. En realizaciones específicas, el agente quimioterápico es oxaliplatino, leucovorina, 5-fluorouracilo, o combinaciones de los mismos. En realizaciones específicas el agente quimioterápico es bortezomib, imatinib, lenalidomida, imbruvica, ipilimumab, pertuzumab, capecitabina, docetaxel, lapatinib, erlotinib, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente quimioterápico es carmustina, etopósido, aracitina, melfalán, o combinaciones de los mismos. En realizaciones específicas el agente quimioterápico es citarabina, daunorubicina, etopósido, o combinaciones de los mismos. En realizaciones específicas el agente quimioterápico es amsacrina, citarabina, etopósido, o combinaciones de los mismos. En realizaciones específicas, el agente quimioterápico es mitoxantrona, citarabina, o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con tratamiento del sujeto con un antibiótico. En una realización, la anomalía digestiva es diarrea. En realizaciones específicas, el antibiótico es ciprofloxacino, clindamicina, amoxicilina-clavulanato, cefixima, cefalosporinas, fluoroquinolonas, azitromicina, claritromicina, eritromicina, tetraciclina o azitromicina.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con tratamiento del sujeto con un fármaco antipsicótico. En una realización, la anomalía digestiva es aumento de peso. En una realización, el fármaco es olanzapina.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con tratamiento del sujeto con un fármaco inhibidor de la bomba de protones. En una realización, la anomalía digestiva es diarrea. En realizaciones específicas, el fármaco es ranitidina, famotidina, cimetidina, omeprazol, sucralfato o esomeprazol.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con tratamiento del sujeto con un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). En una realización, la anomalía digestiva es diarrea. En realizaciones específicas, el fármaco es naproxeno, diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, ketoprofeno, piroxicam, celecoxib, nimesulida o aspirina.
En algunas realizaciones, las anomalías digestivas están asociadas con tratamiento del sujeto con metformina, paroxetina, ácido valproico o clozapina.
En una realización, la reducción del uno o más síntomas aumenta el cumplimiento por el sujeto del régimen de tratamiento. En una realización, la reducción de uno o más síntomas permite que el médico prescriba una dosis superior del fármaco que va a administrarse. En tales realizaciones, el tratamiento de la enfermedad subyacente es más eficaz (por ejemplo aumento de la reducción de síntomas, periodo más corto para lograr un estado libre de enfermedad o síntomas, o mantenimiento más prolongado de un estado libre de enfermedad o síntomas, etc.).
Otras realizaciones
En algunas realizaciones, el sujeto experimenta una reducción en al menos un síntoma de la enfermedad, trastorno o estado gastrointestinal tras el tratamiento. En algunas realizaciones, puede determinarse una reducción en la gravedad de un síntoma tras el tratamiento (por ejemplo midiendo un biomarcador conocido) y es del orden del 3%, el 5%, el 7%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 100%. En algunas realizaciones, los síntomas, medidos tal como se describe en el presente documento, disminuyen en un promedio de aproximadamente el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95% o aproximadamente el 100% en comparación con los síntomas antes de la administración de una composición terapéutica de glicanos farmacéutica. En algunas realizaciones, la reducción en la gravedad del síntoma persiste durante al menos aproximadamente un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, 3 meses, 6 meses, 9 meses, un año, dos años, cinco años, diez años tras el tratamiento o la reducción es permanente.
En una realización, un síntoma de una enfermedad, trastorno o estado gastrointestinal permanece parcial, sustancial o completamente eliminado o con gravedad disminuida en un sujeto durante al menos aproximadamente 1 día, 1 semana, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 9 meses, un año, 18 meses, dos años, tres años, cuatro años, cinco años, diez años o más de diez años tras la terminación del tratamiento. En otra realización un síntoma de una enfermedad, trastorno o estado gastrointestinal se elimina permanentemente o con gravedad disminuida en un sujeto tras la terminación del tratamiento.
En algunas realizaciones, la administración de las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas mejora la salud global del huésped y/o la salud de un nicho específico, tal como el tubo digestivo, por ejemplo modulando (por ejemplo aumentando o disminuyendo) el crecimiento o abundancia de uno o más miembros de la comunidad
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microbiana en el nicho (tales como bacterias comensales residentes y/o patógenos o patobiontes adquiridos).
La investigación del intestino ha conducido a la identificación de biomarcadores con el potencial de demostrar los efectos sobre la salud de los prebióticos, que también pueden usarse para caracterizar los efectos sobre la salud y las eficacias de tratamiento de las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento sobre la microbiota y el entorno gastrointestinal. Estos marcadores incluyen: i) cambios en la microbiota gastrointestinal y el metabolismo global del entorno gástrico, tal como la producción de ácidos orgánicos, ii) modulación del sistema inmunitario, evaluación de globulinas inflamatorias e inmunitarias iii) aumento de la absorción de minerales en el colon, tales como calcio, zinc o magnesio iv) regulación del metabolismo lipídico, reducción del colesterol, v) inducción de otros procesos importantes para la homeostasis del huésped (véanse las revisiones de Pool-Zobel B L. Inulin-type fructans and reduction in cancer of colon risk: review of experimental and human data. 2005. British Journal of Nutrition 93 supl. 1: S73-90; y Liong M T. Roles of Probiotics y Prebiotics in Colon Cancer Prevention: Postulated Mechanisms and In-vivo Evidence. 2008. International Journal of Molecular Sciences 9(5):854-63).
Las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas, cuando se administran a un sujeto en una cantidad eficaz, puede modular una o más rutas del huésped. El tratamiento con el producto terapéutico de glicanos puede dar como resultado aumentos o disminuciones de uno o más biomarcadores que pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. Un investigador puede determinar fácilmente en qué punto o puntos durante el tratamiento debe(n) medirse el/los biomarador(es), por ejemplo antes del tratamiento, a diversos intervalos durante tratamiento y/o tras el tratamiento. Cualquier muestra adecuada, por ejemplo una muestra específica gastrointestinal tal como, por ejemplo una biopsia o muestra de tejido, un hisopo, una secreción gastrointestinal (tal como una muestra de heces/deposiciones), etc. puede extraerse del sujeto y la muestra puede analizarse. En algunas realizaciones, puede detectarse un aumento o una disminución sustancial en un biomarcador.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos se digiere por la microbiota intestinal (por ejemplo clostridios), dando como resultado, por ejemplo, la liberación de ácidos grasos de cadena corta tales como butirato, acetato y propionato, que pueden actuar con una capacidad inmunomoduladora (por ejemplo antiinflamatoria) y otros metabolitos (por ejemplo ácidos biliares y lactato) que pueden conferir efectos sobre la salud beneficiosos al huésped.
Para evaluar el efecto de las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas administradas sobre la producción de SCFA en el intestino, puede recogerse muestras fecales. Los niveles de SCFA, particularmente acetato, propionato y butirato, pueden cuantificarse. Los SCFA, creatinas e hidroxi-SCFA pueden cuantificarse alcalinizando las muestras de deposiciones, obteniendo huellas de la composición metabólica de la muestra usando, por ejemplo, espectrómetro de 1H-RMN 1D, y analizando con métodos estadísticos de múltiples variantes supervisados. La inulina puede servir como control positivo.
En algunas realizaciones, se usan los perfiles de metabolitos microbianos de muestras de pacientes o cultivos de microbios de muestras de sujetos para identificar factores de riesgo para desarrollar una enfermedad, trastorno o estado inflamatorio y/o infeccioso gastrointestinal. Los metabolitos a modo de ejemplo para los fines de diagnóstico, evaluación del riesgo de pronóstico o fines de evaluación del tratamiento incluyen los enumerados en la tabla 2. En algunas realizaciones, los perfiles de metabolitos microbianos se toman a diferentes puntos de tiempo durante la enfermedad y el tratamiento de un sujeto con el fin de evaluar mejor el estado patológico del sujeto incluyendo recuperación o acontecimientos de recaída. Tal monitorización también es importante para reducir el riesgo de que un sujeto desarrolle una nueva enfermedad, trastorno o estado gastrointestinal. En algunas realizaciones, los perfiles de metabolitos informan del tratamiento posterior.
Además, si el médico encargado u otro profesional sanitario determina que es útil, las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse en combinación con otras diversas terapias de referencia. En algunas realizaciones, la combinación de administración del producto terapéutico de glicanos y el agente de terapia de referencia tiene efectos de tratamiento aditivos o sinérgicos. Las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas pueden administrarse antes de, simultáneamente con o después del tratamiento con terapias de referencia. En algunos casos, las terapias alteran la composición y salud de la microbiota normal del tubo digestivo (por ejemplo uso de agentes antibacterianos, antivirales o antifúngicos), lo que puede conducir a la proliferación no deseada de bacterias o patógenos perjudiciales, lo que puede provocar uno o más de los síntomas descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la administración de las composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas descritas en el presente documento es útil para aliviar esos síntomas y mejorar la composición de la comunidad microbiana gastrointestinal.
Administración de productos terapéuticos de glicanos
Para cualquier composición terapéutica de glicanos farmacéutica usada en un método descrito en el presente documento, puede estimarse inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de modelos de animales de laboratorio conocidos por los expertos en la técnica. Tal información puede usarse para determinar de manera más precisa dosis útiles en seres humanos. Las dosificaciones iniciales también pueden estimarse a partir de datos in
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vitro o in vivo. Las dosificaciones iniciales también pueden formularse comparando la eficacia de los compuestos usados en los métodos descritos en el presente documento en ensayos modelo con la eficacia de compuestos conocidos. Por ejemplo, las dosificaciones iniciales pueden formularse comparando la eficacia de las preparaciones terapéuticas de glicanos en ensayos modelo con la eficacia de otros compuestos que han mostrado eficacia en el tratamiento de los presentes estados. En este método, puede obtenerse una dosificación inicial multiplicando la razón de concentraciones eficaces obtenidas en el ensayo modelo para las preparaciones terapéuticas de glicanos usadas en los métodos descritos en el presente documento y el compuesto de control por la dosificación eficaz del compuesto de control. Por ejemplo, si una preparación útil en un presente método es dos veces tan eficaz en un ensayo modelo como un compuesto conocido (por ejemplo, la concentración eficaz (CE50) de la preparación terapéutica de glicanos es igual a la mitad de la CE50 del compuesto conocido en el mismo ensayo), una dosificación eficaz inicial de la preparación terapéutica de glicanos sería la mitad de la dosificación conocida para el compuesto conocido. Usando estas directrices iniciales un experto habitual puede determinar una dosificación eficaz en sujetos, tales como seres humanos. La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles de la preparación terapéutica de glicanos que son suficientes para mantener el efecto terapéutico. Un experto en la técnica podrá optimizar dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.
Dependiendo del trastorno y el sujeto que va a tratarse y la vía de administración, las composiciones pueden administrarse a dosis variables. En una realización, se usa la cantidad eficaz o dosis de producto terapéutico de glicanos más pequeña. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos se administra en una dosis de desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 10.000 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 1.000 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg, de 0,05 mg/kg a aproximadamente 5.000 mg/kg, desde aproximadamente 0,5 mg/kg hasta aproximadamente 5.000 mg/kg, desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 500 mg/kg. Esta dosis puede administrarse como mg/kg/día y puede administrarse como una dosis inicial o puede aumentarse o disminuirse a lo largo del tiempo (por ejemplo, días o semanas) hasta alcanzar una dosis final.
En algunas realizaciones, el producto terapéutico de glicanos se administra en una dosis diaria total por sujeto de desde aproximadamente 1 mg al día hasta aproximadamente 100 gramos al día; desde aproximadamente 10 mg al día hasta aproximadamente 10 gramos al día; desde aproximadamente 100 mg al día hasta aproximadamente 10 gramos al día; desde aproximadamente 1 gramo al día hasta aproximadamente 10 gramos al día, desde aproximadamente 2 gramos al día hasta aproximadamente 20 gramos al día; desde aproximadamente 5 gramos al día hasta aproximadamente 50 gramos al día.
En algunas realizaciones, un síntoma de una enfermedad, trastorno o estado gastrointestinal en un sujeto que presenta los síntomas disminuye o se elimina administrando al sujeto cantidades (o dosis) crecientes, decrecientes o constantes de una composición terapéutica de glicanos farmacéutica durante un periodo de tiempo (por ejemplo un periodo de tratamiento).
En una realización, la composición contiene cepas bacterianas probióticas y/o comensales, beneficiosas en una cantidad comprendida desde 1x107 hasta 1x1013 UFC/dosis y cepa bacteriana, o desde 1x109 hasta 1x1011 UFC/dosis y cepa bacteriana.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra una, dos o tres veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra dos veces al día. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra cada día durante un número de días predeterminado (el periodo de tratamiento). En algunas realizaciones, el periodo de tratamiento es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 100, 200, 300 ó 365 días. En algunas realizaciones, el periodo de tratamiento es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meses. En algunas realizaciones, el periodo de tratamiento es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 años, o toda la vida.
En una realización la duración total de los periodos de tratamiento para una enfermedad, trastorno o estado gastrointestinal puede ser de desde aproximadamente un día hasta 10 años, de un día a 1 año, de 1 día a 6 meses, de 1 día a 3 meses, de 1 día a 1 mes, de un día a una semana, de un día a cinco días, de un día a 10 días, de una semana a aproximadamente 12 semanas, o de aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente diez semanas, o de aproximadamente cuatro semanas a aproximadamente ocho semanas, o de aproximadamente seis semanas. El sujeto puede someterse a un número adecuado de periodos de tratamiento, tales como, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 periodos de tratamiento. Durante un periodo de tratamiento, el sujeto toma una composición terapéutica de glicanos farmacéutica descrita en el presente documento, opcionalmente junto con la ingestión de productos alimenticios que contienen probióticos y/o prebióticos. En una realización, una composición terapéutica de glicanos farmacéutica también puede administrarse en combinación con otra sustancia (tal como bacterias beneficiosas comensales o probióticas, una sustancia prebiótica o un agente terapéutico), tal como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la composición terapéutica de glicanos farmacéutica puede combinarse también con un antibiótico que altera el crecimiento de la microbiota gastrointestinal normal. Normalmente las duraciones de los
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tratamientos con antibiótico son de 1-14 días, o 2-10 días, o 5-7 días. En algunas realizaciones, un producto terapéutico de glicanos se administra a un sujeto que lo necesita inmediatamente después de que uno o más tratamientos con antibiótico hayan terminado (por ejemplo 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas tras haber terminado el tratamiento con antibiótico). Durante un ciclo de tratamiento con antibiótico, la composición terapéutica de glicanos farmacéutica puede proporcionarse al inicio del tratamiento con antibiótico; poco después del tratamiento con antibiótico, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días tras el tratamiento; o puede administrarse tras el diagnóstico del crecimiento de patógenos no deseados.
En algunas realizaciones, la composición terapéutica de glicanos farmacéutica también puede combinarse con un fármaco que provoca disbiosis, por ejemplo un fármaco que altera el crecimiento de la microbiota gastrointestinal normal, por ejemplo un fármaco quimioterápico, un fármaco antidiabético, un fármaco inmunosupresor, un fármaco antimicrobiano, un fármaco antipsicótico, un fármaco inhibidor de la bomba de protones o un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE). La composición terapéutica de glicanos farmacéutica, en algunas realizaciones, reduce los síntomas inducidos por tratamiento o fármaco en un sujeto humano. Los síntomas incluyen anomalías digestivas, tales como, por ejemplo, aumento de peso, estreñimiento, pirosis, molestias estomacales, gas, meteorismo, flatulencia, diarrea, dolor abdominal, calambres, náuseas y vómitos. En algunas realizaciones, un producto terapéutico de glicanos se administra a un sujeto que lo necesita inmediatamente después de que uno o más tratamientos farmacológicos hayan terminado (por ejemplo 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas tras haber terminado el tratamiento con antibiótico). Durante un ciclo de tratamiento farmacológico, la composición terapéutica de glicanos farmacéutica puede proporcionarse antes del inicio del tratamiento farmacológico (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 días antes); el día de inicio del tratamiento farmacológico; o poco después del tratamiento con antibiótico, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días tras el tratamiento, y puede proporcionarse opcionalmente sólo inicialmente (por ejemplo durante un periodo corto) o a lo largo de toda la duración del tratamiento farmacológico, y puede incluso continuar durante un periodo deseado tras haber terminado el periodo de tratamiento farmacológico (por ejemplo durante 1-7 días, 1-14 días o 1-21 días después). En algunas realizaciones, la administración de la composición terapéutica de glicanos farmacéutica se inicia o continúa cuando se producen y/o diagnostican uno o más efectos adversos (por ejemplo anomalías digestivas o crecimiento de patógenos) conjuntamente con el tratamiento farmacológico. En algunas realizaciones, el agente de tratamiento que provoca una disbiosis no es un fármaco sino tratamiento con radiación o cirugía y la composición terapéutica de glicanos farmacéutica puede administrarse también tal como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el número total y la duración de los periodos de tratamiento se basan en la respuesta del sujeto al tratamiento. Por ejemplo, un individuo puede experimentar una reducción en los síntomas tras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 días de tratamiento con una composición terapéutica de glicanos farmacéutica. En otro ejemplo, un individuo puede experimentar una reducción en los síntomas tras 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses de tratamiento con una composición terapéutica de glicanos farmacéutica. Por tanto, la duración del tratamiento viene determinada por la respuesta de un sujeto individual a una composición terapéutica de glicanos farmacéutica y la aparición de alivio de uno o más síntomas. Por tanto, un sujeto puede experimentar síntomas a una dosis dada de una composición terapéutica de glicanos farmacéutica y puede requerirse que el sujeto permanezca a esa dosis, o una dosis inferior, hasta que los síntomas se pasen. Por tanto, en una realización, la duración del tratamiento no se determina al principio, sino que continúa hasta que se logra la dosis máxima de una composición terapéutica de glicanos farmacéutica al día, o hasta que se logra el nivel deseado de reducción en los síntomas. En una realización, el tratamiento es continuo.
En una realización, puede administrarse a un sujeto una dosis durante el primer periodo de tratamiento durante un régimen de tratamiento y una segunda dosis durante un segundo periodo de tratamiento. Por ejemplo, puede administrarse a un sujeto una dosis de composición terapéutica de glicanos farmacéutica durante un periodo de una semana y una segunda dosis durante un periodo de una semana posterior.
Un sujeto puede autoadministrarse una composición terapéutica de glicanos farmacéutica y la composición terapéutica de glicanos la suministra o recomienda (o prescribe) un profesional sanitario, por ejemplo, un médico u otro profesional sanitario cualificado y opcionalmente los resultados de pruebas (por ejemplo obtenidos para biomarcadores de muestras tomadas del sujeto) y/o cambios en la salud y criterios de valoración del tratamiento los monitoriza un profesional sanitario. En algunas realizaciones, la composición terapéutica de glicanos farmacéutica la administra un profesional sanitario.
En una realización, un sujeto que lo necesita puede someterse a ciclos de tratamiento repetidos con una composición terapéutica de glicanos farmacéutica. El ciclo de tratamiento puede repetirse cuando reaparecen los síntomas o aumentan hasta un nivel no deseado. Alternativamente, el ciclo de tratamiento puede repetirse a intervalos regulares o predeterminados. Por tanto, el tratamiento puede repetirse tras aproximadamente un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, seis meses, ocho meses, diez meses, un año, 18 meses, dos años, tres años, cuatro años, cinco años, o más de cinco años, o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, el tratamiento puede repetirse tras un año, luego cada de dos a cinco años después). El tratamiento puede repetirse de la misma forma (por ejemplo, duración, dosificación, momento de dosificación, sustancias adicionales, etc.) que se usó en el
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primer tratamiento o puede modificarse. Por ejemplo, la duración del tratamiento puede acortarse o alargarse, la dosificación puede aumentarse o disminuirse. Opcionalmente, el tratamiento con el producto terapéutico de glicanos puede producirse en combinación con un número diferente o composiciones de agentes, por ejemplo, que contienen más o menos de otras sustancias, o menos o más sustancias (tales como, por ejemplo, una sustancia prebiótica, una bacteria probiótica o un agente terapéutico) además del producto terapéutico de glicanos.
Pueden administrarse sustancias adicionales conjuntamente con una composición terapéutica de glicanos farmacéutica. Estas sustancias pueden potenciar la acción de las dosis de producto terapéutico de glicanos, por ejemplo, estimulando el crecimiento de bacterias en el tubo digestivo que alivian los síntomas de la enfermedad, trastorno o estado gastrointestinal, aumentando la adhesión de bacterias comensales beneficiosas o probióticas en el nicho o en el intestino. Estas sustancias pueden administrarse antes del tratamiento con producto terapéutico de glicanos, durante el tratamiento con producto terapéutico de glicanos, después del tratamiento con producto terapéutico de glicanos, o cualquier combinación de los mismos. Si se administran durante el tratamiento con producto terapéutico de glicanos, pueden administrarse con la dosis de producto terapéutico de glicanos que está administrándose, o antes o después de la dosis de producto terapéutico de glicanos, o cualquier combinación de los mismos. En una realización las sustancias de uso conjuntamente con una composición terapéutica de glicanos farmacéutica incluyen microbio(s) probiótico(s), prebióticos, agentes terapéuticos o tampones/portadores/excipientes. Una o más de estas sustancias pueden usarse en combinación con la composición terapéutica de glicanos farmacéutica en cualquier momento adecuado antes, durante, después del tratamiento, o alguna combinación de los mismos.
Definiciones
“Abundancia” de taxones microbianos tal como se usa en el presente documento es un término relativo y se refiere a la presencia relativa de taxones microbianos con respecto a otros taxones en una comunidad en un nicho microbiano definido, tal como el tubo digestivo, o todo el organismo huésped (por ejemplo un ser humano o un modelo de animal de laboratorio de enfermedad).
“Adquirir” o “que adquiere” tal como se usan los términos en el presente documento, se refieren a obtener la posesión de un valor, por ejemplo, un valor numérico, o imagen, o una entidad física (por ejemplo, una muestra), “adquiriendo directamente” o “adquiriendo indirectamente” el valor o entidad física. “Adquirir directamente” significa realizar un procedimiento (por ejemplo, realizar un método o protocolo sintético o analítico) para obtener el valor o entidad física. “Adquirir indirectamente” se refiere a recibir el valor o la entidad física de otra parte o fuente (por ejemplo, un laboratorio de terceros que adquirió directamente la entidad física o el valor). Adquirir directamente un valor o una entidad física incluye realizar un procedimiento que incluye un cambio físico en una sustancia física o el uso de una máquina o dispositivo. Los ejemplos de adquirir directamente un valor incluyen obtener una muestra de un sujeto humano. Adquirir directamente un valor incluye realizar un procedimiento que usa una máquina o dispositivo, por ejemplo, un espectrómetro de RMN para obtener un espectro de RMN.
La “colonización” de un organismo huésped incluye la residencia no transitoria de una bacteria u otro organismo microbiano. Tal como se usa en el presente documento, “reducir la colonización” de la microbiota de un sujeto huésped, tal como en el tubo digestivo por taxones bacterianos patógenos incluye una reducción en el tiempo de residencia de los taxones bacterianos patógenos en el nicho así como una reducción en el número, la concentración o la abundancia de los taxones bacterianos patógenos en el nicho o adheridos a la superficie del nicho. La medición de las reducciones de taxones bacterianos patógenos adherentes puede demostrarse, por ejemplo, mediante una muestra de biopsia, o las reducciones pueden medirse indirectamente, por ejemplo, midiendo la carga patógena, por ejemplo, en el tubo digestivo de un huésped.
“Distinto” tal como se usa en el presente documento, por ejemplo con referencia a una especie en un producto terapéutico de glicanos, pretende indicar que es químicamente y/o estructuralmente diferente de otra. Por ejemplo, dos azúcares son “distintos” si son químicamente diferentes, por ejemplo una fucosa y una xilosa, o estructuralmente diferentes, por ejemplo cíclicos frente a acíclicos, forma L frente a D. Dos dímeros son distintos si consisten en los mismos dos monómeros pero una pareja contiene enlace alfa-1,4 y la otra contiene un enlace beta-1,6. Las entidades distintas pueden tener cualquier otra característica o propiedad de distinción adecuada que puede detectarse mediante métodos conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento.
“Diversidad de una comunidad microbiana” o “diversidad microbiana” tal como se usa en el presente documento se refiere a la diversidad encontrada en la microbiota de un nicho dado dentro de un sujeto huésped. Puede estar relacionada con el número taxones microbianos distintos y/o riqueza dentro del huésped o nicho. La diversidad puede expresarse, por ejemplo usando el índice de diversidad de Shannon (entropía de Shannon), diversidad alfa- beta, número total de OTU observadas o índice Chaol, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de glicanos descritos en el presente documento modulan (por ejemplo aumentan o disminuyen) la diversidad dentro de una comunidad microbiana, lo que puede expresarse usando la entropía de Shannon como medida. Por ejemplo, cuando más desiguales son las abundancias de los taxones bacterianos, mayor es la media geométrica ponderada de los valores de pi en la fórmula de Shannon, y menor es la entropía de Shannon correspondiente. Si prácticamente toda la abundancia se concentra en un taxón, y los otros
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taxones son muy poco comunes (incluso si hay muchos de ellos), la entropía de Shannon se aproxima a cero. Cuando hay solo un taxón la entropía de Shannon es exactamente igual a cero.
Tal como se usa en el presente documento, un “régimen de dosificación”, “régimen de dosis” o “régimen de tratamiento” es una modalidad de administración de fármacos que logra un objetivo terapéutico. Un régimen de dosificación incluye la definición de uno, dos, tres o cuatro de: una vía de administración, una dosis unitaria, una frecuencia de dosificación y una duración del tratamiento.
“Disbiosis de la microbiota gastrointestinal” se refiere a un estado desequilibrado de la microbiota, por ejemplo, dentro del tubo digestivo, en el que la diversidad normal, proporción de un primer taxón bacteriano con respecto a un segundo taxón bacteriano y/o función de la red ecológica se ven alteradas o perjudicadas. Este estado no deseado, por ejemplo, no sano, puede deberse a varios factores incluyendo, pero sin limitarse a, una disminución o un aumento en la diversidad de la microbiota (por ejemplo taxones bacterianos), el sobrecrecimiento de uno o más patógenos o patobiontes, o el desplazamiento a una comunidad microbiana ecológica que ya no proporciona una función esencial para el sujeto huésped y, en una realización, por tanto ya no promueve la salud, o que está asocida con síntomas no deseados en el sujeto.
“Nicho ecológico” o simplemente “nicho” se refiere al espacio ecológico que ocupa un organismo o grupo de organismos (tal como el tubo digestivo o una o más subsecciones del tubo digestivo, tales como, por ejemplo, el estómago, el intestino grueso o delgado, el recto, etc.). En algunas realizaciones, nicho se refiere específicamente a un espacio que ocupan los microorganismos. El nicho puede describir cómo un organismo o población de organismos responden a la distribución de recursos, parámetros físicos (por ejemplo, espacio tisular del huésped) y competidores (por ejemplo, creciendo cuando los recursos son abundantes, y cuando los depredadores, parásitos y patógenos son escasos) y cómo a su vez altera esos mismos factores (por ejemplo, limitando el acceso de otros organismos a los recursos, actuando como fuente de alimentos para depredadores y consumidor de presas).
Mediante los términos “cantidad eficaz” y “cantidad terapéuticamente eficaz” de una composición farmacéutica o un agente farmacológico quiere decirse una cantidad suficiente de la composición o agente para proporcionar el efecto deseado. En algunas realizaciones, un médico u otro profesional sanitario decide la cantidad apropiada y el régimen de dosificación. Una cantidad eficaz también se refiere a una cantidad de una composición farmacéutica o un agente farmacológico que impide el desarrollo o la recaída de un estado médico.
Tal como se usa en el presente documento, una “preparación terapéutica de glicanos” (también denominada “preparación de productos terapéuticos de glicanos”, “preparación de glicanos” o “producto terapéutico de glicanos”) es una preparación que comprende glicanos (algunas veces denominados especies de glicanos) que presenta un efecto terapéutico. Un producto terapéutico de glicanos comprende una mezcla sintética de una pluralidad de especies de glicanos mono, di, oligoméricos y/o poliméricos (por ejemplo oligo y/o polisacáridos, algunas veces denominados “oligosacáridos”), en el que las especies de glicanos oligoméricos y/o poliméricos comprenden unidades de glicano que están unidas mediante enlaces glicosídicos. Un producto terapéutico de glicanos puede formularse para dar una composición farmacéutica o alimento médico para uso humano. Un producto terapéutico de glicanos puede formularse en cualquier forma de dosificación adecuada incluyendo un kit. En algunas realizaciones, las preparaciones de productos terapéuticos de glicanos no contienen uno o más oligo o polisacáridos que se producen de manera natural, incluyendo: glucooligosacárido, mananoligosacárido, inulina, licnosa, maltotretraosa, nigerotetraosa, nistosa, sesemosa, estaquiosa, isomaltotriosa, nigerotriosa, maltotriosa, melezitosa, maltotriulosa, rafinosa, cestosa, fructooligosacárido, 2’-fucosil-lactosa, galactooligosacárido, glicosilo, idraparinux, isomaltooligosacárido, maltodextrina, xilooligosacárido, agar, agarosa, ácido algínico, ácido algurónico, alfa glucano, amilopectina, amilosa, arabioxilano, beta-glucano, calosa, capsulano, carragenanos, celodextrina, celulina, celulosa, quitina, nanofibrilla de quitina, complejo de quitina-glucano, quitosano, crisolaminarina, curdlano, ciclodextrina, alfa- cilcodextrina, dextrano, dextrina, almidón de dialdehído, ficol, fructano, fucoidano, galactoglucomanano, galactomanano, galactosaminogalactano, goma gellan, glucano, glucomanano, glucoronoxilano, glicocalix, glucógeno, hemicelulosa, hipromelosea, icodextrina, kefirano, laminarina, lentinano, polisacárido de levano, liquenina, manano, mucílago, goma natural, paramilon, ácido péctico, pectina, pentaalmidón, fitoglucógeno, pleurano, poligeenano, polidextrosa, porfirano, pululano, esquizofilano, sefarosa, sinistrina, sizofirano, sugammadex, goma welan, goma xantana, xilano, xiloglucano, zimosano, y similares. En algunas realizaciones, un glicano existe como una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable.
Una “unidad de glicano” (algunas veces denominada “azúcar de alimentación”) tal como se usa en el presente documento se refiere a la unidad individual de una especie de glicano dada a conocer en el presente documento, por ejemplo, los elementos estructurales de los que está compuesta la especie de glicano. En una realización, una unidad de glicano es un monómero. En una realización, una unidad de glicano es un dímero. En una realización una unidad de glicano es un monosacárido. En una realización, una unidad de glicano es un disacárido. En algunas realizaciones, la unidad de glicano es un hidrato de carbono y puede seleccionarse de un alcohol de azúcar, un ácido graso de cadena corta, un ácido de azúcar, un iminoazúcar, un desoxiazúcar y un aminoazúcar. En algunas realizaciones, la unidad de glicano es eritrosa, treosa, eritrulosa, arabinosa, lixosa, ribosa, xilosa, ribulosa, xilulosa, alosa, altrosa, galactosa, glucosa, gulosa, idosa, manosa, talosa, fructosa, psicosa, sorbosa, tagatosa, fucosa, fuculosa, ramnosa, manoheptulosa, sedoheptulosa, y similares. En algunas realizaciones, la unidad de glicano es
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glucosa, galactosa, arabinosa, mañosa, fructosa, xilosa, fucosa o ramnosa. En realizaciones, un glicano comprende unidades de glicano distintas, por ejemplo, un primer y un segundo monosacárido, o un primer y un segundo disacárido, o un monosacárido y un disacárido. En realizaciones, un glicano comprende unidades de glicano distintas, por ejemplo, una primera, una segunda, una tercera, una cuarta y/o una quinta unidad de glicano distinta.
Tal como se usa en el presente documento, una preparación terapéutica de glicanos “aislada” o “purificada” (también denominada algunas veces “pulida”) está sustancialmente pura y libre de contaminantes, por ejemplo patógenos o material biológico no deseado por lo demás, o compuestos orgánicos o inorgánicos tóxicos o no deseados por lo demás. En algunas realizaciones, compuestos, composiciones o preparaciones aislados o puros pueden contener trazas de disolventes y/o sales (tal como menos del 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2%, el 1%, menos del 0,5% o el 0,1% en p/p, p/v, v/v o % molar). Los compuestos o preparaciones puros contienen al menos aproximadamente el 60% (en p/p, p/v, v/v o % molar), al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98% o al menos aproximadamente el 99% en p/p, p/v, v/v o % molar del/de los compuesto(s) de interés. Por ejemplo, una preparación purificada (sustancialmente pura) o aislada de productos terapéuticos de glicanos es una que tiene al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 98%, el 99%, el 99,5%, el 99,8%, el 99,9% o el 100% del producto terapéutico de glicanos en p/p, p/v, v/v o % molar (es decir, no incluye ningún disolvente, tal como por ejemplo agua, en el que la preparación terapéutica de glicanos puede disolverse) y está separada de los componentes que la acompañan, por ejemplo durante la fabricación, extracción/purificación y/o procesamiento (por ejemplo de manera que el producto terapéutico de glicanos está sustancialmente libre de compuestos no deseados). La pureza puede medirse mediante cualquier método convencional apropiado, por ejemplo, mediante cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía de exclusión molecular (SEC)), cromatografía en capa fina (CCF), cromatografía de gases (CG), cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) o espectroscopia e resonancia magnética nuclear (RMN). Purificado o pureza también puede definir un grado de esterilidad que es seguro para su administración a un sujeto humano, por ejemplo, que carece de agentes tóxicos o infecciosos viables.
“Microbioma” tal como se usa en el presente documento se refiere al contenido genético de las comunidades de microbios que viven en y sobre un sujeto (por ejemplo un sujeto humano), tanto de manera sostenida como transitoria, incluyendo eucariotas, arqueas, bacterias y virus (incluyendo virus bacterianos (por ejemplo, fagos)), en el que “contenido genético” incluye ADN genómico, aRn tal como ARN ribosómico y ARN mensajero, el epigenoma, plásmidos, y todos los otros tipos de información genética. En algunas realizaciones, microbiome se refiere específicamente al contenido genético de las comunidades de microorganismos en un nicho.
“Microbiota” tal como se usa en el presente documento se refiere a la comunidad de microorganismos que aparecen (de manera sostenida o transitoria) en y sobre un sujeto (por ejemplo un sujeto humano), incluyendo eucariotas, arqueas, bacterias y virus (incluyendo virus bacterianos, por ejemplo fagos). En algunas realizaciones, microbiota se refiere específicamente a la comunidad microbiana en un nicho.
“Patobiontes” o “patógenos (oportunistas)” tal como se usa en el presente documento se refiere a organismos simbióticos que pueden provocar una enfermedad sólo cuando están presentes en un sujeto determinadas condiciones genéticas y/o ambientales.
Tal como se usa en el presente documento, el término “patógeno” (por ejemplo “bacterias patógenas”) se refiere a una sustancia, un microorganismo o una condición que tiene la capacidad de provocar una enfermedad. En determinados contextos, los patógenos también incluyen microbios (por ejemplo bacterias) que están asociados con una enfermedad o estado pero para los que no se ha establecido o establecido aún una relación causante (directa). Tal como se usa en el presente documento, el término “patógenos” se refiere a virus, parásitos y bacterias u otros patógenos que pueden provocar infecciones en un sujeto, por ejemplo un ser humano.
Tal como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” o “preparación farmacéutica” es una composición o preparación, que tiene actividad farmacológica u otro efecto directo en la mitigación, el tratamiento o la prevención de enfermedad, y/o una forma de dosificación terminada o formulación de la misma y es para uso humano. Una composición farmacéutica o preparación farmacéutica se produce normalmente en condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP). Las composiciones o preparaciones farmacéuticas pueden ser estériles o no estériles. Si no son estériles, tales composiciones o preparaciones farmacéuticas cumplen normalmente las especificaciones y criterios microbiológicos para productos farmacéuticos no estériles descritos en la farmacopea estadounidense (USP) o farmacopea europea (EP). Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además o pueden coadministrarse con agentes activos adicionales, tales como, por ejemplo agentes terapéuticos adicionales. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también por ejemplo agentes terapéuticos adicionales, polifenoles, sustancias prebióticas, bacterias probióticas, excipientes, disolventes, portadores farmacéuticamente aceptables o cualquier combinación de los mismos. “Composiciones terapéuticas de glicanos farmacéuticas” (o simplemente “composiciones terapéuticas de glicanos”) son composiciones farmacéuticas tal como se describe en el presente documento que comprenden preparaciones terapéuticas de glicanos y opcionalmente agentes adicionales, componentes, excipientes o portadores. Cualquier producto terapéutico de glicanos descrito en el presente documento puede formularse como una composición farmacéutica.
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El término “fenotipo” tal como se usa en el presente documento se refiere a un conjunto de características observables de una entidad individual. Como ejemplo un sujeto puede tener un fenotipo de “salud” o “enfermedad”. Los fenotipos describen el estado de una entidad y todas las entidades dentro de un fenotipo comparten el mismo conjunto de características que describen el fenotipo. El fenotipo de un individuo resulta en parte, o en su totalidad, de la interacción del genoma y/o microbioma de las entidades con el entorno.
El término “sujeto” (en algunos casos “paciente”) tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sujeto humano. El término no indica una edad o un género particular. Los sujetos pueden incluir mujeres embarazadas. Los sujetos pueden incluir un recién nacido (un recién nacido prematuro, un recién nacido a término), un lactante de hasta un año de edad, niños jóvenes (por ejemplo, de 1 año a 12 años), adolescentes, (por ejemplo, 13-19 años), adultos (por ejemplo, 20-64 años), y adultos ancianos (65 años y más). Un sujeto no incluye un animal agrícola, por ejemplo, animales de granja o ganado, por ejemplo, reses, caballos, ovejas, cerdos, pollos, etc.
Una “disminución sustancial” tal como se usa en el presente documento (por ejemplo con respecto a un biomarcador o metabolito) es una disminución del 5%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98%, el 99%, el 99,9% o el 100%.
Un “aumento sustancial” tal como se usa en el presente documento (por ejemplo con respecto a un biomarcador o metabolito) es un aumento del 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 100%, el 150%, el 200%, el 250%, el 300%, el 350%, el 400%, el 450%, el 500%, el 550%, el 600%, el 650%, el 700%, el 750%, el 800%, el 850%, el 900%, el 950%, el 1000% o más del 1000%.
“Sintético” tal como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto o preparación artificial, tal como una preparación terapéutica de glicanos, que no se produce de manera natural. En una realización, el catalizador polimérico descrito en el presente documento se usa para sintetizar los glicanos de la preparación en condiciones de reacción adecuadas, por ejemplo mediante una reacción de polimerización que crea oligómeros y polímeros a partir de unidades de glicano individuales que se añaden a la reacción. En algunas realizaciones, el catalizador polimérico actúa como agente de hidrólisis y puede romper enlaces glicosídicos. En otras realizaciones, el catalizador de polímero puede formar enlaces glicosídicos. Las preparaciones terapéuticas de glicanos sintéticas también pueden incluir productos terapéuticos de glicanos que no se aíslan de una fuente de oligo o polisacáridos natural. Ha de entenderse que aunque la preparación terapéutica de glicanos no se aísle de una fuente de oligo o polisacáridos natural, las unidades de glicano que constituyen el producto terapeútico de glicanos pueden aislarse y a menudo se aíslan de fuentes de oligo o polisacáridos naturales, incluyendo las enumeradas en el presente documento, o se sintetizan de novo.
Los términos “tratar” y “tratamiento” tal como se usan en el presente documento se refieren a la administración de un agente o una composición a un sujeto (por ejemplo, un sujeto sintomático aquejado de un estado, trastorno o enfermedad adverso) para efectuar una reducción en la gravedad y/o frecuencia de un síntoma, eliminar un síntoma y/o su causa subyacente, y/o facilitar una mejora o remediación de un daño, y/o prevenir un estado, trastorno o enfermedad adverso en un sujeto asintomático que es susceptible a un estado, trastorno o enfermedad adverso particular, o que se sospecha que está desarrollando o en riesgo de desarrollar el estado, trastorno o enfermedad.
Ejemplos
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química de proteínas, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y farmacología, dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); Green & Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012); Colowick & Kaplan, Methods In Enzymology (Academic Press); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22a edición (Pharmaceutical Press, 2012); Sundberg & Carey, Advanced Organic Chemistry: Parts A and B, 5a edición (Springer, 2007).
Ejemplo 1. Preparación de productos terapéuticos de glicanos
A un matraz de fondo redondo equipado con un agitador superior y un condensador de trayectoria corta con camisa se le añadieron uno o más mono o disacáridos junto con el 3-20% en peso seco de uno o más de los catalizadores descritos en la patente estadounidense n.° 8.466.242 y el documento WO 2014/031956. Se añadió agua u otro disolvente compatible (1,54 equiv.) a la mezcla seca y se combinó la suspensión a aproximadamente 100 rpm usando una paleta dimensionada para coincidir con los contornos del matraz de fondo redondo seleccionado tan estrechamente como sea posible. Entonces se calentó la mezcla hasta 80-155°C. Una vez que los sólidos lograron un estado fundido, se colocó el recipiente bajo una presión de vacío de 10-1000 mbar. Se agitó la reacción durante de 30 minutos a 8 horas, eliminando constantemente el agua de la reacción. Se monitorizó el progreso de la reacción mediante HPLC. Cuando se había producido suficiente oligomerización, se apagó el agitador, se enfrió la reacción hasta temperatura ambiente y se ventiló hasta presión atmosférica, y se disolvió la masa sólida en un
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volumen de agua suficiente para crear una disolución de aproximadamente 50 Brix (gramos de azúcar por 100 g de disolución). Una vez completa la disolución, se retiró el catalizador sólido mediante filtración y se concentró la disolución de oligómeros hasta aproximadamente 50-75 Brix mediante evaporación rotatoria. En casos en los que se ha usado un disolvente orgánico, los disolventes inmiscibles con agua pueden eliminarse mediante extracción bifásica y los disolventes miscibles con agua pueden eliminarse mediante evaporación rotatoria simultáneamente con la etapa de concentración.
Entre otros, se prepararon los siguientes 25 glicanos en múltiples lotes y se sometieron a prueba en diversos ensayos descritos en el presente documento:
Unidad de glicano individual (homoglicanos): xyl100, rha100, ara100, gal100, glu100 y man100.
Dos unidades de glicano (heteroglicanos): ara50gal50, xyl75gal25, ara80xyl20, ara60xyl40, ara50xyl50, glu80man20, glu60man40, man60glu40, man80glu20, gal75xyl25, glu50gal50, man62glu38, y los glicanos híbridos glu90sor10 y glu90gly10.
Tres unidades de glicano (heteroglicanos): xyl75glu 12gal 12, xyl33glu33gal33, glu33gal33fuc33, man52glu29gal19 y glu33gal33neu33.+
Ejemplo 2. Purificación de productos terapéuticos de glicanos
Se disolvieron los oligo y polisacáridos sintetizados como en el ejemplo 1 en agua desionizada hasta una concentración final de 25-50 Brix. Entonces se expuso el material a al menos 2 equivalentes de masa de resina de intercambio iónico Dowex Monosphere 88. La exposición puede producirse mediante agitación en un matraz a 120170 rpm o mediante filtración a través de una columna cargada con suspensión húmeda siempre que el tiempo de residencia sea suficiente para que la disolución logre un pH final de entre 3 y 5. Se aisló la disolución de oligómeros mediante filtración (como en el caso de reacciones agitadas) o elución (como en el caso de filtración en columna) y se repitió el proceso con resina de intercambio iónico Dowex Monosphere 77 de un modo análogo hasta que el pH de la disolución pH estaba por encima de 5,5. Finalmente se expuso la disolución a resina decolorante absorbente Dowex Optipore SD-2 hasta que la disolución estaba suficientemente clarificada y se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros para eliminar finos de resina y resina residual. Entonces se concentró la disolución final hasta 50-85 Brix mediante evaporación rotatoria o hasta un sólido mediante liofilización.
Ejemplo 3. Preparación de alto rendimiento de productos terapéuticos de glicanos a pequeña escala
Se sintetizaron los oligómeros y polímeros tipificados en el ejemplo 1 de un modo en paralelo en placas de 24, 48 o 96 pocillos o de matrices dimensionadas de manera similar de viales de 1 dracma alojados en bloques de calentamiento de aluminio. En este ejemplo, todas las transferencias de líquido se manipularon mediante un robot programable o manualmente usando pipetas calibradas. A cada vial o pocillo se le añadió el 20-100% en peso seco de uno o más de los catalizadores descritos en la patente estadounidense n.° 8.466.242 y el documento WO 2014/031956. Se colocó la placa o bloque de calentamiento sin cubrir en un horno de vacío calentado hasta de 50 a 150°C bajo un vacío de 10-800 mbar. Se protegió la bomba de vacío del horno mediante un condensador de dos fases que consiste en una trampa enfriadora de recirculación seguido por una trampa de hielo seco/acetona. Se calientan las placas o bloques durante de 30 minutos a 6 horas bajo temperatura elevada y presión reducida sin agitar. Tras un periodo de tiempo preestablecido, se ventiló el horno hasta presión atmosférica, se enfriaron las placas o bloques hasta temperatura ambiente, y se diluyó cada pocillo o vial hasta aproximadamente 50 Brix con agua desionizada. Se realizaron las etapas de extracción en fase sólida descritas en el ejemplo 2 mediante elución a través de columnas cargadas en húmedo secuenciales en las que el eluyente de cada columna fluye inmediatamente a la parte superior de la siguiente columna a una velocidad de entre 2 y 6 volúmenes de lecho/hora usando una bomba peristáltica u otra bomba pequeña adecuada. Entonces se enjuagó la pila de columnas con agua desionizada y se concentraron los efluentes combinados mediante liofilización para aislar polvos sólidos con un contenido en agua residual del 1-10% en masa.
Ejemplo 4. Modificación de productos terapéuticos de glicanos mediante eliminación de especies de bajo peso molecular
Se modificaron los oligómeros o polímeros preparados y purificados como en los ejemplos 1 y 2 para eliminar especies de bajo peso molecular. Se logró la separación mediante separación osmótica. Se colocaron aproximadamente 45 cm de tubos de diálisis Biotech CE de MWCO de 1,0 kD (anchura plana de 31 mm) de Spectrum Labs en agua desionizada y se empaparon durante 10 minutos, luego se selló un extremo con una pinza de tubos de diálisis. Se esterilizó por filtración una disolución de 25 Brix de 8 gramos de oligosacárido seco y se selló dentro del tubo con una segunda pinza junto con unos cuantos ml de aire para permitir que el tubo flotara. Entonces se colocó el tubo lleno en un tanque de 11,36 litros (3 galones) de agua desionizada que se agitó con fuerza suficiente como para inducir una agitación lenta de los tubos sellados. Tras 8 horas, se reemplazó el agua del tanque y se permitió que el tubo se agitara durante 16 horas adicionales. Una vez completada la diálisis y que el material tuviese un rendimiento de DP2+ mayor del 95% y un rendimiento de DP3+ mayor del 90%, se esterilizó por
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filtración la disolución diluida y se concentró a vacío hasta una concentración final de aproximadamente 65 Brix o se liofilizó hasta un sólido con una humedad residual de entre el 1 y el 10%. Alternativamente, se logró la separación mediante filtración de flujo tangencial (TFF). En este caso, se colocaron 100 ml de muestra de glicanos de 25 Brix disuelta en agua desionizada y esterilizada por filtración en una botella para alimentación de un sistema de TFF KrosFlo Research IIi de Spectrum Labs que se preparó según la recomendación del fabricante. Entonces se sometió a diafiltración la muestra a través de un filtro de fibra hueca mPES MidiKros de 1 kD a una presión transmembrana de 172 kPa (25 psig). Se usaron las muestras de HPLC de la disolución madre de alimentación tomadas cada 0,5 volúmenes de diafiltración para determinar cuándo el material tenía un rendimiento de DP2+ mayor del 95% y un rendimiento de DP3+ mayor del 90%, momento en el que la disolución se esterilizó por filtración y se concentró a vacío hasta un jarabe de 65 Brix o se liofilizó hasta un sólido con un contenido en agua residual del 1-10% en masa.
Ejemplo 5. Métodos para analizar preparaciones de productos terapéuticos de glicanos
Medición del contenido en glicanos mediante refractometría de líquidos
Se diseñó este experimento para cuantificar la cantidad de glicano en cualquier disolución acuosa dada. Se calibró un refractómetro de azúcar portátil Refracto 30GS de Mettler-Toledo usando agua desionizada por ósmosis inversa de alta pureza. Se filtraron varias gotas de la disolución de glicanos a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros directamente sobre la lente del refractómetro. Se tomó la medición a temperatura ambiente y se notificó como Brix. Los glicanos se concentraron rutinariamente hasta 75 Brix sin solidificación o cristalización obvia a 23°C. Los Brix pueden convertirse entonces en solubilidad suponiendo una densidad específica del agua igual a 1,0 g/ml. Por tanto, 75 Brix (100 gramos de disolución que consiste en 75 gramos de glicano y 25 gramos de agua) son iguales a una solubilidad acuosa de 3,0 g/ml. Como comparación, se notifica que la solubilidad acuosa de D-glucosa es de 0,909 g/ml (48 Brix) a 25°C por Sigma-Aldrich.
Composición monomérica mediante hidrólisis y CG-EM
Se diseñó este experimento para cuantificar la razón de contenido en monómeros dentro de un oligosacárido dado. Se realizó el análisis de la composición de glicosilo mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM) combinadas de los derivados de per-O-trimetilsililo (TMS) de los metilglicósidos de monosacárido producidos a partir de la muestra mediante metanólisis ácida tal como describieron previamente Santander et al. (2013) Microbiology 159:1471. Se liofilizaron entre 100 y 200 pg de muestra dentro de un tubo de ensayo adecuado. Se añadió inositol (20 pg) a la muestra como patrón interno, entonces se calentó la muestra hasta 80°C en HCl 1 M/metanol durante 18 horas. Entonces se reacetilaron los monosacáridos resultantes usando piridina y anhídrido acético en MeOH, y se per-O-trimetilsililaron con Tri-Sil (Pierce) a 80°C durante 30 minutos. El análisis de CG/EM de los metiloglicósidos de TMS se realizó en un instrumento de CG Agilent 7890A interconectado a un instrumento 5975C MSD, usando una columna capilar de sílice fundida Supelco Equity-1 (30 m x 0,25 mm de DI). Se asignó cada pico a un azúcar componente basándose en la comparación con patrones conocidos y la integración de los picos respectivos permitió un cálculo limpio del porcentaje relativo de monómeros dentro de un glicano ejemplificado. En todos los casos sometidos a prueba, la composición de monómeros de un oligosacárido dado coincidía con la razón de entrada dentro del error experimental y la composición de salida coincidía con la composición de entrada dentro de la precisión de la medición.
Distribución de pesos moleculares mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC)
Se diseñó este experimento para cuantificar la distribución de pesos moleculares dentro de un oligosacárido dado. Se realizó la medición mediante HPLC usando el método descrito en la monografía de la farmacopea estadounidense, 38(6) revisión en proceso: heparina sódica (USP37-NF32). Se lograron las separaciones en un sistema de HPLC Agilent 1200 por medio de una columna GE superpose 12 usando acetato de amonio 50 mM como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min y un detector ELSD. La temperatura de la columna se fijó a 30°C y se usó dextrano (peso de 1 kD, 5 kD 10 kD) para dibujar una curva patrón. Se preparó una disolución de 2 mg/ml de las muestras y se hizo pasar a través de un filtro de centrifugadora de 0,45 pm, seguido por inyecciones de 40 pl en la HPLC. Se construyó una curva polinómica de tercer orden basándose en los pesos moleculares logarítmicos y los volúmenes de elución de los patrones enumerados. Se calcularon el peso molecular promedio en peso (Mw), el peso molecular promedio en número (Mn) y el índice de polidispersidad (PDI) para la muestra mediante comparación con la curva patrón. La figura 1 muestra la curva generada durante la evaluación mediante SEC de una muestra de glu100 en la que se determinó que el peso molecular promedio era de 1212 g/mol o aproximadamente DP7. El extremo superior del peso molecular del material se definió mediante el punto de la curva al 10% de absorción máxima por delante de la curva se determinó que era de 4559 g/mol o aproximadamente DP28. El extremo inferior del peso molecular del material tal como se definió mediante el 10% de la absorción máxima por detrás de la curva se determinó que era de 200 g/mol o aproximadamente DP1. El análisis similar de una muestra de glu50gal50 mostró un MW, masa alta y masa baja de 1195 g/mol (~DP7), 4331 g/mol (~DP27) y 221 g/mol (~DP1) respectivamente.
Distribución de pesos moleculares mediante cromatografía de afinidad iónica (IAC)
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La proporción de glicano con DP mayor de o igual a 2 (DP2+) y 3 (DP3+) puede medirse mediante cromatografía de afinidad iónica. Se diluyó una muestra de glicano hasta 50-100 mg/ml y se inyectaron 10 pl de esta disolución sobre un aparato de HPLC Agilent 1260 BioPure equipado con una columna BioRad Aminex HPX-42A de 7,8x300 mm y detector de RI. Usando agua de calidad para HPLC pura como eluyente, se eluyó la muestra a 0,6 ml/min a través de una columna a 80°C y un detector de RI mantenido a 50°C. Los picos que representan DP1-6 se asignan mediante comparación con patrones de referencia y se integran usando el software Agilent ChemStation. Los picos se integran normalmente como DP1, DP2, DP3, DP4-7 y DP8+. El DP que puede lograrse mediante la reacción descrita en el ejemplo 1 varía de monómero a monómero aunque es constante a través de los lotes si el procedimiento se sigue correctamente, por ejemplo la glucosa logra de manera fiable valores de DP mayores que la arabinosa. Por ejemplo, a través de 17 lotes de glu100, los valores de DP2+ oscilaron entre el 85-93% y los valores de DP3+ oscilaron entre el 80-90%. A la inversa, a través de 6 lotes de ara100, los valores de DP2+ oscilaron entre el 63-78% y los valores de DP3+ oscilaron entre el 48-71%. Las mezclas de monómeros se comportaban como promedios de los componentes individuales.
Distribución alfa-/beta mediante RMN 2D
Se diseñó este experimento para cuantificar la razón de enlaces glicosídicos alfa y beta dentro de una muestra dada mediante RMN bidimensional. Se secaron aproximadamente 150 mg de disolución de oligosacáridos de 65 Brix hasta lograr una masa estable en un horno de vacío a 45-95°C bajo una presión de 400 mbar. Se sometió la muestra a dos ciclos de disolución en D2O y secado para eliminar el H2O residual. Una vez secada, se disolvió la muestra en 750 pl de D2O con acetona al 0,1%, se colocó en un tubo de RMN de 3 mm, y se analizó en un instrumento Bruker Avance-III que funcionaba a 500,13 MHz 1H (125,77 MHz 13C) equipado con una sonda Bruker BBFO que funcionaba a 21,1 °C. Se analizó la muestra usando una secuencia de pulsos de coherencia de un único cuanto heteroatómica (HSQC) usando la secuencia de pulsos de Bruker convencional. Se asignaron protones anoméricos entre 4-6 ppm (1H) y 80-120 ppm (13C) mediante analogía a glucosa tal como se notifica en Roslund, et al. (2008) Carbohydrate Res. 343:101-112. Se referenciaron los espectros a la señal de acetona interna: 1H - 2,22 ppm; 13C - 30,8 ppm. Se cuantificaron los isómeros mediante integración de sus picos respectivos usando el paquete de software MNova de Mestrelab Research (Santiago de Compostela, España). La figura 2 muestra la región anomérica de un espectro representativo. La tabla 6 enumera la distribución a través de 13 combinaciones distintas de monómeros mostrando que la razón alfa/beta es tan alta como 4:1 como en el de rha100 y tan baja como 1:1 como en el caso de glu50gal50.
Tabla 6: Distribución de enlaces alfa y beta a través de lotes y tipos de glicanos
glicanos
Enlaces alfa (%) Enlaces beta (%)
Glu100
58 42
61 39
60 40
Gal100
60 40
Glu50gal50
50 50
56 44
Glu33gal33fuc33
55 45
Man100
57 43
Man52glu29gal19
76 24
Ara100
67 33
Rha100
80 20
Xyl100
57 43
59 41
Xyl75gal25
56 44
Identificación de la composición mediante RMN
Se diseñó este experimento para identificar la composición de un glicano mediante identificación por RMN 2D identificación de los monómeros constituyentes. Se secaron aproximadamente 150 mg de disolución de oligosacáridos de 65 Brix hasta una masa estable en un horno de vacío a 45-95°C bajo una presión de 400 mbar. Se sometió la muestra a dos ciclos de disolución en D2O y secado para eliminar el H2O residual. Una vez secada, se disolvió la muestra en 750 pl de D2O con acetona al 0,1%, se colocó en un tubo de RMN de 3 mm, y se analizó en un instrumento en un instrumento Bruker Avance-III que funcionaba a 500,13 MHz 1H (125,77 MHz 13C) equipado
con una sonda Bruker BBFO que funcionaba a 702C. Se analizó la muestra usando una secuencia de pulsos de coherencia de un único cuanto heteroatómica (HSQC) usando la secuencia de pulsos de Bruker convencional. Entonces se examinó la región anomérica de cada espectro de glicano derivado de un único monómero de azúcar para detectar picos que representan enlaces glicosídicos específicos característicos de ese monómero. Debido a la 5 naturaleza de espín aislado de los anillos de hidrato de carbono individuales dentro de los polisacáridos, se predice que los espectros de HSQC de un glicano con más de un monómero están representados por la suma de los picos de HSQC de cada uno de sus azúcares constituyentes. Por tanto, cada monómero constituyente tiene picos de HSQC únicos que aparecerán en cada glicano que contiene ese monómero independientemente de otros monómeros constituyentes y, además, los monómeros usados para sintetizar un glicano pueden determinarse 10 identificando los picos de huellas únicos para cada monómero constituyente. Por ejemplo, la figura 3 muestra que los espectros de HSQC de glu50gal50 son un híbrido de los espectros de glu100 y gal 100. La tabla 7 enumera los picos de huellas para unidades de glicano seleccionadas.
Tabla 7: Picos de HSQC de diagnóstico para cada azúcar componente.
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Monómero
desplazamiento de 1H desplazamiento de 13C Monómero desplazamiento de 1H desplazamiento de 13C
Glucosa
5,42 92,5 Xilosa 5,18 93,0
5,21 92,8 5,10 94,3
5,18 93,9 5,34 98,2
5,08 97,0 5,31 99,6
5,36 98,4 5,11 100,8
5,34 99,8 4,91 99,4
5,38 100,3 4,56 97,3
4,95 98,6 4,64 104,2
4,62 96,6 4,54 103,4
4,70 103,6 4,44 102,6
4,49 103,4 4,44 104,1
Galactosa
5,37 92,9 Arabinosa 5,22 93,2
5,24 93,1 5,13 93,2
5,14 96,0 5,29 96,0
4,96 99,3 5,26 97,2
5,31 98,7 5,12 96,6
5,39 101,4 5,18 99,6
5,00 101,8 5,06 99,2
4,80 101,3 4,99 100,0
4,63 97,0 5,26 101,9
4,56 97,2 5,06 102,1
4,53 103,1 4,55 97,4
4,43 104,1 4,54 105,2
Fucosa
5,18 92,9 4,50 105,5
5,33 92,4 4,38 103,9
5,04 96,3 Ramnosa 5,21 93,2
4,90 99,7 5,10 94,5
4,52 97,0 4,85 94,1
4,39 103,6 5,01 95,8
Manosa
5,37 93,0 5,35 100,5
5,16 94,6 5,15 102,2
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4,88 94,2 5,04 102,9
5,39 101,7 4,78 97,9
5,24 101,9 4,71 99,0
5,13 102,8 4,72 101,0
5,03 102,7
5,24 105,6
5,09 108,0
4,88 94,2
4,89 100,0
4,70 101,1
Aparecieron al menos 5 picos para cada unidad de glicano usada como material de partida en la síntesis de un producto terapéutico de gicanos que contenía 3 o menos unidades de glicano distintas. Los espectros de HSQC de productos terapéuticos de glicanos que contienen 4 o más unidades de glicano distintas tienen al menos 4 picos para cada unidad de glicano constituyente.
Análisis de ramificación
Se diseñó este experimento para cuantificar la distribución de regioisómeros glicosídicos (ramificación) dentro de un oligosacárido dado. Para el análisis de uniones de glicosilo, se permetilaron las muestras, se despolarizaron, se redujeron y se acetilaros; y se analizaron los acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAA) resultantes cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) tal como describen Heiss et al (2009) Carbohydr. Res. 344:915. Se suspendieron las muestras en 200 pl de dimetilsulfóxido y se dejaron agitar durante 1 día. Se efectuó la permetilación mediante dos rondas de tratamiento con hidróxido de sodio (15 min) y yoduro de metilo (45 min). Se hidrolizó la disolución acuosa mediante adición de ácido trifluoroacético 2 M y calentamiento hasta 121 °C durante 2 horas. Se aislaron los sólidos a vacío y se acetilaron en ácido acético/ácido trifluoroacético. Se analizaron los PMAA resultantes en un instrumento de CG Agilent 7890A interconectado a un instrumento 5975C MSD (detector selectivo de masas, modo de ionización por impacto electrónico); se realizó la separación en una columna capilar de sílice fundida unida Supelco SP-2331 de 30 m. La figura 4 muestra tres espectros de CG representativos de este análisis. Estos análisis muestran que los glicanos tenían al menos el 0,1-10% de cada uno de los tipos de enlaces glicosídicos 1,2; 1,3; 1,4 y 1,6. Los materiales también contenían al menos el 5% de los tipos de enlaces ramificados (incluyendo pero sin limitarse a glicósidos 1,3,6; 1,4,6; o 1,2,4) y al menos el 3% de las unidades monoméricas existían en forma de furanosa. Un glicano que se originaba a partir de un único monómero consistía en al menos 12 patrones de sustitución no terminal distintos. Un glicano que se originaba a partir de dos monómeros consistía en al menos 18 patrones de sustitución no terminal distintos. Un glicano que se originaba a partir de tres o más monómeros consistía en al menos 24 patrones de sustitución no terminal distintos.
Ejemplo 6. Recogida de muestras fecales
Se recogieron muestras fecales proporcionando a los sujetos el sistema de recogida de muestras Fisherbrand Commode (Fisher Scientific) e instrucciones asociadas para su uso. Se almacenaron las muestras recogidas con paquetes de hielo o a -80°C hasta su procesamiento (McInnes & Cutting, Manual of Procedures for Human Microbiome Project: Core Microbiome Sampling Protocol A, v12.0, 2010,
hmpdacc.org/doc/HMP_MOP_Version12_0_072910.pdf). También pueden usarse dispositivos de recogida alternativos. Por ejemplo, pueden recogerse muestras en el recipiente con tapón de rosca Globe Scientific con cuchara (Fisher Scientific) o el sistema de recogida OMNIgene-GUT (DNA Genotek, Inc.), que estabiliza el ADN microbiana para la extracción y el análisis posteriores del ácido nucleico. A los sujetos que donaron las muestras fecales se les proporcionó las instrucciones suministradas por el fabricante para el uso de cada dispositivo de recogida. Se almacenaron alícuotas de muestras fecales a -80°C siguiendo protocolos convencionales conocidos por un experto en la técnica.
Ejemplo 7. Determinación del título de muestras microbianas recogidas de heces y muestras de cultivo
Para determinar el título de bacterias comunes del tubo digestivo, se recogieron muestras fecales tal como se describió en el ejemplo 6 y se prepararon como suspensiones al 10% peso/volumen en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Se prepararon diluciones en serie de diez veces en PBS estéril y se sembraron en placa (100 pl por dilución) en agar de sangre de Brucella (Anaerobe Systems; incubado anaeróbicamente para titular de manera no selectiva un elemento común de la microbiota intestinal, incluyendo Bacteroides, o incubado aeróbicamente para titular de manera no selectiva anaerobios facultativos tales como Proteobacteria). También pueden usarse agar de bilis esculina de Bacteroides (Anaerobe Systems; cultivado anaeróbicamente para titular el
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grupo de Bacteroides fragilis), agar de fructosa cicloserina-cefoxitina (Anaerobe Systems; cultivado anaeróbicamente para titular Clostridium difficile), agar de Lactobacillus-MRS (Anaerobe Systems; cultivado anaeróbicamente para titular Lactobacillus), agar azul de metileno eosina (Teknova; cultivado aeróbicamente para titular Escherichia coli y otras bacterias entéricas Gram-negativas), agar de bilis esculina (BD; cultivado aeróbicamente para titular especies de Enterococcus), agar selectivo de Bifidobacterium (Anaerobe Systems; para titular especies de Bifidobacterium) o agar de MacConkey (Fisher Scientific; para titular E. coli y other bacterias entéricas Gram-negativas). Se incubaron las placas a 37°C en condiciones aerobias o anaerobias según fuese apropiado para la especie diana. Tras 24-48 horas, se contaron las colonias y se usaron para calcular retrospectivamente la concentración de células viables en la muestra original.
Para cultivar de manera no selectiva muestras que contienen bacterias recogidas de un modelo de animal de laboratorio o ser humano, se usaron medios ricos o agar tales como agar de sangre de Brucella (Anaerobe Systems), caldo de infusión de cerebro-corazón (Teknova) o caldo de glucosa y carne picada (Anaerobe Systems). Se usó una formulación de medios mínimos tal como M9 (Life Technologies) complementado con aminoácidos, fuentes de carbono u otros nutrientes según fuese necesario para cultivar de manera no selectiva bacterias durante ensayos in vitro que sometían a prueba los efectos de glicanos u otros compuestos sobre las poblaciones bacterianas. Alternativamente, se usaron otras formulaciones de medios mínimos conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, tal como se notifica en Martens et al. (Mucosal Glycan Foraging Enhances Fitness and Transmission of a Saccharolytic Human Gut Bacterial Symbiont, 2008, Cell Host & Microbe, 4:447-457). Alternativamente, se usaron suspensiones fecales a una concentración del 0,1%-10% peso/volumen en PBS en presencia o ausencia de elementos de medios adicionales para ensayos in vitro que sometían a prueba los efectos de glicanos u otros compuestos sobre las poblaciones bacterianas.
Ejemplo 8. Ensayos de crecimiento de cepas individuales
Se realizó un ensayo in vitro para evaluar la capacidad de diversas cepas bacterianas, incluyendo comensales y patógenos del tubo digestivo, para utilizar diferentes glicanos como sustratos de crecimiento. Se diseñó este ensayo para evaluar la capacidad de glicanos seleccionados para promover el crecimiento de microbiota de un estado sano. Adicionalmente, se comparó la capacidad de glicanos seleccionados para promover el crecimiento de comensales con la capacidad de los glicanos para promover el crecimiento de microbios asociados con un estado patológico. Sometiendo a prueba preparaciones de glicanos frente a un panel de bacterias (individualmente) que son características de un estado sano o patológico, pueden seleccionarse preparaciones de glicanos que potencian selectivamente el crecimiento de bacterias de un estado sano con respecto a bacterias de un estado patológico. Se manipularon las cepas bacterianas en todas las etapas en una cámara anaerobia (AS-580, Anaerobe Systems) que presentaba un catalizador de paladio. Inicialmente, se hizo anaerobia la cámara mediante purga con una mezcla de gases anaerobia del 5% de hidrógeno, el 5% de dióxido de carbono y el 90% de nitrógeno y posteriormente se mantuvo en un estado anaerobio usando esta misma mezcla de gases anaerobia. Se confirmó la anaerobiosis de la cámara diariamente usando tiras indicadoras anaerobias Oxoid que cambian de color en presencia de oxígeno. Todos los medios de cultivo, placas de ensayo, otros reactivos y materiales consumibles de plástico se redujeron previamente en la cámara anaerobia durante 24-48 horas antes del contacto con las bacterias. Se prepararon los glicanos ara50gal50, glu33gal33fuc33, glu50gal50, gal100, glu100, ara50xil50, xyl100, ara100, ara60xil40, rha100, gal75xyl25, glu90gly10, man62glu38, man52glu29gal19, y dos controles disponibles comercialmente: fibra de acacia (Acacia Fiber Organic Powder; NOW Foods, Bloomingdale IL) y FOS (Nutraflora FOS; NOW Foods, Bloomingdale IL) al 5% p/v en agua, se esterilizaron por filtración y se añadieron a placas de ensayo Costar 3370 para lograr una concentración final del 0,5% p/v en el ensayo, con cada glicano se sometió a ensayo en dos pocillos no adyacentes y dextrosa y agua suministradas como controles positivo y negativo.
Se obtuvieron aislados bacterianos de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y el Leibniz Institute DSMZ- German Institute of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). 8 especies comensales (Bacteroides caccae ATCC 43185 “BCA.26”, Prevotella copri DSM 18205 “PCO.72”, Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741 “BTH.8”, Bacteroides cellulosilyticus DsM 14838 “BCE.71”, Clostridium scindens ATCC 35704 “CSC.32”, Ruminococcus obeum ATCC 29714 “ROB.74”, Clostridium nexile AtCC 27757 “CNE.31” y Parabacteroides distasonis ATCC 8503 “PDI.6”) y tres especies patógenas (Clostridium difficile ATCC BAA-1382 “CDI.23” y ATCC 43255 “CDI.24”, Enterococcus faecium AtCc 700221 “EFM.66” y Salmonella enterica ATCC 27869 “sEn.52”) se hicieron crecer anaeróbicamente sobre agar de sangre de Brucella (Anaerobe Systems), un medio enriquecido reducido previamente que incluye digestos enzimáticos de caseína y tejidos animales, extracto de levaduras, cloruro de sodio, dextrosa, bisulfito de sodio, sangre de oveja, hemina y vitamina K1, durante 18-48 horas a 37°C. La especie comensal Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835 “AMU.73” se hizo crecer anaeróbicamente en placas de agar MTGE (Anaerobe Systems), un medio rico que incluía una formulación de proteína, extracto de levaduras, vitamina K1 y ácidos grasos volátiles. Se prepararon inóculos raspando las colonias de las placas de agar, suspendiéndolas en tampón fosfato, determinando la densidad óptica de las suspensiones celulares a 600 nM (DO600) en una placa de ensayo de fondo plano de 96 pocillos de poliestireno Costar 3370 usando un lector de placas Biotek Synergy 2 con el software de lector de microplacas Gen5 2.0 All-In-One según el protocolo del fabricante, y diluyendo las células hasta DO600 0,01-0,02 final en medios definidos y semidefinidos que se prepararon sin azúcares. Se sometieron a prueba aislados de D. formicigenerans, P. distasonis, C. difficile y E. faecium en cloruro de sodio 900 mg/l, cloruro de calcio dihidratado 26 mg/l, cloruro de magnesio hexahidratado 20 mg/l, cloruro de manganeso
5
10
15
20
25
30
35
tetrahidratado 10 mg/l, sulfato de amonio 40 mg/l, sulfato de hierro heptahidratado 4 mg/l, cloruro de cobalto hexahidratado 1 mg/l, fosfato de potasio dibásico 300 mg/l, fosfato de sodio dibásico 1,5 g/l, bicarbonato de sodio 5 g/l, biotina 0,125 mg/l, piridoxina 1 mg/l, pantotenato 1 m/l, histidina 75 mg/l, glicina 75 mg/l, triptófano 75 mg/l, arginina 150 mg/l, metionina 150 mg/l, treonina 150 mg/l, valina 225 mg/l, isoleucina 225 mg/l, leucina 300 mg/l, cisteína 400 mg/l y prolina 450 mg/l (Theriot CM et al. Nat Commun. 2014; 5:3114), complementado con el 3,5% (v/v) de caldo de glucosa y carne picada (CMG, Anaerobe Systems), un medio rico que incluye extracto de levaduras, peptona, ternera picada y tampón fosfato. Se sometieron a prueba B. thetaiotaomicron, B. caccae, B. cellulosiliticus y S. entérica en tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 7,2), cloruro de sodio 15 mM, sulfato de amonio 8,5 mM, L-cisteína 4 mM, hematina 1,9 pM, L-histidina 200 pM, cloruro de magnesio 100 pM, sulfato de hierro heptahidratado 1,4 pM, cloruro de calcio 50 pM, vitamina K3 1 pg/ml y vitamina B12 5 ng/ml (Martens EC et al. Cell Host & Microbe 2008; 4, 447-457). Se sometieron a prueba C. scindens, P. copri y R. obeum en peptona triptona 10 g/l, extracto de levaduras 5 g/l, clorhidrato de L-cisteína 0,5 g/l, tampón fosfato de potasio 0,1 M pH 7,2, vitamina K3 1 pg/ml, cloruro de calcio 0,08% p/v, sulfato de hierro heptahidratado 0,4 pg/ml, resazurina 1 pg/ml, hematina 1,2 pg/ml, histidina 0,2 mM, Tween 80 al 0,05%, extracto de carne al 0,5% (Sigma), suplemento de oligoelementos al 1% (ATCC), suplemento de vitaminas al 1% (ATCC), ácido acético al 0,017% v/v, ácido isovalérico al 0,001% v/v, ácido propiónico al 0,2% v/v y ácido N-butírico al 0,2% v/v (Romano KA et al. mBio 2015; 6(2):e02481-14); para C. nexile y A. muciniphila, se complementó este medio con el 3,5% v/v final de caldo CMG. Se expusieron las bacterias a los glicanos ara50gal50, glu33gal33fuc33, glu50gal50, gal100, glu100, ara50xyl50, xyl 100, ara100, ara60xil40, rha100, gal75xyl25, man62glu38, man52glu29gal19, fibra de acacia comercial, FOS comercial y dextrosa a una concentración final del 0,5% p/v en microplacas de 96 pocillos, 200 pl de volumen final por pocillo, a 37°C durante 18-48 horas, anaeróbicamente, hasta que se observó turbidez en los pocillos de control de crecimiento positivo que contenían dextrosa al 0,5% p/v. Se obtuvieron mediciones de DO600 para cada aislado al final del periodo de incubación usando un lector Biotek Synergy2 con el software Gen5 2.0 según las especificaciones del fabricante. Se normalizaron las medicones dividiendo las lecturas de DO600 del aislado en los glicanos de prueba entre la DO600 del aislado en medio complementado con dextrosa al 0,5% p/v para facilitar la comparación de la utilización de glicanos por cepas que crecen dentro de intervalos de DO600 significativamente diferentes. Las tablas 8 y 9 resumen los resultados obtenidos.
Leyenda de los glicanos
N.° de glicano
Identidad de glicano % de DP3+
1
gal75xyl25 50
2
glu50gal50 68-80
3
gal100 78-83
4
glu33gaB3fuc33 54-82
5
man62glu38 63
6
ara50gal50 73
7
glu100 79-80
8
man52glu29gal19 47-77
9
xyl100 37-73
10
ara50xyl50 63
11
ara100 48-85
12
ara60xyl40 70
13
rha100 45-49
14
FOS
15
fibra de acacia
La mayoría de los glicanos soportaban el crecimiento de las cepas comensales sometidas a prueba en este ensayo. Gal75xyl25, glu33gal33fuc33, glu50gal50, gal100, man62glu38, ara50gal50, glu100, man52glu29gal19, ara50xyl50 xyl100 y ara100 soportaban el crecimiento de al menos 5 de 9 comensales (véase la tabla 8).
Tabla 8: Crecimiento de bacterias comensales soportado por bacterias
Aislados Comensales, crecimiento normalizado promedio (NG)
N.° de glicano
PDI. BTH. BCA. CNE. CSC. BCE. PCO. AMU. ROB.
con NG
>0,2
6 8 26 31 32 71 72 73 74
1
9/9 +++ 4+ ++ 4 4 44 444 44 4
2
9/9 444 + 44 4 4 44 444 4 4
3
9/9 444 + + 4+ 4 4 ++ + 4
4
9/9 444 + + 4 4 4 44
4
4
5
8/9 +++ 44 44 + + 44 - + +
6
8/9 444 + 4- - 4 4 44 4 4
1
8/9 +++ + + 4 - 4 44 + 4
8
7/9 +++ + 4 - 4 4 - 4 4
9
6/9 444 4 4 - - 4 44 - 4
10
6/9 44 4 + - - 4 44 - 4
11
5/9 - + 4 - - 4 44 - 4
12
4/9 44 - 4 - - 4 4 - -
13
2/9 - - - - - - 4 - 4
14
5/9 444 ++ 44 - - - 44 - 44
15
1/9 4 - - - - - - - -
Leyenda de los símbolos
Símbolo
NG
-
<0,2
4
0,2-6
44
0,6-1,2
444
>1,2
Algunos glicanos soportaron el crecimiento de comensales sometidos a prueba mejor que los patógenos seleccionados: ara50gal50, glu33gal33fuc33, gal100, glu100 ara50xyl50, xyll 00 y control de FOS comercial 5 soportaron el crecimiento de 5 o más de 9 aislados comensales y 2 o menos de 4 aislados patógenos, con valores de crecimiento normalizados de al menos 0,2. En el ensayo, glu50gal50 y gal75xyl25 soportaron cada uno la mayoría de los comensales y patógenos con valores de crecimiento normalizados de al menos 0,2; sin embargo, soportaron un nivel superior de crecimiento con una fracción mayor de comensales que patógenos: gal75xyl25 produjo valores de crecimiento normalizados >0,6 para 6 de 9 comensales y 1 de 4 patógenos, y glu50gal50 produjo 10 valores de crecimiento normalizados >0,6 para 4 de 9 comensales y 0 de 4 patógenos. En el ensayo, un glicano soportó el crecimiento de patógenos así como comensales: man62glu38 soportó el crecimiento de 4 de 4 patógenos y al menos 8 de 9 comensales con valores de crecimiento normalizados de al menos 0,2 y 3 de 4 patógenos y 6 o menos de 9 comensales con valores de crecimiento normalizados >0,6. En el ensayo, un glicano no soportó una mayoría de comensales o patógenos: rha100 y control de fibra de acacia comercial no soportaron 2 o menos de 9 15 comensales y 2 o menos de 4 patógenos con valores de crecimiento normalizados de >0,2 (véase la tabla 9).
Tabla 9: Crecimiento diferencial de comensales y bacterias patógenas sobre glicanos seleccionados
5
10
15
20
25
30
de glica- no
Patógenos Comensales Patógenos
Comensales con NG>0,2
con NG >0,2 PDI *6 BTH .8 BCA .26 CNE .31 CSC .32 BCE .71 PCO .72 AMU .73 ROB .74 CDI .23 CDI .24 SEN .52 EFM .66
3
9/9 0/4 I+-H- + + ++ + + ++ + + - - - -
7
8/9 2/4 -H++ + + + - + ++ + + 4- - - 4-
6
8/9 0/4 +++ -i- -i- - + + 4-4- + 4- - - - -
10
6/9 0/4 ++ + + - - 4- ++ - + - - - -
9
6/9 0/4 4-4-4- + + - 4-4- - + - - - -
14
5/9 1/4 +++ ++ ++ - - - ++ . ++ - - - 4-
1
9/9 3/4 +++ ++ ++ + + ++ +++ ++ + 4- - 4- 4-
i
9/9 4/4 +++ + ++ + + ++ + + + + + 4-4-
5
8/9 4/4 +++ ++ 4-4- + + ++ - + + ++ 4-4- + ++
13
2/9 0/4 - - - - - - + - + - -
15
1/9 2/4 + - - - - - - 4- - - 4-
Leyenda de los símbolos
Símbolo
NC
-
<0,2
+
0,2-6
++
0,6-1,2
+++
>1,2
Estos datos sugieren que los productos terapéuticos de glicanos soportan el crecimiento de bacterias comensales y determinados subgrupos de glicanos soportan de manera diferencial el crecimiento de comensales son respecto a patógenos.
Ejemplo 9. Efecto de glicanos sobre poblaciones microbianas in vitro
Para determinar la composición de glicanos deseada, se hacen crecer cultivos bacterianos en presencia de glicanos candidatos y se someten a ensayo para determinar su crecimiento, composición de la comunidad (por ejemplo, mediante secuenciación del gen de ARNr 16S), producción de metabolitos y propiedades fenotípicas o transcriptómicas. Se seleccionan glicanos deseados basándose en su capacidad para provocar propiedades deseadas dentro del cultivo bacteriano. Los cultivos bacterianos incluyen monocultivos, cultivos mixtos, cultivos aislados de seres humanos o modelos de animales de laboratorio, cultivos aislados de un ser humano o modelo de animal de laboratorio y adiciones conocidas con un aislado o colección de aislados, o cultivos aislados de un ser humano o modelo de animal de laboratorio y empobrecido en una colección de especies (por ejemplo, mediante aplicación de an antibiótico). El título de los cultivos bacterianos se determina como en el ejemplo 7 y la composición y propiedades de los cultivos bacterianos se cuantifican tal como se describe en el presente documento o usando protocolos convencionales. Este ensayo puede realizarse en presencia de antibióticos o u otros compuestos de prueba. Los resultados obtenidos a partir de los ensayos in vitro se comparan con los obtenidos tras tratar seres humanos con glicanos o administrar los glicanos a un animal de laboratorio en un modelo animal tal como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 10 y ejemplo 12, estableciendo así la correlación in vitro - in vivo de los resultados.
Ejemplo 10. Efecto de glicanos sobre la microbiota intestinal de ratones sin tratamiento previo
Este experimento se llevó a cabo para evaluar el efecto de productos terapéuticos de glicanos sobre la microbiota intestinal y el peso a corto plazo de ratones sin tratamiento previo. En este modelo, se les administró a ratones normales glicanos en su agua potable a lo largo de un periodo de 6 días con muestras fecales tomadas de cada ratón para el análisis del ARNr 16S.
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10
15
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30
35
40
45
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60
65
Se alojaron ratones C57B1/6 (B6N Tac), libres de patógenos de ratón (MPF; Taconic Biosciences, Germantown, NY) con edades de 8-10 semanas, individualmente en jaulas, con 6 animales grupo de dosis. Se alimentó a los animales con dieta de roedores PicoLab 20 (“5053”; LabDiet, St. Louis, MO) o dieta sin fibra (“ZFD”; dieta de roedores modificada AIN-93G: D15091701, Research Diets, New Brunswick, NJ) a voluntad a lo largo del transcurso del estudio y tenían libre acceso al agua. Se mantuvieron los ratones es un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Se aclimataron los ratones durante 7 días (días -7 a -1) antes de la administración de glicanos.
Se administraron los glicanos a los ratones mediante inclusión en su agua potable al 1% peso/volumen (p/v) desde el día 0 hasta el día 5. Los ratones de control recibieron agua que no contenía glicanos. Se realizaron recogidas fecales nuevas para cada ratón desde los días -2 hasta 5. Se monitorizaron los pesos de los ratones los días -1, 1,3 y 4. Los pesos corporales de los ratones no cambiaron significativamente a lo largo del transcurso del estudio.
Se extrajo el ADN genómico de las muestras fecales y se amplificó y secuenció la región variable 4 del gen de ARNr 16S (Earth Microbiome Project protocol
www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/16s/ y Caporaso JG et al. 2012. Ultrahigh-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J.). Se generaron unidades taxonómicas operacionales (OTU) alineando las secuencias de ARNr 16S al 97% de identidad. Se compararon las comunidades microbianas entre sí usando la métrica de distancia UniFrac (Lozupone C. et al., Appl. Environ. Microbiol. Diciembre de 2005 vol. 71 n.° 12 8228-8235).
Se observaron cambios significativos cuando se les administró a los ratones una preparación de xyl100. Las distancias de UniFrac entre la microbiota muestreada un día antes y 5 días después de la administración de glicanos fueron significativamente mayores en ratones tratados con xilosa en comparación con ratones que no recibieron ningún glicano (p=0,0043, prueba de Mann-Whitney, figura 7). Se midió la diversidad alfa mediante el índice de Shannon calculado en la microbiota antes y después de la administración de glicanos o agua. El índice de Shannon disminuyó significativamente tras 5 días de administración de xilosa (p=0,0313, prueba apareada de Wilcoxon, figura 8).
Los cambios en los desplazamientos observados con administración de xilosa se atribuyeron a un aumento en la abundancia relativa de secuencias asignadas al género Akkermansia (filo Verrucomicrobia, p=0,0313, prueba apareada de Wilcoxon, figura 9a) y al género Blautia (filo Firmicutes, familia Lachnospiraceae, p=0,0313, prueba apareada de Wilcoxon, figura 9b).
La especie de Akkermansia más relevante en el intestino de mamíferos es Akkermansia muciniphila. Su fuente de energía preferida es la mucina intestinal del huésped. El consumo de una dieta baja en fibra y una alta ingesta de azúcares simples y grasa da como resultado una producción de moco disminuida (British Journal of Nutrition / volumen 102 / tema 01 / julio 2009, pág. 117-125, Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization, Earle KA et al, Cell Host Microbe. 14 de octubre de 2015; 18(4):478-88). El adelgazamiento del moco intestinal puede dar como resultado un aumento de la permeabilidad del intestino y la translocación de microorganismos o sus componentes, tales como lipopolisacárido (LPS), lo que induce inflamación. Los niveles de LPS aumentan tras el consumo de dieta alta en grasas en roedores, que entonces desarrollan síndrome metabólico (Metabolic endotoxemia initiates obesity and insulin resistance, Cani PD et al, Diabetes. Julio de 2007; 56(7):1761-72).
Aunque no se mostró que Akkermansia muciniphila degradara xilosa in vitro (ejemplo 8, tabla 8, AMU.73), otras especies pueden ser responsables de la fermentación primaria de xyl100, tales como, por ejemplo, Bacteroidetes, lo que a su vez puede inducir el crecimiento de Akkermansia. Por ejemplo, la colonización de ratones libres de gérmenes con Bacteroides thetaiotaomicron induce la producción de moco por células caliciformes intestinales (Wrzosek et al. BMC Biology 2013 11:). Esto puede crear un entorno favorable para el crecimiento de Akkermansia. El consumo moco por Akkermansia puede estimular un aumento de la producción de moco y desempeñar un papel en la restauración de la barrera intestinal que impide la fuga de LPS de endotoxinas bacterianas. La disminución de la endotoxemia reduce la inflamación y puede aliviar síntomas que están asociados con síndrome metabólico. Por ejemplo, la administración de FOS o Akkermansia muciniphila a roedores en un modelo de obesidad inducida por la dieta puede dar como resultado niveles disminuidos de LPS en suero y peso corporal y masa grasa reducidos. (Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity, Everard A, PNAS. 28 de mayo de 2013; 110(22):9066-71).
Se ha mostrado que metabolitos de Akkermansia muciniphila, incluyendo el SCFA propionato, reducen la expresión de reguladores de la adiposidad Gpr43 y receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas y aumentan la expresión de los reguladores génicos histona desacetilasas Hdac3 y Hdac5 (Lukovac et al. 2014. Diferenteial Modulation by Akkermansia muciniphila y Faecalibacterium prausnitzii of Host Peripheral Lipid Metabolism and Histone Acetilation in Mouse Gut Organoids mBio 5(4):e01438-14). Los productos terapéuticos de glicanos, cuando se administran en una cantidad eficaz, pueden modular especies bacterianas que producen SCFA y de ese modo modular la adiposidad y obesidad del huésped. En el ensayo in vitro (ejemplo 8), el crecimiento de AMU.73, un aislado de A. muciniphila, estaba soportado por 8 de 15 glicanos, tal como se muestra en la tabla 8.
Ejemplo 11. Modelos de cocultivo in vitro para someter a prueba el efecto de glicanos sobre las respuestas del huésped a comunidades bacterianas en sitios intestinales
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Las bacterias pueden provocar tanto respuestas proinflamatorias como antiinflamatorias a partir de células huésped (mamífero), y diferentes especies bacterianas pueden provocar diferentes respuestas del huésped. Se usan preparaciones de glicanos para alterar la población bacteriana para provocar una respuesta del huésped deseada. Se usa un modelo de cocultivo in vitro para medir las respuestas del huésped provocadas por poblaciones bacterianas hechas crecer en presencia de glicanos. Los glicanos que promueven poblaciones bacterianas que provocan respuestas del huésped beneficiosas o minimizan respuestas del huésped perjudiciales se seleccionan usando este ensayo.
Se usan líneas de células epiteliales o tejidos del intestino en un modelo de cocultivo (Haller D, Bode C, Hammes WP, Pfeifer AMA, Schiffrin EJ, Blum S, 2000. Non-pathogenic bacteria elicit a diferenteial cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47:79-97) (Borruel et al., 2003. Effects de nonpathogenic bacteria on cytokine secretion by human intestinal mucosa. Am J Gastroenterology. 98:865-870). Se siembran células CaCO- 2 similares a enterocitos humanos a una densidad de 2,5 x 105 células/ml sobre insertos de cultivo celular de 25 mm (tamaño de nucleoporo de 0,4 pm; Becton Dickinson). Se colocan los insertos en placas de cultivo tisular de 6 pocillos (Nunc) y se cultivan 18-22 días a 37°C/el 10% de CO2 en DMEM (glutamina, alto contenido en glucosa; Amimed) complementado con suero de ternero fetal inactivado por calor al 20% (56°C, 30 minutos; Amimed), aminoácidos no esenciales MEM al 1% (Gibco BRL), gentamicina 10 pg/ml (Gibco BRL) y penicilina/estreptomicina al 0,1% (10000 UI/ml/10000 UG/ml; Gibco BRL). Se cambia el medio de cultivo celular cada dos días hasta que las células se diferencian completamente. Alternativamente, se usa un modelo de tejido reconstruido tridimensional producido a partir de fibroblastos y células epiteliales y endoteliales de intestino delgado derivadas de células normales, humanas (modelo EpiIntestinal; MatTek Corporation, Ashland, MA). Se determina la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) usando un voltímetro/MultiCell-ERS voltmeter/ohmímetro. Se lavan los insertos de cultivo dos veces con medio libre de antibiótico precalentado para exponer con cultivos bacterianos. Por separado, se hacen crecer los cultivos bacterianos en presencia de preparaciones de glicano tal como se describe en el ejemplo 9. Tras 16-24 horas de crecimiento en presencia de glicanos, se preparan las suspensiones bacterianas en medio libre de antibiótico y se añaden 106 - 108 UFC a cultivos tisulares o celulares confluentes. Se incuban los cocultivos a 37°C durante 4-24 horas.
A la conclusión del periodo de coincubación, se recoge el sobrenadante y se analiza para detectar citocinas inflamatorias e inmunomoduladoras incluyendo IL-1a, IL-1P, TNF, IL-8, RANTES, IL-10, TGF-p, IFN-y, IL-4, IL-6, IL- 12, IL-17 e IL-23. Se realiza este análisis mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) u otra técnica de cuantificación comparable (por ejemplo, Luminex Assay; Life Technologies, Carlsbad, CA) siguiendo protocolos convencionales. Para analizar una gama más amplia de respuestas, se realiza análisis de la expresión génica (por ejemplo, mediante microalineamiento) o transcriptómico (por ejemplo, mediante sec. de ARN) lisando las células, purificando el ARN y siguiendo protocolos convencionales. Este procedimiento se usa para analizar la expresión de genes que codifican para citocinas inflamatorias, citocinas inmunomoduladoras, péptidos antimicrobianos y otras respuestas relevantes del huésped.
Ejemplo 12. Efecto de glicanos en un modelo de ratón de infección por Clostridium difficile
Se realizó este experimento para analizar los efectos de productos terapéuticos de glicanos en un modelo de ratón de infección por Clostridium difficile (Chen et al, 2008, a Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology 135(6), 1984-1992). En este modelo, se expusieron ratones normales a un régimen de antibiótico que les hace susceptibles a la infección por C. difficile y síntomas de enfermedad, similares con respecto a su desarrollo y manifestación de enfermedad clínica humana. En seres humanos, la enfermedad es lo más a menudo el resultado de la exposición a antibióticos de amplio espectro que se cree que da como resultado disbiosis intestinal y aumento posterior de la colonización colónica con C. difficile. La carga biológica aumentada de C. difficile conduce a la producción de toxinas por la bacteria y a inflamación colónica. Las manifestaciones clínicas en seres humanos incluyen diarrea, pérdida de peso, inflamación intestinal, fiebre y deshidratación. La incidencia clínica de infección por C. difficile y enfermedad es de aproximadamente 750.000 casos al año en los Estados Unidos.
Se alojaron ratones (hembra C57BL/6, 8-10 semanas de edad, 16-18 gramos cada uno; Harlan Laboratories, Indianápolis, EN) en grupos de 3 por jaula, con 4 jaulas por grupo de tratamiento. Se expusieron los ratones a un cóctel de antibióticos en su agua potable durante un periodo de 9 días, comenzando el día -14, catorce días antes de la exposición a Clostridium difficile el día 0. El cóctel de antibióticos consistía en glucosa al 1%, kanamicina (0,5 mg/ml), gentamicina (0,044 mg/ml), colistina (1062,5 U/ml), metronidazol (0,269 mg/ml), ciprofloxacino (0,156 mg/ml), ampicilina (0,1 mg/ml) y vancomicina (0,056 mg/ml). Tres días antes de la exposición a Clostridium difficile (el día -3), los ratones recibieron una única dosis de clindamicina (10 mg/kg) en un volumen de 0,5 ml de agua destilada mediante sonda oral (PO) (véase la tabla 10). Todos los compuestos químicos se adquirieron de Sigma- Aldrich Corp. (St. Louis, MO). El día 0, se expusieron los ratones a esporas de Clostridium difficile (cepa VPI 10463 (ATCC-43255)) a aproximadamente 4,5 log10 esporas por ratón, por vía oral, en un volumen de dosis de 0,5 ml de agua destilada.
Tabla 10: Tratamientos
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Tratamiento
Vía de administración Duración del tratamiento
Agua corriente (control)
Agua potable QD días -15 a 6 (L)
Vancomicina (control)
Sonda PO QD días 0 a 4
glu100 (L)
Agua potable QD días -15 a 6
glu100 (S)
Agua potable QD días -1 a 6 (S)
glu33gal33fuc33 (L)
Agua potable QD días -15 a 6
glu33gal33fuc33 (S)
Agua potable QD días -1 a 6
ara100 (L)
Agua potable QD días -15 a 6
ara100 (S)
Agua potable QD días -1 a 6
glu50gal50 (L)
Agua potable QD días -15 a 6
glu50gal50 (S)
Agua potable QD días -1 a 6
FOS**FOS (Nutraflora FOS; NOW Foods, Bloomingdale IL) (L)
Agua potable QD días -15 a 6
FOS (S)
Agua potable QD días -1 a 6
A. Fenotipos asociados a enfermedad
Se registraron los fenotipos asociados a enfermedad durante una duración de diez días comenzando el día de exposición a Clostridium difficile (el día 0) hasta el día 10. Se registraron los fenotipos, incluyendo letargia, postura encorvada y pelaje erizado, cola/abdomen húmedo e hipotermia desde 0 hasta 4: Normal = 0; letárgico = 1; letárgico + jorobado = 2; letárgico + jorobado + cola/abdomen húmedo (diarrea) = 3; y letárgico + jorobado + cola/abdomen húmedo + hipotérmico = 4. También se monitorizaron y registraron la muerte (del día 0 al día 10 u 11) y el peso (del día 1 al día 7 y día 10) de los animales. Los ratones que mostraban una pérdida de peso corporal de más del 25% en relación con el día 0 se sacrificaron con humanidad.
En estos estudios, todos los animales con cola/abdomen húmedo (diarrea; puntuación clínica de “3”) progresaron hasta la muerte. La diarrea es una indicación de inflamación colónica y hemorragia y es un factor contribuyente a la pérdida de peso observada en modelos de roedor de colonización/infección por C. difficile.
La capacidad de un tratamiento de proteger a los animales de la muerte hasta el día 6 en estos experimentos indica prevención de la enfermedad, por ejemplo, en un ser humano. La capacidad de un tratamiento de proteger a los animales de la muerte entre los días 7 y 11 indica que los animales estaban protegidos de la recaída de la enfermedad en estos modelos.
Además, se evaluó el porte de esporas de Clostridium difficile, que es indicativo de colonización del intestino por Clostridium difficile tanto en ratones como seres humanos, diariamente desde el día 0 hasta día 6. Para la enumeración de UFC de esporas, se suspendieron sedimentos fecales en etanol al 50% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se agitaron con vórtex. Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 1 hora, se agitaron con vórtex bien y se diluyeron en serie en PBS. Se aplicaron las suspensiones resultantes a agar TCCFA selectivo para Clostridium difficile (Teknova, Hollister CA) y se hicieron crecer en una atmósfera anaerobia a 37°C durante la noche para enumerar las UFC.
Se evaluaron los efectos de los tratamientos comparando los fenotipos asociados a enfermedad en grupos tratados con glicanos, no tratados (agua corriente) y tratados con vancomicina. FOS es un fructooligosacárido no digerible, disponible comercialmente. Ensayos clínicos usando FOS comercial como intervención para diarrea asociada a antibióticos y Clostridium difficile (Lewis et al., Failure of dietary oligofructose to prevent antibiotic-associated diarrhea. Aliment Pharmacol Ther 2005; 21: 469-477) y recaída de Clostridium difficile (Lewis et al, Effect of the Prebiotic Oligofructose on Relapse of Clostridium difficile-Associated Diarrhea: A Randomized, Controlled Study. Clin Gastroent Hepatol 2005 (3):442-448) han producido diferentes resultados, no mostrando el primer ensayo ningún efecto del tratamiento con FOS y demostrando el último una reducción en la reaparición de la enfermedad.
Supervivencia
Con respecto a la supervivencia de los animales, no hubo ninguna diferencia significativa entre animales tratados con agua (vehículo) frente a animales tratados con o bien glicanos o bien vancomicina (figura 10). Se interrumpieron los tratamientos de los animales el día 4 (para vancomicina) y el día 6 (para glicanos) y se evaluaron las muertes//puntuaciones clínicas de los animales hasta el día 10 u 11. Para animales tratados con agua, el 75% de los animales murieron para el día 4 (figura 10). Todos (100%) los animales tratados con vancomicina sobrevivieron hasta el día 7. Sin embargo, el 17% de los animales en el grupo tratado con vancomicina murieron para el día 10.
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Los supervivientes restantes en el grupo tratado con vancomicina tenían puntuaciones clínicas por encima de 0. Para los grupos tratados con glicanos (L = días de tratamiento -15 a 6; S = días -1 a 6), las muertes hasta el día 6 fueron las siguientes: Para glu100 (L), glu33gal33fuc33 (L) y glu50gal50 (L y S) la muerte fue del 0%. Para ara100 (S), glu33gal33fuc33 (S), glu100 (L) y FOS (L) el 8% de los animales murieron. Para ara100 (L) y FOS (S) el 25% de los animales murieron. Todos los supervivientes tratados con glicanos permanecieron a una puntuación clínica de 0 y no hubo muertes desde el día 7-11. Ningún animal en los grupos de glu100 (L y S), glu33gal33fuc33 ((L y S), ara100 (S) y glu50gal50 (L y S) presentaba una puntuación clínica de “3”, indicando que estos tratamientos prevenían la diarrea. Dos de los animales en el grupo de control sin tratar presentaban diarrea.
Pérdida de peso
La pérdida de peso en animales tratados con cualquiera de los glicanos sometidos a prueba fue significativamente menor que en animales tratados con agua (figura 11, ***P<0,001; ANOVA de medidas repetidas, comparaciones múltiples corregidas por Bonferonni). El perfil de pérdida de peso en animales tratados con glicanos no fue significativamente diferente del del grupo tratado con vancomicina.
B. Efecto de los tratamientos sobre el porte de esporas de C. difficile.
Los días 0-6 se evaluó la presencia de esporas de C. difficile en las heces de ratones. Los animales tratados con Vancomicina no tenían esporas detectables en sus heces en cualquier día. Los ratones que se trataron con glicanos o agua tenían entre 2 y 6 log10 UFC/gramo de heces. A pesar del porte de esporas de C. difficile el día 6, los animales tratados con glicanos permanecieron sanos hasta el día 10 con puntuaciones clínicas los días 7 y 10 de 0. Todos los animales tratados con vancomicina presentaban signos clínicos el día 10, con el 17% de muertes.
C. Desplazamientos asociados con glicanos en los constituyentes intestinales microbianos
Para determinar cómo la composición de la microbiota intestinal responde al tratamiento con productos terapéuticos de glicanos, se realizó la secuenciación de ARNr 16S de sedimentos fecales en la región variable V4 usando protocolos convencionales del Earth Microbiome Project (
www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/).
El día 6 tras la terminación del tratamiento con glicanos, había una diferencia significativa entre la composición filogenética de la microbiota intestinal composición de ratones tratados con glicanos (L o S) y controles de o bien FOS o bien vehículo y vancomicina (tabla 11).
Tabla 11. Comparación de la composición final entre tratamientos con glicanos con controles de vehículo, vancomicina o FOS.
Vehículo Vancomicina FOS
Glu100
- - *
Glu33gal33fuc33
** ** *
Glu50gal50
*** *** ***
Ara100
** ** *
*adj. P<0,05, **adj. P<0,01, ***adj. P<0,001; adonis por parejas, comparaciones múltiples corregidas por Bonferonni
Diferentes géneros bacterianos tenían una abundancia relativa aumentada con diversos tratamientos con glicanos, tratamiento con vancomicina o control de agua. La figura 12 muestra cambios en la abundancia relativa de géneros bacterianos específicos desde directamente antes (día -1) hasta directamente después (día 6) del tratamiento con glicanos o vancomicina. El género Bacteroides aumentó en los tratamientos con ara100, FOS y glu50gal50. El género Parabacteroides aumento en los tratamientos con glu33gal33fuc33. El género Bifidobacterium aumentó en los tratamientos con FOS, glu100 y glu50gal50. Se ha mostrado que Bacteroides, Parabacteroides y Bifidobacterium se correlacionan positivamente con una composición de microbioma resistente a C. difficile (Seekatz y Young, 2014, The Journal of Clinical Investigation). Notablemente, el género Enterococcus disminuyó en todos los tratamientos y Lactobacillus disminuyó en los tratamientos con FOS, glu100 y glu50gal50. Se ha observado previamente que tanto Enterococcus como Lactobacillus se correlacionan positivamente con una composición de microbioma susceptible a C. difficile (Seekatz y Young, 2014, The Journal of Clinical Investigation).
Se ha mostrado que algunos ácidos biliares secundarios confieren crecimiento de C. difficile in vitro. Se ha planteado la hipótesis de que la capacidad del microbioma intestinal de convertir ácidos biliares primarios en ácidos biliares secundarios antagoniza directamente la infección por C. difficile. Tres glicanos (glu33gal33fuc33, ara100 y glu50gal50) aumentaban todos el potencial funcional predicho del microbioma intestinal para convertir ácidos biliares primarios en ácidos biliares secundarios (figura 13). Esto no se observó en los controles de vancomicina. Además,
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un glicano (glul00) y FOS disponible comercialmente disminuyeron ambos el potencial funcional predicho del microbioma intestinal en promedio. Las predicciones funcionales se hicieron a partir de la secuenciación de ARNr 16S usando PICRUST (picrust.github.io/picrust/).
La producciónde ácidos biliares secundarios está vinculada a una germinación y crecimiento reducidos de C. difficile, y se han asociado miembros de las familias Lachnospiraceae y Ruminococcaceae con la producción de ácidos biliares secundarios y resistencia a la germinación y el crecimiento de C. difficile (Theriot CM, Bowman AA y Young VB. 2016. Antibiotic-induced alterations of the gut alter secondary bile acid production and allow for Clostridium difficile spore germination and outgrowth in the large intestine. mSphere 1 (1 ):e00045-15). Los productos terapéuticos de glicanos, cuando se administran en una cantidad eficaz, pueden modular especies bacterianas que producen ácidos biliares secundarios y de ese modo promover la resistencia a la germinación, el sobrecrecimiento y la colonización por C. difficile.
En el ensayo in vitro del ejemplo 8, el crecimiento de ROB.74, un miembro de la familia Ruminocacceae, estaba soportado por 13 de 15 glicanos, y el crecimiento de CSC.32 y CNE.31, miembros de la familia Lachnospiraceae, estaba apoyado por 6 y 7 de 15 glicanos, respectivamente, tal como se muestra en la tabla 8. Dos tratamientos con glicanos, glu50gal50 y ara100, aumentaron significativamente la abundancia relativa de la ruta de biosíntesis de ácidos biliares secundarios en el modelo de ratón de infección por C. difficile (figura 13).
La diversidad alfa (tal como se mide mediante el índice de Shannon) de la microbiota intestinal aumentó directamente de antes (día -1) a directamente después (día 6) del tratamiento con glicano (figura 14).
Estos resultados, obtenidos en un modelo animal ampliamente usado para la infección por Clostridium difficile, sugiere que los productos terapéuticos de glicanos redujeron la pérdida de peso inducida por C. difficile y mejoraron la supervivencia. Los glicanos seleccionados parecen para promover el crecimiento de géneros bacterianos que contribuyen a la resistencia a C. difficile (Bacteroides, Parabacteroides y Bifidobacterium) y condiciones que son menos favorables para el crecimiento de C. difficile (por ejemplo aumento de la presencia de ácidos biliares secundarios).
Ejemplo 13. Efecto de los glicanos en un modelo de ratón de colitis
Se realizó este experimento para analizar los efectos de productos terapéuticos de glicanos en un modelo de ratón
de colitis (Okayasu et al, 1990, A Novel Method in the Induction of Reliable Experimental Acute and Chronic
Ulcerative Colitis in Mice. Gastroenterology 98:694-702). En este modelo, se expusieron ratones normales a sulfato de dextrano sódico (DSS) en su agua potable, lo que indujo la aparición de síntomas de enfermedad similares con respecto a su desarrollo y manifestación en la enfermedad clínica humana. La colitis ulcerosa humana es un trastorno progresivo, inflamatorio del tubo digestivo con una prevalencia de aproximadamente 150-300 por 100.000 personas. La colitis ulcerosa es el resultado de una respuesta inmunitaria del huésped aberrante a la flora comensal,
se limita al colon e implica inflamación de la mucosa difusa. Los síntomas en seres humanos incluyen
inflamación/ulceración colónica, pérdida de peso y diarrea que puede contener sangre.
Se alojaron ratones (macho C57BL/6, 6-8 semanas de edad, 22-24 gramos cada uno; Charles River Laboratories, Wilmington MA) en grupos de 8 por jaula, con 1 jaula por grupo de tratamiento. El grupo de control de vehículo al que no se le administró DSS al 2,5% se componía de 6 ratones. Se les administraron a los ratones productos terapéuticos de glicanos a una concentración del 1% en su agua potable desde día -7 (7 días antes de la administración de DSS) hasta día 14. Los días 0 a 5 se les administró a los ratones DSS (MP Bio, Santa Ana CA; 36.000-50.000 Da) al 2,5% en su agua potable para inducir fenotipos de colitis.
Se registraron los fenotipos asociados a enfermedad durante una duración de doce días comenzando el día 0 hasta el día 11. Los fenotipos que se puntuaron fueron: peso, incidencia de diarrea y sangre en las deposiciones. Además, se realizó un análisis endoscópico de la inflamación del colon el día 14. Se usó el siguiente sistema de puntuación: sin tratamiento previo, sin edema o desprendimiento de la mucosa, vascularidad clara = 0; edema, desprendimiento de la mucosa, disminución de la vascularidad = 1; edema, desprendimiento de la mucosa, disminución de la vascularidad, friabilidad = 2; hemorragia activa, erosión = 3; ulceración activa, erosión = 4. Se emprendió un análisis histopatológico sobre muestras de colon terminal de todos los ratones. Se fijaron secciones de colon en formalina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Se usó un análisis semicuantitativo de las lesiones colónicas incluyendo erosión de la mucosa, pérdida de glándulas colónicas e inflamación de mucosa a transmural con epitelio mucoso y glandular en regeneración (hiperplásico). Todos los fenotipos imitan a los de la colitis humana. En este modelo, la pérdida de peso pico se produce generalmente el día 10.
Se les administró a todos los animales DSS al 2,5% en el agua potable durante los días 0-5. Se suministraron los siguientes tratamientos con glicanos en el agua potable de los animales a una concentración del 1%: FOS (comercial, control); glu100; man52glu29gal19; fibra de acacia (comercial, control) desde el día -7 hasta el día 14. El grupo de control recibió agua potable corriente en lugar de agua que contenía glicanos.
Se evaluaron los efectos de los tratamientos de prueba comparando los fenotipos asociados a enfermedad en los
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grupos tratados con glicanos y sin tratar (agua corriente). FOS (Nutraflora FOS; NOW Foods, Bloomingdale IL) es un fructooligosacárido no digerible disponible comercialmente. La fibra de acacia (Organic Powder, NOW Foods, Bloomingdale, IL) es un suplemento de fibra disponible comercialmente.
El tratamiento con glu 100 y man52glu29gal19 redujo la incidencia de diarrea y la pérdida de peso desde el día 0 hasta el 11 (figura 15), así como redujo significativamente la inflamación colónica (día 14; figura 16) tal como se evalúa mediante endoscopia en ratones en comparación con o bien animales tratados con agua corriente (control de vehículo) o bien animales tratados con fibra de acacia. Los resultados histopatológicos de muestras de colon de los ratones reflejaban los del análisis endoscópico con respecto a la eficacia de glicanos. Los días acumulados de incidencia de diarrea en los grupos de control y de tratamiento fueron los siguientes: grupo de control de agua: 10 días; fibra de acacia: 14 días; FOS: 4 días; glu 100: 2 días; man52glu29gal19: 3 días. Conjuntamente, estos datos demuestran que los tratamientos con glicanos tienen efectos protectores significativos en un modelo de ratón de colitis.
Estos resultados, obtenidos en un modelo animal de colitis ampliamente usado, sugieren que los productos terapéuticos de glicanos reducen la pérdida de peso, diarrea y la inflamación colónica y el daño inducidos por DSS tal como se evalúa mediante endoscopia e histopatología.
Ejemplo 14. Efecto de glicanos en un modelo de ratón de obesidad inducida por la dieta
Se realizó este experimento para analizar los efectos de productos terapéuticos de glicanos en un modelo de ratón de obesidad inducida por dieta alta en grasas (Wang y Liao, A Mouse Model of Diet-Induced Obesity and Insuline Resistance. Methods Mol Biol. 2012; 821: 421-433). En este modelo, se alimentó a ratones normales con una dieta que contenía el 60% de contenido en grasa a lo largo de 6 semanas. Estos ratones presentaban un aumento de peso significativo en comparación con ratones alimentados con una dieta baja en grasa (10%). En seres humanos, la obesidad es la acumulación de grasa corporal en exceso hasta el grado de que puede tener efectos negativos sobre la salud, incluyendo el desarrollo de diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular. Las principales causas de obesidad son una ingesta de energía alimenticia excesiva, falta de actividad física y predisposición genética. En los Estados Unidos, aproximadamente el 38% de los adultos (78 millones) y el 17% de los niños y adolescentes (13 millones) son obesos. El modelo de ratón de obesidad inducida por la dieta recapitula los criterios de evaluación de la enfermedad humana incluyendo aumento de peso, disminución de la masa corporal magra, cambios en la fisiología orgánica y cambios en marcadores de diabetes.
Se alojaron ratones (macho C57BL/6, 8-10 semanas de edad, 16-18 gramos cada uno; Taconic Labs, Germantown, NY) en grupos de 1-2 por jaula, con 8 animales por grupo de tratamiento. Se alimentó a los ratones con una dieta alta en grasas (60%) (el 60% de las kcal totales aportadas por la grasa) (D12492; Research Diets, New Brunswick, NJ) o dieta coincidente que contenía el 10% de grasa (el 10% de las kcal totales aportadas por la grasa) (D12450; Research Diets). Tras una semana con este régimen de dieta, se les administró a los ratones con la dieta alta en grasas glicanos (autoadministrados en el agua potable; del día 0 al día 44): glu100 al 0,3% peso/volumen (p/v) o man52glu29gal19 al 1% p/v en agua potable, fOs comercial (Nutraflora FOS; NOW Foods, Bloomingdale IL) al 6%, el 1% o el 0,3% p/v en agua potable, o agua corriente (control). Al grupo de ratones que consumía la dieta baja en grasas se le administró agua corriente (control). Se mantuvieron las dietas igual para cada grupo a lo largo de todo el estudio.
Aumento de peso
Se monitorizó el peso cada dos días desde el día 0 hasta el día 44. Los ratones con una dieta alta en grasas aumentaron de peso a un ritmo significativamente más rápido que los ratones alimentados con una dieta baja en grasas. El tratamiento con glu100 (al 0,3% en agua potable) y man52glu29gal19 (al 1% en agua potable) disminuyó significativamente la pendiente de la curva de aumento de peso desde el día 0 hasta el 41 en ratones alimentados con una alta cantidad de grasa en comparación con ratones tratados con agua (vehículo) (figura 17A y figura 17B). FOS a cualquier dosis no tuvo ningún efecto significativo sobre la pendiente de cambio de peso en tanto por ciento (%) en comparación con animales de control de agua.
Tolerancia a la glucosa
El día 42, se sometieron los ratones a una prueba de tolerancia a la glucosa oral mediante ayuno durante 12 horas y luego administración de una dosis por sonda oral de glucosa (2 gramos/kg; Ayala et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice Disease Models & Mechanisms 3, 525-534 (2010)). Se monitorizaron los niveles de glucosa en sangre usando un glucómetro manual (One Touch Ultra®; LifeScan Inc, Wayne PA) a los 120 minutos tras la dosis de glucosa. Los ratones con una dieta alta en grasas tenían una menor capacidad para aclarar la glucosa de su circulación sistémica que los ratones alimentados con una dieta baja en grasas (figura 18). Los ratones alimentados con una dieta alta en grasas tratados con glu100 (0,3%) y man52glu29gal19 (1%) tenían niveles de glucosa en sangre inferiores en comparación con ratones alimentados con una dieta alta en grasas, de control de agua. Estos niveles fueron más similares a los de ratones alimentados con una dieta baja en grasas, de control de agua.
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Desarrollo de almohadillas de grasa
El día 44, se retiraron y se pesaron las almohadillas de grasa epididimal de los ratones. Se usó el peso de las almohadillas de grasa como tanto por ciento del peso corporal total como criterio de valoración para la masa corporal magra, correspondiendo un peso de almohadillas grasas aumentado a una masa corporal magra inferior. Los ratones tratados con man52glu29gal19 (1%) y alimentados con la dieta alta en grasas tenían un % de peso de peso corporal/almohadillas grasas menor que los ratones de control de agua (figura 19) o ratones tratados con FOS alimentados con la dieta alta en grasas.
Los resultados de estos tres criterios de valoración en el modelo de obesidad sugieren que un modelo a plazo más largo podría conducir a cambios significativos en otros parámetros que se evalúan en el modelo (Wang y Liao, A Mouse Model of Diet-Induced Obesity and Insuline Resistance. Methods Mol Biol. 2012; 821: 421-433). Por ejemplo, los ratones alimentados con una dieta alta en grasas presentarán múltiples cambios orgánicos en comparación con ratones alimentados con una dieta baja en grasas. En la 12a semana del experimento y más allá, se sacrificaron los ratones y se recogieron/procesaron determinados tejidos para su análisis. Se recogieron el colon y el ciego, se pesaron y se midieron; los ratones obesos tendrán un colon y ciego más cortos y un colon de peso disminuido. El contenido del ciego se congela instantáneamente para su almacenamiento para el análisis posterior de ARN 16S y metabolitos. Se recogen los hígados, se pesan y se almacenan en formalina para la histopatología. Los ratones alimentados con una dieta alta en grasas tienen a tener pesos de hígado mayores que los alimentados con una dieta baja en grasas. Se toman muestras de sangre y se procesan para obtener plasma para la medición de marcadores inflamatorios (TNF-a, IFN-y, IL-10, IL-13, IL-1P, IL-4, IL-5, IL-6 y KC/GRO), niveles de química clínica (colesterol, triglicéridos) y lipopolisacárido (LPS). Los ratones alimentados con una dieta alta en grasas tienen niveles aumentados de marcadores de inflamación, y niveles de colesterol, triglicérido y LPS circulante superiores. Todos estos criterios de valoración en el modelo someten a prueba manifestaciones similares de obesidad tal como se observan en seres humanos. Los glicanos seleccionados reducen la incidencia o la magnitud del colon y ciego más cortos y peso de colon disminuido. Los glicanos seleccionados reducen la incidencia o la magnitud del aumento de peso del hígado. Los glicanos seleccionados reducen la incidencia o la magnitud de la presencia de marcadores inflamatorios, reducen los niveles de colesterol y/o LPS sistémico.
Estos resultados, obtenidos en un modelo animal ampliamente usado para obesidad inducida por la dieta sugieren que los productos terapéuticos de glicanos pueden prevenir el aumento de peso inducido por una dieta alta en grasas, mejorar la capacidad para aclarar glucosa sanguínea y aumentar la composición corporal de magro/grasa.
Ejemplo 15. Efecto de glicanos sobre la expresión génica en un modelo de ratón
El ensayo se realiza con dos grupos de ratones. El grupo de control de ratones se alimenta con pienso convencional, y los diferentes grupos de tratamiento de ratones se alimentan con pienso convencional suplementado con glicanos. Tras 1-30 días, se extraen muestras de sangre de los ratones, se sacrifican los ratones y se recogen tejidos del intestino, el hígado, la piel y otros sitios de interés y se almacenan a -80°C. Se aísla el ARN de los tejidos y se convierte en ADNc. Se usa el alineamiento GeneChip Mouse Genome 430 2.0 (Affymetrix) para analizar la expresión diferencias entre los y animales tratados y no tratados con glicanos de aproximadamente 14.000 genes murinos. El protocolo experimental y el análisis de datos sin procesar se realizan según las instrucciones del fabricante y los protocolos convencionales. La función biológica de los genes expresados de manera diferencial y su implicación en diversos procesos se obtienen de las siguientes bases de datos: RefGene (referencia para genes, proteínas y anticuerpos: refgene.com/), CTD (base de datos de toxicogenómica comparativa: ctd.mdibl.org/), MGI (informática genómica de ratón:
www.informatics.jax.org/), KEGG (Enciclopedia de Kyoto de genes y genomas:
www.genome.jp/kegg/genes.html). Se usa este procedimiento para identificar la expresión diferencias de genes que codifican para citocinas inflamatorias, citocinas inmunomoduladoras, péptidos antimicrobianos y otras moléculas efectoras relevantes.
Tabla 1: Constituyentes microbianos a nivel de género del tubo digestivo.
Filo
Clase Género
Actinobacteria
Actinobacteria
Actinomyces, Adlercreutzia, Atopobium, Bifidobacterium, Collinsella, Corynebacterium, Eggerthella, Mobiluncus, Propionibacterium, Rothia, Slackia
Bacteroidetes
Bacteroidia Alistipes, Bacteroides, Dysgonomonas, Odoribacter, Parabacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Tannerella
Flavobacteria
Capnocytophaga
Firmicutes
Bacilli Bacillus, Enterococcus, Gemella, Granulicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Turicibacter, Weissella
Clostridia Acidaminococcus, Anaerococcus, Anaerofilum, Anaerofustis, Anaerostipes, Anaerotruncus, Anaerovorax, Bacteroides, Bacteroides, Blautia, Clostridium, Coprococcus, Dehalobacterium, Dialister, Dorea, Eubacterium, Faecalibacterium, Finegoldia, Lachnobacterium, Lachnospira, Megamonas, Megasphaera, Mitsuokella, Moryella, Oribacterium, Oscillospira, Peptococcus, Peptoniphilus, Peptostreptococcus, Phascolarctobacterium, Pseudobutyrivibrio, Roseburia, Ruminococcus, Ruminococcus, Selenomonas, Subdoligranulum, Veillonella
Fusobacteria
Fusobacteria
Fusobacterium, Leptotrichia
Betaproteobacteria Comamonas, Herbaspirillum, Lautropia, Neisseria, Oxalobacter, Sutterella
Deltaproteobacteria
Bilophila, Desulfovibrio, LE30
Epsilonproteobacteria
Campylobacter, Helicobacter
Gammaproteobacteria
Actinobacillus, Aggregatibacter, Citrobacter, Escherichia, Haemophilus, Klebsiella, Moraxella, Pseudomonas, Raoultella
Spirochaetes
Spirochaetes
Treponema
Synergistetes
Synergistetia Cloacibacillus, Synergistes
Tenericutes
Erysipelotrichi Bulleidia, Catenibacterium, Clostridium,
Coprobacillus, Holdemania, RFN20
Mollicutes
Asteroleplasma, Mycoplasma
Verrucomicrobia
Verrucomicrobiae Akkermansia
Euryarchaeota
Methanobacteria Methano brevibacter
Tabla 2: Metabolitos microbianos
2-hidroxiisobutirato, 3-hidroxiisovalerato, 3-metil-crotonilglicina, 3-metilcrotonilglicina, alantoína, betaína, formiato, manitol, glucurónido de p-cresol, fenilacetilglicina, sarcosina, taurina, ácido acético, acetilaldehído, ácido ascórbico, butanodiona, ácido butírico, ácido desoxicólico, sulfato de etilfenilo, ácido fórmico / formiato, indol, ácido isobutírico, ácido isovalérico, ácido propiónico, serotonina, ácido succínico / succinato, TMAO, triptófano, ácido valérico, ácido ursodesoxicólico, lactato, ácido láctico, peróxido de hidrógeno
5 Tabla 3: Constituyentes microbianos a nivel de género predominantes en el intestino grueso (en comparación en el intestino delgado) en seres humanos sanos.
Filo
Clase Género
Bacteroidetes
Bacteroidia Bacteroides, Butyricimonas, Odoribacter, Parabacteroides, Prevotella
Firmicutes
Clostridia Anaerotruncus, Phascolarctobacterium, Ruminococcus,
Proteobacteria
Deltaproteobacteria Bilophila
Verrucomicrobia
Verrucomicrobiae Akkermansia
Tabla 4: Constituyentes microbianos a nivel de género predominantes en el intestino delgado (en comparación con 10 el intestino grueso) en seres humanos sanos.
Filo
Clase Género
Actinobacteria
Actinobacteria
Cryocola, Mycobacterium
Firmicutes
Bacilli Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Turicibacter
Clostridia
Blautia, Coprococcus, Holdemania, Pseudoramibacter Eubacterium
Proteobacteria
Alphaproteobacteria Agrobacterium, Sphingomonas
Filo
Clase Género
Betaproteobacteria Achromobacter, Burkholderia, Ralstonia
Tabla 5: Polifenoles
Subclase de polifenol
Nombre del compuesto
Antocianinas
3-O-(6”-p-cumaroil-glucósido) de malvidina, cianidina, total, 3-O-(6”-acetil- galactósido) de delfinidina, 3-O-(6”-acetil-galactósido) de cianidina, malvidina, 3-O-galactósido de cianidina, 3-O-glucósido de cianidina, 3-O-rutinósido de cianidina, 3-O-soforósido de cianidina, 3-O-glucósido de pelargonidina, 3-O-(6”- malonil-glucósido) de cianidina, peonidina, 3-O-glucósido de peonidina, 3-O- rutinósido de peonidina, 3-O-rutinósido de pelargonidina, pelargonidina, cianidina, 3,5-O-diglucósido de malvidina, 3-O-glucosil-rutinósido de cianidina, 3-O-soforósido de pelargonidina, 3-O-glucosil-rutinósido de pelargonidina, 3-O- (6”-succinil-glucósido) de cianidina, 3-O-(6”-succinil-glucósido) pelargonidina, delfinidina, 3-O-galactósido de delfinidina, 3-O-glucósido de delfinidina, 3-O- arabinósido de delfinidina, petunidina, 3-O-galactósido de petunidina, 3-O- arabinósido de cianidina, 3-O-glucósido de petunidina, 3-O-galactósido de peonidina, 3-O-arabinósido de petunidina, 3-O-glucósido de malvidina, 3-O- arabinósido de malvidina, 3-O-(6”-acetil-arabinósido) cianidina, 3-O-(6”-acetil- glucósido) de delfinidina, 3-O-(6”-acetil-galactósido) de petunidina, 3-O-(6”- acetil-galactósido) de peonidina, 3-O-(6”-acetil-glucósido) de cianidina, 3-O-(6”- acetil-galactósido) de malvidina, 3-O-(6”-acetil-glucósido) de petunidina, antocianinas poliméricas, total, 3-O-(6”-acetil-glucósido) de malvidina, 3-O-(6”- acetil-glucósido) de peonidina, 3-O-arabinósido de pelargonidina, 3-O- rutinósido de delfinidina, 3-O-sambubiósido de cianidina, 3-O-(6”-malonil- glucósido) de pelargonidina, 3-O-(6”-p-cumaroil-glucósido) de peonidina, 3-O- xilósido de cianidina, 3-O-galactósido de malvidina, 3-O-arabinósido de peonidina, 3-O-rutinósido de petunidina, 3-O-xilósido de delfinidina, 3-O-(6”-p- cumaroil-glucósido) de petunidina, 3-O-galactósido de pelargonidina, 3-O- sambubiósido de pelargonidina, 3-O-sambubiósido de delfinidina, 3-O-xilosil- rutinósido de cianidina, vitisina A, 3-O-(6”-p-coumaroil-glucósido) de delfinidina, pigmento A, p-cumaroil-vitisina A, acetilvitisina A, 3-O-(6”-p-cumaroil-glucósido) de cianidina, 3-O-sambubiósido-5-O-glucósido de cianidina, 3-O-(6”-cafeoil- glucósido) de cianidina, 3,5-O-diglucósido de cianidina, pinotina A, 3,5-O- diglucósido de delfinidina, 3,5-O-diglucósido de pelargonidina, 3-O-(6”-cafeoil- glucósido) de malvidina, 3-O-(6”-dioxalil-glucósido) de cianidina, 3-O- laminaribiósido de cianidina, 3-O-(3”-malonil-glucósido) de cianidina, 3-O-(6”- malonil-glucósido) de peonidina, 3-O-(6”-malonil-laminaribiósido) de cianidina, 3-O-dimalonil-laminaribiósido de cianidina, 3-O-(6”-malonil-arabinósido) de cianidina, 3-O-glucosil-glucósido de delfinidina, 3-O-(6”-malonil-3”-glucosil- glucósido) de cianidina, 3-O-(2”-xilosil-6”-glucosil-galactósido) de cianidina, 3- O-(2”-xilosil-6”-(6’”-caffeoil-glucosil)-galactósido) de cianidina, 3-O-(2”-xilosil- galactósido) de cianidina, 3-O-(2”-xilosil-6”-(6”‘-p-hidroxibenzoil-glucosil)- galactósido) de cianidina, 3-O-(2”-xilosil-6”-(6”‘-sinapoil-glucosil)-galactósido) de cianidina, 3-O-(2”-xilosil-6”-(6”‘-feruloil-glucosil)-galactósido) de cianidina, 3-O- (2”-xilosil-6”-(6”‘-p-cumaroil-glucosil)-galactósido) de cianidina, 3-O-(6”-malonil- glucósido) de delfinidina, 3-O-rutinósido de malvidina, 3-O-glucósido de luteolinidina, 3-O-feruloil-glucósido de delfinidina, 3,5-O-diglucósido de petunidina, 3-O-ramnósido de petunidina, luteolinidina, vitisina
A aglicona, pigmento A aglicona, pinotina A aglicona, 3-O-galactósido de4-O- metilcianidina, 3-O-(6”-O-acetil)-glucósido de malvidina, 3-O-diglucósido-5-O- glucósido de cianidina, 3-O-diglucósido-5-O-glucósido de peonidina, 3,5-O- diglucósido de peonidina, 3-O-(2-O-(6-O-(E)-cafeoil-D-glucosil)-D-glucósido)-5- O-D-glucósido de peonidina, 3-O-soforósido de peonidina, 3-O-sambubiósido de peonidina, 3-O-sambubiósido-5-O-glucósido de peonidina, 3-O-xilósido de peonidina, 3-O-D-glucósido de4’-O-metilcianidina, 3-O-glucurónido de cianidina, 3-O-(3”,6”-O-dimalonil-glucósido) de cianidina, 3-sulfato de cianidina, 3-O-L-arabinósido de4-O-metildelfinidina, 3-O-D-glucósido de4-O- metildelfinidina, 3-O-arabinósido de isopeonidina, 3-O-galactósido de isopeonidina, 3-O-glucósido de isopeonidina, 3-O-rutinósido de isopeonidina, 3- O-sambubiósido de isopeonidina, 3-O-xilósido de isopeonidina, 3-O-D- galactósido de 4-O-metilpetunidina, 3-O-D-glucósido de 4-O-metilpetunidina, 3- O-(2-O-(6-O-(E)-cafeoil-D-glucósido)-D-glucósido)-5-O-D-glucósido de cianidina, 3-O-rutinósido de4’-O-metildelfinidina, 3-O-(6”-acetil-glucósido) de pelargonidina
Chalconas
Chalconaringenina, total, buteína, xantohumol, chalconaringenina, 2’-O- glucurónido de chalconaringenina, 4’-O-glucurónido de chalconaringenina, 7-O- glucurónido de chalconaringenina
Dihidrochalconas
floretina, floridzina, xilosil-galactósido de floretina, 2’-O-xilosil-glucósido de floretina, 2’-O-xilosil-glucósido de 3-hidroxifloretina, 2’-O-glucósido de3- hidroxifloretina, floridzina, total, 3-hidroxifloretina, 2’-O-glucurónido de floretina, 3’-O-glucósido de3-metoxifloretina, 3’-O-glucósido de 3-hidroxi-4-O- metilfloretina, 3’-O-glucósido de 3-hidroxifloretina
Dihidro-flavonoles
3-O-ramnósido de dihidroquercetina, dihidroquercetina, engeletina, 3-O- ramnósido de dihidromircetina, 3-O-glucósido de dihidroquercetina, dihidromircetina, dihidrokempferol
Flavanoles
(+)-catequina, (-)-cpicatequina, (+)-galocatequina, (-)-epigalocatequina, (-)-3-O- galato de epicatequina, (-)-3-O-galato de epigalocatequina, catequinas, total, taflavinas, total, tearubiginas, total, teaflavina, 3-O-galato de teaflavina, 3’-O- galato de teaflavina, 3,3’-O-digalato de teaflavina, (+)-3-O-galato de galocatequina, (-)-catequina, (+)-3-O-galato de catequina, ácido teaflávico, ácido epiteaflávico, 3’-O-galato de ácido epiteaflávico, 3-O-galato de isoneoteaflavina, (-)-3-O-galato de calocatequina, (-)-calocatequina, (-)-3-O- galato de catequina, (+)-epicatequina, (-)-8-C-galactósido de epicatequina, isoneoteaflavina, dímero de procianidina B1, dímero de procianidina B2, dímero de procianidina B3, dímero de procianidina B4, dímero de procianidina B5, dímero de procianidina B7, dímero de prodelfinidina B3, trímero de procianidina C1, tetrámero de procianidina T4, 02 meros, procianidinas, total, trímero de procianidina EEC, 01 meros, polímeros (>10 meros), 03 meros, 04-06 meros, 07-10 meros, dímero de procianidina B6, trímero de procianidina T2, trímero de procianidina C2, 3-O-galato de dímero de procianidina B2, 3’-O-galato de dímero de procianidina B2, 3-O-galato de dímero de procianidina B1, trímero de prodelfinidina CG-CG-C, trímero de procianidina T3, 04 meros, dímero de procianidina A2, 05 meros, 06 meros, 07 meros, 08 meros, 09 meros, 10 meros, 02-03 meros, (+)-3-O-arabinósido de epicatequina-(2a-7)(4a-8)- catequina, 3-O-galactósido de cinantanina B1, (+)-3-O-arabinósido de epicatequina-(2a-7)(4a-8)-epicatequina, 3-O-arabinósido de cinantanina B1, dímero de procianidina A1, cinantanina B1, protoantocianidinas, total, trímero de prodelfinidina CG-C-C, trímero de prodelfinidina C-CG-C, (+)-epicatequina- (2a-7)(4a-8)-catequina, (+)-epicatequina-(2a-7)(4a-8)-epicatequina, (-)-3-O- galactósido de epicatequina-(2a-7)(4a-8)-epicatequina, cinantanina A2, Bis- 8,8’-catequinailmetano, cinantanina A3, (+)-catequina-3-O-glucosa, 3’-O- metilepicatequina, 3’-O-glucurónido de 4’-O-metil-(-)-epicatequina, 3’-O- glucurónido de epicatequina, 3-O-galato-4”-O-glucurónido de epigalocatequina, 3’-O-metilcatequina, 3-O-galato de 3’-O-metil-(-)-epicatequina, 3-O-galato de 4’,4”-O-dimetilepigalocatequina, 4’-O-metilepigalocatequina, 3-O-galato de 4”- O-metilepigalocatequina, 4’-O-metilepicatequina, 3-O-galato-7-O-glucósido-4”- O-glucurónido de epigalocatequina, teasinensina A, 3-O-metilepigalocatequina, 3-O-galato de 3’,4”-dimetil-(-)-epicatequina, (-)-3-O-glucurónido de epigalocatequina, 3-O-galato de 3’-O-metil-(-)-epigalocatequina, 3-O-galato de 3”-O-metil-(-)-epigalocatequina, 3-O-galato de 3’,3”-O-dimetil-(-)- epigalocatequina, 7-O-glucurónido de 3’-O-metil-(-)-epicatequina, 7-O- glucurónido de epicatequina, (-)-3’-O-glucurónido de epigalocatequina, (-)-7-O- glucurónido de epigalocatequina, 3’-O-glucurónido de4’-O-metil-(-)- epigalocatequina, 7-O-glucurónido de4’-O-metil-(-)-epigalocatequina, 3’-sulfato de 4’-O-metil-(-)-epigalocatequina
Flavanonas
naringenina, eriodictiol, hesperetina, hesperetina, total, naringenina, total, eriocitrina, hesperidina, naringina, narirutina, neoeriocitrina, neohesperidina, 7- O-rutinósido de isosakuranetina, poncirina, didimina, 4’-O-glucósido de narirutina, 4’-O-glucósido de naringina, 6’-malonato de naringina, isosakuranetina, 7-O-glucósido de naringenina, pinocembrina, 8- prenilnaringenina, 6-prenilnaringenina, 6-geranilnaringenina, isoxantohumol, 7- O-glucósido de eriodictiol, sakuranetina, 3’-O-glucurónido de hesperetina, 7-O- glucurónido de hesperetina, 3’-sulfato de hesperetina, 7-sulfato de hesperetina, homoeriodictiol, 4’-O-glucurónido de naringenina, 5-O-glucurónido de naringenina, 7-O-glucurónido de naringenina, 3’,7-O-diglucurónido de hesperetina, 5,7-O-diglucurónido de hesperetina, pinobanksina, 5-O- metilpinobanksina
Flavonas
apigenina, luteolina, apigenina, total, luteolina, total, diosmina, isoroifolina, neodiosmina, roifolina, sinensetina, nobiletina, tangeretina, 7-O-diglucurónido de luteolina, crisina, diosmetina, acacetina, 7-O-rutinósido de luteolina, tetrametilescutelareina, 7-O-glucósido de luteolina, 7-O-glucósido de apigenina, 6,8-di-C-glucósido de apigenina, sinensetina, total, 6,8-C-arabinósido-C- glucósido de apigenina, 6,8-C-galactósido-C-arabinósido de apigenina, 7-O- glucurónido de luteolina, 7-O-glucurónido de apigenina, 7-O-malonil-glucósido de luteolina, 6-C-glucósido de luteolina, 8-C-glucósido de luteolina, 6-C- glucósido-8-C-arabinósido de luteolina, 7-O-(2-apiosil-glucósido) de luteolina, 7- O-(2-apiosil-4-glucosil-6-malonil)-glucósido de luteolina, 6-C-glucósido de 8-C- arabinósido de apigenina, 7-O-(2-apiosil-6-malonil)-glucósido de luteolina, 7-O- apiosil-glucósido de apigenina, 8-C-glucósido de apigenina, 7,3’,4’- trihidroxiflavona, 7,4’-dihidroxiflavona, geraldona, baicaleina, 6-C-glucósido de apigenina, hispidulina, cirsimaritina, 4’-O-glucósido de luteolina, 5,6-dihidroxi- 7,8,3’,4’-tetrametoxiflavona, pebrelina, gardenina B, nepetina, jaceosidina, cirsilineol, eupatorina, 6-hidroxiluteolina, 7-O-ramnósido de 6-hidroxiluteolina, escutelareina, 7-O-(6”-malonil-apiosil-glucósido) de apigenina, crisoeriol, 7-O- apiosil-glucósido de crisoeriol, 7-O-(6”-malonil-apiosil-glucósido) de crisoeriol, 7-O-glucósido de crisoeriol, 7-O-(6”-malonil-glucósido) de crisoeriol, 7-O- diglucurónido de apigenina, 4’-O-glucósido de roifolina, 3’-O-demetilnobiletina, 4’-O-demetilnobiletina, 6-O-demetileupatilina, 6-O-metilescutelarina, 4’-O- glucurónido de apigenina, 5-O-glucurónido de apigenina, eupatilina, isoescutelareina, 4’-O-glucurónido de escutalareina, 5-O-glucurónido de escutalareina, 6,7-O-diglucurónido de escutalareina, 6-O-glucurónido de escutalareina, 7-sulfato de escutalareina, 7-O-glucurónido de escutalareina, tricina, 6-O-metilscutelareina
Flavonoles
kempferol, quercetina, 3-O-galactósido de quercetina, 3-O-glucósido de quercetina, 3-O-xilósido de quercetina, 3-O-ramnósido de quercetina, 3-O- rutinósido de quercetina, 3-O-soforósido de quercetina, 3-O-arabinósido de quercetina, 3-O-xilosil-glucurónido de quercetina, quercetina, total, kempferol, total, miricetina, total, 3-O-glucósido-7-O-ramnósido de isoramnetina, 3-O- rutinósido de isoramnetina, 3-O-glucurónido de kempferol, 7-O-ramnósido de isoramnetina, 3,4’-O-diglucósido de quercetina, 3-O-rutinósido de miricetina, miricetina, morina, kempferida, 3-O-galactósido de miricetina, 3-O-glucósido de miricetina, 3-O-glucosil-xilósido de quercetina, 3-O-acetil-ramnósido de quercetina, 3-O-galactósido de kempferol, galangina, isoramnetina, 3-O- glucósido de kempferol, 3-O-rutinósido de kempferol, 3-O-glucosil-ramnosil- galactósido de kempferol, 3-O-glucosil-ramnosil-glucósido de kempferol, 3-O- glucosil-ramnosil-galactósido de quercetina, 3-O-glucosil-ramnosil-glucósido de quercetina, ramnetina, 3-O-glucósido de isoramnetina, 3-O-ramnósido de miricetina, 3-O-ramnosil-galactósido de quercetina, 3-O-arabinósido de kempferol, 3-O-glucurónido de quercetina, 3-O-glucurónido de isoramnetina, 3- O-arabinósido de miricetina, 3,7,4’-O-triglucósido de quercetina, 7,4’-O- diglucósido de quercetina, 4’-O-glucósido de quercetina, 4’-O-glucósido de isoramnetina, 3,7-dimetilquercetina, 3-O-soforósido de kempferol, 3,7-O- diglucósido de kempferol, 3-O-diglucósido de quercetina, 3-O-soforósido-7-O- glucósido de kempferol, 3-O-soforotriósido-7-O-soforósido de kempferol, 3-O- sinapoil-cafeoil-soforósido-7-O-glucósido de kempferol, 3-O-feruloil-cafeoil-
soforósido-7-O-glucósido de kempferol, 3-O-feruloil-soforotriósido de kempferol, 3-O-sinapoil-soforósido-7-O-glucósido de kempferol, 3-O-cafeoil-soforósido-7- O-glucósido de kempferol, 3-O-feruloil-soforósido-7-O-glucósido de kempferol, 3-O-(6”-malonil-glucósido) de quercetina, 3-O-(6”-malonil-glucósido) de
kempferol, 3-O-ramnósido de kempferol, 3-O-(6”-malonil-glucósido)-7-O-
glucósido de quercetina, patuletina, quercetagetina, espinacetina, 3-O-glucosil- (1->6)-[apiosil(1->2)]-glucósido de patuletina, 3-O-glucosil-(1->6)-[apiosil(1->2)]- glucósido de espinacetina, 3-O-(2”-feruloilglucosil)(1->6)-[apiosil(1->2)]-
glucósido de patuletina, 3-0-(2“-p-cumaroilglucosil)(1->6)-[apiosil(1->2)]-
glucósido de espinacetina, 3-O-(2”-feruloilglucosil)(1->6)-[apiosil(1->2)]-
glucósido de espinacetina, 3-O-glucosil-(1->6)-glucósido de espinacetina, 4’-O- glucurónido de jaceidina, 4’-O-glucurónido de5,3’,4’-trihidroxi-3-metoxi-6:7- metilendioxiflavona, 4’-O-glucurónido de 5,4’-dihidroxi-3,3’-dimetoxi-6:7-
metilendioxiflavona, espinatósido, 4’-O-glucurónido de espinatósido, 3-O-xilosil- glucósido de kempferol, 3-O-acetil-glucósido de kempferol, 3-O-xilosil- rutinósido de quercetina, 3-O-xilosil-rutinósido de kempferol, 3-O-glucosil- glucósido de quercetina, 7-O-glucósido de quercetina, 3-O-(6”-acetil-glucósido) de quercetina, 3-O-robinósido de 7-O-ramnósido de kempferol, 7-O-glucósido de kempferol, 3-O-galactósido-7-O-ramnósido de kempferol, 3-O-(6”-acetil- galactósido)-7-O-ramnósido de kempferol, 3-O-galactósido-7-O-ramnósido de quercetina, 3-O-(6”-acetil-galactósido)-7-O-ramnósido de quercetina, 3-O-(2”- ramnosil-galactósido)-7-O-ramnósido de kempferol, 3-O-(2’-ramnosil-6”-acetil- galactósido)-7-O-ramnósido de kempferol, 6,8-dihidroxikempferol, 3-O- galactósido de isoramnetina, 3-O-ramnosil-ramnosil-glucósido de quercetina, 3- O-ramnosil-ramnosil-glucósido de kempferol, metilgalangina, 3,7,4’-O- triglucósido de kempferol, 5,3’,4’-trihidroxi-3-metoxi-6:7-metilendioxiflavone, 5,4’-dihidroxi-3,3’-dimetoxi-6:7-metilendioxiflavona, jaceidina, natsudaidaína, 3- metoxinobiletina, 3-metoxisinensetina, 3’-O-glucurónido de quercetina, 3’- sulfato quercetina, 4’-O-glucurónido de quercetina, 4’-O-glucurónido de isoramnetina, tamarixetina, 3-O-glucosil-rutinósido de quercetina
Isoflavonoides
daidzeína, formononetina, genisteína, biocanina a, gliciteína, glicitina, 6”-O- acetildaidzina, 6”-O-malonilgenistina, daidzina, genistina, 6”-O-acetilgenistina, 6”-O-acetilglicitina, 6”-O-malonildaidzina, 6”-O-malonilglicitina, 2’,7-dihidroxi- 4’,5’-dimetoxiisoflavona, 2-deshidro-O-desmetilangolensina, 2’- hidroxiformononetina, 3’,4’,7-trihidroxiisoflavano, 3’,4’,7-trihidroxiisoflavanona, 3’,7-dihidroxiisoflavano 3’-hidroxidaidzeína 3’-hidroxi-O-desmetilangolensina 4’,6,7-trihidroxiisoflavanona, 4’,7,8-trihidroxiisoflavanona, 4’,7-dihidroxi-3’- metoxiisoflavano 4’,7-dihidroxi-6-metoxiisoflavano 4-hidroxiequol, 4’-O- metilequol, 5,6,7,3’,4’-pentahidroxiisoflavona, 5,6,7,4’-tetrahidroxiisoflavona, 5,7,8,3’,4’-pentahidroxiisoflavona, 5,7,8,4’-tetrahidroxiisoflavona, 5’-hidroxi-O- desmetilangolensina 5’-metoxi-O-desmetilangolensina 6,7,3’,4’- tetrahidroxiisoflavona, 6,7,4’-trihidroxiisoflavona, 6’-hidroxiangolensina 6’- hidroxi-O-desmetilangolensina 7,3’,4’-trihidroxi-6-metoxiisoflavona, 7,3’,4’- trihidroxiisoflavona, 7,8,3’,4’-tetrahidroxiisoflavona, 7,8,4’-trihidroxiisoflavona, angolensina caliosina 4’,7-O-diglucurónido de daidzeína, 4’,7-disulfato dedzeina, 4’-O-glucurónido de daidzeína, 4’-sulfato de dzeina, 7-O-glucurónido de daidzeína, dihidrobiocaninaa, dihidrodaidzeína 7-O-glucurónido de dihidrodaidzeína, dihidroformononetina, dihidrogenisteína, dihidrogliciteína, equol, 7-O-glucurónido de formononetina, 7-sulfato de formononetina, 4’,7-O- diglucurónido de genisteína, 4’,7-disulfato de genisteína, 4’-O-glucurónido de genisteína, 4’-sulfato de genisteína, 5-O-glucurónido de genisteína, 7-O- glucurónido de genisteína, 7-sulfato de genisteína, 4’-O-glucurónido de gliciteína, 7-O-glucurónido de gliciteína, koparina, o-desmetilangolensina, orobol, prunetina, pseudobaptigenina, puerarina, 4’-O-glucurónido de daidzina, 7-O-glucurónido de irisolidona, 7-sulfato de tectorigenina, 4’-sulfato de tectorigenina, irisolidona, tectorigenina, tectoridina, 5,7-dihidroxi-8,4’- dimetoxiisoflavona, isotectorigenina, 7-O-glucurónido de equol, 4’-O- glucurónido de equol, 8-hidroxidaidzeína, 7-sulfato daidzeína, 4’-O-sulfo-7-O- glucurónido de daidzeína, 7-O-sulfo-4’-O-glucurónido de daidzeína, 4’-sulfato de equol, 3’,4’,5,7-tetrahidroxiisoflavanona, 3’-O-metilequol, 6-O-metilequol, 3’- hidroxigenisteína, 3’-hidroxidihidrodaidzeína, 6-hidroxidihidrodaidzeína, 3’- hidroxiequol, cis-4-hidroxiequol, 4’-metoxi-2’,3,7-trihidroxiisoflavanona, irilona, vestitona, sativanona, butina, 3’-hidroximelanetina, liquiritigenina, melanetina, estevenina, violanona, isoliquiritigenina, dalbergina, 3’-O-metilviolanona, 8- hidroxidihidrodaidzeína
Lignanos
secoisolariciresinol, matairesinol, lariciresinol, pinoresinol, siringaresinol, isolariciresinol, arctigenina, traquelogenina, medioresinol, 1-acetoxipinoresinol, di-O-glucósido de secoisolariciresinol, sesamina, sesamolina, sesamolinol, sesaminol, 2’-O-b-D-glucosil-(1 ->2)-O-[b-D-glucosil-(1 ->6)]-b-D-glucósido de sesaminol, 2’-O-b-D-glucosil-(1->6)-O-b-D-glucósido de sesaminol, 2’-O-b-D- glucósido de sesaminol, sesamol, 4’-O-b-D-glucosil-(1->6)-O-b-D-glucósido de sesamolinol, 7-hidroximatairesinol, isohidroximatairesinol, secoisolariciresinol- sesquilignano, ciclolariciresinol, 7-oxomatairesinol, todolactol a, conidendrina, 7-hidroxisecoisolariciresinol, nortraquelogenina, lariciresinol-sesquilignano, anhidro-secoisolariciresinol, dimetilmatairesinol, episesamina, episesaminol, 2’- O-b-D-glucosil-(1->2)-O-b-D-glucósido de sesaminol, enterodiol, enterolactona, 2-O-triglucósido de sesaminol, esquisandrina, gomisina D, esquisandrol B, tigloilgomicina H, esquisanenol, esquisanterina A, gomisina M2, desoxiesquisandrina, esquisandrina B, esquisandrina C, 2-hidroxienterodiol, 4- hidroxienterodiol, 6-hidroxienterodiol, 2-hidroxienterolactona, 4- hidroxienterolactona, 6-hidroxienterolactona, 2’-hidroxienterolactona, 4’- hidroxienterolactona, 6’-hidroxienterolactona, 5-hidroxienterolactona, 7- hidroxienterolactona
Metabolitos no fenólicos
ácido 4-etilbenzoico, glicina, 1,3,5-trimetoxibenceno, vaniloilglicina
Alquilmetoxi-fenoles
4-vinilguaiacol, 4-etilguaiacol, 4-vinilsiringol
Alquilfenoles
5-heneicosenilresorcinol, 5-heneicosilresorcinol, 5-heptadecilresorcinol, 5- nonadecenilresorcinol, 5-nonadecilresorcinol, 5-pentacosenilresorcinol, 5- pentacosilresorcinol, 5-pentadecilresorcinol, 5-tricosenilresorcinol, 5- tricosilresorcinol, alqu(en)ilresorcinoles, total, alquenilresorcinoles, total, alquilresorcinoles, total, 3-metilcatecol, 4-metilcatecol, 4-etilcatecol, 4-vinilfenol, 4-etilfenol
Betacianinas
betanina, isobetanina, betanidina, isobetanidina
Capsaicinoides
capsaicina
Curcuminoides
curcumina, desmetoxicurcumina, bisdesmetoxicurcumina
Dihidro-capsaicinas
dihidrocapsaicina, nordihidrocapsaicina
Furanocumarinas
bergapteno, psoraleno, xantotoxina, isopimpinelina, angelicina
Hidroxibenzaldehídos
siringaldehído, aldehído protocatéquico, vainillina, 4-hidroxibenzaldehído, aldehído gálico, p-anisaldehído, etilvainillina, 4-sulfato de vainillina
Hidroxibenzocetonas
3-metoxiacetofenona, 2,3-dihidroxi-1-guaiacilpropanona, paeonol, 5-sulfato de 2,4-dihidroxiacetofenona, 5-sulfato de 2-hidroxi-4-metoxiacetofenona, resacetofenona, noratiriol
Hidroxicinamaldehídos
ferulaldehído, sinapaldehído
Hidroxicumarinas
cumarina, isocumarina, meleína, escopoletina, esculetina, esculina, umbeliferona, 4-hidroxicumarina, urolitina D, 3-sulfato de urilitina B, 3,8-O- diglucurónido de urilitina A, 3,8-disulfato de urilitina A, urilitina A, urilitina B, 3-O- glucurónido de urilitina B, urilitina C
Hidroxifenilalcoholes
alcohol homovanílico
Hidroxifenilpropenos
2-metoxi-5-prop-1-enilfenol, anetol, eugenol, acetileugenol, [6]-gingerol, estragol
Metoxifenoles
guaiacol, p-anisidina
Naftoquinonas
juglona, 1,4-naftoquinona
Terpenos fenólicos
ácido carnósico, rosmanol, carnosol, epirosmanol, rosmadial, timol, carvacrol
Tirosoles
hidroxitirosol, 3,4-DHPEA-AC, p-HPEA-AC, oleuropeína, demetiloleuropeína, 3,4-DHPEA-Ea, ligstrósido, 3,4-DHPEA-EDA, 4-O-glucósido de hidroxitirosol, dimetiléster de oleósido, 11-metiléster de oleósido, 1’-O-glucósido de hidroxitirosol, p-HPEA-EDA, p-HPEA-EA, oleuropeína-aglicona, ligstrósido- aglicona, ácido elenólico, 4-O-glucurónido de tirosol, 4-sulfato de tirosol, hidroxitirosol, total
Otros polifenoles
cumestrol, catecol, pirogalol, florina, fenol, floroglucinol, arbutina, hidroquinona, 3,4-dihidroxifenilglicol, 5,5’,6,6’-tetrahidroxi-3,3’-biindolilo, resorcinol, 1 -fenil-6,7- dihidroxi-isocromano, 1-(3-metoxi-4-hidroxi)-fenil-6,7-dihidroxi-isocromano, ácido litospérmico, ácido litospérmico B, ácido salvianólico B, ácido salvianólico C, ácido salvianólico D, ácido salvianólico G, 3-(3,4-dihidroxifenil)-2- hidroxipropanoato de isopropilo
Ácidos hidroxibenzoicos
glucósido de ácido elágico, ácido protocatéquico, ácido gálico, ácido vanílico, ácido elágico, total, ácido gentísico, ácido elágico, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 3,4-dimetoxibenzoico, ácido siríngico, ácido 5-O-galloilquínico, arabinósido de ácido elágico, acetil-xilósido de ácido elágico, acetil-arabinósido de ácido elágico, ácido 4-metoxibenzoico, ácido gálico, total, ácido benzoico, 2- ácido hidroxibenzoico, ácido 3-hidroxibenzoico, ácido 2,3-dihidroxibenzoico, ácido 2,4-dihidroxibenzoico, 1-O-galoilglucosa, 4-O-glucósido de ácido 4- hidroxibenzoico, 4-O-glucósido de ácido protocatéquico, 4-O-glucósido de ácido gálico, ácido 3,5-dihidroxibenzoico, ácido 2,6-dihidroxibenzoico, 3-O- galato de ácido gálico, éster etílico del ácido gálico, dilactona de ácido valoneico, ácido 2,6-dimetoxibenzoico, ácido 2-hidroxi-4-metoxibenzoico, dilactona de ácido sanguisórbico, galoilglucosa, lambertianina C, sanguiina H-6, sanguiina H-10, elagitaninas, total, punicalagina, ácido galágico, ácido tánico, taninos hidrolizables, total, ácido 3-O-metilgálico, ácido 4-O-metilgálico, ácido 3,4-O-dimetilgálico, punicalina, ácido 4-hidroxihipúrico, 3-hidroxihipúrico, 2- ácido hidroxihipúrico, ácido hipúrico, paeoniflorina, 4-sulfato de ácido vanílico, ácido 2,3,4-trihidroxibenzoico
Ácidos hidroxicinámicos
ácido p-cumárico, ácido 5-p-cumaroilquínico, ácido 4-p-cumaroilquínico, ácido cafeico, feruloilglucosa, ácido ferúlico, ácido cafeoiltartárico, ácido rosmarínico, ácido o-cumárico, ácido m-cumárico, ácido sinápico, p-cumaroilglucosa, ácido p-cumaroilquínico, ácido 3-cafeoilquínico, verbascósido, ácido 4-cafeoilquínico, ácido p-cumaroiltartárico, ácido 2,5-di-s-glutationilcaftárico, ácido feruloiltartárico, éster etílico del ácido cafeico, cinamoilglucosa, ácido 5- cafeoilquínico, ácido 3-p-cumaroilquínico, ácido 2-s-glutationilcaftárico, ácido 5- feruloilquínico, ácido 4-feruloilquínico, ácido 3-feruloilquínico, ácido 5- sinapoilquínico, ácido 4-sinapoilquínico, ácido 3-sinapoilquínico, ácido 3,5- dicafeoilquínico, ácido isoferúlico, cafeoilglucosa, 4-O-glucósido de ácido p- cumárico, 4-O-glucósido de ácido cafeico, 4-O-glucósido de ácido ferúlico, éster glucosídico del ácido p-cumaroiltartárico, éster etílico del ácido p- cumárico, ácido trans-cafeoiltartárico, ácido cis-cafeoiltartárico, ácido trans-p- cumaroiltartárico, ácido cis-p-cumaroiltartárico, ácido trans-cafeico, ácido cis- cafeico, ácido trans-p-cumárico, ácido trans-ferúlico, ácido cis-p-cumárico, ácido cis-ferúlico, ácido 3,4-dimetoxicinámico, ácido hidroxicafeico, ácido cafeico, total, ácido sinápico, total, ácido quicórico, ácido 5-5’- deshidrodiferúlico, ácido 5-8’-deshidrodiferúlico, 1,2-disinapoilgentiobiosa, 1- sinapoil-2-feruloilgentiobiosa, 1,2-diferuloilgentiobiosa, 1,2,2’- trisinapoilgentiobiosa, 1,2’-disinapoil-2-feruloilgentiobiosa, 1 -sinapoil-2,2’- diferuloilgentiobiosa, 1,2,2’-triferuloilgentiobiosa, ácido 8-O-4’- deshidrodiferúlico, ácido 8-8’-deshidrodiferúlico, ácido 5-8’- benzofurandeshidrodiferúlico, ácido cis-3-cafeoilquínico, ácido 3,4- dicafeoilquínico, ácido cis-5-cafeoilquínico, ácido 3,4-diferuloilquínico, ácido 3.5- diferuloilquínico, ácido 1-cafeoilquínico, ácido 1,3-dicafeoilquínico, ácido 1.5- dicafeoilquínico, ácido 4,5-dicafeoilquínico, ácido dicafeoilquínico, b-D- fructosil-a-D-(6-O-(e))-feruloilglucósido, avenantramida 1p, avenantramida 1f, avenantramida 2p, avenantramida 2c, avenantramida 2f, avenantramida 1c, avenantramida 1s, avenantramida 2s, sinapoilglucosa, ácido p-cumaroilmálico, ácido p-cumaroilglicólico, 3-cafeoil-1,5-quinolactona, 4-cafeoil-1,5-quinolactona, ésteres del ácido quínico, total, 3-feruloil-1,5-quinolactona, 4-feruloil-1,5- quinolactona, 3,4-dicafeoil-1,5-quinolactona, 3-p-cumaroil-1,5-quinolactona, 4- p-cumaroil-1,5-quinolactona, ácido cinámico, cafeoil-3-hidroxitirosina, ácido cafeoilaspártico, ácido p-cumaroilaspártico, p-cumaroiloirosina, cafeoiltirosina, p-cumaroil-3-hidroxitirosina, isoverbascósido, sinapina, avenantramida a2, avenantramida k, ferulato de campesterilo, ferulato de sitostanilo, ácido 4-O- 8’,5’-5”-deshidrotriferúlico, ferulato de 24-metilcolestanol, ferulato de 24- metilcolesterol, ferulato de 24-metil-latosterol, ferulato de estigmastanol, ferulato de sitosterol, ferulato de escotenol, ferulato de 24-metilencolestanol, ácido trans-5-cafeoilquínico, ácido trans-3-cafeoilquínico, ácido 3-O- metilrosmarínico, 4-O-glucurónido de ácido sinápico, 4-sulfato de ácido sinápico, 4-sulfato de feruloilglicina, feruloilglicina, 3-O-glucurónido de ácido isoferúlico, 3-sulfato de ácido isoferúlico, 4-sulfato de ácido ferúlico, 4-O- glucurónido de ácido ferúlico, 4-sulfato de ácido cafeico, 3-sulfato de ácido cafeico, 4-sulfato de ácido p-cumárico, CL-glucurónido de feruloilo, CL- glucurónido de isoferuloilo, 3-O-glucurónido de ácido cafeico, 4-O-glucurónido de ácido cafeico, CL-glucurónido de cafeoílo, ácido clorogénico, total, ácido 1.5- diferuloilquínico, ácido 1-cafeoil-5-feruloilquínico, ácido 1 -feruloil-5- cafeoilquínico
Ácidos hidroxifenilacéticos
ácido 3,4-dihidroxifenilacético, ácido 4-hidroxifenilacético, ácido homovanílico, ácido homoverátrico, ácido metoxifenilacético, ácido3-hidroxifenilacético, ácido 2-hidroxifenilacético, ácido 4-metoxifenilacético, fenacetilglicina, ácido fenilacético, ácido 4-hidroximandélico, ácido 2-hidroxi-2-fenilacético, 4-sulfato de ácido homovanílico, ácido 4-hidroxifenil-láctico
Ácidos hidroxifenilpropanoicos
ácido dihidro-p-cumárico, ácido dihidrocafeico, ácido 3,4-dihidroxifenil-2- oxipropanoico, ácido 3-hidroxi-3-(3-hidroxifenil)propiónico, ácido 3-(3,4- dihidroxifenil)-2-metoxipropiónico, ácido 3-hidroxifenilpropiónico, 4-sulfato de ácido dihidroferúlico, 3-O-glucurónido de ácido dihidroisoferúlico, 3-O- glucurónido de ácido dihidrocafeico, 3-sulfato de ácido dihidrocafeico, ácido dihidroferúlico, 4-O-glucurónido de ácido dihidroferúlico, ácido dihidrosinápico, 4-sulfato de dihidroferuloilglicina, dihidroferuloilglicina, danshensu, ácido 3- metoxi-4-hidroxifenilláctico, éster metílico del ácido 3,4-dihidroxifenil-láctico, hidroxidanshensu, ácido 3-fenilpropiónico, ácido 3-hidroxi-4-metoxifenil-láctico, 3-sulfato de ácido dihidroferúlico, ácido 4-hidroxifenil-2- propiónico
Ácidos hidroxifenilpentanoicos
5-(3’-metoxi-4’-hidroxifenil)-Y-valerolactona, 4’-O-glucurónido de 5-(3’-metoxi-4’- hidroxifenil)-y-valerolactona, ácido 4-hidroxi-(3’,4’-dihidroxifenil)valérico, ácido 5-(3’,4’-dihidroxifenil)-valérico, 5-(3’,4’,-dihidroxifenil)-Y-valerolactona, 5-(3’,4’,5’- trihidroxifenil)-Y-valerolactona, 5-(3’,5’-dihidroxifenil)-Y-valerolactona, 5- hidroxifenil-Y-valerolactona, ácido 3-hidroxifenilvalérico, 3-O-glucurónido de 5- (3’,5’-dihidroxifenil)-Y-valerolactona
Estilbenos
trans-resveratrol, 3-O-glucósido de trans-resveratrol, piceatanol, cis-resveratrol, e-viniferina, pteroestilbeno, d-viniferina, 3-O-glucósido de cis-resveratrol, palidol, 3-O-glucósido de piceatanol, pinosilvina, 5-O-glucósido de resveratrol, resveratrol, 3-O-glucósido de resveratrol, 3,4,5,4’-tetrametoxiestilbeno, 3’- hidroxi-3,4,5,4’-tetrametoxiestilbeno, 3-hidroxi-4,5,4’-trimetoxiestilbeno, 4,4’- dihidroxi-3,5-dimetoxiestilbeno, 4’-hidroxi-3,4,5-trimetoxiestilbeno, 4-hidroxi- 3,5,4’-trimetoxiestilbeno, 3-O-glucurónido de cis-resveratrol, 3-sulfato de cis- resveratrol, 4’-O-glucurónido de cis-resveratrol, 4’-sulfato de cis-resveratrol, 3- O-glucurónido de resveratrol, 3-sulfato de resveratrol, 4’-O-glucurónido de resveratrol, 3,5-disulfato de trans-resveratrol, 3,4’-disulfato de trans-resveratrol, 3-O-glucurónido de trans-resveratrol, 3-sulfato trans-resveratrol, 4’-O- glucurónido de trans-resveratrol, 4’-sulfato de trans-resveratrol, dihidroresveratrol

Claims (20)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Composición farmacéutica para su uso en la prevención de una recaída de una infección por Clostridium difficile en un sujeto humano al que se le ha administrado previamente un fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile, comprendiendo la composición una preparación terapéutica de glicanos en una cantidad eficaz para prevenir la recaída, en la que
    i) la preparación terapéutica de glicanos comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01;
    ii) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano; y
    iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1.
  2. 2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que: (i) la recaída comprende la reaparición de uno o más síntomas asociados con una infección por C. difficile; y/o (ii) la recaída se produce durante o después de un régimen de tratamiento farmacológico de primera línea o de referencia.
  3. 3. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que el fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile es un antibiótico, en la que el antibiótico se selecciona opcionalmente del grupo de vancomicina, metronidazol y fidaxomicina.
  4. 4. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la composición se administra simultáneamente o después de la administración del fármaco para el tratamiento de una infección por C. difficile.
  5. 5. Método de preparación de una composición farmacéutica, comprendiendo el método:
    (a) proporcionar una preparación que comprende una mezcla de glicanos sintéticos,
    (b) obtener un valor para las siguientes características de la preparación:
    (i) el grado de polimerización (DP),
    (ii) el grado de ramificación promedio (DB),
    (iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta, y
    (c) formular la preparación como una composición farmacéutica si se cumplen los siguientes criterios:
    (i) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un DP de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano,
    (ii) el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01,
    (iii) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1.
  6. 6. Método según la reivindicación 5, que comprende además:
    b) obtener un valor para una cualquiera o ambas de las siguientes características adicionales de la preparación:
    (iv) la identidad de las unidades de glicano,
    (v) la razón de unidades de glicano, y
    c) formular la preparación como una composición farmacéutica si:
    (vi) la razón de unidades de glicano en la preparación es aproximadamente la misma que la razón del aporte de unidades de glicano.
  7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, que comprende además:
    b) obtener un valor para una cualquiera o ambas características adicionales de la preparación:
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    (iv) el nivel de crecimiento bacteriano, en medios complementados con la preparación, de cepas comensales seleccionadas del grupo que consiste en Bacteroides caccae ATCC 43185, Prevotella copri DSM 18205, Bacteroides thetaiotaomicron ATCC 29741, Bacteroides cellulosilyticus DSM 14838, Clostridium scindens ATCC 35704, Ruminococcus obeum ATCC 29714, Clostridium nexile ATCC 27757 y Parabacteroides distasonis ATCC 8503,
    (v) el nivel de crecimiento bacteriano, en medios complementados con la preparación, de cepas patógenas seleccionadas del grupo que consiste en Clostridium difficile ATCC BAA-1382, Clostridium difficile ATCC 43255, Enterococcus faecium ATCC 700221 y Salmonella enterica ATCC 27869, y
    c) formular la preparación como una composición farmacéutica si se cumplen uno o ambos de los siguientes criterios:
    (vi) promoción por los medios complementados con la preparación del crecimiento de al menos 5 cepas comensales, (v) promoción por los medios complementados con la preparación del crecimiento de no más de 2 cepas patógenas.
  8. 8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en el que la etapa (b) se realiza antes de, simultáneamente con o después de la etapa (b) según la reivindicación 5, pero antes de la etapa (c) según la reivindicación 5.
  9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que la etapa de formular la preparación como una composición farmacéutica comprende uno o más de:
    i) eliminar constituyentes no deseados de la preparación,
    ii) reducir el volumen de la preparación,
    iii) esterilizar la preparación,
    iv) mezclar la preparación con un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable,
    v) mezclar la preparación con un segundo fármaco o agente farmacéutico,
    vi) formular la preparación para dar un jarabe o disolución acuosa,
    vii) formular la preparación para dar un comprimido o píldora,
    viii) formular la preparación para dar una cápsula,
    ix) envasar la preparación,
    x) etiquetar la preparación envasada de ix), y
    xi) vender o poner a la venta la preparación envasada y etiquetada de x).
  10. 10. Método según la reivindicación 5, comprendiendo el método:
    (i) proporcionar una preparación terapéutica de glicanos que comprende al menos una unidad de glicano seleccionada del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa y manosa,
    (ii) determinar si un pico de RMN o grupo de picos de RMN preseleccionados están asociados con la preparación de glicanos, y
    (iii) si está presente el pico o grupo de picos preseleccionados, formular la reparación como una composición farmacéutica.
  11. 11. Método según la reivindicación 10, en el que el pico es un pico de 1H-13C-RMN de HSQC, y en el que la determinación comprende opcionalmente: obtener un valor para la identidad de un pico o grupos de picos de HSQC de 1H-13C asociados con la preparación, y si está presente un pico preseleccionado, formular la preparación como una composición farmacéutica.
  12. 12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en el que
    (i) para glicanos que comprenden glucosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de
    5
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    1H-13C seleccionados de 5,42, 92,5; 5,21, 92,8; 5,18, 93,9; 5,08, 97,0; 5,36, 98,4; 5,34, 99,8; 5,38, 100,3; 4,95, 98,6; 4,62, 96,6; 4,70, 103,6; 4,49, 103,4 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (ii) para glicanos que comprenden galactosa, los picos comprenden al menos un pico de HSQC de 1H-13C seleccionado de 5,37, 92,9; 5,24, 93,1; 5,14, 96,0; 4,96, 99,3; 5,31, 98,7; 5,39, 101,4; 5,00, 101,8' 4,80, 101,3; 4,63, 97,0; 4,56, 97,2; 4,53, 103,1; 4,43, 104,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (iii) para glicanos que comprenden fucosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de ^H-13C seleccionados de 5,18, 92,9; 5,33, 92,4; 5,04, 96,3; 4,90, 99,7; 4,52, 97,0; 4,39, 103,6 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (iv) para glicanos que comprenden xilosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de ^H-C seleccionados de 5,18, 93,0; 5,10, 94,3; 5,34, 98,2; 5,31 99,6; 5,11, 100,8; 4,91, 99,4, 4,56, 97,3; 4,64, 104,2; 4,54, 103,4; 4,44, 102,6; 4,44, 104,1 de desplazamiento de fH (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (v) para glicanos que comprenden arabinosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,22, 93,2; 5,13, 93,2; 5,29, 96,0; 5,26, 97,2; 5,12, 96,6; 5,18, 99,6; 5,06, 99,2; 4,99, 100,0; 5,26, 101,9; 5,06, 102,1; 4,55, 97,4; 4,54, 105,2; 4,50, 105,5; 4,38, 103,9 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (vi) para glicanos que comprenden ramnosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de ]H-13C seleccionados de 5,21, 93,2; 5,10, 94,5; 4,85, 94,1; 5,01, 95,8; 5,35, 100,5; 5,15, 102,2; 5,04, 102,9; 4,78, 97,9; 4,71, 99,0; 4,72, 101,0 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (vii) para glicanos que comprenden manosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,37, 93,0; 5,16, 94,6; 4,88, 94,2; 5,39, 101,7; 5,24, 101,9; 5,13, 102,8; 5,03, 102,7; 5,24, 105,6; 5,09, 108,0; 4,88, 94,2; 4,89, 100,0; 4,70, 101,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente.
  13. 13. Composición farmacéutica que comprende una preparación terapéutica de glicanos que comprende una mezcla de glicanos ramificados, en la que el grado de ramificación promedio (DB) de los glicanos en la preparación es de al menos 0,01, en la que
    i) al menos el 50% de los glicanos en la preparación tienen un grado de polimerización (DP) de al menos 3 y menos de 30 unidades de glicano,
    ii) la preparación de glicanos comprende enlaces glicosídicos tanto alfa como beta,
    iii) al menos uno de los enlaces glicosídicos presentes en los glicanos de la preparación comprende un enlace glicosídico 1->2, un enlace glicosídico 1->3, un enlace glicosídico 1->4 o un enlace glicosídico 1->6, y
    iv) la razón de enlaces glicosídicos alfa con respecto a beta presentes en los glicanos de la preparación es de entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 5:1.
  14. 14. Composición según la reivindicación 13, en la que al menos dos o al menos tres de los enlaces glicosídicos comprenden independientemente un enlace glicosídico 1->2, un enlace glicosídico 1->3, un enlace glicosídico 1->4 o un enlace glicosídico 1->6.
  15. 15. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en la que las unidades de glicano comprenden al menos uno de un monosacárido seleccionado del grupo de glucosa, galactosa, arabinosa, manosa, fructosa, xilosa, fucosa y ramnosa.
  16. 16. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en la que la preparación terapéutica de glicanos es sintética y no se aísla de una fuente de oligosacáridos o polisacáridos natural.
  17. 17. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13-16, que comprende además uno o más de (i) una preparación de polifenoles; (ii) una preparación de bacterias probióticas; (iii) un fármaco o agente terapéutico; y (iv) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  18. 18. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en la que la composición se formula como una forma de dosificación unitaria, y en la que opcionalmente: (i) la forma de dosificación unitaria se formula para administración oral; o (ii) la forma de dosificación unitaria se formula para disolverse en una disolución acuosa y se
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    administra por vía oral como una bebida, un jarabe, una disolución o una suspensión.
  19. 19. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, que comprende al menos una unidad de glicano seleccionada del grupo de: glucosa, galactosa, fucosa, xilosa, arabinosa, ramnosa y manosa, en la que la preparación comprende una unidad de glicano asociada con uno, dos o más de los siguientes picos de HSQC de 1H- 13C:
    (i) para glicanos que comprenden glucosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de ]H-13C seleccionados de 5,42, 92,5; 5,21, 92,8; 5,18, 93,9; 5,08, 97,0; 5,36, 98,4; 5,34, 99,8; 5,38, 100,3; 4,95, 98,6; 4,62, 96,6; 4,70, 103,6; 4,49, 103,4 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de correspondiente;
    3C (ppm) o un pico
    (ii) para glicanos que comprenden galactosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de ]H-13C seleccionados de 5,37, 92,9; 5,24, 93,1; 5,14, 96,0; 4,96, 99,3; 5,31, 98,7; 5,39, 101,4; 5,00, 101,8; 4,80, 101,3; 4,63, 97,0; 4,56, 97,2; 4,53, 103,1; 4,43, 104,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (iii) para glicanos que comprenden fucosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de ^H-13C seleccionados de 5,18, 92,9; 5,33, 92,4; 5,04, 96,3; 4,90, 99,7; 4,52, 97,0; 4,39, 103,6 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (iv) para glicanos que comprenden xilosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de ^H-C seleccionados de 5,18, 93,0; 5,10, 94,3; 5,34, 98,2; 5,31 99,6; 5,11, 100,8; 4,91, 99,4, 4,56, 97,3; 4,64, 104,2; 4,54, 103,4; 4,44, 102,6; 4,44, 104,1 de desplazamiento de fH (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (v) para glicanos que comprenden arabinosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de 1H-13C seleccionados de 5,22, 93,2; 5,13, 93,2;5,29, 96,0; 5,26, 97,2; 5,12, 96,6; 5,18, 99,6; 5,06, 99,2; 4,99, 100,0; 5,26, 101,9; 5,06, 102,1; 4,55, 97,4; 4,54, 105,2; 4,50, 105,5; 4,38, 103,9 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    (vi) para glicanos que comprenden ramnosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de ]H-13C seleccionados de 5,21, 93,2; 5,10, 94,5; 4,85, 94,1; 5,01, 95,8; 5,35, 100,5; 5,15, 102,2; 5,04, 102,9; 4,78, 97,9; 4,71, 99,0; 4,72, 101,0 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C (ppm) o un pico correspondiente;
    vii) para glicanos que comprenden manosa, los picos comprenden al menos uno o al menos dos picos de HSQC de
    H-C seleccionados de 5,37, 93,0; 5,16, 94,6; 4,88, 94,2; 5,39, 101,7; 5,24, 101,9; 5,13, 102,8; 5,03, 102,7; 5,24, 105,6; 5,09, 108,0; 4,88, 94,2; 4,89, 1 3
    (ppm) o un pico correspondiente.
    100,0; 4,70, 101,1 de desplazamiento de 1H (ppm) y desplazamiento de 13C
  20. 20. Kit farmacéutico que comprende:
    i) la composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13-19,
    ii) al menos un segundo constituyente seleccionado del grupo de una preparación de polifenoles, una preparación de bacterias probióticas, un fármaco o agente terapéutico y un componente dietético,
    i) material de instrucciones, y
    ii) envases.
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